CN112300982B - 一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发药物中的应用 - Google Patents
一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发中的应用，包括毛囊干细胞悬液和待修复受损毛囊。本发明提出了利用异体正常人毛囊干细胞联合药物分子营造适于毛囊修复微环境的新思路，并提出了利用软琼脂将毛囊干细胞和受损毛囊进行体外3D共培养的毛囊微阵列共培养系统。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术及生物药物领域，尤其涉及一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发中的应用。
背景技术
毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是存在于毛囊外根鞘隆突部中的一群能自我更新和增殖的多潜能干细胞，能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，对毛发的再生起着重要的作用。研究表明，人毛囊干细胞表达多种细胞表面分子标记物如CD200、角蛋白15(keratin 15，K15)、角蛋白19(keratin 19，K19)、整合素α6、整合素β1、Nestin等，而不表达内皮细胞标志分子CD31；此外，也不表达小鼠毛囊干细胞的标记分子CD34。利用这些阳性和阴性标记分子，研究者们可以更好的分离纯化毛囊干细胞，这加快了毛囊干细胞的研究进程。与胚胎干细胞及其它成体干细胞相比，毛囊干细胞具有来源丰富、取材方便、对机体无损害、无伦理问题等优点。文献报道过，通过移植毛囊干细胞使裸鼠长出毛发，证明移植健康毛囊干细胞具有修复受损毛囊的潜力。
不过，毛囊干细胞在促进毛发再生方面可能有一套复杂的机制。Garza 等发现患者脱发组织和未发生脱发的头皮组织毛囊干细胞的数量没有显著差异，但是脱发头皮组织中的毛囊干细胞不能产生让毛发生长的源细胞，这表明脱发头皮组织中的毛囊干细胞可能产生了缺陷。Matsumura等的研究则表明毛囊干细胞累积的DNA损伤会阻止其发挥作用。还有研究表明毛囊干细胞的增殖分化受其周围微环境影响；周围毛囊的信号会影响毛囊干细胞的活性，从而刺激毛囊生长。因此，对毛囊干细胞促进毛囊再生的作用机制进行研究，有助于推进其临床应用。此外，尽管毛囊干细胞有明确的细胞表面标记分子，但其分离培养的操作却比较复杂、时间周期也较长。因此，倘若能够应用异体来源的毛囊干细胞作为供体，这必将大大扩大毛囊干细胞的应用范围。鉴于此，本发明研究毛囊干细胞促进毛发再生的相关机制，探索利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的可行性。
发明内容
本发明的目的是研究毛囊干细胞促进毛发再生的相关机制，探索利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的可行性。
一种毛囊微阵列共培养系统，包括毛囊干细胞悬液和待修复受损毛囊。
进一步，所述毛囊干细胞悬液的培养方法包括以下步骤：
(1)取健康毛囊以青-链霉素的PBS液反复冲洗；
(2)在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，放到培养皿中；加入毛囊干细胞培养基，37℃、5％CO2孵箱培养；
(3)次日补加等量培养基1.5mL，在倒置显微镜下观察毛囊外根鞘隆突部有无梭形生长的细胞爬出，待细胞融合达80％后传代培养；
(4)将上述毛囊干细胞消化，用毛囊干细胞培养液制成1.0×105个/mL 的毛囊干细胞悬液，计数。
(5)按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。
(6)按1:1比例将0.7％琼脂糖和毛囊干细胞培养基在无菌试管中混合后，在向管中加入1/10体积的毛囊干细胞悬液，充分混匀，注入培养基I的培养皿中，加入量等于培养基I。
(7)2天一次更换培养基，总共培养10天，
进一步，所述毛囊干细胞培养液含10％FBS、100U/mL青链霉素双抗、 2ng/ml bFGF的DMEM/F12。
进一步，所述培养基I，按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。
进一步，所述毛囊干细胞消化的消化液包含质量百分含量为0.1％的胰酶和0.008％的EDTA的磷酸缓冲液。
进一步，所述健康毛囊取自脑后枕部，
进一步，所述消化条件为37℃消化3-5分钟。
进一步，将所述待修复受损毛囊以以青-链霉素的PBS液反复冲洗，插入固化毛囊干细胞悬液上层琼脂糖，置入培养箱中进行3D共培养，形成毛囊微阵列共培养系统。
一种毛囊微阵列共培养系统在治疗病理性脱发中的应用，将脱发区的受损毛囊，植入上述的毛囊微阵列共培养系统进行修复培养，将修复成功的毛囊植于脱发区。
进一步，将修复成功的毛囊植于脱发区，并给与口服药物。
进一步，所述口服药物为胸腺肽。
本发明的有益效果：本发明提出了利用异体正常人毛囊干细胞联合药物分子营造适于毛囊修复微环境的新思路，并提出了利用软琼脂将毛囊干细胞和受损毛囊进行体外3D共培养的毛囊微阵列共培养系统。
附图说明
图1注射5w后各组裸鼠皮肤HE；
图2皮下注射HFSC后毛发生长状态。
具体实施方式
为了阐述本发明的技术方案和技术目的，下面具体实施方式对本发明做进一步介绍。
1、动物试验
1.1建立雄激素性脱发大鼠模型：6周龄雄性SD大鼠，先以脱毛膏脱去背部毛发，再1mL(1.5mg)甲睾酮(取甲睾酮片60片，每片0.5mg，碾成细粉，配蒸馏水20m L，搅匀)及0.2mL猪油灌胃，每天1次，连续灌胃60天，制作雄激素性脱发大鼠模型。
1.2动物分组及毛囊干细胞移植：将造模成功的SD大鼠随机分为对照组、毛囊干细胞组、毛囊干细胞+药物组，每组6只。消化收集毛囊干细胞后，以无菌生理盐水洗涤两次，再以无菌生理盐水重悬制成1.0×105个/mL的细胞悬液。毛囊干细胞组取细胞悬液于大鼠背部脱毛部位皮下多点注射，每个点100μL，共注射500μL；毛囊干细胞每2天注射1次，共进行3次注射。对照组则以同样方式注射同等体积的生理盐水。毛囊干细胞+药物组除进行毛囊干细胞移植外，另外给予腹腔注射适量药物，每周2次。
1.3每周观察大鼠脱毛部位毛发生长情况并作好记录，8周后处死大鼠，取背部脱
毛部位皮肤组织制成石蜡组织标本。
| 对照组 | 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 | 实验组4 | 实验组5 | 实验组6 | |
| 0w | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1w | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2w | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 1 | 2 |
| 3w | 0 | 2 | 3 | 2 | 3 | 2 | 3 |
| 4w | 0 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 |
| 5w | 0 | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
1.4毛囊HE染色：将皮肤组织蜡块切成厚度为5μm的石蜡切片后，二甲苯脱蜡和梯度酒精水化；自来水清洗3次后，用Harris苏木素染色液浸泡染色 3-5min，自来水清洗；1％盐酸酒精分化3-5s，自来水清洗；0.2％氨水溶液浸泡1 min返蓝，自来水清洗；以伊红染色液浸泡染色30s；95％酒精、无水乙醇脱水，二甲苯透明、中性树胶封片；显微镜下观察并拍照，如图1。比较实验组与对照组毛囊有无病理学差异。
1.5毛囊免疫荧光染色：皮肤组织石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，蒸馏水清洗3-5次，用含0.25％Triton-100的10％山羊血清封闭液处理20min，分别加入适当稀释的一抗(K19、CD200、整合素β1)4℃孵育过夜；次日，PBS 清洗3次后，加入与一抗对应种属的荧光二抗37℃反应30min；PBS清洗并经 DAPI复染后封片，于荧光显微镜下观察并拍照。比较实验组与对照组的毛囊干细胞有无差异。
2.毛囊干细胞的分离培养
1)分离培养人毛囊干细胞：招募10名健康志愿者，从每名志愿者脑后枕部提取8～10个完整毛囊，以含高浓度青、链霉素的PBS液反复冲洗3次。在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，放到35cm2培养皿中；加入1.5ml毛囊干细胞培养基(含10％FBS、100U/mL青链霉素双抗、2ng/ml bFGF 的DMEM/F12培养基)，37℃、5％CO2孵箱培养。次日补加培养基1.5mL，在倒置显微镜下观察毛囊外根鞘隆突部有无梭形生长的细胞爬出，待细胞融合达 80％后传代。传代培养至第3代的细胞用于后续实验。
2)流式细胞术鉴定毛囊干细胞表面标记分子和阴性标记分子的表达： 0.25％的胰蛋白酶消化收集第3代的毛囊干细胞，PBS洗1遍，离心收集细胞，用含1％BSA的PBS溶液重悬。分别加入K15、K19、CD200、整合素β1、CD31 和CD34荧光抗体，室温避光孵育30min标记细胞，PBS洗涤后流式细胞仪检测上述标记分子表达情况。
2.毛囊干细胞的免疫原性鉴定
1)WB检测毛囊干细胞MHC-II类分子的表达：收集毛囊干细胞，加入细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白并定量。取15μg蛋白样本加入2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5min，6000rpm离心3min，取上清液上样，电泳后将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜，转膜后室温下封闭2h，将PVDF膜放入杂交袋，分别加入适当稀释的一抗(HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DRA1及内参GAPDH)4℃过夜，加与一抗种属对应的HRP标记的二抗，室温下振荡孵育1h，滤膜漂洗后加入显影液显色，放入凝胶成像仪中曝光成像。利用Quantity One软件处理系统分析目标带的光密度值。
2)实时荧光定量PCR检测毛囊干细胞MHC-II类分子的表达：收集毛囊干细胞以Trizol法提取细胞总mRNA，紫外分光光度计鉴定并定量。利用逆转录反应试剂盒(
RT reagent Kit with gDNA Eraser，TAKARA)将总 RNA逆转录为cDNA。根据Genebank序列，利用Primer 5.0软件设计HLA-DPA1、 HLA-DQA1、HLA-DRA1及内参GAPDH引物并委托公司合成。qRT-PCR反应按试剂盒(SYBR Premix ExTaqTM II，TAKARA)说明书进行。HLA-DPA1、 HLA-DQA1、HLA-DRA1及内参GAPDH引物如下表所示：
表1.HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DRA1及内参GAPDH引物序列
3.毛囊干细胞和受损毛囊体外3D共培养
1)软琼脂体外3D共培养：
a)用三蒸水分别制备1.2％和0.7％两个浓度的低溶点琼脂糖液体，高压灭菌后，40℃维持，使之保持溶解状态。
b)配制2×毛囊干细胞培养基(含20％FBS、200U/mL青链霉素双抗、 4ng/ml bFGF的2×DMEM/F12培养基)，0.1μm一次性无菌滤器过滤后，保存在37℃中。
c)按1:1混合1.2％的琼脂糖和2×DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。
d)消化毛囊干细胞细胞，用毛囊干细胞培养液制成1.0×105个/mL的细胞悬液，计数。
e)按1：1比例将0.7％琼脂糖和2×毛囊干细胞培养基在无菌试管中混合后，在向管中加入1/10体积的毛囊干细胞悬液，充分混匀，注入已铺有1.2％琼脂糖的培养皿中，加入量同上。
f)招募病理性脱发志愿者10名，从脱发区每人提取受损毛囊30个，随机分为对照组、毛囊干细胞组、毛囊干细胞+药物组，每人每组10个；对照组直接制备成5μm厚的冰冻切片冻存于-20℃。剩余两组以含高浓度青、链霉素的 PBS液反复冲洗3次。待上层琼脂糖处于半凝固状态时，插入上层琼脂糖，置入培养箱中进行3D共培养。
g)培养期间，对毛囊干细胞组、毛囊干细胞+药物组的每根毛囊根部滴加 10uLPBS或药物，2天一次，总共培养10天，观察受损毛囊有无毛发生长。
h)培养结束后，将毛囊干细胞组、毛囊干细胞+药物组的毛囊样本制成5 μm厚的冰冻切片用于后续检测。
2)毛囊HE染色：冰冻切片以4％多聚甲醛固定10min，自来水清洗3 次后，用Harris苏木素染色液浸泡染色3-5min，自来水清洗；1％盐酸酒精分化 3-5s，自来水清洗；0.2％氨水溶液浸泡1min返蓝，自来水清洗；以伊红染色液浸泡染色30s；95％酒精、无水乙醇脱水，二甲苯透明、中性树胶封片；显微镜下观察并拍照。比较受损毛囊与共培养的毛囊有无病理学差异。
3)毛囊免疫荧光染色：冰冻切片以4％多聚甲醛固定10min，PBS清洗 3次，用含0.25％Triton-100的10％山羊血清封闭液处理20min，分别加入适当稀释的一抗(K19、整合素β1)4℃孵育过夜；次日，PBS清洗3次后，加入与一抗对应种属的荧光二抗37℃反应30min；PBS清洗并经DAPI复染后封片，于荧光显微镜下观察并拍照。比较受损毛囊与共培养的毛囊干细胞有无差异。
3、利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的临床研究
实施例1毛囊再生技术患者病情记录
患者，男，31岁，因“脱发多年”入院，脱发等级7级，专科情况：前发际线及双侧额角上移明显，仅核心区、中心后区及顶旋区有绒毛状毛发生长，头皮可见，后枕部毛发稀疏细软，头皮可见。诊断：雄激素性脱发
治疗经过：
2019年11月25日，患者08:00入院，术前常规检查血常规及传染病四项，排除手术禁忌征；常规理发清洁头皮。于08:20入手术室，局麻下行自体毛囊提取术(FUE)，于08:50术毕，提取单根毛囊52株，双根毛囊33株放入含营养液试剂瓶低温保存送实验室培养。
2019年12月27日，提前一日嘱患者术前禁饮禁食8小时。08:30术前设计，前发际线高度7.5cm，双侧额角高度7.0cm，种植区域为前发际线致发旋下约4.0㎝范围，约334平方厘米。常规理发清洁头皮。9：30实验室取毛囊细胞回医院4℃低温保存，于09:55入手术室，在基础麻醉+局麻下行“自体毛囊细胞种植术”。种植器械为自主设计生产的毛囊细胞种植枪，每次出液量约10 微升，共4档，每档增加一档即10微升；单次注入毛囊原基数量约10-15个(每次注入回针时有外渗，预计每个点位种植有3-5个毛囊细胞，按正常头发密度为每平方厘米约50-70根头发，此次种植细胞量比较适合)。麻药配比：0.9％氯化钠注射液30毫升、2％盐酸利多卡因注射液5毫升、罗哌卡因注射液5毫升。毛囊细胞种植枪设置深度约4毫米，种植密度约每平方厘米约50针，进针角度为垂直进针。种植过程当中出现液体外渗现象存在，手术于18:25结束，种植面积约334平方厘米。术后口服阿莫西林胶囊抗炎三天。嘱患者保持创面干洁，避免感染。
2019年12月28日，患者术后第一天，生命体征平稳，述伤口微痛，可忍受。查体：种植区创面有少许血浆渗出，微红，无需特殊处理。嘱患者保持创面干洁，避免抓扰和碰撞。
2019年12月29日，患者术后第二天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区创面干洁，皮肤微红，有少许血痂形成，嘱患者保持创面干洁，避免抓扰和碰撞。
2019年12月30日，患者术后第三天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区创面干洁，无明显红肿，创面愈合良好，有血痂形成，嘱患者保持创面干洁，可用温水轻柔清洗头皮，避免抓扰和碰撞，可停止口服抗生素治疗。续观。
2020年01月04日，患者术后第9天，生命体征平稳，述创面瘙痒不适，可忍受。查体：种植区创面有陈旧性血痂及坏死表皮覆盖，创面愈合良好，无红肿渗出。瘙痒考虑毛囊细胞生长过程当中刺激神经末梢所致，嘱患者用生理盐水喷创面止痒，避免抓扰。续观。
2020年01月07日，患者术后第12天，生命体征平稳，述种植区任瘙痒不适，较前无缓解，任考虑毛囊细胞在生长过程中刺激感觉神经末梢所致。述近日用洗发水清洗头皮时出现刺痛感，考虑洗发水成分刺激皮肤及种植区皮肤感觉神经在修复过程中出现神经敏感所致，嘱患者更换刺激性小的婴儿洗发水轻柔清洗头皮对症处理。查体：种植区创面清洁干燥，创面已愈合良好。毛囊检测仪下观测：回种毛囊原基处有毛发生长迹象，每个毛孔为1-3根新生毛发，色棕灰，质地细软。还观察到部分毛囊任在皮下未突破表皮。故无法统计成活率及密度，嘱患者定期门诊复查，了解毛囊细胞生长状况。续观。
2020年01月11日，患者术后第16天，生命体征平稳，述种植区瘙痒症状基本消失，清洗头皮时已无疼痛感。查体：种植区皮肤干洁，无红肿，见细软绒毛生长，毛发密度较稀疏、角度及均匀度理想，外观较手术前改善不明显。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处有细软毛发生长，每个毛孔为1-3根新生毛发，数量增加不明显。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2020年01月19日，患者术后第24天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区皮肤干洁，无红肿，见少量健康毛发生长及细软绒毛生长，较上周密度大。毛发密度、角度及均匀度理想，双侧额角区域较其他种植区生长缓慢，仅有稀疏、色浅、细软绒毛状毛发生长，考虑男性脱发多数自双侧额角开始，此区域毛囊细胞生长缓慢和其内环境是否有关联还有待临床观察和实验室试验结果证实。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处有健康毛发生长，细软毛发生长较之前多，每个毛孔为1-3根新生毛发。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2020年04月09日，患者术后第15周，术后恢复良好，述术后6周左右出现种植区域毛发脱落现象，考虑毛囊细胞在皮内生长发育过程中无法一次发育成健康毛发的正常生理现象，预期需要经过2-3次绒毛脱落才能发育成健康毛发。查体：双侧额角仅见稀疏较短绒毛生长；核心区、中心区及顶旋区见细软，略稀疏、色较黑毛发生长，长约1.0㎝。种植区外观较手术前改善非常显著，毛囊细胞生长过程当中无一个毛孔集中生长导致单个毛孔毛发过多情况，也无毛发均匀度、角度及密度不理想情况，但有毛囊细胞生长时间不一致，毛发长出过程中质地不一致现象出现，考虑毛囊细胞发育受内环境和手术操作影响所致。毛囊检测仪下观测：双侧额角区域毛囊细胞较其他区域生长缓慢，余回种毛囊细胞区仍有细软毛发继续生长，密度已接近正常。每个毛孔为1-3根新生毛发，出现新生毛发生长速度不一致情况。嘱患者每月门诊复查一次。续观。
2020年05月17日，患者术后第20周，术后恢复良好，未述头部瘙痒、感觉异常等不适，饮食睡眠较规律。查体：双侧额角仅见稀疏较短绒毛生长，较 5周前改善不明显，有待后期观察；核心区、中心前区再生种植区域毛发较前部分变粗壮，任有大量绒毛生长，外观较5周改善明显。毛囊检测仪下观测：双侧额角区域再生毛囊有生长现象，但较前无增长、增粗改变，呈绒毛状生长，密度也较低。余回种毛囊细胞区仍有细软毛发继续生长，密度已接近正常。每个毛孔为1-3根新生毛发，出现新生毛发生长速度不一致情况。嘱患者每月门诊复查一次。续观。
2020年06月17日，患者术后第24周，术后恢复良好，述近段时间毛发有脱落症状，饮食睡眠较规律，无不良嗜好。查体：双侧额角仅见稀疏较短绒毛生长，较4周前改善不明显，核心区、中心前区再生种植区域毛发较4周前变稀疏细软，只有少许散在健康毛发生长，外观较4周前差。毛囊检测仪下观测：双侧额角区域再生毛囊呈绒毛状生长，密度尚可，无明显脱落现象，每个毛孔为 1-3根新生毛发。术后24周出现种植区毛发脱落变细软考虑因素为1：毛囊细胞在生长发育过程中出现的生长期过短。2：生长过程中出现的营养不良所致。
双侧额角种植区域至今无明显健康毛发生长，且较其他种植区域密度低，目前考虑和其内环境双氢睾酮分布浓度较高和毛囊生长过程中营养不良外其他因素有待临床观察和验证。
实施例2
患者李帆，男，28岁，因“脱发多年”入院，脱发等级7级，专科情况：前发际线及双侧额角上移明显，仅中心后区及顶旋区有绒毛状毛发生长，头皮可见，后枕部毛发稀疏细软，头皮可见。诊断：雄激素性脱发
治疗经过：
2019年10月17日，13:30入院，术前常规检查血常规及传染病四项，排除手术禁忌征；常规理发清洁头皮。14:00入手术室，于14:00在局麻下行自体毛囊提取术(FUE)，于14:30术毕，提取单根毛囊91株，双根毛囊23株放入含营养液试剂瓶低温保存送实验室培养。
2019年11月11日，10：00实验室取毛囊原基回医院4℃低温保存，于13:40入手术室在局麻下行“自体毛囊细胞种植术”。种植器械为自主设计生产的毛囊细胞种植枪，每次出液量约5微升，共9档，每档增加一档即5微升；单次注入毛囊细胞数量约10-15个(每次注入回针时有外渗，预计每个点位种植有3-5个毛囊细胞，按正常头发密度为每平方厘米约50-70根头发，此次种植细胞量比较适合)。麻药配比：0.9％氯化钠注射液30毫升、2％盐酸利多卡因注射液5毫升、罗哌卡因注射液5毫升。术中麻醉效果欠佳，追加上述配比麻药一次。毛囊细胞种植枪设置深度约4毫米，种植密度约每平方厘米约50针，进针角度为垂直进针。种植过程当中出现液体外渗现象较严重，从新调整针头深度仍然有外渗现象存在，考虑因基液浓度过高，在组织内无法迅速吸收、扩散所致。书中渗血较多，再次手术可考虑使用头部周围橡皮带压迫止血。手术于16:30 结束，因疼痛无法忍受提前结束手术，再次手术考虑使用基础麻醉+局麻解决。种植毛囊细胞量约三分之二袋，种植面积约65平方厘米。术后口服阿莫西林胶囊抗炎三天。嘱患者保持创面干洁，避免感染。
2019年11月12日，患者术后第一天，生命体征平稳，述伤口微痛，可忍受。查体：种植区创面有少许血浆渗出，微红，无需特殊处理。嘱患者保持创面干洁，避免抓扰和碰撞。
2019年11月13日，患者术后第二天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区创面干洁，皮肤微红，有少许血痂形成，嘱患者保持创面干洁，避免抓扰和碰撞。
2019年11月12日，患者术后第三天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区创面干洁，无明显红肿，创面愈合良好，有血痂形成，嘱患者保持创面干洁，可用温水清洗头皮，避免抓扰和碰撞，可停止口服抗生素治疗。续观。
2019年11月18日，患者术后第7天，生命体征平稳，述创面瘙痒不适。查体：种植区创面清洁干燥，创面愈合良好，无红肿渗出。瘙痒考虑毛囊细胞生长过程当中刺激神经末梢所致，嘱患者用生理盐水喷创面止痒，避免抓扰。续观。
2019年11月19日，患者术后第8天，生命体征平稳，述种植区瘙痒不适，嘱其来院复查，于18:30到院。查体：种植区创面清洁干燥，创面已愈合，有血痂及坏死上皮组织覆盖，予以酒精清洗。毛囊检测仪下观测：回种毛囊原基处有毛发生长迹象，每个毛孔为2-5根新生毛发，色黑，质地佳。还观察到部分毛囊任在皮下未突破表皮。故无法统计成活率及密度，嘱患者间隔三天门诊复查一次，了解毛囊细胞生长状况。续观。
2019年11月26日，患者术后第15天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区皮肤干洁，无红肿，见细软绒毛生长，毛发密度、角度及均匀度理想，外观较手术前改善不明显。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处有细软毛发生长，每个毛孔为2-5根新生毛发。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2019年12月03日，患者术后第22天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区皮肤干洁，无红肿，见少量健康毛发生长及细软绒毛生长，较上周密度大，毛发密度、角度及均匀度理想，外观较上周相比右侧额角处毛发生长，改善明显。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处有健康毛发生长，细软毛发生长较之前多，每个毛孔为2-5根新生毛发。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2019年12月09日，患者术后第28天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区皮肤干洁，前发际线位置较手术前下移明显，核心区及左侧额角处毛发质地及密度也较上周增加明显。种植区外观较手术前改善非常显著，观察手术后四周的毛囊细胞生长过程当中没有出现一个毛孔集中生长导致单个毛孔毛发过多情况，也无毛发均匀度、角度及密度不理想情况，但有毛囊细胞生长时间不一致，毛发长出过程中质地不一致现象出现，考虑毛囊细胞发育受内环境和手术操作影响所致。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处仍有细软毛发继续生长，较前密度大。每个毛孔为2-5根新生毛发，出现新生毛发生长速度不一致情况，单个毛孔5根毛发有长短不均现象。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2020年03月22日，患者术后第16周，述术后恢复良好，种植区毛发较前浓密。嘱患者每月门诊复查一次。续观。
2020年4月21日，患者术后第20周，未述特殊不适，术后恢复良好。查体：种植区毛发较稀疏细软，长约3.0㎝，其中核心区和中心前区毛发生长较理想，中心后区绒毛生长多，显稀疏，和手术当中此处种植毛囊细胞数量相对较少有关。种植区质地及密度较术前改善明显。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处仍有细软毛发继续生长，健康毛发长出较前多。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2020年5月17日，患者术后第24周，未述特殊不适，术后恢复良好。查体：种植区毛发密度、质地较4周前改善明显，健康毛发较前增多，长约4.0 ㎝，中心后区与周围区域毛发已无明显差异。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处仍有细软毛发继续生长，密度接近正常90％，健康毛发长出较前多，见较多一个毛孔的双根毛发生长长短不一。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
2020年6月30日，患者术后第32周，未述特殊不适，术后恢复良好。查体：种植区毛发密度、质地较6周前改善明显，健康毛发较前增多，但任有较多细软毛发生长。考虑毛囊发育生长过程当中营养不良导致。毛囊检测仪下观测：回种毛囊细胞处仍有细软毛发继续生长，密度接近正常90％，健康毛发长出较前多，见较多一个毛孔的双根毛发生长长短不一。嘱患者每周门诊复查一次。续观。
实施例3
患者，51岁，因“脱发多年”入院，脱发等级：女性稀疏中度，专科情况：双侧额角上移明显，见少许绒毛生长，头皮可见。核心区、中心区及顶旋区毛发整体稀疏细软，头皮可见。后枕部毛发较稀疏细软，头皮可见。诊断：雄激素性脱发。
治疗经过：
2019年12月04日，患者09:30入院，术前常规检查血常规及传染病四项，排除手术禁忌征；常规后枕部小面积理发，清洁头皮。于10：00入手术室，局麻下行自体毛囊提取术(FUE)，于10:30术毕，提取单根毛囊61株，双根毛囊32株放入含营养液试剂瓶低温保存送实验室培养。
2020年01月04日，提前一日嘱患者术前禁饮禁食8小时。08:30术前设计，前发际线高度不变，双侧额角高度不变，只作加密处理。种植区域为整个核心区、中心区及顶旋区，约262平方厘米。常规清洁头皮。9：30实验室取毛囊细胞回医院4℃低温保存，于09:55入手术室，在基础麻醉+局麻下行“自体毛囊细胞种植术”。种植器械为自主设计生产的毛囊细胞种植枪，每次出液量约 10微升，共4档，每档增加一档即10微升；单次注入毛囊原基数量约10-15个 (每次注入回针时有外渗，预计每个点位种植有3-5个毛囊细胞，按正常头发密度为每平方厘米约50-70根头发，此次种植细胞量比较适合)。麻药配比：0.9％氯化钠注射液30毫升、2％盐酸利多卡因注射液5毫升、罗哌卡因注射液5 毫升。毛囊细胞种植枪设置深度约4毫米，种植密度约每平方厘米约50针，进针角度为垂直进针。种植过程当中出现液体外渗现象存在，手术于13:50结束。术后口服阿莫西林胶囊抗炎三天。嘱患者保持创面干洁，避免感染，避免抓扰和碰撞。
2020年01月05日，患者术后第一天，生命体征平稳，述伤口微痛，可忍受。查体：种植区创面有少许血
渗出，微红，无需特殊处理。嘱患者保持创面干洁，避免抓扰和碰撞。
2020年01月06日，患者术后第二天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区创面干洁，皮肤微红，有少许血痂形成，嘱患者保持创面干洁，避免抓扰和碰撞。
2020年01月07日，患者术后第三天，生命体征平稳，未述特殊不适。查体：种植区创面干洁，无明显红肿，创面愈合良好，有血痂形成，嘱患者保持创面干洁，可用温水轻柔清洗头皮，避免抓扰和碰撞，可停止口服抗生素治疗。续观。
2020年01月09日，患者术后第5天，生命体征平稳，述创面瘙痒不适，可忍受。查体：种植区创面有少许陈旧性血痂及坏死表皮覆盖，创面愈合良好，无红肿渗出。瘙痒考虑毛囊细胞生长过程当中刺激神经末梢所致，嘱患者可以自行用温水清洗头皮，避免抓扰。续观。
2020年01月19日，患者术后第9天，生命体征平稳，述种植区任瘙痒不适，较前无缓解，任考虑毛囊细胞在生长过程中刺激感觉神经末梢所致。查体：种植区创面清洁干燥，创面已愈合良好，肉眼可见种植区有少许健康、色黑毛发生长，长约0.2㎝，是否为毛囊细胞发育生长而成有待临床进一步观察证实。毛囊检测仪下观测：回种毛囊原基处有毛发生长迹象，每个毛孔为1-3根新生毛发，色棕灰，质地细软数量较少。偶见健康毛囊生长。还观察到部分毛囊任在皮下未突破表皮。嘱患者定期门诊复查，了解毛囊细胞生长状况。续观。
2020年04月01日，患者术后第14周，述术后恢复良好，毛发生长缓慢。通过患者照片观察见头顶部种植区毛发生长良好，能正常遮盖头皮。嘱患者每月门诊复查一次。续观。
本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (1)
1.一种毛囊微阵列共培养系统，其特征在于：包括毛囊干细胞悬液和待修复受损毛囊；
所述毛囊干细胞悬液的培养方法包括以下步骤：
(1)取健康毛囊以青-链霉素的PBS溶液反复冲洗；
(2)在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，放到培养皿中；加入毛囊干细胞培养基，37℃、5％CO2孵箱培养；
(3)次日补加等量培养基1.5mL，在倒置显微镜下观察毛囊外根鞘隆突部有无梭形生长的细胞爬出，待细胞融合达80％后传代培养；
(4)将上述毛囊干细胞消化，用毛囊干细胞培养液制成1.0×105个/mL的毛囊干细胞悬液，计数；
(5)按质量比1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后,取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用；
(6)按1:1比例将0.7％琼脂糖和毛囊干细胞培养基在无菌试管中混合后，在向管中加入1/10体积的毛囊干细胞悬液，充分混匀,注入培养基I的培养皿中，加入量等于培养基I；
(7)2天一次更换培养基，总共培养10天；
所述健康毛囊取自健康人体脑后枕部；
所述毛囊干细胞培养液含10％FBS、100U/mL青链霉素双抗、2ng/ml bFGF的DMEM/F12；
所述培养基I，按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后,取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中用；所述毛囊干细胞消化的消化液包含质量百分含量为0.1％的胰酶和0.008％的EDTA的磷酸缓冲液；所述消化条件为37℃消化3-5分钟；
将所述待修复受损毛囊以青-链霉素的PBS液反复冲洗，插入固化毛囊干细胞悬液上层琼脂糖，置入培养箱中进行3D共培养，形成毛囊微阵列共培养系统。
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Granted publication date: 20220128 |