CN111019884A

CN111019884A - 一种抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法

Info

Publication number: CN111019884A
Application number: CN201911412105.7A
Authority: CN
Inventors: 李萍; 王静; 戴成祥; 刘必佐; 沈美萍; 李苏克
Original assignee: Wuxi Cellular Biopharmaceutical Group Ltd; Shanghai Cellular Biopharmaceutical Group Ltd
Current assignee: Shibiman Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111019884B

Abstract

本发明提供了一种抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法。具体地，本发明提供了一种在体外抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化(EMT)的方法，包括步骤：(i)在存在式I化合物的培养体系中，培养人羊膜上皮细胞。本发明所筛选到的方法中，所述化合物在抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化方面的具有显著效果，并且其对细胞的细胞活性和增殖能力没有影响，对细胞毒副作用较小；并且，本发明从基因表达水平和蛋白表达水平验证了式I化合物对于人羊膜上皮细胞有维持上皮表型、干细胞特性和抑制间质细胞特性的作用。

Description

一种抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法。

背景技术

羊膜是位于胎盘内侧的一层薄膜。人羊膜上皮细胞是一种来自羊膜的细胞。人羊膜上皮细胞是由胚胎内细胞发育而来的围产期干细胞之一。人羊膜上皮细胞具有胚胎干细胞分化能力，在特定的环境中可分化为三个胚层。此外，人羊膜上皮细胞具有独特的免疫调节功能和干细胞样免疫调节特性。人羊膜上皮细胞表达胚胎干细胞的多种表面标记物：肿瘤排斥抗原TRA1-60、TRA1-81、期特异性抗原SSEA-3、SSEA4、多潜能转录因子NANOG、OCT4、SOX2。人羊膜上皮细胞低表达Ⅰ类抗原的组织相容性复合体(MHC)，不表达Ⅱ类MHC抗原。人羊膜上皮细胞具有抗炎特性，表达多种抗炎蛋白和抗血管生成蛋白。这些特性使人羊膜上皮细胞的研究在细胞治疗领域具有强大的吸引力。

目前，人羊膜上皮细胞已在结膜重建、神经系统疾病、肝脏疾病等动物疾病模型中取得初步成效。然而，要实现人羊膜上皮细胞的临床应用，仍有许多待解决的问题，特别是上皮间质转化(EMT)的发生。

EMT是上皮细胞获得间充质表型的一个转分化过程。上皮细胞通常呈顶基极性，通过黏附连接和紧密连接表现出较强的细胞-细胞黏附性，基底基质主要由IV型胶原和层粘连蛋白组成。EMT诱导发生后，上皮细胞失去黏附性，细胞形态发生改变，并获得了顶端到尾端的极性。发生EMT的上皮细胞分裂并侵入基底膜，沿着纤维连接蛋白和I型胶原新形成的基质迁移。上皮细胞标志物的丰度开始降低，而间质标志物的丰度开始增加。

EMT在胚胎发生、癌症进展和干细胞分化等不同过程中发挥着至关重要的作用。细胞中的多种细胞通路信号均可以抑制EMT以及促进它的逆向过程MET的发生。EMT过程将会导致上皮细胞相关蛋白(E-Cadherin、Cytokeratin-8)表达的丢失，上调间充质相关蛋白的表达(波形蛋白Vimentin、α-SMA)，特别是EMT显著改变了人羊膜上皮细胞的生物学特性和再生潜力。

综上，在生物技术和医药研究领域中，人羊膜上皮细胞因其具有较高的干细胞特性(可向三胚层分化)、较低的免疫原性以及较优的免疫调节特性，人羊膜上皮细胞在临床应用和组织工程方面具有重要的价值。

近期的研究表明，孕酮(progesterone)能够在绵羊羊膜上皮细胞的体外培养过程中，有效地抑制其上皮间质转化。然而，对于人羊膜上皮细胞，至今未发现可用于体外抑制其上皮间质转化的有效抑制剂。

因此，本领域迫切需要开发一种能够有效抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能够有效抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种在体外抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化(EMT)的方法，包括步骤：(i)在存在式I化合物的培养体系中，培养人羊膜上皮细胞；

在另一优选例中，所述人羊膜上皮细胞为选自第P1代、第P2代、第P3代、第P4代、第P5代、第P6代或第P7代的人羊膜上皮细胞。

在另一优选例中，所述人羊膜上皮细胞为选自第P2代的人羊膜上皮细胞。

在另一优选例中，所述培养体系中的式I化合物的浓度为1-10μM，较佳地3-8μM。

在另一优选例中，所述培养体系中的式I化合物的浓度为5μM。

在另一优选例中，在所述培养体系中，所述人羊膜上皮细胞的接种密度为1×10⁴-3×10⁴个细胞/cm²，较佳地1×10⁴个细胞/cm²，更佳地2×10⁴个细胞/cm²。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(ii)监控人羊膜上皮细胞的上皮间质转化的程度。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述监控包括：检测细胞倍增时间、检测标志物的基因表达水平和/或蛋白表达水平。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述监控包括检测标志物的基因和/或蛋白表达水平，所述的标志物包括正标志物和/或负标志物。

在另一优选例中，所述的正标志物是指其基因表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈正相关，并且负标志物只是其基因表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈负相关。

在另一优选例中，所述的正标志物选自下组：间充质干细胞标志物Vimentin、间充质干细胞标志物ACTA2(α-SMA)。

在另一优选例中，所述的负标志物选自下组：上皮标志物角蛋白8(CK8)、上皮标志物角蛋白19(CK19)、上皮细胞标志物EpCAM、干细胞标志物OCT4、干细胞标志物KLF4，或其组合。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述监控包括通过流式细胞术检测细胞表面标志物的表达量，其中所述的细胞表面标志物包括正表面标志物和/或负表面标志物。

在另一优选例中，所述的正表面标志物是指其蛋白表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈正相关，并且负表面标志物只是其蛋白表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈负相关。

在另一优选例中，所述正表面标志物选自下组：CD146、CD105，或其组合。

在另一优选例中，所述负表面标志物为SSEA4。

在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有可用于抑制人羊膜上皮细胞的上皮间质转化的细胞培养液，所述细胞培养液中，含有浓度为1-10μM的式I化合物；

在另一优选例中，所述细胞培养液中，式I化合物的浓度为3-8μM。

在另一优选例中，所述细胞培养液中，式I化合物的浓度为5μM。

在本发明的第三方面，提供了一种式I化合物的用途，用于制备一细胞培养液，所述细胞培养液用于抑制人羊膜上皮细胞的上皮间质转化(EMT)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同浓度SB431542对人羊膜上皮细胞增殖的影响和对人羊膜上皮细胞基因水平表达的影响。

其中，(A)显示了每天将CCK-8加入不同浓度SB431542培养的细胞中，根据OD 450读数绘制生长曲线。(B)显示了使用qPCR检测不同浓度SB431542培养的P2 hAECs的生物标志物的表达水平情况；包括细胞角蛋白8(CK8)、间充质标记ACTA2(α-SMA)、干细胞标记OCT4、KLF4。误差线，S.D.；*p<0.05。

图2显示了5μM SB431542对不同代次的人羊膜上皮细胞的倍增时间影响。

其中，对照组中，hAEC未经SB431542处理；5μM SB431542是实验组，使用5μMSB431542处理hAEC。

图3显示了5μM SB431542对不同代数的人羊膜上皮细胞的基因水平影响。

其中，使用qPCR方法检测了对照组和实验组的P1、P3、P7 hAECs基因表达情况。生物标志物包括CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2(α-SMA)。误差线，S.D.；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4显示了5μM SB431542对于不同代数羊膜上皮细胞的蛋白表达情况影响。

其中，使用le免疫荧光检测标志物，包括CK8、EpCAM、α-SMA。对照组中，hAEC未经SB431542处理。实验组中，使用5μM SB431542处理hAEC。荧光标记：绿色；DAPI：蓝色。标尺:50mm。

图5显示了使用CCK8检测的不同浓度SB431542和progesterone对P2代AEC的增殖影响。

其中，(A)和(B)显示了每天将CCK-8加入不同浓度SB431542和progesterone培养的细胞中，根据OD 450读数绘制生长曲线。其中，Progesterone对细胞的毒性作用比较显著，所有药物组的细胞增殖情况都不如0μM对照组。

图6显示了用qPCR检测不同浓度SB431542和progesterone培养的P2 hAEC的生物标志物的表达水平情况。其中，生物标志物包括细胞角蛋白8(CK8)，间充质标记ACTA2(α-SMA)，干细胞标记OCT4、KLF4。

其中，(A)显示了不同浓度SB431542对P2代hAECs的生物标志物基因水平表达影响。在5μM药物浓度时，上皮标志物CK8和干细胞表面标志物OCT4表达最高，间充质标志物ACTA2表达最低。(B)显示了不同浓度Progesterone对P2代hAECs的生物标志物基因水平表达影响。上皮标志物CK8和干细胞标志物KLF4的表达没有药物依赖性，加药组的CK8、和KLF4的表达情况都比对照组0μM低。误差线，S.D.；*p<0.05。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种能够有效抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的方法。具体地，本发明人筛选出了一种能够有效抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的化合物(SB431542)，并且筛选出了其抑制效果最佳的浓度。实验表明，在5μM的化合物SB431542的培养体系中，能够在不影响人羊膜上皮细胞增殖的情况下，有效地抑制所培养的人羊膜上皮细胞的上皮间质转化。在此基础上完成了本发明。

羊膜上皮细胞

羊膜是位于胎儿胎盘内侧的一层薄膜。人羊膜上皮细胞虽然具有成熟上皮细胞的表型，但仍可分化为三个胚层的衍生物。

人羊膜上皮细胞表达多种胚胎干细胞表面标志物：肿瘤排斥抗原TRA1-60、TRA1-81、阶段性特异性抗原SSEA-3、SSEA4、多潜能转录因子NANOG、OCT4、SOX2。这些因子相互协调，在维持胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能方面发挥着关键作用。

此外，由于胎盘是发挥胎儿-母体免疫耐受的天然部位，人羊膜上皮细胞表现出较低的免疫原性。人羊膜上皮细胞显示低表达的Ⅰ类抗原的组织相容性复合体(MHC)，但没有Ⅱ类MHC抗原的表达。然而，最近有研究表明，P0代人羊膜上皮细胞表达高水平的MHCⅠ分子(HLA-A、B、C)，但发现水平显著低于其他胎盘细胞和体细胞。

人羊膜上皮细胞还具有抗炎特性，表达多种抗炎蛋白和抗血管生成蛋白。因此，在临床应用和组织工程方面，人羊膜上皮细胞具有巨大的潜力。

式I化合物

如本文所用，术语“本发明化合物”“式I化合物”、“SB431542”可互换使用，是指在本发明的方法中可有效抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化的化合物。

SB431542是一种TGF-βⅠ型受体激活素受体样激酶(ALK)5、ALK4和ALK7的抑制剂，可以诱导Smad2/Smad4和Smad3/Smad4依赖的转录，但对BMP信号通路没有影响。在A498细胞中，SB431542抑制TGF-βI诱导的胶原Iα1和PAI-1mRNA。此外，SB431542抑制TGF-βI诱导的纤连蛋白mRNA和蛋白的表达。SB431542抑制TGF-β调节的生长因子，包括PDGF-A，FGF-2和HB-EGF。在NMuMG和PANC-1细胞中，SB431542也抑制TGF-β调节的上皮细胞向间质转型。

分子量：384.39

分子式：C₂₂H₁₆N₄O₃

化学式：

本发明方法

在本发明中，提供了一种在体外抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化(EMT)的方法，包括步骤：(i)在存在式I化合物的培养体系中，培养人羊膜上皮细胞；

在本发明的一个优选的实施方式中，所述培养体系中的式I化合物的浓度为1-10μM，较佳地3-8μM。

在本发明的一个更加优选的实施方式中，所述培养体系中的式I化合物的浓度为5μM。

优选地，所述人羊膜上皮细胞为选自第P1代、第P2代、第P3代、第P4代、第P5代、第P6代或第P7代的人羊膜上皮细胞。更加优选地，所述人羊膜上皮细胞为选自第P2代的人羊膜上皮细胞。

在本发明方法中的所述培养体系中，所述人羊膜上皮细胞的接种密度为1×10⁴-3×10⁴个细胞/cm²，较佳地1×10⁴个细胞/cm²，更佳地2×10⁴个细胞/cm²。其中，所述的接种密度是指细胞数量与对应的培养器皿的底面表面积之间的比值。

在本发明中，所述的方法还可包括步骤：(ii)监控人羊膜上皮细胞的上皮间质转化的程度。其中，所述监控包括：检测细胞倍增时间、检测标志物的基因表达水平和/或蛋白表达水平。

在一个实施方式中，在步骤(ii)中，所述监控包括检测标志物的基因和/或蛋白表达水平，所述的标志物包括正标志物和/或负标志物。其中，所述的正标志物是指其基因表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈正相关，并且负标志物只是其基因表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈负相关。

优选地，所述的正标志物选自下组：间充质干细胞标志物Vimentin、间充质干细胞标志物ACTA2(α-SMA)；所述的负标志物选自下组：上皮标志物角蛋白8(CK8)、上皮标志物角蛋白19(CK19)、上皮细胞标志物EpCAM、干细胞标志物OCT4、干细胞标志物KLF4，或其组合。

在一个实施方式中，在步骤(ii)中，所述监控包括通过流式细胞术检测细胞表面标志物的表达量，其中所述的细胞表面标志物包括正表面标志物和/或负表面标志物。其中，所述的正表面标志物是指其蛋白表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈正相关，并且负表面标志物只是其蛋白表达水平与人羊膜上皮细胞的上皮间质转化程度呈负相关。

优选地，所述正表面标志物选自下组：CD146、CD105，或其组合；所述负表面标志物为SSEA4。

在本发明的一个优选的实施方式中，使用不同浓度SB431542培养P2代人羊膜上皮细胞，通过细胞的增殖曲线和基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表达的差异，筛选出最适浓度的SB431542。以不加SB431542的细胞为对照组，以加最适浓度的SB431542为实验组，比较不同代次对照组和实验组的细胞倍增时间、基因表达水平(CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2)、流式检测细胞表面标志物(CD146、CD105、SSEA4)和免疫荧光检测细胞蛋白表达情况(CK8、ACTA2、EPCAM)的差异。

本发明的主要优点包括：

1)本发明首次证明了SB431542在抑制人羊膜上皮细胞的上皮间质转化的用途，并筛选出了其较佳的体外使用药物浓度，所述药物浓度对细胞活力和增殖能力没有影响，对细胞毒副作用较小。

2)本发明从基因表达水平和蛋白表达水平验证了SB431542对于人羊膜上皮细胞有维持上皮表型、干细胞特性和抑制间质细胞特性的作用。

3)本发明所提供的方法，能够在不影响人羊膜上皮细胞的细胞活性和增殖条件下，保持人羊膜上皮细胞的上皮表型和干细胞特性，抑制间质细胞特性的发生。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实验方法

人羊膜上皮细胞的分离

紫外消毒生物安全柜，准备无菌手术镊、手术剪、手术刀，取出无菌磁盘，置于生物安全柜的台面上；将胎盘的胎儿面朝上放置，使用手术刀划“十”字，四等分羊膜，使用无菌手术镊、手术剪剥取胎盘表面的羊膜。

第一次消化：①将羊膜置于10cm直径培养皿，培养皿中装有1/2体积的含有抗生素的(1％的青链霉素)PBS。②用手术镊夹持羊膜进行漂洗，重复漂洗2-3遍，去除血细胞。③转移羊膜至新的10cm直径培养皿中，添加10×TrypLe(10ml/g组织)，将组织放置于恒温摇床中，37℃，0.5h，100rpm消化。④消化完毕，将组织及消化液转入15cm直径的培养皿中，使用细胞刮铲，轻刮细胞。⑤将羊膜组织转入新的10cm直径培养皿中，用于第二次消化。细胞悬液转入50ml离心管中，以4℃，300g条件离心10分钟。⑥弃去上清液，使用20ml PBS重悬沉淀，4℃保存。

第二次消化：①在10cm直径培养皿的羊膜组织中，添加10×TrypLe 20ml，将组织放置于恒温摇床中，37℃，0.5h，100rpm消化。②消化完毕，将组织及消化液转入15cm直径的培养皿中，使用细胞刮铲，轻刮细胞。③细胞悬液转入50ml离心管中，以4℃，300g条件离心10分钟。④弃去上清液，使用20ml PBS重悬沉淀，4℃保存。⑤将第一次和第二次消化的细胞悬液混匀，台盼蓝计数，按照2×10⁴/cm²接种T75培养瓶，37℃体积分数5％CO₂培养。⑨48h换液，以后每2d换液1次，直至细胞可以进行传代。

人羊膜上皮细胞的原代培养

细胞接种密度为2×10⁴/cm²，37℃体积分数5％CO₂培养。使用未添加SB431542的上皮完全培养基进行培养。

上皮完全培养基配制：按照上皮细胞培养基EpiCM的使用说明进行配制。

人羊膜上皮细胞的传代培养

人羊膜上皮细胞生长至90％时，每个T75培养瓶加入2ml TrypLE进行消化传代。消化两分钟，加未加药物的上皮完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至50ml离心管中，1200r/min，离心5min，弃上清，计数，按照1×10⁴/cm²接种，置于37℃体积分数5％CO₂培养。

传代培养基：上皮完全培养基中添加不同浓度的SB431542。

筛选最适浓度SB431542

①将SB431542溶于DMSO，配制成10mM浓度。②将10mM SB431542加入至上皮细胞完全培养基中，分别配制成0μM、1μM、5μM、10μM、50μM浓度。③取P2代人羊膜上皮细胞，使用不同药物浓度的培养基进行培养，每2d换一次加药培养基。④使用CCK8，对培养1d、2d、3d、4d的P2代细胞进行生长曲线测定。⑤使用qPCR检测培养3d的P2代细胞的CDH1、CK8、OCT4、KLF4、ACTA2(α-SMA)的基因表达情况。⑥筛选出最适的药物浓度完成后续实验。

细胞生长曲线测定

取不添加SB431542的上皮完全培养基培养的P1代人羊膜上皮细胞，经TrypLE消化，以1×10⁴/cm²的密度接种于96孔板，每个药物浓度的细胞接种2孔。以对应的药物浓度的完全培养基作为空白对照，接种2孔，SB431542的浓度分别为0μM、1μM、5μM、10μM、50μM。使用CCK8试剂盒测试在不同浓度SB431542的培养条件下，人羊膜上皮细胞在1d、2d、3d、4d的代谢值，并筛选出细胞代谢最高值对应的药物浓度。

细胞倍增时间测定

取不添加SB431542的上皮完全培养基培养的P1代人羊膜上皮细胞，经TrypLE消化，以1×10⁴/cm²的密度接种于T25培养瓶。对照组细胞使用不加SB431542的上皮完全培养基，实验组细胞使用最适浓度的SB421542的上皮完全培养基进行培养，等细胞90％融合度，进行传代，标记为P2代细胞，以此类推，计算出P1-P7代每个代次的人羊膜上皮细胞的倍增时间。细胞倍增时间计算：DT＝t*[lg2/(lgNt-lgN0)](t：培养时间；N0为接种细胞数，Nt为t时间后的细胞数)

荧光定量PCR(qPCR)检测

使用RNA抽提试剂盒抽提RNA，使用RevertAid^TMFirst Strand cDNA SynthesisKit反转录1μg RNA。根据实验要求，使用

Gene Expression assays中的探针为引物，荧光定量PCR检测相关转录因子mRNA表达量。并以GAPDH为内参，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，本实验使用

法对实验数据进行分析。

表1荧光定量PCR引物设计

基因	产品货号	来源	Dye
				CDH 1	Hs01023895_m1	Human	FAM-MGB
CK8	Hs01595539_g1	Human	FAM-MGB
				CK19	Hs00761767_s1	Human	FAM-MGB
OCT4	Hs04260367_gH	Human	FAM-MGB
				KLF4	Hs00358836_m1	Human	FAM-MGB
ACTA2	Hs00426835_g1	Human	FAM-MGB
				Vimentin	Hs00958111_m1	Human	FAM-MGB
GAPDH	Hs02786624_g1	Human	VIC-MGB

表注：使用TaqMan Gene Expression assays进行qPCR分析，评估相关转录因子的mRNA表达水平情况。

免疫荧光鉴定羊膜上皮细胞

①取出12孔板，将涂有多聚赖氨酸的细胞爬片置于孔内；②以不加药物培养的P1、P5、P7人羊膜上皮细胞作为阴性对照，以最适浓度SB431542培养的P1、P5、P7人羊膜上皮细胞作为实验组，以1×10⁴/cm²密度接种；③细胞爬片按以下步骤进行染色：PBS漂洗3次，细胞经4％多聚甲醛溶液室温固定20min；PBS漂洗3次，使用0.5％Triton X-100进行破膜；加入500μl封闭液(PBS含0.1％的BSA稀释)室温封闭30min；分别加入一抗Cytokeratin 8(CK8)、EpCAM、Alpha-Smooth Muscle Actin(α-SMA)在4℃条件下孵育过夜；PBS漂洗3次，加入二抗，室温避光孵育1h；PBS漂洗3次，加入1ug/mL的DAPI 500μl，孵育10min。漂洗、晾干、封固后荧光显微镜下观察。

流式检测人羊膜上皮细胞

①以不加药物培养的P2、P5、P7人羊膜上皮细胞作为阴性对照，以最适浓度SB431542培养的P2、P5、P7人羊膜上皮细胞作为实验组。收集细胞悬液，1500rpm离心5分钟，弃上清(留100μl左右液体)。②加抗体(CD324、CD146、CD105、SSEA4)，避光20分钟孵育。③加1ml/管PBS，1500rpm离心5分钟，弃上清。④加500μl PBS，样品用于上机。

实施例1：SB431542的药物浓度的筛选

1.1不同浓度SB431542对人羊膜上皮细胞增殖曲线

在本实施例中，使用CCK8作为细胞增殖的标志物，检测了P2代人羊膜上皮细胞在不同浓度药物影响下每天的代谢OD值。

结果如图1A所示。从实验数据来看，50μM SB421542对细胞的增殖具有显著抑制作用，而低剂量SB431542(0μM、1μM、5μM、10μM)对于细胞的增殖没有抑制作用。

1.2不同浓度SB431542对人羊膜上皮细胞基因水平表达的影响

为了筛选出最优的药物浓度，在本实施例中，还使用qPCR检测了不同浓度药物下SB431542对于P2代人羊膜上皮细胞中的各基因表达水平的影响情况。其中，使用的标志物为上皮标志物角蛋白8(CK8)、间充质标志物ACTA2(α-SMA)、干细胞特性标志物OCT4和KLF4。

实验结果如图1B所示。从实验数据来看，5μM SB431542和对照组0μM SB431542在CK8和KLF4的基因表达水平上具有显著性差异(P<0.05)。

综上，本发明人选取最适药物浓度为5μM SB431542完成后续对不同代次人羊膜上皮细胞的上皮表型影响的实验。

实施例2：5μM SB431542对人羊膜上皮细胞的增殖影响

在本实施例中，记录每个代次90％融合度的细胞数和时间(h)，计算每个代次细胞倍增所需要的时间。其中，对照组为不加药的细胞，实验组为使用5μM SB431542处理的细胞。

实验结果如图2所示。实验数据表明，P1-P6人羊膜上皮细胞加药和不加药的细胞倍增时间基本一致。在P7代，加药的细胞倍增时间为43.5h，不加药的细胞倍增时间为61.4h。

因此，5μM SB431542在7个代次内可维持羊膜上皮细胞的增殖。

实施例3：5μM SB431542对人羊膜上皮细胞的基因表达水平的影响

在本实施例中，使用qPCR检测了对照组和实验组P1、P3、P7代人羊膜上皮细胞中的各基因表达水平情况。

对照组为未使用药物影响的细胞，实验组为5μM SB431542处理过的细胞。使用的Marker为上皮标志物角蛋白8(CK8)和19(CK19)、干细胞标志物OCT4和KLF4、间充质干细胞标志物Vimentin和ACTA2(α-SMA)。

实验结果如图3所示。从实验数据来看，对照组和实验组在CK8、CK19、KLF4、OCT4、Vimentin和ACTA2(α-SMA)的基因表达水平上都有显著性差异(P<0.05)。特别是，在P7代时，实验组细胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平；实验组细胞的ACTA2(α-SMA)和Vimentin明显低于对照组的表达水平。

这表明，在基因表达水平上，5μM SB431542对于7代内的人羊膜上皮细胞，可以有效抑制EMT的发生。

实施例4：5μM SB431542对人羊膜上皮细胞的表面标志物的影响

在本实施例中，使用流式检测技术检测了对照组和实验组P3、P5、P7代人羊膜上皮细胞的表面标志物的变化情况。

其中，对照组为未使用药物影响的细胞，实验组为5μM SB431542处理过的细胞。使用的标志物为间充质标志物CD146、CD105和干细胞标志物SSEA4。实验结果如下表2所示。

从实验数据来看，P3和P5代细胞的实验组的间充质标志物CD146、CD105均比对照组低，而P3、P5和P7代的实验组的干细胞标志物SSEA4的表达量都要比对照组的高。

实验结果表明，SB431542在蛋白表达水平上有抑制人羊膜上皮细胞的EMT的发生，但是有促进干细胞特性相关的蛋白SSEA4的表达。

表2 5μM SB431542对于不同代数人羊膜上皮细胞的表面标志物影响

表注：使用流式检测方法，观察对照组和实验组中P3、P5、P7 hAEC相关表面标志物的变化情况。

实施例5：5μM SB431542对人羊膜上皮细胞的蛋白表达的影响

在本实施例中，使用免疫荧光检测了P1和P7代人羊膜上皮细胞的表面标志物的变化情况。

其中，对照组为未使用药物影响的细胞，实验组为5μM SB431542处理过的细胞。使用的标志物为上皮细胞标志物CK8和EpCAM、间充质干细胞标志物α-SMA。

实验结果如图4所示。从实验结果来看，P1代实验组的CK8和EpCAM表达效果强于P1代对照组细胞，α-SMA在实验组和对照组中均为弱表达；P7代实验组的CK8和EpCAM表达效果强于P7代对照组细胞，且P7代实验组的α-SMA基本不表达。

这表明，在蛋白水平上，5μM SB431542可以较好地维持7代内人羊膜上皮细胞的上皮细胞标志物，并抑制间质细胞标志物的表达，从而抑制EMT的发生。

实施例6：验证其他化合物对EMT的抑制的对比实验

孕酮(Progesterone，又称黄体酮)是一种内源性的甾类激素，分别在AnnunziataMauro(Mauro A,Sanyal H,Canciello A等，雌二醇和孕酮对绵羊羊膜上皮细胞的体外作用.Stem Cells Int,2019.2019:8034578.)和Angelo Canciello(Canciello A,Russo V,Berardinelli P等，孕酮可防止羊膜上皮细胞上皮-间质转化并增强其免疫调节特性.SciRep,2017.7(1):3761.)的实验中，黄体酮被用作为绵羊羊膜上皮细胞EMT的抑制剂，且取得了不错的效果。

孕酮(Progesterone)简介

Progesterone是一种内源性的甾类激素，参与调节月经周期、怀孕、人类和其他物种的胚胎发育过程。是有效的nuclear progesterone receptor(nPR)激动剂，Kd值为1nM；membrane progesterone receptors(mPRs)的激动剂、σ1receptor的拮抗剂。

分子量：314.46

分子式：C₂₁H₃₀O₂

化学式：

6.1检测不同药物对AEC增殖的影响

在本实施例中，使用CCK8作为AEC增殖情况的标志物，检测了不同浓度的SB431542和黄体酮对于AEC增殖的影响。

具体地，本发明人每天将CCK8加入不同浓度SB431542和黄体酮培养的细胞中，根据OD 450读数绘制生长曲线。

实验结果如图5所示。结果显示，黄体酮对细胞的毒性作用比较显著，所有药物组的细胞增殖情况都不如0μM对照组。

因此，在细胞活性方面，黄体酮的毒副作用明显高于SB431542。

6.2检测黄体酮对P2 hAEC中生物标志物的表达水平的影响

在本实施例中，用qPCR检测了不同浓度SB431542和黄体酮培养的P2hAEC的生物标志物的表达水平情况。其中，生物标志物包括细胞角蛋白8(CK8)、间充质标记ACTA2(α-SMA)、干细胞标记OCT4、KLF4。

实验结果如图6所示。

结果显示，在SB431542浓度为5μM时，上皮标志物CK8和干细胞表面标志物OCT4表达最高，间充质标志物ACTA2表达最低。对于黄体酮而言，上皮标志物CK8和干细胞标志物KLF4的表达没有药物依赖性，加药组的CK8、和KLF4的表达情况都比对照组0μM低。

这一结果表明，黄体酮在基因水平表达方面，对人羊膜上皮细胞的上皮细胞标志物和干细胞相关标志物的维持作用都不如SB431542。

总结

在本发明的实施方式中，使用不同浓度SB431542培养P2代人羊膜上皮细胞。

结果表明，5μM SB431542培养条件下的细胞增殖曲线最优，且基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表达最优。因此，最终筛选最适药物浓度为5μM SB431542完成后续实验。

在5μM SB431542培养条件下，P7代实验组的细胞倍增时间优于对照组；P7代实验组细胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平，实验组的ACTA2(α-SMA)和Vimentin表达水平明显低于对照组细胞的表达水平；P3和P5代细胞的实验组的间充质标志物CD146、CD105表达量都要比对照组的低，实验组干细胞相关标志物SSEA4的表达量都要比对照组的高；P7代实验组的CK8和EpCAM表达效果强于P7代对照组细胞，且P7代实验组组的α-SMA基本不表达。

因此，5μM SB431542在人羊膜上皮细胞体外培养7个代次以内可以有效的抑制其上皮间质转化的发生。

本发明所提供的方法，能够在不影响人羊膜上皮细胞的细胞活性和增殖条件下，保持人羊膜上皮细胞的上皮表型和干细胞特性，抑制间质细胞特性的发生。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种在体外抑制人羊膜上皮细胞上皮间质转化(EMT)的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在存在式I化合物的培养体系中，培养人羊膜上皮细胞；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞为选自第P1代、第P2代、第P3代、第P4代、第P5代、第P6代或第P7代的人羊膜上皮细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞为选自第P2代的人羊膜上皮细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养体系中的式I化合物的浓度为5μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述培养体系中，所述人羊膜上皮细胞的接种密度为1×10⁴-3×10⁴个细胞/cm²，较佳地1×10⁴个细胞/cm²，更佳地2×10⁴个细胞/cm²。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：(ii)监控人羊膜上皮细胞的上皮间质转化的程度。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述监控包括：检测细胞倍增时间、检测标志物的基因表达水平和/或蛋白表达水平。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有可用于抑制人羊膜上皮细胞的上皮间质转化的细胞培养液，所述细胞培养液中，含有浓度为1-10μM的式I化合物；

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞培养液中，式I化合物的浓度为5μM。

10.一种式I化合物的用途，其特征在于，用于制备一细胞培养液，所述细胞培养液用于抑制人羊膜上皮细胞的上皮间质转化(EMT)。