CN112359013A - 一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请属于干细胞培养技术领域。本申请提供了一种间充质干细胞外泌体提取液的制备方法和应用。本申请的制备方法先将间充质干细胞在完全培养基中培养，再在含有药物的基础培养基进行饥饿培养，能够得到大量的、纯度高的间充质干细胞外泌体，本申请制备得到的间充质干细胞外泌体提取液不仅具有优异的细胞增殖效果，还具有一定的抗炎和清除皮脂堆积的作用。实验结果显示，本申请制备得到的间充质干细胞外泌体能调控炎症反应，保护受损组织，降低炎症毒性伤害并提升组织耐受性，具有明显的面部痤疮治愈作用，不会造成皮肤损伤和过敏反应。
Description
技术领域
本申请属于干细胞培养技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用。
背景技术
痤疮也称为青春痘，是面部痤疮是一种常见的皮肤病，一般多见于青少年。面部痤疮有很多种类型，以面部粉刺、丘疹、脓疱、结节等多形性皮损为主。严重的还会化脓，因此面部痤疮需要及时进行治疗。现有的祛痘类药物的主要成分均为化学物质，易对人体皮肤造成损伤。
脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种多功能干细胞，在培养过程中可分泌多种外泌体(exosome，exo)，外泌体是一种微小的膜性囊泡结构，可将信息传递至损伤细胞或组织从而参与组织再生。在脐带来源脐带间充质外泌体(MSC-EXO)的研究报道中，MSC-EXO不仅具有强大的组织修复和免疫调节作用，还拥有更显著的安全性。还有研究证明，脐带MSC-EXO可以促进细胞增殖和保护细胞免受过氧化氢诱导的凋亡。
由于脐带间充质干细胞具备方便获得、增殖能力强和免疫原性低的优势，已被广泛用于再生医学及各种疾病的治疗研究。而脐带间充质干细胞外泌体能够促进皮肤成纤维细胞增殖，加速创面愈合及血管生成特性，现已越来越多用于医学美容。
但是，目前脐带间充质干细胞的提取方法很难获取大量、纯度较高的脐带间充质干细胞外泌体，无法满足其在治疗面部痤疮类皮肤疾病的治疗作用。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用，能够得到大量的、纯度高的间充质干细胞外泌体。
本申请的具体技术方案如下：
本申请第一方面提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
S1:用完全培养基分别接种三批间充质干细胞培养液进行细胞融合，分别记为第一批、第二批和第三批；
在第一批间充质干细胞培养液中加入含有药物溶液的基础培养基进行饥饿培养，离心，收集第一上清液；
S2：在第二批间充质干细胞培养液中加入所述第一上清液进行饥饿培养，离心，收集第二上清液；
S3：在第三批间充质干细胞培养液中加入所述第二上清液进行饥饿培养，离心，收集上清液得到所述间充质干细胞外泌体；
所述药物溶液的溶质为3,3’-二吲哚甲烷。
优选的，所述药物溶液的溶剂为二甲基亚砜；
所述药物溶液的溶质在所述基础培养基中的浓度为(40～60)μM。
优选的，所述第一批间充质干细胞培养液中的细胞密度为(5～6)×104个细胞/mL，所述第二批间充质干细胞培养液中的细胞密度为(4～5)×104个细胞/mL，所述第三批间充质干细胞培养液中的细胞密度为(3～4)×104个细胞/mL。
优选的，所述第二批间充质干细胞培养液与所述第一上清液的体积比为1：(1～1.5)，所述第三批间充质干细胞培养液与所述第二上清液的体积比为1：(0.5～1)。
优选的，所述完全培养基为含有10％FBS的DMEM/F12；
所述基础培养基为无酚红的1640培养基或无酚红的MEMα培养基。
优选的，所述细胞融合的融合度为85％-95％。
优选的，细胞融合之后，每一次进行饥饿培养之前，还进行：
用氯化钠注射液清洗间充质干细胞培养液。
优选的，所述饥饿培养的时间为24h，所述离心的离心力为800g-1000g，所述离心的时间为10-15min。
优选的，所述间充质干细胞选自脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
优选的，所述间充质干细胞为P3～P5代间充质干细胞。
本申请第二方面提供一种由上述制备方法制备得到的间充质干细胞外泌体。
本申请第三方面提供3,3’-二吲哚甲烷在制备间充质干细胞外泌体中的应用。
综上所述，本申请提供了一种间充质干细胞外泌体的制备方法和应用。本申请的制备方法先将间充质干细胞在完全培养基中培养，再在含有药物的基础培养基进行饥饿培养，能够得到大量的、纯度高的间充质干细胞外泌体，本申请制备得到的间充质干细胞外泌体提取液不仅具有优异的细胞增殖效果，还具有一定的抗炎和清除皮脂堆积的作用。实验结果显示，本申请制备得到的间充质干细胞外泌体能调控炎症反应，保护受损组织，降低炎症毒性伤害并提升组织耐受性；富含miRNA，在调控炎症过程中起着重要作用，其内源性miR-181c能抑制TLR4信号通路，减弱脂多糖介导的炎症反应，使中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞数量减少，TNF-α、IL-1β等炎症因子表达下降，IL-10抗炎症因子表达升高，从而达到抗炎效果，具有明显的面部痤疮治愈作用，不会造成皮肤损伤和过敏反应。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本申请实施例1和对比例1中P4代人脐带间充质干细胞复苏后的电子显微镜图片(左：放大倍数40×；右：放大倍数100×)；
图2为本申请实施例1和对比例1中P4代人脐带间充质干细胞复苏后的细胞流式检测结果；
图3为本申请实施例1和对比例1中脐带间充质干细胞外泌体的外泌体标志蛋白的Western blot结果图(左：实施例1；右：对比例1)。
具体实施方式
为使得本申请的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而非全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例所使用的试剂均为市售。
图1为本申请实施例1和对比例1中P4代人脐带间充质干细胞复苏后的电子显微镜图片(左：放大倍数40×；右：放大倍数100×)，图2为本申请实施例1和对比例1中P4代人脐带间充质干细胞复苏后的细胞流式检测结果。图1和图2说明实施例1和对比例1中使用的脐带间充质干细胞成功复苏，且复苏后的细胞存活率稳定。
实施例1
1、稀释3,3’-二吲哚甲烷(DIM)药物：用二甲基亚砜(DMSO)对DIM进行稀释，得到400mM浓度的药物母液，再用无酚红1640基础培养基将药物母液稀释到40μM的浓度备用；
2、取P4代人脐带间充质干细胞复苏，接种批次依次为第一批、第二批和第三批，接种密度分别为5×104个细胞/mL、4×104个细胞/mL和3×104个细胞/mL，分别接种于15cm培养皿，20mL/皿，细胞培养用的完全培养基为含10％FBS DMEM/F12完全培养基。于5％CO2，37℃的培养箱中培养；
3、当第一批次细胞汇合度达90％时，用氯化钠注射液清洗1次，洗去培养基颜色，每皿加入20mL步骤1中添加DIM的无酚红1640基础培养基进行饥饿培养。培养24h后收集细胞培养上清液，在1000g条件下离心15min，除去细胞碎片，取上清液备用；
4、当第二批次细胞汇合度达90％时，用氯化钠注射液清洗1次，洗去培养基颜色，每皿加入20mL步骤3中的细胞培养上清液进行饥饿培养。24h后收集细胞培养上清夜，在1000g条件下离心15min，除去细胞碎片，取上清液备用；
5、当第三批次细胞汇合度达90％时，用氯化钠注射液清洗1次，洗去培养基颜色，每皿加入20mL步骤4中的细胞培养上清液进行饥饿培养。24h后收集细胞培养上清液，在1000g条件下离心15min，除去细胞碎片，取上清液，得到脐带间充质干细胞外泌体；
6、将步骤5中得到的脐带间充质干细胞外泌体灌装到无菌西林瓶中，盖上胶塞、铝盖，-20℃保存待用。
对比例1
1、取P4代人脐带间充质干细胞复苏，接种批次依次为第一批、第二批和第三批、接种密度分别为5×104个细胞/mL、4×104个细胞/mL和3×104个/mL，分别接种于15cm培养皿，20mL/皿，细胞培养用的完全培养基为含10％FBS的DMEM/F12完全培养基。于5％CO2，37℃培养箱中培养；
2、当第一批次细胞汇合度达90％时，用氯化钠注射液清洗1次，洗去培养基颜色，每皿加入20mL无酚红的1640基础培养基进行饥饿培养。培养24h后收集细胞培养上清液，在1000g条件下离心15min，除去细胞碎片，取上清备用；
3、当第二批次细胞汇合度90％时，用氯化钠注射液清洗1次，洗去培养基颜色，每皿加入20mL步骤2中的细胞培养上清液进行饥饿培养。24h后收集细胞培养上清液，在1000g条件下离心15min，除去细胞碎片，取上清备用；
4、当第三批次细胞汇合度90％时，用氯化钠注射液清洗1次，洗去培养基颜色，每皿加入20mL步骤3中的细胞培养上清进行饥饿培养。24h后收集细胞培养上清液，在1000g条件下离心15min，除去细胞碎片，取上清液，得到脐带间充质干细胞外泌体；
5、将步骤4中得到的脐带间充质干细胞外泌体灌装到无菌西林瓶中，盖上胶塞、铝盖，-20℃保存待用。
实施例2
将实施例1和对比例1制备得到的脐带间充质干细胞外泌体进行Western blot检测和蛋白浓度检测。图3为本申请实施例1和对比例1中脐带间充质干细胞外泌体的标志蛋白的Western blot结果图(左：实施例1；右：对比例1)。可以看出，实施例1和对比例1均可得到预期的脐带间充质干细胞外泌体产物，但是在添加相同剂量的脐带间充质干细胞外泌体标志蛋白后，实施例1制备得到的脐带间充质干细胞外泌体的蛋白条带表达高于对比例1，说明实施例1制备得到的脐带间充质干细胞外泌体的纯度更高。
表1为实施例1和对比例1制得的脐带间充质干细胞外泌体的蛋白浓度检测结果，可以看出，本申请实施例1制得的脐带间充质干细胞外泌体的蛋白浓度高、纯度高。
表1实施例1和对比例1的脐带间充质干细胞外泌体的蛋白浓度检测结果
| 组别 | 蛋白浓度mg/ml |
| 对比例1 | 0.567049 |
| 实施例1 | 0.861243 |
实施例3
各选取20名面部痤疮的志愿者对实施例1以及对比例1中获得的脐带间充质干细胞外泌体进行医学评价。志愿者每日早、晚各涂抹一次，连续1个月，观察使用者面部痤疮的治愈情况，评价结果见表2。其中，疗效判定的标准为：治愈：痤疮愈合；显效：痤疮愈合80％以上；有效：痤疮愈合40％以上；无效：痤疮无改善；过敏：出现过敏情况。
表2的评价结果表明，治疗前后，实验组(实施例1)与对照组(对比例1)的面部痤疮均未出现恶化情况，且未出现过敏反应。而实验组有效率和治愈率均显著高于对照组，具有统计学意义，说明本申请制得的脐带间充质干细胞外泌体不仅具有优异的细胞增殖效果，还具有一定的抗炎和清除皮脂堆积的作用，具有明显的面部痤疮治愈效果，且不会造成皮肤损伤和过敏反应。
表2实验组与对照组面部痤疮治愈疗效的比较
注：与对照组相比，P＜0.05。
以上所述，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1:用完全培养基分别接种三批间充质干细胞培养液进行细胞融合，分别记为第一批、第二批和第三批；
在第一批间充质干细胞培养液中加入含有药物溶液的基础培养基进行饥饿培养，离心，收集第一上清液；
S2：在第二批间充质干细胞培养液中加入所述第一上清液进行饥饿培养，离心，收集第二上清液；
S3：在第三批间充质干细胞培养液中加入所述第二上清液进行饥饿培养，离心，收集上清液得到所述间充质干细胞外泌体；
所述药物溶液的溶质为3,3’-二吲哚甲烷。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述药物溶液的溶剂为二甲基亚砜；
所述药物溶液的溶质在所述基础培养基中的浓度为(40～60)μM。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一批间充质干细胞培养液中的细胞密度为(5～6)×104个细胞/mL，所述第二批间充质干细胞培养液中的细胞密度为(4～5)×104个细胞/mL，所述第三批间充质干细胞培养液中的细胞密度为(3～4)×104个细胞/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二批间充质干细胞培养液与所述第一上清液的体积比为1：(1～1.5)，所述第三批间充质干细胞培养液与所述第二上清液的体积比为1：(0.5～1)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述完全培养基为含有10％FBS的DMEM/F12；
所述基础培养基为无酚红的1640培养基或无酚红的MEMα培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞融合度为85％-95％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，细胞融合之后，每一次进行饥饿培养之前，还进行：
用氯化钠注射液清洗间充质干细胞培养液。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述饥饿培养的时间为24h，所述离心的离心力为800g-1000g，所述离心的时间为10-15min。
9.一种间充质干细胞外泌体，其特征在于，由权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到。
10.3,3’-二吲哚甲烷在制备间充质干细胞外泌体中的应用。
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