KR20080104850A

KR20080104850A - 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포의 고순도 분리방법

Info

Publication number: KR20080104850A
Application number: KR1020070052215A
Authority: KR
Inventors: 김기진; 신경선; 나규환; 정형민
Original assignee: 포천중문의과대학교 산학협력단; (주) 차바이오텍
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2008-12-03
Also published as: JP2010527629A; US20100112697A1; KR100900309B1; WO2008146992A1

Abstract

본 발명은 (a) 분리된 태반으로부터 융모막판막(chorionic plate membrane)을 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 융모막판막 내부의 세포를 스크레이핑(scraping)하여 중간엽 줄기 세포를 수거하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 세포에 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세테이트를 함유하는 용액을 가하여 효소 반응을 수행하고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 반응액을 원심분리하여 회수된 세포를 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포의 분리방법을 제공한다.

태반, 융모막판막, 중간엽 줄기 세포

Description

태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포의 고순도 분리방법{Process for the high-purity isolation of mesenchymal stem cells derived from placental chorionic plate membrane}

도 1a 내지 도 1c는 각각 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포의 형태, 핵형분석, 및 세포주기를 측정한 결과를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포로부터 발현되는 유전자에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다.

본 발명은 태반의 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리하는 방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)는 자가 증식할 수 있고, 다양한 계통(lineages)로 분화할 수 있는 중복성(multipotent) 줄기 세포로서, 중간엽 전 구 세포(mesenchymal progenitor cells)로 칭해지기도 한다. 중간엽 줄기 세포는 조건에 따라 뼈, 지방, 연골, 신경, 근육, 및 골수 기질 세포 등으로 분화될 수 있어 다양한 치료학적 효능을 갖는다. 중간엽 줄기 세포는 성인 줄기세포의 일종으로, 주로 골수로부터 분리되는 조혈모 줄기 세포와 함께 분리할 수 있는데, 부유 상태로 배양되는 특징을 갖는 조혈모 줄기세포와는 다르게 배양 접시 등에 부착되는 특징을 갖고 있다. 이러한 배양 조건에서 분리 및 배양되는 중간엽 줄기세포는 다양한 실험 및/또는 임상에 사용되어 왔다. 그러나, 나이가 듦에 따라 골수 유래 중간엽 줄기 세포의 분화 능력에 대한 활성도가 감소하여 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 공여자의 상태에 따라 많은 차이를 보이는 단점을 갖고 있으며, 골수 유래 중간엽 줄기세포의 채취 및 분리 과정 시 공여자에게 고통을 주는 등의 문제점들이 제기되면서, 이를 대체할 수 있는 새로운 중간엽 줄기 세포의 분리방법이 요구되고 있다.

한편, 태반은 최근까지 출산 후 폐기되는 일시적인 기관으로 인식되어 왔다. 그러나, 최근 들어 태반의 부위별로 중간엽 세포, 탈락막(decidua) 세포, 영양막(trophoblast), 양막(amnion), 상피 세포(endothelial cells) 등의 다양한 세포들이 존재하는 것이 밝혀지고 있다. Tsuji 그룹과 Kanhai 그룹은 태반 유래 세포들이 중간엽 줄기 세포와 전구세포일 가능성이 높다고 보고한 바 있고(Stem Cells 2004; 22(5): 649-58; Stem Cells 2004; 22(7):1338-1345), Surbek 그룹은 태반유래 중간엽 줄기 세포의 신경재생을 위한 자가면역 이식의 가능성을 제시한 바 있다(Am J Obstet Gynecol 2006; 194(3):664-673). 그 외에도, Takahashi 그룹에서 인간 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 이용하여 연골재생에 효율성 등을 보고한 바 있다(Biochem Biophys Res Commun 2006; 340(3):944-952).

기존에 줄기 세포 연구 및 활용에 있어서의 제한점인 윤리적 문제, 분리할 수 있는 세포수의 제한, 그리고 제한된 단일 조직에서 분리할 수 있는 줄기 세포의 종류 등을 고려할 경우, 태반-유래 줄기 세포의 분리방법을 확립하는 것은 매우 중요하다. 상기한 바와 같이 태반-유래의 다양한 줄기 세포들을 이용하여 그 활용의 가능성을 확인하였으나, 태반을 이용한 중간엽 줄기 세포 분리시 태반 내에 존재하는 여러 다른 세포들과의 혼재로 고순도의 중간엽 줄기 세포의 분리가 곤란한 문제가 있어 왔다.

Zhang 등은 태반으로부터 중간엽 전구 세포의 분리방법 및 얻어진 중간엽 전구 세포의 특성을 개시한 바 있다 (Experimental Hematology 32 (2004) 657-664). 상기 논문에 따르면, 태반으로부터 양막 강(amniotic sac) 및 탈락막을 제거한 후, 인산 완충액으로 세척한 후, 관류액 및 배양액(Iscove's modified Dulbecco medium supplemented with heparin 12.5 U/ml, penicillin 50 U/ml, and streptomycin 50 mg/ml)을 동맥-정맥 순환(arterial-vein circuit)을 통해 흘려 조직의 잔류 혈액을 제거한 다음, 상기 배양액 중에 12 시간 내지 24 시간 동안 담그고, 퍼콜 밀도 구배에 의해 단핵구 세포를 얻은 후, 소 태아 혈청이 함유된 배지 중에 재현탁시켜 중간엽 전구 세포를 분리한다. 상기 방법은 복잡한 단계를 수행하여야 하고, 퍼콜 밀도 구배 등의 과정을 거쳐야 하므로 실험실적 적용은 가능할 수 있으나, 오랜 시간 태반 자체에서 중간엽 줄기세포를 배양하므로, 태반 내에 존재하는 단핵세포들 의 혼재를 초래할 수 있을 뿐 아니라 건강한 중간엽 줄기 세포를 안정적으로 대량의 분리/정제가 곤란하여 임상적으로 적용하기에는 많은 어려운 점이 있다. 또한, 상기 방법은 양막 강 및 탈락막이 제거된 태반을 그대로 사용함으로써, 얻어지는 중간엽 전구 세포가 태반 융모(placental villi) 전반에서 분리되게 되는 다른 세포들과의 혼합으로 순도가 낮아지는 문제가 있다.

최근 S. J. Kim 등은 태반의 융모막판으로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하여, 이를 배아 줄기 세포로부터 형성된 배상체와 공배양함으로써 배아 줄기 세포를 조혈 분화(hematopoietic differentiation)를 촉진시킬 수 있음을 개시한 바 있다(Acta Haematol 2006; 116; 219-222). 상기 논문에 따르면, 태반으로부터 융모막판을 분리하고, 효소 분해에 의해 세포를 분리한 다음, 20% 소 태아 혈청 및 항생제를 함유하는 DMEM 배지 중에서 배양함으로써 융모막판-유래의 중간엽 줄기 세포를 분리한다. 상기 방법은 상대적으로 간단하게 중간엽 줄기 세포를 분리/정제할 수 있으나, 융모막판 전체를 효소처리함으로써 중간엽 줄기 세포뿐만 아니라 융모막판에 박혀 있는 양막(amnion) 세포도 함께 분리되어, 얻어지는 세포의 순도가 떨어지게 된다. 따라서, 얻어진 중간엽 줄기 세포를 여러 차례 계대배양할 경우 양막 유래의 세포가 혼재하게 되어 배양과정 중 증식 속도 차이에 의한 우위점을 차지하여, 중간엽 줄기세포의 순수배양을 어렵게 하는 문제가 있다. 또한, 중간엽 줄기세포의 경우 효소 분해 반응에 민감하여 37℃에서 효소반응을 실시하였을 때는, 쉽게 세포막의 손상을 초래해서 세포의 생존율에 영향을 받게 되는 특징이 있다. 따라서, 기존의 방법으로 태반 융모막판 유래 중간엽 줄기세포의 분리는 사실상 다른 혼재된 세포로부터 기원될 수밖에 없는 실정이다.

본 발명자들은 윤리성의 문제가 없는 태반 유래의 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 태반의 융모막판 내부의 세포를 물리적인 방법인 스크레이핑(scraping) 법을 이용하여 세포를 수거하고, 이를 온화한 조건에서 효소처리한 후, 효소정지 반응을 별도로 수행하여 배양하였을 때, 매우 높은 순도 및 생존율을 갖는 중간엽 줄기 세포가 제조될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 태반의 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 분리된 태반으로부터 융모막판막(chorionic plate membrane)을 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 융모막판막 내부의 세포를 스크레이핑(scraping)하여 중간엽 줄기 세포를 수거하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 세포에 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세테이트를 함유하는 용액을 가하여 효소 반응을 수행하고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 반응액을 원심분리하여 회수된 세포를 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포의 분리방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 분리방법은 융모막판막 내부의 세포를 물리적인 방법인 스크레이핑(scraping) 법을 이용하여 수거함으로써, 융모막판 내부에 박혀 있는 양막(amnion) 세포를 비롯한 다른 세포들을 배제할 수 있어, 최종적으로 얻어지는 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리할 수 있다. 또한, 효소 처리 조건을 온화한 조건에서 수행함과 동시에 별도의 효소 정지 반응을 수행함으로써 세포의 생존율을 크게 높일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 분리방법은 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리할 수 있어 대량증식이 가능하며, 따라서 이를 이용한 다양한 세포 치료제로서의 활용 및 퇴행성 질환 치료제로서의 활용이 가능하다.

본 발명의 분리방법은 분리된 태반으로부터 융모막판막(chorionic plate membrane)을 얻는 단계[단계 (a)]를 포함한다. 상기 태반은 건강한 산모로부터 출산 후 분리되어 폐기되는 태반을 사용할 수 있다. 즉, 상기 "분리된 태반"이라 함은 산모의 모체로부터 출산 후 분리되는 태반을 의미한다. 상기 분리된 태반은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다. 상기 분리된 태반으로부터 융모막판막을 얻는 단계는 통상의 해부학적 방법 예를 들어, 태반의 태아면 측을 덮고 있는 융모막판막을 잡아당기면서 벗겨냄으로써 얻을 수 있다. 얻어진 융모막판막은 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등)이 포함된 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2 회 이상, 바람직하게는 약 5회, 세척함으로써, 조직에 존재하는 오염물질들을 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 분리방법은 얻어진 융모막판막 내부의 세포를 스크레이핑(scraping)하여 세포를 수거하는 단계[단계 (b)]를 포함한다. 상기 스크레이핑은 세포를 긁어낼 수 있는 도구, 예를 들어, 멸균 소독된 슬라이드 글래스(slide glass), 세포 배양용 스크레퍼(scraper) 등을 사용하여 긁어냄으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 스크레이핑은 멸균 소독된 슬라이드 글래스로 모체면 측을 긁어냄으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 구체적으로는 유리 접시에 양막 세포가 있는 부위를 밑으로 펼친 후 멸균 소독된 슬라이드 글래스 등을 이용하여 융모막판막 내부에 존재하는 세포들을 물리적인 방법으로 분리하여 수거할 수 있다.

상기와 같이 수거된 세포는 직접 효소처리하거나, 적절한 완충액으로 세척하고 원심분리하여 세포를 농축한 다음 효소처리할 수 있다. 상기 세척은 HBSS (Hank's balanced salt solution) 등의 완충액을 사용하여 2∼3회 수행될 수 있으며, 상기 원심분리는 1000∼1200 rpm에서 5∼10 분 동안, 바람직하게는 약 1,000 rpm에서 약 5 분 동안 수행될 수 있다.

단계(c)의 효소 처리 단계는 트립신(trypsin) 및 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA)를 함유하는 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세테이트의 농도는 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 약 0.25%의 트립신/EDTA 용액을 사용할 수 있다. 또한, 단계(c)는 별도의 효소 반응 정지 과정을 포함한다. 즉, 본 발명의 분리방법은 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시킴으로써, 효소에 의한 세포의 손상을 최소화할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 상기 효소처리/효소반응억제 과정을 2 회 반복함으로써 중간엽 줄기 세포의 회수량을 증가시킬 수 있다. 즉, 상기 효소처리/효소반응억제 과정을 1회 또는 2회 수행할 수 있으며, 효소처리/효소반응억제 과정을 1회 수 행하는 경우 약 1 시간 동안 효소처리 과정을 수행할 수 있고, 효소처리/효소반응억제 과정을 2회 수행하는 경우 각각 약 30 분씩 효소처리 과정을 수행할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 상기 효소반응 단계를 상대적으로 저온 즉, 약 20∼30 ℃, 바람직하게는 실온에서 서서히 수행한다. 통상적인 효소반응이 약 37 ℃에서 수행됨에 반해, 상대적으로 저온 즉, 약 20∼30 ℃, 바람직하게는 실온에서 서서히 효소반응을 수행할 경우, 세포의 손상을 크게 낮출 수 있음이 새롭게 밝혀졌다.

본 발명의 분리방법은 효소처리/효소반응 억제 과정을 수행하여 얻어진 반응액을 원심분리하여 세포를 회수하고, 이를 중간엽 줄기 세포 배양 배지, 예를 들어 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계[단계 (d)]를 포함한다. 상기 원심분리는 약 1,000 rpm으로 약 5분 동안 수행할 수 있다. 상기 중간엽 줄기 세포 배양 배지는 상대적으로 소량의, 예를 들어 5∼10 %, 바람직하게는 약 10 %의 소 태아 혈청을 함유하는 배지가 사용될 수 있으며, 예를 들면 10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 DMEM/F12가 사용될 수 있다. 상기 배양은 통상의 배양 조건 예를 들어, 37 ℃, CO₂ 배양기 중에서 수행될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1. 중간엽 줄기 세포의 분리

의료, 산과 및 외과적 문제가 없고 태아의 기형이나 다태아가 아닌 37주 이상의 정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 상기 산모로부터 얻은 정상 태반을 신속히 멸균된 용기 및 얼음에 담아 이동시킨 후 육안적으로 태반의 형태학적 및 구조학적 특징을 기록하였다. 태반의 태아면 측을 덮고 있는 융모막판막을 잡아당기면서 벗겨낸 다음, 융모막판막을 항생제(1% 페니실린-스트렙토마이신)가 포함된 인산완충식염수로 5 회 수세하여 수집 및 운반 도중에 발생할 수 있는 조직에 존재하는 오염물질들을 제거하였다.

수세된 융모막판막을 멸균 소독된 150 mm 유리 접시에 양막 세포가 있는 부위를 밑으로 펼친 후 멸균 소독된 슬라이드 글래스로 융모막판막 내부에 존재하는 중간엽 줄기 세포층의 세포들을 긁어내어 수거하였다. 수거된 세포들을 멸균된 HBSS 용액으로 3 회 수세한 후, 1,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 다음, 상층액을 제거한 후 남은 세포에 0.25% 트립신/EDTA 용액 10 ml을 첨가한 후, 실온에서 천천히 혼합하면서 30 분 동안 반응시켰다. 소 태아 혈청 1 ml을 가하여 효소반응을 억제한 후, 상층액(1차 효소반응액)을 분리하여 50 ml 코니컬 튜브(conical tube)에 옮겼다. 나머지 세포에 다시 0.25% 트립신/EDTA 용액 10 ml을 첨가한 후, 실온에서 천천히 혼합하면서 30 분 동안 반응시키고, 상층액을 분리하여 상기 1차 효소반응액과 합하였다. 소 태아 혈청 2.5 ml을 다시 첨가하여 효소 반응을 정지시킨 후 1,000 rpm으로 5 분간 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고, 세포들을 수확하였다. 얻어진 세포들을 배양액(10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 FGF-4가 첨가된 DMEM/F12) 3 ml에 첨가한 후, 잘 혼합하여 T25 플라스크에 넣어 37℃, CO₂ 배양기 중에서 배양하였다.

2006년 9월 4일 분리를 시작으로, 세포의 성장 속도를 고려하여 약 5일에 한번 씩 계대배양을 실시하였고, 10번째 계대까지 배양된 세포들을 CHA-PDMSC-1로 명명하였다.

실시예 2. 형태학적 특성 분석

실시예 1에서 얻은 중간엽 줄기 세포(CHA-PDMSC-1)를 위상차(Phase contrast) 현미경으로 관찰한 결과는 도 1a와 같다. 또한, Mycoplasma Detection kit ((주)인트론바이오테크놀로지)로 측정한 마이코플라스마 시험(mycoplasma test) 결과 음성임을 확인하였고, colcemid (Invitrogen) 처리와 KCl 저장액 (0.075M KCl) 처리, 그리고 Trypsin-Giemsa 염색 후 CytoVision (Applied Imaging 사)을 이용하여 핵형을 분석한 결과, 46 XX로 판명되었다 (도 1b). 또한, Propidium Iodide (PI) 염색 후 유세포 분석기 (FACS, Beckman사)를 이용하여 세포주기를 측정한 결과, 일반적인 세포주기의 형태보다 좀 더 빠른 세포주기의 형태가 관찰되었다 (도 1c).

상기 결과로부터, 태반 융모막판 유래 세포가 건강하고 마이코프라즈마 음성 이면서 정상 핵형을 갖고 있고, 세포 분열이 빠른 안전한 새로운 세포임을 알 수 있다.

실시예 3. 유세포 분석 (Fluorescence activated cell sorting, FACS)

다양한 항체를 이용하여 태반 융모막판 유래 세포의 표면에 존재하는 특정항원을 분석하고자 유세포 분석을 실시하였다. 즉, 80%정도 자란 세포들을 세포분리 용액 (Cell dissociation buffer, GIBCO사)을 1 ml 첨가하여 배양용기로부터 세포들을 분리한 후 각각 녹색 형광물질과 적색 형광물질이 표지되어 있는 CD13, CD71, CD178, CD44, CD105, CD90, CD95, CD34, CD31, CD33, CD56, CD51, HLA-ABC, HLA-DR, cytokeratin 7 등과 같은 여러 인간 특이적인 항체들을 실온에서 1시간 반응시킨 후 인산완충용액(PBS buffer)를 이용하여 3회 수세한 후 유세포 분석기를 이용하여 유세포 분석을 실시하였으며, 그 결과는 도 2와 같다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 분리한 태반의 융모막판 유래 중간엽 줄기 세포는 CD13 양성 (≥99.98), CD71 양성 (≥68.92), CD178 음성 (≤4.58), CD44 양성 (≥99.98), CD105 양성 (≥35.75), CD90 양성 (≥99.46), CD95 양성 (≥99.98), CD34 음성 (≤1.48), CD31음성 (≤1.34), CD33 음성 (≤1.37), CD56 양성 (≥20.04), CD51 음성 (≤8.75) 으로 나타났으며, HLA-ABC 양성 (≥99.55), HLA-DR 음성 (≤4.19), 그리고, cytokeratin 7 음성 (≤2.80)로 확인되었다. 상기 결과로부터, 태반 융모막판 유래 세포가 혈관 내피세포, 혈구세포, 영양막세포 등이 아닌 중간엽 줄기세포의 특징적인 항원들을 발현함으로써, 본 연구 자들이 분리한 세포가 중간엽 줄기세포의 특징을 갖는 세포임을 알 수 있다.

실시예 4. RNA 수준에서의 줄기 세포 관련 유전자들의 발현 분석

본 발명에 따라 분리한 태반의 융모막판 유래 중간엽 줄기 세포로부터 발현되는 유전자에 대한 RT-PCR 분석을 수행하였다. 즉, 태반 융모막판 유래 중간엽 줄기 세포가 T25 flask에서 약 80% 정도 자랐을 때 세포들을 회수하여 TRIZOL을 이용한 세포 용해(lysis) 단계, 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용한 cDNA 합성 단계, 유전자 특이적 염기서열과 Tag. DNA 폴리머라제를 이용한 PCR 증폭 단계, 그리고 증폭된 PCR 산물을 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 증폭된 유전자의 유무를 확인하는 RT-PCR 분석을 수행하였다. 각 유전자의 증폭에 사용된 프라이머 서열, PCR 반응액의 조성은 및 PCR 반응조건은 각각 표 1 내지 표 3과 같다.

유전자	서열 번호	서열	Tm (℃)	size (bp)
nanog	1	F: TTC TTG ACT GGG ACC TTG TC	54	200
	2	R: GCT TGC CTT GCT TTG AAG CA
sox2	3	F: GGG CAG CGT GTA CTT ATC CT	52	200
	4	R: AGA ACC CCA AGA TGC ACA AC
h AFP	5	F: GCT TCG CTT TGC CAA TGC TT	55	500
	6	R: ATG CTG CAA ACT GAC CAC GC
h NF-68kd	7	F: TTT CCT CTC CTT CTT CTT CAC CTT C	58	700
	8	R: GAG TGA AAT GGC ACG ATA CCT A
beta actin	9	F: TCC TTC TGC ATC CTG TCA GCA	58	300
	10	R: CAG GAG ATG GCC ACT GCC GCA

PCR 반응액	용적
cDNA	2~3 ul
10 X h-taq bfr	2.5 ul
10mMd NTP mix	0.5 ul
Primer 1 (10pmol)	1 ul
Primer 2 (10pmol)	1 ul
5 X Band doctor	0 (X0)or 2.5(X0.5) ul
h-Taq.(2.5U/ul)	0.25 ul
D.W - DEPC	X ul
총량	25 ul

	95 ℃	Tm ℃	72 ℃	사이클
변성	15 min			1
증폭	20 sec	40 sec	1min	40
최종			5 min	1

상기와 같이 수행한 RT-PCR 분석 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 태반의 융모막판 유래 중간엽 줄기 세포는 줄기 세포의 자가증식 관련 유전자로 알려진 Nanog 및 Sox2가 발현되었으며, neuroectodermal marker인 NF68 유전자의 발현이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 중간엽 줄기 세포는 자가증식이 가능하고, 외배엽중 신경세포 분화관련 유전자 또한 발현하는 중복성(multipotent) 줄기 세포의 특성을 유지함을 알 수 있다.

실시예 5. 테라토마 형성능 분석

실시예 1에서 얻어진 CHA-PDMSC-1 세포 1 x 10⁶를 SCID 마우스의 고환(testis capsule)에 주입한 후, 12주 후에 테라토마 형성 여부를 확인한 결과 테라토마는 형성되지 않았음을 확인하였다. 따라서, 배아줄기세포의 경우 문제점인 양성 종양, 즉 테라토마 형성하는 것과는 다르게, 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 중간엽 줄기 세포는 전분화능의 특징을 갖는 세포 치료제로 활용시 테라토마를 형성하지 않아 안전한 성인 줄기세포의의 특성을 유지함을 알 수 있다.

실시예 6. 인간 배아줄기 세포 배양을 위한 인간 지지세포로서의 기능확인

인간 배아줄기 세포는 전분화능을 갖고 있어 다양한 세포로 분화 가능한 장점으로 퇴행성 질환의 세포 대체 치료요법의 희망을 제시하고 있으나, 현재까지 구축 및 배양 유지되는 대부분의 인간 배아줄기세포의 경우 지지세포의 상태에 큰 영향을 받아, 현재까지는 마우스 기원의 STO cell 또는 MEF (mouse embryonic fibroblast)를 이용한 지지세포를 사용하고 있다. 하지만, 줄기 세포 치료제 개발에 있어 가장 고려해야 할 부분으로 종간의 오염이 있어 인간 유래 지지세포의 개발이 시급한 상황이다. 따라서, 본 발명의 분리방법에 의해 얻어진 CHA-PDMSC-1을 이용한 인간 지지세포로의 활용 여부를 검증하였다.

차병원에서 구축된 CHA-9 인간 배아 줄기 세포를 이용하여 CHA-PDMSC-1 세포의 지지세포 능력을 시험하고자 CHA-9 인간 배아줄기세포를 계대배양할 때, 하루 전 10ug/ml 농도로 mitomycin C (Sigma)를 2시간 동안 처리하여 세포들의 세포주기를 G0로 정지시킨 후 트립신/EDTA를 처리하여 세포들을 분리하고, 분리된 세포들을 0.8 X 10⁵ 개씩 개수하여 4-웰 배양접시에서 배양하였다. 그 다음날 계대배양하는 CHA-9 인간 배아줄기세포의 세포들을 분리하여 4-웰 배양접시에 부착되어 배양되고 있는 CHA-PDMSC-1 위에 놓고 함께 배양하면서 CHA-9 인간 배아 줄기 세포의 배양 상태를 형태학적, 배아줄기세포 특이적 마커의 발현 등으로 관찰하였다. 그 결과, 10 계대(passage) 이상 함께 배양하였을 때도 CHA-9 인간 배아 줄기 세포는 형태학적으로 미분화 상태를 잘 유지하였고, 성장 속도로 일정하게 유지되었으며, 배아줄기세포의 특이적인 마커들의 발현이 잘 유지되었음을 확인하였다.

본 발명의 분리방법은 태만 융모막판막 내부의 세포를 물리적인 방법인 스크레이핑법을 이용하여 수거함으로써, 융모막판 내부에 박혀 있는 양막(amnion) 세포를 비롯한 다른 세포들을 배제할 수 있어, 최종적으로 얻어지는 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리할 수 있다. 또한, 효소 처리 조건을 온화한 조건에서 수행함과 동시에 별도의 효소 정지 반응을 수행함으로써 세포의 생존율을 크게 높일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 분리방법은 중간엽 줄기 세포를 고순도로 분리할 수 있어 대량증식이 가능하며, 따라서 이를 이용한 다양한 세포 치료제로서의 활용 및 퇴행성 질환 치료제로서의 활용이 가능하다.

<110> CHABIOTECH CO., LTD. College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Process for the high-purity isolation of mesenchymal stem cells derived from placental chorionic plate membrane <130> PN0117 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ttcttgactg ggaccttgtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 gcttgccttg ctttgaagca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gggcagcgtg tacttatcct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 agaaccccaa gatgcacaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 gcttcgcttt gccaatgctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 atgctgcaaa ctgaccacgc 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 tttcctctcc ttcttcttca ccttc 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 gagtgaaatg gcacgatacc ta 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 tccttctgca tcctgtcagc a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 caggagatgg ccactgccgc a 21

Claims

(a) 분리된 태반으로부터 융모막판막(chorionic plate membrane)을 얻는 단계;

(b) 단계(a)에서 얻어진 융모막판막 내부의 세포를 스크레이핑(scraping)하여 중간엽 줄기 세포를 수거하는 단계;

(c) 단계(b)에서 얻어진 세포에 트립신 및 에틸렌디아민테트라아세테이트를 함유하는 용액을 가하여 효소 반응을 수행하고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시키는 단계; 및

(d) 단계(c)에서 얻어진 반응액을 원심분리하여 회수된 세포를 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계

를 포함하는 태반 융모막판막-유래 중간엽 줄기 세포의 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 스크레이핑이 멸균된 슬라이드 글래스로 모체면 측을 긁어냄으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(b)를 수행 후, 얻어진 세포를 세척하고, 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 농축한 다음, 단계(c)를 수행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(c)를 2 회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제4항에 있어서, 단계(c)의 상기 효소 반응이 각각 30 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(c)의 상기 효소반응이 20∼30 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제6항에 있어서, 단계(c)의 상기 효소반응이 실온에서 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(d)의 배지가 10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 DMEM/F12 인 것을 특징으로 하는 분리방법.