CN112716979A - 羊膜上皮细胞条件培养基的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制药用途，一种羊膜上皮细胞条件培养基在滴眼液制备中的应用和羊膜上皮细胞条件培养基在制备针对过敏性结膜炎的药物中的应用，以及一种羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备方法。本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制药用途，首次发现并证明来源于人羊膜上皮细胞的条件培养基能够抑制过敏性结膜炎。使用本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液治疗结膜炎过敏性结膜炎，免疫原性低，避免直接使用细胞，安全有效，产品稳定性高。

Description

羊膜上皮细胞条件培养基的制药用途

技术领域

本发明涉及一种羊膜上皮细胞条件培养基在滴眼液制备中的应用。本发明还涉及羊膜上皮细胞条件培养基在制备针对过敏性结膜炎的药物中的应用，属于干细胞技术领域。

背景技术

变态反应性疾病(Allergic diseases)是由免疫系统对环境中典型的无害物质触发超敏反应引起的一系列疾病，影响20-30％人口，已经成为全球主要的健康问题之一，医疗保健支出用于该类疾病治疗的比例逐年升高。典型的变态反应性疾病包括花粉热、食物过敏、过敏性皮炎、过敏性哮喘和过敏反应。结膜过敏性疾病(Allergic conjunctivaldiseases，ACD)就是这样一类发生在眼表结膜的变态反应性疾病,临床将该病分为5类：过敏性结膜炎(Allergic conjunctivitis，AC)，具体细分为1.季节性过敏性结膜炎(Seasonal allergic conjunctivitis，SAC)和2.常年性过敏性结膜炎(Perennialalergic conjunctivitis，PAC)，3.巨乳头性结膜炎，4.春季角结膜炎和5.特应性角结膜炎。AC典型症状为眼痒、异物感及结膜囊分泌物增多，伴有结膜充血、水肿，60％以上SAC患者伴有过敏性鼻炎。致病的过敏原主要有：花粉、尘螨、灰尘、动物毛发等。目前，我国尚缺乏关于ACD大样本流行病学研究数据。在美国40％人群罹患ACD，但仅10％患者会选择就医。在亚洲，15-20％日本人有ACD病史。具体分型而言，SAC占美国ACD患者的90％以上；在我国，SAC和PAC占所有ACD患者的74％。然而近年来，由于自然环境变化、空气污染状况等因素，该病发病率呈进行性上升趋势。AC发病机制被认为主要是外部过敏原诱导，Th2细胞参与IgE介导的I型超敏反应。当眼表变应原与已致敏的结膜肥大细胞膜表面FcεRI上的IgE结合，启动早期相反应(earlyphase reaction，EPR)，受体交联触发肥大细胞脱颗粒，释放组胺、色氨酸、前列腺素等多种介质，介导组织特异性症状，肥大细胞释放趋化因子，诱导局部活化的血管内皮细胞表达新的粘附因子，启动晚期相反应(later phase reaction，LPR)，多种炎症细胞浸润，尤其是嗜酸性粒细胞，此外还有嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞。抗原特异性T细胞启动嗜酸性粒细胞向结膜浸润，损伤组织。结膜和角膜的上皮细胞和纤维母细胞通过诱导分泌和表达细胞因子、趋化因子、黏附分子等细胞因子，促进炎症发生及组织重建。关于AC的发病机制仍然存在许多未知亟待深入研。AC的治疗主要是脱离过敏原和药物治疗。药物治疗包括抗组胺药、肥大细胞稳定剂、抗组胺药及肥大细胞稳定剂双效药物、糖皮质激素和免疫抑制剂，辅助药物主要是人工泪液、非甾体抗炎药和血管收缩剂。以上治疗临床效果有限，其中糖皮质激素治疗最有效，但也会导致严重的副作用，长期使用容易引起眼压升高，引起激素性白内障和激素性青光眼，限制了其在临床上的应用。尽管AC通常不会对视力造成威胁，但该病容易反复发作，发作时眼部不适感强烈，显著影响患者的生活质量和工作效率。因此，开发与皮质类固醇疗效相似但安全性大大提高的新药对AC的治疗具有迫切的必要性。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)作为目前应用最广泛的干细胞，除了具有干细胞的多胚层分化潜能应用于组织修复与再生，还通过表达合成分泌多种生物活性物质，如转化生长因子β(TGF-β)、TGF-α、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞介素(IL)等生长因子和趋化因子，具有营养和免疫调节特性，因此MSCs在治疗涉及免疫反应的疾病方面具有巨大的潜力。事实上，MSCs和MSC条件培养基(conditioned medium,CM)或MSC来源的细胞外囊泡已经被报道对包括自身免疫性疾病和过敏性免疫性疾病在内的各种炎症性疾病具有抗炎和保护作用。有研究报道，TNF-α刺激的骨髓来源MSC条件培养基通过COX2依赖的抗过敏机制抑制实验性过敏性结膜炎(EAC)。而来源于胎盘组织的羊膜上皮细胞则是极具潜力的用于治疗过敏性疾病的候选细胞之一。羊膜上皮细胞(amniotic epithelialcells，AECs)是指存在于胎盘组织中的羊膜表面的一种间充质干细胞，具有高效增殖和多向分化潜能，在特定条件下可定向分化，具有独特的免疫学特性，可以分泌多种细胞/生长因子。由于其易于获得，来源广泛，免疫原性低，成为再生医学研究和应用的种子细胞之一。然而，直接使用干细胞治疗具有储存和运输不便以及免疫排斥方面的缺点。间充质感细胞分泌的微囊泡和外泌体中含细胞因子、生长因子、miRNA、mRNAs等多种成分。这些因子可短期或长期参与细胞交流、细胞信号转导、细胞或组织代谢改变等生理过程中。因此，使用羊膜上皮细胞条件培养基成为过敏性结膜炎极具潜力的治疗手段之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制药用途。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种羊膜上皮细胞条件培养基在滴眼液制备中的应用。

本发明还提供羊膜上皮细胞条件培养基在制备针对过敏性结膜炎的药物中的应用。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：过敏性结膜炎包括季节性过敏性结膜炎、常年性过敏性结膜炎、巨乳头性结膜炎、春季角结膜炎和特应性角结膜炎。

本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液，还具有这样的特征，还包括在条件培养基滴眼液中添加药学上可接受的等渗剂、抑菌剂、稳定剂、增粘剂、增溶剂、蛋白质保护剂、药剂载体中的至少一种。

本发明的应用，还具有这样的特征：羊膜上皮细胞是从人胎盘组织中分离得到的。

本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液，还具有这样的特征，该条件培养基滴眼液中含有由人羊膜上皮细胞分泌的抑炎因子和营养因子。

本发明还提供一种羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一，以人胎盘组织中分离羊膜为原料，制备得到羊膜上皮细胞；

步骤二，在适合培养羊膜上皮细胞的培养基中传代培养羊膜上皮细胞；

步骤三，当第3代细胞汇合度达到约90％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞3次；

步骤四，更换成无血清培养基继续培养24小时；

步骤五，通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液使用0.22μm无菌滤器除菌过滤，即得到羊膜上皮细胞条件培养基，采用羊膜上皮细胞条件培养基制备滴眼液。

进一步，本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备方法，还具有这样的特征：使用从人胎盘组织分离并培养的第3代羊膜上皮细胞来制备条件培养基。

进一步，本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备方法，还具有这样的特征：适合培养羊膜上皮细胞的培养基为添加了人血小板裂解物的DMEM/F12培养基或添加了人血小板裂解物的EpiLife培养基。

进一步，本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备方法，还具有这样的特征：步骤四中，无血清培养基选自DMEM/F12培养基或EpiLife培养基。

发明的有益效果：1.本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制药用途，首次发现并证明来源于人羊膜上皮细胞的条件培养基能够抑制过敏性结膜炎。

2、使用本发明的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液治疗结膜炎过敏性结膜炎，免疫原性低，避免直接使用细胞，安全有效，产品稳定性高。

3、本发明为临床利用干细胞技术治疗免疫性疾病提供新的思路和理论依据，推动干细胞治疗过敏性结膜炎的转化科学研究。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的羊膜上皮细胞的镜下形态特点。

图2为不同时间点正常对照组(PBS)，过敏性结膜炎组(EAC)，治疗组(AECM)小鼠抓挠次数的统计。

图3为不同时间点正常对照组(PBS)，过敏性结膜炎组(EAC)，治疗组(AECM)小鼠的临床评分的统计。

图4为正常对照组(PBS)、过敏性结膜炎组(EAC)和治疗组(AECM)中小鼠眼表组织HE染色和甲苯胺兰染色结果，图A和图E是小鼠眼表组织HE染色的结果，图B显示浸润炎症细胞的分布数量，图G是嗜酸性粒细胞的分布数量，图C是小鼠眼表组织甲苯胺兰染色结果，图D是肥大细胞的分布数量，图H是激活的肥大细胞的比例，图F是杯状细胞的分布数量。

图5为正常对照组(PBS)，过敏性结膜炎组(EAC)，治疗组(AECM)小鼠眼表灌洗液OLF的IgE水平。

图6为正常对照组(PBS)，过敏性结膜炎组(EAC)，治疗组(AECM)小鼠的B220+B细胞的IgE水平。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

在本说明书中，术语“羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells，AECs)”是指存在于胎盘组织中的羊膜表面的一种间充质干细胞，具有高效增殖和多向分化潜能，在特定条件下可定向分化，具有独特的免疫学特性，可以分泌多种细胞/生长因子。由于其易于获得，来源广泛，免疫原性低。

在本发明的实施方式中，“羊膜上皮细胞件培养基(AEC-CM)”是指体外培养人羊膜上皮细胞时，微囊泡及多种蛋白质等生物活性成分直接分泌到培养基中由此形成的培养基。以此培养基制备滴眼液。

实施例1：羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备

1)羊膜上皮细胞分离培养：从人胎盘组织中分离羊膜，用无菌生理盐水清洗干净后，采用剪切分离与胰蛋白酶消化法获得原代羊膜上皮细胞，在适合培养羊膜上皮细胞的培养基中培养羊膜上皮细胞，当发现细胞集落生长，贴壁细胞融合至70-80％用0.25％胰蛋白酶消化，进行传代培养；羊膜上皮细胞的镜下形态特点如图1所示。

2)收集：继续用适合培养羊膜上皮细胞的培养基中培养羊膜上皮细胞至第3代，当细胞汇合度达到约90％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞3次，更换成无血清培养基继续培养24小时，通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液使用0.22um无菌滤器除菌过滤，即得到羊膜上皮细胞条件培养基。

实施例2：羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液对过敏性结膜炎的治疗效果

实验性过敏性结膜炎小鼠模型为短豚草花粉诱导小鼠实验性变态反应性结膜炎模型。建立方法为：6周龄Balb/c小鼠，雌雄不限，在第0天用足垫注射法将50μg SRW花粉(Greer Lab)接种在5ml的ImjectAlum(Thermo Scientific)中，正常对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。第5天重复致敏程序以增强过敏反应。从第10天到第14天，用悬浮在10μl磷酸盐缓冲液(PBS)中的1.5mg SRW花粉(pH值为7.2)局部施用于小鼠双眼，正常对照组施用磷酸盐缓冲液(PBS)。滴眼方法为羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液(10μL)在SRW花粉激发前30分钟局部施用一次，在第10至14天每天4次。在每次用SRW花粉进行局部激发20分钟后，临床检查动物是否有立即过敏反应的迹象。不同时间点是指羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液滴眼后每天进行检测；临床检查为采用裂隙灯下的临床评分法，评价眼周充血、结膜红肿、眼睑水肿、粘液分泌情况，临床评分结果参见图3，观察统计抓挠次数，抓挠次数的统计结果如图2所示。形态学检测为通过石蜡切片和苏木素伊红、甲苯胺蓝染色检测免疫细胞的变化，结果如图4所示。收集眼表灌洗液OLF，B220⁺B细胞培养进行免疫学指标检查，结果如图5和图6所示所示。

以上仅实施例也仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种羊膜上皮细胞条件培养基在滴眼液制备中的应用。

2.羊膜上皮细胞条件培养基在制备针对过敏性结膜炎的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述过敏性结膜炎包括季节性过敏性结膜炎、常年性过敏性结膜炎、巨乳头性结膜炎、春季角结膜炎和特应性角结膜炎。

4.根据权利要求1所述的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液，其特征在于，还包括在所述条件培养基滴眼液中添加药学上可接受的等渗剂、抑菌剂、稳定剂、增粘剂、增溶剂、蛋白质保护剂、药剂载体中的至少一种。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述羊膜上皮细胞是从人胎盘组织中分离得到的。

6.根据权利要求1或2所述的羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液，其特征在于，该条件培养基滴眼液中含有由人羊膜上皮细胞分泌的抑炎因子和营养因子。

7.一种羊膜上皮细胞条件培养基滴眼液的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一，以人胎盘组织中分离羊膜为原料，制备得到羊膜上皮细胞；

步骤二，在适合培养羊膜上皮细胞的培养基中传代培养羊膜上皮细胞；

步骤三，当第3代细胞汇合度达到约90％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞3次；

步骤四，更换成无血清培养基继续培养24小时；

步骤五，通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液使用0.22μm无菌滤器除菌过滤，即得到羊膜上皮细胞条件培养基，采用羊膜上皮细胞条件培养基制备滴眼液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

使用从人胎盘组织分离并培养的第3代羊膜上皮细胞来制备条件培养基。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述适合培养羊膜上皮细胞的培养基为添加了人血小板裂解物的DMEM/F12培养基或添加了人血小板裂解物的EpiLife培养基。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

步骤四中，所述无血清培养基选自DMEM/F12培养基或EpiLife培养基。

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