CN115028159A - 一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳点及其制备方法和用途 - Google Patents

一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳点及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳点及其制备方法和用途，属于生物医药技术领域。本发明纳米碳量子点是由如下重量配比的原料制备而成：色氨酸0.1～1份、六水三氯化铁1～10份、邻苯二胺1～10份。本发明还提供了利用该纳米碳量子点制备得到的偶联物。本发明制备得到的ICDs具有过氧化物模拟酶活性。利用ICDs偶联GOD和Trf获得的IGTCDs具有靶向大脑、葡萄糖氧化酶活性、橙色荧光发射、低毒、生物相容性良好等适于体内应用、分析的性质。IGTCDs可有效抑制肿瘤代谢和增殖，用于肿瘤治疗。本发明验证了基于TME的抗肿瘤治疗的可行性，介绍了碳点在肿瘤治疗中的新应用思路。

Description

一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳点及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳点及其制备方法和用途。
背景技术
恶性肿瘤逐渐成为危及人类健康的一大重要隐患，如今，肿瘤发病率愈加增高，其存在的易转移、预后差、常用治疗手段对人体存在较大危害等问题都限制着肿瘤治疗的安全有效性。例如，乳腺癌是一类由乳腺上皮细胞增殖失控引发的疾病，占女性癌症发病的24.2％，目前针对乳腺癌的治疗手段较为成熟，多采用手术切除的方式，但也有转移、复发的潜在风险；胶质细胞瘤这类原发性脑瘤存在治愈率低、预后差、生存期短的特点，临床常采用的手术伴随放、化疗手段始终无法革除肿瘤浸润性生长的危害，且易造成机体毒副反应，缺乏更安全合理的治疗方式，需开创新颖有效的治疗思路及治疗方式。
纳米药物在肿瘤治疗中已有较为成熟的研究应用，除包载药物、经系列修饰实现患处释药等应用外，某些具光热、光动力催化效应的纳米材料也被用于肿瘤治疗的相关研究，但其在临床上的应用受到一定的限制。基于肿瘤微环境(TME)的靶向释药逐渐成为肿瘤治疗的热点，肿瘤部位与正常组织的微环境代谢存在差异，常表现为组织内部乏氧、间质高压及高炎症反应等。高活性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶使肿瘤组织的葡萄糖主要经糖酵解这一旁路代谢供能，产生葡萄糖高摄取及乳酸堆积的Warburg效应，呈微酸性环境(pH＝6.5～6.8)。可利用TME微酸、高葡萄糖浓度的特征，实现组织内部药物释放或固有物质特异性转化，提高治疗选择性，进一步增强疗效，降低毒副作用。
已有基于TME微酸性环境特点开发的多种抗肿瘤纳米疗法，通过构建pH敏感的纳米载体，实现肿瘤追踪成像、诊断及治疗。诸如铁磁性纳米颗粒(γ-Fe2O3或四氧化三铁NPs)、非晶态FeO纳米颗粒(AFeNPs)这类铁掺杂纳米材料，可作为催化剂催化分解肿瘤靶点高代谢的葡萄糖，利用微酸环境发生类芬顿反应。以实现肿瘤患处的内源性葡萄糖酶解转化，过氧化氢分解及毒性羟自由基的催化释放，诱导癌细胞的凋亡，产生肿瘤抑制效果，这类基于纳米酶作用的肿瘤治疗相关研究逐渐成为热点。
纳米酶，即具某种天然酶活性的纳米材料，其在贮存条件、合成成本等方面较天然酶具有一定优势，在生物医学、化学分析、疾病诊疗等方面均有广泛应用。常见的纳米模拟酶有过氧化物、过氧化氢、氧化物模拟酶等活性。此类模拟酶因存在提纯难、成本高、贮存条件要求高、稳定性差等缺陷限制了应用。碳量子点这类优良的荧光纳米材料，在理化检测、药物递送等方面均有相关研究，并利用其存在的低毒、易修饰等特性在体内成像及疾病治疗等方面也有广泛应用。此外，碳量子点还具有易于合成、性质稳定的特点。铁掺杂碳量子点作为一类常见的过氧化物酶，联合TMB-H2O2模型可实现对过氧化氢的检测；联合葡萄糖氧化酶，可实现对葡萄糖的定量检测，产生的蓝绿色氧化态TMB与还原性物质反应又会使体系褪色，因此，亦可用于生物胺、谷胱甘肽等还原性物质的检测。
若此类模拟酶的葡萄糖酶解、过氧化氢分解及毒性羟自由基催化释放能力可于体内肿瘤患处发挥靶向性作用，则可实现肿瘤部位内源性物质转化，增强抗肿瘤作用的特异性，降低毒副作用同时具有理想抑瘤率。传统将碳量子点作为过氧化物酶，多应用于物质的分析检测，未有将具过氧化物酶活性碳量子点用于针对肿瘤微环境的抑瘤效果考察。
此外，与传统纳米材料相比，部分荧光碳点除成像优势外兼具肿瘤靶向功能，亦可经修饰GRD肽、HA、转铁蛋白等肿瘤穿透肽或肿瘤标志物配体进一步增强选择性和BBB穿透能力，这类集成像、靶向功能一体的纳米材料在疾病治疗中具有重要意义。若同时兼具治疗功能，这类稳定、高效、安全的多功能材料在肿瘤医学中将具更大研究价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳点及其制备方法和用途。该纳米碳点可用于过氧化氢、葡萄糖的体外检测，亦兼具成像、治疗及肿瘤靶向功能。
本发明提供了一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳量子点，它是由如下重量配比的原料制备而成：色氨酸0.1～1份、六水三氯化铁1～10份、邻苯二胺1～10份。
进一步地，所述色氨酸和邻苯二胺的摩尔比为1:4。
进一步地，前述的纳米碳量子点是由如下重量配比的原料制备而成：色氨酸0.5份、六水三氯化铁8份、邻苯二胺1.08份。
本发明还提供了前述的纳米碳量子点的制备方法，它包括如下步骤：
(1)将色氨酸、六水三氯化铁和邻苯二胺加入溶剂中，超声分散均匀后，加热反应；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，将滤液透析、干燥，即得；
优选地，
步骤(1)中，所述溶剂为水和浓盐酸混合溶液，所述水和浓盐酸的体积比为(10～20)：1；
和/或，步骤(1)中，所述反应的温度为180～250℃；
和/或，步骤(1)中，所述反应的时间为2～5小时；
和/或，步骤(2)中，所述透析时透析袋的截留分子量为500Da；
和/或，步骤(2)中，所述干燥为冻干；
更优选地，
步骤(1)中，所述水和浓盐酸的体积比为20：1；
和/或，步骤(1)中，所述浓盐酸与色氨酸的体积质量比为10mL：1g；
和/或，步骤(1)中，所述反应的温度为200℃；
和/或，步骤(1)中，所述反应的时间为3小时。
本发明还提供了前述的纳米碳量子点作为氧化物模拟酶中的用途。
本发明还提供了前述的纳米碳量子点在检测葡萄糖中的用途。
本发明还提供了一种纳米碳量子点偶联物，它是由如下重量配比的原料制备而成：前述的纳米碳量子点10～20份、葡萄糖氧化酶5～10份、转铁蛋白1～5份。
进一步地，前述的纳米碳量子点与葡萄糖氧化酶的质量比为2:1；和/或，前述的纳米碳量子点与转铁蛋白的质量比为9:1；
优选地，所述的纳米碳量子点偶联物是由如下重量配比的原料制备而成：前述的纳米碳量子点18份、葡萄糖氧化酶9份、转铁蛋白1份。
本发明还提供了前述的纳米碳量子点偶联物的制备方法，它包括如下步骤：
1)将前述的纳米碳量子点溶于水中，并加入葡萄糖氧化酶；
2)将转铁蛋白、EDC和NHS溶于溶剂中，超声处理，活化转铁蛋白表面羟基；
3)将步骤2)得到的溶液加入步骤1)中，搅拌、透析、干燥，即得；
优选地，
步骤1)中，加入葡萄糖氧化酶后搅拌过夜；
和/或，步骤2)中，所述溶剂为PBS；
和/或，步骤2)中，所述超声处理时间为1～3h；
和/或，步骤3)中，所述搅拌时间为12～24h；
和/或，步骤3)中，所述透析使用超纯水透析；
和/或，步骤3)中，所述透析时透析袋的截留分子量为500Da；
和/或，步骤3)中，所述干燥为冻干。
本发明还提供了前述的纳米碳量子点偶联物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的优势为：
本发明采用水热法合成的ICDs表面具有丰富的官能团，易于改性。偶联GOD和Trf获得IGTCDs，具有靶向大脑、葡萄糖氧化酶活性、橙色荧光发射、低毒、生物相容性良好等适于体内应用、分析的性质。IGTCDs可靶向大脑并利用肿瘤微环境(TME)酸性特征及代谢葡萄糖依赖特点启动一系列葡萄糖酶解、过氧化氢分解、ROS(·OH)释放的级联反应，消耗瘤部葡萄糖肿位，削弱糖酵解，同时羟自由基可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤代谢和增殖，进而实现脑胶质瘤的靶向治疗。
IGTCDs合成简便，工艺稳定，表现出良好的过氧化物酶活性和生物相容性。具有较高的细胞亲和力和良好的脑靶向功能，其橙色荧光发射促进了细胞摄取和生物成像。在肿瘤治疗中具理想抑瘤率，对于乳腺癌，抑瘤率达36.7～69.9％；用于脑胶质瘤治疗时，其抑瘤率可达41.45～98.32％，均具有良好的肿瘤抑制效果。IGTCDs实现了靶向、治疗和成像功能的一体化，同时，验证了基于TME的抗肿瘤治疗的可行性，介绍了碳点在肿瘤治疗中的新应用思路。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为碳量子点ICDs的合成流程。
图2为IGTCDs的合成过程。
图3为ICDs的荧光光谱；右上角内嵌图为日光和紫外光下ICDs溶液的观测情况。
图4为ICDs的TEM图；右上角内嵌图为ICDs的粒径分布图。
图5为ICDs的紫外光谱图。
图6为ICDs的Zeta电位表征。
图7为ICDs的红外光谱图。
图8为ICDs的XPS图。
图9为紫外照射时间对ICDs荧光强度的干扰。
图10为自然存放时间对ICDs荧光强度的干扰。
图11为体系盐浓度对ICDs荧光强度的干扰。
图12为体系pH对ICDs荧光强度的干扰。
图13为L-B定律及Michaelis-Menten动力学方程。
图14为H2O2和TMB为底物时，ICDs酶催化动力学分析；a为TMB的C-V0图；b为TMB双倒数图；c为H2O2的C-V0图；d为H2O2双倒数图。
图15为ICDs催化反应过程的OD625变化情况；图中箭头方向为曲线变化过程，最低为0min，最高处为30min时的吸光曲线，间隔2min测定，选取过程中部分曲线显示其变化过程。
图16为ICDs不同比例偶联GOD的酶促反应相对速率。
图17为不同Trf偶联量的C6细胞摄取图及不同偶联比例IGTCDs的相对反应速率。
图18为IGTCDs的荧光光谱；右上角内嵌图为紫外光和日光下IGTCDs溶液的观测情况。
图19为IGTCDs的TEM图；右上角内嵌图为IGTCDs的粒径分布图。
图20为IGTCDs的DLS分析图；a为不同溶液体系；b为不同时间。
图21为IGTCDs的红外光谱图。
图22为IGTCDs的XPS图谱。
图23为IGTCDs的紫外光谱图。
图24为IGTCDs催化反应前1200s内的OD652变化。
图25为IGTCDs的体外催化性能考察结果：a为IGTCDs催化葡萄糖分解的酶动力学结果；b为双倒数作图结果。
图26为IGTCDs-TMB模型反应的吸光度变化。
图27为DCFH-DA荧光探针检测·OH荧光光谱变化图。
图28为IGTCDs的细胞毒性与不同pH下的C6细胞凋亡效应；a为L929细胞与不同浓度IGTCDs共孵育24h后的存活率；b为C6细胞与不同浓度IGTCDs分别在pH6.0、7.4下共孵育24h后的存活率；c为C6细胞与不同浓度IGTCDs在pH6.0下分别共孵育12、24、36h后的存活率；d为C6细胞与300μg·ml-1IGTCDs在pH6.0下分别共孵育12、24、36h后的存活率。
图29为LSCM观测不同pH IGTCDs的羟自由基释放结果。
图30为.IGTCDs、ICDs的LSCM荧光成像观测。
图31为不同浓度IGTCDs羟自由基释放考察。
图32为IGTCDs不同孵育时间的羟自由基释放考察。
图33为治疗期各组小鼠体质量变化。
图34为治疗15天各静注组肿瘤相对体积变化曲线。
图35为治疗15天各瘤内注射组肿瘤相对体积变化曲线。
图36为15天后静注各组肿瘤形貌图。
图37为15天后瘤内注射各组肿瘤形貌图。
图38为15天后静注、瘤内注射各组肿瘤体积。
图39为给药2h内血糖浓度的变化。
图40为胶质瘤小鼠的模型建立。
图41为15天内空白组及治疗组小鼠的肿瘤信号强度。
图42为治疗过程第5、10、15天的肿瘤信号变化。
图43为治疗过程第10、15天的肿瘤生长速率。
图44为高、低剂量治疗组的肿瘤抑制率。
图45为偶联前后材料的组织成像对比。
图46为治疗10天各组小鼠的脑部IGTCDs荧光强度。
图47为对照组及治疗组小鼠组织的HE染色分析。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、碳量子点ICDs的制备
碳量子点ICDs的制备工艺见图1。称取0.05g色氨酸(Trp)、0.8g FeCl3·6H2O、0.108g邻苯二胺(OPD)，转入烧杯，加入500μl浓盐酸，10ml超纯水，超声分散均匀后转入反应釜聚四氟乙烯内衬中，于200℃加热反应3h后，冷却至室温，过滤得到棕色溶液，于透析袋(MWCO＝500Da)中超纯水透析12小时，冻干得到固体ICDs(铁掺杂碳量子点)，避光干燥保存备用。
实施例2、ICDs偶联产物IGTCDs的合成
IGTCDs的合成过程见图2。具体方法如下：
将20mg冻干所得ICDs粉末(实施例1制备)溶于2ml超纯水中，匀速搅拌，缓慢滴加500μl 20mg·ml-1的葡萄糖氧化酶(GOD)溶液(溶剂为PBS，pH＝7.4)，搅拌过夜；而后将1.7mg转铁蛋白(Trf)、4mg EDC及6mg NHS溶于500μl PBS(pH＝7.40)中，超声处理1h，活化转铁蛋白表面羧基，而后取250μl，将其缓慢滴入1ml上述ICDs-GOD溶液中，搅拌24h，超纯水透析10h(MWCO＝500Da)，冻干收集IGTCDs(葡萄糖氧化酶及转铁蛋白偶联的铁掺杂碳量子点)固体。密封避光存储于-20℃，以供后续使用。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
文中所述的差异分析采用多重比较的单因素方差分析(ANOVA)或t检验进行统计学分析，数据以平均±标准差(SD)表示，*p<为0.05，**p<为0.01，***p<为0.001。
试验例1、碳量子点ICDs性能测定
通过前期研究，发现并非任意铁掺杂碳量子点都具有良好的重复性以及稳定的荧光，且荧光易于区分生物背景。本发明前期研究发现：(1)以PEG400、柠檬酸为碳源，FeCl3·6H2O作为铁掺杂剂，水热法合成的铁掺杂碳量子点PICDs工艺重复性不佳，产物光学特性不稳定；(2)以甘氨酸为碳源，掺杂六水三氯化铁，水热法合成的碳量子点GICDs发蓝色荧光，不易于区分生物背景；(3)以槲皮素、甘氨酸为碳源，六水三氯化铁为金属掺杂，水热法合成的碳量子点GQCDs荧光量子产率低；(4)以PEI、甘氨酸为碳源，六水三氯化铁为金属掺杂，水热法合成的碳量子点UPCDs荧光强度低。这些碳量子点均无法作为本发明理想的碳量子点。
经过不断研究，本发明得到一种荧光量子产率高、性质稳定、合成方法重复性良好的碳量子点ICDs。碳量子点ICDs的制备方法如实施例1所述。
碳量子点ICDs荧光量子产率的测定：据量子产率稳定性及激发波长相近原则选用甲酚紫为参比物(λEx＝595nm)，经参比法于紫外分光光度计560nm处分别测定二者的OD值(需小于0.05)并扫描荧光光谱图，计算ICDs的荧光量子产率Yf(quantum yield ofFluorescence)。
按照实施例1所述合成方法，重复制备6份碳量子点ICDs，测定其荧光量子产率Yf及荧光发射λEx/λEm考察该合成工艺的稳定性，结果如表1。由表1可知：重复制备的6份碳量子点ICDs，其荧光激发、发射波长稳定，最佳激发、发射波长均为560/610nm，其荧光量子产率Yf在20.99～21.92％范围内，平均荧光量子产率为21.79％，RSD为1.84％，说明此工艺制得的碳点具较高荧光量子产率，性质稳定，合成方法重复性良好。
表1.ICDs制备工艺的重复性考察
Figure BDA0003698247620000071
试验例2、碳量子点ICDs的工艺研究
为得到高荧光量子产率、性质稳定、波长理想的目标碳点，对碳点制备工艺进行优化。对反应温度、时间、投料比、铁掺杂量进行筛选，考察不同条件下制得产物的荧光量子产率Yf及最佳荧光激发、发射波长(Ex/Em)。
1、反应投料比的筛选
首先对反应投料比进行筛选，以nTrp：nOPD(物质的量之比)＝1:3、1:4、1:5加入色氨酸和邻苯二胺(固定色氨酸为0.05g，改变邻苯二胺用量)，掺杂0.8g FeCl3·6H2O，加入500μl浓盐酸，10ml超纯水，超声分散后转于聚四氟乙烯内衬内，于反应釜中200℃下加热反应3h，冷却至室温，过滤得到棕色溶液。分别考察色氨酸、邻苯二胺按不同投料比反应时产物ICDs的量子产率Yf(％)及荧光发射λEx/λEm，结果如下表2。
表2.色氨酸和邻苯二胺不同投料比制备的产物的量子产率和荧光发射结果
Figure BDA0003698247620000081
由表2可知，随着邻苯二胺投料量的升高，其荧光激发、发射波长逐步红移，由蓝、绿特征荧光变为橙色荧光，荧光量子产率也有进一步的提高。但邻苯二胺过量时，量子产率下降，波长蓝移，说明碳点在此投料比下的荧光结构可能受到干扰。色氨酸和邻苯二胺以1:4物质的量之比投料反应时，发射波长最长，且具有最佳荧光量子产率，达21.92％。因此选择nTrp：nOPD＝1:4(物质的量之比)为反应最佳投料比。
2、盐酸加入量的筛选
以色氨酸、邻苯二胺按nTrp：nOPD＝1:4(物质的量之比)投料(色氨酸0.05g、邻苯二胺0.108g)，掺杂0.8g FeCl3·6H2O，分别加入200μl、500μl、800μl浓盐酸，10ml超纯水，超声分散后转于聚四氟乙烯内衬内，于反应釜中200℃下加热3h，冷却至室温，过滤得到棕色溶液。考察不同盐酸加入量时产物ICDs的量子产率Yf(％)及荧光发射λEx/λEm，结果如下表3。
表3.不同盐酸加入量制备的产物的量子产率和荧光发射结果
Figure BDA0003698247620000082
由表3可知，浓盐酸的加入量对反应产物的荧光性质存在一定影响，随着浓盐酸加入量的增加，产物荧光出现红移，但均具有较高量子产率。其中，在500μl浓盐酸添加量时，产物的发射波长最长，且荧光量子产率最高，达21.92％，因此选择500μl为盐酸加入最佳体积。
3、金属掺杂量的筛选
色氨酸、邻苯二胺按nTrp：nOPD＝1:4(物质的量之比)投料(色氨酸0.05g、邻苯二胺0.108g)，分别加入0.1g、0.5g、0.8g、1.0g、1.2g FeCl3·6H2O，加入500μl浓盐酸，10ml超纯水，超声分散后转于聚四氟乙烯内衬内，于反应釜中200℃下加热3h，冷却至室温，过滤得到棕色溶液。考察不同金属掺杂量下反应产物ICDs的荧光量子产率Yf(％)及荧光发射λEx/λEm，结果如下表4。
表4.不同金属掺杂量制备的产物的量子产率和荧光发射结果
Figure BDA0003698247620000091
由表4可知，不同金属掺杂量对碳点的荧光特征及量子产率也会有影响，在0.1～0.8g FeCl3·6H2O掺杂时，碳点的荧光均为λEx/λEm＝560/610nm，而荧光量子产率随着掺铁量的增加而升高，而当掺铁量超过0.8g，其荧光发射逐渐蓝移，降至λEx/λEm＝520/580nm，1.2g掺杂时荧光量子产率仅9.350％。0.8g FeCl3·6H2O掺杂时，反应产物的发射波长长，且荧光量子产率最为理想，因此选择FeCl3·6H2O掺杂量为0.8g。
4、反应温度的筛选
色氨酸、邻苯二胺按nTrp：nOPD＝1:4(物质的量之比)投料(色氨酸0.05g、邻苯二胺0.108g)，掺杂0.8g FeCl3·6H2O，加入500μl浓盐酸，10ml超纯水，超声分散后转于聚四氟乙烯内衬内，于反应釜中在180℃、200℃、220℃、250℃下分别加热3h，冷却至室温，过滤得到棕色溶液。考察不同反应温度下产物ICDs的荧光量子产率Yf(％)及荧光发射λEx/λEm，结果如下表5。
表5.不同反应温度制备的产物的量子产率和荧光发射结果
Figure BDA0003698247620000092
由表5可知，体系反应温度与产物的发射情况密切相关，180℃下的反应产物呈绿色荧光，量子产率仅为10.36％，说明此条件下的产物荧光性能不佳。而过度加热引起的碳源碳化过度，也会影响荧光特征，且过高温度下长时间加热，反应釜内衬易融化变形，影响合成的重复性。200℃下，产物的波长理想且具理想荧光量子产率。因此选择200℃为最佳反应温度。
5、反应时间的筛选
色氨酸、邻苯二胺按nTrp：nOPD＝1:4(物质的量之比)投料(色氨酸0.05g、邻苯二胺0.108g)，掺杂0.8g FeCl3·6H2O，加入500μl浓盐酸，10ml水，超声分散后转于聚四氟乙烯内衬内，于反应釜中200℃下分别加热2h、3h、4h、5h，冷却至室温，过滤得到棕色溶液。考察不同加热时间所得产物ICDs的荧光量子产率Yf(％)及荧光发射λEx/λEm，结果如下表6。
表6.不同反应时间制备的产物的量子产率和荧光发射结果
Figure BDA0003698247620000101
由表6可知，反应时间对产物量子产率具有一定影响，200℃下加热2～5h，产物发射波长均集中在550～610nm的较长波长范围内，但过长加热时间会使碳点的荧光量子产率下降，因此选择3h为最佳反应时间。
通过对ICDs的工艺筛选，确定了本发明制备碳量子点ICDs的最佳工艺条件为：色氨酸、邻苯二胺按nTrp：nOPD＝1:4(物质的量之比)投料(色氨酸0.05g、邻苯二胺0.108g)，掺杂0.8g FeCl3·6H2O，加入500μl浓盐酸，10ml水，超声分散后转于聚四氟乙烯内衬内，于反应釜中200℃下加热3h。制得的ICDs荧光量子产率Yf为21.92％，λEx/λEm＝560/610nm。
试验例3、碳量子点ICDs的表征
1、碳量子点ICDs的理化表征
对实施例1制备的ICDs进行荧光光谱扫描，测定其荧光最大激发、发射波长，并于紫外灯下观测其荧光情况；经TEM图表征其粒径分布及形态；经紫外光谱扫面判定其紫外吸收情况；测定Zeta电位表征ICDs的电荷性质；经红外光谱测定其结构；XPS测定铁掺杂是否成功，并分析其铁离子的存在形式。图3～图8为ICDs系列理化表征结果。
1.1荧光光谱分析
取一定浓度的ICDs溶液于荧光比色皿中，在荧光分光光度计-光谱扫描模式下进行检测。图3为ICDs的荧光光谱图，由图可见，当激发光λEx由550nm增加至560nm时，荧光强度增强，当激发光进一步增加至565nm，荧光强度下降明显，570nm激发时又有升高，λEx＝560nm的激发下的荧光强度最大。在此激发光变化过程中，荧光强度有所变化，但ICDs的发射峰位始终位于λEm＝610nm处，未见红移。由此得到ICDs的最佳激发、发射波长：λEx/λEm＝560/610nm，内嵌图中为ICDs溶液在日光和紫外灯下的观测情况，可见ICDs溶液在日光下呈棕色透明溶液，紫外灯照射下显橙色，说明ICDs具橙色荧光，与其610nm的荧光发射性质相符。
1.2 TEM粒径、形貌分析
将一滴一定浓度的ICDs溶液滴于铜网，晾干后于透射电子显微镜下(TEM，Transmission Electron Microscope)观测ICDs的形态，测定其粒径大小，并用“Image J”对ICDs的TEM图进行粒径分布分析。如图4，ICDs呈球形，分散均匀，如内嵌图所示，其粒径集中于10nm。由此可知，ICDs是一类分散均匀，粒径约10nm的球形粒子。
1.3紫外光谱分析
取一定浓度的ICDs溶液于石英比色皿中，于紫外分光光度计-光谱扫描模式下测定ICDs的紫外吸收情况。结果如图5，在此ICDs溶液紫外吸收图谱中，380nm、420nm处存在两个明显的紫外吸收峰，在450～500nm也存在一定吸收。其中，380nm的峰可能与ICDs含酮结构有关。且ICDs溶液呈黄棕色，说明其选择性吸收了白光中的蓝色或绿色，因此在450～500nm处有一定吸收。
1.4 Zeta电位分析
合成的碳量子点ICDs后续将用于体内研究，因此采用粒度分析仪对ICDs的电位进行表征。取一定浓度的ICDs溶液，置于电位皿内，粒度分析仪-Zeta电位测定模式下对ICDs溶液的电位分布进行测定，如图6，ICDs水溶液电位为3.58mV。表明ICDs带正电荷，可能与Fe3+、Fe2+的金属离子掺杂相关。
1.5红外光谱分析
对ICDs进行红外光谱扫描，表征其具有的官能团。除去H2O溶剂峰、空气背景峰后，将ICDs溶液滴于红外光谱仪点样处，洗耳球小心吹干，进行测定。ICDs的红外表征图谱如图7，可见其存在多个吸收峰，其中，3050.51cm-1、1460cm-1、1375cm-1处的吸收归于C-H伸缩振动，说明具芳环结构，可能与邻苯二胺的苯环结构或色氨酸的吲哚结构有关；1411.74cm-1的O-H吸收及1219.80cm-1处的C-O吸收证明可能存在醇羟基；1643.12cm-1处的C＝O吸收及3050.51cm-1、3184.6cm-1处存在的与C-H重叠的多个羟基宽峰吸收表明具羧基结构；3405.68cm-1处的单峰吸收表明ICDs具氨基，可能与色氨酸结构含有氨基、羧基相关。由此可知，ICDs表面官能团丰富，具有羟基、羧基、氨基及芳环结构。其表面丰富的官能团是后续改性修饰的基础。
1.6 X-射线光电子能谱分析
于ICDs中掺杂铁，是赋予其过氧化物酶活性的基础。为确定ICDs中的金属掺杂是否成功，将透析、冻干所得的ICDs固体粉末研磨细腻、均匀后，于X-射线光电子能谱分析仪分析其组成。其XPS表征结果如图8，对ICDs的Fe 2p分峰，可见其于712、725eV处存在较强吸收，可知ICDs结构中的Fe元素主要以Fe3+、Fe2+形式存在。
综上所述，经荧光、紫外、红外光谱、XPS、TEM、Zeta电位等系列表征，可知合成的ICDs经紫外照射呈橙光发射；掺杂的铁主要以Fe3+、Fe2+形式存在；表面官能团丰富，存在羟基、羧基、氨基，具芳环结构；粒径集中于10nm，Zeta电位为3.58mV；可通过活化表面羟基、羧基对其粒径、电位进行一定修饰或偶联以满足后续用于体内的要求。
2、碳量子点ICDs的质控分析
ICDs稳定的理化性质，是后续实验及实际运用的基础条件。因此，本发明从紫外照射时间、自然存放时间、体系盐浓度、pH值及常见的细胞共存物五方面对实施例1制备的ICDs抗环境干扰能力进行评估，对ICDs进行质控分析，结果如图9～12及表7。
2.1紫外照射时间
于96孔板内加入200μl ICDs溶液(ICDs的浓度为500μg·ml-1，溶剂为超纯水)，放置于365nm紫外灯下照射，间隔2～4h分别于不同孔加入同管样液200μl，每孔重复三次，24h后于酶标仪λEx/λEm＝560/610nm处测定各孔荧光强度，即ICDs在0、2、4、8、12、16、20、24h紫外灯照射后的荧光值。根据ICDs在24h内紫外照射下的荧光强度，评估ICDs这类荧光物质抗紫外照射干扰的能力，结果如图9。
紫外照射24h内，ICDs荧光强度总体略有下降，12h的紫外照射对ICDs的荧光几乎无明显影响，12～16h荧光略有下降，16h后则趋于稳定，但仍有较强的荧光值。说明ICDs的抗紫外照射干扰能力良好，光稳定性较好，短时间的紫外照射对碳点的荧光不会产生明显影响，但为保证应用种良好的荧光性能，也应避光贮存。
2.2自然存放时间
将500μg·ml-1ICDs溶液及10mg冻干所得的固体粉末于室内环境密封避光放置，于不同时间测定其各自的荧光强度，考察自然存放时间对碳点荧光强度的影响，分析碳量子点固、液态储存的差异，以得最佳保存条件。ICDs固体测定前均等量稀释，制成等浓度溶液。分别于第0、2、3、5、7、10、20、30天于96孔板内各加入200μl 500μg·ml-1ICDs溶液或等浓度的固体稀释液，于酶标仪λEx/λEm＝560/610nm处测定各孔荧光强度，以测定30天内二者荧光强度的变化，评估ICDs自然存放条件的稳定性。
结果如图10，固态储存的ICDs荧光强度较ICDs溶液明显更稳定。室温放置15天时，溶液态ICDs的荧光强度有所下降，20～30天逐渐趋于稳定。为考察其保存状态对荧光稳定性的干扰情况，以筛选最佳碳点保存条件，将冻干样品以固态贮存，临用时定量溶解，其荧光强度在30天内未见明显下降。因此，合成的ICDs产物应及时冻干，避光密封贮存，临用时定量稀释，以保证应用中ICDs稳定良好的光学性质，具最佳荧光发射。
2.3体系盐浓度
NaCl为细胞、体内常见的溶液体系，为保证ICDs的体内应用，对其在不同浓度氯化钠溶液中的荧光强度进行测定，考察盐浓度对其荧光性质的影响。移取1ml 500μg·ml- 1ICDs储备液于10ml容量瓶中，依次用WNaCl＝0.11％、0.33％、0.55％、0.77％、0.99％、1.11％、1.33％、1.55％不同浓度的氯化钠溶液定容。分别移取各样液200μl于96孔板中，于酶标仪λEx/λEm＝560/610nm处测定各孔荧光强度。以测定不同体系盐浓度条件下(WNaCl＝0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5％)，体系的荧光强度，考察ICDs在NaCl溶液中的稳定性。
如图11，ICDs荧光强度在不同NaCl浓度的体系中(WNaCl＝0.1～1.3)基本稳定，荧光未猝灭，可知生理状态下的盐浓度(WNaCl＝0.9％)对ICDs的荧光基本无干扰，即使在WNaCl＝1.5的盐浓度体系中，ICDs仍具良好的荧光性质。
2.4体系pH值
移取1ml 500μg·ml-1ICDs储备液于10ml容量瓶中，分别用不同pH值(2～10)的磷酸盐缓冲液(PBS)定容，分别移取各样液200μl于96孔板中，于酶标仪λEx/λEm＝560/610nm处测定各孔荧光强度，评估ICDs的pH稳定性。
如图12，ICDs的荧光强度受pH干扰较大，自荧光在强酸条件下受抑制，pH＜4.5时，ICDs的荧光随着pH降低而减弱，在pH＝5～7时基本稳定，此时ICDs具有较强荧光，而后随着体系碱性增强，其荧光又会受到抑制。这可能与ICDs的结构及其表面官能团相关，不同pH条件可能会影响碳点的表面，对其表面缺陷的发光机制产生影响，但实验中所涉及的常用pH环境中，ICDs的荧光强度良好且稳定。
2.5常见细胞共存物
移取1ml 25μg·ml-1ICDs储备液于5ml容量瓶中，分别用一定浓度各类常见细胞共存物K+、Ca2+、Zn2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Na+、Ni+、Co2+、Mg2+、葡萄糖、果糖、乳糖、甘氨酸、蔗糖、色氨酸溶液定容，吸取200μl加入96孔板中，于酶标仪测定λEx/λEm＝560/610nm处各孔的荧光强度，考察ICDs荧光强度受生物体内常见共存物质的影响情况，结果如表7。
表7.常见细胞共存物对ICDs荧光强度的影响
Figure BDA0003698247620000141
注：ICDs浓度为5μg·ml-1。
由表7共存物质干扰结果可知，体系共存0.1倍于ICDs浓度的Cr3+、1倍于ICDs浓度的Cu2+、Fe3+，10倍于ICDs浓度的Na+、Ni+，100倍于ICDs浓度的K+、Ca2+、Zn2+、Co2+、蔗糖、色氨酸，200倍于ICDs浓度的Mg2+、葡萄糖、果糖、乳糖、甘氨酸时，体系与水溶液中等量浓度的ICDs荧光强度间偏差≤±5％，可知上述浓度的物质对ICDs的荧光强度几乎无干扰。综上，ICDs的光稳定性良好，受紫外照射、盐浓度、常见细胞共存物的干扰小，是一类优良的荧光发射材料。
本部分对ICDs从紫外照射时间、自然存放时间、体系盐浓度、pH及常见细胞共存物五个方面对ICDs进行质量控制研究，评估其理化性质及光学稳定性。可知，ICDs抗紫外照射干扰能力强，在照射24h内能维持较稳定的荧光；固态在室温下储存30天稳定性良好，荧光衰减小；在WNaCl＝0.1～1.3％、pH 5～7的体系中均有良好、稳定的荧光；且常见的细胞共存物对其荧光几乎无影响。
试验例4、碳量子点ICDs催化功能的评价
以H2O2-TMB显色反应为模型，考察所得目标碳点ICDs(实施例1制备)的过氧化物模拟酶性质。
1、ICDs过氧化物酶活性测定
1.1溶液配制
系列pH的10mM醋酸-醋酸钠缓冲液：精密称定0.385g醋酸铵，溶解转移至500ml容量瓶中，超纯水定容，后用乙酸调节，pH计测定，得到pH 3.0～7.0的系列醋酸-醋酸钠缓冲液，备用于后续最适酶促条件的筛选。
ICDs储备液的配制：称取25mg ICDs固体粉末(实施例1制备)，溶解后用超纯水于5ml容量瓶定容，得5mg·ml-1ICDs溶液，移液枪移取250μl上述溶液至25ml容量瓶中，超纯水定容以得0.05mg·ml-1ICDs溶液，作为ICDs储备液备用。
系列浓度ICDs溶液的配制：10ml移液管依次精密移取3.0、4.0、4.5、5.5、6.0ml0.05mg·ml-1ICDs储备液至10ml容量瓶中，超纯水定容，得到0.030～0.060mg·ml-1的ICDs溶液，备用于碳点浓度条件筛选。
过氧化氢储备液的配制：移液枪取77μl 30％H2O2于10ml容量瓶中，超纯水定容，摇匀，移液管精密移取2.0ml于10ml容量瓶中，超纯水稀释定容，得到15.4mM H2O2溶液，作为储备液备用。
梯度浓度过氧化氢溶液的配制：10ml移液管分别精密移取2.0、3.0、4.5、6.0、6.5ml 15.4mM H2O2储备液于10ml容量瓶中，超纯水稀释定容，得到0.088～0.286mM的H2O2溶液，备用于过氧化氢的检测和酶促动力学分析。
3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺(TMB)储备液的配制：精密称定0.012g TMB，乙醇溶解，于10ml棕色容量瓶定容，摇匀，避光保存，制得5mM TMB乙醇溶液，作为储备液备用。
系列浓度TMB乙醇溶液的配制：移液管分别精密移取0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.0ml 5mM TMB储备液于10ml容量瓶中，得到0.125～2mM TMB乙醇溶液，备用于TMB酶促动力学分析。
1.2过氧化物酶活性测定
过氧化物酶活性测定方法为：于5ml EP管中依次加入3mL 10mM醋酸-醋酸钠缓冲液、100μl的ICDs溶液、100μl H2O2、200μl TMB溶液(以H2O2为催化底物时，加入0.15mM H2O2，加入不同浓度的TMB为反应物；以TMB为催化底物时，加入2mM TMB，加入不同浓度的H2O2为反应物)，混合均匀，后于一定温度的恒温水浴锅中孵育5分钟，立即于紫外分光光度计时间扫描模式下测定体系在λ＝652nm处的OD值变化曲线，前180s内曲线斜率即为反应初速度V0，经Michaelis-Menten动力学方程公式计算催化反应的Km及Vmax。
经过研究发现本发明制备的ICDs作为模拟酶的最适酶促反应条件为：醋酸-醋酸钠缓冲液pH＝4.0、ICDs浓度为0.05mM、孵育温度为45℃。
在最适酶促反应条件下，分别以0.15mM H2O2、2mM TMB为固定浓度的催化底物，分别各加入配制的0.088～0.286mM H2O2、0.125-2mM TMB，按上述过氧化物酶活性测定方法测定反应初速度V0，计算酶促反应的Km与Vmax，分别测定以TMB、H2O2为底物时ICDs的过氧化物模拟酶活性。基于TMB-H2O2比色反应对ICDs酶活性进行动力学分析，分别以固定浓度的过氧化氢(0.15mM)、TMB(2mM)为反应底物，测定加入不同浓度反应物时的酶促动力学曲线，反应遵循Michaelis-Menten动力学方程(如图13所示)：v0＝Vmax·[s]/(KM+[s])，v0为反应初速度、Vmax为最大反应速率、KM为米氏常数、[S]为底物浓度。
根据朗伯-比尔定律，将平均初始吸光度变化转化为羟基自由基形成的初始速度(V0)，与反应物浓度绘制曲线，用米氏方程拟合，经线性双倒数图分别计算ICDs对H2O2及TMB的KM与Vmax。
结果如图14a，以0.15mM H2O2为底物时，测得ICDs催化0.125～2mM范围内TMB的酶促反应过程(图14a中TMB浓度为体系中的TMB终浓度，计算方法为加入浓度*200/3400＝0.007-0.117mM)，双倒数曲线拟合方程如图14b，为y＝27.861x+46.943，R2＝0.999(x、y分别为底物浓度及初速度倒数)。
如图14c，以2mM TMB为固定浓度催化底物时，测得ICDs催化0.088～0.286mM范围内H2O2的酶促反应(图14c中H2O2浓度为体系中的H2O2终浓度)，双倒数曲线方程如图14d，为y＝5.2008x+1.8909，R2＝0.997。
计算所得ICDs的动力学参数如表8，作为过氧化物酶，其催化TMB的Vmax为0.02×10-6Ms-1，Km为0.59mM；催化过氧化氢的Vmax为0.53×10-6Ms-1，Km为2.75mM，可知ICDs对TMBKm小于对过氧化氢的Km值，表明ICDs对TMB的亲和力大于过氧化氢，但与辣根过氧化物酶(HRP)相比，ICDs对过氧化氢的Km更小，亲和力更佳。可见本发明ICDs作为一类过氧化物酶，具良好催化活性。
表8.ICDs与HRP的酶动力学参数比较
Figure BDA0003698247620000161
2、葡萄糖比色检测
经前述测定，证实了ICDs催化过氧化氢分解的能力，可作为一类过氧化物模拟酶，且较于常见的辣根过氧化物酶，其对过氧化氢有更为理想的亲和力。在此基础上，联用葡萄糖氧化酶，预期利用葡萄糖氧化酶酶解葡萄糖产生过氧化氢的功能，联合ICDs这类过氧化物酶的过氧化氢催化分解功能，基于TMB-H2O2显色模型实现葡萄糖的定量检测。
2.1溶液配制
葡萄糖储备液的配制：称取0.216g葡萄糖，溶解转移至50ml容量瓶，超纯水定容，制得24mM的葡萄糖溶液，作为储备液备用。
系列浓度葡萄糖溶液的配制：10ml移液管依次精密移取1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、8.0ml 24mM葡萄糖储备液于10ml容量瓶中，超纯水稀释定容，得到2.40～19.2mM的葡萄糖溶液，备用于葡萄糖的检测。
2.2 ICDs催化过程动态比色监测
TMB被广泛应用于体系羟自由基的监测，为考察ICDs联合葡萄糖氧化酶，酶解葡萄糖、催化过氧化氢分解，释放羟自由基的过程，应用TMB-H2O2比色反应模型对体系羟自由基的释放进行动态监测。于5ml EP管中加入20μl GOD(葡萄糖氧化酶)、80μl 19.20mM葡萄糖，混匀后于37℃恒温恒温水浴锅孵育20min，而后依次加入3mL 10mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)、100μl0.05mM ICDs溶液、200μl 2mM TMB溶液，混匀后于45℃水浴锅中孵育5min，于紫外分光光度计测定其在λ＝652nm处的OD值变化情况。
如图15，0～30min内，体系在652nm处的OD值逐渐升高，自最初的0.05升至0.87，说明体系中的葡萄糖氧化酶酶解葡萄糖，产生了过氧化氢，可与ICDs进一步反应，释出可氧化无色TMB为蓝绿色氧化态TMB的羟自由基。在反应中，为保证反应终点的统一测定，加入TMB反应的经典终止剂—稀硫酸溶液，加入后体系有蓝绿色变为黄色，在450nm处有紫外吸收。
2.3检测方法
于5ml EP管中加入20μl GOD(葡萄糖氧化酶)、80μl 2.40～19.20mM葡萄糖，混匀后于37℃恒温水浴锅孵育20min，而后加入3mL 10mM pH＝4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液、100μl0.050mM ICDs溶液、200μl 2mM TMB溶液，混匀于45℃反应30min后，加入1mL 2mM硫酸终止液，于紫外分光光度计测定体系的OD450值，计算ΔOD450＝OD-ODBlank(OD表示加入待测物，反应终止时体系于450nm处的吸光度值，ODBlank为空白对照于450nm处的吸光度)，建立ΔOD450与葡萄糖浓度的定量关系，并对ICDs检测葡萄糖的定量方法进行专属性、线性与范围、精密度、回收率的系列方法学考察。经过方法学验证，发现ICDs检测葡萄糖的方法专属性良好，常见的糖类：果糖、蔗糖、乳糖、甘露糖对葡萄糖的测定几乎无干扰；在0.055～0.444mM葡萄糖浓度范围内与体系OD450满足线性方程△OD450＝1.1758[Glu]+0.0282(R2＝0.999，n＝3)，检测限为0.028mM，具有良好线性关系；此方法精密度良好，中间精密度及重复性精密度在1.27～1.66％范围内；平均回收率达100.1％，说明本法对线性范围浓度内的葡萄糖测定准确。
试验例5、IGTCDs的合成方法筛选
1、GOD偶联量的筛选
ICDs经静电吸附作用偶联GOD的能力有限，为筛选合适的酶偶联量，将0.5g ICDs(实施例1制备)溶于50ml超纯水中，溶解后于5个圆底烧瓶中各加入10ml ICDs溶液，依次缓慢滴加250、500、1000、1600、2000μl 50mg·ml-1GOD溶液，搅拌过夜，透析并冻干收集，制成m(ICDs:GOD)＝8:1、4:1、2:1、1.25:1、1:1的五份ICDs-GOD偶联物，偶联不同量的GOD，经透析、冻干后精密称定偶联产物，制成0.05mg·ml-1ICDs-GOD溶液，对其酶促活性按试验例4“1.2过氧化物酶活性测定”，测定催化等量葡萄糖的反应初速度V0，根据其酶促反应催化速率选择最适GOD偶联量。
结果如图16所示：未掺杂GOD的ICDs无葡萄糖分解能力，当ICDs与GOD以质量比8:1偶联时，反应速率最大，1:1偶联时反应速率最小，以1.25～2:1的比例偶联，反应速率明显上升，2～4:1趋于稳定，达最佳反应速率的91.4～95.6％，说明此比例下ICDs与GOD静电吸附联结接近饱和，从经济、有效的角度，选择GOD：ICDs＝1:2(质量比)的偶联比例。
2、Trf偶联量的筛选
2.1偶联及流式测定方法
在确定GOD偶联量的基础上，将0.32g冻干所得ICDs粉末溶于40ml超纯水中，溶解后于4个圆底烧瓶中个加入10ml ICDs溶液，分别缓慢滴加1ml 40mg·ml-1的GOD溶液，搅拌过夜；将34mg转铁蛋白、0.112g EDC及0.168g NHS溶于1500μl PBS(pH＝7.40)中，超声处理1h，活化转铁蛋白表面羧基，而后分别缓慢滴加200、300、400、500μl于上述ICDs-GOD溶液中，搅拌24h，透析处理，冻干收集IGTCDs固体，得到m(ICDs:Trf)＝18:1、12:1、9：1、7:1的系列偶联物。
测定C6细胞对上述系列偶联产物的摄取情况。贴壁的C6胶质瘤细胞经消化、离心处理后转移至无菌12孔板中，每孔加入1ml DMEM-高糖培养基，于恒温孵箱中孵育24h至细胞贴壁。弃去孔中原培养基，更换含300μg·ml-1不同转铁蛋白偶联量IGTCDs的1ml新鲜培养基，将C6细胞与各组IGTCDs溶液共孵育12h后，避光状态下，小心吸取孔内培养基，并用0.01M无菌PBS(p H＝7.40)仔细洗涤2次，以充分除去死细胞及游离态药物。而后加入不含EDTA的胰酶消化约3min，加入无血清、双抗的纯净培养基以终止消化。小心吹打孔内细胞，于1.5ml EP管内收集各孔细胞液，1200r/min转速下用离心机离心3min，吸出上清液，各管加入500μl PBS(p H＝7.40)吹打均匀，转移至流式管内，使用细胞流式仪在PE-Cy5-H通道下进行检测。
2.2筛选结果
由图17中不同转铁蛋白掺杂IGTCDs的C6细胞摄取实验可知，无转铁蛋白掺杂的细胞摄取率较低，荧光强度集中于3～4×103，而偶联转铁蛋白后，细胞摄取率均有大幅提升，接近未偶联材料的10倍左右，说明转铁蛋白的偶联可增加细胞对材料的摄取。由图17不同偶联量的相对摄取率曲线可见，在以18:1质量比偶联ICDs与转铁蛋白时，有最大荧光强度，说明此时细胞摄取最佳，9～12:1偶联质量比时，荧光强度略有下降，但仍达最佳摄取率的89.6～93.2％，说明此时转铁蛋白的偶联趋于饱和。偶联比例为7:1时荧光强度相对较低，仅为最佳摄取率的80.5％。自经济有效的角度，选定9：1(质量比)为转铁蛋白的最佳偶联量。
试验例6、IGTCDs的表征
1、IGTCDs的理化表征
与ICDs的表征内容类似，对IGTCDs(实施例2制备)进行荧光光谱扫描，测定其荧光最大激发、发射波长，并于紫外灯下观测其荧光情况；经TEM图表征其粒径分布及形态；经红外光谱测定其结构；经XPS测定IGTCDs的元素组成；经紫外光谱扫面判定其紫外吸收情况测定。图18～图23为IGTCDs系列理化表征结果。
1.1荧光光谱分析
取一定浓度的IGTCDs溶液于荧光比色皿中，在荧光分光光度计-光谱扫描模式下进行检测。图18为IGTCDs的荧光光谱图，可见，当激发光λEx由550nm增加至560nm时，荧光强度增强，当激发光进一步增加至565～570nm时，荧光强度又有下降，在λEx＝560nm的激发下的荧光强度最大。在此激发光变化过程中，荧光强度有所变化，但IGTCDs的发射峰位始终位于λEm＝610nm处，未见红移。由此得到IGTCDs的最佳激发、发射波长：λEx/λEm＝560/610nm，内嵌图为IGTCDs溶液在紫外、日光灯下的观测情况，可见IGTCDs溶液在日光下呈棕色透明溶液，紫外灯照射下显橙色，说明IGTCDs与ICDs类似，均具橙色荧光。
1.2粒径分析
将一滴一定浓度的IGTCDs溶液滴于铜网，晾干后于透射电子显微镜下(TEM，Transmission Electron Microscope)观测IGTCDs的形态，测定其粒径大小，并用“ImageJ”对IGTCDs的TEM图进行粒径分布分析。如图19，IGTCDs呈接枝状结构，分散均匀，这可能与ICDs与GOD、Trf依次偶联有关，如内嵌图所示，其粒径集中于100nm。此外，本发明IGTCDs的电位为-4.21mV，此时的电位、粒径较为理想，适于体内应用。粒径过大则容易被免疫系统识别而攻击，材料表免得负电荷，可经电荷排斥力保护粒子免受蛋白吸附，且于体外存放时更加稳定。
1.3 DLS分析
IGTCDs的后续应用涉及PBS、FBS、水溶液体系，为保证其在测定过程中的粒径的稳定、均一性，于纳米粒度分析仪测定了IGTCDs在水、50％FBS和PBS中的粒径分布均一性。
如图20，IGTCD在H2O、PBS及50％FBS中粒径均集中于117.6nm，多分散指数(PDI)均小于0.3，说明IGTCDs具有良好的分散性和均匀性。分别在12、24、36、48和72h测定了不同体系中IGTCDs的粒径。其中，72h内IGTCDs在上述溶液体系中基本稳定，粒径分布均匀(PDI<0.3)，说明IGTCDs的分散性良好、稳定，可进行后续应用。
1.4红外光谱分析
对IGTCDs进行红外光谱扫描，表征其具有的官能团。除去H2O溶剂峰、空气背景峰后，将IGTCDs溶液滴于红外光谱仪点样处，洗耳球小心吹干，进行测定。IGTCDs的红外表征图谱如图21，其中3414.28cm-1处的吸收说明存在氨基，1022.5cm-1处存在醚键吸收，1414.20cm-1、645.66cm-1和1249.17cm-1处存在酰胺键的吸收，这可能与转铁蛋白羧基与ICD-GOD氨基的结合有关。
1.5 X-射线光电子能谱分析
将透析、冻干所得的IGTCDs固体粉末研磨细腻、均匀后，于X-射线光电子能谱分析仪分析其组成。由图22XPS表征结果，可知IGTCDs含C、O、Cl、N、Fe等元素，其中Fe元素来源于ICDs中的Fe3+、Fe2+。
1.6紫外光谱分析
取一定浓度的IGTCDs溶液于石英比色皿中，于紫外分光光度计-光谱扫描模式下测定紫外吸收情况。结果如图23，在430nm处有一个较强的吸收峰，表明存在n→π*跃迁，可能与IGTCDs中存在C＝O结构有关。
试验例7、IGTCDs催化羟自由基释放的确证
1、IGTCDs酶促动力学考察
以TMB-H2O2为显色反应模型，评价IGTCDs(实施例2制备)是否集葡萄糖酶解、过氧化氢分解，释放羟自由基氧化TMB的能力。考虑到GOD、Trf的偶联成本及实验目的，本部分将基于微量酶促动力学的考察，以考察IGTCDs与葡萄糖、TMB间有无阳性显色反应为目标，应用96孔板加样，酶标仪测定IGTCDs的酶促动力学常数。
将110μl 10mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)、30μl 50μg·ml-1IGTCDs和30μl梯度浓度在0.044～0.330mM葡萄糖加入96孔板中，45℃下孵育30min，加入30μl 2mM TMB，采用酶标仪动力学检测模式检测体系在λ＝652nm处的OD值变化曲线，计算反应前180s的初速度V0，经Michaelis-Menten动力学方程公式计算催化反应的Km及Vmax。
图24为加入0.044、0.110、0.165、0.275及0.330mM葡萄糖，IGTCDs-TMB体系在652nm处1200s内的吸光度变化情况，可知IGTCDs具有酶解葡萄糖、催化过氧化氢分解释放羟自由基，引发TMB氧化生成蓝绿色ox-TMB的能力，吸光度的差异与葡萄糖浓度存在正相关关系，可进一步分析其催化能力。
IGTCDs催化葡萄糖分解的酶动力学结果如图25a，双倒数作图，结果如图25b，酶促反应方程y＝5.71×10-4x+3.613×10-3，x、y分别为最大反应速率和底物浓度的倒数。经米氏方程计算得其催化参数Km和Vmax值分别为0.158mM和276.81Ms-1。
2、TMB比色反应的检测
在验证IGTCDs催化功能的基础上，对其酶解葡萄糖产生过氧化氢，分解过氧化氢释放羟自由基的过程进行进一步考察。铁掺杂纳米材料作为一种过氧化物酶，可触发Fenton反应，催化·OH的释放，氧化无色TMB产生652nm紫外吸收的蓝色TMB+(oxTMB)，其机理如下。
H2O2+Fe3+→Fe2++O2+2H+ (1)
Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH (2)
O2+Fe2+→Fe3++O2 (3)
基于此，应用H2O2-TMB比色模型监测羟基自由基的生成过程，于5ml EP管中加入3ml 10mM HAC-NaAC缓冲液(pH＝4.00)，500μl 1mMIGTCDs和250μl 5mM葡萄糖溶液，孵育后于紫外分光光度计记录625nm处的OD值变化过程。如图26所示，体系吸光度逐渐增加，40分钟趋于稳定，表明产生了·OH，可氧化无色TMB，生成蓝色的氧化态TMB(ox-TMB)。如内嵌图，分别在含有0、2、5、8mM葡萄糖的组中于40min加入250μl 0.1mM硫酸终止反应，可见体系颜色由蓝变黄，颜色深浅程度与葡萄糖浓度正相关。因此，可以证明IGTCDs酶解葡萄糖，生成的过氧化氢可通过Fenton反应生成羟基自由基。
3、DCFH-DA荧光探针的检测
除TMB这一经典的羟自由基比色检测模型外，还可用DCFH-DA对产物·OH进行确证。·OH可氧化DCFH，生成有特定荧光激发、发射的DCF(Ex/Em＝488/525nm)。将1ml HAC-NaAC缓冲液(pH＝4.00)、1ml 1mM IGTCDs和250μl 10mM葡萄糖加入5ml EP管中，孵育后加入200μL1mM DCFH-DA溶液，记录Ex＝488nm处荧光光谱的变化过程。如图27所示，Em＝525nm处的荧光强度逐渐增加，40min趋于稳定。内嵌图显示反应前后体系在紫外照射下的荧光发射，反应前呈IGTCDs的橙色荧光，反应后呈DCF的绿色荧光。再次证实了IGTCDs触发过氧化氢的分解、释放·OH的功能。
试验例8、IGTCDs的细胞应用
在验证了IGTCDs(实施例2制备)的·OH催化释放功能的基础上，对其毒性、细胞水平的肿瘤凋亡效应及成像功能进行了相应考察。以评估其成像、治疗效应可否应用于体内研究。
细胞培养：实验所用的L929成纤维细胞于DMEM培养基中培养、C6胶质瘤和C6-luc细胞系于DMEM高糖培养基培养，于其中添加10％胎牛血清(FBS)、5％双抗(100u/ml链霉素和青霉素)，在37℃，5％二氧化碳恒温孵育箱中培养。
1、细胞毒性及pH选择效应
1.1 IGTCDs的细胞毒性考察
为考察IGTCDs对正常细胞的生物相容性，采用CCK-8检测其细胞毒性。将L929细胞以5000～6000个/孔的密度接种于96孔板中，加入100μl DMEM培养基孵育12小时，至细胞贴壁。小心吸出原培养基，更换100μl新鲜DMEM，依次加入梯度浓度的IGTCDs(0、100、200、300、400、500μg·ml-1)，在37℃下孵育24h。后小心吸取孔内液体，各孔加入100μl生理盐水洗涤2次以消除碳点的颜色影响。于每孔中加入90μl DMEM和10μl CCK-8检测试剂，2～4小时测定450nm处的OD值，按照“细胞活力(％)＝[OD加药-ODblank]/[OD0加药-ODblank]*100％”的测定公式计算细胞活力(OD加药为加入IGTCDs、CCK-8的孔内吸光度，ODblank为未加入IGTCDs、CCK-8的孔内吸光度，OD0加药为未加入IGTCDs，加入CCK-8的孔内吸光度)，考察IGTCDs对正常细胞的生物相容性。
2、IGTCDs凋亡细胞的pH选择性
同法测定IGTCDs对C6胶质瘤细胞的效应。将C6胶质瘤细胞以6000～10000个/孔的密度接种于96孔板中，在不同pH(6.0或7.4)的DMEM高糖培养基中孵育8～10小时，直至细胞贴壁生长。小心吸出原培养基，更换100μl新鲜DMEM高糖培养基(pH＝6.0或7.4)，依次加入梯度浓度的IGTCDs(0、100、200、300、400、500μg·ml-1)，在37℃孵育一定时间。而后小心吸取孔内液体，各孔加入100μl生理盐水洗涤2次。于每孔中加入90μl DMEM和10μl CCK-8检测试剂，2～4小时内测定450nm处的OD值，计算细胞活力。
如图28a，IGTCDs在中性培养基(pH＝7.4)中与L929细胞共孵育24小时后，对正常细胞的毒性较低，即使在较高浓度(500μg·ml-1)下，细胞活力仍高于85％，说明IGTCDs具有良好的生物安全性。图28b中，IGTCDs与C6细胞共孵育24小时后，在中性、酸性环境中的细胞毒性具有显著差异(p<0.001)，酸性条件下，300μg·mL-1IGTCDs的细胞存活率仅28.09％，中性环境达64.43％，表明IGTCDs在酸性环境下可诱导肿瘤细胞凋亡。
在中性条件下，L929和C6细胞与等浓度的IGTCDs共孵育，细胞活力之间的差异可能是由于肿瘤细胞中高浓度的β-D-葡萄糖可触发IGTCDs的酶催化，释放具凋亡作用·OH引起。由此可知，即使在中性培养环境中，IGTCDs对C6细胞也表现出一定的凋亡作用，而中性环境或低糖水平的正常组织限制了IGTCDs效应的充分发挥。
由图28c和28d可以看出，当与IGTCDs共孵育时间从12h延长到36h时，C6细胞活力相近，36h略高于12和24h但无显著差异(p<0.05)，表明IGTCDs起效迅速，与作用时间关系较小，在一定程度上可抑制肿瘤生长。酸性环境下，C6细胞与300μg·ml-1IGTCDs共孵育24小时后，抑瘤率可达71.90％。
综合细胞毒性和效应的结果，本发明选择毒性低且具理想肿瘤抑制率的IGTCDs浓度，300μg·mL-1以开展后续成像实验，以保证视野内的细胞数量及良好的肿瘤细胞凋亡作用。
试验例9、IGTCDs的细胞成像应用
采用共聚焦激光扫描显微镜LSCM观察IGTCDs的细胞成像情况，以及不同pH条件下IGTCDs催化C6细胞释放活性氧的功能。IGTCDs为实施例2制备的IGTCDs。
将C6胶质瘤细胞以150000～200000个/孔的密度接种于以放置无菌爬片的6孔板中，在一定pH(6.0或7.4)的DMEM高糖培养基中培养12小时直至细胞贴壁生长。小心弃去原培养基，每孔加入1ml新鲜DMEM高糖培养基(pH＝6.0或7.4)，后依次加入梯度浓度的IGTCDs(50，150，300μg·ml-1)，在37℃孵育一定时间后小心吸取培养基，加入1ml 10μM DCFH-DA样液，37℃孵育25min。小心吸出各孔溶液，依次用1ml无血清的DMEM培养基和1ml无菌PBS(pH＝7.40)仔细冲洗，除去残留探针。用500μl 4％多聚甲醛固定细胞形态15min，吸出后加入500μl 1μM的DAPI试剂，孵育5min后吸出，用PBS仔细洗涤2次，抠片覆于滴有抗荧光猝灭剂及甘油的洁净盖玻片，封片，晾干后于LSCM测定。
LSCM测定中，采用DAPI试剂Ex/Em＝340/488nm的荧光特性定位细胞核，Ex/Em＝560/610nm处观察细胞对IGTCDs的摄取，Ex/Em＝488/525nm处观察DCFH-DA被ROS氧化，DCF的产生，分别在三个视野下观测细胞内的荧光情况。
如前所述，IGTCDs催化羟自由基的产生与触发芬顿反应相关，其对C6细胞的pH选择性凋亡作用已经验证，为确证羟基自由基(·OH)的产生，本发明使用DCFH-DA荧光探针研究了不同材料在不同pH下催化C6胶质瘤细胞产生ROS的功能，在一定的荧光条件下，对IGTCDs的细胞效应及细胞成像功能进行评价。
1、IGTCDs释放羟自由基的pH选择性
结果如图29所示，酸性条件下(pH＝6.00)可见明显绿色荧光，表明细胞内羟自由基的生成，氧化DCFH生成DCF(Ex/Em＝488/525nm)；而在pH＝7.40时，仅见DAPI试剂定位细胞核显示的蓝色荧光，未观察到细胞的绿色荧光，表明IGTCDs催化释放羟自由基的pH选择性。
2、IGTCDs的细胞成像
在验证IGTCDs羟自由基催化作用的基础上，对其细胞摄取及胞内荧光发射情况进行了考察。未经偶联的ICDs及IGTCDs的荧光成像状态如图30，可见DAPI试剂的核定位蓝色荧光，此外，在Ex/Em＝560/610nm处，于细胞质中可见明显橙色荧光。证明碳点可被细胞吸收，主要分布在细胞质中，细胞呈纤维状，边界清晰，形态良好。说明ICDs、IGTCDs均可于细胞质中表现橙光发射，初步验证了IGTCDs良好的生物相容性和细胞成像的探针应用。
3、不同浓度IGTCDs的羟自由基释放考察
为了考察IGTCDs的胶质瘤细胞摄取情况，将C6细胞与梯度浓度的IGTCDs(50、150、300μg·ml-1)共孵育12h，同法应用DCFH-DA荧光探针观察不同条件下ROS的生成状态。如图31，在酸性条件下(pH＝6.0)，与空白组相比，所有IGTCDs组在Ex/Em＝488/525nm处均可观察到强烈的DCF绿色荧光，证明IGTCDs在酸性环境具经酶解葡萄糖催化羟自由基释放的能力。Ex/Em＝560/610nm下均观测到明显的橙色荧光，表明IGTCDs可以有效地被细胞内吞，分布于细胞质中，是产生胞内效应的基础，也证明IGTCDs具明显异于生物背景的荧光，是优秀的细胞成像材料。
4、IGTCDs不同孵育时间的羟自由基释放考察
由图32可见，低浓度的IGTCDs(50μg·mL-1)的细胞数量明显高于中、高浓度，这可能与ROS诱导的细胞凋亡有关。在此基础上，考察孵育时间对细胞凋亡的影响，延长IGTCDs(300μg·mL-1)与C6细胞的共孵育时间，当其从12h增加到20h、24h时，IGTCDs的橙色荧光明显增强，表明细胞对IGTCDs的摄取较好，从而可促进胞内羟自由基水平的进一步提升，以达细胞凋亡效果。与此同时，可见视野内细胞数量明显减少，细胞形态也有明显变化，从最初的梭形变为圆形，可能与·OH诱导的细胞膜破坏、脂质氧化和细胞凋亡有关。
该试验例验证了IGTCDs在细胞水平表现出的良好光学特性和生物相容性，并对其效应的发挥进行了评价，验证了其胞内羟自由基释放能力的时间、pH及浓度效应特点。IGTCDs经细胞内吞作用集中分布于细胞质中，橙色荧光的发射特性使其可作为一类细胞成像的优良探针。此外，在酸性条件下，300μg·mL-1的IGTCDs可有效催化葡萄糖的酶解，触发Fenton反应进而释放羟自由基，诱导C6胶质瘤细胞的凋亡，初步验证了其在细胞水平的肿瘤杀伤作用。在此基础上，可开展后续的小鼠肿瘤治疗相关研究。
试验例10、IGTCDs的抗肿瘤研究应用
1、乳腺癌治疗
1.1小鼠乳腺癌肿瘤模型
35只体重16～18g的雌性balb/c小鼠经适应性喂养7天后，于单侧第四乳腺垫分别接种4T1细胞(0.1ml，1×106个)以建立小鼠乳腺癌肿瘤模型，观察肿瘤生长情况。5天后可见肿瘤明显凸起，筛选得15只肿瘤体积相近小鼠，随机分为3组，高、低剂量的实验组间隔24h经尾静脉注射IGTCDs(6mg·kg-1，3mg·kg-1)，对照组注射等量生理盐水。间隔48h测定各组小鼠体重、肿瘤体积(V＝a*b2/2，a、b分别为肿瘤长、短径长)的变化情况。同法筛选得15只肿瘤体积相近小鼠，随机分为3组，高、低剂量的实验组间隔24h于瘤内注射IGTCDs(6mg·kg-1，3mg·kg-1)，对照组注射等量生理盐水。间隔48h测定各组小鼠体重、肿瘤体积(V＝a*b2/2，a、b分别为肿瘤长、短径长)的变化情况。记录15天内各组参数的变化情况，分析IGTCDs的乳腺癌治疗效应，比较瘤内注射与静脉注射的治疗效果。IGTCDs为实施例2制备的IGTCDs。
1.2乳腺癌的治疗
间隔48h给药前记录静脉及瘤内注射组的小鼠在15天治疗期内体重，如图33，各组小鼠体重均无较大波动，均在15～19g范围内。治疗组小鼠生长状态良好，说明IGTCDs的注射未见明显毒性。
1.2.1肿瘤相对体积
图34为15天内IGTCDs静脉给药治疗组肿瘤相对体积的变化情况，可见静脉注射组内对照组小鼠肿瘤生长迅速，且组间肿瘤大小逐渐出现一定差异，这可能与小鼠自身的生长与生理状态差异有关。至15天时，小鼠肿瘤已增至近初体积的5.8倍。而低剂量静注组，对肿瘤生长表现出一定的抑制作用，15天时的肿瘤体积近初始体积的3.8倍；高剂量静注组则具更明显的肿瘤抑制效果，15天的肿瘤体积近初始体积的2.2倍。7～9天起，高、低剂量的静注治疗组对肿瘤均表现出较为明显的抑制作用。证明静脉注射IGTCDs对乳腺癌具有一定抑制作用。
图35为15天内IGTCDs瘤内给药治疗组肿瘤体积的相对变化情况，可见其中对照组小鼠肿瘤生长迅速，与静注组小鼠类似，对照组内小鼠肿瘤体积逐渐呈现一定差异，可能与小鼠自身的生长与生理状态差异有关。15天时，对照组小鼠肿瘤已增至近初体积的3.9倍。而低剂量组，对肿瘤生长则表现出一定的抑制作用，15天时的肿瘤体积近初始体积的2.7倍；高剂量组则具更明显的肿瘤抑制效果，15天的肿瘤体积近初始体积的1.4倍。证明瘤内注射IGTCDs对胶质瘤的生长具有明显的抑制作用。
1.2.2肿瘤形态
治疗结束后，处死、解剖各组小鼠，小心取出皮下肿瘤。如图36、图37，分别为静注、瘤内注射组中对照及治疗组肿瘤形貌图。可见治疗组肿瘤较对照组体积明显减小，高剂量组呈现出更明显的肿瘤抑制作用。其中，低剂量给药时，静注组与瘤内注射组肿瘤体积接近，而高剂量瘤内注射组肿瘤体积较静脉注射组大于低剂量组，说明瘤内注射的肿瘤抑制效果更理想。
测定肿瘤体积，对IGTCDs的肿瘤抑制效果进行评估，如图38，IGTCDs的静脉及瘤内注射组均较对照组有明显的抑瘤效果。静脉注射3mg·kg-1、6mg·kg-1IGTCDs的肿瘤抑制率分别达36.7％、54.7％，瘤内注射3mg·kg-1、6mg·kg-1IGTCDs的肿瘤抑制率分别达46.4％、69.9％。
由此可知，静脉及瘤内注射IGTCDs均对小鼠乳腺癌产生较为理想的治疗效应。其中，瘤内给药的抑瘤率更佳，这可能与IGTCDs直接酶解患处葡萄糖、催化产生肿瘤凋亡作用的羟自由基有关。静脉注射中，即使偶联了肿瘤靶向功能的转铁蛋白，也会存在IGTCDs在转运过程与血液中葡萄糖作用而有所损失，因此，瘤内注射的药物利用率最大，表现出良好的肿瘤抑制效果。
1.2.3 IGTCDs对血糖水平的影响
为此，测定了给药后小鼠的血糖浓度变化。各组给药后，立即用采血针采集小鼠尾部血液，采用血糖仪进行测定2h内各组小鼠血糖的变化情况，结果如图39。
对照组小鼠血糖较为平稳，在2h内几乎不变，1h后略有下降，血糖浓度在±0.2范围波动，可能与此2h监测期内未进食相关。治疗组小鼠在给药5min后，可见血糖有一定下降，静注组下降0.5～1.3mmol·L-1，瘤内注射下降0.1～0.5mmol·L-1可见，静注组血糖下降更为明显。60min后瘤内注射组血糖水平逐渐恢复正常，90min后静脉注射组水平逐渐恢复稳定，说明IGTCDs会使小鼠血糖略有下降，但一定时间后会恢复正常血糖水平。
2、胶质瘤治疗
2.1小鼠胶质瘤模型建立
30只体重20～25g的昆明小鼠经适应性喂养7天后，腹腔注射4％水合氯醛(150mg·kg-1)麻醉后，小心自小鼠头顶至右耳剔除毛发，于立体定位装置小心固定，如图40，消毒暴露部位后于眼部联结中线处做一个长度约为1.0cm的垂直切口，并暴露颅顶额叶十字线，在交叉中心右侧2.0mm、下方0.6mm处钻孔，孔直径约1.0mm。后用微注射器接种C6-LUC细胞(10μl，2.5×105个细胞)以建立小鼠脑胶质瘤模型，后用可吸收缝合线缝合，消毒创面。观察小鼠的生长活动，接种5天后，小鼠体重略有下降，觅食活动正常，饮水频率下降，头部注射部位略有肿胀。
2.2胶质瘤的治疗
用小动物活体成像仪观察并记录肿瘤信号，并准确标记，筛选信号相近小鼠9只并标记分组。筛选出9只近似肿瘤信号的小鼠(1.4～4.5×106)，均匀分为实验组(高剂量和低剂量，n＝3)和对照组(n＝3)。实验组分别间隔24h经尾静脉注射3mg·kg-1，6mg·kg- 1IGTCDs，对照组注射等量生理盐水。接种8～11天后，对照组小鼠活动向一侧倾斜，头顶部凸起加剧，实验组未见隆起加重。13～15天时，观察到对照组小鼠毛发紊乱，精神状态不佳，头顶部隆起更加明显，而实验组小鼠形态行为相对正常。按照前述荧光信号测定方法分别在10、15天记录小鼠的肿瘤信号，分析15天内各组荧光信号的变化过程。IGTCDs为实施例2制备的IGTCDs。
2.2.1肿瘤信号变化
表9. 15天内对照及治疗组的小鼠肿瘤信号值
Figure BDA0003698247620000271
从图41、42和表9的肿瘤信号-时间图可以看出，对照组小鼠15天内肿瘤荧光信号明显增强，而治疗组小鼠第10天荧光信号有一定增加，但增幅明显低于对照组。第15天，治疗组肿瘤荧光信号明显下降，在第10、15天的肿瘤信号分别为原始肿瘤信号的4.30、5.82倍；治疗组中低剂量组分别为2.43、0.76倍，高剂量组分别为1.83、0.09倍。说明高、低剂量的IGTCDs均表现出明显的肿瘤抑制效果。
2.2.2肿瘤生长速率
根据各组小鼠的肿瘤信号计算第10、15天的肿瘤生长速率，结果如图43，对照组肿瘤生长迅速，第10、15天的肿瘤增长率分别为330.4％、482.0％。治疗组前期肿瘤仍表现为增长状态，但速率远低于对照组，10天后，其肿瘤增长速率明显减缓，高、低剂量的治疗组分别自142.5％、82.56％降至-23.57％、-90.55％，相较于治疗最初的肿瘤信号实现负增长。
2.2.3肿瘤抑制率
表10.治疗组第10、15天的肿瘤抑制率
Figure BDA0003698247620000272
Figure BDA0003698247620000281
计算高、低剂量治疗组肿瘤抑制率，结果如图44、表10。可见高、低剂量的治疗组内肿瘤抑制率无显著差异(P<0.01)，说明低浓度的IGTCDs即可发挥理想的抑瘤效应。此外，IGTCDs的肿瘤抑制率达41.45～98.32％，说明IGTCDs在体内具有明显的抗肿瘤作用，能有效诱导胶质瘤细胞凋亡。
2.3.4组织成像
IGTCDs的胶质瘤抑制作用基于靶向催化患处葡萄糖酶解、经芬顿反应触发过氧化氢分解以提高羟自由基水平，进而诱导胶质瘤细胞的凋亡。因此，脑靶向作用是评估IGTCDs治疗效果的关键。第15天测定各组小鼠肿瘤荧光信号后，处死，解剖取出组织，生理盐水小心清洗组织表面，吸干表面水分。在IGTCDs的荧光激发、发射(Ex/Em＝560/610nm)下经小动物活体成像仪测定IGTCDs的组织分布。
3只小鼠分别经尾静脉注射3mg·kg-1ICDs，10天后处死，解剖组织以观察ICDs的分布。如图45，与3mg·kg-1IGTCDs低剂量治疗组相比，在同一测量标尺下，ICDs在大脑无分布，而IGTCDs有明显的荧光信号，这表明转铁蛋白已经有效偶联，是发挥治疗效应的基础与关键。此外，在同一标尺下，IGTCDs于脑部有明显荧光信号，而在其他组织器官的荧光信号均较弱，其中，肝作为代谢关键组织显较弱荧光，说明IGTCDs进入体内后，主要分布、作用于脑部，证实了偶联转铁蛋白的靶向性，表面IGTCDs在体内无明显蓄积。
如图46，在Ex/Em＝560/610nm的荧光条件下，IGTCDs的分布集中于大脑，其荧光信号明显强于其他组织。内嵌图为各组小鼠的脑部形态，可观察到对照组大脑形态严重受损，剥离时脑组织固定性较差，难以完成取出，而治疗组结构完整，形态良好，可完整剥离，证明IGTCDs可抑制胶质瘤的生长，维持大脑的正常形态。
综上所述，IGTCDs对胶质瘤具有良好的生物成像和靶向功能，是一种结合靶向、成像和治疗能力并具有良好生物相容性的纳米酶材料。
2.3.5组织切片病理分析
15天后处死对照组与高、低剂量组小鼠，取出组织，清洗表面浮血，用4％甲醛固定12～24h后进行切片病理学分析，HE染色后于显微镜下观察心、肝、脾、肺、肾及脑部的病理学形态，评估IGTCDs对脑和各主要器官的病理损伤。
如图47所示，对照组脑部胶质细胞层明显增厚，而治疗组胶质细胞呈长梭形平行排列，可见波浪状栅栏结构，说明有所改善，IGTCDs具有一定治疗效应。与对照组相比，其余组织未见明显损伤，进一步证明了IGTCDs在治疗过程中具有良好的生物相容性。
综上，本发明采用水热法合成的ICDs表面具有丰富的官能团，易于改性。偶联GOD和Trf获得IGTCDs，具有靶向大脑、葡萄糖氧化酶活性、橙色荧光发射、低毒、生物相容性良好等适于体内应用、分析的性质。IGTCDs可靶向大脑并利用肿瘤微环境(TME)酸性特征及代谢葡萄糖依赖特点启动一系列葡萄糖酶解、过氧化氢分解、ROS(·OH)释放的级联反应，消耗瘤部葡萄糖肿位，削弱糖酵解，同时羟自由基可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤代谢和增殖，进而实现脑胶质瘤的靶向治疗。
IGTCDs合成简便，工艺稳定，表现出良好的过氧化物酶活性和生物相容性。具有较高的细胞亲和力和良好的脑靶向功能，其橙色荧光发射促进了细胞摄取和生物成像。在肿瘤治疗中具理想抑瘤率，对于乳腺癌，抑瘤率达36.7～69.9％；用于脑胶质瘤治疗时，其抑瘤率可达41.45～98.32％，均具有良好的肿瘤抑制效果。IGTCDs实现了靶向、治疗和成像功能的一体化，同时，验证了基于TME的抗肿瘤治疗的可行性，介绍了碳点在肿瘤治疗中的新应用思路。

Claims (10)

1.一种具有过氧化物模拟酶活性的纳米碳量子点，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：色氨酸0.1～1份、六水三氯化铁1～10份、邻苯二胺1～10份。
2.根据权利要求1所述的纳米碳量子点，其特征在于：所述色氨酸和邻苯二胺的摩尔比为1:4。
3.根据权利要求1或2所述的纳米碳量子点，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：色氨酸0.5份、六水三氯化铁8份、邻苯二胺1.08份。
4.权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)将色氨酸、六水三氯化铁和邻苯二胺加入溶剂中，超声分散均匀后，加热反应；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，将滤液透析、干燥，即得；
优选地，
步骤(1)中，所述溶剂为水和浓盐酸混合溶液，所述水和浓盐酸的体积比为(10～20)：1；
和/或，步骤(1)中，所述反应的温度为180～250℃；
和/或，步骤(1)中，所述反应的时间为2～5小时；
和/或，步骤(2)中，所述透析时透析袋的截留分子量为500Da；
和/或，步骤(2)中，所述干燥为冻干；
更优选地，
步骤(1)中，所述水和浓盐酸的体积比为20：1；
和/或，步骤(1)中，所述浓盐酸与色氨酸的体积质量比为10mL：1g；
和/或，步骤(1)中，所述反应的温度为200℃；
和/或，步骤(1)中，所述反应的时间为3小时。
5.权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点作为氧化物模拟酶中的用途。
6.权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点在检测葡萄糖中的用途。
7.一种纳米碳量子点偶联物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点10～20份、葡萄糖氧化酶5～10份、转铁蛋白1～5份。
8.根据权利要求7所述的纳米碳量子点偶联物，其特征在于：所述权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点与葡萄糖氧化酶的质量比为2:1；和/或，所述权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点与转铁蛋白的质量比为9:1；
优选地，所述的纳米碳量子点偶联物是由如下重量配比的原料制备而成：权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点18份、葡萄糖氧化酶9份、转铁蛋白1份。
9.权利要求7或8所述的纳米碳量子点偶联物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)将权利要求1～3任一项所述的纳米碳量子点溶于水中，并加入葡萄糖氧化酶；
2)将转铁蛋白、EDC和NHS溶于溶剂中，超声处理，活化转铁蛋白表面羟基；
3)将步骤2)得到的溶液加入步骤1)中，搅拌、透析、干燥，即得；
优选地，
步骤1)中，加入葡萄糖氧化酶后搅拌过夜；
和/或，步骤2)中，所述溶剂为PBS；
和/或，步骤2)中，所述超声处理时间为1～3h；
和/或，步骤3)中，所述搅拌时间为12～24h；
和/或，步骤3)中，所述透析使用超纯水透析；
和/或，步骤3)中，所述透析时透析袋的截留分子量为500Da；
和/或，步骤3)中，所述干燥为冻干。
10.权利要求6～8任一项所述的纳米碳量子点偶联物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
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