CN110721198A - 一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及外泌体喷雾制作工艺技术领域，提供一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，本发明中用来培养间充质干细胞的培养基为加入10％胎牛血清的HamF12培养基，能够在一定程度上防止干细胞在培养过程中进行分化；在提取外泌体的过程中，最后依次离心前将沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬并进行最后依次离心，能够将沉淀中附着的杂质与外泌体相分离，使提取的外泌体纯度更高；本发明制备的外泌体喷雾能够直接对癫痫患者进行鼻内给药，使喷雾中的外泌体作用于癫痫患者的神经元，并对神经元的炎症进行缓解，从而能够防止认知和记忆功能障碍的产生，并阻止海马体的异常神经发生，进而在癫痫患者发病时能够在一定程度上缓解其脑损伤的发生，实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体喷雾制作工艺技术领域，具体涉及一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺。
背景技术
癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征。以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫是神经系统常见疾病之一，患病率仅次于脑卒中。癫痫持续状态是持续时间超过30分钟的单次癫痫发作的正式名称，或者一连串癫痫发作，而且不会在其间恢复意识。如果不能迅速停止癫痫状态，甚至可能会导致脑损伤、认知功能丧失和记忆丧失，因此需要制备一种药物使其能够在患者癫痫发作的状态下对其神经元进行保护，防止患者的神经元受到损伤，而且现有的抑制癫痫的药物大都需要静脉注射给药，但是患者在癫痫持续的状态很难进行静脉穿刺，若能够通过喷雾的方式对癫痫患者进行给药，则会使给药方式更加简便，且能够缩短给药操作的时间，从而快速实现对癫痫患者的神经元进行保护。
发明内容
解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，旨在能够通过便捷快速的概要方式对癫痫患者进行给药，能够在癫痫患者发病过程中对其神经元进行保护，防止患者发生脑损伤。
技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，包括以下制作步骤：
S1、将加入10％胎牛血清的HamF12培养基分装置到培养瓶中，然后取间充质干细胞以合适的密度接种至所述培养瓶中，将接种后的HamF12培养基放置于含5％CO2的孵箱内在37℃条件下培养24-36h后，全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液；
S2、观察S1中间充质干细胞的生长情况，当细胞融合度达到90％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤三次，所得记为细胞悬浊液；
S3、取S2中的细胞悬浊液经300×g低速离心10-15min，除去细胞结构；再将上清液经2000×g高速离心30min，除去死亡细胞；最后将上清液经10000×g离心30min，除去细胞碎片及死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留取上清液；
S4、将经过S3处理后的上清液在室温下经100000×g离心80min，去除上清液留取沉淀；将所述沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬，再次经100000-120000×g离心80min，弃去上清液所得即为外泌体；
S5、取S4中的外泌体8-12份、去离子水50-60份、防腐剂3-5份和维生素1-2份进行搅拌，搅拌速率为200-300r/min，搅拌时间为10-15min，所得记为混合液体；
S6、对S5中的混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
更进一步地，所述S1中的间充质干细胞为成人骨髓间充质干细胞。
更进一步地，所述S1中的密度为将间充质干细胞以1×106/mL的密度接种于50mL的培养瓶中。
更进一步地，所述S2中的PBS为1×PBS缓冲液。
更进一步地，所述S3中的离心环境均为室温。
更进一步地，所述S5中的防腐剂为苯甲酸钠，且所述维生素为维生素B2。
更进一步地，所述S6中超声分散的时间为20-30min。
有益效果
本发明提供了一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，与现有公知技术相比，本发明的具有如下有益效果：
本发明中用来培养间充质干细胞的培养基为加入10％胎牛血清的HamF12培养基，能够在一定程度上防止干细胞在培养过程中进行分化，由于间充质干细胞的贴壁能力较强，能够在培养的过程中直接将培养基吸出对其进行更换；在提取外泌体的过程中，最后依次离心前将沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬并进行最后依次离心，能够将沉淀中附着的杂质与外泌体相分离，使提取的外泌体纯度更高；本发明制备的外泌体喷雾能够直接对癫痫患者进行鼻内给药，使喷雾中的外泌体作用于癫痫患者的神经元，并对神经元的炎症进行缓解，从而能够防止认知和记忆功能障碍的产生，并阻止海马体的异常神经发生，进而在癫痫患者发病时能够在一定程度上缓解其脑损伤的发生，实用性强。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，包括以下制作步骤：
S1、将加入10％胎牛血清的HamF12培养基分装置到培养瓶中，然后取间充质干细胞以合适的密度接种至培养瓶中，将接种后的HamF12培养基放置于含5％CO2的孵箱内在37℃条件下培养24h后，全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液；
S2、观察S1中间充质干细胞的生长情况，当细胞融合度达到90％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤三次，所得记为细胞悬浊液；
S3、取S2中的细胞悬浊液经300×g低速离心12min，除去细胞结构；再将上清液经2000×g高速离心30min，除去死亡细胞；最后将上清液经10000×g离心30min，除去细胞碎片及死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留取上清液；
S4、将经过S3处理后的上清液在室温下经100000×g离心80min，去除上清液留取沉淀；将沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬，再次经100000×g离心80min，弃去上清液所得即为外泌体；
S5、取S4中的外泌体8份、去离子水60份、防腐剂4份和维生素2份进行搅拌，搅拌速率为2000r/min，搅拌时间为15min，所得记为混合液体；
S6、对S5中的混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
更进一步地，S1中的间充质干细胞为成人骨髓间充质干细胞。
更进一步地，S1中的密度为将间充质干细胞以1×106/mL的密度接种于50mL的培养瓶中。
更进一步地，S2中的PBS为1×PBS缓冲液。
更进一步地，S3中的离心环境均为室温。
更进一步地，S5中的防腐剂为苯甲酸钠，且维生素为维生素B2。
更进一步地，S6中超声分散的时间为20min。
实施例2：
本实施例的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，包括以下制作步骤：
S1、将加入10％胎牛血清的HamF12培养基分装置到培养瓶中，然后取间充质干细胞以合适的密度接种至培养瓶中，将接种后的HamF12培养基放置于含5％CO2的孵箱内在37℃条件下培养36h后，全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液；
S2、观察S1中间充质干细胞的生长情况，当细胞融合度达到90％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤三次，所得记为细胞悬浊液；
S3、取S2中的细胞悬浊液经300×g低速离心10min，除去细胞结构；再将上清液经2000×g高速离心30min，除去死亡细胞；最后将上清液经10000×g离心30min，除去细胞碎片及死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留取上清液；
S4、将经过S3处理后的上清液在室温下经100000×g离心80min，去除上清液留取沉淀；将沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬，再次经110000×g离心80min，弃去上清液所得即为外泌体；
S5、取S4中的外泌体12份、去离子水50份、防腐剂3份和维生素1份进行搅拌，搅拌速率为260r/min，搅拌时间为12min，所得记为混合液体；
S6、对S5中的混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
更进一步地，S1中的间充质干细胞为成人骨髓间充质干细胞。
更进一步地，S1中的密度为将间充质干细胞以1×106/mL的密度接种于50mL的培养瓶中。
更进一步地，S2中的PBS为1×PBS缓冲液。
更进一步地，S3中的离心环境均为室温。
更进一步地，S5中的防腐剂为苯甲酸钠，且维生素为维生素B2。
更进一步地，S6中超声分散的时间为25min。
实施例3：
本实施例的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，包括以下制作步骤：
S1、将加入10％胎牛血清的HamF12培养基分装置到培养瓶中，然后取间充质干细胞以合适的密度接种至培养瓶中，将接种后的HamF12培养基放置于含5％CO2的孵箱内在37℃条件下培养30h后，全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液；
S2、观察S1中间充质干细胞的生长情况，当细胞融合度达到90％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤三次，所得记为细胞悬浊液；
S3、取S2中的细胞悬浊液经300×g低速离心15min，除去细胞结构；再将上清液经2000×g高速离心30min，除去死亡细胞；最后将上清液经10000×g离心30min，除去细胞碎片及死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留取上清液；
S4、将经过S3处理后的上清液在室温下经100000×g离心80min，去除上清液留取沉淀；将沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬，再次经120000×g离心80min，弃去上清液所得即为外泌体；
S5、取S4中的外泌体10份、去离子水55份、防腐剂5份和维生素1份进行搅拌，搅拌速率为300r/min，搅拌时间为10min，所得记为混合液体；
S6、对S5中的混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
更进一步地，S1中的间充质干细胞为成人骨髓间充质干细胞。
更进一步地，S1中的密度为将间充质干细胞以1×106/mL的密度接种于50mL的培养瓶中。
更进一步地，S2中的PBS为1×PBS缓冲液。
更进一步地，S3中的离心环境均为室温。
更进一步地，S5中的防腐剂为苯甲酸钠，且维生素为维生素B2。
更进一步地，S6中超声分散的时间为30min。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，包括以下制作步骤：
S1、将加入10％胎牛血清的HamF12培养基分装置到培养瓶中，然后取间充质干细胞以合适的密度接种至所述培养瓶中，将接种后的HamF12培养基放置于含5％CO2的孵箱内在37℃条件下培养24-36h后，全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液；
S2、观察S1中间充质干细胞的生长情况，当细胞融合度达到90％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤三次，所得记为细胞悬浊液；
S3、取S2中的细胞悬浊液经300×g低速离心10-15min，除去细胞结构；再将上清液经2000×g高速离心30min，除去死亡细胞；最后将上清液经10000×g离心30min，除去细胞碎片及死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留取上清液；
S4、将经过S3处理后的上清液在室温下经100000×g离心80min，去除上清液留取沉淀；将所述沉淀用1×PBS缓冲液吹打重悬，再次经100000-120000×g离心80min，弃去上清液所得即为外泌体；
S5、取S4中的外泌体8-12份、去离子水50-60份、防腐剂3-5份和维生素1-2份进行搅拌，搅拌速率为200-300r/min，搅拌时间为10-15min，所得记为混合液体；
S6、对S5中的混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
2.根据权利要求1所述的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，所述S1中的间充质干细胞为成人骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，所述S1中的密度为将间充质干细胞以1×106/mL的密度接种于50mL的培养瓶中。
4.根据权利要求1所述的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，所述S2中的PBS为1×PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，所述S3中的离心环境均为室温。
6.根据权利要求1所述的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，所述S5中的防腐剂为苯甲酸钠，且所述维生素为维生素B2。
7.根据权利要求1所述的一种预防癫痫产生脑损伤的外泌体喷雾的制作工艺，其特征在于，所述S6中超声分散的时间为20-30min。
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