WO2019045360A2 - 액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법 Download PDF

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WO2019045360A2
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Definitions

  • the present invention relates to a method of preventing or treating keloids using liquid-phase plasma.
  • Keloid is a disease that grows abnormally fibrous tissue in wound healing process after skin damage, and it has the nature to grow around beyond the size of wound or inflammation site.
  • Clinically it is diagnosed as keloid when the epidermis is normal, the dermis is proliferated and thick, the blood vessels are abundant, and the infiltration of inflammatory cells is increased compared with normal scar tissue.
  • the collagen bundles of the normal dermis are relaxed and disorganized, whereas the keloid dermis is thick and rich in collagen bundles.
  • keloids are characterized by large, closely spaced collagen fibers consisting of numerous fibrils, with thick, irregularly arranged, hyalinized collagen called keloid collagen.
  • plasma is an ionized gas satisfying Debye sheath in physics or chemistry, and is a collection of charged particles having electric conductivity, and liquid-phase plasma means a liquid substance in which the above-mentioned plasma is treated.
  • a plasma treatment apparatus using plasma KR 10-1568380 B1
  • a plasma treatment method US 9226790 B2
  • a plasma apparatus US 6518538 B2
  • the present invention relates to a method of preventing or treating keloids using liquid-phase plasma, and the liquid-phase plasma of the present invention is expected to be widely used for the prevention and treatment of keloid, since the effect of inhibiting keloid formation and proliferation is remarkable .
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, and it relates to a method of preventing or treating keloids using liquid plasma.
  • keloids refers to a disorder in which abnormal tissue growth occurs abnormally during wound healing that occurs after skin damage, and is also referred to as a " benign dermal fibrous tumor ". It is caused by the impaired ability to control and inhibit the wound healing process properly. It is pointed out that abnormal accumulation of extracellular matrix (ECM) such as excessive secretion of collagen is caused, and it is not malignant. Unlike ordinary scars, keloids are harder, protrude above the skin surface, and have reddish, irregular features. A wide range of involvement can result in cosmetic problems if it occurs on the face or on the face, and can cause movement disorders if it occurs on important areas such as the joints.
  • ECM extracellular matrix
  • keloids may need to be distinguished from hypertrophic scars because they can penetrate into the surrounding normal skin beyond the original wound area. More specifically, keloids develop after a few months after trauma, do not improve over time, spread beyond the original lesion area, develop only in people with genetic factors, In contrast, hypertrophic scarring occurs within a short period of time after trauma, improves over time, is localized to the wound area, is common, and is independent of skin color.
  • non-thermal atmospheric pressure plasma is also referred to as a cold or non-equilibrium plasma and is a concept opposite to a thermal plasma. It can be made easily with low energy under relatively low pressure, and the temperature of the reaction gas is similar to that of the atmosphere, but the temperature of electrons is about 10 to 100 times higher than that of the atmosphere. Atmospheric and atmospheric plasma at atmospheric pressure and high pressure has the characteristic of being able to generate chemically highly reactive reactants and to promote chemical reactions that are difficult or impossible to achieve by conventional methods.
  • the plasma generating apparatus is not particularly limited as long as it can generate a non-thermal atmospheric pressure plasma.
  • the carrier gas used for generation of the non-thermal atmospheric pressure plasma is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group consisting of oxygen, nitrogen, helium, and argon, more preferably nitrogen and / or argon.
  • non-thermal plasma treated solution refers to the generation of a high-density, high-energy plasma in a liquid and can be accomplished by exposure to atmospheric pressure nonthermal plasma .
  • the term " liquid-phase plasma " can be used interchangeably with the term " plasma-conditioned liquid material " or water plasma, But it is preferably water, saline, buffer, or medium, and most preferably a medium.
  • the liquid-phase plasma of the present invention can be supplied in the form of a liquid composition, it is possible to simultaneously provide moisturization and treatment in a skin disease which is easy to circulate and carry and which is important for moisturizing. In addition, there is no risk of damage to the skin, such as a burn caused by user's erroneous operation of the apparatus, and uniform spreading over a wide and curved area, as compared with the case of directly treating the affected part of the skin with plasma.
  • the term " culture media " means a medium capable of supporting cell growth and survival in vitro , and includes culture mediums such as those conventionally used in the art Include all media. Depending on the type of cells, medium and culture conditions can be selected.
  • the basic medium used for culturing the cells is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source and a trace element component.
  • These cell culture basal media include, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F- Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, and the like.
  • treatment &quot means any action that improves or alleviates the symptoms of keloid or diseases resulting therefrom by using the liquid plasma according to the present invention.
  • compositions of the present invention that have a therapeutic effect on keloid can prevent such diseases using liquid-phase plasmas according to the present invention before the initial symptoms or symptoms of keloid appear.
  • the term " pharmaceutical composition” means a composition to be administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a liquid plasma prepared by irradiating a plasma with a liquid substance, and may include a protein involved therein and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent have.
  • the above " pharmaceutically acceptable " carrier or excipient as referred to above means approved by the regulatory agency of the government or listed in government or other generally approved pharmacopoeias for use in vertebrates, and more particularly in humans do.
  • the pharmaceutical compositions of this invention may be in the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous carrier, and may be prepared in the form of a solid or semi-solid.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may include a formulating agent such as a suspending, stabilizing, solubilizing and / or dispersing agent and may be sterilized.
  • the pharmaceutical composition may be stable under the conditions of manufacture and storage and may be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria or fungi.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may be in the form of a sterile powder for reconstitution with suitable carriers before use.
  • the pharmaceutical compositions may be presented in unit-dose form, in micro needle patches, in ampoules, or in other unit-dose containers, or in multi-dose containers.
  • the pharmaceutical composition may be stored in a freeze-dried (lyophilized) condition requiring only the addition of a sterile liquid carrier, e. G., A vehicle immediately prior to use.
  • a sterile liquid carrier e. G., A vehicle immediately prior to use.
  • the injection solutions and suspensions may be prepared from sterile powders, granules or tablets.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated, or may be included in the form of microspheres in a liquid.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may include pharmaceutically acceptable compounds and / or mixtures thereof at a concentration of between 0.001 and 100,000 U / kg.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may contain suitable excipients such as preserving agents, suspending agents, additional stabilizing agents, dyes, buffers, antimicrobial agents, antifungal agents, and isotonic agents such as, for example, .
  • the term " stabilizer" refers to a compound that is optionally used in the pharmaceutical compositions of the present invention to increase shelf life.
  • the stabilizing agent may be a sugar, an amino acid, or a polymer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also include one or more pharmaceutically acceptable carriers, which may be solvents or dispersion media.
  • pharmaceutically acceptable carriers include water, saline, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols), oils, and suitable mixtures thereof.
  • sterilization techniques applied to the pharmaceutical compositions of the present invention include filtration through a bacteria-inhibiting filter, sterilization of the terminals, incorporation of a sterile preparation, irradiation, sterilization gas irradiation, heating, vacuum drying and freeze drying do.
  • " administration " means introducing the composition of the present invention to a patient by any appropriate method, and the administration route of the composition of the present invention may be administered through any conventional route so long as it can reach the target tissue have.
  • the composition is most preferably, but not exclusively, provided in the form of being applied on the skin or injected subcutaneously or intradermally.
  • the method of treatment of the present invention may comprise administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount.
  • the effective amount may be determined depending on the kind of the disease, the severity of the disease, the kind and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of the formulation and the age, body weight, general health condition, sex and diet, And the fraction of the composition, the duration of the treatment, the drug being co-administered, and the like.
  • a method of manufacturing a plasma processing apparatus comprising the steps of: (a) filling a plasma generator with a carrier gas; (b) supplying a voltage of 1 kV to 20 kV and a frequency of 10 to 30 kHz to the plasma generator to generate a plasma; And (c) irradiating the generated plasma to a liquid material, wherein the carrier gas in the step (a) is at least one selected from the group consisting of nitrogen, helium, argon, and oxygen Wherein the carrier gas is a mixture of nitrogen and argon in a ratio of 15: 2 by volume, wherein the carrier gas is a mixture of nitrogen and argon in a ratio of 15: 2 by volume to the total volume of the liquid plasma for prevention or treatment of keloid.
  • step (b) Characterized in that the irradiation in step (b) is performed for 10 to 60 seconds per 1 ml at a distance of 0.1 cm to 15 cm from the surface of the liquid material.
  • the liquid substance in the step (c) is at least one selected from the group consisting of water, saline, buffer solution, It provides a process for the preparation of a liquid for plasma treatment.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of keloid comprising a liquid plasma prepared by any one of the above methods, wherein the pharmaceutical composition is an oral formulation, a parenteral formulation or a topical formulation Characterized in that the pharmaceutical composition is used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating keloid comprising a liquid plasma prepared by any one of the above methods, wherein the pharmaceutical composition is an oral formulation, a parenteral formulation or a topical formulation Characterized in that the pharmaceutical composition is used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers.
  • a method of preventing or treating keloid comprising administering any one of the above pharmaceutical compositions to a subject other than a human.
  • the present invention relates to a method of preventing or treating keloid using liquid-phase plasma, and the liquid-phase plasma of the present invention is expected to be widely used for prevention and treatment of keloid because of its remarkable effect of inhibiting keloid formation and proliferation.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method of manufacturing a liquid-phase plasma according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of confirming the NO production effect in direct treatment with a liquid plasma or plasma in which keroid fibroblasts are different from a carrier gas according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a result of confirming cell migration inhibitory effect upon treatment with a liquid plasma with a carrier gas in keloid fibroblasts according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the cell migration inhibitory effect of the liquid-phase plasma treatment prepared by varying the plasma treatment time for keloid fibroblasts according to an embodiment of the present invention.
  • the liquid-phase plasma was produced using an atmospheric-pressure plasma generator having a quartz or ceramic tube as a dielectric and a non-thermal plasma source of multiple nozzles.
  • the gas supply nozzle diameter of the device was less than 3 mm and was designed to generate a uniform plasma of 1 inch size for medical research.
  • Carrier gas was supplied to the apparatus at a flow rate of 10 L / min, and 2 ml of the cell culture medium was added per ml at a distance of 4 cm from the bottom surface of the dispensed culture dish (12-well plate, TPP, Renner, Dannstadt, Germany)
  • the liquid plasma was prepared by treating the plasma for 30 seconds.
  • the power supply specification of the plasma apparatus is preferably 1 to 20 kV in power and 10 to 30 kHz in average frequency, and most preferably 3 kV in power and 25 kHz in operating frequency .
  • a schematic view of a method of manufacturing the liquid-phase plasma is shown in Fig.
  • the fibroblasts isolated from the skin tissues diagnosed as keloids were named "Keloid fibroblast (KF)" as the condition beyond the original wound boundary continuously for more than one year after wound recovery in wounded skin tissue , 10 volume% FBS, and 1 volume% antibiotic / antimicrobial agent in RPMI-1640 medium at 5 vol% CO 2 and 37 ⁇ .
  • KF Kerpha fibroblast
  • the cells were grown at a density of 80 to 90 in the culture dish, subculture was performed, and trypsin was used in the passage. In the examples for the present invention, only F2 to F7 generation cells were used.
  • Plasma Human-derived keloid primary cultured fibroblasts were divided into 96-well plates at a concentration of 1 x 10 < 5 > cells / ml, and the cells were stabilized for 24 hours and then subjected to plasma treatment. Plasma was directly treated with a plasma for 30 seconds (Direct plasma) using the plasma apparatus described in Example 1, and the liquid plasma prepared by the method of Example 1 was treated. In each case, 1, respectively.
  • NTS Direct plasma treatment Liquid-Phase Plasma Processing
  • the control controls Plasma No treatment Treatment of culture medium without plasma irradiation (general culture medium)
  • N 2 Nitrogen is used as carrier gas in plasma generation
  • Argon is used as carrier gas in plasma generation
  • Nitrogen and argon are mixed as a carrier gas in the ratio of 1500: 200 when plasma is generated.
  • NO is a substance produced by nitric oxide synthase from arginine, and it is known that NO plays a role in promoting cell metabolism through the increase of intracellular cGMP.
  • the cell migration inhibition effect of the liquid plasma treated keloid fibroblast was confirmed.
  • the cells were cultured in a 12-well culture dish at a density of 5 x 10 5 / well, and the central portion of the cells of the monolayer sheet was rubbed with a tip scratch. Thereafter, the cells were washed to remove cell debris from the smear, and the cells were treated with a liquid plasma as shown in Table 1, cultured for an additional 24 hours, and then the cell migration was measured. The results are shown in Fig.
  • the cell migration was significantly inhibited in all the groups treated with the liquid plasma as compared with the control group treated with the normal culture medium. Especially, when the nitrogen / argon mixed gas was used as the carrier gas, there was.
  • Example 4 From the experimental results of Example 4, the effect of inhibiting cell migration of liquid-phase plasma produced by using a nitrogen / argon mixed gas as a carrier gas at different plasma treatment times was confirmed. The experiment was carried out in the same manner as in Example 4.
  • the effect of the treatment differs depending on the type of the carrier gas used when the plasma is generated, and when the plasma is generated by using the nitrogen / argon mixed gas as the carrier gas instead of the nitrogen or argon gas alone, And the therapeutic effect was excellent.

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Abstract

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 액상 플라즈마는 켈로이드의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 켈로이드의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법
본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
켈로이드란 피부 손상 후 발생하는 상처 치유과정에서 비정상적으로 섬유조직이 밀집되게 성장하는 질환으로 본래 상처나 염증 발생부위의 크기를 넘어서 주변으로 자라는 성질을 갖고 있다. 임상적으로, 표피는 정상이나 진피는 증식되어 두껍고 혈관이 풍부하며, 일반적인 흉터조직과 비교해서 염증세포의 침윤이 증가한 경우에 켈로이드라고 진단한다. 정상 진피의 콜라겐 다발은 이완되어 있고 배열이 흐트러져 있는데 비해서, 켈로이드의 진피는 콜라겐 다발이 두껍고 풍부한 특징이 있다. 조직학적인 특징으로, 켈로이드는 수많은 원섬유(fibril)로 이루어진 크고 넓고 밀접하게 배열된 콜라겐 섬유가 나타나는데, 소용돌이 모양으로 불규칙하게 배열된 두꺼운 유리질화(hyalinized) 콜라겐을 켈로이드 콜라겐이라고 명명한다. 이러한 켈로이드는 침범 범위가 넓어 미용적인 문제를 일으킬 뿐만 아니라 관절과 같이 중요한 부위에 발생할 경우에는 관절의 운동을 방해할 수 있으므로, 켈로이드 성향이 있는 사람은 가능한 한 불필요한 상처를 내지 않도록 주의하는 것이 무엇보다 중요하다. 그러나 부득이하게 발생한 상처에 대하여 켈로이드로 진행되지 않도록 선처방하는 방법이 부재한 실정이므로, 이에 대한 기술 개발이 시급하다 할 것이다.
한편, 플라즈마란 물리학이나 화학 분야에서 디바이 차폐(Debye sheath)를 만족하는 이온화된 기체로, 전기전도도를 가지는 전하를 띤 입자들의 집합체이고, 액상 플라즈마란 상기의 플라즈마를 처리한 액상 물질을 의미한다. 최근 플라즈마를 바이오 메디칼 분야에 적용하기 위한 노력으로, "플라즈마를 이용한 피부 치료 장치(KR 10-1568380 B1)", "플라즈마 피부 치료 방법(US 9226790 B2)", 및 "피부 표면 개질을 위한 플라즈마 장치(US 6518538 B2)" 등의 기술이 개발되고 있으나, 액상 플라즈마의 형태로 켈로이드 치료에 이용하고자 하는 기술 개발은 전무한 실정이다.
따라서 본 발명은, 액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 켈로이드의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 켈로이드의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "켈로이드(keloids)"란, 피부 손상 후 발생하는 상처 치유과정에서 비정상적으로 섬유조직이 밀집되게 성장하는 질환으로, '진피섬유양성종양(benign dermal fibrous tumor)'이라고도 명명된다. 상처치유 과정을 적절하게 조절하고 억제하는 기능의 장애에 의해서 발생하는 것으로, 콜라겐의 과도한 분비와 같은 세포외기질(ECM: Extracellular matrix)의 비정상적인 축적이 원인인 것으로 지적되고 있으며, 악성화 되지는 않는다. 켈로이드는 일반 흉터와 달리 더 단단하고, 피부면 위로 튀어 올라와 있으며, 표면이 붉고, 불규칙한 특징을 가지고 있다. 침범 범위가 넓어 안면 등에 발생할 경우 미용적인 문제를 일으킬 수 있고, 관절과 같이 중요한 부위에 발생할 경우에는 운동 장애를 유발할 수 있다.
켈로이드는 비대 흉터(hypertrophic scar)와는 달리 원래의 상처 부위를 넘어서 주변의 정상피부로 침윤해 들어갈 수 있으므로, 비대 흉터와 구분하는 것이 필요하다. 보다 구체적으로, 켈로이드는 외상 후 수개월 후에 발생하고, 시간이 지나도 호전되지 않으며, 원래 병변 부위를 넘어서 주변으로 번지며, 유전적 요인이 있는 사람에게서만 발생하며, 피부색이 짙은 사람에게서 호발하는 특징이 있는데 비하여, 비대 흉터는 외상 후 빠른 시간 내에 발생하고, 시간이 지나면서 호전되며, 상처 부위에 국한되며, 발생 빈도가 흔하며, 피부색과 무관하다.
본 발명의 일 구체예에서 "비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)"란, 저온(cold) 또는 비평형(non-equlibrium) 플라즈마라고도 명명되며 열 플라즈마(thermal plasma)에 반대되는 개념이다. 비교적 낮은 압력 하에서 낮은 에너지를 가지고 쉽게 만들어질 수 있으며, 반응 가스의 온도가 대기의 온도와 비슷하지만 전자의 온도만 그보다 약 10 내지 100 배 높은 상태에 있는 특징이 있다. 상압이나 고압에서의 비열 대기압 플라즈마는 화학적으로 반응성이 매우 큰 반응물을 생성하여, 일반적인 방법으로는 실현되기 어렵거나 불가능한 화학반응을 촉진시킬 수 있는 특성을 가지고 있다. 본 발명에 있어서 플라즈마 발생 장치는 비열 대기압 플라즈마를 발생시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용 가능하다. 비열 대기압 플라즈마 발생에 이용되는 캐리어 가스는 크게 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 산소, 질소, 헬륨, 및 아르곤으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이고, 더욱 바람직하게는 질소 및/또는 아르곤이다.
본 발명의 일 구체예에서 “액상 플라즈마(non thermal plasma treated solution, NTS)”란, 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시키는 것을 의미하며, 대기압의 상온 비열 플라즈마(nonthermal plasma, NTP)에 노출시켜 제조될 수 있다. 상기 용어 “액상 플라즈마”는 용어 “플라즈마 처리된 액상 물질(plasma-conditioned liquid material)" 또는 워터 플라즈마(water plasma)와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기의 “액상 물질”은 액상 형태의 물질은 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 물, 식염수, 완충액, 또는 배지이고, 가장 바람직하게는 배지이다.
본 발명의 액상 플라즈마는 액상 조성물의 형태로 공급 가능하므로 유통 및 휴대가 편리하고, 보습이 중요한 피부 질환에 있어서 보습과 치료를 동시에 제공하는 것이 가능하다. 또한, 피부 환부에 직접 플라즈마를 처리하는 것보다 세포 손상이 적고, 사용자의 잘못된 기기 조작에 의한 화상 등 피부 손상의 위험이 전혀 없으며, 넓고 굴곡된 면적에도 균일하게 도포 가능한 장점이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “배지(culture media)”란, 인 비트로(in vitro)에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12,(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 "치료”란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 켈로이드 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 켈로이드의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 “예방”이란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 켈로이드 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 켈로이드에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 켈로이드의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 있어서 "약학조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 플라즈마를 액상 물질에 조사하여 제조한 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물은 피부 위에 도포하거나 피하 또는 피내에 주사하는 형태로 제공되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 캐리어 가스는 질소와 아르곤을 15:2 부피%로 혼합한 것인 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 10 내지 60 초간 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 약학조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 켈로이드 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 켈로이드의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 켈로이드의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 켈로이드의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 액상 플라즈마의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 켈로이드 섬유아세포에 캐리어 가스를 달리한 액상플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리 시 NO 생성 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 켈로이드 섬유아세포에 캐리어 가스를 달리한 액상플라즈마 처리 시 세포이동 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 켈로이드 섬유아세포에 플라즈마 처리 시간을 달리하여 제조한 액상 플라즈마 처리 시 세포이동 억제 효과를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 액상 플라즈마(NTS)의 제조
액상 플라즈마는 유전체로 석영 또는 세라믹 관을 구비하고, 다중 노즐의 비열 플라즈마 소스를 구비하는 대기압 플라즈마 발생 장치를 이용하여 제조하였다. 상기 장치의 가스 공급 노즐 직경은 3mm 미만이고, 의학적 연구를 위해 1인치 크기의 균일한 플라즈마를 발생시키도록 설계되었다. 상기 장치에 캐리어 가스를 10L/min 유량으로 공급하고, 2㎖의 세포 배지가 분주된 배양 접시(12-웰 플레이트, TPP, Renner, Dannstadt, Germany)의 바닥 표면으로부터 4cm 이격된 거리에서 1㎖당 30초간 플라즈마를 처리하는 방법으로 액상 플라즈마를 제조하였다. 이 때, 플라즈마 장치의 전원 공급 장치 사양은 전력 1 내지 20 kV, 및 평균 주파수 10 내지 30 kHz인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 전력 3 kV, 및 동작 주파수 25 kHz인 것이나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 액상 플라즈마의 제조방법 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 켈로이드 섬유아세포의 배양
상처 발생된 피부 조직에서 상처 회복 후 1년 이상 지속적으로, 원래의 상처 경계를 넘어선 상태로서, 켈로이드로 진단된 피부 조직으로부터 분리된 섬유아세포를 "켈로이드 섬유아세포(Keloid Fibroblast, KF)"로 명명하고, 10 부피% FBS, 및 1 부피% 항생제/항균제가 포함된 RPMI-1640 배지로 5 부피% CO2 및 37℃ 습윤 환경에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80 내지 90 밀도로 증식한 시점에서 계대 배양을 수행하였고, 계대 시에는 트립신을 이용하였다. 본 발명을 위한 실시예에서는 F2 내지 F7 세대의 세포만을 사용하였다.
실시예 3. 켈로이드 섬유아세포에 플라즈마 처리 시 NO 생성 효과 확인
사람 유래의 켈로이드 초대배양 섬유아세포를 96-웰 플레이트에 1 × 105 cells/㎖의 농도로 분주하고 24시간 동안 세포를 안정시킨 후 플라즈마 처리하였다. 플라즈마는 상기 실시예 1에 기재된 플라즈마 장치로 세포에 직접 플라즈마를 30초간 처리하거나(Direct plasma), 실시예 1의 방법으로 제조한 액상 플라즈마를 처리하였고, 각각의 경우에 사용한 가스의 종류에 따라 표 1과 같이 분류하였다.
플라즈마 직접 처리(Direct plasma) 액상 플라즈마 처리(NTS)
대조군(control) 플라즈마 무처리(No treat) 플라즈마 조사하지 않은 배양액 처리(일반 배양액)
N2 플라즈마 발생시 캐리어 가스로 질소 사용
Ar 플라즈마 발생시 캐리어 가스로 아르곤 사용
N2/Ar 플라즈마 발생시 캐리어 가스로 질소와 아르곤을 1500:200 비율로 혼합하여 사용
플라즈마 또는 액상 플라즈마 처리 후 24시간을 추가로 배양하고, 배양액을 수집하여 배양배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 mim)하였다. NO(nitric oxide)의 정량은 그리이스 방법(Griess reagent method)을 이용하여 정량하였다. NO는 아르지닌(L-arginine)으로부터 산화 질소 합성효소에 의하여 생성되는 물질로, 세포 내 cGMP의 상승을 통해 세포 대사를 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 각 그룹의 배양액 100 ㎕와 그리이스 용액(1% sulphanilamide와 0.1% naphthylethylendiamide를 포함한 5%(v/v) phosphoric acid) 100 ㎕를 분주하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 결과를 도 2에 나타내었다.
실험 결과, ① 액상 플라즈마의 형태로 처리하는 것이 세포에 플라즈마를 직접 처리하는 것에 비하여 NO 생성이 감소되지 않는다는 것과, ② 액상 플라즈마와 플라즈마 직접 처리 모두 대조군에 비하여 NO 생성 증가 효과가 있다는 것과, ③ 질소 또는 아르곤 가스를 단독으로 사용하는 경우보다 질소/아르곤 혼합 가스를 캐리어 가스로 사용하여 플라즈마를 발생시키는 경우에 세포의 NO 생성 증가 효과가 현저하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 켈로이드 섬유아세포에 플라즈마 처리 시 세포이동 억제 효과 확인
액상 플라즈마 처리된 켈로이드 섬유아세포의 세포이동 억제 효과를 확인하였다. 이를 위해, 세포를 12-웰 배양접시에 5 x 105/웰의 밀도로 배양하였고, 단층의 시트(sheet)를 형성한 세포의 중심부를 팁으로 긁는 방법으로 도말하였다. 이후, 세척하여 도말에 의한 세포 잔해를 제거하고, 상기 표 1과 같이 액상 플라즈마를 처리하고, 24시간 추가로 배양한 후, 세포 이동을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실험 결과, 일반 배양액을 처리한 대조군에 비해서 액상 플라즈마를 처리한 모든 그룹에서 세포 이동이 유의하게 억제되었으며, 특히 질소/아르곤 혼합 가스를 캐리어 가스로 사용한 경우에 현저하게 세포 이동 효과가 좋은 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 켈로이드 섬유아세포에 플라즈마 처리 시간에 따른 세포이동 억제 효과 확인
상기 실시예 4의 실험 결과로부터, 질소/아르곤 혼합 가스를 캐리어 가스로 사용하되, 플라즈마 처리 시간을 달리하여 제조한 액상 플라즈마의 세포이동 억제 효과를 확인하였다. 실험 방법은 실시예 4와 동일하게 수행하였다.
실험 결과, 배지에 플라즈마를 10초 처리하여 액상 플라즈마를 제조한 경우에는 켈로이드 섬유아세포의 세포이동 억제 효과가 미비하였으나, 30초 처리하여 액상 플라즈마를 제조한 경우에는 대조군(일반 배양액)에 비하여 세포이동 억제 효과가 현저한 것으로 나타났다. 그러나 이 때 세포의 증식은 모든 그룹에서 비슷하게 유지되는 것을 볼 때, 상기 세포이동 억제가 세포 증식의 감소에 따른 것은 아니라는 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 실시예 1 내지 5의 결과로부터, 플라즈마를 액상 플라즈마의 형태로 처리하는 것이 플라즈마를 세포에 직접 처리하는 것에 비하여 켈로이드 치료 효과가 감소되지 않음을 알 수 있었다. 그러나 액상 플라즈마의 형태로 처리하는 것이 손상된 피부 환부에 직접 플라즈마를 처리하는 것보다 세포 손상이 적고, 사용자의 잘못된 기기 조작에 의한 화상 등 피부 손상의 위험이 전혀 없으며, 넓고 굴곡된 면적에도 균일하게 도포 가능하다는 것을 고려할 때, 액상 플라즈마가 플라즈마 직접 처리보다 의학적 유용성이 높다고 할 것이다.
또한, 플라즈마 발생 시 사용되는 캐리어 가스의 종류에 따라 치료의 효과가 상이하다는 것과, 질소 또는 아르곤 가스를 단독으로 사용하는 경우보다 질소/아르곤 혼합 가스를 캐리어 가스로 사용하여 플라즈마를 발생시키는 경우에 켈로이드 치료 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.

Claims (9)

  1. (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
    (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
    (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 캐리어 가스는 질소와 아르곤을 15:2 부피%로 혼합한 것인, 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 10 내지 60 초간 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, 켈로이드 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법.
  6. 제 1항의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는, 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는, 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
  9. 제 6항의 약학조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 켈로이드 예방 또는 치료 방법.
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