WO2019182299A1 - 피부에 대한 ｉｐｌ 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법 - Google Patents

피부에 대한 ｉｐｌ 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a skin cosmetic method using a combination of IPL (Intense Pulsed Light) irradiation and exosome treatment derived from stem cells.
  • IPL Intelligent Pulsed Light
  • the present invention relates to a skin care method for reducing skin redness, which is a side effect caused by IPL irradiation, by treating the skin with exosomes derived from stem cells along with IPL irradiation.
  • Lasers are widely used to improve the appearance of skin and to cope with skin. Since the laser beam consists of only a single wavelength of light, it is effective for the improvement of one specific skin lesion. If the skin has several types of skin lesions, each skin lesion should be irradiated with a laser beam of a different wavelength. If the laser device does not support laser beam irradiation of different wavelengths, it is inconvenient to replace the device and Even with the support of laser beam irradiation, care must be taken because the user must operate the device to change the wavelength of the laser beam.
  • IPL Intelligent Pulsed Light
  • IPL Intense Pulsed Light
  • IPL emits light at multiple wavelengths rather than a single wavelength. IPL can improve skin condition throughout the face, reducing energy than laser beams and allowing multiple intense wavelengths of light to reach the skin. Improving the skin condition of the entire face using IPL is called "Photorejuvenation”. Repeating the IPL irradiation five times every three to four weeks can improve the facial skin's condition with multiple wavelengths of light.
  • IPL is relatively safer than laser beams and is known to have fewer bruising side effects, but it also has side effects such as redness of the skin, burning or stinging of the skin and pigmentation (so-called "tiger masks").
  • the cell secretome contains a variety of bioactive factors that control the behavior (behavior) of the cell, especially in the cell secretion 'exosomes (cell) having a signaling function between cells ', And its research on the composition and function is actively underway.
  • Extracellular vesicles are called cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, may be used separately from exosomes.
  • Exosomes are tens to hundreds of nanometers of endoplasmic reticulum consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, and include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differently regulated by the environment of the secretory cell.
  • Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors depending on the nature and state of the cells from which they are derived. Stem cell-derived exosomes, which proliferate, regulate cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect stem cell characteristics related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • the present inventors have been intensively researching new applications of stem cell-derived exosomes and integrating them with medical or cosmetic technologies, and side effects of IPL irradiation when treating exosomes derived from stem cells on the skin together with IPL irradiation.
  • the present invention was completed by confirming the effect of reducing the redness of the skin.
  • An object of the present invention is to provide a skin care method using a combination of IPL (Intense Pulsed Light) irradiation and exosomes derived from stem cells.
  • IPL Intelligent Pulsed Light
  • Another object of the present invention is to provide a skin beauty method for reducing skin redness, which is a side effect of IPL irradiation, by treating the skin with exosomes derived from stem cells along with IPL irradiation.
  • the present invention comprises the steps of irradiating the skin with IPL (Intense Pulsed Light), before the IPL irradiation, during the IPL irradiation, or after the IPL irradiation, the IPL It provides a skin cosmetic method for reducing the skin redness, such as side effects due to IPL irradiation except for the treatment, comprising applying a composition containing stem cells derived from the exosomes as an active ingredient to the skin to be investigated.
  • IPL Intelligent Pulsed Light
  • exosomes refers to vesicles of a size ranging from tens to hundreds of nanometers (preferably approximately 30 to 200 nm) consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, provided that Particle size of exosomes may vary depending on the cell type, isolation method and measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes include proteins called exosome cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.).
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differently regulated by the environment of the secretory cell. Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.
  • exosome has a nano-size vesicle structure secreted by stem cells and released into the extracellular space and a vesicle having a composition similar to exosomes (eg, exosomes- Pseudo vesicles).
  • the type of the stem cells is not limited, but as an example, which does not limit the present invention, preferably may be mesenchymal stem cells, for example, fat, bone marrow, umbilical cord or cord blood-derived stem cells, more preferably Fat-derived stem cells.
  • the type of the adipose derived stem cells is not limited as long as there is no risk of infection by the pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but preferably, human adipose derived stem cells.
  • the stem cell-derived exosomes used in the present invention have an effect of reducing skin redness, which is a side effect of IPL irradiation, and do not cause adverse effects on the human body, and are derived from various stem cells that may be used in the art or may be used in the future.
  • the exosomes derived from stem cells isolated according to the isolation method of the embodiments described below should be understood as an example of the exosomes that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • IPL Intense Pulsed Light
  • IPL is light that has various wavelength ranges and is periodically emitted in the form of a strong pulse.
  • IPL for example, is light in the wavelength range of approximately 300 to 1200 nm (varies depending on the IPL device), and is periodically emitted in the form of a strong pulse.
  • IPL irradiation equipment uses a lamp flash that emits light at a wavelength of approximately 300-1200 nm and controls the wavelength of the light emitted by the filter.
  • skin care reduces, alleviates and / or ameliorates and / or soothes side effects due to IPL irradiation, such as pain, burning, stinging, redness or swelling of the skin after IPL irradiation, and the like. It has a positive effect such as shrinking pores and reducing sebum secretion.
  • the term “iontophoresis” refers to a method of allowing an ionized active ingredient to penetrate the skin with electrical repulsion by changing a skin's electrical environment by applying a potential difference by flowing a microcurrent to the skin to which the active material is applied. Means.
  • the iontophoresis used in one embodiment of the present invention is a method in which a current from an external power source flows into the electrode patch on the skin to introduce a microcurrent into the skin, and a battery is mounted on the electrode patch itself.
  • the manner in which the microcurrent is introduced the manner in which the microcurrent is introduced into the skin through a patch equipped with reversed electrodialysis means for generating a current through the difference in ion concentration between the high concentration electrolyte solution and the low concentration electrolyte solution.
  • the present invention is not limited thereto, and various methods of iontophoresis may be used.
  • the method for improving the skin condition comprises: (a) irradiating IPL to the skin of a mammal; and (b) before or after the IPL irradiation, to the skin of the mammal subject to the IPL irradiation. Applying a composition comprising a cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • the skin care method of an embodiment of the present invention can shorten downtime, which is a time taken for skin redness and swelling, which are side effects due to IPL irradiation, to disappear.
  • the skin care method of an embodiment of the present invention may further exhibit at least one effect of skin soothing, pore reduction, or sebum secretion reduction.
  • the composition may be a cosmetic composition or a skin external preparation.
  • the cosmetic composition may be a cream or lotion.
  • the component usually used in cosmetics or external preparation for skin within the range that does not impair the effects of the present invention,
  • a moisturizer, antioxidant, oily component, ultraviolet absorber, emulsifier, surfactant, thickener, alcohol, powder component, colorant, aqueous component, water, various skin nutrients, etc. can be suitably blended as needed.
  • the composition may be used in combination with a conventional skin improver and / or moisturizers in addition to the exosomes derived from stem cells, as long as the action (reduction of side effects due to IPL irradiation, etc.) is not impaired.
  • the exosomes derived from stem cells may be supported or mixed in at least one of a hydrogel, hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or a hyaluronic acid gel.
  • the type of the hydrogel is not limited, but may be preferably a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum.
  • the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention may include, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, and aerosols. It can be applied to various forms such as, mist, foundation, powder and oil paper.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition may be applied or deposited on at least one side of a patch, mask pack or mask sheet.
  • the external skin preparation of one embodiment of the present invention is prepared with a cosmetic composition, for example, for the purpose of reducing skin redness or swelling after burning IPL, reducing burning and stinging, soothing skin, shrinking pores, and reducing sebum secretion, etc.
  • Cosmetic formulations may be used in any formulations conventionally made in the art.
  • patch for example, patch, mask pack, mask sheet, supple cosmetics, nourishing cosmetics, astringent cosmetics, nourishing cream, massage cream, eye cream, cleansing cream, essence, eye essence, cleansing lotion, cleansing foam, cleansing water, sunscreen, lipstick , Soaps, shampoos, surfactant-containing cleansing, bathing agents, body lotions, body creams, body oils, body essences, body cleaners, hair dyes, hair tonic and the like, but is not limited thereto.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention comprises ingredients conventionally used in external preparations for skin and / or cosmetics, such as conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. And a carrier.
  • ingredients conventionally used in external preparations for skin and / or cosmetics such as conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings.
  • a carrier e.g., a carrier.
  • other ingredients may be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty according to the kind or purpose of use of the external preparation for skin and / or cosmetic composition.
  • Skin cosmetic method of an embodiment of the present invention (c) performing iontophoresis (iontophoresis) by flowing a microcurrent to the skin of the mammal to which the composition containing the stem cell-derived exosomes as an active ingredient is applied And (d) delivering the stem cell-derived exosomes into the mammalian skin through the microcurrent.
  • iontophoresis iontophoresis
  • the composition is, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, It can be applied to various forms such as aerosol, mist, foundation, powder and oil paper.
  • the composition may be applied or deposited on at least one side of a mask pack, mask sheet or patch.
  • the step (b) is (b1) applying the composition directly to the skin of the mammal, (b2) the mask pack, mask sheet is applied or deposited the composition Or by contacting or attaching the patch to the skin of the mammal, or by sequentially proceeding with (b1) and (b2).
  • At least one surface of the mask pack, the mask sheet or the patch includes a hydrogel, hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or a hyaluronic acid gel. At least one of the may be applied.
  • the type of the hydrogel is not limited, but may be preferably a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol. The gelling polymer and polyhydric alcohol may be exemplified in the foregoing description.
  • step (c) may be performed by contacting or attaching an iontophoresis device to the skin of the mammal.
  • the iontophoresis device is a flexible battery, lithium ion secondary battery, alkaline battery, dry cell, mercury battery, lithium battery, nickel-cadmium battery, and reverse electrodialysis battery It may include at least one battery selected from the group consisting of.
  • Skin beauty method of the present invention by treating the skin with exosomes derived from stem cells with IPL irradiation to reduce the redness of the skin side effects due to IPL irradiation and to reduce the pain, burning and stinging caused by IPL irradiation and skin It has a soothing effect.
  • the skin care method of the present invention when combined with exosomes derived from stem cells in combination with IPL irradiation can reduce downtime (downtime) which is the time taken to eliminate the redness and swelling of the skin side effects caused by IPL irradiation
  • downtime is the time taken to eliminate the redness and swelling of the skin side effects caused by IPL irradiation
  • it can also have a positive skin cosmetic effect such as shrinking skin pores and reducing sebum secretion.
  • the skin cosmetic method of the present invention is to improve the positive skin cosmetic effect and the side effect reduction effect by the IPL irradiation when applying the stem cell-derived exosomes to the skin using the iontophoresis device Can be.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a process for separating and purifying exosomes in a method for producing exosomes from stem cell culture according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of measuring the relative amount of protein (Relative amount of protein) contained in the solution for each step (step) to prepare an exosome from the stem cell culture in accordance with an embodiment of the present invention.
  • the ratio of the total amount of protein in each step is expressed as the relative ratio of the total amount of protein to the stem cell culture.
  • the experimental results show the results obtained in two different batches, respectively.
  • Figure 3 shows the results of measuring the productivity (purity) and (productivity) of the exo-some obtained in accordance with an embodiment of the present invention.
  • the productivity of the exosomes was calculated as "the number of particles of exosomes per mL of stem cell culture (CM)", and the purity of the exosomes was calculated as "the number of particles of exosomes per ⁇ g of protein contained in the final fraction”. It was.
  • the experimental results show the results obtained in five different batches.
  • 4A to 4E show the results of physical characterization of the exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • 4A shows particle size distribution and particle number by tunable resistive pulse sensing (TRPS) analysis.
  • 4B shows particle size distribution and particle number by NTA (nanoparticle tracking analysis) analysis.
  • FIG. 4C shows the particle image by magnification by means of the transmitted electron microscopy (TEM) analysis.
  • TEM transmitted electron microscopy
  • 4D shows Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • 4E shows the results of flow cytometry for CD63 and CD81 in marker analysis for exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • 5A-5C show NTA analysis results for particle size distribution showing that exosomes with uniform particle size distribution and high purity are obtained with trehalose addition. As the amount of trehalose added increases, particle size distribution results with a single peak can be obtained.
  • FIGS. 6A to 6C show NTA analysis results showing particle size distribution depending on whether trehalose is added in the preparation of exosomes according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6A shows the addition of trehalose throughout the manufacturing process
  • FIG. 6B shows freezing of the cell culture and thawing after thawing
  • FIG. 6C shows trehalo. The result obtained without adding oss is shown.
  • 6D shows the results of comparing relative productivity and relative concentration of exosomes isolated by the methods of FIGS. 6A to 6C.
  • 6E shows the mean particle size of the exosomes isolated by the methods of FIGS. 6A-6C.
  • Figure 7 shows the results confirmed that there is no cytotoxicity after treatment with exosomes according to one embodiment of the present invention to HS68 cells, human skin fibroblasts.
  • 10 is a exosome derived from the stem cell according to an embodiment of the present invention on the right side of the subject 1 after the IPL irradiation and a physiological saline is applied to the left side of the subject 1, the rubber mask (control) for 30 minutes ) Is a graph of sebum secretion measured on day 10 and 18 after treatment.
  • HS68 cells which are human dermal fibroblasts, were purchased from ATCC and were prepared by 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific). Passage was carried out in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • Fat-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 , 37 ° C. according to cell culture methods known in the art. Then, washed with phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, phenol-free medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant (hereinafter, culture) was recovered. .
  • phosphate-buffered saline purchased from ThermoFisher Scientific
  • exosomes In the separation of exosomes, 2% by weight of trehalose was added to the culture to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity. After the addition of trehalose, the culture solution was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste, and large particles. The filtered culture immediately separated the exosomes through a separation process. In addition, the filtered culture was stored in the refrigerator (image 10 °C or less) and then used for exosome separation. In addition, the filtered culture solution was stored frozen in an cryogenic freezer of -60 °C or less and thawed and then exosomes were separated. Thereafter, exosomes were separated from the culture using a tangential flow filtration device (TFF).
  • TMF tangential flow filtration device
  • Example 1 the exosomes were separated from the culture medium filtered with a 0.22 ⁇ m filter, and the TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for concentration, desalting and diafiltration.
  • the filter for the TFF method was a cartridge filter (aka hollow fiber filter; purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore).
  • TFF filters can be selected by various molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by the selected MWCO, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, and small molecule compounds smaller than MWCO were removed.
  • MWCO molecular weight cutoffs
  • MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da TFF filter was used to isolate and concentrate the exosomes.
  • the culture solution was concentrated to a volume of 1/100 to 1/25 by using the TFF method, while exosomes were separated by removing substances smaller than MWCO.
  • the separated and concentrated exosome solution was further subjected to desalting and diafiltration using the TFF method.
  • desalting and buffer exchange were carried out continuously (discontinuous diafiltration) or at least 4 times, preferably 6 times to 10 times, more preferably, relative to the starting volume. It was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more.
  • To the buffer solution was added 2% by weight of trehalose dissolved in PBS to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity.
  • Figures 6A to 6E The results of confirming the effect of obtaining a high purity and uniform particle size distribution of exosomes according to the trehalose treatment in a high yield are shown in Figures 6A to 6E.
  • the amount of protein in the isolated exosomes, cultures, and fractions of TFF separation was measured using BCA coloration (purchased from ThermoFisher Scientific) or FluoroProfile fluorescence (purchased from Sigma).
  • Exosome is isolated and concentrated by the TFF method of one embodiment of the present invention, and the degree of protein, lipid, nucleic acid, low molecular weight compounds, etc. is monitored by protein quantitation and the results are shown in FIG. As a result, it was found that the protein present in the culture medium was effectively removed by the TFF method of one embodiment of the present invention.
  • the isolated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis (NTA; purchased from Malvern) or tunable resistive pulse sensing (TRPS; purchased from Izon Science).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • TRPS tunable resistive pulse sensing
  • the uniformity and size of the isolated exosomes were analyzed using a transmitted electron microscopy (TEM).
  • TRPS, NTA, TEM analysis results of the exosomes isolated in accordance with one embodiment of the present invention are shown in Figures 4A to 4C.
  • FIGS. 5A to 5C the results of NTA analysis of the size distribution of the exosomes depending on whether trehalose was added are shown in FIGS. 5A to 5C.
  • Trehalose concentrations were increased to 0%, 1% and 2% by weight (from top to bottom in FIGS. 5A-5C) and were repeated three times.
  • trehalose is not present, particles having a size of 300 nm or more are identified, while increasing the amount of trehalose added decreases the particles having a size of 300 nm or more and makes the size distribution of exosomes uniform. .
  • Figure 4D shows the results of Western blot for exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention, confirming the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers.
  • Anti-CD9 purchased from Abcam
  • anti-CD63 purchasedd from System Biosciences
  • anti-CD81 purchasedd from System Biosciences
  • anti-TSG101 purchasedd from Abcam
  • Figure 4E confirmed the presence of CD63 and CD81 markers as a result of analysis using a flow cytometer for the exosomes isolated in accordance with the method of one embodiment of the present invention.
  • an exosome-human CD63 separation / detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
  • PE-mouse anti-human CD63 PE-Mouse anti markers were stained using -human CD63
  • PE-mouse anti-human CD81 purchasedd from BD
  • the present invention confirms that exosomes with high purity and uniform particle size distribution can be efficiently and efficiently separated and purified in high yield by adding trehalose in the manufacturing process using tangential flow filtration.
  • the processes of the separation method of one embodiment of the present invention are scale-up and suitable for GMP.
  • HS68 cells which are human skin fibroblasts
  • HS68 cells were treated with exosomes at different concentrations, and cell proliferation rates were confirmed.
  • HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS and then aliquoted to have a confluency of 80-90% and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed and the exosomes prepared in Example 2 were treated for each concentration, and cultured for 24 to 72 hours to evaluate cell viability.
  • WST-1 reagent purchased from Takara
  • MTT reagent purchased from Sigma
  • CellTiter-Glo reagent purchased from Promega
  • Aramamar blue reagent Measurements were performed using alamarBlue reagent (purchased from ThermoFisher Scientific) and a microplate reader (purchased from Molecular Devices).
  • the comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosomes, it was confirmed that no cytotoxicity by the exosomes of the present invention within the concentration range tested (Fig. 7).
  • IPL was irradiated on the face of a human using IPL equipment, cellec (JCIS Medical, Geumcheon-gu, Seoul, Korea). [IPL parameters were as follows: wavelength 560nm; Wavelength energy 17 J / cm 2 ; Probe interval on 3ms / off 20ms / on 4ms; 2 pass].
  • Red phase change rate [(red phase measured on N day)-(red phase on the day after procedure)] / (red on the day after procedure) group)(%).
  • the red face of the face which is a side effect due to IPL irradiation in the right face of the subject 1 treated with the stem cell-derived exosome of one embodiment of the present invention compared to the left face of the subject 1 treated with the physiological saline treated as a control group. (redness) was found to be significantly reduced (Fig. 8).
  • the skin pore size and sebum secretion of Subject 1 were measured using Mark-View Facial Skin Analyzer on the 10th and 18th day of the treatment as described above, which was measured on the day before the IPL procedure. Compared with size and sebum secretion respectively. As a result, the skin pores size and sebum secretion were significantly reduced in the right face of the subject 1 treated with the stem cell-derived exosomes of one embodiment of the present invention compared to the left face of the subject 1 treated with physiological saline. It could be confirmed (FIGS. 9 and 10).
  • Subject 1 was asked to answer a questionnaire about pain, burning and tingling, and skin soothing effects.
  • Subject 1 responded that the stem cell-derived exosomes had less pain, burning and stinging due to IPL irradiation, and had a skin soothing effect than the sites treated with physiological saline.
  • IPL was irradiated on the subject 2's face.
  • 1 ml of stem cell-derived exosomes (2 ⁇ 10 9 particles / mL concentration) (exosomes prepared in Example 2) stock solution (suspension) of one embodiment of the present invention was applied to the right side of subject 2
  • the left face of Subject 2 was coated with physiological saline.
  • the iontophoresis was performed on the right face, and a rubber mask was laminated and pressed on the left face for 30 minutes.
  • Iontoporesis was performed by flowing a 0.5 mA microcurrent for 20-30 minutes to the right face of stem cell-derived exosomes using iontophoresis equipment (IONZYME) (purchased from Environ). .
  • IONZYME iontophoresis equipment
  • Red phase change rate [(red phase measured on N day)-(red phase on the day before procedure)] / (red on the day before procedure) group)(%).
  • red face of the face which is a side effect of IPL irradiation compared to the left face of subject 2 treated with physiological saline as a control group on the right face of subject 2 treated with exosomes derived from stem cells of one embodiment of the present invention (redness) was found to be significantly reduced (Fig. 11).
  • the skin pore size and sebum secretion of Subject 2 were measured using Mark-View Facial Skin Analyzer at 18 days after the above treatment, and the skin pore size and sebum of Subject 2 measured on the day before IPL procedure. The amount of secretion was compared with each gig. As a result, the skin pores size and sebum secretion were significantly reduced compared to the left face of the subject 1 treated with physiological saline in the right face of the subject 2 treated with exosomes derived from stem cells of one embodiment of the present invention. It could be confirmed (FIGS. 12 and 13).
  • Subject 2 was asked to answer a questionnaire about pain, burning, stinging, and skin soothing effects.
  • Subject 2 responded that the stem cell-derived exosomes had less pain, burning and stinging due to IPL irradiation, and had a skin soothing effect than the sites treated with physiological saline.
  • IPL was irradiated on the subject 3's face.
  • 1 ml of stem cell-derived exosomes (5.87 ⁇ 10 7 particles / mL concentration) (exosome prepared in Example 2) of the stock solution (suspension) was applied to the right side of the subject 3
  • the left face of subject 3 was coated with physiological saline.
  • the iontophoresis was performed on the right face, and a rubber mask was laminated and pressed on the left face for 30 minutes.
  • Iontoporesis was performed by flowing a 0.5 mA microcurrent for 20-30 minutes to the right face of stem cell-derived exosomes using iontophoresis equipment (IONZYME) (purchased from Environ). .
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Abstract

본 발명은 (a) IPL(Intense Pulsed Light)을 포유동물의 피부에 조사하는 단계와, (b) 상기 IPL 조사 전 또는 후에, 상기 IPL 조사 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 피부 미용방법을 제공한다. 본 발명의 피부 미용방법은 IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 IPL 조사 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기(redness)를 감소시키고 IPL 조사로 인한 통증, 화끈거림 및 따가움 감소와 피부 진정(soothing) 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 피부 미용방법에 따라 IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 모공 축소 및 피지분비 감소라는 긍정적인 피부 미용 효과도 나타낼 수 있다.

Description

피부에 대한 ＩＰＬ 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법
본 발명은 피부에 대한 IPL(Intense Pulsed Light) 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법에 관한 것이다.
얼굴이나 신체 등의 외모에 대한 관심이 증가함에 따라 피부 상태를 개선하고 외모의 부족한 부분을 보완하고자 하는 미용 수요가 늘어나고 있다.
피부 외관 상태 개선 및 피부 미용을 위해 레이저가 광범위하게 사용되고 있다. 레이저 빔은 단일 파장의 빛으로만 구성되기 때문에 특정한 한 가지의 피부 병변의 개선에 효과적이다. 피부에 여러 종류의 피부 병변을 갖는 경우 각 피부 병변 마다 다른 파장의 레이저 빔을 조사해야 하는데, 레이저 기기가 여러 파장의 레이저 빔 조사를 지원하지 않는 경우에는 기기를 교체해야 하는 불편이 있고 여러 파장의 레이저 빔 조사를 지원하더라도 사용자가 레이저 빔의 파장 변경을 위해 기기 조작을 해야 하므로 세심한 주의가 필요하다.
IPL(Intense Pulsed Light)은 원래 혈관질환을 치료할 목적으로 개발되었다. IPL은 레이저와 달리, 단일 파장이 아니라 복합적인 파장의 빛을 방출한다. IPL은 얼굴 전체의 피부 상태를 개선할 수 있는데, 레이저 빔 보다 에너지를 줄이며 복합적인 파장의 강한 빛을 피부에 나눠서 도달하게 할 수 있다. IPL을 이용한 얼굴 전체의 피부 상태 개선을 "Photorejuvenation"이라고 부른다. IPL 조사를 3~4주 간격으로 5회 정도 반복하게 되면 복합적인 파장의 빛에 의해 얼굴 피부 상태를 개선할 수 있다.
IPL은 레이저 빔 보다 상대적으로 안전하고 멍과 같은 부작용이 적은 것으로 알려져 있으나, 피부가 붉게(redness) 되고 피부가 화끈거리거나 따가운 부작용이나 색소침착(소위, "타이거 마스크") 등의 부작용이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 IPL의 강도를 세밀하게 조정할 수 있는 장비들이 개발되고 있고, 보호 크림을 피부에 도포하고 IPL을 조사하는 방법 등 부작용을 최소화하는 방법이 제안되고 있다. 그러나 이러한 IPL 시술 장비와 시술기법의 개선에도 불구하고 부작용은 여전히 발생하고 있다. 따라서, IPL 조사에 따른 부작용을 최소화하기 위한 다른 측면에서의 연구가 필요하다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 줄기세포 유래의 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하면 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 피부에 대한 IPL(Intense Pulsed Light) 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IPL(Intense Pulsed Light)을 피부에 조사하는 단계와, 상기 IPL 조사 전(前), 상기 IPL 조사 동안, 또는 상기 IPL 조사 후(後), 상기 IPL 조사 대상이 되는 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "IPL(Intense Pulsed Light)"은 다양한 파장 범위를 갖고 강한 펄스 형태로 주기적으로 방출되는 빛이다. IPL은 예를 들어, 대략 300~1200nm (단, IPL 기기에 따라 가변됨) 파장 범위의 빛으로서, 강한 펄스 형태로 주기적으로 방출된다. IPL을 조사하는 기기는 대략 300~1200nm의 파장의 빛을 방사시키는 램프 플래쉬를 이용하고 필터를 사용해서 나오는 빛의 파장을 조절한다.
본 명세서에서 용어, "피부 미용"은 IPL 조사로 인한 부작용, 예를 들어 IPL 조사 후 통증, 화끈거림, 따가움, 피부가 붉어지거나 붓는 현상 등을 감소, 완화 및/또는 개선하고/하거나, 피부 진정, 모공 축소, 피지분비 감소 등의 긍정적인 효과를 가져오는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 구체예의 피부 상태의 개선 방법은, (a) IPL을 포유동물의 피부에 조사하는 단계와, (b) 상기 IPL 조사 전 또는 후에, 상기 IPL 조사 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은 피부 진정(soothing), 모공 축소, 또는 피지분비 감소 중 적어도 하나의 효과를 추가로 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 화장료 조성물은 크림 또는 로션일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(IPL 조사로 인한 부작용 감소 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 예를 들어, IPL 시술 후 피부가 붉어지거나 붓는 현상 감소, 화끈거림 및 따가움 감소, 피부 진정, 모공축소, 피지분비 감소 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, (c) 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함할 수 있다.
본 발명의 피부 미용방법은 IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기(redness)를 감소시키고 IPL 조사로 인한 통증, 화끈거림 및 따가움 감소와 피부 진정(soothing) 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 피부 미용방법에 따라 IPL 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 모공 축소 및 피지분비 감소라는 긍정적인 피부 미용 효과도 나타낼 수 있다.
추가로, 본 발명의 피부 미용방법은 줄기세포 유래의 엑소좀을 이온토포레시스 장치를 이용하여 피부에 적용할 경우 IPL 조사에 의한 부작용 감소 효과 및 전술한 바와 같은 긍정적인 피부 미용 효과를 향상시킬 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4A 내지 도 4E는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5A 내지 도 5C는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6A 내지 도 6C는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 IPL 조사 후 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽에는 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 도포하고 실험대상자 1의 얼굴 왼쪽에는 생리적 식염수를 도포한 다음, 30분간 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 10일째 및 18일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 9는 IPL 조사 후 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽에는 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 도포하고 실험대상자 1의 얼굴 왼쪽에는 생리적 식염수를 도포한 다음, 30분간 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 10일째 및 18일째에 피부 모공 크기를 측정한 결과 그래프이다.
도 10은 IPL 조사 후 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽에는 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 도포하고 실험대상자 1의 얼굴 왼쪽에는 생리적 식염수를 도포한 다음, 30분간 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 10일째 및 18일째에 피지분비량을 측정한 결과 그래프이다.
도 11은 IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고, 얼굴 오른쪽에는 이온토포레시스를 수행하고 얼굴 왼쪽에는 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 18일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 12는 IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고, 얼굴 오른쪽에는 이온토포레시스를 수행하고 얼굴 왼쪽에는 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 18일째에 피부 모공 크기를 측정한 결과 그래프이다.
도 13은 IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고, 얼굴 오른쪽에는 이온토포레시스를 수행하고 얼굴 왼쪽에는 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 18일째에 피지분비량을 측정한 결과 그래프이다.
도 14는 IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 3의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고, 얼굴 오른쪽에는 이온토포레시스를 수행하고 얼굴 왼쪽에는 러버 마스크(control)를 적용한 처치 후 42일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6A 내지 도 6E에 도시하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5A 내지 도 5C에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5A 내지 도 5C의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6A 내지 도 6C에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 제조과정에서 트레할로오스를 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).
실시예 5: 사람 안면에 대한 IPL 조사와 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 처리
실시예 5-1: 1차 안면부 임상 실험
IPL 장비인 셀렉(cellec)(주식회사 제이시스 메디칼, 대한민국 서울시 금천구 소재)를 사용하여 IPL을 사람의 얼굴에 조사하였다[IPL 파라미터는 다음과 같음: 파장 560nm; 파장 에너지 17 J/cm2; 조사 간격 on 3ms /off 20ms /on 4ms; 2 패스(pass)].
실험대상자 1의 안면을 깨끗이 닦은 후 30분간 마취제를 안면에 도포하고 IPL을 조사하였다. IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀 (2×109 입자/mL 농도)(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽에 도포하였고, 실험대상자 1의 왼쪽 얼굴에는 생리적 식염수를 도포하였다. 그리고 실험대상자 1의 얼굴 위에 30분 동안 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다.
상기와 같은 처치 후 10일째 및 18일째에 대한민국 경기도 소재의 피에스아이 플러스(주)의 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 실험대상자 1의 안면 붉은기를 측정하였고, 이를 IPL 시술 후 당일에 측정된 실험대상자 1의 안면 붉은기와 비교하였다. 실험대상자 1의 붉은기의 변화율(% Change of Redness)을 다음 수식에 의하여 분석하였다: 붉은기 변화율 = [(N일째 측정된 붉은기)-(시술 후 당일 붉은기)]/(시술 후 당일 붉은기)(%). 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 1의 오른쪽 얼굴에서 대조군인 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 1의 왼쪽 얼굴에 비해 IPL 조사로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)가 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 8).
또한, 상기와 같은 처치 후 10일째 및 18일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 실험대상자 1의 피부 모공 크기 및 피지분비량을 측정하였고, 이를 IPL 시술 전 당일에 측정된 실험대상자 1의 피부 모공 크기 및 피지분비량과 각각 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 1의 오른쪽 얼굴에서 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 1의 왼쪽 얼굴에 비해 피부 모공 크기 및 피지분비량이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 9 및 도 10).
한편, 실험대상자 1에게 통증, 화끈거림 및 따가움 감소와 피부 진정 효과에 대한 설문조사에 대해 답하도록 하였다. 이에 대해 실험대상자 1은 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 부위가 생리적 식염수를 처리한 부위에 비해 IPL 조사로 인한 통증, 화끈거림 및 따가움이 적었고 피부 진정 효과가 있다고 응답하였다.
실시예 5-2: 2차 안면부 임상 실험
실시예 5-1에 기술된 방식과 동일한 방식으로, IPL을 실험대상자 2의 안면에 조사하였다. IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀 (2×109 입자/mL 농도)(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽에 도포하였고, 실험대상자 2의 왼쪽 얼굴에는 생리적 식염수를 도포하였다. 그리고 나서 오른쪽 얼굴에는 이온토포레시스를 수행하였고 왼쪽 얼굴 위에는 30분 동안 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다. 이온토포레시스는 이온토포레시스 장비(IONZYME)(Environ에서 구입)를 사용하여 줄기세포 유래의 엑소좀이 도포된 오른쪽 얼굴에 20~30분 동안 0.5 mA의 미세전류를 흘려주는 방식으로 수행하였다.
상기와 같은 처치 후 18일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 실험대상자 2의 안면 붉은기를 측정하였고, 이를 IPL 시술 전 당일에 측정된 실험대상자 2의 안면 붉은기와 비교하였다. 실험대상자 2의 붉은기의 변화율(% Change of Redness)을 다음 수식에 의하여 분석하였다: 붉은기 변화율 = [(N일째 측정된 붉은기)-(시술 전 당일 붉은기)]/(시술 전 당일 붉은기)(%). 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 2의 오른쪽 얼굴에서 대조군인 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 2의 왼쪽 얼굴에 비해 IPL 조사로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 11).
또한, 상기와 같은 처치 후 18일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 실험대상자 2의 피부 모공 크기 및 피지분비량을 측정하였고, 이를 IPL 시술 전 당일에 측정된 실험대상자 2의 피부 모공 크기 및 피지분비량과 각긱 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 2의 오른쪽 얼굴에서 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 1의 왼쪽 얼굴에 비해 피부 모공 크기 및 피지분비량이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 12 및 도 13).
한편, 실험대상자 2에게 통증, 화끈거림 및 따가움 감소와 피부 진정 효과에 대한 설문조사에 대해 답하도록 하였다. 이에 대해 실험대상자 2는 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 부위가 생리적 식염수를 처리한 부위에 비해 IPL 조사로 인한 통증, 화끈거림 및 따가움이 적었고 피부 진정 효과가 있다고 응답하였다.
실시예 5-3: 3차 안면부 임상 실험
실시예 5-1에 기술된 방식과 동일한 방식으로, IPL을 실험대상자 3의 안면에 조사하였다. IPL 조사 후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀 (5.87×107 입자/mL 농도)(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 실험대상자 3의 얼굴 오른쪽에 도포하였고, 실험대상자 3의 왼쪽 얼굴에는 생리적 식염수를 도포하였다. 그리고 나서 오른쪽 얼굴에는 이온토포레시스를 수행하였고 왼쪽 얼굴 위에는 30분 동안 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다. 이온토포레시스는 이온토포레시스 장비(IONZYME)(Environ에서 구입)를 사용하여 줄기세포 유래의 엑소좀이 도포된 오른쪽 얼굴에 20~30분 동안 0.5 mA의 미세전류를 흘려주는 방식으로 수행하였다.
상기와 같은 처치 후 42일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 실험대상자 3의 안면 붉은기를 측정하였고, 이를 IPL 시술 전 당일에 측정된 실험대상자 3의 안면 붉은기와 비교하였다. 실험대상자 3의 붉은기의 변화율(% Change of Redness)을 다음 수식에 의하여 분석하였다: 붉은기 변화율 = [(N일째 측정된 붉은기)-(시술 전 당일 붉은기)]/(시술 전 당일 붉은기)(%). 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 3의 오른쪽 얼굴에서 대조군인 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 3의 왼쪽 얼굴에 비해 IPL 조사로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)가 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 14).
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (13)

  1. (a) IPL(Intense Pulsed Light)을 포유동물의 피부에 조사하는 단계와,
    (b) 상기 IPL 조사 전 또는 후에, 상기 IPL 조사 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 IPL 조사로 인한 피부 부작용을 감소시키는 피부 미용방법.
  2. 제1항에 있어서,
    IPL 조사로 인한 피부 붉은기, 화끈거림, 따가움 또는 통증 중 적어도 하나를 감소시키는, 피부 미용방법.
  3. 제2항에 있어서,
    IPL 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시키는, 피부 미용방법.
  4. 제3항에 있어서,
    피부 진정(soothing), 모공 축소, 또는 피지분비 감소 중 적어도 하나의 효과를 추가로 나타내는, 피부 미용방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 현탁액인 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제인 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 크림 또는 로션인, 피부 미용방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 피부 미용방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는, 피부 미용방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (b1) 상기 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행되는, 피부 미용방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행되는, 피부 미용방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하는, 피부 미용방법.
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