CN106591225A

CN106591225A - 3,3’‑二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞旁分泌和治疗皮肤损伤的用途

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Publication number: CN106591225A
Application number: CN201611005232.1A
Authority: CN
Inventors: 张斌; 史惠; 许文荣; 钱晖; 潘昭吉; 尤本帅; 杨伦宇
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu Aoyang Biomedical Research Institute Co ltd
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-16
Also published as: CN106591225B

Abstract

本发明涉及3,3’‑二吲哚甲烷（3,3′‑diindolylmethane，DIM）提高脐带间质干细胞旁分泌和治疗皮肤损伤的用途，属于中药用途技术领域；具体涉及的是DIM能够提高提高脐带间质干细胞的旁分泌和治疗皮肤烧伤修复的效果；本发明所述的DIM对可以使脐带间质干细胞的干细胞特性得到显著地的提升，提高其向其他类型细胞分化的能力，同时可以促进脐带间质干细胞IL‑6、IL‑8、G‑CSF等旁分泌因子的增加，最终提高脐带间质干细胞在皮肤烫伤中的修复作用，这一发现拓展了DIM的应用范围，提高了脐带间质干细胞促进皮肤组织再生的能力，具有广阔的临床应用前景。

Description

3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞旁分泌和治疗皮肤损伤的用途

技术领域

本发明涉及3,3’-二吲哚甲烷（3,3′-diindolylmethane，DIM）提高脐带间质干细胞旁分泌和治疗皮肤损伤的用途，属于中药用途技术领域。

背景技术

皮肤损伤是日常生活常见的一种创伤。皮肤损伤也是常见的战伤之一，占战伤的10%-30%，在核战争中的可达到90%。烧烫伤具有高发病率和死亡率。目前大面积的皮肤损伤治疗主要通过全身支持治疗、创面的清理及结痂切除和外科植皮等方法，传统的治疗方法虽然有一定效果但其结痂深度难于把握、皮源紧张和易感染的问题有待解决。

近年来，以干细胞特别是间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，研究表明MSC主要旁分泌促生长的细胞因子进而促进皮肤创伤的修复，在烧烫伤的修复中具有广阔的临床应用前景。然而，MSC注射体内后治疗效果受其存活率和旁分泌生长因子多少的影响，因此试图提高MSC细胞的旁分泌能力和增殖扩增能力是进一步提高其治疗效果的关键。目前提高细胞干性和促再生能力的主要是通过基因改造的方法，但是基因编辑的不确定性导致其改造后的干细胞具有安全性的问题。近年来，通过药物刺激来达到改造干细胞的研究越来越引起人们的重视。

3,3’-二吲哚甲烷（DIM）提取自十字花科蔬菜的天然化合物，它是吲哚-3-甲醇（I3C）的体内二聚产物，属于吲哚芥子油苷的一种。目前对DIM的研究主要集中在其肿瘤治疗的作用，其抗肿瘤的机制包括：调控肿瘤细胞的凋亡、增殖、细胞周期及肿瘤细胞中关键的信号通路。在组织再生方面，DIM具有促进肝脏和急性肺损伤修复的作用，但是，申请人前期的研究表明，低浓度的DIM具有促进胃癌细胞生长的作用，因此直接应用DIM存在着安全性的副作用，由此寻找一种既能体现DIM的促组织再生作用又能防止其副作用的方法是十分必要的。本发明首次将DIM作用于脐带间质干细胞，发现DIM预处理的脐带间质干细胞具有更好的旁分泌和促进皮肤烫伤修复的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷而提供一种能够提高人脐带间质干细胞特性和旁分泌作用的新方法和新药物。经验证，DIM具备能够促进hucMSC向脂肪细胞和骨细胞分化的能力，能够促进hucMSC细胞分泌IL-6、IL-8、Wnt11等促进皮肤组织再生的因子的作用。

本发明涉及的DIM预处理的脐带间质干细胞具有更好促进皮肤烫伤修复的作用。实验证明DIM刺激后的脐带间质干细胞更好地促进大鼠皮肤烫伤的创面愈合、更好地促进其表皮的再生化、皮肤细胞增殖再生能力等作用，具有极佳的临床应用价值。本发明涉及的DIM对脐带间质干细胞预处理的步骤具体操作如下：

（1）脐带间质干细胞的原代培养：依据已经建立的脐带来源间质干细胞的方法进行分离培养，并进行多向分化和流式指标的鉴定（Qiao Chun et al. Human mesenchymal stemcells isolated from the umbilical cord. Cell Biol Int. 2008 Jan;32(1):8-15.）

（2）应用二甲基亚砜（DMSO）对DIM进行稀释（DIM为疏水性药物，需要DMSO进行助溶），稀释到500 mM浓度的母液，后将此浓度的DIM再应用DMEM细胞培养液（含有胎牛血清）进行稀释到应用浓度；

（3）种脐带间质干细胞于培养器皿中，细胞密度在40%左右，将DMEM细胞培养液稀释好的DIM溶液作用脐带间质干细胞48h后即可得到DIM预处理的脐带间质干细胞，将处理的间质干细胞消化收集即可进行下一步分析和应用。

本发明提供的是一种能够提高脐带间质干细胞治疗皮肤损伤治疗效果的新方法，这里所述的皮肤损伤是烧烫伤；

本发明涉及的是DIM这种抗肿瘤药物的新应用；

在一具体实例中，DIM能够提高人脐带间质干细胞特性和旁分泌作用；

在一具体实例中，DIM预处理的脐带间质干细胞可以更好地促进烧烫伤皮肤的创面愈合，表皮的再生化。

本发明的有益效果：

由上述提取方法不难发现，本发明涉及的是DIM的新应用，与现有直接进行hucMSC移植治疗皮肤烫伤相比较，本发明具有以下的特点：应用DIM预处理的hucMSC较未处理的MSC细胞具有更强的旁分泌作用，促进hucMSC细胞旁分泌促组织再生的相关因子，DIM刺激后hucMSC的干细胞分化能力得到显著地提高，具体表现在其干细胞的成脂成骨分化能力更强，干细胞相关基因Oct4、Nanog、Sall4、Sox2的表达呈显著上调，也就是其干细胞特征更加明显；更重要是，DIM刺激后的hucMSC治疗皮肤烧伤的效果更加明显，具体表现为，DIM刺激的hucMSC细胞创面愈合的速度、表皮再生化及组织细胞的增殖能力均优于对照hucMSC，以上的内容提示通过DIM处理的hucMSC细胞拥有更好的组织再生能力，因此本发明具有重要的临床意义。

附图说明

图1为DIM作用脐带间质干细胞的作用浓度的确定结果。

图2为DIM促进脐带间质干细胞增殖结果；图中A为平皿中未经DIM刺激（左）和DIM刺激后（右）的脐带间质干细胞形成的克隆数量和大小；B为形成的克隆数量柱形图。

图3为DIM促进脐带间质干细胞干性转录因子Sall4、Nanog、Oct4、Sox2在mRNA（图A）和蛋白（图B）水平的表达结果。

图4为DIM对脐带间质干细胞成骨成脂分化的检测结果。

图5为定量PCR分析DIM对脐带间质干细胞中Adipo（脂肪细胞的标记基因，图A）和骨细胞的标记基因（ALP，图B）的表达影响结果。

图6为luminex分析DIM对脐带间质干细胞13种重要旁分泌因子的表达影响（100倍）结果。

图7为DIM预处理的脐带间质干细胞治疗SD大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型的促修复作用的示意图。

图8为3个不同组大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤创面的大体照片（图A）和HE染色（图B）的结果。

图9为对损伤组织应用DIM预处理的hucMSC治疗后，进行PCNA组织化学染色的结果；

图10 为免疫荧光对损伤后皮肤组织中CK19（皮肤表皮层的标记蛋白）的表达进行染色的结果。

具体实施实例

以下结合具体实施例对本发明更好的阐述，以便与对本发明更好的理解。

实施例1：DIM能够提高脐带间质干细胞的干细胞特性和旁分泌功能。

本实施例所使用的主要材料和来源分别如下：

MSC培养试剂：低糖DMEM（Gibco公司产品）、胎牛血清（Gibco公司产品）、胰蛋白酶（Sigma公司产品）、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基（上海依科赛公司）、RNA逆转录试剂盒（南京诺维赞）、蛋白提取试剂盒（碧云天）、间质干细胞成脂诱导液和成骨诱导液（广州赛业公司）、Luminex细胞因子检测试剂（美国Millipore）。

倒置显微镜、生物显微镜、超净工作台、台式离心机、Biorad定量PCR仪、Luminex检测设备均来源于美国Millipore公司；

DIM药物（美国Sigma公司）、6或24孔培养板（Corning公司）、定量PCR mix（南京诺维赞公司）、定量PCR排管（Biorad公司）、Western blot相关试剂、成脂诱导液（广州赛业公司）、成骨诱导液（广州赛业公司）、Luminex检测试剂（美国Millipore公司）；

Sall4抗体（美国Abcam公司）、Oct4抗体（美国SAB公司）、Sox2抗体（美国Millipore公司）、GAPDH抗体（康维世纪公司）、抗兔二抗及抗鼠二抗（康维世纪公司）；

胃癌细胞株HGC-27、SGC-7901购自中科院上海细胞所；

如附图1中，对本发明实施例1具体实施步骤描述如下：

（1） hucMSC的分离培养：采用本实验室已建立的方法成功分离培养及鉴定hucMSC（Qiao Chun et al. Human mesenchymal stem cells isolated from the umbilicalcord. Cell Biol Int. 2008 Jan;32(1):8-15），分离出的hucMSC于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（2）对购买的DIM药物进行稀释：应用二甲基亚砜（DMSO）对DIM进行稀释，稀释到500 mM浓度的母液，后将此浓度的DIM再应用低糖DMEM细胞培养液（含有胎牛血清）进行稀释到应用浓度，本实施例中为0、10、25、50、100、250、500μM。（3）将脐带间质干细胞及胃癌细胞HGC-27、SGC-7901分别种在24孔板的不同孔中，每种细胞种7个孔，次日待细胞贴壁后将0，10，25，50, 100，250，500μM浓度的DIM加入不同细胞孔中刺激，结果发现DIM针对脐带间质干细胞的IC50显著地的高于肿瘤细胞，50μM DIM时，50%以上肿瘤细胞多被杀死，而hucMSC细胞的死亡率确只有10%左右（图 1），因此本发明选择50μM的DIM浓度作为脐带间质干细胞刺激浓度。

（4）将50μM DIM刺激48小时后的脐带间质干细胞以种于6孔板中，细胞数量为1000个/孔，生长10天左右，结果显示，DIM刺激后的脐带间质干细胞形成的克隆数量和大小均显著高于对照组（未经DIM刺激的脐带间质干细胞），结果如图 2，这一结果表明，与其抗肿瘤细胞的作用不同，DIM能够促进脐带间质干细胞的增殖扩增；

（5）干细胞的转录因子在维持干细胞的多重分化和自我更新能力发挥重要作用，因此干细胞转录因子的表达也是干细胞特性的重要体现，本发明的研究结果显示，DIM能够显著的促进脐带间质干细胞重要的转录因子Sall4、Nanog、Oct4、Sox2在蛋白和mRNA水平的表达（图 3）；具体操作为将脐带间质干细胞种于6孔板中，细胞密度为80000个/孔，50μM DIM进行刺激48小时后，加入RNA裂解液或者蛋白裂解液破坏细胞，分别提取RNA和蛋白，RNA进行逆转录（依据试剂盒说明书即可），通过定量PCR分析Sall4、Nanog、Oct4、Sox2的mRNA的表达量（引物序列为表1），蛋白质通过Western Blot分析Sall4、Nanog、Oct4、Sox2的表达量，结果见图3。

表1.Sall4、Nanog、Oct4和Sox2的引物序列

（5）干细胞特征的重要标记是其向其他细胞类型分化能力的提高，为了进一步证明DIM对hucMSC干细胞特性的上调作用，本发明检测了DIM作用后的脐带间质干细胞向脂肪和骨细胞分化的能力，具体步骤如下，50μM DIM刺激48小时后的脐带间质干细胞及未经处理的hucMSC分别种在6孔板中，细胞密度为200000个/孔，加入成脂和成骨诱导液，依据说明书进行换液处理，诱导大约1周左右，进行成骨和成脂染色，并收集RNA进行成脂标记基因Adipo和成骨标记基因ALP的表达分析，结果显示，DIM作用的hucMSC分化呈骨细胞数量（图 4）和RT-PCR检测的骨细胞标记基因（Adipo和ALP）的表达量均显著地高于未经DIM刺激的脐带间质干细胞组（图 5）

表2. Adipo和ALP的引物序列

（6）目前的研究证实，间质干细胞的旁分泌作用是其促进组织损伤修复的重要机制，由此本发明分析了DIM对脐带间质干细胞多种细胞因子的旁分泌情况，将脐带间质干细胞种于6孔板中，加入50μM DIM刺激48小时后，应用PBS对孔中细胞进行清洗，洗净DIM的药物残留，后加入新鲜的营养液再进行培养48小时，收集细胞的培养上清，通过luminex试剂盒，依据其说明书处理待检上清，通过美国Millipore公司的luminex检测仪分析DIM刺激前后脐带间质干细胞分泌上清中细胞因子的表达变化，结果显示，DIM促进脐带间质干细胞IL-6、IL-8、G-CSF、MCP-1、TNF-α的分泌增加，并且这种上调作用可以被Wnt信号抑制剂ICG001逆转，可能与Wnt信号的活化有关（图 6）；

通过以上的实验验证可以发现，DIM能力显著地提高脐带间质干细胞的干细胞特性、分化能力和旁分泌作用。

实施例2：DIM预处理的脐带间质干细胞具有更好的促皮肤深Ⅱ度烫伤修复作用

实施例2所使用的主要材料和来源分别如下：

SD大鼠（江苏大学动物实验中心，此实验由江苏大学伦理委员会批准）；

本课题组自行发明的小型动物烫伤装置（该装置已申请专利并获得授权，申请号：201420060187.X）；

免疫组织化学染色试剂（武汉博士德公司，按照试剂盒说明书进行操作）；

CK19抗体及PCNA抗体（美国Bioworld公司）；

对本发明实施例2具体实施步骤描述如下：

（1）SD大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型的构建：将体重200g的大鼠背部应用8%的Na₂S进行脱毛处理，次日应用烫伤装置80℃损伤8s，制造一个直径为1.5cm的圆形创面；

（2）脐带间质干细胞分泌exosome的应用：将大鼠模型分为3组： PBS注射组（阴性对照）：大鼠在创面皮下组织注射200µL磷酸盐缓冲液（PBS）；未经处理的hucMSC治疗组：创面皮下组织注射200µL PBS溶解的1×10⁵hucMSC细胞；DIM处理的hucMSC治疗组：创面皮下组织注射200µL PBS溶解的DIM处理的1×10⁵hucMSC细胞；修复效果观察的时间是2周，具体的实验方案按照图7进行；

（3）如附图8A，大体创面观察照片表明，与未经DIM处理的脐带间质干细胞和PBS相比，DIM预处理的脐带间质干细胞明显促进烫伤皮肤的修复作用，创伤面积显著的减少；

（4）HE的皮肤组织切片的组织观察表明，与未经DIM处理的脐带间质干细胞和PBS相比，DIM预处理的脐带间质干细胞明显促进烫伤皮肤的表皮再生化，表现为表皮覆盖创面的范围明显增多，如附图8B；

（5）对DIM预处理的脐带间质干细胞及对照组的皮肤组织进行细胞增殖指标PCNA的组织化学染色表明，DIM预处理的hucMSC明显促进烫伤皮肤明显促进皮肤细胞增殖生长（附图9）；

（6）对表皮的标记蛋白CK19的免疫荧光染色可以发现，DIM预处理的脐带间质干细胞治疗的大鼠皮肤表皮再生化更加显著，表皮细胞的数量也明显地的增多（附图10）。

Claims

1.3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞的干细胞特性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为提高脐带间质干细胞的转录因子的表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为提高脐带间质干细胞向脂肪和骨细胞分化的能力。

4.3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞的旁分泌的应用。

5.3,3’-二吲哚甲烷提高脐带间质干细胞在制备治疗皮肤损伤药物效果的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述皮肤损伤为烧伤或烫伤。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述烫伤为深Ⅱ度烫伤。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，3,3’-二吲哚甲烷需对脐带间质干细胞预处理，具体操作如下：

（1）脐带间质干细胞的原代培养；

（2）应用二甲基亚砜对DIM进行稀释为母液，再应用DMEM细胞培养液（含有胎牛血清）进行稀释到应用浓度；

（3）种脐带间质干细胞于培养器皿中，将DMEM细胞培养液稀释好的DIM溶液作用脐带间质干细胞一段时间后即可得到DIM预处理的脐带间质干细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的3,3’-二吲哚甲烷稀释后的应用浓度为50μM。