CN113930335B - 一种纳米酶级联生物反应器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米酶级联生物反应器（MEGR）及其制备方法和应用。本发明提供了一种纳米酶级联生物反应器，为将物质甲连接在物质乙表面得到的复合物；所述物质甲为偶联有CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶；所述物质乙为外泌体。本发明利用外泌体仿生修饰碳点纳米酶，提高肿瘤组织的富集能力；利用外泌体表面天然的NADPH氧化酶2为碳点纳米酶提供更多的催化底物；利用RSR13改善肿瘤组织乏氧，为NADPH氧化酶2提供更多氧气。本发明可以实现协同联动增效抑制肿瘤生长。

Description

一种纳米酶级联生物反应器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳米酶级联生物反应器及其制备方法和应用。
背景技术
纳米酶（nanozymes）作为本身蕴含酶学特性的纳米材料，能够将细胞代谢产物催化为活性氧（reactive oxygen species, ROS），应用于肿瘤的纳米酶催化治疗。该治疗方法不仅适用于各阶段肿瘤患者的治疗，而且也适用于术后患者的配合治疗，具有适用范围广的优势，发展空间尤其广阔。纳米酶具有类似过氧化物酶的催化特性，可催化产生ROS，在生物医学中的应用尤为突出。研究人员借助纳米酶催化产生的过量ROS杀伤肿瘤细胞，为攻克恶性肿瘤提供了纳米酶催化治疗的新思路。
2018年，中国科学院施剑林团队合成了一种枝状介孔二氧化硅纳米粒子作为药物输运系统载体，依次负载直径2nm的超小Fe3O4纳米粒子和葡萄糖氧化酶，构建一种新型的纳米催化剂。该纳米催化剂中的葡萄糖氧化酶是一种高活性有机酶，且Fe3O4纳米粒子是一种高效、高稳定性的Fenton反应催化剂。该催化剂利用肿瘤细胞内旺盛的葡萄糖原料和微酸性代谢环境，连锁地进行高效的生物酶催化反应和化学Fenton催化反应。在第一步生物酶催化反应中，葡萄糖氧化酶选择性地催化肿瘤内的d-葡萄糖生成过氧化氢（H2O2）与葡萄糖内脂。H2O2作为下一步化学Fenton催化反应的反应物，在酸性条件下被Fe3O4纳米粒子催化生成高毒性的活性氧物种-羟基自由基（•OH）。高毒性的•OH可以诱导肿瘤细胞的凋亡，在实现杀死肿瘤细胞的同时，不对正常的组织和器官造成损害。
纳米酶在肿瘤治疗领域中的研究，特别是纳米酶在体内的递送有待进一步的探索。纳米酶催化治疗肿瘤的两个关键点：（1）纳米酶如何高效递送到达肿瘤组织；（2）纳米酶能否在肿瘤组织部位最大程度发挥催化抑瘤作用。如何采用最佳的修饰策略、提高纳米酶的生物安全性、充分发挥纳米酶的催化活性、增加到达肿瘤病灶部位的机会，在复杂的肿瘤微环境中最大程度的发挥催化抑制肿瘤的作用，是未来纳米酶催化治疗肿瘤研究中，最有潜力的研究方向之一。
由于生物机体的极度复杂性，经过精心设计的纳米药物系统在临床实验中的表现远远没有达到预期效果。纳米酶应用于体内治疗需要克服以下问题：（1）体内长循环：纳米粒子等外源性物质受到机体免疫系统的排斥作用，被自身的巨噬细胞吞噬清除；（2）肿瘤靶向性：未经修饰的纳米颗粒易被体内单核巨噬系统（MPS）/网状内皮系统（RES）所吞噬，即使在纳米材料表面连接功能靶向分子，也没有明显提升纳米颗粒在肿瘤组织的有效聚集；相反，靶向分子的引入导致纳米颗粒尺寸增加，表面性质的改变，使其更易被MPS/RES捕获，无法靶向递送到肿瘤组织部位；（3）传统功能化修饰影响酶活性：传统的化学修饰方法，不可避免的引入其它的化学元素和官能基团，在一定程度上会影响纳米酶的催化能力；（4）体内催化能力有待进一步提高：如何为纳米酶提供更多的催化底物，使机体保持中、高浓度的ROS，破坏细胞的动态平衡，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，迫切需要科研人员寻找一种能够提高纳米酶生物安全性和催化能力的修饰策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米酶级联生物反应器（MEGR）及其制备方法和应用。
本发明提供了一种纳米酶级联生物反应器，为将物质甲连接在物质乙表面得到的复合物；所述物质甲为偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶；所述物质乙为外泌体。
本发明提供了一种纳米酶级联生物反应器，为将物质甲连接在物质乙表面得到的复合物；所述物质甲为偶联有CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶；所述物质乙为外泌体。
所述外泌体表面具有CD63抗原。所述物质甲和所述物质乙通过CD63抗体和CD63抗原的特异性结合实现所述连接。
所述物质甲和所述物质乙的质量配比（原料质量配比）具体可为：1-10:1-10。
所述物质甲和所述物质乙的质量配比（原料质量配比）具体可为：1-2:1-2。
所述物质甲和所述物质乙的质量配比（原料质量配比）具体可为：1:1。
所述“将物质甲连接在物质乙表面”的具体方法可为：在PBS缓冲液中，加入所述物质甲和所述物质乙，室温反应；然后离心弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为纳米酶级联生物反应器。
所述“将物质甲连接在物质乙表面”的具体方法可为：在5mL PBS缓冲液（pH7.2）中，加入10mg 所述物质甲和10mg所述物质乙，室温反应8-12小时；然后14000rpm离心6min，弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为纳米酶级联生物反应器。
所述物质甲的制备方法可为：在EDC和NHS活化作用下，偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶表面游离的羧基与CD63抗体的游离氨基通过形成酰胺键耦联在一起，得到所述物质甲。
偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶与CD63抗体的质量配比（原料质量配比）可为：10mg：1-10μg。
偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶与CD63抗体的质量配比（原料质量配比）可为：10mg：2.5μg。
所述物质甲的制备方法可为：将偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶悬浮于pH6.5的PBS缓冲液，然后转移至反应瓶中，加入EDC和NHS，室温反应以活化；活化完成后，向所述反应瓶中加入CD63抗体，室温反应；然后离心弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为所述物质甲。
所述物质甲的制备方法具体可为：将10mg偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶悬浮于5mL pH6.5的PBS缓冲液，然后转移至反应瓶中，加入10mg EDC和4mg NHS，室温反应15-30min以活化；活化完成后，向所述反应瓶中加入5μL CD63抗体（抗体含量为2.5μg），室温反应6h；然后14000rpm离心6min，弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为所述物质甲。
具体的，以上任一所述外泌体为巨噬细胞来源的外泌体。
所述巨噬细胞具体可为M1型巨噬细胞。
所述M1型巨噬细胞的制备方法可为：诱导MO型巨噬细胞极化形成M1型巨噬细胞。
所述M1型巨噬细胞的制备方法具体可为：取MO型巨噬细胞，在含有100ng/mL LPS和100ng/mL IFN-γ的DMEM培养基中培养24h。
所述MO型巨噬细胞具体可为J774A.1细胞。
外泌体的制备方法具体包括如下步骤：
（1）取J774A.1细胞，在含有100ng/mL LPS和100ng/mL IFN-γ的DMEM培养基中培养24h；
（2）完成步骤（1）后，取上清液，2000×g离心10min，取上清液；
（3）取步骤（2）得到的上清液，10000×g离心30min，取上清液；
（4）取步骤（3）得到的上清液，140000×g离心90min，收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为即为外泌体。
所述偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶的制备方法如下：通过缩醛键（响应微酸性环境），将乏氧抑制剂偶联于碳点纳米酶表面，得到偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
碳点纳米酶与乏氧抑制剂的质量配比（原料质量配比）可为：1mg：1-100μg。
碳点纳米酶与乏氧抑制剂的质量配比（原料质量配比）可为：1mg：10μg。
所述偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶的制备方法如下：取碳点纳米酶，用PBS缓冲液重悬，然后加入EDC和乏氧抑制剂，室温反应，然后离心收集沉淀，然后用水洗涤沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
所述偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶的制备方法如下：取1mg碳点纳米酶，用2mLPBS缓冲液（pH7.2）重悬，然后加入20μg EDC和10μg 乏氧抑制剂，室温下磁力搅拌反应2h，然后100000g离心10min，收集沉淀，然后用水洗涤沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
乏氧抑制剂即可以抑制肿瘤乏氧的物质。
具体的，以上任一所述乏氧抑制剂可为Efaproxiral。
具体的，以上任一所述碳点纳米酶为石墨烯量子点纳米酶。
具体的，石墨烯量子点纳米酶是以聚丙烯腈为原料制备得到的。
具体的，石墨烯量子点纳米酶是以聚丙烯腈为原料通过化学氧化剥离法制备得到的。
石墨烯量子点纳米酶的制备方法具体如下：
（1）将0.2g聚丙烯腈加入到由40mL 98%硫酸溶液和12mL 68%硝酸溶液混匀形成的溶液中，然后超声处理（超声参数：室温，功率50W，时间2h），然后升温至100℃并反应24h（反应过程中持续搅拌）；
（2）完成步骤（1）后，进行超滤（截留分子量为3000Da），弃除滤液，剩余物进行真空冷冻干燥，得到的产物即为石墨烯量子点纳米酶。
本发明还提供了一种纳米酶级联生物反应器的制备方法，包括如下步骤：
（1）在碳点纳米酶表面偶联乏氧抑制剂，得到偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶；
（2）在偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶的表面游离羧基上连接CD63抗体，得到偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶；
（3）将偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶连接在外泌体表面，得到纳米酶级联生物反应器。
在碳点纳米酶表面偶联乏氧抑制剂的方法如下：通过缩醛键（响应微酸性环境），将乏氧抑制剂偶联于碳点纳米酶表面。
碳点纳米酶与乏氧抑制剂的质量配比（原料质量配比）可为：1mg：1-100μg。
碳点纳米酶与乏氧抑制剂的质量配比（原料质量配比）可为：1mg：10μg。
在碳点纳米酶表面偶联乏氧抑制剂的方法如下：取碳点纳米酶，用PBS缓冲液重悬，然后加入EDC和乏氧抑制剂，室温反应，然后离心收集沉淀，然后用水洗涤沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
在碳点纳米酶表面偶联乏氧抑制剂的方法如下：取1mg碳点纳米酶，用2mL PBS缓冲液（pH7.2）重悬，然后加入20μg EDC和10μg 乏氧抑制剂，室温下磁力搅拌反应2h，然后100000g离心10min，收集沉淀，然后用水洗涤沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
乏氧抑制剂即可以抑制肿瘤乏氧的物质。
具体的，所述乏氧抑制剂可为Efaproxiral。
“在偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶的表面游离羧基上连接CD63抗体”的方法如下：在EDC和NHS活化作用下，偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶的表面游离羧基与CD63抗体的游离氨基通过形成酰胺键耦联在一起。
偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶与CD63抗体的质量配比（原料质量配比）可为：10mg：1-10μg。
偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶与CD63抗体的质量配比（原料质量配比）可为：10mg：2.5μg。
“在偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶的表面游离羧基上连接CD63抗体”的方法如下：将偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶悬浮于pH6.5的PBS缓冲液，然后转移至反应瓶中，加入EDC和NHS，室温反应以活化；活化完成后，向所述反应瓶中加入CD63抗体，室温反应；然后离心弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
“在偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶的表面游离羧基上连接CD63抗体”的方法如下：将10mg偶联乏氧抑制剂的碳点纳米酶悬浮于5mL pH6.5的PBS缓冲液，然后转移至反应瓶中，加入10mg EDC和4mg NHS，室温反应15-30min以活化；活化完成后，向所述反应瓶中加入5μL CD63抗体（抗体含量为2.5μg），室温反应6h；然后14000rpm离心6min，弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶。
所述外泌体表面具有CD63抗原。
“将偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶连接在外泌体表面”是通过CD63抗体和CD63抗原的特异性结合实现的。
偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶和外泌体的质量配比（原料质量配比）具体可为：1-10:1-10。
偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶和外泌体的质量配比（原料质量配比）具体可为：1-2:1-2。
偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶和外泌体的质量配比（原料质量配比）具体可为：1:1。
“将偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶连接在外泌体表面”的方法如下：在PBS缓冲液中，加入偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶和外泌体，室温反应；然后离心弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为纳米酶级联生物反应器。
“将偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶连接在外泌体表面”的方法如下：在5mL PBS缓冲液（pH7.2）中，加入10mg 偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶和10mg外泌体，室温反应8-12小时；然后14000rpm离心6min，弃除上清；然后用水洗涤并收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为纳米酶级联生物反应器。
具体的，以上任一所述外泌体为巨噬细胞来源的外泌体。
所述巨噬细胞具体可为M1型巨噬细胞。
所述M1型巨噬细胞的制备方法可为：诱导MO型巨噬细胞极化形成M1型巨噬细胞。
所述M1型巨噬细胞的制备方法具体可为：取MO型巨噬细胞，在含有100ng/mL LPS和100ng/mL IFN-γ的DMEM培养基中培养24h。
所述MO型巨噬细胞具体可为J774A.1细胞。
外泌体的制备方法具体包括如下步骤：
（1）取J774A.1细胞，在含有100ng/mL LPS和100ng/mL IFN-γ的DMEM培养基中培养24h；
（2）完成步骤（1）后，取上清液，2000×g离心10min，取上清液；
（3）取步骤（2）得到的上清液，10000×g离心30min，取上清液；
（4）取步骤（3）得到的上清液，140000×g离心90min，收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为即为外泌体。
具体的，以上任一所述碳点纳米酶为石墨烯量子点纳米酶。
具体的，石墨烯量子点纳米酶是以聚丙烯腈为原料制备得到的。
具体的，石墨烯量子点纳米酶是以聚丙烯腈为原料通过化学氧化剥离法制备得到的。
石墨烯量子点纳米酶的制备方法具体如下：
（1）将0.2g聚丙烯腈加入到由40mL 98%硫酸溶液和12mL 68%硝酸溶液混匀形成的溶液中，然后超声处理（超声参数：室温，功率50W，时间2h），然后升温至100℃并反应24h（反应过程中持续搅拌）；
（2）完成步骤（1）后，进行超滤（截留分子量为3000Da），弃除滤液，剩余物进行真空冷冻干燥，得到的产物即为石墨烯量子点纳米酶。
聚丙烯腈具体为平均分子量为150000的聚丙烯腈。
CD63抗体（Anti-CD63 antibody）：Abcam公司，货号ab271286。
Efaproxiral（RSR13）：MedChemExpress公司，CAS号为131179-95-8。
聚丙烯腈（average Mw 150,000）：Sigma-Aldrich公司，CAS号为 25014-41-9。
本发明还保护以上任一所述纳米酶级联生物反应器在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还保护一种用于治疗肿瘤的药物，包括以上任一所述纳米酶级联生物反应器。
具体的，所述肿瘤为实体性肿瘤。
示例性的，所述肿瘤为鼻咽癌。
所述纳米酶级联生物反应器通过静脉给药的方式趋化富集到实体性肿瘤的病灶部位。
以上任一所述纳米酶级联生物反应器的粒径大小为50-150nm。
以上任一所述纳米酶级联生物反应器的粒径大小为80-120nm。
以上任一所述纳米酶级联生物反应器的粒径大小约为100nm。
纳米酶（nanozymes）能够将细胞代谢产物催化为活性氧（reactive oxygenspecies, ROS），过量ROS杀伤肿瘤细胞。
本发明利用M1型巨噬细胞外泌体仿生修饰碳点纳米酶，提高肿瘤组织的富集能力；利用外泌体表面天然的NADPH氧化酶2为碳点纳米酶提供更多的催化底物；利用RSR13改善肿瘤组织乏氧，为NADPH氧化酶2提供更多氧气。本发明制备得到了在肿瘤部位高效富集的纳米酶级联生物反应器，可以实现协同联动增效抑制肿瘤生长。
附图说明
图1为透射电子显微镜下石墨烯量子点纳米酶的照片。
图2为原子力显微镜下石墨烯量子点纳米酶的照片。
图3为利用电子顺磁共振检测石墨烯量子点纳米酶催化产生羟基自由基的结果。
图4为外泌体表征的结果（Western Blotting、透射电子显微镜观察、动态光散射粒度仪分析）。
图5为M1外泌体膜表面天然的NADPH氧化酶2的含量与酶活性。
图6为MEGR在肿瘤组织部位富集的结果。
图7为MEGR抑制肿瘤生长的疗效的结果。
图8为制备纳米酶级联生物反应器的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
聚丙烯腈（average Mw 150,000）：Sigma-Aldrich公司，CAS号为 25014-41-9。EDC，全称为 N-乙基-N′-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐：Sigma-Aldrich公司，CAS号为25952-53-8。CNE-2细胞：人鼻咽癌细胞。
实施例1、制备纳米酶级联生物反应器
制备纳米酶级联生物反应器的流程示意图见图8。
一、石墨烯量子点纳米酶的制备与表征
1、石墨烯量子点纳米酶的制备
以聚丙烯腈为原料，通过化学氧化剥离法制备石墨烯量子点纳米酶。
具体步骤如下：
（1）将0.2g聚丙烯腈加入到由40mL 98%硫酸溶液和12mL 68%硝酸溶液混匀形成的溶液中，然后超声处理（超声参数：室温，功率50W，时间2h），然后升温至100℃并反应24h（反应过程中持续搅拌）。
（2）完成步骤（1）后，进行超滤（截留分子量为3000Da），弃除滤液，剩余物进行真空冷冻干燥，得到的产物即为石墨烯量子点纳米酶。
2、石墨烯量子点纳米酶的表征
利用透射电子显微镜（TEM）观察步骤1制备的石墨烯量子点纳米酶的形态和大小，见图1的a。利用原子力显微镜（AFM）分析步骤1制备的石墨烯量子点纳米酶的高度及横向粒径，见图1的b。石墨烯量子点纳米酶尺寸均一、分散性良好、粒径约为5nm。
利用分光光度计法测量计算步骤1制备的石墨烯量子点纳米酶的酶动力参数。测试原理：H2O2的特异吸收峰在240nm，因此利用紫外分光光度计读取反应体系240nm的吸收值变化来直接定量地测定H2O2。测试原理：向500μL含60mM H2O2的PBS缓冲液（pH7.2）中加入石墨烯量子点纳米酶并使其浓度为0.05mg/mL，立刻用移液枪轻轻吹打混匀，然后迅速置于紫外可见分光光度计中检测240nm下的光吸收值变化；扫描时间为180s，扫描的时间间隔为0.1s，反应温度为37ºC。结果见图2。结果表明，其与H2O2的反应动力学曲线符合米氏方程。
利用电子顺磁共振（ESR）检测步骤1制备的石墨烯量子点纳米酶催化产生羟基自由基的能力。测试方法（200μL的反应体系）：PBS缓冲液（pH7.2）中，加入H2O2、DMPO和石墨烯量子点纳米酶（H2O2在体系中的浓度为100mM ，DMPO在体系中的浓度为100mM，石墨烯量子点纳米酶在体系中的浓度为0.05mg/mL）并充分混匀，然后迅速吸入毛细管中，在室温下用紫外灯照射10min，然后用Burker ER300E检测电子自旋信号（检测条件为微波功率15.89mW，调制幅度为3.081G扫描范围为100G，调制频率为100kHz，中心场强为3485G）。结果见图3。结果表明，其具备催化H2O2，产生高细胞毒性的•OH的能力。
二、Efaproxiral纳米酶的制备
肿瘤乏氧,亦即实体肿瘤供氧不足,在实体瘤中是一个非常常见的现象。乏氧抑制剂即可以抑制肿瘤乏氧的物质。Efaproxiral 是一种血红蛋白 (Hb)合成变构调节剂，能够降低血红蛋白对氧（O2）的亲和力，促进O2释放，可作为乏氧抑制剂。Efaproxiral（RSR13）：MedChemExpress公司，CAS号为131179-95-8。
通过缩醛键（响应微酸性环境），将Efaproxiral偶联于石墨烯量子点纳米酶表面，得到表面偶联Efaproxiral的石墨烯量子点纳米酶，简称Efaproxiral纳米酶。具体步骤：取1mg步骤一的1制备的石墨烯量子点纳米酶，用2mL PBS缓冲液（pH7.2）重悬，然后加入20μgEDC和10μg Efaproxiral，室温下磁力搅拌反应2h，然后100000g离心10min，收集沉淀，然后用去离子水洗涤沉淀3次（每次洗涤均为：用去离子水悬浮沉淀，然后100000g离心10min，收集沉淀），然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为Efaproxiral纳米酶。
三、外泌体的提取
1、诱导MO型巨噬细胞极化形成M1型巨噬细胞
第一组：取J774A.1细胞（小鼠单核巨噬细胞），在含有100ng/mL LPS和100ng/mLIFN-γ的DMEM培养基中培养24h。
第二组：取J774A.1细胞（小鼠单核巨噬细胞），在含有100ng/mL IFN-γ的DMEM培养基中培养24h。
第三组（Control组）：取J774A.1细胞（小鼠单核巨噬细胞），在DMEM培养基中培养24h。
2、提取外泌体
（1）完成步骤1后，取上清液，2000×g离心10min，取上清液。
（2）取步骤（1）得到的上清液，10000×g离心30min，取上清液。
（3）取步骤（2）得到的上清液，140000×g离心90min，收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为即为外泌体。
3、表征
Western Blotting 检测外泌体表面是否具有M1型巨噬细胞标志物iNOS。取步骤2制备的外泌体，用PBS缓冲液（pH7.2）重悬，然后进行Western Blotting。采用的一抗为iNOSAntibody，Mouse Specific（Abcam公司，货号为2982)，采用的二抗为Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody （Abcam公司，货号为7074）。结果见图4的c。第一组处理得到的外泌体，表面检测到M1型巨噬细胞标志物iNOS，第一组处理得到的外泌体为M1外泌体。M1外泌体用M1 Exo表示。
利用透射电子显微镜（TEM）观察M1外泌体的形态和大小，见图4的a。利用动态光散射粒度仪分析M1外泌体的水合粒径和分散性，见图4的b。M1外泌体粒径约为80nm。
4、检测M1外泌体膜表面天然的NADPH氧化酶2的含量与酶活性。
将M1外泌体分别放置于氮气饱和（N2）、氧气饱和（O2）、空气饱和（air）三种不同的缓冲液中，检测M1外泌体表面NOX2酶催化O2-的产量。
检测方法：诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)，通过检测电子自旋共振（electron spin-resonance spectroscopy，ESR）信号，检测O2-的产量。
超氧阴离子试剂盒：超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，根据A530值可以计算样品中O2－含量。超氧阴离子检测试剂盒：品牌Millipore Sigma，货号CS1000。
缓冲液为PBS缓冲液（pH7.2）。
结果见图5。M1外泌体表面NOX2酶催化氧气产生超氧化物阴离子（O2-），并且产量与氧气浓度成正比。
四、纳米酶级联生物反应器的制备
由于外泌体表面具有CD63，所以可以借助CD63抗体耦联Efaproxiral纳米酶，从而将Efaproxiral纳米酶连接在M1外泌体表面。
1、CD63抗体-Efaproxiral-纳米酶的制备
CD63抗体（Anti-CD63 antibody）：Abcam公司，货号ab271286。
在EDC和NHS活化作用下，Efaproxiral纳米酶表面游离的羧基与CD63抗体的游离氨基通过形成酰胺键耦联在一起，得到表面偶联CD63抗体的Efaproxiral纳米酶，简称CD63抗体-Efaproxiral-纳米酶。
具体步骤：将10mg步骤二制备的Efaproxiral纳米酶悬浮于5mL pH6.5的PBS缓冲液，然后转移至反应瓶中，加入10mg EDC和4mg NHS；将反应瓶置于磁力搅拌器上室温反应15-30min以活化；活化完成后，向所述反应瓶中加入5μL CD63抗体（抗体含量为2.5μg），室温反应6h；然后14000rpm离心6min，弃除上清；然后用蒸馏水洗涤三次（每次洗涤均为：加入蒸馏水，充分振荡，然后14000rpm离心6min，弃除上清），收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为CD63抗体-Efaproxiral-纳米酶。
2、制备纳米酶级联生物反应器
通过CD63抗体识别M1外泌体表面特征分子CD63，将CD63-Efaproxiral-纳米酶修饰在M1外泌体表面，得到纳米酶级联生物反应器（用MEGR表示）。
具体步骤：在5mL PBS缓冲液（pH7.2）中，加入10mg步骤1制备的CD63抗体-Efaproxiral-纳米酶和10mg步骤三制备的M1外泌体，室温反应8-12小时；然后14000rpm离心6min，弃除上清；然后用蒸馏水洗涤三次（每次洗涤均为：加入蒸馏水，充分振荡，然后14000rpm离心6min，弃除上清），收集沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥，得到的产物即为纳米酶级联生物反应器。
3、表征
利用动态光散射粒度仪（DLS）分析步骤2制备的纳米酶级联生物反应器的水合粒径和分散性。MEGR的粒径大小约为100nm。
实施例2、MEGR在肿瘤组织部位富集
取实施例1制备的纳米酶级联生物反应器，采用荧光染料Cy7进行标记，然后用蒸馏水洗涤，然后进行冷冻干燥，得到的产物即为具有Cy7标记的纳米酶级联生物反应器，用Cy7-MEGR表示。
取正常雌性BALB/c 小鼠（6周左右，18～20g），皮下接种CNE-2细胞（接种部位为右后腿上方）。每只小鼠的接种量为1×106个CNE-2细胞（体积为100μL，用pH7.2的PBS缓冲液重悬）。接种10天后，可肉眼观察到肿瘤，即为小鼠肿瘤模型。
试验组：小鼠肿瘤模型，尾静脉注射Cy7-MEGR，每2天注射一次（单次剂量为0.3mg Cy7-MEGR/kg体重，体积为100μL，用pH7.2的PBS缓冲液重悬），注射4次。
对照组：小鼠肿瘤模型，尾静脉注射含荧光染料Cy7的PBS缓冲液，每2天注射一次（体积为100μL），注射4次。
设置正常雌性BALB/c 小鼠，不进行任何处理，作为正常对照。
完成第4次注射的第二天，进行活体成像。
可以观察到，与对照组小鼠相比，试验组小鼠的Cy7-MEGR集中富集于肿瘤部分。
示例性的结果见图6。
实施例3、MEGR抑制肿瘤生长的疗效
1、制备小鼠肿瘤模型
取正常雌性BALB/c 小鼠（6周左右，18～20g），皮下接种CNE-2细胞（接种部位为右后腿上方）。每只小鼠的接种量为1×106个CNE-2细胞（体积为100μL，用pH7.2的PBS缓冲液重悬）。接种10天后，选择肿瘤体积约200 mm3的小鼠，即为小鼠肿瘤模型。
2、给药以及效果评价
小鼠肿瘤模型，分成2组，每组8只。
试验组（MEGR组）：尾静脉注射实施例1制备的纳米酶级联生物反应器，每2天注射一次（单次剂量为0.3mg纳米酶级联生物反应器/kg体重，体积为100μL，用pH7.2的PBS缓冲液重悬，注射8次。
对照组（Control组）：注射PBS缓冲液，每2天注射一次（体积为100μL），注射8次。
第一次注射前作为试验第0天，测量肿瘤体积，作为参比体积。
每2天测量肿瘤体积，减去参比体积，作为相对体积。
肿瘤体积V=L×W2/2；L，肿瘤的长；W，肿瘤的宽。
肿瘤的相对体积变化曲线见图7。与对照组相比，试验组小鼠的肿瘤体积显著变小，纳米酶级联生物反应器展示出良好的抑瘤效果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (4)

1.一种纳米酶级联生物反应器，为将物质甲连接在物质乙表面得到的复合物；
所述物质甲为偶联有CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶；偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶表面游离的羧基与CD63抗体的游离氨基通过形成酰胺键耦联在一起，得到所述物质甲；通过缩醛键，将乏氧抑制剂偶联于碳点纳米酶表面，得到偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶；所述碳点纳米酶为石墨烯量子点纳米酶；所述乏氧抑制剂为Efaproxiral；
所述外泌体为巨噬细胞来源的外泌体，表面具有CD63抗原；所述巨噬细胞为M1型巨噬细胞，是诱导MO型巨噬细胞极化形成的；
所述物质甲和所述物质乙通过CD63抗体和CD63抗原的特异性结合实现所述连接。
2.一种纳米酶级联生物反应器的制备方法，包括如下步骤：
（1）通过缩醛键，将乏氧抑制剂偶联于碳点纳米酶表面，得到偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶；所述碳点纳米酶为石墨烯量子点纳米酶；所述乏氧抑制剂为Efaproxiral；
（2）偶联有乏氧抑制剂的碳点纳米酶表面游离的羧基与CD63抗体的游离氨基通过形成酰胺键耦联在一起，得到偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶；
（3）通过CD63抗体和CD63抗原的特异性结合，将偶联CD63抗体和乏氧抑制剂的碳点纳米酶连接在外泌体表面，得到纳米酶级联生物反应器；所述外泌体为巨噬细胞来源的外泌体，表面具有CD63抗原；所述巨噬细胞为M1型巨噬细胞，是诱导MO型巨噬细胞极化形成的。
3.权利要求1所述纳米酶级联生物反应器在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
4.一种用于治疗肿瘤的药物，包括权利要求1所述纳米酶级联生物反应器。
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