JP5693447B2 - 細胞毒性免疫グロブリン - Google Patents

Description

本発明は細胞毒性免疫グロブリンに関する。

モノクロナール抗体は、治療的結合剤として広く使用されている。本明細書内において基本的な抗体構造を無傷なIgG1免疫グロブリンを例に説明することにする。

２本の同一のＨ鎖（Ｈ）と２本の同一のＬ鎖（Ｌ）は合わさってＹ字型の抗体分子を形成している。Ｈ鎖はそれぞれ４つのドメインを有する。アミノ末端可変部位（VH）は、Ｙの先端にある。これらに続いて３つの定常領域がある：C1、C2及びカルボキシ末端CH3である（Ｙ字状軸の基部で）。短い延長部のスイッチはＨ鎖可変領域及び定常領域と結合する。ヒンジはCH2とCH3（Fc断片）を抗体の残りの部分（Fab断片）と結合する。１つのFcと２つの同一Fab断片は、無傷の抗体分子内のヒンジのタンパク質分解性開裂により形成することができる。Ｌ鎖は、スイッチにより分けられた２つのドメインである可変部（VL）と定常部（CL）から成る。

ヒンジ領域内のジスルフィド結合は、２つのＨ鎖を結合する。Ｌ鎖は、更なるジスルフィド結合によりＨ鎖と結合する。Asn−結合した炭水化物部分は、免疫グロブリンのクラスに応じて定常ドメイン内の種々の位置で結合する。IgG1に関しては、ヒンジ領域中でCys235とCys238対の間で、２つのジスルフィド結合は２つのＨ鎖を結合する。Ｌ鎖は２つの更なるジスルフィド結合により、CH1ドメイン中のCys229sと、CLドメイン中のCys214sの間でＨ鎖に結合する。炭水化物部分は各々のCH2のAsn306に結合し、Ｙ字状軸中で顕著な膨出を生じる。

これらの特徴は重大な機能的結果を有する。Ｈ鎖とＬ鎖両方の可変領域である（VH）と（VL）は、Ｙの"先端"に存在し、そこにこれらは位置して抗原と反応する。分子のこの先端は、アミノ酸配列のＮ−末端が位置する側である。Ｙ字状軸は、エフェクター機能を効率的に媒介するような方法で、補体の活性化及びFcレセプターとの相互作用、又はADCC及びADCPを実施する。そのCH2とCH3ドメインは、膨出してエフェクタータンパク質との相互作用を促進する。アミノ酸配列のＣ末端は、先端とは反対側に位置し、これはＹの"根元"と称することができる。

ラムダ（λ）とカッパ（κ）と称される２つのタイプのＬ鎖が抗体で見つかっている。所定の免疫グロブリンは、κ鎖もしくはλ鎖のどちらかを有し、１つずつ有することはない。λＬ鎖とκＬ鎖を有する抗体間では機能的な差異は見つかっていない。

抗体分子内のそれぞれのドメインは、圧縮された逆平行のβバレル中で、それぞれ互いに密に詰まった２つのβシートから成る類似構造を有する。この保存的な構造は免疫グロブリンフォールドと称される。この定常ドメインの免疫グロブリンフォールドは、４本のストランドのシートに対して密に詰まった３本のストランドのシートを有する。このフォールドは各シートのβストランド間の水素結合により、内部の反対側のシートの残基間の疎水結合により、及びシート間のジスルフィド結合により安定化されている。３本のストランドのシートは、ストランドＣ、Ｆ及びＧから成り、かつ４本のストランドのシートは、ストランドＡ、Ｂ、Ｅ及びＤを有する。Ａ〜Ｇの文字は、免疫グロブリンフォールドのアミノ酸配列に沿ったβストランドの配列位置を示す。

可変ドメインのフォールドは、４個及び５個のストランドの２つのシート内に配置された９個のβストランドを有する。５個のストランドのシートは、定常部位の３つのストランドのシートと構造的に相同であるが、しかし更なるストランドC'とC''を有する。ストランドの残り（A、B、C、D、E、F、G）は、免疫グロブリンの定常ドメイン中のそれらの対と同じトポロジー及び類似構造を有する。定常ドメインと同じく、ジスルフィド結合はストランドＢとＦを反対側のシートで結合する。

Ｌ鎖とＨ鎖の免疫グロブリン鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変ループもしくは相補性決定領域（CDRs）を有する。Ｖドメインの３つのCDRs（CDR1、CDR2、CDR3）は、βバレルの１つの末端に密集する。CDRsは、免疫フロブリンフォールドのβストランドB-C、C’-C''及びF-Gを結合するループである。CDRs内の残基は、隣の免疫グロブリン分子とは異なり、各抗体に抗原特異性を付与する。

抗体分子の先端のＶＬとＶＨドメインは、６つのCDRs（それぞれのドメインに３つずつ）が抗原特異的結合に対する表面の形成において共同して密に詰まっている。従って、抗体の天然の抗原結合部位は、Ｌ鎖可変部位のストランドB-C、C'-C''及びF-GとＨ鎖可変部位のストランドB-C、C'-C''及びF-Gと結合するループから成る。

天然の免疫グロブリンにおいてCDRループではないループもしくはCDRループにより決定されるような抗原結合ポケットの部分ではないループ、及び場合によりCDRループ領域内で隣接するループは、抗原結合特異性又はエピトール結合特異性を有さないが、免疫グロブリン分子全体及び／又はそのエフェクター又はその他の機能の正確なフォールディングに寄与するので、本発明の目的では構造的ループと称することにする。

従来技術の文献には、免疫グロブリン様スカフォールドが既存の抗原結合部位を処理する目的で用いられ、それにより新たな結合特性が導入されている事が示されている。殆どの場合に、CDR領域は抗原結合のために設計されている。換言すると、免疫グロブリンフォールドの場合には、その結合親和性又は特性を変えるために、天然の抗原結合部位だけが変性される。このように処理した免疫グロブリンの種々のフォーマットを記載している現存する文献の大部分は、一本鎖Fv断片（scFv）又はFab断片の形で頻繁に表現している。これらは、ファージ粒子の表面上で表示されるか、又は種々の原核又は真核発現系で溶解性発現される。

WO06/07260A1には、構造ループ領域内で変性して新規抗原結合部位を得ることを含む免疫グロブリンの設計方法が記載されている。この方法は、免疫グロブリンに幅広く利用可能であり、かつ様々な抗原をターゲッティングする免疫グロブリンのライブラリーを作成するために使用してもよい。CH3ライブラリーは、抗原の特異的バインダーを選択するのに有効であることが示されてきた。

WO08/003103A2には、CD20抗原のミモトープを示す合成ペプチドにおけるCH3、CH1又はCLライブラリーのパンニングが記載されている。

特異的な免疫グロブリンバインダーを得るために、この分野では様々な免疫グロブリンライブラリーが提唱されている。従来技術は、一般に結合ドメインのモノマーの一価表示に関する。WO9209590A2には、粒子の表面上に融合タンパク質の１つのコピーを表示するファージミド粒子が記載されている。これにより、ファージミド粒子（またバクテリーファージとも称される）のライブラリーから高親和性のバインダーを得ることが記載されている。結合ポリペプチドとファージコートタンパク質をコードする遺伝子から成る複製可能な発現ベクターは、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を形成するために提供される。これらは、ファージミド粒子のキメラタンパク質、ファージコートタンパク質及び結合ポリペプチドである。

US5223409には、一般に重要なタンパク質をコードする遺伝子を線維状ファージM13の遺伝子IIIコートタンパク質のＮ−末端ドメインに融合する方法が記載されている。遺伝子融合は突然変異し、ファージミド粒子の表面上で低量で発現する構造的に関連する融合タンパク質のライブラリーを形成する。生物学的選択及びスクリーニングは、薬物候補として有用な新規リガンドを同定するために使用される。

しかし、このような"融合ファージ"又は一価のファージ表示又は個々の単一融合タンパク質の使用には幾つかの制限がある。多くの生物学的物質は、天然にはオリゴマーの形で存在する。本発明の目的では、オリゴマーとはダイマー、トリマー又はそれ以上、２４個のモノマーまでの高度なポリマーの形を意味する。

従来技術による融合ファージは、モノマーの融合タンパク質を表示することが記載されている。なぜならば、単一融合タンパク質がファージミド粒子により表示される場合には、最も高い親和性のバインダーは１つのライブラリーからのみ選択されると主に考えられていたからである。しかし天然のタンパク質はダイマーとして又はより高い程度のオリゴマー化で組み立てられる。単一融合タンパク質を有するダイマー表示を得るために、コートタンパク質と結合ポリペプチドの間に位置する条件付き終止コドンを含む幾つかの技術が開発された（Dall’s Acqua et al., The Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180）。これによりファージに融合した物に加えて、ポリぺプチドの可溶性モノマーが発現され、従ってダイマーの形成が可能になる。しかし、このような終止コドンは、可溶性結合ポリペプチドに加えて適量の融合タンパク質を提供するために、アミノ酸中の終止コドンを翻訳できる特異的なサプッレサーホスト細胞内での伸長を必要とする。

従来技術の融合タンパク質は、幾つかの場合においてより大きい結合ポリペプチドを表示するリンカー配列を含む。２４個までのアミノ酸のリンカー配列は、抗体の可変ドメインを表示する標準的な目的で一般的に使用される。例えば、ベクターpCOMB3xの表示に関しては、以下を参照のこと（Hybrid. Hybridomics. 2003 Apr; 22(2): 97-108. Development of functional human monoclonal single-chain variable fragment antibody against HIV-1 from human cervical B cells, Berry JD, Runtherford J. Silverman GJ, Kaul R, Elia M, Gobuty S, Fuller R, Plummer FA, Barbas CF.）。

全長IgG1をベースとする免疫グロブリンは、充実性腫瘍を患っている患者の治療に、特にerbBクラスのレセプターを過剰発現する腫瘍に幅広く使用されてきた。これらのレセプターの中には、EGFR（Her1）、Her2、Her2neu、Her3及びHer4がある。

ハーセプチン（transtuzumab、humAb4D5）は、乳癌治療で使用するためのモノクロナー抗体をベースとする製品である。ハーセプチン抗体は、her2neuのHER2細胞外ドメインの4D5に特異的である（c-erbB-2又はMAC117とも称される）。

"HER2細胞外ドメイン"又は"HER2 ECD"は、それぞれ細胞膜に固定されているか、又は循環している細胞の外側であるHER2のドメイン（又はその断片を含む）を意味する。HER2の細胞外ドメインは４つのドメインから成っていることができる：
"ドメインI"（アミノ酸残基、約１〜１９５）、"ドメインII"（アミノ酸残基、約１９６〜３１９）、"ドメインIII"（アミノ酸残基、約３２０〜４８８）及び"ドメインIV"（アミノ酸残基、約４８９〜６３０）（シグナルペプチド無しの残基の番号付け）。

"エピトープ4D5"は、HER2の細胞外ドメイン内の領域であり、これに抗体4D5（ATCC CRL 10463）とトランスツズマブ（transtuzumab）が結合する。このエピトープは、HER2の膜内外ドメイン、すなわちHER2のドメインIV内に近い。HER2の4D5エピトープは、約５２９〜約６２５の残基の領域内（HER2 ECDを含める）の１つ以上の残基を取り囲んでいる。ここで、残基の番号付けにはシグナルペプチドも含める。

EGFRは、単一の膜内外領域と、非触媒的調節領域によりフランキングされた細胞質チロシンキナーゼドメインを有する大きな（1186残基）モノマーの糖タンパクである。

配列分析は、ectoドメイン（1〜621残基）が、４つのサブドメインを含むことを示した。ここでは、L1、CR1、L2及びCR2と称することにし、その際、LとCRはそれぞれLarge及びCys-richの頭辞語である。L1とL2ドメインは、それぞれドメインII及びIIIとも称してある。CRドメインは先にドメインII及びIV又はS1.1-S1.3及びS2.1-S2.3と称した（SはSmallの略語）。

EGFRの外部ドメインへのMABsは、レセプターに対するリガンド結合及びそれに続くシグナルトランスダクションを崩壊するために開発された。３つのEGFRを特異的に遮断する抗体は、in vitroで詳細に特徴付けられ、かつ現在のところ臨床試験で使用されている。これは、mAbC225（ERBITUX/cetuximab）、mAb425（EMD72000）及びヒトmAb ABX-EGFである。C225（Cetuximab/Erbitux）は、FDAが転移性直腸癌に認可したものであり、かつmAb425（EMD59000）、そのヒト化バージョン（EMD72000）は現在ではEGFrを表示する様々な充実性腫瘍の臨床試験フェーズIIである。C225は、EGFrの細胞外ドメイン上に特異なエピトープに結合する。主に腫瘍細胞で表示される両方の抗体の野生型レセプターに対するならびに突然変異体レセプター（EGFrVIII）に対する独立した結合が示されている。セツキシマブ（Cetuximab）は専らEGFR（sEGFR）の細胞外領域のドメインIIIとだけ反応し、有利にはこのドメイン上のリガンド結合領域を封入し、かつレセプターを二量体化から空間的に妨げる。

自然に生じる突然変異体EGFレセプターは、神経グリア芽細胞種で初めて示された。EGFRvIIIとして公知であるように、この分子はEGFレセプターの細胞外ドメインでエキソン２〜７の欠損を示す。これは２７３個のアミノ酸を除去し、かつ新たなグリシンを融合結合部で作成する。EGFRvIII（de2-7 EGFR又はdeltaEGFRとも称される）は、細胞外部位のフレーム内欠損を有し、これは様々なタイプのヒトの腫瘍で見つかっている。

WO9720858A1は、Her2表示細胞中でアポトーシスを含む抗−Her2抗体に関する。従って、Her2に結合するモノクロナール抗体（mAbs）は、精製した溶解性Her2でマウスを免疫化することにより発生する。

WO06087637A2は、Her2/neuを認識する抗体に関し、かつHer2/neu表示細胞上で抗増殖効果を発揮する。この文献は、単離抗体又は断片、これらの変異体又は誘導体、特にヒトFab断片及びscFv断片、Her2neuに特異的に結合するものを記載しているが、しかし細胞毒性活性の無いものである。

幾つかの従来技術で開示されたものは、ADCCのような細胞毒性活性の不在で、腫瘍成長を阻害する可能性のある抗体フォーマットに関する。

Rovers et al（Cancer Immunol. Immunother. (2007) 56: 303-317頁）には、腫瘍細胞成長を阻害する可能性のある抗−EGFRナノ体が記載してある。

WO03/075840A2には、ヒトVEGFと匹敵するか、又はそれ以上の親和性を有するKDRに結合する抗体、かつKDRの活性を中和するもの、これらの中でもKDRの活性を中和し、よって脈管形成と腫瘍成長を阻害する一価のFabsが開示されている。

その他の免疫グロブリン断片は、ヒトの治療用に提唱されている。

特許明細書WO06036834A2には、Fcドメインのループ領域中に内部配列として挿入された、生物学的に活性なペプチドが記載されている。前記明細書は、内部ペプチド配列が予め存在するFcドメイン中のアミノ酸の挿入又は置換により加えられていてもよい分子に関する。例示的なペプチドは、p185HER2/neuのターゲッティングである。

HER2/neuをターゲッティングするペプチドは、Park et alによりNat. Biotechnol.(2000)18(2): 194-8頁に記載されている。ペプチド結合親和性は、通常は１０^-6Mを上回るkDを有する低い範囲内であるが、記載された環外抗−HER2/neuペプチドミミックは、通常は高い親和性（KD＝300nM）を有する。

WO01/01748A2には、ヒトerbB2遺伝子産物に低い結合親和性で結合するペプチド化合物が記載されている。erbB2に向けられた例示的なペプチド−Fc融合タンパク質は、競合結合において試験された。ここで、競合相手として使用したペプチドと同じタイプのものを少量用いて、低いIC50値の結果が出たが、飽和アッセイで決定したようなKd又はEC50値は示さないものと思われる。

本発明の対象は、細胞表面に結合する改善された免疫グロブリン製品の提供である。

この対象は、請求項に記載されたような内容により解決される。

本発明のまとめ
本発明によれば、６０kDまでの分子量を有し、Kd＜１０^-8M、有利にはnMの範囲又はそれ以下の結合親和性で細胞表面ターゲットに特異的に結合する細胞毒性抗体が提供される。本発明による高親和性モジュラー抗体は、細胞層又は腫瘍を通りやすくし、またターゲットが過剰発現した箇所で細胞溶解又は細胞死を作用させる利点を持たせるためにサイズを小さくしてある。また本発明によるモジュラー抗体は、飽和結合アッセイで決定したように有利にはIC50＜１０^-8Mを有する。

本発明によるモジュラー抗体は、有利にはADCC、ADCP、CDC又はアポトーシス活性のうち少なくとも１つを作用させる。

本発明によるモジュラー抗体の細胞毒性活性は、ADCC、ADCP及びCDC活性のうち少なくとも１つにより測定されるように、特にそのエフェクター機能により決定される。

本発明による有利なモジュラー抗体は、モジュラー抗体ドメインのオリゴマー、特に免疫グロブリンドメインのオリゴマーであるか、又は全長免疫グロブリンの断片である。有利な抗体は、VH/VL、CH1/CL、CH2/CH2、CH3/CH3、Fc及びFabから成るグループから選択されるダイマー、又はこれらの一本鎖である。

本発明によるモジュラー抗体は、構造ループ領域内に、ランダム化された抗体配列及び／又は少なくとも１つの結合部位を有する結合部位を含有し、これは抗原結合に寄与し得る末端ドメイン配列を潜在的に含むものと常に解釈される。ランダム化された抗体配列の部位は、CDR領域内又は構造ループ領域内にあってもよい。従って、ターゲット又はエフェクター分子のような機能的リガンド、有利な場合にはスカフォールドリガンドに対する結合は、CDR領域無しの免疫グロブリン、又はCDR領域以外の部位によっても可能である。

有利な実施態様によれば、細胞表面ダーゲット結合部位はCDR領域内に位置し、かつ機能的リガンド又はスカフォールドリガンドに対して特異性を有する結合部位は、構造ループ領域内にある。

二者択一的に有利な実施態様によれば、機能的リガンド又はスカフォールドリガンドに対して特異性を有する結合部位は、CDR構造ループ領域内にあり、かつ細胞表面ターゲット結合部位は構造ループ領域内に位置する。

本発明による有利なモジュラー抗体は、ターゲットと結合するために特異的結合特性を有し、これはEGFR、Her2、Her2neu、Her3及びHer4から成るグループから選択されるerbBクラスのレセプターである。本発明による有利なモジュラー抗体は、充実性腫瘍を患っている患者を治療するために提供され、この腫瘍はerbBクラスのレセプターを発現する。

構造ループ領域のEFループ内に１つのアミノ酸配列を含み、この配列が表４と５に記載されている配列番号（場合によりEF及び／又はAB及び／又はCDループに含まれる）から成るグループから選択される抗Her2モジュラー抗体が特に有利である。

高い効率があり、しかし小さなサイズの抗体には長期間を必要とするにもかかわらず、モジュラー抗体ドメインのライブラーを用いて、特にエフェクターリガンドに結合するモジュラー抗チアドメインのオリゴマーのライブラリーを用いて、本発明によるモジュラー抗体が得られたのは、これが初めてである。選択されたこのようなライブラリーのメンバーは、生物学的細胞毒性又は細胞崩壊の前提条件として、ターゲット結合とエフェクターリガンド結合の両方の特性を有する。モジュラー抗体スカフォールドのフォーマットは、変異体及びこのようなスカフォールドのライブラリーの製造により変化しないのが更に有利であり、従って、ライブラリーメンバーはスカフォールドリガンドに結合することにより決定されるような機能的フォーマットを維持する。

本発明によれば、請求項１に記載のモジュラー抗体を製造する方法が更に提供され、該方法は以下の工程：
ａ、モジュラー抗体ドメインのオリゴマーのライブラリーを提供し、
ｂ、エフェクターリガンドの存在で前記ライブラリーを前記ターゲットと接触させ、
ｃ、次の
（i）Kd＜１０^-8M又はＩＣ50＜１０^-8M及び
（ii）細胞毒性活性
両方の特性を有するライブラリーメンバーを選択し、かつ
ｄ、モジュラー抗体の調製物を製造する
から成る。

有利な選択法は、ターゲット及びエフェクターリガンドの両方に同時に結合を提供し、これは効果的な細胞崩壊に有利である。同時の結合は、二次元微分、例えばFACS系において細胞ベースのアッセイで決定するのが有利である。

有利には、ライブラリーメンバーはランダム化された抗体配列を含み、その際に突然変異誘発の部位はCDR領域内に又はCDR領域以外にあり、有利には場合により末端配列を含む構造ループ領域内にある。

本発明による方法で使用されるようなライブラリーは、エフェクターリガンドと相互作用する結合部位とは別に突然変異誘発を提供する設計により製造されるのが有利である。従って、エフェクター分子結合又はスカフォールドリガンド結合のアッセイを用いる品質コントロールにより決定されるような、高品質ライブラリーが有利に使用される。

本発明による有利な方法は、更に親和性成熟の工程を有し、細胞表面ターゲットに対する結合親和性を増大する。この親和性成熟は、有利にはコントロールタンパク質との交叉反応ではなく、しかしなお中程度もしくは低い親和性を有しているターゲットに結合させるために決定された結合特異性を有する選択された免疫グロブリンの突然変異誘発により行うのが有利である。IC50又はKd＜１０^-6Mの結合親和性を有するライブラリーメンバーは、更に突然変異されて、親和性成熟したバインダー又はこのようなバインダーのプールを提供する。すなわち、IC50又はKd＜１０^-7M、有利にはIC50又はKd＜１０^-8M、又はnMもしくはより低い範囲の高親和性を有する親和性成熟したバインダーのライブラリーを提供する。この場合に、本発明によるモジュラー抗体は、細胞毒性効果に関して、なお機能的であるのが有利である。

有利な実施態様によれば、erbBクラスのレセプターを表示する充実性腫瘍を患っている患者を治療するための、本発明によるモジュラー抗体を製造する方法が提供される。

本発明によるモジュラー抗体は、有利にはerbBクラスのレセプターを表示する充実性腫瘍を患っている患者を治療するために使用される。

図１は、ライブラリーFcab01の組立てに使用した断片を製造するために利用したPCRを示す図である。PCRプライマーは、それぞれ５’−３’方向で矢印で示されている。垂直線は、突然変異遺伝子の組立てに使用した導入された制限部位のおおよその位置を示す。制限部位はPCR断片のライゲーション用のプライマーに含まれている。 図２はCH3ドメインのアミノ酸配列及び二次構造を示す図である。ランダム化のスキームは、ライブラリーFcab01からFcab06に示されている。ABとEPループ中でランダム化された箇所は丸で示されている。Ｘは、２０種の全てのアミノ酸を示し、ｚはAla、Asp、Ser、Tyrである。 図３は配列番号１に相当し、IgG1 Fc断片の結晶構造（アミノ酸配列）を示す図である。 図４は配列番号２に相当し、ランダム化されたアミノ酸変性を含むヒトIgG（アミノ酸配列）を示す図である。 図５は配列番号１１に相当し、FcabRGD4Lのアミノ酸配列（アミノ酸配列）を示す図である。 図６は配列番号１２に相当し、ベクターpHENFcabRGD4（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図７は配列番号１４に相当し、ベクターpHENFcabRGD4L（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図８は配列番号１５に相当し、ベクターpYD1dX（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図９は配列番号１６に相当し、ベクターpYD1dXFc（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１０は配列番号１７に相当し、pYD1CH12 （ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１１は配列番号１８に相当し、Fcab01（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１２は配列番号１９に相当し、Fcab02（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１３は配列番号２０に相当し、Fcab03（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１４は配列番号２１に相当し、Fcab04（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１５は配列番号２２に相当し、Fcab05（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１６は配列番号２３に相当し、Fcab06（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１７は配列番号７２に相当し、ベクターpYD1（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１８は配列番号７３に相当し、ベクターpYD1Nhe（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図１９は配列番号７４に相当し、ベクターpYD1lnk（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２０は配列番号７５に相当し、ベクターpYD1mata（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２１は配列番号７６に相当し、ベクターpYD1gal（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２２は配列番号７７に相当し、4D5H（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２３は配列番号７８に相当し、4D5L（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２４は配列番号７９に相当し、ベクターpYD4D5hc（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２５は配列番号８０に相当し、4D5hp（アミノ酸配列）を示す図である。 図２６は配列番号８１に相当し、ベクターpYD4D5hl（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２７は配列番号８２に相当し、4D5lp（アミノ酸配列）を示す図である。 図２８は配列番号４２７に相当し、プラスミドpYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt（ヌクレオチド配列）を示す図である。 図２９は配列番号４２８に相当し、プラスミドpYD1dX_dCH1_Fcab_wt（ヌクレオチド配列）を示す図である。

本発明の詳細な説明
定義
本明細書中で使用される特別な用語は以下の意味を有する。

本発明により使用されるような"免疫グロブリン"という用語は、単一特異的、二重特異的、多重特異的であるか、又は一価、二価又は多価の結合特性を示し、有利には、例えば抗原、エフェクター分子あるいは病原体由来又はヒト構造のタンパク質のエピトープ、例えば細胞会合もしくは血清タンパク質を含む自己抗原に対して少なくとも２個、より有利には少なくとも３個の特異的結合部位を有するポリペプチド又はタンパク質として定義される。本発明により使用される免疫グロブリンという用語には、抗体の機能的断片、例えば、Fc、Fab、scFv、CH1/CLドメインの一本鎖ダイマー、Fv、ダイマー、例えば、VH/VL、CH1/CL、CH2/CH2、CH3/CH3、又は免疫グロブリンの他の誘導体又は組合せ、例えば、免疫グロブリンドメインの対の一本鎖のも含まれる。更に、この定義には、可変領域（例えば、dAb、Fd、Vl、Vk、Vh、VHH）と定常領域のＨ鎖とＬ鎖のドメイン又はCH1、CH2、CH3、CH4、Cl及びCκのような無傷の抗体の個々のドメインならびに構造ループにより結合した免疫グロブリンドメインの少なくとも２個のβストランドから成るミニドメインも含まれる。

本発明により使用されるような"モジュラー抗体"は、少なくとも１つのポリペプチドモジュール又はタンパク質ドメイン（有利には天然型）から成るヒト抗体のような抗原結合分子として定義される。"モジュラー抗体"は、免疫グロブリン、免疫グロブリン様タンパク質であるか、又はモジュラーフォマット、また免疫グロブリンもしくは抗体に類似した抗原結合特性を示す他のタンパク質である抗原結合分子を含み、これは有利にはヒトタンパク質をベースとする抗原結合スカフォールドとして使用できる。

本発明により使用されるような"免疫グロブリン様分子"とは、抗原結合タンパク質、特にヒトタンパク質を意味し、これはモジュラー法で形成できるドメイン構造を有する。本発明により有利に使用されるような免疫グロブリン様分子は、Ｔ細胞レセプター（TCR）又はこの可溶性部分、フィブロネクチン、トランスフェリン、CTLA-4、一本鎖抗原レセプター、例えば、T細胞レセプターに関するもの、抗体、抗体ミメチックス、アドネクチン、アンチカリン、フィロマー、反復タンパク質、例えば、アンキリン反復配列、アビマー（Avimer）、Versabodies^TM、サソリ毒ベースの分子、及び抗原結合特性を有するその他の非抗体タンパク質スカフォールドを意味する。

アニキリン反復配列（AK）、アルマジロ反復配列（ARM）、ロイシンリッチリピート（LRR）及びテトラトリコペプチド（TPR）タンパク質は、反復タンパク質の最も優性なメンバーである。反復タンパク質は、積み重ねられて延長したドメインを形成する相同構造単位（反復単位）から成る。結合相互作用は、通常は幾つかの隣接する繰り返しにより媒介され、大きなターゲット相互作用表面を生じる。

アビマーは、多くの細胞表面レセプター中の多重ドメインの鎖としてAドメインを含む。このファミリーのドメインは、小さな分子、タンパク質及びウイルスを含む１００種を越える様々な公知のターゲットと結合する。トランケーション分析は、ターゲットが一般に多重A-ドメインにより、特有のエピトープに独立に結合している各ドメインと接触することを示した。多重結合ドメインを組み合わせることにより生じる結合力は、親和性と特異性を増大させる有力なアプローチであり、これらのレセプターは、その過程の際に活用される。

アンチカリンは、ヒト化抗体に典型的な規定された結合特性を有するリポカリンスカフォールドに由来する工学的に作成されたヒトタンパク質である。リポカリンは、１６０〜１８０個のアミノ酸から成り、かつ４つのループにより囲まれたリガンド結合ポケットを有する円錐形のβバレルタンパク質を形成する。小さな疎水性化合物は、リポカリンの天然リガンドであり、かつ新たな化合物特異性を有する種々のリポカリン変異体（"アンチッカリン"とも称される）は、この結合ポケット中で残基をランダム化した後に単離できる。

一本鎖抗原レセプターは、一本鎖の可変ドメインを含み、かつラクダの単一ドメイン抗体よりも２０％小さい。

フィロマーは、生物多様性の天然タンパク質断片に由来するペプチドである。"モジュラー抗体"、"免疫グロブリン"、"免疫グロブリン様タンパク質"という用語には、これらの誘導体も同様に含まれると解釈される。誘導体とは、本発明の１つ以上のモジュラー抗体の組合せ、及び／又は本発明のモジュラー抗体のいずれかのドメイン又はミニドメインが、他のタンパク質の１つ以上のいずれかの位置で融合した融合タンパク質である（例えば、他のモジュラー抗体、免疫グロブリン、リガンド、スカフォールドタンパク質、酵素、トキシン及びそのようなもの）。本発明のモジュラー抗体の誘導体は、様々な化学技法、例えば、共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合などにより、他の物質に会合又は結合することにより得てもよい。免疫グロブリンに結合した他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機及び無機分子又はこれらのいずれかの組合せ物（例えば、PEG、プロドラッグ又はドラッグ）であってもよい。誘導体は、同じアミノ酸配列を有するが、しかし非天然又は化学的に変性したアミノ酸から完全に又は部分的に作られた抗体を含む。有利な誘導体は、ターゲット結合及び細胞毒性活性の両方に関して機能を有する。

本発明による"構造的ループ"又は"非CDR−ループ"とは、以下のように解釈される：モジュラー抗体、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様物質は、いわゆる免疫グロブリンフォールドを有するドメインから作られる。本質において、逆平行βシートはループにより連結し、圧縮された逆平行のβバレルを形成する。可変領域では、このドメインの幾つかのループが本質的に抗体の特異性、すなわち、抗体の天然の結合部位による抗原との結合に寄与する。これらのループは、CDRループとも称される。CDRループは、CDRループ領域内に位置し、これは幾つかの場合には可変フレームワーク領域の部分も含み（"VFR"と称される）、この領域はCDRループに隣接する。VFRの幾つかのループは、抗体の抗原結合ポケットにも寄与することが知られていて、これは一般的にCDRループにより決定される。従って、VFRループは、CDRループ領域の部分として考えられていて、かつ新たな抗原結合部位を工学的に作成するために適切に使用できない。抗原−結合ポケット又はCDRループ領域以外のループは、通常は構造ループ又は非CDRループと称される。CDRループ領域内又はCDRループの付近に位置するVFRとは異なり、可変ドメインのVFRのその他のループは構造ループとみなされ、かつ特に本発明による使用に適切である。これらはCDRループ領域の反対側に位置するか、又は可変免疫グロブリンドメインのＣ末端側に位置するVFRの構造ループであるのが有利である。定常ドメインは、１つの構造ループ領域内、例えば、抗体ドメインのＣ末端側もしくはＮ末端側のどちらかに、また抗体ドメインの側鎖中にも構造ループを有する。定常ドメインは、フレームワーク領域の部分とも称される。

本発明により使用されるような"抗原"又は"ターゲット"という用語には、モジュラー抗体の結合部位により認識され得る特に全ての抗原とターゲット分子が含まれる。本発明による分子によりターゲットされるような特に有利な抗原は、前記抗原又は分子であり、これらは免疫学的にもしくは治療学的に関連することが既に証明されたか、又は可能であるものであり、特に臨床効果が試験されたものである。

本明細書中で使用されているような"ターゲット"又は"抗原"という用語には、アレルゲン、腫瘍関連抗原、自己抗原、これは細胞表面レセプター、酵素、Fc-レセプター、FcRn、HAS、IgG、インターロイキン又はサイトカインを含む、補体系のタンパク質、輸送タンパク質、血清分子、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原及びウイルス抗原、また伝達性海綿状脳症 (TSE)、例えば、プリオン（感染又は非感染）、及び炎症状態に関するマーカー又は分子、例えば、前炎症性因子、多発性硬化症又はアルツハイマー病、又はハプテンから成るグループから選択される分子が含まれる。

"細胞表面抗原"という用語には、細胞表面上の抗体構造により認識できる全ての抗原、及びこのような分子の断片が含まれるものとする。有利な細胞表面抗原は、免疫学的にもしくは治療学的に関連することが既に証明されたか、又は可能であるものであり、特に前臨床効果もしくは臨床効果が試験されたものである。細胞死滅活性を媒介する細胞表面分子が本発明の目的に特に関連する。本発明による免疫グロブリンが有利には２個の細胞表面分子と結合する際に、免疫系は細胞崩壊又は細胞死をもたらし、これによりヒトの細胞を攻撃する可能性のある手段が提供される。

抗原は、ターゲット分子全体として又はこのような分子の断片として認識され、一般的にエピトープと称されるターゲットの下部構造と認識されるものとする。抗原の下部構造は、これらが免疫学的に関連する限りは、一般に"エピトープ"（例えば、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ）と称され、これらはすなわち天然抗体又はモノクロナール抗体によっても認識される。本明細書で使用されるような"エピトープ"という用語は、本発明によるモジュラー抗体又は免疫グロブリンの結合部位に対する特異的な結合相手を完全に作るか、又は特異的結合相手の部分であってもよい分子構造に関する。エピトープという用語は、ハプテンも意味する。化学的に、エピトープは炭水化物、ペプチド、脂肪酸、有機物質、生化学物質又は無機物質から成るか、又はこれらの誘導体ならびにこれらのいずれかの組合せから成っていてよい。エピトープがポリペプチドである場合には、通常は少なくとも３個のアミノ酸、有利には８〜５０個のアミノ酸、より有利には約１０〜２０個のアミノ酸をペプチド中に含有する。ペプチドの長さには厳密な上限はないが、これはタンパク質のポリペプチド配列の全長に近い。エピトープは、線状又は立体構造エピトープであることができる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖の一次配列の単一セグメントから成る。線状エピトープは、連続又は重複であってもよい。立体構造エピトープは、ポリペプチドのフォールディングにより一緒になり、三次元構造を形成するアミノ酸から成るが、これらのアミノ酸は必ずしも線状構造内で互いに隣接している必要はない。特に、エピトープは診断学的に関連する分子の少なくとも一部である。すなわち、サンプル中のエピトープの不在又は存在は、患者の疾患もしくは健康状態、又は製造におけるプロセス状態又は環境もしくは食事状態と定量的又は定性的に相関する。エピトープは、治療学的に関連する分子、すなわち、疾患の経路を変更する特異的結合ドメインによりターゲッティング可能である分子の少なくとも一部であってもよい。

本明細書で使用されているような"特異的に結合する"又は"特異的結合"とは、結合反応に関し、分子の異種母集団中で重要な同源リガンドの決定するものを意味する。従って、設計条件下（例えば、免疫アッセイ条件）では、モジュラー抗体はその特定のターゲットと結合し、かつサンプル中に存在する他の分子には著しい量で結合することはない。

特異的結合とは、結合がターゲットの同一性、高度、中程度又は低い程度の結合親和性又は結合力の面から選択的であることを意味する。選択的結合は、通常は結合定数又は結合動態が少なくとも１０倍異なる、有利には少なくとも１００倍異なる、かつより有利には少なくとも１０００倍異なる場合に達成される。

"発現系"とは、所望のコード配列とコントロール配列を有する核酸分子が操作可能な結合の状態にあり、その結果、これらの配列で形質転換もしくはトランスフェクトされた宿主がコードタンパク質の生産を可能にすることを意味する。形質転換を有効にするために、発現系はベクター上に含まれていてもよい。しかし、該当するDNAは宿主染色体に組込まれていてもよい。二者択一的に、発現系をin vitroの転写／翻訳に使用することもできる。

免疫グロブリンのアミノ酸配列の全ての番号付けはIMGT番号付け方式による（IMGT, the international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212）。

本発明の目的で、"結合剤"又は"リガンド"とは結合対の数を意味する。特に、結合対の結合ドメインとして使用される可能性のある結合ポリペプチドを意味する。結合相手の例には、機能的相互作用を有する結合剤の対、例えば、リガンドに結合するレセプター、抗原又はレセプターに結合する抗体、ターゲットに結合する薬剤及び基質に結合する酵素のようなものが含まれる。

本発明の目的で使用されるような"融合タンパク質"又は"キメラ融合タンパク質"という用語は、遺伝子パッケージから成る分子、外側の表面構造の少なくとも一部、例えばコートタンパク質、場合によりリンカー配列、及び結合剤を意味する。融合タンパク質は、結合剤の遺伝子と情報を有するベクターによりコード化され、かつ遺伝子パッケージの表面で結合剤のコピーを表示する。

本発明の目的で使用されるような"細胞毒性"又は"細胞毒性活性"という用語は、抗原に結合した場合に、補体経路を活性化するか又はキラー細胞を活性化し、細胞溶解を生じるか又はアポトーシスを引き起こす細胞性抗原に対する特異的分子を意味する。特に、これは細胞毒性Ｔ細胞における活性を生じるエフェクター細胞における活性、又は抗体依存性細胞媒介細胞障害（ADCC）、補体依存細胞障害（CDC）及び／又は細胞食作用（ADCP）を媒介する細胞にあてはまる。更にこれはアポトーシス効果に当てはまり、プログラムによる細胞死（PCD）を引き起こす。本発明によるモジュラー抗体は、エフェクター細胞のFcレセプターに結合することにより、又はプログラムによる細胞死を誘発することにより抗体に被覆されたターゲット細胞を死滅させる。

"スカフォールド"とは、ポリペプチドの変異体又はレパートリーの構築において、ポリペプチドの分子構造を支持するために使用される天然又は人工的な一時的なフレームワークを意味する。通常、親分子の三次構造又は機能を保持しているのはポリペプチドドメインのモジュラー系である。例示的なスカフォールドは、モジュラー抗体であり、これは突然変異誘発されてスカフォールド内で変異体を製造し、ライブラリーを得てもよい。

本発明の目的に使用される"スカフォールドリガンド"という用語は、モジュラー抗体のスカフォールド又は骨格と結合するリガンドを意味し、これにより前記モジュラー抗体の分子構造又は一次機能及び特異性を決定する。有利な場合には、スカフォールドリガンドは、機能的リガンドであり、エフェクターリガンドのように結合の際に生物学的機能を媒介する。二者択一的な実施態様では、スカフォールドリガンドは機能的リガンドであり、これはCDR領域もしくは構造ループ領域により結合する特異的ターゲットである。同一のスカフォールドリガンドは、それらのターゲット特異性にかかわらずモジュラー抗体の多くの変異体に結合できる。一般に、スカフォールドリガンド結合部位の存在は、変異体が発現し、かつ正確にフォールドされることを示す。従って、スカフォールドリガンドのその結合部位に対する結合は、ポリペプチドのレパートリーから機能的ポリペプチドを予備選択し、特徴付けかつスクリーニングする方法を提供する。スカフォールドリガンドに対する結合特性を維持するモジュラー抗体の変異体の設計は、例えば、突然変異の導入の結果生じる非機能的なフォールディングミュータント又は発現ミュータントの製造を回避し、その際に、これらの変異体、実質的にどのターゲット又はエフェクターリガンドとも結合できない。時折、このような非機能的ミュータントは、ポリペプチドレパートリーの構築で使用される通常のランダム化ならびに多様化の方法により生じる。スカフォールドリガンドに結合する機能的ミュータントの提供は、当業者により、機能的に富み、良好にフォールドされ、かつ高度発現されたライブラリーのメンバーのモジュラー抗体のライブラリーの作成が可能である。例えば、スカフォールドは親Fabであることができ、かつ親Fab変異体の少なくとも２０％、有利には少なくとも３０％、より有利には少なくとも４０％が前記親FabのCDR−ターゲットに結合している。

本発明の目的に使用されるような"エフェクターリガンド"という用語は、エフェクター分子のようにエフェクター機能を媒介するリガンドを意味する。例示的なエフェクターリガンドはFcレセプター又は免疫グロブリンを妨害するFcレセプターのような分子である。Fcレセプターは、免疫系の保護機能に寄与するナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球及び肥満細胞を含めた特定の細胞表面上で見られるタンパク質である。その名前は、Fc（断片、結晶性）領域として公知の抗体の一部に特異的なその結合に由来する。Fcレセプターは、感染細胞又は侵入した病原体に付着する抗体に結合する。それらの活性は食細胞又は細胞毒性細胞を刺激し、抗体媒介性細胞食作用（ADCP）又は抗体依存細胞媒介性細胞障害（ADCC）により病原菌又は感染細胞を破壊する。Fcレセプターには幾つかの異なるタイプがあり、それらが認識する抗体のタイプに基づいて分類される；例えば、最も一般的な抗体のクラスであるIgGに結合するレセプターは、Fc−ガンマレセプター（FcγR）と呼ばれ、IgAに結合するものはFc−αレセプター（FcαR）と呼ばれ、かつIgEに結合するものはFc−レセプター（FcαR）と呼ばれる。エフェクターリガンドと同等であり、よって定義に含まれるものは、モジュラー抗体の範囲内で同じ又は類似した結合部位を認識する代理リガンド、例えばタンパク質Aのようなものである。

全てのFcγRは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、かつオプソニンを作用させる（被覆された）病原菌を誘発する最も重要なFcレセプターである。このファミリーには、幾つかのメンバーが含まれる；例えばFcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32a）、FcγRIIB（CD32b）、FcγRIIIA（CD16a）、FcγRIIIB（CD16b）があり、これらはその分子構造の違いにより抗体親和性が異なる。例えば、FcγRIは、FcγRIIやFcγRIIIよりも強くIgGに結合し、かつ３つの免疫グロブリン（Ig）様ドメイン（FcγRIIやFcγRIIIよりも１つ多いドメインを有する）から成る細胞外タンパク質を有する。これらの特性は、単独のIgG分子（又はモノマー）によりFcγRIの活性化を可能にするのに対して、後者２つのFcγレセプターは活性化すべき免疫複合体内で複数のIgG分子に結合しなくてはならない。

もう１つのFcRは、複数の細胞タイプにおいて発現され、かつMHCクラスIの構造に類似している。このレセプターは、gGにも結合し、この抗体の保存に関わる。しかし、このFcレセプターは、母親から胎盤を介して胎児へ、又は母乳を介して乳児へのIgG輸送にも関わるので、新生児Fcレセプター（FcRn）とも呼ばれる。近年では、このレセプターはIgG血清レベルの恒常性に関わっているものとされている。

抗体依存細胞媒介性細胞障害（ADCC）は、細胞に媒介される免疫のメカニズムであり、これにより、免疫系のエフェクター細胞は特異的抗体により結合されたターゲット細胞を活発に溶解する。これは、ヒト免疫応答の一部として抗体が感染を制限し、かつ阻止できるように作用するメカニズムのうちの１つである。古典的ADCCはナチュラルキラー（NK）細胞により媒介される；単核細胞及び好酸球もADCCを媒介できる。例えば、好酸球は回虫として知られる特定の寄生虫をADCCにより死滅させることができる。ADCCは、先の抗体応答とは独立しているので適応性免疫応答の一部分である。

アミノ酸に関連して"異種"とは、新たに導入された天然由来のアミノ酸を意味するが、しかし変性部位に対して異種であるか、また天然由来のアミノ酸の置換物を意味するわけではない。抗原結合部位に関する"異種"は、抗原結合部位が薬剤の特異的結合領域により天然に形成されず、かつ異種結合相手であるが薬剤の天然の結合相手ではないものを新たに工学的に作成した結合部位により結合することを意味する。

本明細書内で使用されるような"CDR領域"とも称される"可変結合領域"という用語は、抗原との結合相互作用が可能な様々な構造を有する分子を意味する。これらの分子は、そのままの形で使用されるか、又はより大きなタンパク質の内部に組み込まれていてもよく、このように結合機能を有するタンパク質の特異的領域が形成される。様々な構造は、免疫グロブリン又はフィロマーのような結合タンパク質の天然のレパートリーから誘導されるか、あるいか反復タンパク質、アビマー及びアンチカリンを含む合成的多様性から誘導することができる。様々な構造は、特に本明細書内で記載されているランダム化法により製造することもできる。これらには突然変異されたCDR又は非CDR領域、免疫グロブリン可変ドメイン又は定常ドメインのループ領域が含まれる。

特異的部位に種々の変性がある変性結合剤は、"変異体"と称される。スカフォールドの変異体は、有利に分類されて結合剤のライブラリーを形成し、これは予定した機能を有するライブラリーのメンバーを選択するために使用できる。これに従い、抗体配列は例えば突然変異誘発法によりランダム化される。有利な実施態様によれば、結合剤のループ領域、例えば１つ以上のループ又は末端で、潜在的に結合部位に寄与する位置を有する親抗体配列は、有利に突然変異又は変性されてライブラリーを形成する。これは有利にはランダム突然変異誘発法、セミランダム突然変異誘発法、又は特に部位特異的ランダム突然変異誘発法により行われ、特にランダムに生じたインサートを欠失、置換するか又はループもしくはループ領域、有利にはCDRループ領域又は構造的ループ領域に挿入される。これは抗体ドメイン又は下部構造の末端のうち１つに位置する末端配列を含んでいてもよい。

二者択一的に、組合せたアプローチを使用するのが有利である。公知のどの突然変異誘発法を使用してもよく、その中でもカセット突然変異誘発法が用いられる。これらの方法は、本発明の免疫グロブリンの所望の位置でアミノ酸変性を行うために使用してもよい。幾つかの場合には、位置はランダムに選択することができ、これは例えば、可能なアミノ酸のいずれかを用いて、又は有利なアミノ酸を選択して、ループ配列をランダム化することにより行われるか、又はアミノ酸の変更は単純なルールを用いて行われる。例えば、全ての残基、例えば特定のアミノ酸、例えばアラニンを突然変異させることができ、これはアミノ酸スキャンニング又はアラニンスキャンニングと呼ばれる。このような方法は、より洗練され工学的アプローチと組み合わせてもよく、その際に高いレベルの配列の多様性をスクリーンする選択方法が用いられる。

６０kD未満又は６０kDまでの分子量を有する本発明による有利な細胞毒性モジュラー抗体は、全長の抗体と比べると小さなサイズを有する。有利なサイズは、５５kDまでである。モジュラー抗体の単一ドメインは、通常は１０〜１５kDの分子量を有するので、４つの抗体ドメインをベースとする又はこれから成る分子は、グリコシル化に応じて、又はトキシン又はペプチドのような薬理学的に活性な物質の更なる共役に応じて４０〜６０kDの分子量を有していてもよい。

有利なフォーマットは、モジュラー抗体ドメインから成るオリゴマー、有利には４個までのドメイン、より有利には３個までドメイン、更に有利には２個のドメインベースとするオリゴマーであり、このオリゴマーは有利にはFabのようなヘテロダイマー、又はFcのようなホモダイマーから成る。５個以上のモジュラー抗体ドメインの組合せをベースとするフォーマットは、通常はサイズを小さくした断片の特殊な利点、すなわち様々な発現系における発現かつ組織貫通を容易にする利点を発揮しないと考えられる。

本発明の有利なモジュラー抗体を単一ドメイン抗体として提供するのが適している。しかし、抗体ドメインは発現の際に、Fcのようなホモダイマーとして、又はFabのようなヘテロダイマーとして二量化する傾向がある。このように、二量体構造は安定な分子を提供するために有利であると考えられている。免疫グロブリンの有利なダイマーは、単一ドメインダイマー、VH/VL、CH1/CL（κ又はλ）、CH2/CH2及びCH3/CH3から成るグループから選択される。モジュラー抗体ドメインのダイマー又はオリゴマーは、一本鎖又は２本鎖の分子として、特に１つのドメインのＣ末端がもう１つのＮ末端に結合するものとして提供できる。

結合相手は、通常は非共有相互作用により互いに特異的に結合する薬剤である。結合相手の例には、機能的相互作用を有する結合剤の対、例えば、リガンドに対するレセプター結合、抗原に対する抗体の結合、ターゲットに対する薬物結合、及び基質に対する酵素結合が含まれる。結合相手は、多くの治療、診断、分析及び工業的用途で使用されているのが見出されている。最も顕著な結合相手は、抗体又は免疫グロブリン、断片又はそれらの誘導体である。大抵の場合に、このような結合剤の結合は生物学的効果又は機能、"機能的相互作用"を媒介する必要がある。

本発明の特別な実施態様によれば、細胞毒性モジュラー抗体は結合剤であり、これはヒト又はマウス由来の免疫グロブリンであり、かつ様々な目的に、特に製剤学的組成物で使用される。当然ながら、変性された免疫グロブリンはヒト化されているか又はキメラ免疫グロブリンであってよい。

ヒト免疫グロブリンである結合剤は、有利にはIgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及びIgMから成るグループから選択されるか又は誘導されている。マウス免疫グロブリン結合剤は、有利にはIgA1、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2C及びIgMから成るグループから選択されるか又は誘導されている。

このような結合剤は、有利にはＨ鎖及び／又はＬ鎖又はこれらの部分を有する。本発明による変性免疫グロブリンは、Ｈ鎖とＬ鎖、少なくとも１つの可変ドメイン及び／又は定常ドメイン、又はミニドメインを含むこれらの一部分を有していてよい。

定常ドメインは、免疫グロブリン普請の定常部位の免疫グロブリンフォールド単位であり、定常領域のドメインとも称される（例えば、CH1、CH2、CH3、CH4、Cκ、Cl）。

可変ドメインは、免疫グロブリンの可変部位の免疫グロブリンフォールド単位であり、可変領域のドメインとも称される（例えば、Vh、Vκ、Vl、Vd）。

本発明による例示的なモジュラー抗体は、CH1、CH2、CH3、CH4、Igκ-C、Igl-C、これらの組合せ物、誘導体、又はミニドメインを含むこれらの一部分から成るグループから選択された定常ドメインから成り、その際、少なくとも１つのループ領域を含み、かつこの少なくとも１つのループ領域が少なくとも１つのアミノ酸変性を有し、少なくとも１つの変性ループ領域を形成することに特徴付けられる。その際、前記の少なくとも１つの変性ループ領域は、抗原の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。

本発明による他のモジュラー抗体は、Ｈ鎖又はＬ鎖の可変部位、これらの組合せ物、誘導体又はミニドメインを含むこれらの一部分から成ることができ、その際、少なくとも１つのループ領域を含み、かつ前記の少なくとも１つのループ領域は、少なくとも１つのアミノ酸変性を有し、少なくとも１つの変性ループ領域を形成することに特徴付けられる。その際、前記の少なくとも１つの変性ループ領域は、抗原の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。

本発明によるモジュラー抗体は、１つ以上のドメイン（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、１０個のドメイン）を含んでいてもよい。１つ以上のドメインがモジュラー抗体に存在する場合には、これらのドメインは同じタイプ又は異なるタイプであってもよい（例えば、ヒンジ領域あり又は無しのCH1-CH1-CH2、CH3-CH3、（CH2）₂-（CH3）₂）。

本発明は、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEの部分のような抗体の一部分に関する。本発明のモジュラー抗体は、機能的抗体断片、例えば、Fab、Fab₂、scFv、Fc、Fcab^TM、抗原結合Fc、又はこれらの一部分であるか、又はミニボディーのような免疫グロブリンの他の誘導体又は組合せ物、可変領域のＨ鎖とＬ鎖のドメイン（例えば、dAb、Fd、VL、Vλ及びVκを含む、VH、VHH）ならびに２つの構造ループにより結合された免疫グロブリンドメインの２つのβストランドから成るミニドメインであってもよく、これは単離されたドメインとして又は天然に付随する分子に関連したものであってよい。本発明の特別な実施態様は、抗体分子のFc断片に関し、これはアミノ酸配列の変性による抗原結合Fc断片（Fcab^TM）として、又はレセプター、ペプチド又は他の抗原結合分子、例えばscFvに対する共役物もしくは融合体としてのFc断片である。

モジュラー抗体は、単離ポリペプチドとして、又は組換え法、融合又は共役法により他のペプチド又はポリペプチドとの組合せ分子として使用できる。ペプチドは、有利には免疫グロブリンドメイン配列に相同であり、かつ有利には少なくとも５個のアミノ酸長さ、より有利には少なくとも１０個、なお有利には少なくとも５０個もしくは１００個のアミノ酸長さを有し、かつ少なくとも部分的に免疫グロブリンドメインのループ領域から成る。有利な結合特性は、先に定義したエピトープ結合、親和性及び結合力に関する。

本発明によるモジュラー抗体は、更に１つ以上の変性モジュラー抗体、又は非変性モジュラー抗体、又はこれらの一部分と組合せて、組合せモジュラー抗体を得ることもできる。組合せは有利には、組換え法により得られるが、吸着、静電相互作用又はそのようなものによる結合によっても、またリンカーを用いて又は無しで共役又は化学結合によっても得られる。有利なリンカー配列は、天然のリンカー配列であるか又は機能的に適切な人工配列であってもよい。

一般に、本発明によるモジュラー抗体を構成単位として使用し、他のモジュラー抗体又は生物学的に活性な物質もしくは分子と分子的に結合させてもよい。特異的相手に結合する少なくとも１つの抗体を、構造ループのような可変もしくは非可変配列により、少なくとも１つの他の結合分子と分子的に結合させるのが有利である。前記結合分子は、抗体、抗体断片、可溶性レセプター、リガンド又は他の抗体ドメインであるか、又はそれらの結合部分であることができる。他の組合せ物は、タンパク質様分子、核酸、脂肪、有機分子及び炭水化物を意味する。

本発明により工学的に作成された分子は、独立分子として、ならびに融合タンパク質又は誘導体として有用であり、最も一般的には変性の前又は後で、より大きな構造の一部分、例えば完全な抗体分子の一部分もしくはこれらの一部分又は断片になるように融合される。従って、本発明により製造されるような免疫グロブリン又は融合タンパク質は、Fc断片、Fab断片、Fv断片、一本鎖抗体、特に免疫グロブリンドメイン及びその他の一本鎖Fv断片、二次特異的、scFv又は多重特異的scFv、二重特異性抗体、一特異性抗体、多重特異性抗体、多価又は多量体を有する。工学的に作成されたタンパク質を使用し、単一特異性、二重特異性、三重特異性である分子、更により多くの特異性を有する分子を製造できる。同時に本発明により、このような分子の予定した用途の要求に応じて、結合価をコントロールし、かつ予備選択することができる。

本発明によれば、モジュラー抗体は場合により１つ以上の結合領域を抗原に作用させる。これには細胞表面ターゲットに特異的に結合する結合部位及びエフェクター機能を媒介する結合部位が含まれる。１つ以上の抗原に対する抗原結合部位は、CDR領域又は他のナチュラルレセプター結合構造により提示されるか、又は可変もしくは定常ドメイン構造のどちらかの抗体ドメインの構造ループ領域に導入されてもよい。結合部位の結合特性を試験するために使用されるような抗原は、天然に存在する分子であるか又は、溶液もしくは懸濁液の形の化学合成された分子であるか又は組換え分子であり、例えば、固相のような粒子の上又は内部に位置するか、又は細胞もしくはウイルス表面上又は内部に存在する。免疫グロブリンの抗原に対する結合は、依然として抗原が分子に付着又は結合していて、かつ構造が自然の状態である場合に決定するのが有利である。これにより、診断又は治療用途の目的に最も適切な変性免疫フロブリンを同定し、かつ得ることができる。

モジュラー抗体又は免疫グロブリンドメインは、本発明により変性してもよい（ここで使用されているような免疫グロブリン及び抗体という用語は、交換可能である）。この変性は、有利には免疫グロブリンドメイン又はその一部分で行われる。これらは末端配列、有利にはＣ末端配列、及び／又はCDR-ループ又は非CDR-ループのどちらかを含むループ領域の一部であり、変性又は突然変異誘発の有利な部位である。特別な実施態様によれば、構造ループ領域には末端配列が含まれ、これが抗原結合に寄与する。幾つかの場合には、定義づけられた変性構造ループ又は構造ループ領域、又はこれらの一部分を結合もしくは組合せの目的で単離された分子として使用するのが好ましい。

本発明によるモジュラー抗体は、少なくとも構造ループ及び／又はCDRループの一部分により、前記細胞表面ターゲットに結合するのが特に有利である。

二者択一的な実施態様では、本発明によるモジュラー抗体は、少なくとも構造ループ及び／又はCDRループの一部分により、前記エフェクターリガンドもしくはこのようなエフェクターリガンドの代替リガンド（タンパク質A）に結合して、これによりエフェクター機能を媒介するのが有利である。

有利な実施態様では、結合剤はその天然の又は変性された結合構造、又は新たに形成された結合部位と結合する。特に同種又は異種のこのような少なくとも２つのエピトープに対して結合しており、この場合に抗原は同種又は異種であってもよい。

結合剤の有利なドメイン構造では、少なくとも１つのループ領域又は末端領域内でモジュラー抗体を変性又はランダム化し、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸を置換、欠失及び／又は挿入するのが有利であり、点突然変異法、又はループ全体を交換するのが有利である、より有利には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個、３０個までのアミノ酸を交換するのが有利である。これにより、変性配列はループは保存領域に含まれることなくアミノ酸を含み、新たに導入されるアミノ酸は天然に生じるが、しかし変性の部位の外部で生じるか、又は天然に生じるアミノ酸の置換物である。

しかし、結合剤のループ領域に挿入されるアミノ酸の最大数は、有利には３０個を上回ることがなく、有利には最大でも２５個、更に有利には２０個のアミノ酸である。アミノ酸の置換と挿入、又はランダム化の目的に有利なアミノ酸の選択は、あらゆる可能なアミノ酸を用いて、又は技術水準で公知の方法ならびに本特許明細書で開示されたような方法により有利にはランダム又はセミランダムに生じる。

変性の部位は、特異的な単一ループ又はループ領域であってよく、特に構造ループもしくは構造ループ領域である。ループ領域は通常は互いに隣接する少なくとも２つの、有利には少なくとも３個又は少なくとも４個のループから成り、かつこれは抗原結合部位又は抗原結合ポケットを形成することにより抗原の結合に寄与する。１つ以上の変性の部位が１０個のアミノ酸の領域内、より有利には２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０〜１００個のアミノ酸の領域内にあるのが有利であり、特に１つの構造領域内にあり、抗原がループ領域に空間的に接近できる表面又はポケットを形成するのが有利である。

これに関連して、有利な変性はCH1、CH2、CH3及びCH4のループ領域内で、特にアミノ酸７〜２１、アミノ酸２５〜３９、アミノ酸４１〜８１、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸８９〜１０３及びアミノ酸１０６〜１１７の範囲内で工学的に作成されるか、又は末端配列、有利には抗体ドメインのＣ末端又はＮ末端から６個のアミノ酸の範囲内で工学的に作成される。

他の有利な実施態様では、アミノ酸９２〜９８から成る構造ループ領域内の変性を、アミノ酸８〜２９から成る構造ループ内の変性と組み合わせる。

先に定義した個々の免疫グロブリンのアミノ酸範囲は、変性されるべきループ領域を有する。有利には、アミノ酸９２〜９８から成る構造ループ領域内での変性を、１つ以上の他の構造ループ内の変性と組み合わせる。

有利な実施態様では、アミノ酸９２〜９８から成る構造ループ領域内の変性を、アミノ酸４１〜４５．２から成る構造ループ内の変性と組み合わせる。

より有利には、アミノ酸９２〜９８、アミノ酸４１〜４５．２及びアミノ酸８〜２０個から成る各構造ループは、少なくとも１つのアミノ酸変性を含む。

他の有利な実施態様では、アミノ酸９２〜９８、アミノ酸４１〜４５．２及びアミノ酸８〜２０から成る各構造ループは、少なくとも１つのアミノ酸変性を含む。

他の有利な実施態様によれば、CH3の位置１５〜１７、２９〜３４、４１〜４５．２、８４〜８５、９２〜１００及び／又は１０８〜１１５の領域内のアミノ酸残基が変性される。

ヒト由来のIgk-CとIgl-Cの有利な変性は、アミノ酸８〜２０、アミノ酸２６〜３６、アミノ酸４３〜７９、アミノ酸８３〜８５、アミノ酸９０〜１０１、アミノ酸１０８〜１１６及びアミノ酸１２２〜１２６の領域内の部位で工学的に作成される。

本発明による治療法として使用される他の有利な免疫グロブリンは、有利にはＨ鎖とＬ鎖の可変ドメイン、又はミニドメインを含むそれらの一部分と、少なくとも１つのループ領域、有利には構造ループ領域と一緒に構成され、かつ少なくとも１つのループ領域は、少なくとも１つの変性ループ領域を形成する少なくとも１つのアミノ酸変性を含むことに特徴付けられ、その際に、前記の少なくとも１つの変性ループ領域は、上記のような関連する結合部位を形成する。

特別な実施態様によれば、本発明により有利に使用される免疫グロブリンは、可変ドメイン内に変性を含むこともでき、これはVH、Vκ、Vλ、VHH及びこれらの組合せから成るグループから選択される。

特に、これらはアミノ酸７〜２２、アミノ酸３９〜５５、アミノ酸６６〜７９、アミノ酸７７〜８９又はアミノ酸８９〜１０４のアミノ酸範囲（このドメインのアミノ酸位置の番号付けはIMTGのものである）において少なくとも１つの変性を有するか、又は末端配列内で抗体ドメインのC末端もしくはN末端から６個のアミノ酸範囲内において少なくとも１つの変性を有する。

特殊な実施態様では、本発明により有利に使用される免疫グロブリンは、ヒト由来のVH又はVκ又はVλのループ領域が、アミノ酸７〜２２、アミノ酸４３〜５１、アミノ酸６７〜７７、アミノ酸７７〜８８個及びアミノ酸８９〜１０４の範囲内に、より有利にはアミノ酸位置１２〜１７、アミノ酸位置４５〜５０、アミノ酸位置６８〜７７、アミノ酸位置７９〜８８及びアミノ酸位置９２〜９９（このドメインのアミノ酸位置の番号付けはIMTGのものである）に少なくとも１つの変性を有することに特徴付けられる。

変性の目的で選択できるようなヒト由来の免疫グロブリンの可変ドメインの構造ループ領域は、有利にはアミノ酸位置８〜２０、アミノ酸位置４４〜５０、アミノ酸位置６７〜７６、アミノ酸位置７８〜８７及びアミノ酸位置８９〜１０１の範囲内に位置するか、又は末端配列、有利には抗体ドメインのC末端又はN末端から６個のアミノ酸の範囲内に位置する。

有利な実施態様によれば、変性の目的で選択できるようなマウス由来の免疫グロブリンの可変ドメインの構造ループ領域は、有利にはアミノ酸６〜２０、アミノ酸４３〜５２、アミノ酸６７〜７９、アミノ酸７９〜８７及びアミノ酸９１〜１００の範囲内に位置するか、又は末端配列、有利には抗体ドメインのC末端又はN末端から６個のアミノ酸の範囲内に位置する。

本発明により治療学的に有利に使用される免疫グロブリンは、ラクダ科由来であることもできる。ラクダの抗体は１つのＨ鎖だけから成り、かつＬ鎖とＨ鎖から成る通常の抗体と同じ抗原親和性を有する。従って、ラクダの抗体は例えばヒトの抗体よりも相当に小さく、この事が密な組織を貫通して抗原に到達することを可能にするが、より大きなタンパク質では不可能である。更に、簡素さ、高い親和性及び特異性ならびに活性部位への到達の可能性及び活性部位との相互作用の比較に関して、ラクダのH鎖抗体は通常の抗体に対して、臨床的に価値のある化合物の設計、生産及び用途において利点を示す。

本発明による他の有利な実施態様によれば、ラクダ科由来のモジュラー抗体もしくは免疫グロブリンの構造ループ領域は、例えば、VHH内のアミノ酸７〜１９、アミノ酸４３〜５５、アミノ酸６８〜７６、アミノ酸８０〜８７及びアミノ酸９１〜１０１の範囲内で、又は末端配列、有利には抗体ドメインのC末端又はN末端から６個のアミノ酸の範囲内が変性されている。

本発明によるモジュラー抗体を製造する有利な方法は、少なくとも１つの１番目のエピトープに特異的に結合するモジュラー抗体の工学的作成に関し、これはそれぞれ構造ループ領域内において少なくとも２カ所の部位又はループでの変性を含み、かつ前記構造ループ領域の、少なくとも１つの２番目のエピトープに対する特異的結合を決定し、そこでは非変性構造ループ領域（非CDR領域）は、前記の少なくとも１つの２番目のエピトープには特異的に結合しない。従って、１番目の抗原に特異的な抗原結合構造は、２番目の抗原に対して他の結合価もしくは特異性を加えることにより改善される。この特異性は同じであってよく、異種のエピトープ又は同種のエピトープのどちらかをターゲットし、結合価を増大させるか、又は二重特異性、オリゴ特異性又は多重特異性分子を得てもよい。

他方で、エフェクター分子又は免疫細胞と相互作用し、有利にはエフェクターリガンドに結合する天然構造を含むモジュラー抗体の使用を可能にするのが有利である。これらの天然構造は、変化しないままであるか又は増大したエフェクター機能にモジュレートされる。例えばFcレセプターへの結合部位はCH2及び／又はCH3ドメイン領域内に位置すべきであることが記載されていて、かつ周知の技法により突然変異誘発されてもよい。

ADCC（抗体依存性細胞媒介細胞障害）は、結合抗体の定常領域を認識するFcレセプターを有する細胞によって抗体被覆された細胞を死滅させる。殆どのADCCは、それらの表面上にFcレセプターFcγRIII又はCD16を有するNK細胞により媒介される。一般的なアッセイは、ラモス細胞のようなターゲット細胞を使用し、新たに単離したエフェクター細胞を添加する前に連続的に希釈した抗体と一緒にインキュベートされる。次にADCCアッセイは、更に数時間インキュベートされ、かつ％細胞毒性が検出される。通常はターゲット：エフェクター比は約１：１６であるか、又は１：１〜１：５０であってもよい。

補体依存性細胞障害（CDC）はキラー細胞のメカニズムであり、その際にターゲット細胞表面に結合した抗体は補体を固定し、その結果、ターゲット細胞膜内に穴を開ける膜攻撃複合体が組み立てられ、引き続き細胞溶解を生じる。一般に使用されるCDCアッセイに続いて、ADCC測定と同じ方法が行われるが、しかしエフェクター細胞の代わりに補体を含有する血清が用いられる。

ADCCとCDCアッセイのどちらかにより測定される細胞毒性活性は、コントロールと比べて細胞溶解のパーセンテージに著しい増大がある場合に本発明によるモジュラー抗体が証明されるものである。ADCC又はCDCに関連する細胞毒性活性は、有利には絶対的パーセンテージの増大として測定され、これは有利には５％よりも高く、より有利には１０％よりも高く、更に有利には２０％よりも高い。

ADCPとも称される抗体依存性細胞食作用（ADCP）は、通常は培養されたヒト細胞の細胞溶解と並んで調査されている。食細胞による食作用は、通常はヒトの単核細胞又は単核細胞に誘導されるマクロファージであり、以下のように抗体により媒介され測定できる。精製された単核細胞はサイトカインと培養され、FcγRsの発現を促進するか、又はマクロファージへの分化を誘発する。次にADCPとADCCアッセイは、ターゲット細胞を用いて実施される。食作用は、フローサイトメトリーにより測定される陽性細胞のパーセンテージとして決定される。陽性のADCP活性は食作用による抗体−抗原複合体の著しい吸収により明らかになる。ADCPに関する細胞毒性活性は、有利には食細胞による抗体−抗原複合体の絶対パーセンテージの吸収として証明され、これは有利には５％よりも高く、より有利には１０％よりも高く、更に有利には２０％よりも高い。

典型的なアッセイでは、PBMC又は単核細胞又は単核細胞に誘導されるマクロファージは、RF2培地（2%FCS補充RPMI 1640）中、９６ウェルプレート中で１００ml／ウェル当たり１×１０⁵個の生存可能細胞の濃度で再懸濁される。適切なターゲット抗原を提示する適切なターゲット細胞、例えばHer2/neu抗原及びSKBR3細胞はPKH2緑色蛍光染料で染色される。引き続き１×１０⁴個のPKH2標識されたターゲット細胞及びHer2特異的（IgG1）抗体（又はモジュラー抗体）又はマウスIgG1アイソトープコントロール（又はモジュラー抗体コントロール）は、種々の濃度（例えば１〜１００μg/ml）でPBMCのウェルに添加され、かつ最終体積２００mlにて３７℃で２４時間インキュベートされる。インキュベーションに続いて、PBMC又は単核細胞又は単核細胞に誘導されるマクロファージ及びターゲット細胞は、EDTA-PBSで回収され、かつ９６ウェルV-型底プレートに移される。このプレートを遠心分離し、かつ上澄液を吸引する。細胞を、RPE-共役抗−CD11b、抗−CD14及びヒトIgGの１００ml混合物で対比染色し、混合し、氷上で６０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、かつ２％ホルムアルデヒド−PBSで固定する。２色フローサイトメトリー分析を例えばFACSCaliburを用いて光学ゲーティング下に実施する。PKH2標識したターゲット細胞（緑色）がFL-1チャンネル中で検出され（発光波長、530nm）かつRPE標識したPBMC又は単核細胞又は単核細胞から誘導されるマクロファージ（赤色）がFL-2チャンネル中で検出された（発光波長、575nm）。残りのターゲット細胞は、PKH²⁺/RPE-二重標識細胞である細胞として定義づけられ、これらはPBMC又は単核細胞又は単核細胞由来のマクロファージによりターゲットの食作用を示すと考えられる。ターゲット細胞の食作用は、以下の方程式により計算される：食作用（％）＝１００×［（二重陽性の％）／（二重陽性の％＋残りの標的の％）］。全ての試験は通常二重反復試験又は三重反復試験で実施され、かつ結果は平均値６SDとして表現される。

アポトーシス活性は、有利には瀕死もしくは死細胞を決定する標準方法を用いて測定される。ネクローシス及びアポトーシスを測定するために、細胞毒性アッセイを用いることができる。これらのアッセイは、プラズマ膜浸透性の増大を測定する放射線的アッセイかつ非放射線的アッセイであることができる。それというのも、瀕死細胞は漏出するようになり、また比色アッセイではミトコンドリアの代謝活性の減少が測定されるからである。ここで、死細胞中のミトコンドリアは染料を代謝できないのに対して、生細胞中のミトコンドリアは代謝できる。

細胞の集団又は個々の細胞においてDNAの断片化のようなアポトーシスの初期の指標を測定することもでき、その際にアポトーシスDNAは種々の長さの片に分解され、膜非対称における置換（ホスファチジルセリンをベース、かつアネキシンＶをベースとするアッセイ）、アポトーシスカスパゼの活性化の測定又はミトコンドリアによるシトクロムＣ及びAlFのサイトプラズマへの放出の測定が行われる。

本発明によるモジュラー抗体の有利な細胞毒性活性は、個々のex vivo細胞溶解アッセイにおいて測定したような細胞崩壊の少なくとも２０％の値になる。

有利には本発明によるモジュラー抗体の細胞毒性活性は、細胞溶解を媒介するか、又は細胞ベースのアッセイ（EC50＜１０^-8Ｍ、有利にはnMの範囲又はそれ以下）において細胞死を媒介する。

本発明によるモジュラー抗体のエフェクター機能は、細胞毒性活性であり、これは例えば、免疫グロブリン構造に共役してもよいトキシンにより提供されるような合成細胞毒性活性とは通常は異なる。トキシンは通常、エフェクター分子かつ生物学的防御機構を活性化しない。このように、本発明によるモジュラー抗体の有利な細胞毒性活性は、生物学的細胞毒性活性であり、これは通常は効果的な細胞崩壊につながる免疫刺激である。

更に細胞毒性活性は、物質が細胞成長を阻害する簡単な細胞阻害効果とは区別され、前記阻害効果は、例えば成長因子のレセプターに結合することにより成長因子機能を遮断するか、又は脈管形成を阻害することにより行われる。細胞毒性は、実質的に活発に攻撃して、このように細胞死又は細胞溶解を導くものとして考えられている。従って、悪性細胞又は感染細胞の数を即座に減少させる高度に効率的な方法として考えられている。細胞毒性化合物と比べて、細胞成長阻害剤は細胞を即座には死滅させずに、細胞成長と増殖を減少させるだけであり、このようなわけで治療目的にはあまり活性ではないと考えられている。

本発明によるモジュラー抗体はどの種類の結合分子又は構造にも特異的に結合でき、特に抗原、タンパク質様分子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、グリカン、炭水化物、脂質、有機分子、特に小さな有機分子、無機分子又はこれらの組合せ物又は融合体（PEG、プロドラッグ又はドラッグを含む）に結合できる。本発明による有利なモジュラー抗体は、少なくとも２個のループ又はループ領域を有していてもよく、これにより各ループ又はループ領域は種々の分子又はエピトープに結合することができる。

有利にはターゲット抗原は、細胞表面抗原から選択され、これはレセプター、特にerbBレセプターチロシンキナーゼ（例えば、EGFR、HER2、HER3及びHER4、特にこのようなレセプターの細胞外ドメインのエピトープ、例えば、4D5エピトープ）、TNFレセプタースーパーファミリーの分子、例えば、Apo-１レセプター、TNFR1、TNFR2、神経発育因子レセプター（NGFR）、CD40、T細胞表面分子、T細胞レセプター、T細胞抗原OX40、TACIレセプター、BCMA、Apo-3、DR4、DR5、DR6、デコイレセプター、例えば、DcR1、DcR2、CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1を含むが、但しこれらの分子に限定されることはなく、B−細胞表面抗原、例えば、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、充実性腫瘍又は血液癌細胞の抗原又はマーカー、リンパ腫又は白血病の細胞、血小板を含む他の血液細胞を含むが、しかしこれらの分子に限定されることはない。

更に有利な実施態様によれば、ターゲット抗原は、上皮細胞、充実性腫瘍の細胞、感染細胞、血液細胞、抗原提示細胞及び単核細胞のような細胞により示される抗原のものから選択される。細胞によりターゲット抗原が発現もしくは過剰発現されるものは、有利にはターゲッティングされ、これは腫瘍関連抗原、特にEpCAM、腫瘍関連グリコタンパク質−72（TAG-72）、腫瘍関連抗原CA125、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、腫瘍関連抗原発現性ルイスＹ関連炭水化物、癌胎児抗原（CEA）、CEACAM5、HMFG PEM、ムチンMUC1、MUC18及びサイトケラチン腫瘍関連抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、アレルゲン、アレルギー関連分子IgE、cKIT及びFc−ε−レセプターI、IRp60、IL-5レセプター、CCR3、赤血球細胞レセプター（CR1）、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ラット血清アルブミン、Fcレセプター、新生児FcレセプターFcRn、Fc−γ−レセプター、Fc−γRI、Fc−γ−RII、Fc−γRIII、Fc−α−レセプター、Fc−ε−レセプター、フルオレセリン、リゾチーム、トル様レセプター９、エリスロポイエチン、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD11、CD11a、CD14、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD56、CD64、CD80、CD147、CD3、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、LIF、OSM、TNF-α、TNFβ−2 , TNFα , TNFαβ、TNF-R1、TNF-RII 、FasL 、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL、RANKL 、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT 、VEG1、OX40L、TRAIL レセプター１、A1アデノシンレセプター、リンホトキシンβレセプター、TACI、BAFF-R 、EPO ; LFA-3、ICAM-1、ICAM-3 、インテグリンβ１、インテグリンβ２、インテグリンα４／β７、インテグリンα２、インテグリンα３、インテグリンα４、インテグリンαｖ、αＶβ３インテグリン、FGFR−３、ケラチノサイト成長因子、GM-CSF、M-CSF、RANKL 、VLA-1、VLA-4 、L-セレクチン、抗ld、E-セレクチン、HLA、HLA-DR、CTLA-4、Ｔ細胞レセプター、B7-1、B7-2、VNRインテグリン、TGFβ1、TGFβ2、エオタキシン１、BLyS（B-リンパ球刺激物質）、補体C5、lgE 、lgA、lgD、lgM、lgG、因子Vll、CBL、NCA90 、EGFR(ErbB-1) 、Her2/neu(ErbB-2) 、Her3(ErbB-3) 、Her4(ErbB4) 、組織因子、VEGF 、VEGFR 、エンドセリンレセプター、VLA-4 、炭水化物、例えば、血液型抗原及び関連炭水化物、Galili−グリコシル化、ガストリン、ガストリンレセプター、腫瘍関連炭水化物、ハプテンNP-cap又はNIP-cap、T細胞レセプターα／β、E−セレクチン、P−糖タンパク質、MRP3、MRP5、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼpi（多剤耐性タンパク質）、α−顆粒膜タンパク質（GMP）140、ジゴキシン、胎盤アルカリホスファターゼ（PLAP）及び睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、トランスフェリンレセプター、ヘパラナーゼI、ヒト心臓ミオシン、糖タンパク質IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）gH外皮糖タンパク質、HIV gp120、HCMV、RSウイルスRSVF、RSVF Fgp、VNRインテグリン、HepBgp120、CMV、gpIIbIIIa、HIV IIIB gp120V3ループ、RSウイルス（RSV Fgp）、単純疱疹ウイルス（HSV）gD糖タンパク質、HSV gB糖タンパク質、HCMV gB外皮糖タンパク質、ウェルチ菌毒及びこれらの断片から成るグループから選択される。

本発明による有利なモジュラー抗体は、前記ターゲット抗原に対して高い親和性で、特に高い付着速度及び／又は低い解離速度で、又は高い結合力で結合する。通常は、バインダーはkd＜１０^-9Mを有する高い親和性のバインダーであると考えられている。１０^-6M未満〜１０^-9Mまでのkdを有する中程度の親和性バイダーも本発明により提供され、有利には親和性成熟プロセスと共役して提供される。

親和性成熟は、抗原に対して増大した親和性を有する抗体が製造されるプロセスである。アミノ酸突然変異誘発を含む抗体の構造変化を伴って、又は免疫グロブリン遺伝子断片における体細胞突然変異の結果、抗原に対する結合部位の変異体が形成され、かつより大きい親和性が選択される。親和性成熟モジュラー抗体は、親抗体よりも数log倍大きい親和性を示してもよい。単一の親抗体を親和性成熟に課してもよい。ターゲット抗原に対して類似した結合親和性を有するモジュラー抗体の二者択一的なプールは、変化して親和性が成熟した単一抗体もしくはこのような抗体の親和性が成熟したプールを得る親構造であると考えてもよい。

本発明によるモジュラー抗体の有利な親和性成熟変異体は、結合の親和性において少なくとも１０倍の増大を示し、有利には１００倍の増大を示す。親和性成熟は、親分子の個々のライブラリーを用いる選択操作の経過において使用でき、これは中程度の結合親和性を有するモジュラー抗体を用いて、結合親和性kd＜１０^-8Ｍの特異的ターゲット結合特性及び／又はIC50＜１０^-8Ｍのポテンシーを有する本発明のモジュラー抗体を得ることができる。二者択一的に、結合のポテンシー又は親和性は、本発明によるモジュラー抗体の親和性成熟により更に増大させ、１０^-9Ｍ未満、有利には１０^-10Ｍ未満又は１０^-11Ｍ未満、最も有利にはピコモルの範囲内に相当する高い値を得てもよい。

EC50又は５０％飽和濃度とも称されるIC50は、モジュラー抗体の結合ポテンシーの尺度である。これは、平衡で又は飽和下に考え得る最大の結合の５０％を作るバインダーのモル濃度である。結合のポテンシーは、通常はそのIC50により定義される（これによりEC50と解釈される）。これは、最大結合の半分の飽和を達成するのに必要なバインダーの濃度を測定することにより所定の結合剤に関して計算できる。IC50とEC50値の説明は、特に競合アッセイにおいてではなく、飽和結合アッセイにおいて決定する場合に抗体又は抗体変異体のポテンシーを、類似した有効度のものと比較するために有効である。この場合に、これがin vivoで半分の最大（50%）効果を得るためのプラズマ濃度を決定する濃度であると考えられる。IC50又はEC50が低いほど、モジュラー抗体のポテンシーは大きくなり、かつエフェクター機能又は細胞毒性活性のように、最大生物応答を阻害するために必要である抗体の濃度は低くなる。抗体の濃度が低いことは、副反応との関連が殆どない。

通常、抗体の結合親和性は抗体の濃度に関して特徴付けられ、その濃度では、抗原結合部位の半分が占められ、これは解離定数（Kd又はK_D）として公知である。

通常は、飽和結合アッセイで決定する場合には、抗体の親和性はIC50ともよく相関する。その結合部位に対するアンタゴニストの親和性（Ki）は、レセプターと結合するその能力として理解され、これは結合の持続期間及び個々のアゴニスト活性を決定する。親和性成熟による親和性を増大させる処置は、通常は結合のポテンシーも増大させ、Kd値と同じ範囲内でそれぞれIC50値の減少を導く。

IC50とKd値は、従来技術で周知の飽和結合アッセイを用いて測定してもよい。競合アッセイとは異なり、飽和結合アッセイは競合相手の濃度とは独立した値（比較可能な値）を提供し、これはin vivoでの結合親和性に表示的であってよい。

本発明によるモジュラー抗体は、有利には標識又はリポーター分子に共役し、これらは有機分子、酵素標識、放射線標識、着色標識、蛍光標識、色素標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド状の金及びこれらの混合物から成るグループから選択される。標識又はリポーターに共役する変性免疫グロブリンは、例えばアッセイ系又は診断法に使用してもよい。

本発明によるモジュラー抗体は、例えば、結合アッセイ（例えば、ELISA）及び結合試験において前記共役物の簡単な検出を可能にする他の分子に共役してもよい。

有利な実施態様では、抗体変異体は１つ以上の細胞ベースのアッセイもしくはin vivoアッセイを用いてスクリーニングされる。このようなアッセイでは、精製もしくは非精製変性免疫グロブリンが、典型的には細胞が個々の免疫グロブリン又はライブラリーに属する免疫グロブリンのプールに曝されるように外的に添加される。これらのアッセイは、常にではないが通常は、免疫グロブリンの機能に基づく。すなわち、そのターゲットに結合し、かつ幾つかの生物化学的現象、例えば、エフェクター機能、リガンド／レセプター結合阻害、アポトーシス等を媒介する抗体の能力による。このようなアッセイは、しばしば抗体に対する細胞応答、例えば、細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、又は天然遺伝子又はリポーター遺伝子の細胞発現のような転写活性のモニタリングを含む。例えば、このようなアッセイはADCC、ADCP、CDC又はアポトーシス活性を導き出す抗体変異体の能力の尺度であってもよい。幾つかのアッセイに関して、ターゲット細胞の他に更なる細胞又は成分、例えば、血清補体又はエフェクター細胞、例えば、末梢血単核細胞（PBMCs）、NK細胞、マクロファージ及びそのようなものを添加する必要があるかもしれない。このような更なる細胞は、任意の生物、有利にはヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルから由来するものであってもよい。モジュラー抗体は、ターゲットを発現する特定の細胞系のアポトーシスを引き起こし得るか又は、これらはアッセイに加えられた免疫細胞によってターゲット細胞での攻撃を媒介してもよい。細胞死又は生存率のモニタリング方法は、従来技術から工程であり、かつ染料、免疫化学的試薬、細胞化学的試薬及び放射線試薬の使用を含む。例えば、カスパーゼ染色アッセイは、アポトーシスの測定を可能にし、かつ放射線物質又はアラマーブルーのような蛍光染料の吸収又は放出は、モニタリングすべき細胞成長又は活性化を可能にする。

有利な実施態様では、DELFIART EuTDAベースの細胞毒性アッセイ（Perkin Elmer,MA）を使用できる。二者択一的に、死亡又は損傷したターゲット細胞は、１つ以上の天然の細胞内成分、例えば乳酸デヒドロゲナーゼの放出を測定することによりモニタリングしてもよい。

転写活性は、細胞ベースのアッセイにおいて機能をアッセイする方法として役立つ。この場合に、応答は天然遺伝子又はアップレギュレートされた免疫グロブリンの放出をアッセイするか、又は二者択一的にレセプター構築物を介して読み出しを行ってもよい。また細胞ベースのアッセイは、モジュラー抗体の存在に対する応答として細胞の形態変化の処置を含んでいてもよい。このようなアッセイの細胞タイプは、原核生物又は真核生物、及び技術水準で公知の様々な細胞系を用いることができる。二者択一的に、変異体をコード化する核酸で形質転換するか、もしくはトランスフェクトされた細胞を用いて細胞ベースのスクリーンが実施される。すなわち、抗体変異体は細胞に外的に加えられない。例えば、１実施態様では、細胞ベースのスクリーンは細胞表面提示を利用する。細胞表面上で変性免疫グロブリンの提示を可能にする融合相手を用いることもできる（Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12: 395-399）。

有利な実施態様では、モジュラー抗体の免疫抗原性は、１つ以上の細胞ベースのアッセイを用いて測定してもよい。有利な１実施態様では、ex vivo T細胞の活性化アッセイを使用して、免疫抗原性が試験的に定量化される。この方法では、抗原提示細胞及び適合ドナーからのナイーブＴ細胞は、関心のあるペプチド又は全体の抗体と１回以上掛け合わされる。このように、Ｔ細胞活性は多くの方法、例えば、サイトカインの生産をモニタリングするか、又はトリチウムチミジンの吸収を測定することで検出できる。最も有利な実施態様では、インテーフェロンγ酸性は、エリスポットアッセイを用いてモニタリングされる。

本発明によるモジュラー抗体の生物学的特性は、細胞、組織、全体の生物実験においてex vivoで特徴付けられる。従来技術で公知のように、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ及びサルを含む（しかしこれらに限定されない）動物において、薬物はin vivoで試験されて、疾患又は疾患モデルに関する治療に対する薬物効率が測定されるか、又は薬物の薬動動態、薬力薬理学、毒性及びその他の特性が測定される。動物は、疾患モデルに関するものであってもよい。治療薬は、しばしばヌードマウス、SCIDマウス、異種移植マウス及びトランスジェニックマウス（ノックイン及びノックアウトを含む）で試験されるが、これらに限定されることはない。このような試験は、適切な半減期、エフェクター機能、アポトーシス活性、細胞毒性もしくは細胞溶解活性を有し、治療学的に使用すべき抗体の有効性を決定する意味のあるデータを提供し得る。どの生物も、有利には哺乳類を試験に使用してもよい。例えば、霊長類、サルは、ヒトとの遺伝的類似性があるので、治療モデルとして適切であり、ひいては本発明によるモデル抗体の効率、毒性、薬動動態、薬力薬理学、半減期又はその他の特性を試験するために使用してもよい。ヒトにおける物質試験は、薬剤としての承認のために最終的に必要であり、当然ながらこれらの試験は検討される。従って、本発明のモジュラー抗体をヒトにおいて試験し、それらの治療有効性、毒性、免疫抗原性、薬動力学、及び／又はその他の臨床特性を決定してもよい。特に、単一細胞又は細胞複合体と、少なくとも２個の結合モチーフを介して、有利には、少なくとも３つの構造がターゲット細胞に架橋して結合している本発明によるモジュラー抗体は、細胞ターゲッティング又は架橋の際に、エフェクター活性又はプレアポトーシスもしくはアポトーシス活性が有効であると考えられる。多価結合は、架橋とも称される結合相手の比較的に大きな会合を提供し、これがアポトーシスと細胞死には前提条件である。

本発明のモジュラー抗体は、幅広い抗体製品で使用されているのが見出される。１実施態様では、本発明のモジュラー抗体は、治療又は予防のため、例えば、能動的免疫治療又は受動的免疫治療として、また調製の目的で、工業的用途又は分析的用途のため、また診断薬、工業用化合物又は研究用試薬として、有利には治療薬として使用される。モジュラー抗体は、モノクロナール又はポリクロナールである抗体組成物において使用してもよい。有利な実施態様では、本発明のモジュラー抗体はターゲット抗原を有するターゲット細胞、例えば癌細胞を捕捉又は死滅させるために使用される。二者択一的な実施態様では、本発明のモジュラー抗体は、例えば、サイトカイン又はサイトカインレセプターを拮抗作用することによりターゲット抗原の遮断、中和又は作動に使用される。

二者択一的に有利な実施態様では、本発明のモジュラー抗体は、成長因子又は成長因子レセプターを遮断、拮抗又は作動するために使用され、これによりターゲット抗原を有する又はこれを必要なターゲット細胞の死滅を媒介する。

二者択一的に有利な実施態様では、本発明のモジュラー抗体は酵素及び酵素の基質を遮断、拮抗又は作動するために使用される。

有利な実施態様では、モジュラー抗体は特定疾患を治療するために患者に投与される。本発明の目的で"患者"とは、ヒト及び他の動物の両方、有利には哺乳類及び最も有利にはヒトを含む。本明細書中の"特定疾患"とは、本発明の変性免疫グロブリンを有する製剤学的組成物の投与により改善され得る疾患を意味する。

１実施態様では、本発明によるモジュラー抗体は患者に投与される唯一の治療学的活性剤である。二者択一的に、本発明によるモジュラー抗体は１つ以上の治療剤と組み合わされて投与され、前記治療剤には、細胞毒性剤、化学療法薬、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管形成剤、心臓保護剤又はその他の治療薬が含まれるが、これらに限定されることはない。モジュラー抗体は１つ以上の治療レジュメに付随して投与されてもよい。例えば、本発明のモジュラー抗体は、化学療法、放射線療法又は化学療法と放射線療法の両方を組み合わせて投与してもよい。１実施態様では、本発明のモジュラー抗体は、本発明のモジュラー抗体を含有もしくは含有しなくてもよい１つ以上の抗体と組み合わせて投与してもよい。本発明のその他の実施態様では、本発明のモジュラー抗体及び１つ以上のその他の抗癌治療を用いて、ex vivoで癌細胞を治療してもよい。このようなex vivo治療は、骨髄移植及び特に自己骨髄移植において有用であることが検討されている。当然ながら本発明の抗体を手術のような他の治療法と組み合わせて用いることもできる。

様々な他の治療薬は、本発明のモジュラー抗体と一緒に投与するために使用されている。１実施態様では、モジュラー抗体は、血管の発達を或る程度遮断又は妨げる抗血管剤と一緒に投与される。抗血管形成因子は、例えば、小さな分子又はタンパク質、例えば抗体、Fc融合分子又はサイトカインであってもよく、これらは血管線維症の促進にかかわる成長因子又は成長因子レセプターに結合する。有利な抗血管因子は、血管内皮成長因子（VEGF）に結合する抗体である。代替となる実施態様では、モジュラー抗体は、適応免疫応答を誘発もしくは増加させる治療剤、例えば、CTLA-4をターゲットとする抗体と一緒に投与される。二者択一的な実施態様では、変性免疫グロブリンは、或る程度チロシンキナーゼのチロシンキナーゼを阻害する分子であるチロシンキナーゼ阻害剤と一緒に投与される。二者択一的な実施態様では、本発明のモジュラー抗体はサイトカインと一緒に投与される。本明細書内で使用されるような"サイトカイン"とは、１つの細胞集団により放出されるタンパク質に関する総称を意味し、これは他の細胞においてケモカインを含む細胞内媒介物として作用する。

本発明のモジュラー抗体及び１つ以上の治療活性剤が調製される製剤学的組成物が検討される。

本発明のモジュラー抗体の適切な調製物は、所望の程度の純度を有する前記免疫グロブリンを、任意の製剤学的に認容性の担体、付形剤又は安定剤と混合し、凍結乾燥された調製物又は水溶液の形で調製される。in vivo投与で使用すべき調製物は、有利には滅菌されている。これは滅菌濾過膜による濾過又は他の方法により簡単に実施される。本明細書で開示されているモジュラー抗体及び他の治療活性剤も、免疫リポソームとして及び／又はマイクロカプセル内に封入された形で調製してもよい。

本発明のモジュラー抗体を有する製剤学的組成物の投与は、有利には滅菌水溶液の形で、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、鼻腔内、経皮吸収、粘膜、局所的（例えば、ゲル、軟膏剤、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、Aradigm社により市販されているAERx^TM吸入技術、又はInhance^TM肺デリバリー系、吸入治療により市販）、経膣、非経口、直腸、又は眼球内を含む様々な方法で行うことができるが、これらに限定されることはない。

本発明による有利な方法は、突然変異誘発法により変性され、新たな結合部位を得るモジュラー抗体に関する。有利な突然変異誘発法はランダム化法に関し、その際に、ペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列は少なくとも１つの位置で突然変異され、それによりランダム化された配列が得られ、これが抗原結合を媒介する。例えば、特異的抗体配列はランダムに変性されて免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン又はこれらの一部をコードする核酸分子が得られる。前記免疫グロブリンは、少なくとも１つのヌクレオチド反復単位を、有利には配列５’−NNS−３’、５’−NNN−３’、５’−NNB−３’又は５’−NNK−３’を有する構造ループコーディング領域内又は末端領域内に有する。幾つかの実施態様では、変性核酸は、TMT、WMT、BMT、RMC、RMG、MRT、SRC、KMT、RST、YMT、MKC、RSA、RRC、NNK、NNN、NNS又はこれらの組合せ物から成るグループから選択されるヌクレオチドコドンを有する（コーディングはIUPACによる）。

核酸分子の変性は、合成オリゴヌクレオチドを、核酸のより大きなセグメントに挿入することにより、又は完全な核酸分子のデノボ合成により行ってもよい。アミノ酸のサブセットをコード化すべき場合には、核酸の合成は、ナンセンス配列の組合せの数を減らすトリヌクレオチド構成単位を用いて行ってもよい（例えば、Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004)32: e158; Virnekas et al.Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607）。

本発明の他の重要な態様は、各有効結合ドメインが、これをコード化する特殊なDNA又はRNA分子と物理的に会合することであり、かつ更に融合タンパク質は遺伝子パッケージの表面でオリゴマー化されて天然のオリゴマー構造及び機能的構造内で結合ポリペプチドを提示する。一旦結合ドメインの同定が成功すると、発現、組換え又は更なる工学的作成を目的とする遺伝子を容易に得ることができる。この会合が生じる形は、結合ドメイン−コード化遺伝子を複製及び発現し、かつこの結合ドメインをその外側に輸送するウイルス、細胞又は胞子のような"複製可能な遺伝子パッケージ"である。他の形は翻訳タンパク質を有するコーディングRNAに結合するリボソームのようなin-vitroで複製可能な遺伝子パッケージである。リボソーム内では、ポリメラーゼを用いて遺伝子材料が酵素増幅により複製される。

細胞又はウイルス又はターゲット分子を認識する結合剤を有する核酸は単離され、かつ必要な場合には増幅される。遺伝子パッケージは有利にはM13ファージであり、かつタンパク質はM13遺伝子IIIタンパク質の外表面の運搬シグナルを含む。

融合タンパク質用の有利な発現系は、ノンサプレッサー宿主細胞であり、これはアンバー終止コドンのような終止コドンに対して敏感であり、よってこの後に翻訳が停止する。このような終止コドンが不在の場合には、ノンサプッレサー宿主細胞、有利には大腸菌を使用するのが有利である。このような終止コドンが存在する場合には、サプッレサー宿主細胞が使用される。

有利には、本発明の方法では遺伝子パッケージのベクター又はプラスミドは、転写調節エレメントの厳重なコントロール下かつ培養条件下に、粒子表面上に２個未満のコピーの融合タンパク質を表示するベクター又はファージミド粒子の量又は数が、約２０％未満であるように調節される。より有利には、２個未満のコピーの融合タンパク質を表示するベクター又はファージミドの数は、１個以上のコピーの融合タンパク質を表示する粒子の数の１０％未満である。最も有利には、この量は１％未満である。

本発明により使用される発現ベクターは、結合ポリペプチドを発現することができ、かつ以下のように製造してもよい：初めに、種々の結合配列をコードする複数のポリヌクレオチドを導入することにより、結合ポリペプチド遺伝子ライブラリーを合成する。複数のポリヌクレオチドは、増殖して前記結合ポリペプチドの融合タンパク質を発現できるベクター中に、オペレート可能な組合せの形で結合するのに適切な量で合成される。二者択一的に、複数のオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応により増幅されて発現に十分な材料を得ることもできる。しかし、これは結合ポリペプチドが大きなポリヌクレオチド配列、例えば２００塩基対以上又は時には３００塩基対以上の配列のものによってコードされる場合にだけ有利である。このように、多様な合成ライブラリーが有利に形成され、前記の多様なライブラリーから、結合ポリペプチドを製造できる少なくとも１つの発現ベクターを選択する準備がされ、その際に、該結合ポリペプチドは、所望する予備選択された機能及び結合特性、例えば、特異性のようなものを有する。

ランダムに変性された核酸分子は、先に同定した反復単位を含むものであってもよく、これは、天然に存在する全ての公知のアミノ酸又はこれらのサブセットをコードする。特異的なアミノ酸のサブセットが変性の目的で使用される変性配列を含有するライブラリーは、"フォーカスト（focused）"ライブラリーと称される。このようなライブラリーのメンバーは、変性部位で、このようなサブセットのアミノ酸の増大した可能性を有し、これは通常よりも少なくとも２倍、有利には少なくとも３倍、より有利には少なくとも４倍高い。このようなライブラリーは、制限された又はより少ない数のライブラリーメンバーも有するので、実際のライブラリーメンバーの数は、理論的ライブラリーメンバーの数に達する。ある場合には、フォーカストライブラリーのライブラリーメンバーの数は、理論的数の１０³倍以上、有利には１０²倍以上、最も有利には１０倍以上である。

本発明による通常のライブラリーは、少なくとも１０個の融合タンパク質又は有効な結合剤又はスカフォールドタンパク質の変異体を有し、有利には少なくとも１００個、より有利には少なくとも１０００、更に有利には少なくとも１０⁴個、更に有利には少なくとも１０⁵個、更に有利には少なくとも１０⁶個、更に有利には少なくとも１０⁷個、更に有利には少なくとも１０⁸個、更に有利には少なくとも１０⁹個、更に有利には少なくとも１０¹⁰個、更に有利には少なくとも１０¹¹個から１０¹²個までを有し、in vitro表示法の場合には、例えばリボソーム表示の場合には、より多くの数でも実施可能である。

ランダム化ライブラリーをコードする遺伝子を製造する様々な代替物が可能である。完全な合成アプローチによりDNAを製造することができ、その際に配列は重複断片に分けられ、これは引き続き合成オリゴヌクレオチドとして調製される。これらのオリゴヌクレオチドは混合され、かつ初めに約１００℃に加熱することにより互いにアニーリングし、次に周囲温度までゆっくり冷却される。このアニーリング工程の後に、合成により組み立てられた遺伝子は直接にクローニングされるか、又はクローニングの前にPCRにより増幅することもできる。

二者択一的に、ライブラリーの挿入を発生させるために部位特異的突然変異の他の方法を用いることもできる。この例は、Kunkel法（Kunkel TA、表現型選択なしの迅速かつ効率的な部位特異的突然変異）又はDpnl法（Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W, Cline J, Mathur E, Bauer JC. ポリメラーゼ連鎖反応による二本鎖DNAの部位特異的突然変異、Gene. 1994 Dec 30; 151(1-2): 119-23頁）である。

様々な目的で、ライブラリーインサートをコードする配列に、サイレント突然変異を導入することもできる。例えば、制限部位を導入して配列の一部分のクローニング又はモジュラー交換を促進することができる。サイレント突然変異を導入する他の例は、ライブラリーを"マークする"能力である。すなわち、これは選択した位置で特異的コドンを与えることを意味し、これら（又はこれらから誘導される選択クローン）を、例えば後続の工程中で認識することを可能にし、その際に、例えば種々の特徴を有する種々のライブラリーを共に混合し、かつパンニング法において混合物として使用できる。

本発明は、ターゲットに対して結合するモジュラー抗体ドメインのオリゴマーを製造する方法を提供し、該方法は次の工程：
− 上記のように本発明により製造されたモジュラー抗体ドメインのオリゴマーのライブラリーを用意し、
− スカフォールドリガンドの存在で、前記ライブラリーと前記ターゲットを接触させ、かつ
− 機能的オリゴマーの調製物を製造する
を有する。

スカフォールドリガンドは、エフェクター分子、FcRn、タンパク質A、タンパク質G、タンパク質L及びCDRターゲットから成るグループから選択することができる。一例として、エフェクター分子は、CD64、CD32、CD16、Fcレセプターから成るグループから選択できる。

オリゴマーは、VH/VL、CH1/CL、CH2/CH2、CH3/CH3、Fc及びFab、又はこれらの一本鎖のグループから選択されるダイマーであることができる。

本発明による方法は、モジュラー抗体ドメイン又はこれらの変異体を表現する少なくとも１０²個の独立したクローンを含有するライブラリーを提供できる。本発明によれば、予備選択された独立したクローンのプールを提供することもでき、これは例えば親和性成熟されていて、該プールは有利には少なくとも１０個、更に有利には少なくとも１００個、更に有利には少なくとも１０００個、更に有利には少なくとも１００００個、更に有利には少なくとも１０００００個の独立したクローンを有する。予備選択されたプールを含有するライブラリーは、本発明による高い親和性のモジュラー抗体を選択するために有利な材料である。

本発明により使用されるようなライブラリーは、有利には１０²個のライブラリーメンバー、更に有利には少なくとも１０³個、更に有利には少なくとも１０⁴個、更に有利には少なくとも１０⁵個、更に有利には少なくとも１０⁶個、更に有利には少なくとも１０⁷個、更に有利には少なくとも１０⁸個、更に有利には少なくとも１０⁹個、更に有利には少なくとも１０¹⁰個、更に有利には少なくとも１０¹¹個から１０¹²個までのライブラリーメンバー、好ましくは親分子から誘導されるものを有し、これはスカフォールドとして少なくとも１つの特異的機能又は結合部分を含有する機能的モジュラー抗体である。

通常、本発明によるライブラリーは、更にモジュラー抗体の変異体を含有し、この場合、これは突然変異誘発法又はランダム法により製造される。これらの変異体は、不活性又は非官能性抗体を含む。従って、機能的な効果を決定するために、適切なアッセイを用いてこのようなライブラリーをスクリーニングするのが有利である。本発明による有利なライブラリーは、モジュラー抗体の少なくとも１０²個の変異体、更に有利には少なくとも１０³個、更に有利には少なくとも１０⁴個、更に有利には少なくとも１０⁵個、更に有利には少なくとも１０⁶個、更に有利には少なくとも１０⁷個、更に有利には少なくとも１０⁸個、更に有利には少なくとも１０⁹個、更に有利には少なくとも１０¹⁰個、更に有利には少なくとも１０¹¹個から１０¹²個までの変異体又はそれ以上の変異体を有し、これにより最も適切なバインダーを選択するためにより高い多様性の抗体のレパートリーが提供される。このような合成ライブラリーは、本明細書で開示されたような突然変異誘発法を用いて作成してもよい。

有利には、該ライブラリーは酵母ライブラリーであり、かつ酵母宿主細胞は、細胞表面上で生物活性を有するオリゴマーを表示する。酵母宿主細胞は、有利にはサッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、Schizisaccharomyces属、クルイベロミセス属、ヤロウィア属及びカンジダ属から選択される。宿主細胞がサッカロミセス・セレビジエであるのが最も有利である。

本発明は、モジュラー抗体ドメインの機能的ダイマー又はこれらの変異体の少なくとも１０²個の独立したクローンを有する更に高品質のライブラリー、又は最適化された又は予備選択されたクローン、例えば親和性成熟されたクローンのプールを提供する。前記プールは、ターゲット及びスカフォールドリガンドに結合している少なくとも１０個の独立したクローンを含有する。ターゲットは、親分子に結合するリガンドであることができ、その際に、アミノ酸の多様化が行われる。親分子は機能的オリゴマー、特に機能的Fc又は機能的Fab、又はそれらの一部分であることができる。

ライブラリーは、ターゲット及びスカフォールドリガンドに結合しているモジュラー抗体ドメインの機能的ダイマーを含有でき、かつ機能的ダイマーの少なくとも２０％、有利には少なくとも３０％、より有利には少なくとも４０％は、CD64に結合している。これは特に、FcスカフォールドのようにCH2ドメインを含有するモジュラー抗体を用いる場合に有利である。

二者択一的に、ライブラリーは、ターゲット及びスカフォールドリガンドに結合しているモジュラー抗体ドメインの機能的ダイマーを含有でき、かつ機能的ダイマーの少なくとも２０％、有利には少なくとも３０％、より有利には少なくとも４０％は、タンパク質Aに結合している。これは特に、FcスカフォールドのようにCH2ドメインとCH3ドメインを含有するモジュラー抗体を用いる場合に有利である。

二者択一的に、ライブラリーは、ターゲット及びスカフォールドリガンドに結合しているモジュラー抗体ドメインの機能的ダイマーを含有でき、かつ機能的ダイマーの少なくとも２０％、有利には少なくとも３０％、より有利には少なくとも４０％は、同じCDRターゲットに結合している。これは特に、単一CDRターゲットに特異性を有するFcスカフォールドのように可変領域を含有するモジュラー抗体を用いる場合に有利である。

技術水準で周知のように、特定の結合特性及び親和性を有するタンパク質の同定と単離に使用できる様々な表示及び選択法があり、これは例えば、細胞及び非細胞性のような表示技法、特に移動性を持たせた表示系を含む。細胞系の中でも、ファージ表示、ウイルス表示、酵母又は他の真核細胞表示、例えば、哺乳類又は昆虫細胞表示を使用してもよい。移動性を持たせた系は、溶解した形の表示系、例えば、in vitro表示系に関し、これらの中でもリボソーム表示、mRNA表示又は核酸表示に関する。

抗体変異体を製造かつスクリーニングする方法は技術水準で周知である。抗体分子生物学、発現、精製及びスクリーニングに一般的な方法は、例えば、Duebel & Kontermann編集、Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; 及びHayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5: 683-689; Maynard & Gerorgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76に記載されている。

本発明によるライブラリーは、特異的フォーマットを少なくとも５０％、有利には少なくとも６０％、更に有利には少なくとも７０％、更に有利には少なくとも８０％、更に有利には少なくとも９０％含有するか、又は主に特異的抗体フォーマットから成る専用のライブラリーとして設計してもよい。本発明による有利なライブラリーが、VHライブラリー、VHHライブラリー、Vκライブラリー、Vλライブラリー、Fabライブラリー、CH1/CLライブラリー、Fcライブラリー及びCH3ライブラリーから成るグループから選択されるような特異的抗体フォーマットが有利である。１つ以上の抗体ドメインを含有する複合分子の含有物に特徴付けられるライブラリーは、T−細胞レセプターを含有し、T−細胞レセプターライブラリーを形成するものである。他の有利なライブラリーは、エピトープライブラリーであり、その際に、融合タンパク質は様々なエピトープを有する分子を有し、類似しているが異なる結合機能を有する競合分子の選択を可能にする。例としてはTNFαライブラリーがあり、その際にTNF−α融合タンパク質のトリマーが１つの遺伝子パッケージにより表示される。

以下の実施例を参照にして上記の説明がより完全に理解されることになる。しかし、このような例は単に本発明の１つ以上の実施態様を実施する方法の代表的なものにすぎず、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。

実施例
例１：ノンフォーカストFcabライブラリー（Fcab01）の構築とファージ表面表示
IgG1 Fc断片の結晶構造（Bookhaven Databaseに1OQO.pdb入力と記載されている）を使用してFcabライブラリーの設計に役立てた。

Fcabライブラリーの構築するためのベースとして使用した配列は、配列番号１（図３）に挙げられている。この配列内では、１番目のアミノ酸はヒトIgG1のGlu216に相応する［EU番号付け；IMGTベースによる（http://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html;lookup 2007 06 25)］。これはヒトIgG1ヒンジ領域の１番目の残基であり、ヒトIgG1のＨ鎖定常ヒンジ領域の（E）PKSCDKTHTCPPCPとして挙げてある。配列番号１（図３）の最後から２番目の残基はヒトIgG1のGly446に相当する（EU番号付け;IMGT：ヒトIgG1のCH3ドメインの残基番号129）。

1oqo.pdbの構造を詳細に分析し、かつβストランドに結合するループを形成する残基を視覚的に検査した後に、残基144、145及び146をランダム化することにした。これらは、配列番号１（図３）のβストランドE-Fと結合するループの一部分である。熟成した残基の他に、５個の残基を配列番号１（図３）の残基番号198に挿入した。配列番号２（図４）には、ライブラリーFcab01のライブラリーインサートの配列が挙げられている。ここで、ランダム化された残基の位置ならびに５個の挿入残基は文字Ｘで表示されている。

工業的に作成した遺伝子は、一連のPCR反応により変質プライマーを用いて製造し、それに続いて得られたPCR産物をライゲーションした。ライゲーションを促進するために、配列番号１（図３）をコードするヌクレオチド配列の幾つかのコドンを変性し、アミノ酸配列を変えずに制限部位を製造した（サイレント突然変異）。クローニングベクターpHEN1（Nucleic Res. 1991 Aug 11; 19(15): 4133-7. 線維状ファージの表面上のマルチサブユニットタンパク質：抗体（Fab）Ｈ鎖とＬ鎖の表示法、Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.）を、pelB分泌シグナルを有する枠内に挿入するために、pelB分泌シグナルの３’末端側に近いNcoI制限部位を使用した。ランダム化された残基には、天然に存在する２０種全てのアミノ酸をコード化するコドンNNS（IUPACコード、SはヌクレオチドCとGを意味する）を選択した。但し、３つのうち２つの終止コドンは省いた。例えば、NNB（BはヌクレオチドT、C及びGを意味する）のような他のコドンを使用することもできる。工学的に作成した配列は、配列番号３（図５）にヌクレオチド配列として挙げてある。この配列には、ファージミド表示ベクターpHEN1中にクローニングするために使用される制限部位、すなわち、５’末端のNcoI部位と３’末端のNotI部位も含まれる。

突然変異されたCH3ドメインの組立てに使用されるPCRプライマーの配列は、配列番号４〜配列番号９に挙げられている。
配列番号４（PCRプライマーEPKSNCO）
ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc
配列番号５（PCRプライマーCH3LSAC）
agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg
配列番号６（PCRプライマーCH3CSAC）
gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg
配列番号７（PCRプライマーCH3CHIN）
tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg
配列番号８（PCRプライマーCH3RHIN）
tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg
配列番号９（PCRプライマーCH3RNOT）
agttgcggccgctttacccggagacagggagag。

図１には、突然変異遺伝子を組み立てるために生じたPCR断片、及びそれに使用したプライマーが図示されている。

ヒトモノクロナール抗体3D6のＨ鎖のcDNA（Felgenhauer M, Kohl J, Rueker F. N, HIV-1-gp41に特異的なヒトモノクロナール抗体のＨ鎖とＬ鎖のV領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列、Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25; 18(16): 4927）を、PCR反応用のテンプレートとして使用した。３つのPCR産物をそれぞれSacI及び／又はHindIIIで消化し、かつ一緒にライゲーションした。ライゲーション産物を更にNcoIとNotIで消化し、かつ予めNcoIとNotIで消化しておいた表面表示ファージミドベクターpHEN1にライゲートした。ライゲーション産物をエレクトロポレーションによりE. Coliに形質転換した。選択したクローン数を制限分析かつDNAシーケンス化によりコントロールし、かつ正確に挿入されたランダム化配列を含めて、インサートが予定通りに含有されているのが分かった。ファージ調製の後続の工程のために、標準的なプロトコールを続けた。簡単に述べると、エレクトロポレーションによりライゲーション混合物をE. Coli TG1細胞に形質転換した。引き続き、ヘルパーM13-KO7と一緒にファージ粒子をE. Coli TG1細胞から取り出した。次に２工程で、ファージ粒子をPEG/NaCl含有の培養上澄液から沈殿させ、水に溶解させ、かつパンニングによる選択に使用するか、又は二者択一的にマイナス８０℃で貯蔵した。

例２：フォーカストFcabライブラリー（Fcab02）の構築及びファージ表面表示
例１に記載したように、ランダム化されたライブラリーの位置が完全にランダム化されたFcabライブラリーを調製した。すなわち、これらはNNS、NNB、NNK、NNNのコドンによりコード化されている。

明確にするために、記号N、B、S又はKの意味をIUPACヌクレオチド不確定コードにより定義し、これを以下の表に挙げる。

表１：ＩＵＰＡＣヌクレオチド不明確コード

材料：核酸配列中の不確定に表示された塩基の命名法
配列：Recommendations 1984, A Cornish-Bowden, Nucleic Acids Res. 1985 May 10; (13)9: 3021-3030。

上記のこれらのコドンは、２０個の全てのアミノ酸が、これらのコドンによりコード化されるように表示されている。考え得るアミノ酸以外のサブセットを選択するのが有利である。例は、次の文献に見出すことができる（Fellouse FA, LiB, Cpmpaan DM, Peden AA, Hymowiz SG, Sidhu SS. 二進コードによる分子認識、J Mol Biol. 2005 May 20; 348(5): 1153-62. Epub 2005 Apr 1.; Fellouse FA, Wiesmann C, Sidhu SS. ４個のアミノ酸コードからの合成抗体：抗原認識におけるチロシンの主な役割、Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Aug 24; 101(34): 12467-72、Epub 2004 Aug 11）。４個だけの異なるアミノ酸タイプを可能にするフォーカスライブラリーは、例えばコドンKMT（アミノ酸Ser、Tyr、Ala及びAspをコードする）を用いることにより構築できる。

フォーカストFcabライブラリー（Fcab02と表記）は、例１に記載したのと同じように構築したが、NNSコドンをKMTコドンで置換した。

従って、配列番号２（図４）の文字"Ｘ"は、今度はライブラリーFcab02を説明するために"S、Y、A及びD"（Ser、Tyr1,Ala及びAsp）を意味する。

例３：ライブラリーインサート（結合相手）とp3の間に更なるアミノ酸残基を有するファージ表面表示ライブラリーの構築
表示タンパク質の有効結合部位のアクセシビリティーを調べるために、結合アッセイを行った：ファージ懸濁液を抗−myc mAb 9E10被覆マイクロプレート（又はイムノチューブ）と反応させた。洗浄後、結合したファージが抗−M13−酵素共役物で検出された。コントロールとして、タンパク質融合とmyc-tagを表示しないヘルパーファージをプレートと反応させた。その他のコントロールは、ファージと被覆されていないプレートとの反応ならびにファージとファージのp3−融合相手を認識する抗血清との反応である。

典型的には、p3−融合タンパク質を表示するファージの抗myc反応性は、極めて明瞭なELISA読み出しを生じ得るのに対して、抗myc-mAbに対するヘルパーファージの反応は、バックグランドを上回ってはならない（被覆されていないプレート）。アンカーとしてのタンパク質IIIに対する結合によりM13ファージの表面で表示されたCH3ダイマーの構造は、様々なリンカー長さと組成物を用いて各CH3がタンパク質IIIに結合するような構造である。このようにCH3ダイマーは、有利には２つのアンカーにより表示される。

リンカーの最適化：
表示すべきタンパク質と、遺伝子パッケージのアンカータンパク質の間のリンカー（線維状ファージの場合には、例えばp3、p8、pX、pIX、pVII）は、表示分子の有効結合部位が空間的にファージ粒子の付近にある場合には特に重要である。可変ドメイン及びCDR−ループにより形成された抗原結合部位及びp3に対するアミノ末端融合としてのライブラリーメンバーの表示を使用する抗体ライブラリーにおいて、潜在的な抗体結合部位はファージ粒子には向けられていない。従って、ライブラリーメンバーとファージコートタンパク質の間のリンカー構造は、あまり重要ではない。しかし、免疫グロブリン領域の底部ループの工学的作成及びファージ表示の実施は、非効率的な方法であってもよく、かつ抗原結合クローンの収率を下げるか又はこれを排除する。ライブラリーメンバーと、表面上のその融合相手の間のリンカーを変えることで、この問題を解決するかもしくは少なくとも低減させることができる。

最適なリンカー配列を（長さと柔軟性ならびに安定性の面で）選択するために、リンカーのライブラリーを調製でき、その際、遺伝子的に複製可能なパッケージの表面でアンカータンパク質が結合タンパク質に融合できる。このことは空間的な理由で選択が難しい。

この配列のライブラリーは、長さ及びアミノ酸含有量を変化させることができる。最適なリンカー用のリンカーライブラリーの選択法は用途によるが、しかし基本的には、特定の方法論で全ての特性が選択されるべきである。選択が困難な抗原に対する富化はリンカー配列を生じ、これがライブラリーメンバーを抗原へアクセスしやすくする。プロテアーゼ溶液中又は他の厳格な条件下でのインキュベーション、又は原核生物的条件下（例えば、微生物培養）の宿主細胞による頻繁なパッセージングは、安定な表示リンカーにとって適切な選択である。

リンカーのライブラリーは、公知のライブラリー技法により製造される。合成リンカー配列の長さは、１０〜５００アミノ酸の間で変化してよい。二者択一的に、リンカーは柔軟な特性であることが公知の完全なタンパク質であることができる。

リンカーの最適化Fcab01：
１例として、ライブラリーFcab01（例１に記載）を使用できる。初めに、NcoIとNotI制限部位を用いて、このライブラリーをファージミド表示ベクターpHEN1中でクローニングした。このようにクローニングした場合に、１８個のアミノ酸残基がFcab01ライブラリーインサートのＣ−末端アミノ酸残基と、ファージM13p3のN−末端アミノ酸残基の間にあった。この結合領域の配列は、配列番号１０ SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVESに挙げられている。ここで、以下のように説明する：初めの４つの残基SPGKは、Fcab1ライブラリーインサートの４個のC末端残基であり、続いてアミノ酸配列AAAが続き、これはNotI制限部位によりコードされたアミノ酸残基であり、これにEQKLISEEDLが続く。これはmycエピトープであり、続いてNGAAがあり、この後にはアンバー終止コドンがある。これはE.coliのアンバーサプッレサー菌株中、例えばTG1中でグルタミン（Q）に翻訳される。配列番号１０のＣ末端の４個の残基TVESは、ベクターpHEN1に存在するようなファージM13p3の４個のＮ末端残基である。

Fcab（結合相手）とファージ体（遺伝子パッケージ）の間に距離を増してFcabインサートを表示するファージを構築するために、５個の更なる残基をNotIクローニング部位のすぐ上流でFcabインサートであるFcabRGD4のC末端に挿入し、クローンFcabRGD4Lを生じた。FcabEGD4は、CH3ドメインのEFループに挿入された抗原結合RGDモチーフを有し、かつELISAにおいてαvβ−インテグリンに結合するFcabである。長さの増したリンカー配列として、ファージM13p3配列中に８回登場するアミノ酸配列EGGGSを使用した。pHEN1へのクローニングの後に発現されるようなFcabRGD4Lのアミノ酸配列は、配列番号１１（図５）に挙げられている。配列番号１１（図５）では、アミノ酸残基１９８〜２０４がRGDモチーフを表し、アミノ酸残基２３７は、FcabインサートのＣ末端残基であり、残基２３８〜２４２は挿入されたリンカー配列であり（これが非変性pHEN1との違いである）、これにmyc tag、アンバー終止コドン及びp3配列が続く。

構築物のクローニングに、PCRプライマーEPKSNCO（配列番号４）とCH3rlink actagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag（配列番号１３）を用いてpHENFcabRGD4（配列番号１２）からFcabRGD4配列を増幅し、かつNcoIとMotI制限部位によりベクターpHEN1にクローニングした。得られたベクターpHENFcabRGD4K（配列番号１４／図７）は、ヌクレオチド位置3057〜3071に更なるリンカー配列を有する。

２つのファージミドベクターであるpHENFcabRGD4とpHENFcabRGD4LをE. Coli TG1に形質転換した。引き続き、ヘルパーファージM13-KO7と一緒にファージ粒子をE.coli TG1細胞から取り出した。次に２工程で、ファージ粒子をPEG/NaCl含有の培養上澄液から沈殿させ、水に溶解させ、かつELISAに使用した。

ファージELISAは以下の様に実施した：
ファージ懸濁液をαvβ3−インテグリン被覆マイクロプレート（又はイムノチューブ）と反応させた。洗浄後、結合したファージが抗M13−酵素共役物で検出された。コントロールとして、タンパク質融合を表示しないヘルパーファージ及びmyc-tagを、プレートならびにそれらの表面上でwtFcabを有するファージ粒子と反応させた。その他のコントロールは、ファージと被覆されていないプレートとの反応、及びファージとファージのFcab−融合相手を認識する抗血清との反応である。長さが増したリンカーを有するファージ粒子は、pHENFcabRGD4に含有されているような元のリンカーを有するファージ粒子よりも容易にαvβ3−インテグリンと反応し、それゆえELISAにおいて強いシグナルを生じた。

ファージ選択を行うことができ、その際、wtFcabを有するファージ粒子は、FcabRGD4又はFcabRGD4Lのどちらかを有するファージ粒子の少量と混合される。

例４：Fcab ^TM ライブラリーの設計
Fcabライブラリーの設計（図２に記載）：抗体のCH3定常ドメインの非CDRループのアミノ酸の位置をランダム化に考慮した。特にループA-B、C-D及びE-Fは、これらがドメインの片側にあると考えられている。特定の位置でランダム化するための設計基準の幾つかをここで説明することにする。

抗原抗体相互作用に関わるアミノ酸は、本明細書中でフォーカストライブラリーに含まれるものとして記載する。ここで、アミノ酸Ala、Asp、Ser及びTyrは、フォーカストライブラリーを設計するように使用される。

制限されたアミノ酸利用度を有するライブラリーは、実質的にどの抗原に対してもバインダーを生じるのに十分であることが示される（Sidhu & Fellhouse, NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2、682頁以降；Koide et al PNAS、第104巻、6632〜6637頁）。このような制限（又はフォーカスされた）ライブラリーの利点は、これらが現在の技術により完全にカバーされることである。典型的には、アミノ酸利用度は、リガンドレセプター結合の天然のアミノ酸利用度に反映される。しかし、２個だけのアミノ酸（チロシンとセリン）を利用するライブラリーでさえも良好な選択結果（種々のバインダーに対するバインダーの頻度の面及び親和性の面で）を生じることが報告されている。

ループの柔軟性：
特定のループ構造は、全体の天然構造を保持するためにスカフォールドタンパク質により必要とされる。ループ及び延長したループ内での多くのアミノ酸位置のランダム化は、ランダム化位置の片側又は両側で特定の配列を形成することで促進させることもできる。これらの配列は柔軟な配列であってよく、それによりこのような位置での特定のライブラリー配列の伸長が補償できる。

表２：Fcab^TMライブラリーの例（フォーカスト、ノンフォーカスト）

Fcab01ライブラリーは、先の実施例に記載されている。フォーカストライブラリー設計Fcab02、Fcab04及びFcab06の配列スペースは、約１０e９の実際の細菌ライブラリーサイズによりカバーされる。これとは異なり、完全にランダム化されたライブラリーFcab01、Fcab03及びFcab05は極めて不十分にしか示されていない。

酵母にてループをランダム化する設計
バクテリア中でのFcab設計とライブラリーの作成に関する上記の例と同様に、酵母ライブラリーを作成した。表３に示されているように、変性ABループ、CDループ及びEFループの様々な組合せを作成した。この例で変性したABループは、アミノ酸３５８〜３６８（wt配列"LTKNQ"）に及び、CDループはアミノ酸３８４〜３８８（wt配列"NGQPE"）に及び、かつEFループは４１３〜４１９（wt配列"DKSRWQQ"）に及ぶ。

先に述べたように、"Ｘ"は完全なランダム化を示し、かつ"Ｚ"はフォーカスした設計を示す。挿入され、かつwt Fcスカフォールドに存在しないアミノ酸は、表３でのカギ括弧の間に記載されている。これらのライブラリーに関して、ループが変性されていない場合には、個々のwt配列の１文字アミノ酸コードが表に記載されている。これらのライブラリーでは、理論的組合せの数がクローンの実験数を越えるので、生じた個々の酵母クローンの数は最後の列で示されている。

表３：Fcab^TMライブラリーの例、フォーカスト及びノンフォーカスト、ＡＢループ、ＣＤループ及びＥＦループの突然変異と挿入

例５：相同組換えベクターによる酵母表示ライブラリーのクローニング
pYD1（Invitrogen社）をベースベクターとして使用した。XhoI部位を除去するためにベクターを以下のように変性した：pYD1をXhoIで切断し、DNAポリメラーゼのクレノウ断面で処理し、かつライゲーションした。得られた配列は、pYD1dX（配列番号１５／図８）に挙げられている。pYD1dXは位置921/925で特有のBamHI制限部位と、963/967でNolI制限部位を含む。pYD1dXは、これらの２つの制限酵素で開環される。ヒトIgG1からのCH1-ヒンジ-CH2-CH3をコードするインサートは、ヒトIgG1モノクロナール抗体のＨ鎖をコードするcDNAからPCRにより調製される。このインサートでは、位置突然変異誘発が標準的な方法を用いて導入され、CH1ドメインのC末端システイン残基をセリンに突然変異させる。インサートは、両末端にそれぞれBamHI及び非制限部位と結合するPCRプライマーを用いて増幅される。次にこれらの制限部位を、pYD1dXにインサートをクローニングし、表示ベクターpYD1dXFc（配列番号１６／図９）を生成するために使用した。

CH1ドメインのＣ末端で突然変異したコドン（CysからSer）は、配列pYD1DxFcでは位置1233〜1235である。インサートの終止コドンは位置1917/1919である。

酵母表面でヒトCH1-ヒンジ-CH2-CH3を表示するための陽性コントロールとして使用したベクターは、ベクターpYD1CH12（以下参照）を構築するための出発点である。

ライブラリーのクローニング
突然変異がCH3ドメインの構造ループに導入されたライブラリーのクローニングは、相同組換えにより酵母で行った（ギャップ修復）。このために、CH3ドメインを欠く宿主ベクターを調製した：pYD1DxFcをXhoI（位置1603/1607）とNotI（位置1921/1925）で切断し、大きな断片を分取ゲル電気泳動により調製し、DNAポリメラーゼのクレノウ断片で処理し、かつ再びライゲーションした。この手法は、特有のXhoI部位（位置1603/1607）を再構築し、かつベクターpYD1CH12（配列番号１７／図１０）を生じた。引き続き、pYD1CH12をXhoIで切断し、かつ酵母中でのギャップ修復のためのレシピエントベクターとして使用した。

二者択一的に、表３に記載されているライブラリーについて、ヒンジ領域、CH1及びCH2ドメイン、CH1ドメインが欠けたものから成る種々のレシピエントベクターを構築した。このベクターでは、BamH1（位置：921/926）とXho1（位置：1603/1608）を切り取ることによりCH1ドメインを除去した。その代わりに、PCRにより作成したヒンジ領域、CH2ドメイン及び相応する制限酵素部位を有する断片を挿入した。得られたプラスミドは、pYD1_dX_dCH1_Fcab_wt（配列番号４２８／図２９）であった。更なる工程では、Xho1（1309/1314）とNot1（1626/1633）で消化することにより、プラスミドのCH3ドメインを除去し、その代わりに２つのシーケンスタグと交換した：V5タグに続いてHis6タグが続く。配列は、pYD1ベクターからPCR増幅により得られ、かつXho1とNot1制限酵素部位を用いてクローニングした。最終的なプラスミドであるpYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt（配列番号４２７／図２８）をライブラリーレシピエントベクターとして使用した。pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wtは、ヒンジ領域から出発してCH3ドメインの開始で終了し、ヒトIgG1断片をコードする。これは特有のBamHI（921/926）、Xhi1（1309/1314）及びNotI（1422/1429）制限部位を有する。最後の２個は相同組換えによりCH3ライブラリーを導入するために使用した。ベクターpYD1_dX_dCH1_Fcab_wtを酵母表面でヒトヒンジ-CH2-CH3を表示する陽性コントロールとして使用し、pYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wtを表３に記載されているライブラリーを構築するための出発点として使用した。

pYD1dXFcのインサートの材料として、FcabライブラリーであるFcab01（配列番号１８）、Fcab02（配列番号１９）、Fcab03（配列番号２０）、Fcab04（配列番号２１）、Fcab05（配列番号２２）及びFcab06（配列番号２３）を使用した。これらのライブラリーを標準的なDNA合成により調製し、かつランダム化された残基ならびにヒトIgG1のCH3ドメインのABループ（359と361の間（EU番号付け））とEFループ（413と419の間（EU番号付け））に挿入された残基を含んだ。この合成DNAからは、酵母中のギャップ修復用のインサートを、PCRプライマー対を用いてPCRにより増幅した。

XhoIで切断したベクターpYD1CH12１００μgとインサート１００μgを混合し、かつ以下のプロトコール（これは必要量の細胞とDNAを形質転換するために１００倍にスケールアップしてある）に従って、酢酸リチウム法を用いて酵母菌株EBY100（Invitrogen社）中に形質転換した。簡単に述べると、ベクターDNA１μgとインサートDNA１μgを単一形質転換するために、YPD１０ml（2%ペプトン、デキストロース（D-グルコース））を酵母コロニーを用いて接種し、かつ一晩３０℃で振盪した。一晩の培養物のOD600を測定し、かつ培養物を希釈してYPD５０ml中０．４のOD600にし、かつ更に２〜４時間成長させた。細胞を２５００rpmでペレット化し、４０ml１×TE（10mM Tris、pH7.5、1mM EDTA）中に再懸濁させた。細胞を２５００rpmで再びペレット化し、かつ1M LiAc/0.5×TE２ml中に再懸濁させ、続いて室温で１０分間インキュベートした。ベクターDNA１μg、インサート１μg及び変性した剪断サーモン精子DNA（2mg/ml）１００μgを酵母懸濁液１００μlと混合した。1M LiAc/40%PEG-3350／1×TE７００μlを加え、かつ酵母／DNA懸濁液と混合し、続いて３０℃で３０分間インキュベートした。DMSO８８μlを加え、混合し、かつ混合物を４２℃で７分間インキュベートし、続いて遠心分離器中で１０秒間遠心分離した。次に上澄液を除去し、細胞ペレットを1ml１×TE中に再懸濁させ、かつ再びペレット化した。次にペレットをTE５０〜１００μl中に再懸濁させ、かつロイシン含有の最小デキストロースプレート（10g/l酵母窒素ベース、２０g/lデキストロース、０．１g/lロイシン、１５g/lアガール）上にプレーティングした。プレートを３０℃で２〜４日間インキュベートした後に単一のコロニーが現れ、引き続き回収した。

ベクターpYD1dX_dCH1dCH3のインサートの材料として、表３に記載されているFcabライブラリーを使用した。これらのライブラリーを標準的なDNA合成法により調製し、かつランダム化された残基ならびに挿入された残基をヒトIgG1のCH3ドメインのABループ、CDループならびにEFループ中に含んだ（表３参照）。合成DNAから、YCH3.25 rec.backとYCH3.25 rec. opt.for（使用したプライマー以下に挙げてある）を用いてPCRにより酵母中のギャップ修復用のインサートを増幅した。基本的な形質転換ミックスは、XhoIで切断したpYD1dX_dCH1dCH3_Fcab_wt２μgとインサートDNA１μgを有した。これを混合し、かつ以下のプロトコール（これは必要量の形質転換を得るために１００倍にスケールアップしてある）に従って、酢酸リチウム法を用いて酵母菌株EBY100（Invitrogen社）中に形質転換した。簡単に述べると、ベクターDNA２μgとインサートDNA１μgを単一形質転換するために、YPD１０ml（2%ペプトン、デキストロース（D-グルコース））を酵母コロニーを用いて接種し、かつ一晩３０℃で振盪した。一晩培養したOD600を測定し、かつ培地を希釈してYPD５０ml中０．３のOD600にし、かつ更に６時間もしくは２．５のOD600で成長させた。細胞を２５００rpmでペレット化し、２回洗浄した：まず蒸留水２５mlで、次にLiAc１００mlで；かつ最後に１００mM LiAc５００μl中に再懸濁させた。ベクターDNA２μg、インサート１μg及び変性した剪断サーモン精子DNA（2mg/ml）１００μgを、PEG3500（33% w/w）と１００mM LiAc含有の溶液中で酵母５０μlと混合し、最終的な体積３６０μlにした。良く均一化した後に、酵母を３０℃で３０分間保持し、かつ細胞ペレットをYPD中に再懸濁させ、かつ細胞を更に３０℃で６０〜９０分間回収した。次にペレットを３０℃で２日間選択培地（プレート及び／又は液体、以下参照）中でインキュベートした。ライブラリーの多様性は、プレート上でコロニーに成長した単一細胞の数により決定した。これは、回収期間の直後に調製し、かつ接種しておいた。

プライマーのリスト：

培養−誘導化
回収した酵母ライブラリー（yFcabライブラリー）をSD-CAA培地（10g/l酵母窒素ベース、10g/lカザミノ酸、及び20g/lデキストロース、0.1g/lロイシン、9.67g/l NaH₂PO₄-2H₂O及び10.19g/l Na₂PO₄・7H₂O）１０ml中で接種し、かつ振盪機において２５０rpm及び２８℃で６〜８時間成長させた。培養物のOD600を測定決定し、かつ培養物を０．２のOD600までの希釈し、かつ同じ条件で１〜２のOD600が達成されるまで成長させた。遠心分離（3000rpm／5分／4℃）により細胞を回収し、かつ誘導培地SG/R-CAA（10g/l酵母窒素ベース、10g/lカザミノ酸、及び20g/lデキストロース、10g/lラフィノース、0.1g/lロイシン、9.67g/l NaH₂PO₄-2H₂O及び10.19g/l Na₂PO₄・7H₂O）中に再懸濁させた。培養物を振盪機において２５０rpmかつ２０℃で２日間インキュベーションにより誘発し、引き続き分析かつ分類した。二者択一的に、培養物を振盪機において２５０rpmかつ３７℃で１日間インキュベーションし、引き続き分析かつ分類した。

yFcabライブラリーの品質コントロール
SD-CAA培地で誘発した２日後に、yFcabライブラリーをそれらの発現レベル及び発現したFcabの品質に関して試験した。ポリクロナール抗ヒトIgG-Fc抗血清（Sigma社）を用いて発現レベルを試験した。このために、0.5×10e6ライブラリー細胞を１ml染色バッファー（SB）中で希釈した。これは、２%BSAを有するPBCから成っていた。細胞をペレット化し、かつ1/2000希釈された抗ヒトIgG-Fc抗血清（Sigma社）を含有する１００μlSBで３０分間氷上で染色し、SBで２回洗浄し、かつ引き続きFACS中で分析した。一般的に、全ての細胞の７０％〜８０％が各ライブラリー中、その細胞表面上でFcabを発現した。Fcabの正確なフォールディングを試験するために、タンパク質Aの染色を行った。再び０．５×１０e6ライブラリー細胞を１ml染色バッファーSB中で希釈し、細胞をペレット化し、かつ１μg／mlProt-A-FITC（Fluka社）含有の１００μlSBで氷上で３０分間染色し、SBで２回洗浄し、かつ引き続きFACS中で分析した。一般的に、上記のようにyFcabライブラリーは４０％以上のタンパク質A陽性細胞を示した。

Fcabが細胞表面上でダイマーとして発現されるかどうかを試験するために、ヒトCD54での染色を行った。５×10e5細胞をペレット化し、かつ氷上で、１μg/mlCD64（R&D Systems）含有SB５０μlで３０分間染色した。洗浄工程の後、細胞をPenta His Alexa Fluor 488（QIagen社）含有のSB５０μl中に再懸濁させ、氷上で更に３０分間インキュベートした。FACS分析のために細胞を洗浄し、かつ氷冷したSB２００μl中に再懸濁させた。コントロールとして、CD64でプレインキュベートせずに、細胞を当量のPenta His Alexa Fluor 488と一緒にインキュベートした。インキュベーションの後に、細胞を氷冷SBで２回洗浄し、かつFACSにおいて分析した。一般に、各ライブラリー中、全ての細胞の＞５０％がそれらの細胞表面上でダイマーのFcabを発現した。

抗原（Her2）のビオチン化
組換え抗原、例えばＨer2（Bendermedsystems）を製造者の指示に従って、Pierce社のEZリンク系を用いて行った。簡単に述べると、抗原をPBSで透析し、PBS中で１mg/mlに希釈し、かつ水中で予備透析しておいた１０mMスルホ-LC-LC-ビオチン（EZリンク、Pierce社）と混合した。抗原とビオチンの最終比は１：３であり、かつ混合物を室温で３０分間インキュベートした。この後に、MWCO3000（Sartorius社）カラムを用いて混合物をPBSに対して"透析"した（5×8’、4000rpm）。最後に、ビオチン化した抗原（Her2）の濃度をHPLCにより試験し、かつ−２０℃で貯蔵した。

ビオチン化した抗原の品質をELISAにより試験した。はじめにPBS（100μl/well）中、プレートを１０μg/mlで抗−Her2抗体（例えば、ハーセプチン）を被覆し、引き続き、１００μl／ウェルを４℃で一晩にわたって保持し、この後にプレートを洗浄バッファー（WB）（PBS+0.05% Tween20）で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（BB）（PBS+2%BSA）により室温で１時間ブロックした。WBで３回洗浄した後に、種々の濃度のHer2−ビオチンを１００μl／ウェルのBB中に室温で１時間加え、続いてWBで３回洗浄した。最後にプレートをBB中１：25000ストレプタビジン−HRP（GEhealthcare社）と室温で１時間インキュベートし、かつWBで３回洗浄した。３０％H₂SO₄１００μl／ウェルを添加して反応を停止させてから約１０分後に基質TMB（Sigma社）１００μl/ウェルの添加により色が展開した。４５０〜６３０nmでELISAリーダーを用いて結果を分析した。

例６：抗原特異的（Her2）Fcabの製造
FACSを用いた抗原特異的（Her2）Fcabの選択
第一の選択段階：
FACS分類の２日前に、2.5×10e8個の独立したFcabクローン含有の酵母ライブラリーをSG/R-CAA培地で誘発し、上記のようにそれらの細胞表面上にFcabを発現させた。ライブラリーの例えば１０倍（＝2.5×10e9）をカバーする細胞の量を、２mlＳＢ中５００nMビオチン化抗体（Her2）と一緒に３０分間インキュベートした。次に細胞を冷SBで１回洗浄し、次にSB中１：100希釈しておいたストレプタビジン−PE（R&D systems社製）と一緒に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を冷SBで２回洗浄し、かつ１×10e9細胞／mlの最終濃度まで希釈した。１００μl中の５×10e6細胞／mlでのコントロール染色は、抗原の不在下にストレプタビジン−PEだけで行った。完全なライブラリーとコントロール染色の両方は、例えばBD由来のFACS ARIAにおいて分析した。分類様のゲートを用意するために、コントロール細胞を使用した。はじめに、FSC/SSCゲート（G1）をセットし、正常な酵母細胞を同定し、G1からはFSC-幅対FSC-面積プロットを作成し、かつ凝集していない細胞を新たなゲート（G2）で選択した。引き続きFSC対FL-2（PEチャネル）を用いて、ストレプタビジン−PEとの反応性に関してG2中の細胞を分析した。（擬）陽性細胞０．１％を含むようにG3を用意した。引き続き、上記のようなセットと用いて少なくとも５×10e8染色細胞（ライブラリーサイズ２倍、又は理想的にはそれ以上）を分析し、かつG3の細胞をSD-CAA培地２〜３ml含有のチューブ内に貯蔵した。おおよそ５×10e5細胞（プール１）が選択の第一段階で回収され、かつ１〜２日間増殖させ、この後に細胞を−８０℃で貯蔵することができ、かつアリコートを誘発し、上記のようにFcabを発現させることができた。２日以上後に、次の選択段階を行ってもよい。

第二の選択段階：
第一段階で選択したプール１を誘発し、上記のようにそれらの表面上でFcabを発現させた。少なくとも５×10e6細胞（プール１の複数のコピーを含む）を１ml SB中、５００nMビオチン化抗原（Her2）と一緒に氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞を冷SBで１回洗浄し、次にSB中１：100希釈したストレプタビジン−PE（R&Dsystems社製）を用いて２μg／mlタンパク質A−PE（Fluka社）と一緒に氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞を冷SBで２回洗浄し、かつ約２×10e6細胞／mlの最終濃度まで希釈した。更に、コントロール染料を行い、その際に、１００μl細胞中のプール１の５×10e6細胞／mlを上記のようにProAとストレプタビジン−PEの混合物と一緒にインキュベートしたが、しかし抗原（Her2）とはインキュベートしなかった。更に、Fcab-wtを発現する酵母クローン１００μl中５×10e5細胞（非ランダム化Fc断片）を上記のようにストレプタビジン−PEの不在下にProA−FITCで染色した。Fcab-wt発現細胞を例えばBD由来のFACS ARIAにおいて分析し、分類のためのゲートを調整した。はじめにFSC/SSCゲート（G1）を調整して正常な酵母細胞を同定し、G1からFSC幅対FSC面積−プロットを作成し、かつ凝集しない細胞だけを新たなゲート（G2）中で選択した。

引き続きG2中の細胞をFSC幅対FL-1（FITC）を用いてタンパク質A発現に関して分析した。G3は、強いタンパク質A陽性細胞（親ゲートの５０〜６０％）をカバーするように調整し、かつG4は弱いタンパク質A陽性細胞（親ゲートの２０〜３０％）をカバーするように調整した。G3＋G4は、G2での全細胞のおおよそ７０〜８０％を含んだ。タンパク質A-FITCの存在で、ストレプタビジン−PE用に染色したプール細胞を使用して分類ゲートの残りを調整した。はじめにG1とG2をプール細胞でチェックし、かつ必要があれば調節した。プール細胞はG3では少ない現象を有し、かつG4でも同じであり、Fcab-wtとしてフォールドされるFcabをプール１中の全ての細胞が発現するわけではないことが示された。染色されたコントロールプール細胞を使用することで、G3とG4に新たなゲートを調製した。新たなゲートはプロットFSCとFL-2（PE）中で用意した。G3中の０．１％（偽）ストレプタビジン陽性細胞を含有するゲート（G5）が用意され、かつ同じことをG4中の細胞にも行いG6が得られた。次の工程で、Her2-ビオチン+ストレプタビジン−PE用に染色した少なくとも５×10e6細胞とタンパク質A-FITCをFACS-ARIAにより分類した。酵母培地２〜３mlを含有している分類チューブ中に細胞をG5から回収した（プール２．１とG6（プール２．２））。両方のゲートから１０〜１０００個のクローンを予測できた。両方の新たなプールを１〜２日間増殖し、かつ−８０℃で貯蔵した。２．１と２．２からの細胞を更に第三の段階で分類するために使用するか、又はこれらをFACSで更に分類する前に、ABループ（アフィニティー突然変異）の更なるランダム化を行ってもよい（有利には２つのクローンを一緒に混合した後に）。

選択クローン／プールのアフィニティー突然変異
アフィニティー突然変異のために、選択クローンにおいて又は選択クローンのプールにおいて、有利には１つだけのループ（この場合にはABループ）に多様性を導入した。このために、位置３５９と３６０及び３６１（EU番号付け）に変性コドンを含むプライマー：
（プライマーAbmut gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtcaaag、配列番号２６）又は
二者択一的に、位置３５８、３５９、３６０、３６１及び３６２（EU番号付け）に変性コドンを含むプライマー（プライマーAbmut2LR、gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag、配列番号２７）を用いてPCRを行った。

両方の場合に、これらのPCRで使用した第二のプライマーは、gapfcs3である。酵母中で効率的にギャップ修復するためのフランキング配列を作成するために、得られたPCR産物を更にgapch35とgapfsc3のプライマー対を用いて増殖させ、かつ引き続きサッカロミセス・セレビシエ菌株EBY100中で上記のように酢酸リチウム形質転換法によりXhoIで切断したpYD1CH12と一緒に形質転換した。ABループ中で記載した残基のランダム化に代替的なプライマーとして、次のようなプライマー
Abmut1L
（gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggtgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtca
aag、配列番号２８）又は
Abmut1R
（gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtca
aag、配列番号２９）
を使用してもよい。同様の方法で、EFループ中の残基を全ランダム化によりランダム化した。

二者択一的なランダム化は、個々のクローンy-Her.C2.P4.2-9上のプライマーとしてスパイクしたオリゴヌクレオチドを用いて実施した。この場合に、オリゴは個々のループの完全なランダム化について述べたものと同様に設計したが、しかしランダム化された部分は、コドンの第一と第二の位置で元の塩基の７０％と、他の３つのヌクレオチドのそれぞれ１０％を含んだ。第三の位置は、元の塩基７０％と、NNK又はNNSコドンによるベース３０％を含んだ。

完全なランダム化において、Abmutプライマーは各クローンの８０００個の新たな変異体（プール２．３）を生じ、かつAbmut2LRプライマーは３×10e6の新たな変異体（プール２．４）を生じた。従ってプール２．３と２．４は、両方とも約10e8の新たなライブラリーを生じた。それというのも出発材料（プール２．１＋２．２）は既に約１０〜１０００個のクローンを含有していたからである。

第三の選択段階
親和性成熟したプール２．３と２．４及び必要な場合にはプール２．１（タンパク質A陽性細胞だけが好ましい）を誘発し、上記のようにそれらの細胞表面上でFcabを発現させ、かつ引き続き"第二の選択段階"で記載したように分類したが、但しプール２．３と２．４がはるかに大きい点が異なった。よってプールの染色体積は、"第一の選択段階 "で記載したライブラリー染色のものと等しかった。第三の選択段階では、Her2陽性／タンパク質A細胞だけを分類した。これらの選択から誘導されたプールは通常＞２０％のHer2／タンパク質A陽性細胞を含有した。そうでない場合には、Her2の第四及び第五（又はそれ以上）の選択の段階をタンパク質Aと一緒に又は用いずに行った。例えば、H242-9Qクローンの親和性熟成は、EC50＝１５５nMから１８．９nM（H10-03-6クローン）に対する結合親和性の増大を生じた。

クローン分析：
Her2/タンパク質A細胞（>20%が好ましい）含有のプールからの独立したクローンを、このプールをSD-CAA培地含有のアガールプレートにプレーティングするか、又はプールを生じさせずにプレート上にFACS ARIAから直接に単一細胞（＝クローン）をスポットすることにより調製した。クローンを成長させ、かつ液体培地に移し、かつ−８０℃で貯蔵した。引き続きクローンのアリコートを誘発し、上記のようにそれらの細胞表面上にFcabを発現させ、かつFACSにおいて幾つかのパラメーターをスクリーニングした。これらのパラメーターは以下のものである：タンパク質A−FITCの存在あり及び不在で、選択（Her2）に使用した抗原の用量応答範囲、上記のようなCD64染色。更に、類似した染色プロトコールを用いて、幾つかの関係の無いビオチン化抗原をスクリーニングし、非交叉反応するFcabを同定した。

抗原（Her2）＋タンパク質A陽性細胞を選択する幾つかの段階の後に、５００nM抗原（Her2）で染色した場合には、クローンの大部分のパーセンテージが＞２５％の抗原（Hwe2）陽性を示し、かつ２μg/mlタンパク質A−FITCで染色した場合には＞７０％のタンパク質A陽性を示したことが観察された。殆どの場合には、これらのクローンは＞５０％CD64結合も示した。従って、このことはランダム化していないFc断片（Fcab wt）のタンパク質A及びCD64染色レベルが酵母上で発現されたことを反映している。

上記のような特徴を有し、上記のように選択されたクローンは、可溶性分子として製造するのが容易である。これは、主にFcab DNAの新たな宿主細胞への一時的なトランスフェクションにより、また安定なトランスフェクションによっても行うことができる。このために、標準的な方法を用いて個々の酵母クローンからのDNAを単離した。完全なCH3ドメイン又はライブラリー中でランダム化されたCH3ドメインの一部分だけをコードする関連するDNAをPCRにより増幅し、かつFcabの欠損部及び適切なプロモーター及びG418のような１つ以上の選択マーカーを有する新たな発現ベクターにトランスフェクトし、これらは非トランスフェクト細胞のプールからトランスフェクト細胞の選択を可能にした。次に新たなベクターHEK293又はCHOのような宿主中に一時的にトランスフェクトした。宿主細胞を回収でき、かつ引き続き１０日まで培養した。タンパク質Aにおいて精製した後に、可溶性Fcabを含有する培養物の上澄液を更なる試験に使用した。適切な細胞系を標準的な方法により作成してもよい。

表４：プール拡張後および親和性成熟後、初期ライブラリーからの選択されたHer2結合酵母クローンの配列：配列番号１（図３）の番号付けを参照（ＣＤループ：AA169ff NGQPE）

表５：プール拡張後および親和性成熟後、初期ライブラリーからの選択されたHer2結合酵母クローンの配列：配列番号１（図３）の番号付けを参照

哺乳類細胞中での抗原特異的クローンの発現と精製：
上記のような特徴を有し、上記のように選択されたクローンを、pCEP4（Invitrogen社）のような哺乳類発現ベクター中でクローニングした。高度に精製されたプラスミドDNA（Qiagen社）を、製造者（Invitrogen社）により推奨されているようなFreestyle^TM MAX ReafentでHEK293freestyle細胞を一時的にトランスフェクトするために使用した。トランスフェクション５日後に、遠心分離により、かつ０．２μMのステリカップフィルター（Millipore社）を通して濾過することにより細胞上澄液を細胞崩壊物からクリアーにした。二者択一的に、HEK293freestyle細胞又はCHO細胞を、ネオマイシン又はピューロマイシンのような抗体耐性用の遺伝子を含有する発現プラスミドでトンランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を抗体の存在で培養し、特異的に生存する細胞クローンを生じた。これは抗原特異的Fc断片と一緒に抗体耐性遺伝子を安定に発現する。このような安定なトランスフェクタントは、長期間にわたり一定して関心のあるタンパク質を分泌する。タンパク質Aイムノアフィニティークロマトグラフィーにより抗原特異的Fcabを細胞上澄液から精製した。カラムをグリシン緩衝液（pH=2.9〜4.0）で洗浄することにより、結合したFcabをタンパク質Aから溶出し、続いてPBS（pH=6.8）に対して透析した。Fcabの純度は、非還元SDS-PAGE分析により測定し、かつZorbax GF250カラム及びPBSをランニング緩衝液として用いて、可能性のある凝集物をサイズ排除HPLCにより検出した。

Fcabの構造的特徴付け：
Fcレセプターとタンパク質Aへの結合を使用して精製したFcabの全体の構造的統一性を予測した。ネオナタルFcレセプター（FcRn）との会合は、組換えヒトFcRnの5000応答ユニット（RU）に連結したBiocore CM5チップに10μg/mlFcabをpH＝６．０で添加して測定した。FcRnからのFcabの解離は、pH＝7.4で試験した。これらの実験は、Her-2特異的Fcabと、野生型Fcabに極めて類似した結合特性を有するFcRnとのpH依存的相互作用を証明した。高親和性FcレセプターCD64へのFcabの結合は、3000RUタンパク質Aで被覆したBiacore CM5チップを用いて測定し、続いて１０μg/mlFcab溶液を添加した。最後に、ヒト可溶性CD64を５μg/mlで加えた。得られた結合曲線は、野生型Fcabで得られたものと見分けがつかなかった。組換えFcab（１０μg/ml）とタンパク質Aの相互作用は、タンパク質Aを被覆したBiacore CM5チップ（3000RU）を用いてSPRによっても測定した。再び、親和性は野生型Fcabで得られたものと匹敵可能であった。

Fcabの抗原特異的結合：
Her2に結合するHer2-特異的Fcabのポテンシーと特異性は、ELISAにより推定した。ヒト可溶性Her-2（Bender Med Systems社、オーストリア）を２μg/mlでプラスチックに被覆した。非特異的結合部位を洗浄かつブロックした後に、Fcabの濃度を増大させながら添加した。Her-2が結合したFcabを検出するために、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Serotec社）に共役した抗−FcCH2ドメインに特異的なモノクロナール抗体を添加した。結果は、幾つかのHer-2特異的Fcabがそのターゲットと低いnM範囲で相互作用できることを証明した。それというのも、他のHerファミリーメンバー（Her1、Her3及びHer4）に対する結合がELISAにより判定されたものよりも１００倍以上弱かったからである。Her-2に無関係の抗原に対する結合は何も検出されなかった。

表６：ELISAにおけるHer-2特異的Fcabの結合親和性：

抗原結合はSPRによっても決定された。Biacore CM5チップは種々の量のヒト可溶性Her-2で被覆し、続いてFcabの濃度を増大させて添加した。Fcabの親和性（K_D）は、ソフトウェアBiaEvalを用いてフィッティングした後に、得られた結合曲線から計算した。これらの実験条件では、Her-2特異的FcabであるH561G3M1G4とH10-03-6は、それぞれ７．５nMと８．６nMのK_D値でHer-2に結合した。抗原結合は、Her-2過剰発現するヒト乳癌細胞系SKBR3とCalu-3を用いてFACSによって評価した。１×１０⁵個の細胞をFcabの濃度を増大させながら氷上で６０分間インキュベートした。遠心分離及び洗浄により細胞に結合していない抗体を除去した。細胞に結合したFcabは、フィコエリトリン（Sigma社）に共役した抗ヒトFc特異的抗体と一緒に氷上で６０分間インキュベートすることにより検出された。細胞を洗浄した後に、細胞表面上の蛍光の強さをFACSCalibur装置（Beckton Dickinson社）において測定した。SKBR3とCalu-3細胞に結合したが、しかしHer-2を発現しないMDA-MB468細胞には最小限度にしか結合しなかった試験済みの全てのHer-2特異的Fcabは、ELISAで見られたような弱い抗原交叉反応性が確認された。SKBR3細胞上でのHer-2特異的Fcabの明確な親和性（EC₅₀）は、表６に挙げられている。
抗原特異的Fcabのエフェクター機能（ADCC）：
Her-2特異的FcabがFcエフェクター機能を媒介するかどうかを決定するために、ADCCアッセイを行った。これらのタイプのアッセイでは、抗体はターゲット細胞に結合し、かつこれらをナチュラルキラー（NK）細胞のようなエフェクター細胞上のFcレセプターに対する結合によるアポトーシスについてマークした。蛍光染料カルボキシ−フルオルセイン・スクシンイミジルエステル（CFSE）で標識されたSKBR3（ターゲット細胞）を、Her-2特異的Fcabの濃度を増大させながら３７℃で２０分間インキュベートした。製造者（Miltenyi Biotech）の指示に従い、MACS磁気ビーズを使用してAutoMACS装置内で、ネイティブディプレションにより付着していないNK細胞を健常ドナーのヒト血液から単離した。精製したNK細胞をオプソニン処理したSKBR3細胞と５：１の比で混合し、かつ３７℃で４時間インキュベートした。この後に、アポトーシス細胞を特異的に染色する蛍光染料７−アミノアクチノマイシン（7-AAD）を加えた。アポトーシスSKBR細胞は、FACSでは7-AAD/CSFE二重陽性細胞として数えられた。Her-2特異的FcabであるH10-03-6とABEFs0101は、それぞれ１．１nMと１．０nMのEC₅₀値で死滅させるSKBR3細胞の可能性のあるメディエーターであることが分かった。アポトーシス誘発のメカニズムは、NK細胞の存在に依存し、Her-2特異的FcabがADCC機能を有することを証明する。

例７： 4D5Fabの酵母表示
酵母でFab断片を表示するたｍに、酵母表示ベクターpYD1（Invitrogen社）（配列番号７２／図１７）を以下のように変性した：
NheI制限部位を部位特異的突然変異により位置581/586で導入し、変性ベクターpYD1Nhe（配列番号７２／図１８）を生じた。このベクターをNheIとPmeIで制限し、３つの断片を生じた。最大の断片はベクターの骨格の残りであった。その中に合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿入し、ベクターpYD1lnk（配列番号７４／図１９）を生じた。次にベクター０pYD1からMATα転写末端領域を含むカセットをPCRにより増幅し、かつBamHIとPstI制限によりpYD1lnk中にクローニングし、かつライゲーションした。得られたベクターはpYD1mata（配列番号７５／図２０）であった。GAL1プロモーター、Aga2をコードする遺伝子及びNotIとSfiIクローニング部位を有する合成リンカーを含むカセットをpYD1からPCRにより増幅し、かつEcoRIとPacI制限部位によりpYD1mata中にクローニングし、ベクターpYD1gal（配列番号７６／図２１）を得た。

酵母で表示すべきFabの一例として、それぞれ抗体4D5（Herceptin）のVH-CH1とVL-CLをコードする遺伝子を合成により作成した（配列4D5F（配列番号７７／図２２））と4D5L（配列番号７８／図２３））。

4D5HはSfiIとNotI制限部位によりフランキングされ、かつベクターpYD1gal中にクローニングし、ベクターpYD4D5hc（配列番号７９／図２４）を生じた。このベクターでは、4D5HのＮ末端がAga2のＣ末端に融合し、かつ4D5HのＣ末端がAga2のＣ末端に融合し、かつ4D5HのＣ末端でヘキサヒスチジンタグと結合し、その後に終止コドンが続く。4D5のVH-CH1のアミノ酸配列は、4D5hpに挙げてある（配列番号８０／図２５）。

4D5Lは、NcoIとAscI制限部位によりフランキングされ、かつベクターpYD4D5hc中にクローニングされ、ベクターpYD4D5hlを生じた（配列番号８１／図２６）。4D5Lは、Aga2分泌シグナルよりも先行し、かつCLドメインのＣ末端システイン残基の後に終止コドンを有する。4D5のVL-CLのアミノ酸配列は、4D5lp（配列番号８２／図２７）に挙げられている。

4D5Fabを表示するために、ベクターpYD4D5hlを酵母菌株EBY100（Invitrogen社）に形質転換し、形質転換体をトリプトファン不含の最小培地中で選択し、かつ標準的なプロトコール（Invitrogen社）に従って、組換えタンパク質の発現をガラクトース含有培地で成長させることにより誘発した。

例８：4D5FabのCLドメインの構造ループ内でランダム化された残基を有するライブラリーの構築
酵母中での表示ライブラリー構築における第一の工程として、野生型CL（Cκ）ドメインを制限酵素BsiWIとAscIを用いて表示ベクターpYD4D5hl（配列番号８１）から切り取った。BsiWIとAscI部位によりフランキングされたヒトCκドメインをコードする合成遺伝子（pYD4D5hlによる状況）を調製し、その際に、ランダム突然変異と挿入を、それぞれABとEFループ内に導入した。この特別な例では、３、４又は５個のNNBコドンの挿入をヒトＣκドメインのアミノ酸位置１６と１７の間で行い、かつ残基の位置９２、９３、９４、９５、９７、９８及び９９をNNBコドンと置き換えた（IMGT番号付け、図２参照）。NNBコドンは、位置１と２で全部で４個のヌクレオチドを含有し、かつ位置３でＣ、Ｇ及びＴを含有した。従って、NNBは天然にコードされるアミノ酸を全部で２０個コードする。

以下のような標準的な方法でライブラリーを調製かつ選択した。

スカフォールドリガンドとして、CDRターゲットHer2neuと4D5エピトープを使用した。ライブラリーのメンバーを、CLドメイン中に工学的に作成された結合部位を有する本発明による細胞毒性モジュラー抗体を製造するために選択した。これは、Fcγレセプターのようなエフェクター分子に特異的に結合する。得られたFcbを（i）Kd＜１０^-8MとIC50＜１０^-8Mを有するHer2neu結合に関して、及び（ii）CDC及び／又はADCCアッセイを用いるエフェクター機能に関して試験した。

Claims (13)

1. ６０ｋＤまでの分子量を有し、Ｋｄ＜１０^-8Ｍの結合親和性で細胞表面ターゲットに特異的に結合する、細胞毒性モジュラー抗体であって、細胞表面ターゲットがＨｅｒ２であり、かつ抗体が、ＣＨ３ドメインの構造ループ領域内でＨｅｒ２に特異的に結合し、配列表番号１９１、２４１及び３７０のアミノ酸配列を含む結合部位を含む、前記細胞毒性モジュラー抗体。
2. ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ又はアポトーシス活性のうち少なくとも１つを有する、請求項１に記載のモジュラー抗体。
3. アポトーシス活性を有する、請求項２に記載のモジュラー抗体。
4. 前記抗体は、モジュラー抗体ドメインのオリゴマーである、請求項１から３までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体。
5. 前記抗体が、抗原結合Ｆｃである、請求項１から４までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体。
6. 前記抗体がＩｇＧ１ Ｆｃである、請求項１から５までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体。
7. さらに、１つ以上の変性モジュラー抗体と又は非変性モジュラー抗体もしくはこれらの一部と組合せた、請求項１から６までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体を含む組合せモジュラー抗体。
8. 完全な抗体分子である、請求項７に記載の組合せモジュラー抗体。
9. 前記抗体がヒト免疫グロブリンである、請求項１から６までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体。
10. 前記抗体が、ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭである、請求項９に記載のモジュラー抗体。
11. 前記モジュラー抗体が、モジュラー抗体のドメイン又はミニドメインが１つ以上の他のタンパク質に融合されている融合タンパク質である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体。
12. 前記モジュラー抗体に融合したタンパク質が、他のモジュラー抗体、免疫グロブリン、リガンド、スカフォールドタンパク質、酵素、及びトキシンからなる群から選択される、請求項１１に記載のモジュラー抗体。
13. ｅｒｂＢクラスのレセプターを発現し、レセプターがＨｅｒ２である充実性腫瘍を患っている患者を治療するための、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のモジュラー抗体を含む医薬組成物。

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