WO2024010157A1 - 모유두 세포를 포함하는 조성물 - Google Patents

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WO2024010157A1
WO2024010157A1 PCT/KR2022/020123 KR2022020123W WO2024010157A1 WO 2024010157 A1 WO2024010157 A1 WO 2024010157A1 KR 2022020123 W KR2022020123 W KR 2022020123W WO 2024010157 A1 WO2024010157 A1 WO 2024010157A1
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WO
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cells
hair
dermal papilla
papilla cells
cell
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PCT/KR2022/020123
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English (en)
French (fr)
Inventor
황주영
정매
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주식회사 에피바이오텍
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a composition containing dermal papilla cells isolated from human scalp. Specifically, the present invention relates to a composition for treating or preventing hair loss comprising administering human-derived dermal papilla cells at 10,000 cells/cm 2 to 100,000 cells/cm 2 per unit area by subcutaneous or dermal injection.
  • the present invention relates to a method of treating or preventing hair loss by administering dermal papilla cells to a patient at a dose of 10,000 cells/cm 2 to 100,000 cells/cm 2 per unit area.
  • Human hair is a collection of approximately 100,000 individual hairs, which are produced by hair follicles. Hair follicles serve as a reservoir of stem cells that can generate all the cell lines needed to reconstruct the hair follicle itself, the epithelium, and the sebaceous glands. There is a hair follicle bulb at the base of the hair follicle, and matrix cells that proliferate in the follicle bulb become hair.
  • the hair follicle bulb contains dermal sheath cup (DSC) cells and dermal papilla cells (DPC). Dermal papilla cells are mesenchymally-derived fibroblasts located at the base of hair follicles and are key cells responsible for hair development and growth.
  • DSC dermal sheath cup
  • DPC dermal papilla cells
  • anagen phase which is the period during which hair grows
  • catagen phase which is a stage in which hair follicles shrink as overall apoptosis of hair follicle cells occurs for 10 to 14 days after the anagen phase
  • a telogen phase which is a phase in preparation for the next growth period that lasts an average of 3 months.
  • the reason why the length of hair varies depending on the area is because the duration of the growth phase, which is a unique characteristic of the hair follicle, is different for each area.
  • human hair since human hair has a certain hair growth cycle, it always maintains a certain number of hairs.
  • the dermal papilla cells present in the hair root become smaller, and as the dermal papilla cells become smaller, the thickness of the hair becomes thinner, and at the same time, the hair growth cycle becomes shorter. Therefore, as hair loss progresses, the hair becomes very thin and the hair growth cycle becomes shorter, causing it to grow a little and then fall out.
  • the most frequently used hair loss treatments in Korea include finasteride (brand name Propecia), dutasteride (brand name Avodart), and minoxidil (brand name Minoxil or Rogaine).
  • finasteride brand name Propecia
  • dutasteride brand name Avodart
  • minoxidil brand name Minoxil or Rogaine
  • the above treatments have side effects such as decreased libido, erectile dysfunction, loss of ability to drive and perform, itchiness at the application site, erythema, skin irritation, and eye irritation, and unwanted hair growth may be observed in other body parts other than the head. do.
  • hair transplant surgery has recently been attempted for patients with severe hair loss, but the high cost and side effects after the procedure have been pointed out as limitations.
  • the present inventors completed the present invention by confirming the specific number of cells per unit area that have a hair loss treatment effect by promoting hair growth when isolated or cultured dermal papilla cells are administered subcutaneously or dermically.
  • Patent Document 0001 Korean Patent No. 10-2406953
  • the present invention provides a composition for treating or preventing hair loss, comprising human-derived dermal papilla cells, and administering the dermal papilla cells by subcutaneous injection or dermal injection at 10,000 cells/cm 2 to 100,000 cell/cm 2 per unit area.
  • the purpose is to
  • the present invention aims to provide a method of treating or preventing hair loss by administering the composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition that contains dermal papilla cells and is administered by subcutaneous injection or dermal injection at 10,000 cells/cm 2 to 100,000 cell/cm 2 per unit area.
  • the number of dermal papilla cells administered per unit area may be 25,000 cell/cm 2 to 75,000 cell/cm 2 , and more preferably 25,000 cell/cm 2 .
  • the dermal papilla cells may be of human origin.
  • the dermal papilla cells may be isolated by a method comprising culturing the dermal papilla tissue isolated from the scalp under hypoxic conditions and attaching the dermal papilla cells to a culture plate, wherein the hypoxic conditions have an oxygen saturation of 0.5 to 5%. It may have an oxygen saturation of 2%.
  • the pharmaceutical composition can treat or prevent hair loss.
  • composition containing dermal papilla cells according to the present invention has the effect of treating or preventing hair loss by administering the dermal papilla cells at 10,000 cells/cm 2 to 100,000 cell/cm 2 per unit area by subcutaneous or dermal injection.
  • Figure 1 shows the results of monitoring skin darkening after administration of dermal papilla cells in mice.
  • Figure 2 shows the results of measuring the weight of hair obtained 14 days after administration of dermal papilla cells in mice.
  • Figure 3 shows the experimental process to confirm the effective administration dose in pigs.
  • Figure 4 shows the results of measuring the number of hairs per unit area one month after administration of dermal papilla cells in pigs.
  • Figure 5 shows the results of measuring hair thickness one month after administration of dermal papilla cells in pigs.
  • “dermal papilla cells (DPC)” are mesenchymally-derived fibroblasts located at the base of hair follicles and are key cells responsible for the development and growth of hair.
  • hair loss used in the present invention refers to the absence of hair in areas where hair should normally exist, regardless of the cause, and includes alopecia areata, hereditary androgen alopecia, telogen effluvium, traumatic alopecia, hair growth wall, and compressive alopecia. It may be alopecia, anagen alopecia, pityroid alopecia, syphilitic alopecia, seborrheic alopecia, symptomatic alopecia, cicatricial alopecia, or congenital alopecia, but is not limited thereto.
  • prevention refers to any act of suppressing or delaying the onset of a disease by administering a composition
  • treatment refers to improving or beneficially improving the symptoms of an individual suspected of having a disease or developing a disease by administering a composition. It means any action that changes.
  • treatment refers to a treatment that improves hair loss symptoms by delaying or stopping hair loss by administering a composition, or beneficially changes hair loss symptoms, such as promoting hair growth and hair growth, such as lengthening or increasing the number of hairs. It means all actions.
  • the bottom of a sterilized 100 mm Petri dish was filled with 20 mL of 4% FBS-containing isolation/culture medium to submerge the scalp tissue collected from the donor and stored to prevent the scalp tissue from drying out.
  • After placing the tissue on the bottom of the Petri dish it was cut into strips without overlapping hair follicles using a disposable scalpel, and the cut tissue strips were stored in a Petri dish containing the separation medium where the tissue was stored.
  • the cut tissue strip was placed on the bottom of a new Petri dish, and then hair follicles were separated one by one using a disposable scalpel and stored in a Petri dish containing new medium.
  • a 150 mm Petri dish was placed on the stereomicroscope stage, and one hair follicle isolated in Example 1 was placed thereon. Then, a drop of separation medium was added using a 1 mL syringe to prevent the dish from drying out.
  • a disposable scalpel the border between the dermal sheath cup (DSC) and the upper dermal sheath (UDS) of the hair follicle was cut.
  • DSC dermal sheath cup
  • UDS upper dermal sheath
  • DP dermal papilla
  • the separated dermal papilla tissue was placed on the tip of a syringe needle and transferred to a 6-well plate (CellBind surface). Twelve pieces of dermal papilla tissue were inoculated per well, placed in an incubator without shaking the plate, and cultured for 5 to 10 days. Then, the medium was changed once or twice every 2 to 3 days until the confluency reached 60%. Replaced (p0).
  • mice After shaving the backs of 7-week-old C3H/HeN mice, they were divided into five test groups as shown in Table 1 below, and each of the three test groups was given a low dose (1x10 4 ), a medium dose (1x10 5 ), and a high dose (5x10 5 ) of dermal papillae.
  • Cells (EPI-001) were injected subcutaneously. At this time, the same volume of water for injection was injected subcutaneously as a negative control, and 50 ⁇ l of minoxidil (nanoxidil) was applied at 2% as a positive control.
  • test substance Capacity (cell count) Suspension ( ⁇ l/point) Route of administration One excipient 0 200 Subcutaneous injection 2 EPI-001 (low dose) 1x10 4 200 Subcutaneous injection 3 EPI-001 (medium capacity) 1x10 5 200 Subcutaneous injection 4 EPI-001 (high capacity) 5x10 5 200 Subcutaneous injection 5 minoxidil 2% - Apply 50 ⁇ l
  • Example 2 Based on the experimental results in these mice, the experiment in Example 2 below was performed to confirm the effective dose showing excellent effects.
  • FIG. 3 After shaving the back of a 5-week-old male Farm Pig weighing 15 to 20 kg, an administration site of 4 cm 2 per test substance was marked as shown in FIG. 3 (A: EPI-001 (1x10 5 ), B: Excipient, C : EPI-001(3x10 5 )).
  • A EPI-001 (1x10 5 )
  • B Excipient
  • C EPI-001(3x10 5 )
  • the test group was injected intradermally with 1x10 5 cell/4cm 2 and 3x10 5 cell/4cm 2 dermal papilla cells (EPI-001), respectively, and the negative control group was injected intradermally with water for injection as an excipient.
  • EPI-001 1x10 5 cell/4cm 2 and 3x10 5 cell/4cm 2 dermal papilla cells
  • test substance Capacity cell/4cm 2
  • Suspension ⁇ l/point
  • the dermal papilla cells were 25,000 cell/cm 2 (1x10 5 cell/4cm 2 ) and 75,000 cell/cm 2 (3x10 5 cell/4cm 2 ), it was confirmed that the number of hairs per unit area increased in both cases.
  • the dermal papilla cells of the present invention when administered at 25,000 cell/cm 2 to 75,000 cell/cm 2 , it exhibits an effect of promoting hair growth or hair growth.

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Abstract

본 발명은 인체 두피로부터 분리한 모유두 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 인체 유래 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 피하주사 또는 진피주사로 투여하는 것을 포함하는 탈모의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 환자에게 투여하여 탈모를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

모유두 세포를 포함하는 조성물
본 발명은 인체 두피로부터 분리한 모유두 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인체 유래 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 피하주사 또는 진피주사로 투여하는 것을 포함하는 탈모의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2 용량으로 환자에게 투여하여 탈모를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
인간의 머리카락은 약 100,000개의 개별 모발의 집합체이며, 모발은 모낭(hair follicle)에 의해 생성된다. 모낭은 모낭 자신, 상피 및 피지선을 재구성하는데 필요한 모든 세포주를 생성할 수 있는 줄기세포의 저장소 역할을 한다. 모낭의 기저부에는 모낭 구근(hair follicle bulb)이 존재하며, 모낭 구근에서 증식하는 기질 세포들(matrix cells)이 모발이 된다. 모낭 구근은 진피성 외피 컵(dermal sheath cup; DSC) 세포 및 모유두 세포(dermal papilla cell; DPC)를 포함한다. 모유두 세포는 모낭의 기저부에 위치한 중간엽-유래 섬유아세포(mesenchymally-derived fibroblasts)이며 모발의 발생과 성장을 담당하는 핵심 세포이다.
모발은 성장기(anagen), 퇴화기(catagen) 및 휴지기(telogen)의 3단계 주기를 거쳐 성장, 유지 및 탈락된다. 모발이 자라는 기간인 성장기에는 성인의 경우, 하루 평균 0.3mm 정도의 모발이 자라며, 한 달에 1cm 정도 성장하고, 통상 3년 내지 7년간 지속되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 성장기 후 10일 내지 14일 동안 전반적인 모낭세포의 세포사멸(apoptosis)이 일어나면서 모낭이 축소되는 단계인 퇴화기, 평균 3개월의 다음 성장기를 준비하는 단계인 휴지기를 거쳐 모발이 빠지게 되며, 부위에 따라 모발의 길이가 다른 이유는 각각의 부위에 따라서 모낭의 고유한 특징인 성장기의 지속기간이 서로 다르기 때문이다.
이와 같이 사람의 모발은 일정한 모발 성장주기(hair growth cycle)를 가지고 있기 때문에 항상 일정한 수의 모발을 유지하게 된다. 그러나 탈모가 진행되면 모근에 존재하는 모유두 세포가 작아지고, 모유두 세포가 작아지면 머리털의 굵기가 가늘어지고, 동시에 모발 성장주기도 짧아진다. 따라서 탈모가 진행되면 머리털은 매우 가늘어지며 모발 성장주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 빠지게 된다.
탈모의 원인으로는 유전적인 원인, 남성호르몬의 작용뿐만 아니라 내분비 질환, 영양 결핍, 약물 사용, 출산, 발열, 수술 등의 심한 신체적, 정신적 스트레스 등의 요인들이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 남성형 탈모뿐만 아니라 식생활의 변화, 사회 환경 등에 의한 스트레스의 증가로 인해 여성의 탈모 인구도 증가하고 있는 추세이며, 연령 또한 낮아지고 있다.
현재 국내에서 가장 빈번하게 쓰이는 탈모 치료제로는 피나스테라이드(finasteride; 상품명 Propecia　), 두타스테라이드(dutasteride; 상품명 Avodart　), 미녹시딜(minoxidil; 상품명 마이녹실　 또는 Rogaine　) 등이 있다. 그러나 상기 치료제는 성욕감퇴, 발기부전, 운전 및 수행능력 상실, 도포 부위의 가려움, 홍반, 피부 자극, 눈의 자극 등의 부작용이 나타나며, 머리 이외에 다른 신체 부위에서의 원치 않는 모발의 성장이 관찰되기도 한다. 또한 최근 중증 탈모 환자들을 대상으로 모발 이식술이 시도되고 있지만, 고가의 비용과 시술 후 부작용이 한계로 지적되고 있다.
한편, 약물을 직접 피부에 도포하는 방식 이외에도 탈모 치료방법으로 모낭 세포를 생체 외에서 배양하여 이식하는 기술이 시도되고 있으나, 모유두 세포를 탈모 치료제로 사용하기에는 여러 어려움이 존재한다. 두피로부터의 분리가 어렵고, 배양 조건이 까다로우며 충분한 양의 세포를 배양하는 것이 어려울 뿐만 아니라 여러 번 계대배양할 경우 모발 재생 능력이 현저히 저하되는 한계가 있기 때문이다. 그러나 본 발명자들은 한국등록특허 제10-2406953호와 같이, 모유두 세포의 분리 및 배양 과정에 있어서 저산소 배양을 통해 모유두 세포의 확립 기간을 단축시킬 수 있는 분리 방법을 발견하였다.
이에, 본 발명자들은 분리 또는 배양된 모유두 세포를 피하 또는 진피 투여할 경우 모발의 성장을 촉진시킴으로써 탈모의 치료 효과를 갖는 구체적인 단위면적당 세포 수를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 한국등록특허 제10-2406953호
본 발명은 인체 유래 모유두 세포를 포함하고, 상기 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 피하주사 또는 진피주사로 투여하는 것을 특징으로 하는 탈모의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 투여하여 탈모를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 모유두 세포를 포함하고, 상기 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 피하주사 또는 진피주사로 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게, 상기 단위면적당 투여되는 모유두 세포의 수는 25,000 cell/cm2 내지 75,000 cell/cm2 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 25,000 cell/cm2 일 수 있다.
상기 모유두 세포는 인체 유래인 것일 수 있다.
또한, 상기 모유두 세포는 두피로부터 분리한 모유두 조직을 저산소 조건에서 배양하여 모유두 세포를 배양 플레이트에 부착하는 단계를 포함하는 방법으로 분리된 것일 수 있으며, 상기 저산소 조건은 0.5 내지 5% 산소 포화도를 갖는 것일 수 있으며, 바람직하게 2% 산소 포화도를 갖는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 탈모를 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 모유두 세포를 포함하는 조성물은 상기 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 피하주사 또는 진피주사로 투여함으로써 탈모의 치료 또는 예방 효과를 갖는다.
도 1은 마우스에서 모유두 세포 투여 후의 피부 다크닝 모니터링 결과를 나타낸다.
도 2는 마우스에서 모유두 세포 투여 14일 후의 수득된 모발의 무게를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 돼지에서의 유효 투여 용량을 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸다.
도 4는 돼지에서 모유두 세포 투여 한달 후의 단위면적당 모발의 수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 돼지에서 모유두 세포 투여 한달 후의 모발의 두께를 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 "모유두 세포(dermal papilla cell; DPC)"는 모낭의 기저부에 위치한 중간엽-유래 섬유아세포(mesenchymally-derived fibroblasts)이며 모발의 발생과 성장을 담당하는 핵심 세포이다.
본 발명에서 사용된 용어 "탈모"는 그 원인과 무관하게, 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 지칭하며, 원형 탈모, 유전성 안드로겐 탈모, 휴지기 탈모, 외상성 탈모, 발모벽, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모 또는 선천성 탈모일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 특히, 본 발명에서 "치료"는 조성물의 투여에 의해 탈모 진행이 지연 또는 멈춰 탈모 증세를 호전시키거나, 모발이 길어지거나 수가 많아지는 등의 발모 및 육모가 촉진되는 등의 탈모 증세를 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[제조예]
모유두 세포의 분리 및 배양
멸균된 100 mm 페트리 접시(petri dish) 바닥면 위에 20 mL의 4 % FBS 함유된 분리/배양배지를 기증자로부터 체취한 두피조직이 잠기도록 채워주어 두피 조직이 마르지 않게 보관하였다. 페트리 접시 바닥면 위에 조직을 올려놓은 후 일회용 메스를 이용하여 스트립(strip) 형태로 모낭이 겹치지 않게 잘라내고, 조직을 보관하였던 분리용 배지가 담긴 페트리 접시에 잘린 조직 스트립을 보관하였다. 잘린 조직 스트립을 새로운 페트리 접시 바닥면에 올린 후 일회용 메스를 이용하여 모낭을 1개씩 분리해 새로운 배지가 담긴 페트리 접시에 보관하였다.
실체 현미경 제물대에 150 mm 페트리 접시(petri dish)를 올려놓고 상기 실시예 1에서 분리한 모낭 1개를 올려놓은 후 마르지 않도록 1 mL 시린지(syringe)를 이용하여 분리용 배지를 한 방울 떨어뜨렸다. 일회용 메스를 이용하여 모낭의 진피성 외피 컵(DSC; dermal sheath cup)과 상부 진피성 외피(UDS; upper dermal sheath) 경계를 잘라내었다. 잘라낸 진피성 외피 컵이 마르지 않도록 분리용 배지를 한 방울 보충해준 후 2개의 1 mL 시린지를 이용하여 1개는 진피성 외피 컵을 고정하고 다른 1개로는 진피성 외피 컵의 가장 뾰족한 부분인 컵의 바닥부분을 톡톡쳐서 컵이 뒤집어진 형태가 되도록 하였다. 뒤집어진 진피성 외피 컵의 내부에서 길쭉한 마름모꼴 또는 물방울 모양의 모유두 조직(dermal papilla, DP)이 튀어나오면 시린지를 이용하여 모유두 조직만 잘라내었다.
분리된 모유두 조직(DP)을 시린지 니들 끝에 올려서 6 웰(well) 플레이트(CellBind surface)로 옮겼다. 웰당 모유두 조직 12개를 접종하였고, 플레이트가 흔들리지 않게 배양기에 넣고 5 내지 10일 동안 배양한 후 컨플루언시(confluency)가 60 %가 될 때까지 배지를 2~3일에 1회, 2번 교체하였다(p0).
상기 접종한 모유두 조직으로부터 이탈된 모유두 세포가 웰(well) 내 60 % 정도 찼을 때 T75 플라스크(flask)로 계대배양하였다. 6 웰 플레이트의 배지를 버리고 1x DPBS로 1회 세척한 다음 웰당 0.5 mL의 아큐타제(Accutase)를 첨가하여 배양기에서 10분간 반응시켰다. 이후 웰당 2 mL씩 분리용 배지를 분주한 후 50 mL 튜브에 모두 회수한 다음, 상온 및 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 1 mL의 배양 배지로 하층에 남아있는 세포를 부유시킨 후 T75 플라스크에 새 배양배지 15 mL을 넣고 부유된 세포용액을 계산하여 분주한 후 플라스크를 조심스럽게 3회 이상 회전하여 세포들이 골고루 섞이도록 하였다. 이후 배양기에 4일 동안 배양하고, 4일 간격으로 1차 계대부터 8차 계대까지 계대배양하였다.
[실시예 1]
마우스에서의 용량별 효과 확인
7주령 C3H/HeN 마우스의 등을 면도한 뒤, 하기 표 1과 같이 5개의 시험군으로 나누고, 3개의 시험군에 각각 저용량(1x104), 중용량(1x105) 및 고용량(5x105)의 모유두 세포(EPI-001)를 피하주사하였다. 이때 음성 대조군으로는 동일한 볼륨의 주사용수를 피하주사하였고, 양성 대조군으로는 50μl의 미녹시딜(나녹시딜)을 2%로 도포하였다. 모발주기가 유도되는 표시인 피부 다크닝(darking)을 모니터링하기 위해 모유두 세포 투여 후 1일, 7일, 9일, 12일 및 14일째 마우스의 등을 사진으로 촬영하였고, 14일 후 마우스의 등에 발모된 털을 수득하여 그 무게를 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
시험물질 용량(세포 수) 현탁액(μl/point) 투여경로
1 부형제 0 200 피하주사
2 EPI-001(저용량) 1x104 200 피하주사
3 EPI-001(중용량) 1x105 200 피하주사
4 EPI-001(고용량) 5x105 200 피하주사
5 미녹시딜 2% - 50 μl 도포
도 2에 나타낸 바와 같이, 모유두 세포 투여 14일 후에 수득된 모발의 무게를 측정한 결과, 모유두 세포를 저용량(1x104 세포 수)로 투여한 경우 모발의 무게가 가장 많은 것을 확인하였고, 모유두 세포의 용량이 증가할수록 수득된 모발의 무게가 감소하는 것으로 나타났다.
따라서, 고용량과 비교하여 저용량에서 오히려 더욱 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 마우스에서의 실험결과를 기초로 하여, 우수한 효과를 나타내는 유효 용량을 확인하기 위하여 하기 실시예 2의 실험을 수행하였다.
[실시예 2]
돼지에서의 유효 투여 용량 확인
15~20kg의 5주령 수컷 Farm Pig의 등을 면도한 뒤 도 3에 나타낸 바와 같이, 시험물질당 4 cm2의 투여부위를 표시하였다(A: EPI-001(1x105), B: 부형제, C: EPI-001(3x105)). 하기 표 2와 같이, 시험군에는 각각 1x105 cell/4cm2 및 3x105 cell/4cm2의 모유두 세포(EPI-001)를 피내주사하였고, 음성 대조군으로는 부형제인 주사용수를 피내주사하였다. 투여 한달 후, 두피 분석기기로 돼지의 피부를 50배 확대하여 단위면적(5.2 x 5.8 mm)당 모발의 수와 두께를 Image J 프로그램을 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
시험물질 용량(cell/4cm2) 현탁액(μl/point) 투여경로
1 부형제 0 200 피내주사
2 EPI-001 1x105 200 피내주사
3 EPI-001 3x105 200 피내주사
도 4에 나타낸 바와 같이, 모유두 세포 투여 한달 후의 단위면적당 모발의 수를 확인한 결과, 모유두 세포를 25,000 cell/cm2 (1x105 cell/4cm2)및 75,000 cell/cm2 (3x105 cell/4cm2)으로 투여한 경우 모두 단위면적당 모발의 수가 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 모유두 세포 투여 한달 후의 모발의 두께를 확인한 결과, 모우듀 세포를 25,000 cell/cm2 및 75,000 cell/cm2으로 투여한 경우 모두 모발의 두께가 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 모유두 세포를 25,000 cell/cm2 내지 75,000 cell/cm2으로 투여할 경우 발모 또는 육모의 촉진 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 모유두 세포를 포함하고, 상기 모유두 세포를 단위면적당 10,000 cell/cm2 내지 100,000 cell/cm2으로 피하주사 또는 진피주사로 투여하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모유두 세포는 인체 유래인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 모유두 세포를 단위면적당 25,000 cell/cm2 내지 75,000 cell/cm2으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 모유두 세포를 단위면적당 25,000 cell/cm2으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 탈모를 치료 또는 예방하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모유두 세포는 두피로부터 분리한 모유두 조직을 저산소 조건에서 배양하여 모유두 세포를 배양 플레이트에 부착하는 단계를 포함하는 방법으로 분리된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 저산소 조건은 0.5 내지 5% 산소 포화도를 갖는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 저산소 조건은 2% 산소 포화도를 갖는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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