CN113621563A - 一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。本发明提供了一种制备成纤维细胞外泌体的方法，包括：将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；收集培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。本发明基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激成纤维细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含细胞外泌体的上清原液和细胞裂解液，最大限度保留细胞培养上清中促进细胞生长的营养成分和活性因子，去除其他大分子蛋白、细胞碎片等难吸收成分，并加入具有消炎保湿作用的积雪草苷、玻尿酸等，具有多重修复护理功效，改善皱纹修复的微环境。

Description

一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
皱纹是由于皮肤真皮层内的胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等物质缺失，无法支撑皮肤的正常架构，皮肤表皮层随之塌陷形成沟壑而形成的。成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维及有机基质，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。
外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，内含复杂的RNA和蛋白质，功能取决于其来源的细胞类型，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、细胞间信息传递、组织稳态调控等方面发挥重要作用。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。
第一方面，本发明要求保护一种制备成纤维细胞外泌体的方法。
本发明要求保护的制备成纤维细胞外泌体的方法，可包括如下步骤：
(I)将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％(空气标准含氧量)，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％(空气标准含氧量)；
(II)收集经步骤(I)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞的培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。
其中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。
在本发明的具体实施方式中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。
在本发明中，所述氧气浓度均指体积百分含量。
在步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养时间均可为10-14h(如12h)；CO2的浓度均可为5％(体积百分含量)；培养温度均可为37℃；采用的培养基均可为无血清干细胞培养基。在本发明的具体实施方式中，所述无血清干细胞培养基具体为TheraPEAKTM MSCGM-CDTM Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAKTM MSCGM-CDTM人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司。
步骤(I)中，将所述成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还可包括如下步骤：将所述成纤维细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。然后再进行PBS洗涤(如洗涤两次)。
步骤(II)中，可按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述成纤维细胞外泌体：收集所述成纤维细胞的培养上清，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液过滤，所得滤液中即含有成纤维细胞外泌体。
进一步地，所述将离心所得上清液过滤具体可为：先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞外泌体精提原液。
进一步地，所述反复冻融是在-20℃冷冻，常温融化。所述反复冻融的次数可为多次，如3次。所述离心可为多次离心，如2-3次，每次离心后取上清液进行下一次离心。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面所述方法制备得到的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液。
第三方面，本发明要求保护一种用于修复皱纹的滋润营养精华液(E液)。
本发明要求保护的用于修复皱纹的滋润营养精华液(E液)，由分别独立包装的B液和D液组成，或者由所述B液和所述D液等体积混合而成(其中所述B液和所述D液的浓度均为：由初始浓度为1×106个成纤维细胞/ml按照各自的制备方法所得原液的浓度)。
所述B液为前文所述的成纤维细胞外泌体精提原液。
所述D液可按照包括如下步骤的方法制备得到：
(A)按照前文第一方面所述方法中的步骤(I)，将成纤维细胞置于所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；
(B)收集经步骤(A)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞裂解粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞裂解精提液，即为所述D液。
步骤(B)中，所述反复冻融是在-20℃冷冻，常温融化。所述反复冻融的次数可为多次，如3次。所述离心可为多次离心，如2-3次，每次离心后取上清液进行下一次离心。
第四方面，本发明要求保护一种用于修复皱纹的成套产品。
本发明要求保护的用于修复皱纹的成套产品，由前文所述滋润营养精华液(E液)和基底液(F液)组成；所述基底液(F液)组成如下：积雪草苷0.92％(质量百分含量)，玻尿酸0.26％(体积百分含量)，甘油0.12％(体积百分含量)，橄榄油0.15％(体积百分含量)，余量为生理盐水。
第五方面，本发明要求保护一种用于修复皱纹的成纤维细胞外泌体敷贴。
本发明要求保护的用于修复皱纹的成纤维细胞外泌体敷贴，可按照包括如下步骤的方法制备得到：在无菌条件下，将所述基底液(F液)附着于蚕丝布表层，随后再将蚕丝布完全浸润入前文由所述B液和所述D液混合而成的所述滋润营养精华液(E液)中，浸润时间为12hs，使得滋润营养精华液能完全浸润于附着有基底液的蚕丝布上，确保滋润营养精华液不失去活性，浸润环境应保持4℃，获得所述成纤维细胞外泌体敷贴。
进一步地，还可包括如下步骤：无菌条件下，轻轻移取所述成纤维细胞外泌体敷贴，放置于无菌铝箔袋中，封口，低温保存。
第六方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法A、一种提高成纤维细胞增殖能力的方法，包括前文第一方面所述方法中的步骤(I)，得到增殖能力提高的成纤维细胞。
经所述步骤(I)培养后的成纤维细胞的增殖能力比在正常氧浓度(20.9％)条件下(除了氧浓度不同外，其余条件均相同)培养的成纤维细胞的增殖能力更强。
方法B、一种提高成纤维细胞外泌体组织修复能力的方法，包括前文第一方面所述方法中的步骤(I)，经步骤(I)培养后的成纤维细胞分泌的外泌体的组织修复能力提高。
经所述步骤(I)培养后的成纤维细胞分泌的外泌体的组织修复能力比在正常氧浓度(20.9％)条件下(除了氧浓度不同外，其余条件均相同)培养的成纤维细胞分泌的外泌体的组织修复能力更强。
方法C、一种修复皱纹的方法，包括如下步骤：将前文所述的成纤维细胞外泌体敷贴贴敷于待修复部位皮肤，保持1-2h，每周使用1次，连续使用1一个月以上(如2个月)。
进一步地，所述待修复部位皮肤为面部皮肤。
第七方面，本发明要求保护如下任一应用：
P1、前文所述的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液在制备前文所述滋润营养精华液(E液)或前文所述成套产品或成纤维细胞外泌体敷贴中的应用；
P2、前文所述的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液或前文所述滋润营养精华液(E液)或前文所述成套产品或成纤维细胞外泌体敷贴在修复皱纹中的应用；
P3、前文所述的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液或前文所述滋润营养精华液(E液)或前文所述成套产品或成纤维细胞外泌体敷贴在组织修复中的应用。
在本发明中，所述成纤维细胞可为商品化的成纤维细胞，也可为从离体皮肤组织上分离的成纤维细胞。
在本发明中，所述成纤维细胞具体可为人成纤维细胞。
在本发明中，所述修复皱纹具体为修复面部皮肤皱纹。
本发明通过富集成纤维细胞生长过程中分泌到细胞培养上清的活性因子、RNA(核糖核酸)、酶等活性物质，并通过纳米膜过滤，去除难吸收的大分子，有效促进真皮层成纤维细胞的再生和生理功能的恢复，将成纤维细胞外泌体、成纤维细胞裂解液、积雪草苷、玻尿酸按一定比例混合制备敷贴，使得各组分充分发挥各自作用，配合基底液中具有消炎、保湿、润滑的成分，达到去皱、修复、滋润的多重功效，有效提高皱纹的修复效果。
本发明基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激成纤维细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含细胞外泌体的上清原液和细胞裂解液，最大限度保留细胞培养上清中促进细胞生长的营养成分和活性因子，去除其他大分子蛋白、细胞碎片等难吸收成分，并加入具有消炎保湿作用的积雪草苷、玻尿酸等，具有多重修复护理功效，改善皱纹修复的微环境。
附图说明
图1为不同氧浓度条件下成纤维细胞生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、成纤维细胞的分离
1、皮肤来源的成纤维细胞的获得
无菌条件下，取耳后微量皮肤，采用真皮层组织贴块法，将组织接种于培养瓶中，加入适量成纤维细胞培养基(TheraPEAKTM MSCGM-CDTM Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAKTM MSCGM-CDTM 人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司)，置于37℃培养箱内培养传代，此细胞为原代细胞，即P0代。
2、成纤维细胞的扩增
在无菌条件下，当步骤1中所得的成纤维细胞铺满培养瓶底部80％以上面积时，倒掉培养基，用生理盐水润洗2次后，加入消化液消化(具体为：加入0.25％的胰酶2-3ml，消化50s左后，移除胰酶，加入新的培养基终止消化，吹散贴壁细胞)，将消化后的细胞移入离心管，转速1500rpm，离心6min，洗涤2次，进行传代，当细胞达到80％以上的融合时，重复以上操作，连续传代培养P1-P5代。
实施例2、氧浓度梯度处理成纤维细胞
移取实施例1中生长状态良好的P3代成纤维细胞，数量为5×106，传代T175细胞培养瓶，使用商品化细胞培养液(TheraPEAKTM MSCGM-CDTM Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAKTM MSCGM-CDTM人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司)孵育8小时，用PBS洗涤细胞两次，将细胞随机分成两组。
氧浓度梯度处理组：4％O2，5％CO2，37℃培养12hs；8％O2，5％CO2，37℃培养12hs；16％O2，5％CO2，37℃培养12hs；24％O2，5％CO2，37℃培养12hs；28％O2，5％CO2，37℃培养12hs；32％O2，5％CO2，37℃培养12hs。
氧浓度正常处理组：20.9％O2，5％CO2，培养温度37℃培养72hs。必要时氮气平衡(即除了O2和CO2外，其余气体为氮气)。
两组均培养72hs。其中，各气体含量均为体积百分含量。对上述两组细胞进行培养时，仍然使用上述使用商品化细胞培养液(英文名称：TheraPEAKTM MSCGM-CDTMMesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined，中文名称：TheraPEAKTM MSCGM-CDTM人间充质干细胞培养基，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司)。
实施例3、CCK-8(CellCounting Kit 8)法检测细胞增殖
1、分别将实施例2氧浓度梯度处理组和氧浓度正常处理组的成纤维细胞接种至96孔细胞培养板，细胞浓度为2×104/ml，100μl/孔，按照每组8个复孔依次接种，共设七组，从1至7。
2、连续培养7天，细胞培养过程中，每日在固定时间点向1组细胞培养基中加入CCK-8溶液(Cell Counting Kit 8，货号：96992，Sigma-Aldrich产品，供应商：美国Merck公司)，10μl/孔，孵育2.5hs后，测量OD值，波长为450nm。
3、结果显示：氧浓度梯度组和氧浓度正常组的成纤维细胞增殖趋势均呈典型“S”型细胞生长曲线，氧浓度梯度组成纤维细胞的增殖能力明显高于氧浓度正常组，见图1。表明极端应激因素可高效激发细胞增殖潜能。
实施例4、成纤维细胞外泌体分离纯化和成纤维细胞裂解液的提取
1、成纤维细胞外泌体分离纯化
在无菌条件下，将实施例2氧浓度梯度处理组和正常氧浓度组的成纤维细胞培养到80％以上的融合时，移取细胞培养上清至离心管中，放入-20℃冰箱，待液体全部结冰后，常温解冻，反复冻融3次后，离心力2000g，离心10min，将细胞培养上清转移入新的离心管，再次离心10min，离心力2000g；重复2-3次后得到上清，上清用100μm滤网过滤，获得外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤后，获得成纤维外泌体精提原液。
2、成纤维细胞裂解液的提取
移取状态良好的实施例2氧浓度梯度处理组和正常氧浓度组成纤维细胞，移除细胞培养上清，加入注射用水，冲洗两遍后，弃掉上清，加入新的注射用水，并将细胞移入离心管中，放入-20℃冰箱，待液体全部结冰后，常温解冻，反复冻融3次后，离心10min，离心力2000g，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心10min，离心力2000g，重复3次后上清先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞裂解粗提液；再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞裂解精提液。
实施例5、成纤维外泌体敷贴的制备
1、移取实施例2氧浓度梯度处理组和正常氧浓度组生长状态良好的成纤维细胞，数量为5×106，传代培养至T175细胞培养瓶，使用商品化无血清干细胞培养基(TheraPEAKTMMSCGM-CDTM Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAKTM MSCGM-CDTM人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司)，细胞生长的融合度达到80％-90％时，移取细胞培养上清至离心管中，放入-20℃冰箱，待液体全部结冰后，常温解冻，反复冻融3次后，离心力2000g，离心10min，将细胞培养上清转移入新的离心管，再次离心10min，离心力2000g；重复2-3次后得到上清，上清用100μm滤网过滤，获得外泌体粗提液(A液)，再用0.22μm滤膜过滤后，获得成纤维外泌体精提原液(B液)。
2、移取实施例2氧浓度梯度处理组和正常氧浓度组状态良好的P3-P5代成纤维细胞，移除细胞培养上清，加入注射用水，冲洗两遍后，弃掉上清，加入新的注射用水，并将细胞移入离心管中，放入-20℃冰箱，待液体全部结冰后，常温解冻，反复冻融3次后，离心10min，离心力2000g，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心10min，离心力2000g，重复3次后上清先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞裂解粗提液(C液)；再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞裂解精提液(D液)，4℃低温保存。
3、在无菌条件下，将成纤维细胞外泌体精提原液(B液)与成纤维细胞裂解精提液(D液)按照1:1(体积比)的比例(两种原液的浓度均为：由初始浓度为1×106个成纤维细胞/ml按照各自的制备方法所得原液的浓度)混匀，混匀过程全程在低温环境中进行，获得滋润营养精华液(E液)，-4℃低温保存。
4、基底液F配制(首先将玻尿酸、甘油、橄榄油、生理盐水等成份制成混合溶液，再加入积雪草苷，配制成基底液F)
Figure BDA0003193742910000071
其中，各物质的浓度为在基底液F中的终浓度。积雪草苷的CAS号：16830-15-2，供应商：鼎瑞化工(上海)有限公司。
5、成纤维外泌体敷贴的制备
(1)在无菌条件下，首先将基底液(F液)附着于蚕丝布表层，随后再将蚕丝布完全浸润入滋润营养精华液(E液)中，浸润时间为12hs，使得滋润营养精华液能完全浸润于附着有基底液的蚕丝布上，确保滋润营养精华液不失去活性，浸润环境应保持4℃，获得基于成纤维外泌体的敷贴；
(2)无菌条件下，轻轻移取成纤维细胞外泌体敷贴，放置于无菌铝箔袋中，封口，低温保存。
实施例6、成纤维外泌体敷贴修复皱纹的使用案例
取出实施例5制备的低温保存的成纤维细胞敷贴1张，完全展开后，轻轻贴敷面部，轻拍敷贴，确保其与皮肤无间隙紧密贴合，保持1-2小时，每周使用1次，连续使用1个月、2个月后，眼角处、额部长度大于1cm的皱纹数量和覆盖面积均明显减少，其中，来源于氧浓度梯度组的外泌体敷贴去皱修复效果更显著，详细结果见表1。
表1、氧浓度变化刺激成纤维细胞产生外泌体促进面部皱纹修复效果分析
Figure BDA0003193742910000072
Figure BDA0003193742910000081
注：皱纹数量相比使用前减少比例＝(使用前皱纹数量-使用后皱纹数量)/使用前皱纹数量。额部皱纹覆盖面积相比使用前减少比例＝(使用前额部皱纹覆盖面积-使用后额部皱纹覆盖面积)/使用前额部皱纹覆盖面积。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种制备成纤维细胞外泌体的方法，包括如下步骤：
(I)将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％；
(II)收集经步骤(I)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞的培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养时间均为10-14h；和/或
步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，CO2的浓度均为5％；和/或
步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养温度均为37℃；和/或
步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，采用的培养基均为无血清干细胞培养基；和/或
步骤(I)中，将所述成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还包括如下步骤：将所述成纤维细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(II)中，按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述成纤维细胞外泌体：收集所述成纤维细胞的培养上清，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液过滤，所得滤液中即含有成纤维细胞外泌体；
进一步地，所述将离心所得上清液过滤为：先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞外泌体精提原液。
6.利用权利要求1-5中任一所述方法制备得到的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液。
7.一种用于修复皱纹的滋润营养精华液，由分别独立包装的B液和D液组成，或者由所述B液和所述D液等体积混合而成；
所述B液为权利要求6所述的成纤维细胞外泌体精提原液；
所述D液按照包括如下步骤的方法制备得到：
(A)按照权利要求1-4任一中的步骤(I)，将成纤维细胞置于所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；
(B)收集经步骤(A)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞，反复冻融，4℃2000g离心8-10min，然后将离心所得上清液先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞裂解粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞裂解精提液，即为所述D液。
8.一种用于修复皱纹的成套产品，由权利要求7所述滋润营养精华液和基底液组成；所述基底液组成如下：积雪草苷0.92％质量百分含量，玻尿酸0.26％体积百分含量，甘油0.12％体积百分含量，橄榄油0.15％体积百分含量，余量为生理盐水。
一种用于修复皱纹的成纤维细胞外泌体敷贴，按照包括如下步骤的方法制备得到：在无菌条件下，将所述基底液附着于蚕丝布表层，再将蚕丝布浸润入权利要求7中由所述B液和所述D液等体积混合而成的所述滋润营养精华液中，浸润时间为12hs，浸润环境保持4℃，获得所述成纤维细胞外泌体敷贴。
9.如下任一方法：
方法A、一种提高成纤维细胞增殖能力的方法，包括权利要求1-4任一中的步骤(I)，得到增殖能力提高的成纤维细胞；
方法B、一种提高成纤维细胞外泌体组织修复能力的方法，包括权利要求1-4任一中的步骤(I)，经步骤(I)培养后的成纤维细胞分泌的外泌体的组织修复能力提高；
方法C、一种修复皱纹的方法，包括如下步骤：将权利要求8所述的成纤维细胞外泌体敷贴贴敷于待修复部位皮肤，保持1-2h，每周使用1次，连续使用1一个月以上。
10.如下任一应用：
P1、权利要求6所述的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液在制备权利要求7所述滋润营养精华液或权利要求8所述成套产品或成纤维细胞外泌体敷贴中的应用；
P2、权利要求6所述的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液或权利要求7所述滋润营养精华液或权利要求8所述成套产品或成纤维细胞外泌体敷贴在修复皱纹中的应用；
P3、权利要求6所述的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液或权利要求7所述滋润营养精华液或权利要求8所述成套产品或成纤维细胞外泌体敷贴在组织修复中的应用。
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