CN115819576A - 一种卵巢干细胞在治疗卵巢抗衰药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卵巢干细胞在治疗卵巢抗衰药物中的应用。本发明特异性的构建并获得了HMGB1单克隆抗体，该抗体本身除了具有较好的靶向结合功能之外，还能够通过抑制HMGB1的表达来抑制卵巢癌细胞的增殖以及联合干细胞外泌体来抑制卵巢早衰，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本申请涉及生物领域，具体的涉及一种卵巢干细胞在治疗卵巢抗衰药物中的应用。
背景技术
卵巢早衰是一种常见的妇科内分泌疾病，发生在40岁以下女性，其主要特点是闭经、促性腺激素过高和雌激素缺乏，发病率在0.9％-1.2％。中华医学会妇产科学分会给出的诊断标准为：闭经时间≥4-6个月，两次间隔4周以上卵泡刺激素>40U/L，伴有雌激素降低及绝经症状。大部分临床卵巢早衰的具体病因尚不明确，目前认为有遗传性因素、自身免疫性因素、医源性因素、环境因素等几种原因，随着化疗在妇科肿瘤的广泛应用，医源性继发性卵巢早衰的发病率正呈逐渐上升的趋势。
针对前述病因，目前治疗卵巢早衰的主要措施包括激素替代治疗、免疫调节、卵巢组织冻存移植、胚胎冻存移植等，这些临床治疗方法可以改善卵巢早衰症状并能促进患者生育，但并不能从根本上恢复卵巢功能，且存在伦理争议及不良反应。因此，探寻一种能够高效、安全地恢复卵巢功能的治疗手段是学界的当务之急。
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞研究开始于20世纪60年代，在加拿大科学家发现并命名造血干细胞之后，从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养，其能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。在1998年末，美国两个研究小组成功培养出人类胚胎干细胞，保持了胚胎干细胞分化为各种体细胞的全能性。造血干细胞是最早被发现的，且研究最多、最先用于治疗疾病的成体干细胞，长期以来，一直认为干细胞只属于造血系统。随着干细胞研究的不断深入，近年来，几乎在所有组织中都发现了干细胞，干细胞生物学和干细胞生物工程已成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科。间充质干细胞可以修复组织损伤，促进器官功能恢复，具有很好的临床应用价值，应用前景广阔。探究其内在机制将能指导临床更好地发挥其功能，并为间充质干细胞治疗卵巢早衰提供理论支持。
近年来，间充质干细胞治疗卵巢早衰的有效性已经被大量研究证实。但是，同种异体间充质干细胞移植期间可能存在免疫排斥的风险。另外，自体间充质干细胞移植前取材面临着侵入性手术的问题，同时间充质干细胞还面临移植后存活率较低的问题。因此，进一步研究间充质干细胞分泌的胞外囊泡，如外泌体和微囊泡，是解决这些问题的突破口。胞外囊泡是细胞间通讯的重要介质，是干细胞治疗各类疾病的另一项重要机制，故详细综述以全面概括其治疗卵巢早衰的内在机制。外泌体和微囊泡构造不同但功能类似，二者都是细胞分泌的携带小分子蛋白质、miRNA、lncRNA和细胞因子的囊泡，主要参与细胞间通讯并调节受体细胞的功能。一项关于间充质干细胞分泌的微囊泡研究显示：微囊泡可以促进共培养的颗粒细胞的增殖，其可以通过激活PI3K/AKT通路恢复化疗诱导的小鼠早衰卵巢的功能并抑制颗粒细胞的凋亡。骨髓间充质干细胞可以通过分泌外泌体传递miR-144-5p来治疗大鼠卵巢滤泡闭锁，并可以将外泌体转移至与环磷酰胺共培养的卵巢颗粒细胞中以减少其凋亡。因此干细胞的外泌体或者外囊泡可以有效的用于卵巢早衰的治疗。
此外，在研究中也发现，高迁移率族蛋白-1(HMGB1)是广泛存在于真核生物细胞核内的非组蛋白DNA结合蛋白。它主要表达于各种组织器官的细胞核内，在人和小鼠的体内呈现高度保守表达。HMGB1是一种具有细胞因子作用的特殊分子。而且它是唯一一个可以分泌至胞外，并在胞外发挥细胞因子作用的。它主要依靠被动和主动两种方法释放到胞外。前者，在细胞损伤或被破坏后分泌；后者，免疫细胞被激活后将HMGB1分泌到细胞外基质中。HMGB1参与介导多种免疫反应，如移植排斥、缺血再灌注损伤、急性肺损伤等。它通过树突状细胞DC的成熟与迁移、CD4+T细胞的增殖、Th1细胞的分化、B细胞的活化来参与适应性免疫应答。根据POF患者卵巢组织周围浸润大量免疫细胞可以支持POF的自身免疫特性，以及其最终会导致卵巢纤维化等方面，已有研究表明HMGB1可能是导致卵巢早衰的一个重要因素，阻断HMGB1可以保护卵巢早衰。因此，开发有效阻断HMGB1的抑制剂并和干细胞一起用于卵巢早衰的治疗是重要的治疗研究方向。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性抑制HMGB1的单克隆抗体。
所述特异性抑制HMGB1的单克隆抗体为2E08，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有99％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有99％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有98％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有98％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有97％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有97％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有96％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有96％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有95％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有95％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有94％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有94％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有93％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有93％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有92％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有92％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
一方面，在本发明的另一个优选实施方案中，所述所述轻链可变区具有如SEQ IDNO.1所示序列或者与所述SEQ ID NO.1所示序列有91％以上的序列同源性的序列，且重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示序列或者与所述SEQ ID NO.2所示序列有91％以上的序列同源性的序列，且仍保持相同或相似的抗体活性。
在本发明的一个优选实施方案中，上述的抗体，或其抗原结合片段可以进一步被化学修饰，例如可以将一个或多个化学基团连接于抗体，以增加抗体的一个或多个功能特性。例如，常见的化学修饰有糖基化修饰和聚乙二醇化修饰等。其中，例如，可以在重链或轻链可变区进行糖基化修饰，增加一个或多个糖基化位点，以改善抗体的部分功能，例如增强抗体的免疫原性或改善抗体的药物动力学等。例如，在合适的条件下，将抗体或其抗原结合片段与活性的聚乙二醇(例如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物)进行酰化反应或烷基化反应实现聚乙二醇化修饰，以改善抗体的部分功能，例如增加抗体的生物(如血清)半衰期等。上述的化学修饰不显著改变本发明抗体或其抗原结合片段的基本功能和性质，这些经过化学修饰后的变体也落入本发明的保护范围之内。
进一步的，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有特异性抑制HMGB1的单克隆抗体。
进一步的，本发明的药物组合物可以将溶液填充至容器中，以液剂的形式提供，另外，可以通过冷冻干燥法、喷雾干燥法将溶液以冷冻干燥制剂或喷雾干燥制剂等非口服药物组合物的形式提供。优选为液剂。
进一步的，本发明的药物组合物中，可以根据期望适当添加助悬剂、助溶剂、等渗剂、防腐剂、防吸附剂、赋形剂、舒缓剂、含硫还原剂、抗氧化剂等药品添加物。
进一步的，作为本发明中使用的表面活性剂，只要是制药学上可接受、具有表面活性作用的表面活性剂，则没有特别限制。
具体而言，包括例如：非离子性表面活性剂，例如单辛酸失水山梨醇酯、单月桂酸失水山梨醇酯和单棕榈酸失水山梨醇酯等失水山梨醇脂肪酸酯；单辛酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯等甘油脂肪酸酯；单硬脂酸十聚甘油酯、二硬脂酸十聚甘油酯和单亚油酸十聚甘油酯等聚甘油脂肪酸酯；单月桂酸聚氧乙烯失水山梨醇酯、单油酸聚氧乙烯失水山梨醇酯、单硬脂酸聚氧乙烯失水山梨醇酯、单棕榈酸聚氧乙烯失水山梨醇酯、三油酸聚氧乙烯失水山梨醇酯和三硬脂酸聚氧乙烯失水山梨醇酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯；四硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇酯和四油酸聚氧乙烯山梨糖醇酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；单硬脂酸聚氧乙烯甘油酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；二硬脂酸聚乙二醇酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚和聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯脂肪酸酰胺，例如聚氧乙烯十八烷酰胺等具有6～18的HLB的表面活性剂；阴离子性表面活性剂，例如鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠和油基硫酸钠等具有C10～C18烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯月桂基硫酸钠等所添加的环氧乙烷单元的平均摩尔数为2～4、烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；磺基琥珀酸月桂基钠等具有C8～C18烷基的磺基琥珀酸烷基盐；卵磷脂和甘油磷脂等天然的表面活性剂；鞘磷脂等鞘磷脂；以及C12～C18脂肪酸的蔗糖酯。
进一步的，本发明提供了特异性抑制HMGB1的单克隆抗体在制备治疗卵巢早衰的药物组合物中的用途。
进一步的，所述卵巢早衰是化疗药物导致的早衰。
进一步的，本发明提供了特异性抑制HMGB1的单克隆抗体在制备治疗卵巢癌的药物组合物中的用途。
有益效果
本发明特异性的构建并获得了HMGB1单克隆抗体，该抗体本身除了具有较好的靶向结合功能之外，还能够通过抑制HMGB1的表达来抑制卵巢癌细胞的增殖以及联合干细胞外泌体来抑制卵巢早衰，具有很好的应用价值。
附图说明
图1Western印迹检测结果图
图2单抗对肿瘤细胞生长抑制结果图
图3各组对卵巢颗粒细胞凋亡的影响图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1HMGB1单克隆抗体的制备
以重组HMGB1蛋白作为免疫蛋白原，其货号为P09429，武汉菲恩生物科技有限公司。
首次免疫时，在小鼠颈背部皮下注射100μg重组HMGB1蛋白。首免后第21天进行第2次免疫，每只小鼠颈背部皮下注射100μg重组HMGB1蛋白。第2次免疫后第14天，选择ELISA效价最高的1号小鼠进行第3次免疫，经腹腔给1号小鼠注射100μg重组HMGB1蛋白，并经小鼠眼眶静脉丛采血。第3次免疫后的第14天进行第4次免疫，分别在邻近脾和腹腔内给小鼠注射50μg重组HMGB1蛋白。第4次免疫7d后取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规方法融合。间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆化。
经细胞融合、筛选及克隆化，获得3株能稳定分泌HMGB1单抗的杂交瘤细胞株，克隆号分别为2E08、5G07及6H05。按照常规方法，用上述杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，将腹水纯化后获得单抗。
利用小鼠Ig类/亚类/亚型检测试剂盒对2E08、5G07及6H05单抗进行检测，结果如表1所示。
表1 2E08、5G07及6H05单克隆抗体亚型检测
| 单抗名称 | 重链亚类 | 轻链亚类 |
| 2E08 | IgG2a | κ |
| 5G07 | IgG2a | κ |
| 6H05 | IgG2a | κ |
通过抗体亚类检测，可以发现，本发明获得3个抗体均是IgG2a，κ链。
实施例2HMGB1单克隆抗体2E08的特异性鉴定
Western印迹法检测单克隆抗体2E08的特异性，分别将收集的卵巢癌SKOV3细胞裂解液、大肠杆菌裂解液，细胞上清、纯化后蛋白制备成Western印迹样本，进行电泳并转膜，加入待检测单抗2E08，4℃反应过夜，HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育40min后进行显影。结果如图1所示。
如图1所示，克隆号为2E08的单抗可检测到卵巢癌SKOV3细胞裂解液表达的HMGB1，而未能检测到大肠杆菌裂解液中的相关。上述结果表明，克隆号为2E08的单抗可用于Western印迹法实验，对HMGB1的表达进行检测。
实施例32E08单克隆抗体亲和力鉴定
采用生物膜层干涉技术对2E08单克隆抗体与HMGB1蛋白它们之间的结合动力学进行检测，检测过程在OctetRED96(Fortebio)仪器上进行。
检测方法如下：提前将AHC探针在无菌水中浸泡10分钟进行平衡，检测的过程全部在30℃的反应条件下进行，可以分为以下五个步骤，1)调零：将探针浸入在无菌水中作用60秒获得检测基线；2)捕获抗体：将探针浸入10μg/ml的2E08单抗溶液中作用200秒捕获抗体；3)再次调零：将探针浸入缓冲液(加入0.02％Tween20的PBS溶液)中作用120秒去除未结合的抗体；4)结合HMGB1：将探针浸入起始浓度为100nM、3倍梯度稀释的HMGB1蛋白溶液中，作用300秒得到单抗与HMGB1结合的动态曲线；5)结合解离：将探针放入缓冲液中作用300秒。蛋白的结合引起生物膜厚度的变化，导致干涉光波发生相对位移，被光谱仪检测到，形成干涉光谱，以干涉图谱的实时位移(nm)显示出来。以此检测HMGB1与本申请的单抗结合解离的动态曲线。在数据分析时样本孔的数据减去缓冲液对照孔的数据，扣除缓冲溶液的非特异性干扰，采用1：1结合模型，对不同的HMGB1稀释浓度下与单抗的结合进行整体曲线拟合，得到亲和力常数KD值为(8.56±0.03)nM；显示了本申请的单抗与HMGB1蛋白有非常强的亲和力。
实施例42E08单克隆抗体特性鉴定
将卵巢癌SKOV3细胞按2×104/孔接种于96孔板，37℃，5％CO2条件下培养。
每孔保持为100μ1的培养基，同时每个实验组(本发明的抗体，浓度为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)、阴性对照组(PBS溶液)、阳性对照组(甘草酸100μg/ml)均设计6个复孔设立，做好标记。配置好CCK-8稀释溶液(l0ul/ml，吹打混匀后加入实验组和对照组并在没有细胞的孔中设立空白对照组放入培养箱孵育4h，用酶标仪选取在490nm检测细胞的吸光度，检测72h后数据。将数据空白校准取均值进行统计学分析。检测不同药物浓度下卵巢癌SKOV3细胞细胞生长状况。细胞生长抑制率＝(空白组A490-实验组A490)/空白组A490*100％。
结果如图2所示可以看出，添加了单抗的治疗组中，肿瘤细胞的增殖能力明显下降与阴性对照组相比差异显著(P<0.01)，而没有添加单抗的对照组中的肿瘤细胞增殖能力没有明显变化,在都是100μg/ml的浓度条件下，本发明的2E08单克隆抗体比阳性对照具有更好的抑制效果，达到了(72.2±1.8)％。
实施例5卵巢干细胞的培养及外泌体的制备
超净台内，将人卵巢标本置于皿中，PBS冲洗组织3次，尽量去除红细胞。眼科剪充分剪碎组织至糊状。将3倍于组织体积的胶原酶加入皿中，吹打并转移至离心管，放入37℃培养箱。消化约30min，每隔10rain充分吹打，直至组织块溶解，消化液变浑浊。加入等量A液(DMEM(Hyclone，美国)+lO％胎牛血清(Hyclone，美国)+l％青霉素、链霉素(Sigma，美国))充分混匀，以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞2次，用200目滤网过滤，离心后加入3mlB液种于培养皿，37℃、O.5％CO2，培养箱培养。隔天换液，每天倒置显微镜下观察细胞贴壁及集落生长情况。待皿中细胞长到80％汇合度时即消化传代。弃除培养液，加入PBS洗2次，加入O.25％胰酶覆盖皿底，置于37摄氏度培养箱。间隔2min镜下观察消化情况，待大部分贴壁细胞变圆变亮，加入等量含10％胎牛血清的A液中止消化，用吸管反复轻柔吹打皿底，使呈单细胞悬液。以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞2次，加入适量B液(80％KnockoutDMEM(Gibco，美国)+20％KnockoutSerumReplacement(Gibco，美国)+l％非必须氨基酸(Hyclone，美国)+1％谷氨酰胺(Gibco，美国)+1％β-巯基乙醇(Gibco，美国)+4ng/mlβ-FGF(Gibco，美国)+1％青霉素、链霉素(Sigma，美国))，按1：2的比例传代，37℃、0.5％CO2培养箱培养。隔天换液，每天倒置显微镜下观察细胞生长情况。取有集落生长的培养皿，弃掉培养液，PBS轻轻冲洗2次，避光条件下按试剂盒说明配置碱性磷酸酶鉴定液，混匀后覆盖皿底。置于暗室，镜下观察细胞染色情况。结果显示细胞呈紫蓝色为碱性磷酸酶阳性。免疫荧光法检测0ct-4表达情况(1)将无菌盖玻片置入培养皿中进行细胞爬片培养，待细胞占爬片80％左右，用PBS洗5min。(2)4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3次，每次5min。(3)O.5％PBST破膜5min，PBS洗3次，每次5min。(4)5％羊血清37℃封闭30min，PBS洗2次，每次5min。分别加入兔抗人0ct-4抗体IgG(效价1：400)及PBS(作为空白对照)，湿盒内4℃孵育过夜。(5)PBS洗3次，每次10min，加入山羊抗兔IgG/AlexaFlour594(效价1：50)，室温避光孵育60min。(6)PBS洗3次，每次5min，用含DAPI的封片剂封片。(7)荧光显微镜下观察并拍照，结果显示细胞核呈红色的阳性结果，表明本发明制备并获得了卵巢干细胞。
取3代生长良好的卵巢干细胞细胞，饥饿培养24h后收集培养上清，3000g离心30min除去细胞碎片，再经0.45μm针式过滤器过滤到15ml规格的超滤离心管中，4℃条件下3000g离心30min，进一步去除细胞碎片。采用exoEasyMaxiKit试剂盒提取外泌体，按体积比为1∶1加入外泌体浓缩液和Buffer XBP混匀，500g离心1min；取离心柱上层液体加入10mlBufferXWP 5000g离心5min；取上层液体加入1mLBuffer XE 500g洗脱1min；再次加入1mlBuffer XE 5000g重复洗脱1次得到纯化的外泌体洗脱液，冷藏备用。
实施例62E08单克隆抗体及卵巢干细胞外泌体对卵巢早衰的影响
卵巢早衰模型建立：取昆明雌性小鼠，按体质量与随机数字表随机分为空白组，模型组，阳性对照戊酸雌二醇片组，2E08单克隆抗体组，外泌体治疗组，2E08单克隆抗体联合外泌体治疗组，每组10只。除空白组小鼠腹腔注射等量生理盐水外，其余5组小鼠均以30mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺，注射体积为20mL/kg，左右腹交替进行，每天1次，连续注射20d，复制POF模型。
给药方法：造模第1天开始，分别将戊酸雌二醇片组(200μg/kg)，2E08单克隆抗体组(200μg/kg)，以及外泌体(200μg/kg)分别灌胃给药、注射给药、注射给药；戊酸雌二醇片组每天1次，单抗和/或外泌体4天1次给药，连续给药至32d。
对化疗致POF模型小鼠外周血清E2、FSH水平测定于末次给药2h后，摘眼球取血，室温静置30min后以3000r/min离心20min，制备血清，液氮保存，参照试剂盒说明要求，以ELISA法测定小鼠外周血清中E2、FSH含有量。
表1各组对化疗致POF小鼠外周血清E2、FSH含有量的影响
| 组别 | E2(pg/mL) | FSH(pg/mL) |
| 空白组 | 1.143±0.224 | 0.723±0.020 |
| 模型组 | 0.635±0.038 | 1.279±0.105 |
| 阳性对照组 | 1.046±0.064* | 0.892±0.054* |
| 单抗组 | 1.077±0.102* | 0.853±0.038* |
| 外泌体组 | 0.984±0.063* | 0.963±0.087* |
| 外泌体加单抗组 | 1.120±0.035* | 0.785±0.039* |
*与模型组比较，P<0.05.
与空白组比较，模型组小鼠血清E2含有量明显降低(P＜0.01)，FSH含有量明显升高(P＜0.01)。经单抗或者外泌体治疗后，与模型组比较，小鼠血清E2含有量均明显升高，FSH含有量均明显降低。特别是外泌体联合单抗一起治疗后，二者的治疗效果具有显著的改变，提示单抗或者外泌体或者二者的联合可有效调节化疗致POF模型小鼠血清性激素水平，改善内分泌功能紊乱。
对化疗致POF模型小鼠卵巢组织病理学切片检查小鼠采血后，迅速剖开腹腔，摘取双侧卵巢与子宫，剔除周围附着的脂肪与结缔组织，以分析天平称湿重，计算脏器系数；同时将双侧卵巢以4％多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色等方法处理后，制作卵巢病理切片进行显微镜观察。
表2各组对化疗致POF小鼠卵巢、子宫系数的影响
| 组别 | 卵巢系数(g/100g) | 子宫系数(g/100g) |
| 空白组 | 0.136±0.020 | 0.419±0.064 |
| 模型组 | 0.086±0.019 | 0.201±0.031 |
| 阳性对照组 | 0.114±0.021* | 0.280±0.057* |
| 单抗组 | 0.122±0.034* | 0.330±0.068* |
| 外泌体组 | 0.105±0.017* | 0.276±0.044* |
| 外泌体加单抗组 | 0.130±0.038* | 0.394±0.053* |
*与模型组比较，P<0.05.
与空白组比较，模型组小鼠卵巢、子宫系数均明显降低。经单抗和/或外泌体治疗后，与模型组比较，小鼠子宫、卵巢系数均明显升高(P＜0.05)。提示单抗和/外泌体可有效增加化疗致POF模型小鼠生殖器官质量，增强生殖功能。
对化疗致POF模型小鼠卵巢颗粒细胞凋亡检测参照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书，对卵巢颗粒细胞凋亡情况进行检测。具体方法为:切片常规脱蜡入水，H2O2处理，标本片加0.01mol/LTBS1∶200新鲜稀释的蛋白酶K(Pro-teinaseK)消化，标记缓冲液湿润，末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)与地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸(DIG-d-UTP)标记，封闭液封闭，加入生物素化抗地高辛抗体与链霉亲和素—过氧化物酶(SABC)，37℃反应，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞，采用MoticB5显微摄像图像分析系统进行凋亡细胞平均光密度值分析。结果如图3所示。
结果图3显示，空白组颗粒细胞凋亡程度较轻，凋亡阳性细胞数较少。与空白组比较，模型组小鼠凋亡阳性细胞明显增多，凋亡平均光密度值明显升高(P＜0.01)。经单抗和/或外泌体治疗后，与模型组比较，小鼠凋亡颗粒细胞数量明显减少，凋亡平均光密度值明显降低(P＜0.05)，特别是单抗联合外泌体其平均光密度值只有0.53±0.01，与空白组非常接近。这说明单抗联合外泌体可有效抑制化疗致POF模型小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，延缓卵巢过早衰老进程，改善与恢复卵巢功能。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种特异性抑制HMGB1的单克隆抗体2E08，其特征在于轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的特异性抑制HMGB1的单克隆抗体2E08联合卵巢干细胞外泌体在制备治疗卵巢早衰的药盒中的用途，其中，所述的卵巢早衰是化疗药物导致的。
3.如权利要求1所述的特异性抑制HMGB1的单克隆抗体2E08在制备抑制卵巢癌细胞增殖的药物组合物中的用途。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述药盒中含有药学上可接受的载体。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述药物组合物中含有药学上可接受的载体。
6.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述外泌体是通过本领域常规的外泌体制备方法来制备获得的。
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