DE60028970T2 - An her2 bindende peptidverbindungen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft neue Verbindungen, die an das menschliche erbB2-Genprodukt (ErbB2, auch als HER2 oder c-ErbB-2 bekannt) binden. Die Erfindung betrifft außerdem Zusamensetzungen, wie z.B. pharmazeutische Zusammensetzungen, die die neuen Verbindungen umfassen.
  • Beschreibung ähnlicher Offenbarungen
  • Phagendisplay stellt ein Mittel zur Erzeugung von Peptiden und Proteinvarianten durch Randomisierung spezifischer Aminosäurereste in einer Templatsequenz oder durch Erzeugen von naiven Peptidbibliotheken bereit (H. Lowman, Methods Mol. Biol. 87, 249–264 (1998); Lowman, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401–424 (1997)). Die Identifizierung und Isolierung von präsentierten Proteinen oder Peptiden, die an ein vorherbestimmtes Zielmolekül binden, kann durch Anreicherung präsentierender Phagen gegenüber nicht-bindenden oder schwach bindenden Varianten an immobilisierten Zielmolekülen erzielt werden (H. Lowman (1989), siehe oben). Aufeinander folgende Umläufe von Mutagenese und Selektion können Peptidliganden oder Proteinvarianten mit hoher Affinität für Zellrezeptoren liefern (H. Lowman (1998), siehe oben). Das Verfahren ist verwendet worden, um Peptidmotive zu identifizieren, die zum Beispiel zu einem Zellziel gehören (Arap et al., Science 279, 377–380 (1998)) oder um aus nativen proteinbindenden Liganden gereifte Peptidliganden oder Peptidliganden mit verbesserter Affinität zu erzeugen (Lowman et al., Biochemistry 30, 10832–10838 (1991)). Beispiele von Proteinen mit verbesserter Affinität oder Spezifität umfassen menschliches Wachstumshormon, Zinkfinger, Proteaseinhibitoren, in den Herzvorkammern gebildete Polypeptide und Antikörper (J. Wells und H. Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 597–604 (1992), T. Clackson und J. Wells, Trends Biotechnol. 12, 173–184 (1994); Lowman et al., Biochemistry 30(10), 832–838 (1991); Lowman et al. und J. Wells, J. Mol. Biol. 234, 564–578 (1993); M. Dennis und R. Lazarus, J. Biol. Chem. 269(22), 137–144 (1994)).
  • Unter Einsatz der In-vivo-Phagenselektion ist Phagendisplay verwendet worden, um Peptide zu identifizieren und zu isolieren, die fähig sind, die selektive Lokalisierung zu verschiedenen Organen, wie z.B. Hirn und Niere, zu vermitteln (Pasqualini und Rouslothi, Nature 380, 364–366 (1996)) sowie um Peptide zu identifizieren, die zu gewissen Tumortypen gehören, die αvβ3- und αvβ5-Integrine tragen (Arap et al., Science 279, 377–380 (1998)). US-Patent Nr. 5.627.263 beschreibt Peptide, die vom α5β1-Integrin erkannt werden und selektiv daran binden. Unter Verwendung von durch monovalenten Phagendisplay erzeugten, strukturell beschränkten Peptidbibliotheken sind 14 Aminosäuren umfassende Peptide isoliert worden, die spezifisch an insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 bindende Proteine (IGFBPs) binden (Lowman et al., Biochemistry 37, 8870–8878 (1998)). Die Peptide enthalten eine Helixstruktur und binden IGFBPs in vitro und setzen insulinähnliche Wachstumsfaktor-α-(IGF-1-)Aktivität frei (Lowman et al. (1998), siehe oben).
  • Bestimmte Zellrezeptoren und ihre Liganden, insbesondere jene im Zusammenhang mit der Pathogenese verschiedener menschlicher Malignitäten, sind neulich im Mittelpunkt des Interesses in der wissenschaftlichen Gemeinde, da neue, auf Protein basierende Therapeutika in die klinische Phase eintreten. Beispielsweise ist gefunden worden, dass das menschliche erbB2-Gen (auch als her2 oder c-erbB-2 bekannt), das für einen Transmembranglykoproteinrezeptor von 185 kd (p185HER2) kodiert, der mit dem Epidermiswachstumsfaktorrezeptor (EGFR) verwandt ist, bei etwa 25% bis 30% menschlicher Brustkrebsfälle überexprimiert ist (Slamon et al., Science 235, 177–182 (1987); Slamon et al., Science 244, 707–712 (1989)). Mehrere Beweisführungen unterstützen eine direkte Rolle für ErbB2 bei der Pathogenese und klinischen Aggressivität von ErbB2 überexprimierenden Tumoren. Es ist gezeigt worden, dass die Einführung von erbB2 in nicht-neoplastische Zellen ihre maligne Transformation verursacht (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7159–7163 (1987); DiFiore et al., Science 237, 78–182 (1987)). Von transgenen Mäusen, die HER2-exprimieren, hat sich erwiesen, dass sie Mammatumore entwickeln (Guy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10578–10582 (1992)).
  • Die Überexpression von ErbB2 wird allgemein als Vorhersage einer schlechten Prognose betrachtet, insbesondere bei Patienten mit Primärerkrankung, die Achsellymphknoten umfassen (Slamon et al. (1987) und (1989), siehe oben; Ravdin und Chamness, Gene 159, 19–27 (1995); und Hynes und Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198, 165–184 (1994)). Überexpression ist außerdem mit Empfindlichkeit und/oder Resistenz gegen Hormontherapie und chemotherapeutische Regime, einschließlich CMF (Cyclophosphamid, Methotrexat und Fluoruracil) und Anthracyclinen (Baselga et al., Oncology 11 (3 Suppl. 1), 43–48 (1997)), in Verbindung gebracht worden.
  • Ein monoklonaler rekombinanter humanisierter Anti-ErbB2-Antikörper (eine humanisierte Version des murinen Anti-ErbB2-Antikörpers 4D5, der als rhuMAb HER2 oder HERCEPTIN® bezeichnet wird) ist in Patienten mit ErbB2 überexprimierendem metastatischem Brustkrebs, die vorher extensive Anti-Krebs-Therapie erhalten haben, therapeutisch aktiv (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14, 737–744 (1996)).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, die an das menschliche erbB2-Genprodukt (ErbB2) der folgenden Formel binden: Xaa(1-14)-Cys-Xaa16-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(21-27) (Seq.-ID Nr. 90), worin X(1-14) abwesend ist oder zwischen ein und vierzehn Aminosäuren umfasst; Xaa16 eine aus der aus Met, Thr, Cys und Ile bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa(21-27) abwesend ist oder zwischen ein und sieben Aminosäuren umfasst. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung (die hierin als Peptidliganden bezeichnet werden) sind Peptide. Bevorzugte Peptidliganden umfassen lineare und zyklische Peptide, vorzugsweise zyklische Peptidverbindungen, einschließlich Dimere und andere Kombinationen der vorangehenden allgemeinen Struktur.
  • Konkrete Beispiele derartiger Verbindungen umfassen zyklische Peptide von zwischen etwa 10 und 60 Aminosäureresten und umfassen gegebenenfalls N- oder C-terminale Modifizierungen oder beide, wie z.B. Ester, Amide, Salze und andere Derivate davon. Gemäß bevorzugten Aspekten der Erfindung sind die Verbindungen vorzugsweise nicht-natürlich auftretende Aminosäuresequenzen, die ErbB2 binden. Vorzugsweise ist die Verbindung eine nicht-natürlich auftretende Aminosäuresequenz von zwischen etwa 5 und 50 Aminosäureresten. Bevorzugte Verbindungen sind zyklische Peptide, die die vorangehende allgemeine Formel aufweisen und zwischen etwa 20 und etwa 30 Aminosäureresten aufweisen, und umfassen Dimere und andere Kombinationen davon.
  • In speziellen Aspekten richtet sich die Erfindung auf Kombinationen von Peptidliganden mit anderen Peptidliganden oder mit anderen Proteinen, insbesondere Serumproteinen oder Peptiden. Die Kombinationen werden mit Blick auf verschiedene Ziele hergestellt, einschließlich: Erhöhung der Affinität oder Avidität des Peptidliganden für sein Zielmolekül, wie z.B. durch Verwendung verschiedener Multimerisierungsdomänen; Erhöhung der Stabilität des Peptidliganden oder Erleichterung seiner Gewinnung und Reinigung, wie z.B. durch Exprimieren des Peptidliganden als Z-Proteinfusion; Verbessern der therapeutischen Wirksamkeit des Peptidliganden in Aspekten der Erfindung, die die In-vivo-Verwendung des Peptidliganden umfassen, beispielsweise durch Erhöhen oder Erniedrigen der Serumhalbwertszeit, beispielsweise durch Fusionieren des Peptidliganden an ein Plasmaprotein, wie z.B. Serumalbumin, ein Immunglobulin, Apolipoproteine oder Transferrin (wobei eine derartige Fusion zweckmäßigerweise in rekombinanten Wirtszellen oder durch Verwendung von bifunktionellen Vernetzungsmitteln vorgenommen wird), und Einführen von zusätzlichen Funktionalitäten, wie z.B. jene einer funktionellen Fc-Domäne oder zytotoxischen oder Enzym-Gruppierung.
  • Die Verbindung der Erfindung kann an eine Multimerisierungsdomäne gebunden werden. Die Multimerisierungsdomäne ist vorzugsweise eine Immunglobulinsequenz. Sie kann außerdem beispielsweise eine Leucin-Zipper-Sequenz sein. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist die Immunglobulinsequenz vorzugsweise eine konstan te Region einer Immunglobulinsequenz und insbesondere die konstante Region einer Immunglobulinschwerkette. Die Multimerisierungsdomäne kann sich mit einer oder mehreren Begleit-Multimerisierungsdomänen paaren, um Homo- und Heteromultimerzusammensetzungen bereitzustellen. Bevorzugt gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind Homo- und Heteromultimere, insbesondere Homo- und Heterodimere, worin die Multimerisierungsdomänen konstante Regionen von Immunglobulinschwerketten sind, die sich paaren, um funktionelle Immunglobulin-Fc-Domänen bereitzustellen. Daher stellt die Erfindung gemäß bevorzugten Aspekten ein Hybridmolekül bereit, das eine Verbindung der Erfindung, deren Funktion das Abzielen auf einen ErbB2-tragenden Zelltyp ist, sowie eine funktionelle Immunglobulin-Fc-Domäne umfasst, die eine mit einer funktionellen Immunglobulin-Fc-Domäne verbundene Effektorfunktion besitzt.
  • Hybridmoleküle gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen gegebenenfalls eine weitere funktionelle Gruppierung, wie z.B. eine Enzymgruppierung oder eine zytotoxische Gruppierung. Beispielsweise kann die zusätzliche funktionelle Domäne ein Enzym sein, das kovalent an ein Hybridmolekül gebunden und fähig ist, an einem Prodrug in einer solchen Weise zu agieren, dass das Prodrug zu seiner aktiveren Form umgesetzt wird. Die optionale funktionelle Domäne kann nach bestimmten bevorzugten Aspekten der Erfindung ein zytotoxisches Mittel sein, das beispielsweise durch kovalente Bindung an ein Hybridmolekül gebunden ist. Bevorzugte zytotoxische Mittel umfassen beispielsweise chemotherapeutische Mittel, Toxine und radioaktive Isotope. Die Verbindungen, die die Hybridmoleküle umfassen, und Zusammensetzungen, die diese umfassen, werden bei der Bindung oder beim Nachweis des menschlichen erbB2-Genprodukts und gegebenenfalls zur Abgabe einer funktionellen Gruppierung, wie z.B. eines Enzyms oder zytotoxischen Medikaments, an den ErbB2-tragenden Zelltyp verwendet.
  • In einer ihrer Ausführungsformen ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung, wie z.B. das oben beschriebene Hybridmolekül, ein Polypeptid, und die Erfindung umfasst eine isolierte DNA, die für das Polypeptid der Erfindung kodiert. Gemäß diesem Aspekt umfasst die Erfindung außerdem eine operabel an das DNA-Molekül gebun dene Expressionskontrollsequenz, einen Expressionsvektor, vorzugsweise ein Plasmid, das das DNA-Molekül umfasst, wobei die Kontrollsequenz von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt wird, und eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle. Gemäß bevorzugten Aspekten kodiert die Nucleinsäure für ein Hybridmolekül, das eine Peptidverbindung der Erfindung und eine Immunglobulin-Konstantregiondomänensequenz umfasst. Das Nucleinsäuremolekül gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert für ein Hybridmolekül, und die für die Peptidverbindung der Erfindung kodierende Nucleinsäure ist operabel an die Immunglobulindomänensequenz gebunden (in dem Sinne, dass die DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und sich im Leseraster befinden). Gegebenenfalls können die DNA-Sequenzen durch eine Nucleinsäuresequenz verbunden sein, die für eine optionale Linkerdomänen-Aminosäuresequenz kodiert.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Schritte des Isolierens oder Synthetisierens von Nucleinsäuresequenzen, die für jegliche der Aminosäuresequenzen der Erfindung kodieren, Ligierens der Nucleinsäuresequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, der zur Expression der Nucleinsäuresequenz in einem geeigneten Wirt fähig ist, Transformierens des Wirts mit dem Expressionsvektor, in den die Nucleinsäuresequenz ligiert worden ist, und Kultivierens des Wirts unter Bedingungen umfasst, die zur Expression der Nucleinsäuresequenz geeignet sind, wodurch das von der gewählten Nucleinsäuresequenz kodierte Protein vom Wirt exprimiert wird. Vorzugsweise wird das Polypeptid dann aus der Wirtszellenkultur gewonnen. Bei diesem Verfahren kann der Ligationsschritt außerdem das Ligieren der Nucleinsäure in einen geeigneten Expressionsvektor umfassen, sodass die Nucleinsäure operabel an ein geeignetes Sekretionssignal gebunden ist, wodurch die Aminosäuresequenz vom Wirt sekretiert wird.
  • Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen, einschließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen der Erfindung umfassen, die insbesondere für den Nachweis und die Behandlung von Krankheiten oder Störungen zweckdien lich sind, die mit erbB2-Genexpression verbunden sind. Sets und Fertigartikel für Nachweis und Behandlung von Krebs können umfassen:
    • (a) einen Behälter;
    • (b) ein am Behälter angebrachtes oder diesem zugehöriges Etikett; und
    • (c) eine Zusammensetzung, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst und im Behälter enthalten ist,
    wobei die Zusammensetzung für die Behandlung einer mit erbB2-Genexpression, wie z.B. Krebs, in Verbindung stehenden Krankheit oder Störung wirksam ist. Vorzugsweise weist das Etikett auf dem Behälter darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs verwendet werden kann, und die Verbindung in der Zusammensetzung umfasst eine hierin beschriebene Verbindung, die an das menschliche erbB2-Genprodukt bindet. Die Sets können gegebenenfalls Hilfskomponenten umfassen, wie z.B. einen zweiten Behälter, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer umfasst, sowie Anleitungen zur Verwendung der Zusammensetzung zur Behandlung einer Störung.
  • Ebenfalls offenbart werden Verfahren, die zur Behandlung verschiedener Krankheiten und Störungen wie z.B. Krebs zweckdienlich sind, insbesondere jener, die durch die Beteiligung von ErbB2 gekennzeichnet sind. Daher stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer ErbB2-vermittelten oder -assoziierten Krankheit oder Störung in einem Wirt, der dessen bedarf, bereit und kann das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung an den Wirt umfassen. Verschiedene Dosierungsformen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können jene umfassen, die für parenterale, orale, rektale und pulmonale Verabreichung einer Verbindung geeignet sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Eine therapeutische Dosierungsform der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann auch für intravenöse Abgabe geeignet sein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von Krankheiten und Störungen zweckdienlich sein, die ein(en) ErbB2-vermittelten/s oder assoziierten/s Prozess oder Ereignis, wie z.B. Krebs, umfassen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung eines nativen IgG und von aus dem Papain- und Pepsinverdau resultierenden Fragmenten davon. Disulfidbindungen sind durch -S-S- zwischen beispielsweise den CH1- und CL-Domänen dargestellt. In der Figur bedeutet V variable Domäne; C konstante Domäne; steht L für Leichtkette und steht H für Schwerkette.
  • 2A stellt Angleichungen von nativen IgG-Fc-Region-Aminosäuresequenzen dar. Gezeigt sind menschliche (hum) IgG-Fc-Region-Sequenzen, humIgG1 (Nicht-A- und A-Allotypen) (Seq.-ID Nr. 72 bzw. 73), humIgG2 (Seq.-ID Nr. 74), humIgG3 (Seq.-ID Nr. 75) und humIgG4 (Seq.-ID Nr. 76). Die menschliche IgG1-Sequenz ist der Nicht-A-Allotyp, und Unterschiede zwischen dieser Sequenz und dem A-Allotyp (bei Positionen 356 und 358; EU-Nummerierungssystem) sind unter der menschlichen IgG1-Sequenz gezeigt. Ebenfalls gezeigt sind native murine (mur) IgG-Fc-Region-Sequenzen, murIgG1 (Seq.-ID Nr. 77), murIgG2A (Seq.-ID Nr. 78), murIgG2B (Seq.-ID Nr. 79) und murIgG3 (Seq.-ID Nr. 80). 2B zeigt die prozentuelle Identität unter den Fc-Region-Sequenzen der 2A.
  • 3 zeigt die Angleichungen von nativen menschlichen IgG-Fc-Region-Sequenzen, humIgG1 (Nicht-A- und A-Allotypen) (Seq.-ID Nr. 72 und 73), humIgG2 (Seq.-ID Nr. 74), humIgG3 (Seq.-ID Nr. 75) und humIgG4 (Seq.-ID Nr. 76), wobei Unterschiede zwischen den Sequenzen mit Sternchen markiert sind.
  • 4 zeigt die Anreicherung von polyvalenten Peptidphagen, die die extrazelluläre HER2-Domäne (ECD) binden. Das Verhältnis der von einem mit HER2 beschichteten Well im Vergleich zu einem mit BSA beschichteten Well eluierten Phagen ist für Selektionsumläufe 3 und 4 gezeigt.
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines Phagenbindungstests. Es zeigte sich, dass Phagenklone 1.1, 5.1 und 7.1 an immobilisiertes HER2-ECD, nicht jedoch an BSA oder nahe verwandtes HER3 oder HER4 binden, was darauf hinweist, dass sie HER2-ECD spezifisch erkannten.
  • 6 zeigt eine EC50-Ermittlung für immobilisiertes HER2 bindendes Peptid 1.1.FIZb.
  • 7 zeigt die Ergebnisse eines Konkurrenztests für synthetische Peptide HER201 und HER212 sowie rekombinante Peptide 1.1.FI-Z und 7.1c-Z mit Peptid 1.1.FI-Zb um Bindung an immobilisierte HER2-ECD.
  • 8A–C. 8A zeigt das 1.1.FI-Z-Präparat (S) (Seq.-ID Nr. 81), gereinigt unter Verwendung von Superdex 75 in Monomer (M) und Dimer (D) enthaltende Fraktionen. 8B zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Ausgangsmaterial und Fraktionen aus der SUPERDEXTM-75-Säule für Peptid 1.1.FI-Z. 8C zeigt HER2-Bindungsaktivität, die beim Testen unter Anwendung eines Konkurrenztests mit den Dimerfraktionen von 1.1.FI-Z übereinstimmen.
  • 9A–C. 9A zeigt das (1.1FI)2-Z-Präparat (Seq.-ID Nr. 82) (1.1FI zweimal wiederholt und an die Z-Domäne von Protein A fusioniert), gereinigt unter Verwendung von Superdex 75 in Monomer und Dimer enthaltende Fraktionen. 9B zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen aus der SUPERDEXTM-Säule für Peptid (1.1FI)2-Z. 9C zeigt HER2-Bindungsaktivität, die beim Testen unter Anwendung eines Konkurrenztests mit den Monomerfraktionen von (1.1FI)2-Z übereinstimmen.
  • 10A und B. 10A und 10B zeigen, dass die Peptide HER201 und 7.1c-Z die Bindung von Klasse-1- und Klasse-7-Phagen blockieren, was nahe legt, dass beide Klassen von Peptiden an dieselbe Stelle am HER2 binden.
  • 11. zeigt Beispiele von Klasse-1- und Klasse-7-Sequenzen, die eine Kern-Homologieregion zwischen den beiden Peptidklassen offenbaren. Sequenz 7.1c (Seq.-ID Nr. 83), 1.1.2 (Seq.-ID Nr. 84), 1.1.FC (Seq.-ID Nr. 85), 1.1.FA (Seq.-ID Nr. 86), 1.1.FB (Seq.-ID Nr. 87), 1.1.FH (Seq.-ID Nr. 88), 1.1.CF (Seq.-ID Nr. 89).
  • 12 zeigt die Ergebnisse eines Konkurrenztests von Klasse-1- und Klasse-7-Peptiden mit bekannten, gegen HER2 gerichteten monoklonalen Antikörpern um Bindung von HER2-ECD. Die Peptide konkurrieren nicht mit den monoklonalen Antikörpern um Bindung von HER2-ECD, was nahe legt, dass die Peptide eine HER2-ECD-Stelle binden, die sich von der unterscheidet, die von bekannten monoklonalen Antikörpern erkannt wird.
  • 13 zeigt die Ergebnisse eines Bindungstests, der unter Verwendung des Peptids 1.1.FI-Zb und Zellen, die entweder HER2 in verschiedenen Ausmaßen (MDA 361 [4 × 105 Rezeptoren/Zelle]) und BT 474 ([3 × 106 Rezeptoren/Zelle]) exprimieren, oder Zellen durchgeführt wurde, die kein HER2 exprimieren (BaF3). Es zeigte sich, dass 1.1.FI-Zb Zellen proportional zur Anzahl von an der Zelle exprimierten HER2-Rezeptoren und Konzentration von 1.1.FI-Zb-Peptid bindet.
  • 14 zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen, und zwar von Peptid 1.1FI, das über einen Linker an die Gelenks-, CH1- und CH2-Domänen von menschlichem IgG1 fusioniert ist (1.1FI-Fc). Die Molekulargewichtsverschiebung unter den beiden Bedingungen weist auf eine Dimerisierung der konstanten Ig-Regionen und die Bildung einer Fc-Domäne hin.
  • 15 zeigt die abgeleiteten Peptidsequenzen aus Klonen in den Bibliotheken 1.1 und 7.1. Sequenz 1.1 (Seq.-ID Nr. 57); 1.1.8 (Seq.-ID Nr. 58); 1.1.9 (Seq.-ID Nr. 59); 1.1.10 (Seq.-ID Nr. 60); 1.1.1 (Seq.-ID Nr. 61); 1.1.2 (Seq.-ID Nr. 62); 1.1.6 (Seq.-ID Nr. 63); 1.1.11 (Seq.-ID Nr. 64); 1.1.3 (Seq.-ID Nr. 65); 1.1.4 (Seq.-ID Nr. 66); 1.1.5 (Seq.-ID Nr. 67); 1.1.7 (Seq.-ID Nr. 68); Consensus (Seq.-ID Nr. 69); 7.1 (Seq.-ID Nr. 45); 7.1.1 (Seq.-ID Nr. 46); 7.1.9 (Seq.-ID Nr. 47); 7.1.6 (Seq.-ID Nr. 48); 7.1.5 (Seq.-ID Nr. 49); 7.1.3 (Seq.-ID Nr. 50); 7.1.4 (Seq.-ID Nr. 51); 7.1.2 (Seq.-ID Nr. 52); 7.1.7 (Seq.-ID Nr. 53); 7.1.8 (Seq.-ID Nr. 54); 7.1.11 (Seq.-ID Nr. 55); Consensus (Seq.-ID Nr. 56).
  • 16 zeigt die Sequenzen aus Zufallsklonen für jede Bibliothek mit dem vierten Selektionsumlauf. Sequenz 1.1 (Seq.-ID Nr. 57); Consensus (Seq.-ID Nr. 58); 1.1.FC (Seq.-ID Nr. 30); 1.1.FN (Seq.-ID Nr. 31); 1.1.FA (Seq.-ID Nr. 1); 1.1.FM (Seq.-ID Nr. 2); 1.1.FE (Seq.-ID Nr. 3); 1.1.FH (Seq.-ID Nr. 29); 1.1.FB (Seq.-ID Nr. 12); 1.1.FF (Seq.-ID Nr. 13); 1.1.FI (Seq.-ID Nr. 14); 1.1.FK (Seq.-ID Nr. 15); 1.1.FD (Seq.-ID Nr. 16); 1.1.FQ (Seq.-ID Nr. 17); 1.1.FS (Seq.-ID Nr. 18); 1.1.FX (Seq.-ID Nr. 9); 1.1.FY (Seq.-ID Nr. 10); 1.1.FZ (Seq.-ID Nr. 11); 1.1.NC (Seq.-ID Nr. 4); 1.1.NB (Seq.-ID Nr. 5); 1.1.NM (Seq.-ID Nr. 6); 1.1.NQ (Seq.-ID Nr. 7); 1.1.NA (Seq.-ID Nr. 19); 1.1.NG (Seq.-ID Nr. 20); 1.1.NH (Seq.-ID Nr. 21); 1.1.NE (Seq.-ID Nr. 22); 1.1.NJ (Seq.-ID Nr. 23); 1.1.NF (Seq.-ID Nr. 24); 1.1.NK (Seq.-ID Nr. 25); 1.1.NR (Seq.-ID Nr. 26); 1.1.CF (Seq.-ID Nr. 28); 1.1.CA (Seq.-ID Nr. 32); 1.1.CB (Seq.-ID Nr. 33); 1.1.CC (Seq.-ID Nr. 34); 1.1.CD (Seq.-ID Nr. 35); 1.1.CE (Seq.-ID Nr. 36); 1.1.CG (Seq.-ID Nr. 37); 1.1.CH (Seq.-ID Nr. 38); 1.1.CI (Seq.-ID Nr. 39); 1.1.CJ (Seq.-ID Nr. 40); 1.1.CL (Seq.-ID Nr. 41); 1.1.CM (Seq.-ID Nr. 42); 1.1.CP (Seq.-ID Nr. 43).
  • 17 zeigt die Ergebnisse eines Konkurrenztests von 1.1FI-Fc und 1.1FI-Z mit Peptid 1.1FI-Zb um Bindung an immobilisierte HER2-ECD.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Definitionen
  • Die Ausdrücke „HER2", „ErbB2", „c-Erb-B2" werden wechselseitig verwendet. Wenn nicht anders angegeben beziehen sich die Ausdrücke „ErbB2", „c-Erb-B2" und „HER2" bei Verwendung hierin auf das menschliche Protein und „her2", „erbB2" und „c-erb-B2" auf das menschliche Gen. Das menschliche erbB2-Gen und ErbB2-Protein werden beispielsweise beschrieben in Semba et al., PNAS (USA) 82, 6497–6501 (1985), und Yamamoto et al., Nature 319, 230–234 (1986) (Genbank-Zugangsnummer X03363). ErbB2 umfasst vier Domänen (Domänen 1–4).
  • Der Ausdruck „Peptidligand" bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf Aminosäuresequenzen unabhängig von ihrem Ursprung, deren Funktion die Bindung von ErbB2 ist. Peptidliganden im Kontext der vorliegenden Erfindung sind im Allge meinen eingeschränkte (d.h. sie weisen ein gewisses Strukturelement auf, z.B. die Gegenwart von Aminosäuren, die eine β-Schleife oder ein β-Faltblatt einführen, oder das z.B. durch die Gegenwart von Disulfid-gebundenen Cys-Resten zyklisiert ist) oder nicht eingeschränkte (z.B. lineare) Aminosäuresequenzen von weniger als etwa 50 Aminosäureresten und vorzugsweise weniger als etwa 40 Aminosäureresten. Unter den Peptidliganden mit weniger als etwa 40 Aminosäureresten sind Peptidliganden von zwischen etwa 10 und etwa 30 Aminosäureresten und insbesondere die Peptidliganden von etwa zwischen 20 bis etwa 30 Aminosäureresten bevorzugt. Jedoch wird der geübte Fachmann nach dem Lesen der vorliegenden Offenbarung erkennen, dass es nicht die Länge eines bestimmten Peptidliganden, sondern seine Fähigkeit zur Bindung von ErbB2 ist, die den Peptidliganden der vorliegenden Erfindung hervorhebt. Daher sind Peptidliganden von 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 Aminosäureresten mit gleicher Wahrscheinlichkeit Peptidliganden im Kontext der vorliegenden Erfindung.
  • Ein Peptidligand der vorliegenden Erfindung wird ErbB2 mit ausreichender Affinität und Spezifität binden, wenn der Peptidligand ErbB2, wie z.B. eine ErbB2-tragende Zelle, in vitro und vorzugsweise in vivo „anpeilt", „bindet" oder darauf „abzielt" (siehe beispielsweise die Verwendung der Ausdrücke „anpeilen" („homes to", „homing") und „abzielen auf" („targets") in Pasqualini und Ruoslahti, Nature 380, 364–366 (1996), und Arap et al., Science 279, 377–380 (1998)). Im Allgemeinen wird der Peptidligand ErbB2 mit einer Affinität von weniger als etwa 1 μM, vorzugsweise weniger als etwa 100 nM und bevorzugter weniger als etwa 10 nM, binden, wie durch einen In-vitro-Test, wie z.B. einen Konkurrenztest unter Verwendung eines ErbB-Substrats, das zu jenen von Jones et al., FEBS Letters 447, 227–231 (1999), beschriebenen analog ist, ermittelt werden kann. Jedoch sind Peptidliganden mit einer Affinität von weniger als etwa 1 nM und vorzugsweise zwischen etwa 1 pM und 1 nM für ErbB2 mit gleicher Wahrscheinlichkeit Peptidliganden im Kontext der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen kann ein Peptidligand, der ErbB2 wie oben beschrieben bindet, durch jegliche einer Anzahl von Standardtechniken auf dem Gebiet der Erfindung wie hierin beschrieben, wie z.B. durch Bindung eines immobilisierten ErbB2-Moleküls, isoliert und identifiziert werden.
  • Wie erwähnt sind Peptidliganden wie oben beschriebene Aminosäuresequenzen, die natürlich vorkommende sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurenreste enthalten können. Daher können so genannte „Peptid-Mimetika" und „Peptid-Analoga", die chemische Nicht-Aminosäurestrukturen umfassen können, die die Struktur einer bestimmten Aminosäure oder eines bestimmten Peptids nachahmen, Peptidliganden im Kontext der Erfindung sein. Derartige Mimetika oder Analoga sind im Allgemeinen dahingehend gekennzeichnet, dass sie ähnliche physikalische Eigenschaften, wie z.B. Größe, Ladung oder Hydrophobie, in der geeigneten räumlichen Ausrichtung aufweisen, wie sie sich in ihren Peptidgegenstücken finden. Ein konkretes Beispiel einer mimetischen Peptidverbindung ist eine Verbindung, bei der die Amidbindung zwischen einer oder mehreren der Aminosäuren beispielsweise durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder eine andere Bindung ersetzt ist, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt ist (siehe beispielsweise Sawyer, in: Peptide Based Drug Design, ACS, Washington DC, S. 378–422 (1995)).
  • Daher wird der Ausdruck „Aminosäure" im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in seinem weitesten Sinne verwendet und umfasst natürlich vorkommende L-α-Aminosäuren oder -Reste. Die herkömmlich verwendeten Ein- und Dreibuchstabenabkürzungen für natürlich vorkommende Aminosäuren werden hierin verwendet (A. L. Lehninger, Biochemistry, 2. Auflage, Worth Publishers, New York, S. 71–92 (1975)). Der Ausdruck umfasst D-Aminosäuren sowie chemisch modifizierte Aminosäuren, wie z.B. Aminosäureanaloga, natürlich vorkommende Aminosäuren, die üblicherweise nicht in Proteine eingebaut werden, wie z.B. Norleucin, und chemisch synthetisierte Verbindungen, die Eigenschaften aufweisen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekanntermaßen für eine Aminosäure charakteristisch sind. Zum Beispiel sind Analoga und Mimetika von Phenylalanin oder Prolin, die dieselbe Konformationseinschränkung der Peptidverbindungen wie natürliches Phe oder Pro ermöglichen, in der Definition von Aminosäure umfasst. Derartige Analoga und Mimetika werden hierin als „funktionelle Äquivalente" einer Aminosäure bezeichnet. Andere Beispiele von Aminosäuren werden von Roberts und Vellaccio aufgezählt (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross und Meiehofer (Hrsg.), Bd. 5, Academic Press, Inc., N.Y., S. 341 (1983)).
  • Peptidliganden, die beispielsweise durch standardmäßige Festphasensynthesetechniken synthetisiert werden, sind nicht auf von Genen kodierte Aminosäuren eingeschränkt. Üblicherweise angetroffene Aminosäuren, die nicht vom genetischen Code kodiert werden, umfassen beispielsweise jene, die in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 90/01940 beschrieben sind, wie z.B. 2-Aminoadipinsäure (Aad) für Glu und Asp; 2-Aminopimelinsäure (Amp) für Glu und Asp; 2-Aminobuttersäure (Abu) für Met, Leu und andere aliphatische Aminosäuren; 2-Aminoheptansäure (Ahe) für Met, Leu und andere aliphatische Aminosäuren; 2-Aminoisobuttersäure (Aib) für Gly; Cyclohexylalanin (Cha) für Val und Leu und Ile; Homoarginin (Har) für Arg und Lys; 2,3-Diaminopropionsäure (Dpr) für Lys, Arg und His; N-Ethylglycin (EtGly) für Gly, Pro und Ala; N-Ethylglycin (EtGly) für Gly, Pro und Ala; N-Ethylasparigin (EtAsn) für Asn und Gln; Hydroxyllysin (Hyl) für Lys; Allohydroxyllysin (AHyl) für Lys; 3-(und 4-)Hydroxyprolin (3Hyp, 4Hyp) für Pro, Ser und Thr; Allo-Isoleucin (Alle) für Ile, Leu und Val; ρ-Amidinophenylalanin für Ala; N-Methylglycin (MeGly, Sarcosin) für Gly, Pro und Ala; N-Methylisoleucin (Melle) für Ile; Norvalin (Nva) für Met und andere aliphatische Aminosäuren, Norleucin (Nle) für Met und andere aliphatische Aminosäuren; Ornithin (Orn) für Lys, Arg und His; Citrullin (Cit) und Methioninsulfoxid (MSO) für Thr, Asn und Gln; N-Methylphenylalanin (MePhe), Trimethylphenlyalanin, Halogen-(F-, Cl-, Br- und I-)Phenylalanin, Trifluorylphenylalanin für Phe.
  • Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung sind in Tabelle 1 unter der Überschrift „beispielhafte Substitutionen" und „bevorzugte Substitutionen" dargestellt. Falls bevorzugte Substitutionen nicht in einer Verminderung oder Veränderung der HER2-Bindung resultieren, können substantiellere Veränderungen, die in Tabelle 1 als „beispielhafte Substitutionen" bezeichnet oder hierin weitergehend beschrieben sind, eingeführt und die Produkte auf HER2-Bindung getestet werden.
  • Tabelle 1
    Figure 00150001
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung liegende Peptidliganden sind vorzugsweise nicht-natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen. Unter nicht-natürlich vorkommend wird verstanden, dass die Aminosäuresequenz des jeweiligen Peptidliganden sich nicht in der Natur findet. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird „nicht-natürlich auftretend" verwendet, um sich auf einen Peptidliganden zu beziehen, der einer nicht-nativen oder nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz entspricht. Peptidliganden dieser Art können unter Anwendung einer Auswahl an Techniken hergestellt oder ausgewählt werden, die dem geübten Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können eingeschränkte oder uneingeschränkte Peptidbibliotheken randomisiert erzeugt und an einem Phagen präsentiert werden, wobei Standardtechniken auf dem Gebiet der Erfindung eingesetzt werden (beispielsweise Lowman et al., Biochemistry 37, 8870–8878 (1998)).
  • Zumindest drei unterschiedliche Spezies von Peptidliganden können auf Basis der mit ErbB2-Bindung assoziierten Funktion unterschieden werden. Sie werden hierin als „neutrale", „Agonisten"- und „Antagonisten"-Peptidliganden bezeichnet. Im Allgemeinen ist die Funktion eines neutralen Peptidliganden die oben beschriebene Bindung von ErbB2. Neutrale Peptidliganden sind in Aspekten der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wo das Abzielen auf einen bestimmten, ErbB2 tragenden Zelltyp mit beispielsweise einem zytotoxischen Mittel oder einem Enzym erwünscht ist.
  • Im Allgemeinen hat ein „Agonisten"-Peptidligand zusätzlich zur Bindung von ErbB2 eine direkte Wirkung auf eine ErbB2-tragende Zelle. Vorzugsweise wird der Agonisten-Peptidligand ErbB2 wie beschrieben binden sowie ein Ereignis auslösen oder vermitteln, das mit dem ErbB2-ErbB3-Proteinkomplex und/oder dem ErbB2-ErbB4-Proteinkomplex in Verbindung steht, wie z.B. die Fähigkeit, die intrazelluläre Kinasedomäne zu veranlassen, Tyrosinreste im ErbB2-Rezeptorkomplex zu phosphorylieren. Zusätzlich kann die Bindung des Agonisten-Peptidliganden mit der Dimerisierung des ErbB2-Rezeptors verbunden sein. Die Fähigkeit, ErbB2-Rezeptorvermittelte Phosphorylierung oder ErbB2-Rezeptor-Dimerisierung auszulösen, kann unter Verwendung von Standardtechniken auf dem Gebiet der Erfindung, wie z.B. Tyrosinphosphorylierungstests und SDS-PAGE, quantifiziert werden.
  • Im Gegensatz dazu ist die Funktionsweise eines „Antagonisten"-Peptidliganden, die mit einer natürlichen Ligandenbindung des ErbB2-ErbB3-Proteinkomplexes und/oder ErbB2-ErbB4-Proteinkomplexes assoziierte Aktivität zu vermindern, beispielsweise die von der Bindung des nativen Liganden ausgelöste Zellreaktion, beispielsweise durch Bindung an den oder Blockierung der Assoziation von ErbB2-ErbB3-Proteinkomplex und/oder ErbB2-ErbB4-Proteinkomplex mit einem nativen oder natürlich vorkommenden Liganden.
  • Jedoch sind die vorangehenden Klassen nicht einschränkend. Beispielweise bewirkt die Bindung eines Peptidliganden in bestimmten Ausführungsformen die Internalisierung des ErbB2-Rezeptors oder die Auslösung von assoziierten Zellereignissen, wie z.B. die Auslösung von programmiertem Zelltod oder Apoptose. Peptidliganden, die die Internalisierung von ErbB2 oder ErbB2-Rezeptorkomplex auslösen, sind besonders bei Ausführungsformen der Erfindung zweckdienlich, die die intrazelluläre Abgabe eines beschriebenen zytotoxischen Mittels erfordern, wie hierin unten beschrieben wird.
  • Die Phrase „löst Apoptose aus" oder „fähig zur Auslösung von Apoptose" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Verbindung, programmierten Zelltod auszulösen, der durch die Bindung von Annexin V, Fragmentierung von DNA, Zellschrumpfung, Dilatation des endoplasmatischen Retikulums, Zellfragmentierung und/oder Bildung von Membranvesikeln (Apoptosekörperchen genannt) gemessen wird. Die Zelle ist eine, die den ErbB2-Rezeptor exprimiert oder überexprimiert. Vorzugsweise ist die „Zelle" eine Tumorzelle, z.B. eine Brust-, Eierstock-, Magen-, Endometrium-, Speicheldrüsen-, Lungen-, Nieren-, Kolon-, Schilddrüsen-, Pankreas- oder Blasenzelle. In vitro kann die Zelle eine SKBR3-, BT474-, Calu-3-Zelle, MDA-MB-453-, MDA-MB-361- oder SKOV3-Zelle sein. Es sind verschiedene Verfahren zur Beurteilung der mit Apoptose verbundenen Zellereignisse verfügbar. Zum Beispiel kann Phosphatidylserin-(PS-)Translokation durch Annexin-Bindung gemessen werden; DNA-Fragmentierung kann durch „DNA-Laddering" beurteilt werden; und Kern/Chromatin-Kondensation zusammen mit DNA-Fragmentierung kann durch jegliche Zuname hypodiploider Zellen beurteilt werden. Vorzugsweise ist die Apoptose auslösende Verbindung eine, die in einer etwa 2- bis 50fachen, vorzugsweise etwa 5- bis 50fachen und insbesondere bevorzugt etwa 10- bis 50fachen, Induktion der Annexinbindung im Vergleich zu unbehandelten Zellen in einem Annexinbindungstest unter Verwendung von BT474-Zellen resultiert.
  • „Heregulin" (HRG) bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein Polypeptid, das die ErbB2-ErbB3- und ErbB2-ErbB4-Proteinkomplexe aktiviert (d.h. bei der Bindung daran die Phosphorylierung von Tyrosinresten im Komplex induziert). Verschiedene, von diesem Ausdruck umfasste Polypeptide sind beispielsweise in Jones et al., FEBS Letters 447, 227–231 (1999); Holmes et al., Science 256, 1205–1210 (1992); WO 92/20798; Wen et al., Mol. Cell. Biol. 14(3), 1909–1919 (1994); und Marchionni et al., Nature 362, 312–318 (1993), offenbart. Der Ausdruck umfasst biologisch aktive Fragmente und/oder Varianten natürlich vorkommender HRG-Polypeptide, wie z.B. ein Fragment einer EGF-ähnlichen Domäne davon (z.B. HRGβ1177-244).
  • Der „ErbB2-ErbB3-Proteinkomplex" und „ErbB2-ErbB4-Proteinkomplex" sind nicht-kovalent assoziierte Oligomere des ErbB2-Rezeptors und des ErbB3-Rezeptors bzw. ErbB4-Rezeptors. Die Komplexe bilden sich an einer Zelle, die beide dieser Rezeptoren exprimiert, und können durch Immunpräzipitation isoliert und mittels SDS-PAGE analysiert werden, wie in Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20), 14661–14665 (1994), beschrieben ist.
  • Der Ausdruck „Multimerisierungsdomäne", wie er in bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf den Abschnitt des Moleküls, an den der Peptidligand entweder direkt oder über eine „Linkerdomäne" gebunden wird. Die Multimerisierungsdomäne ist eine Aminosäuredomäne, die gemäß bevorzugten Ausführungsformen die Wechselwirkung von zwei oder mehreren Multimerisierungsdomänen erleichtert. Während die Multimerisierungsdomäne die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Multimerisierungsdomänen fördert, besteht keine Notwendigkeit im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass der an eine Multimerisierungsdomäne gebundene Peptidligand als ein Abschnitt eines Multimers vorliegt.
  • Die Multimerisierungsdomäne kann ein Polypeptid sein, das die stabile Wechselwirkung von zwei oder mehreren Multimerisierungsdomänen fördert. Beispielhaft und nicht einschränkend kann eine Multimerisierungsdomäne eine Immunglobulinsequenz, wie z.B. eine konstante Immunglobulinregion, ein Leucin-Zipper, eine hydrophobe Region, eine hydrophile Region, ein Polypeptid, das ein freies Thiol umfasst, das eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen zwei oder mehreren Multimerisierungsdomänen bildet, oder beispielsweise eine „Protuberance-intro-cavity"-Domäne sein, die im US-Patent Nr. 5.731.168 beschrieben wird. In diesem Patent werden Protuberanzen konstruiert, indem kleine Aminosäureseitenketten aus der Schnittstelle eines ersten Polypeptids durch eine größere Seitenkette (zum Beispiel ein Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt werden. Ausgleichende Hohlräume identischer oder ähnlicher Größe wie die Protuberanzen werden gegebenenfalls an der Schnittstelle eines zweiten Polypeptids erzeugt, indem große Aminosäureseitenketten durch kleinere (zum Beispiel Alanin oder Threonin) ersetzt werden.
  • In einem bevorzugten Aspekt stellt die Multimerisierungsdomäne jenen Abschnitt des Moleküls bereit, der die stabile Wechselwirkung der beiden oder mehrerer Multimerisierungsdomänen fördert oder ermöglicht und die Bildung von Dimeren und anderen Multimeren aus monomeren Multimerisierungsdomänen fördert oder ermöglicht. Vorzugsweise sind Multimerisierungsdomänen nach diesem Aspekt der Erfindung Immunglobulinkonstantregiondomänen. Konstante Immunglobulindomänen bieten den Vorteil der Verbesserung der In-vivo-Zirkulationshalbwertszeit der Verbindungen der Erfindung und ermöglichen dem geübten Fachmann gegebenenfalls die Inkorporation einer hierin beschriebenen „Effektorfunktion" in gewisse Aspekte der Erfindung.
  • In der gesamten vorliegenden Patentbeschreibung und in allen Ansprüchen ist die Nummerierung der Reste in einer Immunglobulinschwerkette jene des EU-Index wie in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Der „EU-Index wie in Kabat et al." bezieht sich auf die Restenummerierung des menschlichen IgG1-EU-Antikörpers.
  • „Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine mit denselben Struktureigenschaften. Während Antikörper eine Bindungsspezifität gegen ein spezifisches Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere antikörperähnliche Moleküle, denen Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden zum Beispiel in niedrigen Ausmaßen vom Lymphsystem und in erhöhten Ausmaßen von Myelomen produziert.
  • „Antikörper" und „Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten zusammengesetzt sind. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, während die Anzahl von Disulfidbindungen unter den Schwerketten verschiedener Immunglobulinisotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist außerdem in regelmäßigen Abständen befindliche Intraketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist eine Amino-(N-)terminale variable Domäne (VH) auf, gefolgt von carboxy-(C-)terminalen konstanten Domänen. Jede Leichtkette weist eine variable N-terminale Domäne (VL) und eine C-terminale konstante Domäne auf; die konstante Domäne der Leichtkette (CL) ist an der ersten konstanten Domäne (CH1) der Schwerkette ausgerichtet, und die variable Domäne der Leichtkette ist an der variablen Domäne der Schwerkette ausgerichtet. Gemäß der Domänendefinition der Immunglobulinpeptidketten weisen Leicht-(L-)Ketten zwei konformer ähnliche Domänen VL und CL auf; und Schwerketten weisen vier Domänen (VH, CH1, CH2 und CH3) auf, wobei jede eine Intraketten-Disulfidbrücke aufweist.
  • In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten (C-) Domäne der Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Die Immunglobulinklasse kann weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2. Die konstanten Domänen der Schwerkette, die den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, sind α-, δ-, ε-, γ- bzw. μ-Domänen. Die Leichtketten von Antikörpern jeglicher Vertebratenspezies können einer von zwei unterschiedlichen Typen zugeordnet werden, die auf Basis der Aminosäuresequenz ihrer konstanten Domänen Kappa (κ) oder (λ) genannt werden. Sequenzuntersuchungen haben gezeigt, dass die μ-Kette von IgM fünf Domänen, VH, CHμ1, CHμ2, CHμ3 und CHμ4, enthält. Die Schwerkette von IgE (ε) enthält ebenfalls fünf Domänen.
  • Die Untereinheitenstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen verschiedener Klassen von Immunglobulinen sind wohlbekannt. Von diesen sind IgA und IgM polymer, und jede Untereinheit enthält zwei Leicht- und zwei Schwerketten. Die Schwerkette von IgG (γ) enthält einen Abschnitt einer Polypeptidkette, die zwischen den CHγ1- und CHγ2-Domänen liegt und als Gelenksregion bekannt ist. Die α-Kette von IgA weist eine Gelenksregion auf, die eine O-gebundene Glykosylierungsstelle enthält, und die Gelenksregion der μ- und ε-Ketten weisen keine Sequenz auf, die zur Gelenksregion der γ- und α-Ketten analog ist, enthalten jedoch eine vierte konstante Domäne, die in den anderen fehlt. Die Domänenzusammensetzung von Immunglobulinketten kann wie folgt zusammengefasst werden:
    Leichtkette λ = Vλ Cλ
    κ = Vκ Cκ
    Schwerkette IgG(γ) = VH CHγ1, Gelenk CHγ2 CHγ3
    IgM(μ) = VH CHμ1 CHμ2 CHμ3 CHμ4
    IgA(α) = VH CHα1 Gelenk CHα2 CHα3
    IgE(ε) = VH CHε1 CHε2 CHε3 CHε4
    IgD(δ) = VH CHδ1 Gelenk CHδ2 CHδ3
  • Die „CH2-Domäne" einer menschlichen IgG-Fc-Region (auch als „Cγ2"-Domäne bezeichnet) erstreckt sich üblicherweise etwa von der Aminosäure 231 bis etwa zur Aminosäure 340. Die CH2-Domäne ist dahingehend einzigartig, als dass sie nicht mit einer weiteren Domäne eng gepaart ist. Stattdessen sind zwei N-gebundene ver zweigte Kohlenhydratketten zwischen die beiden CH2-Domänen eines intakten nativen IgG-Moleküls eingeschoben.
  • Die „CH3-Domäne" umfasst den Abschnitt von Resten C-terminal zu einer CH2-Domäne in einer Fc-Region (d.h. etwa von Aminosäurerest 341 bis etwa zu Aminosäurerest 447 eines IgG).
  • „Gelenksregion" ist im Allgemeinen als Abschnitt definiert, der sich von Glu216 bis Pro230 von menschlichem IgG1 erstreckt (Burton, Molec. Immunol. 22, 161–206 (1985)). Gelenksregionen aus anderen IgG-Isotypen können an der IgG1-Sequenz ausgerichtet werden, indem die ersten und letzten Cysteinreste, die die Interschwerketten-S-S-Bindungen ausbilden, an denselben Positionen platziert werden.
  • Die „untere Gelenksregion" einer Fc-Region ist normalerweise als der Abschnitt von Resten unmittelbar C-terminal zur Gelenksregion definiert, das sind die Reste 233 bis 239 der Fc-Region.
  • Der Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische antigenbindende Fragmente, die „Fab"-Fragmente oder -Regionen genannt werden, jede mit einer einzigen Antigenbindungsstelle, und ein(e) restliche(s) „Fc"-Fragment oder -Region (1). Obgleich die Abgrenzungen der Fc-Region einer Immunglobulinschwerkette variieren können, ist die menschliche IgG-Schwerketten-Fc-Region üblicherweise als der Abschnitt definiert, der sich von einem Aminosäurerest an Position Cys226 oder von Pro230 zum Carboxylterminus davon erstreckt. Die Fc-Region eines Immunglobulins umfasst in Allgemeinen zwei konstante Domänen, CH2 und CH3, wie beispielsweise in 1 dargestellt ist. Eine „native Fc-Regionsequenz" umfasst eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz einer sich in der Natur findenden Fc-Region identisch ist. Sequenzen nativer menschlicher Fc-Regionen sind in 2 und 3 dargestellt und umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die menschliche IgG1-Fc-Region (Nicht-A- und A-Allotypen); menschliche IgG2-Fc-Region; menschliche IgG3-Fc-Region; und menschliche IgG4-Fc-Region sowie na türlich vorkommende Varianten davon. Sequenzen nativer muriner Fc-Regionen sind in 2A dargestellt.
  • Pepsinbehandlung liefert ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und nach wie vor in der Lage ist, Antigen zu vernetzen. Das Fab-Fragment enthält die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxylterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich einem oder mehreren Cysteinen aus der Antikörpergelenksregion. Fab'-SH ist die Bezeichnung hierin für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe trägt/tragen. F(ab')2-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere chemische Bindungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
  • Eine „funktionelle Fc-Region" besitzt eine „Effektorfunktion" einer nativen Fc-Region. Beispielhafte „Effektorfunktionen" umfassen Clq-Bindung; komplementabhängige Zytotoxizität; Fc-Rezeptor-Bindung; antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC); Phagozytose; Herabregulierung von Zelloberflächenrezeptoren (z.B. B-Zellen-Rezeptor) usw. Derartige Effektorfunktionen erfordern im Allgemeinen, dass die Fc-Region mit einer Bindungsdomäne (z.B. einem Peptidliganden) kombiniert wird, und können unter Verwendung von verschiedenen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Tests festgestellt werden.
  • Durch Einführen der geeigneten Aminosäuresequenzmodifizierungen in eine elterliche oder native Fc-Region kann man eine Varianten-Fc-Region erzeugen, die (a) antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) in Gegenwart von menschlichen Effektorzellen effektiver vermittelt und/oder (b) an Fc-Gamma-Rezeptor (FcγR) mit besserer Affinität als das elterliche Polypeptid bindet. Derartige Fc-Region-Varianten werden im Allgemeinen zumindest eine Aminosäuremodifikation in der Fc- Region umfassen. Die Varianten-Fc-Region kann zwei, drei, vier, fünf usw. in ihr befindliche Substitutionen umfassen.
  • Mehrere Antikörpereffektorfunktionen werden von Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt, die die Fc-Region eines Antikörpers binden. FcRs sind durch ihre Spezifität für Immunglobulin-Isotypen definiert; Fc-Rezeptoren für IgG-Antikörper werden als FcγR, für IgE als FcεR, für IgA als FcαR und so weiter bezeichnet. Drei Unterklassen von FcγR sind identifiziert worden: FcγR I (CD64), FcγR II (CD32) und FcγR III (CD16). Da jede FcγR-Unterklasse von zwei oder drei Genen kodiert wird und alternatives RNA-Splicing zu mehreren Transkripten führt, existiert eine breite Vielfalt an FcγR-Isoformen. Diese unterschiedlichen FcR-Untertypen werden auf verschiedenen Zelltypen exprimiert (im Überblick beschrieben von Ravetch und Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 457–492 (1991)). Beispielsweise findet sich FcγRIIIB in Menschen nur auf Neutrophilen, wogegen sich FcγRIIIA auf Makrophagen, Monozyten, natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und einer Subpopulation von T-Zellen findet. Bemerkenswerterweise ist FcγRIIIA das einzige FcR, das auf NK-Zellen vorhanden ist, einem der Zelltypen, die mit ADCC in Verbindung stehen.
  • Die Bindungsstellen für FcγR an menschlichen und murinen Antikörpern sind vorher an der unteren Gelenksregion kartiert worden (Reste 233–239: EU-Indexnummerierung wie in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Woof et al., Molec. Immunol. 23, 319–330 (1986); Duncan et al., Nature 332, 563 (1988); Canfield und Morrison, J. Exp. Med. 173, 1483–1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9036–9040 (1991).
  • „Clq" ist ein Polypeptid, das eine Bindungsstelle für die Fc-Region eines Immunglobulins umfasst. Clq zusammen mit zwei Serinproteasen, Clr und Cls, bildet den Komplex C1, die erste Komponente des komplementabhängigen Zytotoxizitäts-(CDC-)Stoffwechselwegs.
  • „Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität" und „ADCC" beziehen sich auf eine zellvermittelte Reaktion, bei der nicht-spezifische zytotoxische Zellen, die FcRs exprimieren (z.B. natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Neutrophile und Makrophagen), gebundenen Antikörper auf einer Zielzelle erkennen und anschließend die Lyse der Zielzelle bewirken. Die Primärzellen zur Vermittlung von ADCC, NK-Zellen, exprimieren ausschließlich FcγRIII, wogegen Monozyten FcγRI, FcγRII und FcγRIII exprimieren. FcR-Expression auf hämatopoetischen Zellen wird in Tabelle 3 und auf Seite 464 von Ravetch und Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 457–92 (1991), zusammengefasst.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Salvage-Rezeptorbindungsligand" auf einen Liganden der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z.B. IgG, IgG2, IgG3 oder IgG4), der für die Erhöhung der In-vivo-Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist (US-Patent Nr. 5.739.277, ausgegeben am 14. April 1998).
  • „Behandlung" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die die Störung bereits aufweisen, sowie jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
  • „Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifizierte Tier, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere, sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
  • Eine „Störung" ist jeglicher Zustand, der aus der Behandlung mit den die Peptidliganden der Erfindung umfassenden Zusammensetzungen Nutzen zieht. Dies umfasst chronische und akute Störungen oder Krankheiten, einschließlich jene pathologischen Leiden, die das Säugetier für die fragliche Störung empfänglich machen. Nichteinschränkende Beispiele von hierin zu behandelnden Störungen umfassen gutartige und bösartige Tumoren; Leukämien und Lymphmalignitäten; Neuronale, Glia-, Astrozyten-, Hypothalamus- und andere Glandula-, Makrophagen-, Epithel-, Stroma- und Blastozöl-Störungen; und entzündliche, angiogene und immunologische Störungen.
  • Die Ausdrücke „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen Plattenepithelkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkrebs, Einerstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, Brustkrebs, Kolonkrebs, kolorektales Karzinom, Endometriumkrebs, Speicheldrüsenkrebs, Nierenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkarzinom, Leberkarzinom und verschiedene Typen von Kopf- und Nackenkrebs.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „parenteral" auf die Einführung einer Verbindung der Erfindung in den Köper, die nicht über den Verdauungskanal erfolgt, und insbesondere auf intravenöse (i.v.), intraarterielle (i.a.), intraperitoneale (i.p.), intramuskuläre (i.m.), intraventrikuläre und subkutane (s.c.) Wege.
  • Ausführungsarten der Erfindung
  • Peptidliganden
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung liegende Peptidliganden binden ErbB2 in einem In-vitro-Test und weisen die folgende allgemeine Formel auf:
    Figure 00260001
    worin Xaa(1-14) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und vierzehn Aminosäuren umfasst; Xaa16 aus der aus Met, Thr, Cys und Ile bestehenden Gruppe ausgewählt und vorzugsweise Ile ist; Xaa(21-27) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und 7 Aminosäuren umfasst. Vorzugsweise wird der Peptidligand um die Bindung von ErbB2 in einem In-vitro-Test mit einem Peptidligand der folgenden Formel konkurrieren:
    Figure 00270001
    worin X(1-3) und X(17-20) unabhängig voneinander nicht vorhanden sind oder zwischen einer und drei bzw. einer und vier Aminosäuren aufweisen und Xaa1, Xaa2 und Xaa3 Aminosäuren sind. In bestimmten Ausführungsformen wird der Peptidligand der vorliegenden Erfindung mit jeglichem der in Seq.-ID Nr. 1 – Seq.-ID Nr. 44 und Seq.-ID Nr. 57 – Seq.-ID Nr. 69 dargestellten Peptidliganden, hierin beschrieben, und vorzugsweise mit Seq.-ID Nr. 14 um Bindung von ErbB2 konkurrieren.
  • Wie aus dem Vorangegangenen einzusehen ist, sind die Ausdrücke „konkurrieren" und „Fähigkeit zu konkurrieren" relative Ausdrücke. Folglich beziehen sich die Ausdrücke bei Verwendung zur Beschreibung der Peptidliganden der vorliegenden Erfindung auf Peptidliganden, die eine 50%ige Hemmung der Bindung von beispielsweise Seq.-ID Nr. 14 hervorrufen, wenn sie in einer Konzentration von 50 μM, vorzugsweise 1 μM, bevorzugter 100 μM und vorzugsweise 1 nM und weniger, in einem hierin beschriebenen Standardkonkurrenztest zugegen sind. Derartige Peptidliganden werden im Allgemeinen ErbB2 mit einer Affinität von weniger als etwa 1 μM, vorzugsweise weniger als etwa 100 nM und bevorzugter weniger als etwa 10 nM, binden, wie durch einen Standardkonkurrenztest wie z.B. jenem ermittelt wird, der in den Beispielabschnitten beschrieben ist. Jedoch sind Peptidliganden mit einer Affinität für ErbB2 von weniger als etwa 1 nM und vorzugsweise zwischen etwa 1 pM und 1 nM mit gleicher Wahrscheinlichkeit Peptidliganden im Kontext der vorliegenden Erfindung.
  • Für In-vitro-Testsysteme zur Ermittlung, ob eine Verbindung mit einem oben beschriebenen Peptidliganden konkurriert oder die Fähigkeit hat, zu konkurrieren, kann der geübte Fachmann einen beliebigen einer Anzahl von Standardkonkurrenztests einsetzen. Derartige Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kompetitive Testsysteme unter Verwendung von Techniken, wie z.B. Radioimmuntests, Enzymimmuntests (EIA), vorzugsweise den Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA), „Sandwich"-Immuntests, immunoradiometrische Tests, Fluoreszenzimmuntests und Immunoelektrophoresetests, um einige wenige zu benennen.
  • Beispielhaft und nicht einschränkend kann ein ELISA-Test durchgeführt werden, worin Mikrotiterplatten (zum Beispiel 96-Well-Platten Nunc MaxisorpTM, Inter Med, Dänemark) mit HER2-ECD in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 9,3, unter Verwendung von 5 μg/ml über Nacht bei 4°C beschichtet werden. Wells können unter Verwendung von PBS, das 1% BSA enthält (PBS-BSA), 1 h lang bei 25°C blockiert werden. Kandidat-Peptidliganden werden in PBS-BSA titriert und auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von Peptid 1.1.FI (Seq.-ID Nr. 14), hergestellt als Z-Fusionsprotein (1.1.FI-Z) wie hierin beschrieben und biotinyliert (1.1.FI-Zb), an immobilisierte HER2-ECD zu blockieren. Nach einer Inkubation von etwa 1 Stunde wird die Platte mit PBS-TWEEN gewaschen, und es wird Streptavidin-HRP für etwa 30 Minuten zugegeben. Die Platten werden wiederum mit PBS-TWEEN gewaschen, und die gebundene HRP wird unter Verwendung von ABTS/H2O2-Substrat getestet. Die Änderung der Absorption bei 405 nm wird aufgezeichnet. Die Absorptionsabnahme wird gegen die Probenkonzentration aufgetragen und eine IC50 für jeden Kandidat-Peptidliganden ermittelt.
  • Wie vorhin angemerkt, sind bevorzugte Peptidliganden der vorliegenden Erfindung nicht-natürlich vorkommende Peptidliganden von zwischen 10 und 30 Aminosäureresten und vorzugsweise etwa 20 Aminosäureresten. Besonders bevorzugte oben beschriebene Peptidliganden bestehen aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und können unter Anwendung standardmäßiger rekombinanter und synthetischer Techniken erzeugt werden, die dem geübten Fachmann wohlbekannt sind.
  • Bevorzugte Peptidliganden weisen die folgende allgemeine Formel auf:
    Figure 00280001
    worin X(1-7) und Xaa(14-20) unabhängig voneinander nicht vorhanden sind oder zwischen einer und sieben Aminosäuren aufweisen und Xaa9 eine aus der aus Met, Ile und Thr bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure und vorzugsweise Ile ist.
  • Bevorzugter gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind Peptidliganden, die die folgende bevorzugte Formel ausweisen:
    Figure 00290001
    worin Xaa(1-3)- nicht vorhanden ist oder zwischen einer und drei Aminosäuren aufweist, Xaa5 eine Aminosäure ist, Xaa13 eine Aminosäure ist, Xaa14 eine Aminosäure ist und -Xaa(17-20) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und vier Aminosäuren aufweist. Beispielhafte Peptidliganden gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind Peptidliganden, worin X(1-3)- nicht vorhanden ist oder aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Gln-Arg-Asn-, Leu-Ser-Pro-, Glu-Asn-Trp-, Ala-Ser-His-, Lys-Leu-Asn-, Thr-Gln-Ala-, Ala-Pro-Arg-, Gln-Val-Tyr-, Arg-Thr-Glu-, Phe-Ala-Gly-, Thr-Ala-Arg-, Arg-Pro-His-, Asn-Val-Cys-, Cys-Ile-Asp-, Tyr-Glu-Trp-, Arg-Trp-Asp-, His-Trp-Met-, Asn-Trp-Pro-, Phe-Asn-Trp-, Phe-Ser-Gly-, Gly-Gly-Trp-, Leu-Trp-Phe-, Gly-Ile-Pro-, Trp-Trp-Thr-, Leu-Gly-Trp-, Ser-Pro-Trp-, Arg-Gly-Trp-, Tyr-Glu-Phe-, Tyr-Glu-Gly-, Tyr-Glu-Val-, Tyr-Ser-Phe-, Tyr-Asp-Phe-, Asp-Glu-Val-, Ser-Glu-Val-, Phe-Glu-Phe- und His-Asp-Val-; Xaa5 aus der aus Ala, Thr, Met, Val, Arg, Glu, Asp, Ser, Gln, Pro, Gly, Phe und Lys bestehenden Gruppe gewählt ist; Xaa14 aus der aus Glu, Lys, Arg, Asp, Ser, Ala, Asn, Thr, Gly, Pro, Val und Gln bestehenden Gruppe gewählt ist, Xaa5 aus der aus Met, Phe, Ala, Cys, Gln, Glu, Trp, Leu, Val, Tyr, Thr, Ser und Asn bestehenden Gruppe gewählt ist und -Xaa(17-20) ein aus vier Aminosäuren bestehendes Peptid mit den folgenden beispielhaften Sequenzen ist:
  • Figure 00290002
  • Figure 00300001
  • Vorzugsweise ist -Xaa(17-20) ein Peptid mit vier Aminosäuren mit der folgenden Formel:
  • Figure 00300002
  • Beispielhafte Peptidliganden gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind Peptidliganden, worin -Xaa(17-20) aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe gewählt ist:
  • Figure 00300003
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung sind Peptidliganden, worin -Xaa(17-20) ein Peptid mit vier Aminosäuren mit der folgenden Formel ist:
    Figure 00310001
    worin Xaa18 eine Aminosäure und Xaa19 eine Aminosäure ist. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen beispielhafte Peptidliganden ein aus der folgenden Gruppe gewähltes -Xaa(17-20):
  • Figure 00310002
  • Beispielhafte Peptidliganden gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen:
    Figure 00310003
    Figure 00320001
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    einschließlich konservative Aminosäuresubstitutionen in den vorangegangenen beispielhaften Aminosäuresequenzen.
  • Weitere bevorzugte Peptidverbindungen haben außerdem die allgemeine Formel:
    Figure 00350001
    worin Xaa(1-10) nicht vorhanden ist oder zwischen 1 und 10 Aminosäuren aufweist, Xaa12 eine Aminosäure ist, Xaa14 eine Aminosäure ist, Xaa21 eine Aminosäure ist, Xaa22 eine Aminosäure ist, Xaa23 eine aus der aus Val und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist und Xaa(24-27) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und vier Aminosäuren aufweist. Vorzugsweise ist Xaa12 gemäß diesem Aspekt der Erfindung eine aus der aus Val, Leu, Ser, Trp bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; ist Xaa14 eine aus der aus Gln, Glu, Asp und His bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; ist Xaa21 eine aus der aus Gly und Glu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; ist Xaa22 eine aus der aus Trp, Leu und Phe bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure und ist Xaa23 Val.
  • Bevorzugte Peptidliganden gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen jene, worin Xaa(1-10) 10 Aminosäuren umfasst und die folgende Formel aufweist:
    Cys-Xaa(2-7)-Cys-Xaa9-Gly- und worin Xaa(24-27) vier Aminosäuren umfasst und die folgende Formel aufweist:
    Xaa(24-26)-Cys und worin Xaa(2-7) sechs Aminosäuren und Xaa(24-26) 3 Aminosäuren aufweist.
  • Bevorzugt gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind Peptidliganden, worin Xaa(1-10) die folgende Formel aufweist:
    Cys-Xaa2-Trp-Val-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa9-Gly- (Seq.-ID Nr. 127), worin Xaa2 eine aus der aus Ala und Ser bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist, Xaa5 eine aus der aus Ser, Leu, Ala, Ar und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist, Xaa6 eine aus der aus Phe, Val und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist, Xaa7 eine aus der aus Asp, Gln, Tyr, Trp, Leu und His bestehen den Gruppe ausgewählte Aminosäure ist und Xaa9 eine aus der aus Gly, Phe und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist.
  • Unter dieser Gruppe von Peptiden bevorzugt sind Peptidliganden, worin Xaa(1-10) die folgende Formel aufweist:
    Cys-Ala-Trp-Val-Leu-Xaa6-Xaa7-Cys-Gly-Gly- (Seq.-ID Nr. 128) und worin Xaa(24-26) die folgende Formel aufweist:
    Xaa24-Xaa25-Xaa26 und Xaa24 eine aus der aus Trp, Val, Gly und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure, vorzugsweise Val, ist; Xaa25 eine aus der aus Asn, Lys, Asp, Glu und His bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure, vorzugsweise Asn, ist und Xaa26 eine aus der aus Ala, Ser und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure, vorzugsweise Ala, ist.
  • Beispielhaft und nicht einschränkend sind die folgenden Peptidliganden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet:
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Peptidligandenkombinationen
  • A. Multimerisierungsdomänen
  • Die Peptidliganden können mit einer Multimerisierungsdomäne kombiniert werden, wodurch Hybridmoleküle bereitgestellt werden, die zumindest zwei unterschiedliche Domänen umfassen. Jedes Molekül umfasst eine Peptidligandendomäne und eine Multimerisierungsdomäne. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Peptidligandendomäne an eine Immunglobulin-Fc-Region, gegebenenfalls über eine flexible Linkerdomäne, gebunden werden.
  • Die Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung werden durch Kombinieren der Peptidliganden mit einer geeigneten Multimerisierungsdomäne konstruiert. Für gewöhnlich wird bei der Herstellung der Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung für den Peptidliganden kodierende Nucleinsäure operabel an Nucleinsäure gebunden, die für die Sequenz der Multimerisierungsdomäne kodiert. Typischerweise kodiert das Konstrukt für ein Fusionsprotein, worin der C-Terminus des Peptidliganden an den N-Terminus oder C-Terminus, vorzugsweise den C-Terminus, der Multimerisierungsdomäne gebunden ist. Jedoch sind Fusionen, wo beispielsweise der N-Terminus des Peptidliganden an den N-Terminus oder C-Terminus der Multimerisierungsdomäne gebunden ist, ebenfalls möglich.
  • Bevorzugte Multimerisierungsdomänen sind Sequenzen konstanter Immunglobulinregionen. Typischerweise wird in derartigen Fusionen das kodierte Hybridmolekül zumindest funktionell aktive Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette beibehalten. Fusionen werden außerdem beispielsweise an den C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zu CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen.
  • Die exakte Aminosäurestelle, an der die Fusion des Peptidliganden an die konstante Immunglobulindomäne vorgenommen wird, ist nicht entscheidend; spezielle Stellen sind wohlbekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften zu optimieren. Diesbezüglich möge sich der geübte Fachmann auf die Konstruktion verschiedener Immunoadhäsine beziehen, die in der Literatur beschrieben sind (US-Patent Nr. 5.116.964, 5.714.147 und 5.336.603; Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990); Watson et al., J. Cell Biol. 110, 2221–2229 (1990); Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991); Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991); Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569; Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991); Mohler et al., J. Immunol. 151, 1548–1561 (1993); Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991); Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992); Chalupny et al., PNAS USA 89, 10360–10364 (1992); Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstract-Nr. 1448 (1991)).
  • Gemäß einem speziellen Aspekt wird eine Immunglobulin-artige Multimerisierungsdomäne gewählt, um ein Multimer wie z.B. ein Dimer mit einem funktionellen Fc bereitzustellen. In bevorzugten Aspekten wird die Multimerisierungsdomäne gewählt, um eine Fc-Domäne bereitzustellen, die eine Effektorfunktion aufweist, die mit einer nativen Immunglobulin-Fc-Region in Zusammenhang steht. Daher wird der Peptidligand in gewissen Aspekten an eine konstante Domäne einer Immunglobulinschwer kette gebunden, um ein Multimer bereitzustellen, das eine funktionelle Fc-Domäne umfasst, die aufgrund einer gewissen Effektorfunktion oder gewisser Effektorfunktionen ausgewählt ist. In diesem Fall wird für eine Immunglobulinketten-Peptidligandensequenz kodierende DNA typischerweise mit der für ein zweites Peptidliganden-Immunglobulinschwerkettenfusionsprotein kodierenden DNA coexprimiert. Nach Sekretion wird die Hybridschwerkette kovalent verknüpft, um eine Immunglobulinähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei Disulfid-verbundene Immunglobulinschwerketten umfasst. Der geübte Fachmann wird anerkennen, dass Effektorfunktionen beispielsweise Clq-Bindung; komplementabhängige Zytotoxizität; Fc-Rezeptorbindung; antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC); Phagozytose; und Herunterregulierung von Zelloberflächenrezeptoren (z.B. B-Zellenrezeptor; BCR) und Verlängern der Halbwertszeit durch Inkorporation des Salvage-Rezeptor-Bindungsliganden umfassen, wie beispielsweise beschrieben im US-Patent Nr. 5.739.277, ausgegeben am 14. April 1998.
  • Vorzugsweise ist die Fc-Region eine menschliche Fc-Region, z.B. eine menschliche Fc-Region nativer Sequenz, menschliche IgG1- (A- und Nicht-A-Allotypen), IgG2-, IgG3- oder IgG4-Fc-Region. Derartige Sequenzen sind in den 2 und 3 dargestellt. Zusätzlich kann man durch Einführen der geeigneten Aminosäuresequenzmodifizierungen in eine elterliche Fc-Region eine Varianten-Fc-Region erzeugen, die (a) antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) in Gegenwart menschlicher Effektorzellen effektiver vermittelt und/oder (b) an Fc-Gamma-Rezeptor (FcR) mit besserer Affinität als die native Sequenz bindet. Derartige Fc-Region-Varianten werden im Allgemeinen zumindest eine Aminosäuremodifizierung in der Fc-Region umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Peptidligandensequenz an den N-Terminus der Fc-Region von Immunglobulin G1 (IgG1) fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Region der Schwerkette an die Peptidligandensequenz zu fusionieren. Jedoch werden bevorzugter eine Sequenz, die in der Gelenksregion unmittelbar stromauf der Papain-Spaltstelle beginnt, die IgG-Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Schwerkettenregion mit 114 ange nommen wird), oder analoge Stellen anderer Immunglobuline bei der Fusion verwendet. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird die Peptidligandenaminosäuresequenz an (a) die Gelenksregion (oder eine andere Linkerdomäne) und CH2 und CH3 oder (b) die CH1-, Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG-Schwerkette fusioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Peptidligandenaminosäuresequenz an (a) die Gelenksregion (oder eine andere Linkerdomäne) und (b) die CH3-Domäne eines IgG1 fusioniert (siehe beispielsweise die in Hu et al., Cancer Res. 56, 3055–3061 (1996), beschriebenen Konstrukte).
  • Hybridmoleküle, die einen Peptidliganden und eine Multimerisierungsdomäne umfassen, können als Multimere, zum Beispiel Homodimere oder Heterodimere oder sogar Heterotetramere, assembliert werden. Homodimere resultieren aus der Paarung oder Vernetzung von zwei Monomeren, die einen Peptidliganden und eine Multimerisierungsdomäne umfassen. Jedoch ist es nicht entscheidend, dass sich zwei identische Monomere paaren. Ein hierin definiertes Hybridmolekül, das einen Peptidliganden und eine Multimerisierungsdomäne, wie z.B. eine konstante Immunglobulindomäne, umfasst, kann sich mit einer Begleit-Immungobulinkette paaren, die einen Arm eines Immunglobulins umfasst. Verschiedene beispielhafte assemblierte Hybridmoleküle, die im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen, sind unten schematisch dargestellt:
    • (a) ACH
    • (b) ACH-ACH
    • (c) ACH-VHCH-VLCL
    • (d) ACH-VHCH
    worin jedes
    A
    identische oder verschiedene Peptidliganden darstellt;
    VL
    eine variable Immunglobulin-Leichtkettendomäne ist;
    VH
    eine variable Immunglobulin-Schwerkettendomäne ist;
    CL
    eine konstante Immunglobulin-Leichtkettendomäne ist und
    CH
    eine konstante Immunglobulin-Schwerkettendomäne ist.
  • Der Kürze halber zeigen die vorangehenden Strukturen nur Schlüsseleigenschaften; sie zeigen nicht optionale Linkerdomänen zwischen den Peptidligandendomänen und den Multimerisierungsdomänen, wie hierin unten beschrieben wird; sie bezeichnen weder Verbindungs-, Gelenks- oder andere Domänen der Immunglobuline, noch sind Disulfidbindungen gezeigt. Wo jedoch derartige Domänen für Bindungsaktivität erforderlich sind, werden sie so konstruiert, dass sie an den üblichen Stellen vorhanden sind, die sie in den Immunglobulinmolekülen belegen.
  • Obgleich die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette in den Hybridmolekülen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulinleichtkette vorhanden sein, die entweder kovalent an ein Peptidliganden-Immunglobulinschwerketten-Fusionspolypeptid assoziiert oder direkt an den Peptidliganden fusioniert ist. Im ersteren Fall wird für eine Immunglobulinleichtkette kodierende DNA typischerweise mit der für das Peptidliganden-Immunglobulinschwerketten-Fusionspolypeptid kodierenden DNA coexprimiert. Nach Sekretion werden die Hybridschwerkette und die Leichtkette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei Disulfid-verbundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst.
  • Die hierin beschriebenen Hybridmoleküle werden am zweckdienlichsten konstruiert, indem die für den Peptidligandenabschnitt kodierende cDNA-Sequenz In-frame an einer Immunglobulin-cDNA-Sequenz fusioniert wird. Jedoch kann eine Fusion an genomische Immunglobulinfragmente ebenfalls verwendet werden (siehe z.B. Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letztere Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen zur Expression. cDNAs, die für konstante IgG-Schwerkettenregionen kodieren, können auf Basis von veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken, die sich von Milz oder Peripherblutlymphozyten herleiten, durch Hybridisierungs- oder durch Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Techniken isoliert werden. Die für den Peptidliganden und die Immunglobulin-Anteile des Hybridmoleküls kodierenden cDNAs werden in Tandem in einen Plasmidvektor insertiert, der die effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen steuert.
  • Alternativ dazu und insbesondere in Ausführungsformen, wo der Peptidligand beispielsweise durch standardmäßige Festphasensyntheseverfahren synthetisiert wird, kann der Peptidligand an die Multimerisierungsdomäne durch jegliche einer Vielzahl von Mitteln gebunden werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die kovalente Bindung ist typischerweise die zweckdienlichste, jedoch können andere Formen der Bindung in Abhängigkeit von der Anwendung eingesetzt werden. Beispiele geeigneter Formen kovalenter Bindung umfassen die Bindungen, die aus der Reaktion von aktivierte chemische Gruppen tragenden Molekülen mit Aminosäureseitenketten in der Multimerisierungsdomäne resultieren und können unter Verwendung einer Vielzahl von bifunktionellen Proteinkopplungsmitteln hergestellt werden, wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiven Estern (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie z.B. Glutaraldehyd), Bis-Azidoverbindungen (wie z.B. Bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-Diazoniumderivaten (wie z.B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie z.B. Tolyen-2,6-diisocyanat) und Bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol).
  • B. Peptidligandenfusionen
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Peptidligandendomäne gegebenenfalls an beispielsweise eine andere Peptidligandendomäne entweder direkt oder über einen flexiblen Peptidlinker wie unten beschrieben gebunden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Linkerdomäne jegliche Gruppe von Molekülen, die eine räumliche Brücke zwischen zwei oder mehreren Peptidligandendomänen wie hierin unten ausführlicher beschrieben bereitstellt. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden Peptidliganden wie beispielsweise in einem Fusionsprotein miteinander verbunden. Die Hybridmoleküle dieses Aspekts der Erfindung sind beispielsweise bei der Vernetzung von zwei oder mehreren Rezeptoren zweckdienlich.
  • C. Linkerdomänen
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Peptidligandendomäne gegebenenfalls an beispielsweise eine andere Peptidligandendomäne oder eine Multimerisierungsdomäne über einen flexiblen Peptidlinker gebunden. Die Linkerkomponente des Hybridmoleküls de Erfindung nimmt nicht notwendigerweise an der Funktion des Hybridmoleküls teil, kann jedoch dazu beitragen. Daher ist die Linkergruppe gemäß der vorliegenden Erfindung jegliche Gruppe von Molekülen, die eine räumliche Brücke zwischen zwei oder mehreren Peptidligandendomänen oder einer Peptidligandendomäne und einer Multimerisierungsdomäne bereitstellt.
  • Die Linkerdomäne kann verschiedene Längen aufweisen und verschiedenartig aufgebaut sein. Es ist im Allgemeinen die durch die Linkerdomäne bewirkte Ausrichtung und nicht ihre chemische Struktur, die wichtig ist. Die Linkerdomäne ermöglicht es vorzugsweise der Peptidligandendomäne des Hybridmoleküls, im Wesentlichen frei von räumlichen/konformeren Einschränkungen an das zugehörige ErbB2-Molekül zu binden. Daher hängt die Länge der Linkerdomäne vom Charakter der beiden funktionellen Einheiten, z.B. des Peptidliganden und den Multimerisierungsdomänen, des Hybridmoleküls ab.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass verschiedene Kombinationen von Atomen für Moleküle variabler Länge auf Basis bekannter Abstände zwischen verschiedenen Bindungen sorgen (Morrison und Boyd, Organic Chemistry, 3. Auflage, Allyn und Bacon, Inc., Boston, MA (1977)). Beispielweise kann die Linkerdomäne ein Polypeptid variabler Länge sein. Die Aminosäurezusammensetzung des Polypeptids bestimmt den Charakter und die Länge des Linkers. Beispielhaft umfassen Linkerdomänen zwischen 2 und 10 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 6 Aminosäuren, wie z.B. Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (Seq.-ID Nr. 129), Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly (Seq.-ID Nr. 130) und Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly (Seq.-ID Nr. 131).
  • D. Andere bispezifische Kombinationen
  • Gemäß gewissen Aspekten der Erfindung sind bispezifische oder doppelspezifische Zusammensetzungen vorgesehen, die zumindest eine Peptidligandendomäne umfassen. Beispielsweise sind bispezifische Antikörperzusammensetzungen unter Verwendung von Leucin-Zippern produziert worden (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992)). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen werden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere können an der Gelenksregion zur Bildung von Monomeren reduziert und dann zur Bildung von Antikörper-Heterodimeren wieder oxidiert werden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Peptidliganden-Homodimer und -Heterodimeren eingesetzt werden, wobei die Peptidliganden anstelle der Bindungsdomänen der Antikörper-Heterodimere eingesetzt werden.
  • Rekombinante Synthese
  • Die vorliegende Erfindung umfasst isolierte DNA, die für ein hierin beschriebenes Peptid kodiert. Für die Peptide der Erfindung kodierende DNAs können mittels einer Vielzahl von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, chemische Synthese durch jegliches der in Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716–734 (1989), beschriebenen Verfahren, deren gesamte Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist, wie z.B. die Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren. In einer Ausführungsform werden von der Zelle des Expressionswirts bevorzugte Codons bei der Konstruktion der kodierenden DNA verwendet. Alternativ dazu kann für das Peptid kodierende DNA verändert werden, um für eine oder mehrere Varianten zu kodieren, indem rekombinante DNA-Techniken angewendet werden, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese (Kunkel et al., Methods Enzymol. 204, 125–139 (1991); P. Carter et al., Nucl. Acids. res. 13, 4331 (1986); M. J. Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1982)), Kassettenmutagenese (J. A. Wells et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (J. A. Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)) und dergleichen.
  • Die Erfindung umfasst außerdem eine Expressionskontrollsequenz, die operabel an das für ein Peptid der Erfindung kodierende DNA-Molekül gebunden ist, und einen Expressionsvektor, wie z.B. ein Plasmid, das ein DNA-Molekül umfasst, worin die Kontrollsequenz von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt wird. Im Allgemeinen enthaften Plasmidvektoren Replikations- und Kontrollsequenzen, die sich von einer mit der Wirtsspezies kompatiblen Wirtszelle herleiten. Der Vektor trägt für gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Sequenzen, die für Proteine kodieren, die fähig sind, für eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen.
  • Geeignete Wirtszellen zur Expression der DNA umfassen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E. coli K12, Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
  • Zusätzlich zu Prokaryoten können eukaryotische Organismen, wie z.B. Hefen, oder von mehrzelligen Organismen stammende Zellen als Wirtszelle verwendet werden. Zur Expression in Hefewirtszellen, wie z.B. gewöhnlicher Bäckerhefe oder Saccharomyces cerevisiae, umfassen geeignete Vektoren episomal replizierende Vektoren auf Basis des 2-Mikrometer-Plasmids, Integrationsvektoren und künstliche Hefechromosom-(YAC-)Vektoren. Geeignete Wirtszellen zur Expression stammen auch aus mehrzelligen Organismen. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Insektenzellen, wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Zur Expression in Insektenwirtszellen, wie z.B. Sf9-Zellen, umfassen geeignete Vektoren Baculovirusvektoren. Zur Expression in Pflanzenwirtszellen, insbesondere zweikeimblättrigen Pflanzenwirten, wie z.B. Tabak, umfassen geeignete Expressionsvektoren Vektoren, die aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens stammen.
  • Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszellen umfassen die mittels SV40 transformierte Affen-Nieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenlinie (293 oder auf Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
  • Zur Expression in prokaryotischen Wirten umfassen geeignete Vektoren pBR322 (ATCC-Nr. 37,017), phGH107 (ATCC-Nr. 40.011), pBO475, pS0132, pRIT5, jeglichen Vektor der pRIT20- oder pRIT30-Reihe (Nilsson und Abrahmsen, Meth. Enzymol. 185, 144–161 (1990)), pRIT2T, pKK233-2, pDR540 und pPL-Lambda. Prokaryotische Wirtszellen, die die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung enthalten, umfassen E. coli K12, Stamm 294 (ATCC-Nr. 31446), E.-coli-Stamm JM101 (Messing et al., Nucl. Acid Res. 9, 309 (1981)), E.-coli-Stamm B, E.-coli-Stamm X1776 (ATCC-Nr. 31537), E. coli c600 (Appleyard, Genetics 39, 440 (1954)), E. coli W3110 (F-, Gamma-, prototroph, ATCC-Nr. 27325), E.-coli-Stamm 27C7 (W3110, tonA, phoA E15, (argF-lac)169, ptr3, degP41, ompT, kanr) (US-Patent Nr. 5.228.931, ATTC-Nr. 55.244), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Serratia marcescans und Pseudomonas-Spezies.
  • Zur Expression in Säugetierwirtszellen umfassen zweckdienliche Vektoren aus SV40 stammende Vektoren, aus Cytomegalovirus stammende Vektoren, wie z.B. die pRK-Vektoren, einschließlich pRK5 und pRK7 (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987); EP 307.247 (15. 3. 1989), EP 278.776 (17. 8. 1988), aus Vaccinia-Viren oder ande ren Pockenviren stammende Vektoren und retrovirale Vektoren, wie z.B. aus murinem Moloney-Leukämie-Virus stammende Vektoren (MoMLV).
  • Gegebenenfalls wird die für das Peptid von Interesse kodierende DNA operabel an eine Sekretionsleadersequenz gebunden, was in der Sekretion des Expressionsprodukts durch die Wirtszelle in das Kulturmedium resultiert. Beispiele von Sekretionsleadersequenzen umfassen stII, Ecotin, lamB, Herpes GD, Ipp, Alkalische Phosphatase, Invertase und Alphafaktor. Ebenfalls geeignet zur Verwendung hierin ist die 36 Aminosäuren aufweisende Leadersequenz von Protein A (Abrahmson et al., EMBO J. 4, 3901 (1985)).
  • Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transfiziert und vorzugsweise transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die zur Induktion von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene geeignet modifiziert sind.
  • Transfektion bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle unabhängig davon, ob irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Dem Durchschnittsfachmann sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO4-Präzipitation und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Tätigkeit dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
  • Unter Transformation wird das Einführen von DNA in einen Organismus verstanden, sodass die DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie im Abschnitt 1.82 von Sambrock et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989), beschrieben ist, wird im Allgemeinen für Prokaryoten und andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthal ten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation gewisser Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das in den Abschnitten 16.30–16.37 von Sambrook et al. (siehe oben) beschriebene Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtsystemtransformationen sind von Axel in dem am 16. August 1983 ausgegebenen US 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach den Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kerninjektion, Elektroporation oder durch Protoplastenfusion, ebenfalls verwendet werden.
  • Andere bevorzugte Vektoren können unter Anwendung von Standardtechniken konstruiert werden, indem die relevanten Merkmale der oben beschriebenen Vektoren kombiniert werden. Relevante Merkmale umfassen den Promotor, die Ribosombindungsstelle, das Gen von Interesse oder die Genfusion (die Z-Domäne von Protein A und das Gen von Interesse und einen Linker), die Antibiotikaresistenzmarker und die geeigneten Replikationsstartpunkte.
  • Eine Variation der obigen Verfahren sieht die Verwendung von Genfusionen vor, worin das für das gewünschte Peptid kodierende Gen mit einem für ein anderes Protein oder ein Fragment eines anderen Proteins kodierenden Gen im Vektor assoziiert ist. Dies resultiert in der Produktion des gewünschten Peptids durch die Wirtszelle als eine Fusion mit einem anderen Protein oder Peptid. Das „andere" Protein oder Peptid ist häufig Protein oder Peptid, dass von der Zelle sekretiert werden kann, wodurch es möglich wird, das gewünschte Peptid aus dem Kulturmedium zu isolieren und zu reinigen, und wodurch die Notwendigkeit der Zerstörung der Wirtszellen eliminiert wird, die sich ergibt, wenn das gewünschte Peptid innerhalb der Zelle verbleibt. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein intrazellulär exprimiert werden. Es ist zweckdienlich, Fusionsproteine zu verwenden, die in hohem Ausmaß exprimiert werden.
  • Die Verwendung von Genfusionen kann, obgleich sie nicht essentiell sind, die Expression von heterologen Peptiden in Insektenzellen sowie die anschließende Reinigung dieser Genprodukte erleichtern. Protein-A-Fusionen werden häufig verwendet, da die Bindung von Protein A oder im spezielleren der Z-Domäne von Protein A an IgG einen „Affinitäts-Handgriff" für die Reinigung des fusionierten Proteins bereitstellt. Beispielsweise kann eine für den gewünschten Peptidliganden kodierende DNA-Sequenz durch ortsgerichtete Mutagenese an das Gen für eine Consensusdomäne von Protein A fusioniert werden, die als die Z-Domäne bekannt ist (Nilsson et al., Protein Engineering 1, 107–113 (1987)). Nach Expression und Sekretion kann das Fusionsprotein enzymatisch gespalten werden, um freies Peptid zu liefern, das aus dem enzymatischen Gemisch gereinigt werden kann (siehe z.B. Varadarajan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5681–5684 (1985); Castellanos-Serra et al., FEBS Letters 378, 171–176 (1996); Nilsson et al., J. Biotechnol. 48, 241–250 (1996)).
  • Fusionsproteine können unter Verwendung von Chemikalien gespalten werden, wie z.B. Bromcyan, das an einem Methionin spaltet, oder Hydroxylamin, das zwischen einem Asn- und Gly-Rest spaltet. Unter Anwendung standardmäßiger rekombinanter DNA-Methodik können die für diese Aminosäuren kodierenden Nucleotidbasenpaare unmittelbar ans 5'-Ende des für das gewünschte Peptid kodierenden Gens insertiert werden.
  • Alternativ dazu kann man proteolytische Spaltung von Fusionsprotein einsetzen. Carter, in: Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladisch et al. (Hrsg.), American Chemical Society Symposium Series Nr. 427, Kap. 13, Seiten 181–193 (1990).
  • Proteasen wie z.B. Faktor Xa, Thrombin und Subtilisin oder seine Mutanten und eine Anzahl von anderen sind erfolgreich verwendet worden, um Fusionsprotein zu spalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung für die Produktion von Peptidliganden. von weniger als etwa 30 Aminosäuren bevorzugt ist die Protease Trypsin, die höchst spezifisch für Arg- und Lys-Reste ist. Trypsinspaltung wird in Nilsson et al., J. Biotech. 48, 241 (1996), und Smith et al., Methods Mol. Biol. 32, 289, allgemein erörtert.
  • Typischerweise wird ein Peptidlinker, der der Spaltung durch die verwendete Protease zugänglich ist, zwischen dem „anderen" Protein (z.B. der Z-Domäne von Protein A) und dem gewünschten Peptid insertiert. Unter Anwendung von DNA-Rekombinationsverfahren werden die für den Linker kodierenden Nucleotidbasenpaare zwischen die für die anderen Proteine kodierenden Gene oder Genfragmente insertiert. Die proteolytische Spaltung des teilweise gereinigten Fusionsproteins, das den korrekten Linker enthält, kann dann entweder am nativen Fusionsprotein oder am reduzierten oder denaturierten Fusionsprotein durchgeführt werden.
  • Das Peptid kann bei Expression als Fusionsprotein korrekt gefaltet sein oder nicht. Außerdem kann der spezielle Peptidlinker, der die Spaltstelle enthält, der Protease zugänglich sein oder nicht. Diese Faktoren bestimmen, ob das Fusionsprotein denaturiert oder neu gefaltet werden muss und falls dies der Fall ist, ob diese Verfahren vor oder nach der Spaltung eingesetzt werden.
  • Wenn eine Denaturierung und Neufaltung erforderlich ist, wird das Peptid typischerweise mit einem chaotropen Mittel, wie z.B. Guanidin-HCl, behandelt und wird dann mit einem Redoxpuffer behandelt, der beispielsweise reduziertes und oxidiertes Dithiothreit oder Glutathion in den geeigneten Verhältnissen und bei geeignetem/r pH und Temperatur enthält, sodass das Peptid zu seiner nativen Struktur neu gefaltet wird.
  • Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in In-vitro-Kultur sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
  • Bei zyklisierten Ausführungsformen der Erfindung kann das rekombinant produzierte Peptid durch Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung wie oben beschrieben zyklisiert werden.
  • Nützlichkeit
  • Allgemein gesprochen können die Peptidliganden und Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung in denselben Anwendungen verwendet werden wie z.B. native oder Varianten-Heregulin-Moleküle oder gegen ErbB2 gerichtete Antikörper verwendet werden können. Selbstverständlich können manche im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegende Peptidliganden oder Hybridmoleküle für eine bestimmte Anwendung besser geeignet sein als für eine andere Anwendung. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird ohne weiteres herausfinden, welche Moleküle für eine vorgegebene Anwendung geeignet sind, indem ein oder mehrere herkömmliche biologische Tests verwendet werden, um die biologische Aktivität des Peptidliganden oder Hybridmoleküls zu ermitteln.
  • Als Beispiel sind Hereguline bei der Behandlung einer Auswahl an Störungen zweckdienlich, beispielsweise Störungen und Krankheiten, die das Nervensystem, Muskulatur und Epithel beeinträchtigen. Beispielsweise kann ein Agonisten-Peptidligand oder Hybridmolekül der vorliegenden Erfindung bei der Förderung der Entwicklung, Erhaltung und/oder Regeneration eines Neurons in vivo in derselben Weise verwendet werden, in der Heregulin oder eine Heregulinvariante verwendet wird. Der Behandlung mit Peptidliganden oder Hybridmolekülen gemäß diesem Aspekt der Erfindung zugängliche Krankheiten oder Störungen umfassen beispielsweise Trauma-begleitende Zentralnervensystemschädigung, operative Eingriffe, Schlaganfall, Ischämie, Infektion, metabolische Störungen, Mangelernährung, Malignität oder ein toxisches Mittel. Neurodegenerative Störungen können ebenfalls behandelt werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, menschliche neurodegenerative Krankheiten oder Störungen, wie z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Epilepsie, multiple Sklerose, Huntington-Chorea, Downsyndrom, sensorineurale Taubheit und Menière-Krankheit. Ebenso sind bestimmte Peptidliganden zur Verwendung bei der Behandlung von Neuropathie, wie z.B. mit systemischen Krankheiten assoziierter peripherer Neuropathie oder Störungen wie z.B. Diabetes geeignet.
  • Agonisten-Peptidliganden, die wie beschrieben nach ErbB2-Bindung ein Phosphorylierungsereignis auslösen, sind für die vorangehenden Aspekte der Erfindung be sonders zweckdienlich. Spezielle Agonisten-Peptidliganden der Erfindung sind fähig, das Überleben von Zellen zu fördern, das heißt, dass sie den Überlebenszeitraum einer ErbB2-tragenden Zelle entweder in vivo oder in vitro im Vergleich zum Überlebenszeitraum von Zellen erhöhen, die nicht einem speziellen Agonisten-Peptidliganden exponiert worden sind. In bevorzugten Ausführungsformen bewirkt oder verstärkt der Agonisten-Peptidligand die Proliferation von ErbB2-tragenden Zelltypen entweder in vivo oder in vitro, wie sie beispielsweise durch Messung der 3H-Thymidin-Aufnahme durch Zellen quantifiziert wird. Proliferation kann mit Differenzierung von ErbB2-Zellen verbunden sein, wie mittels Screening einer ErbB2-tragenden Zellpopulation auf phänotypische Veränderungen ermittelt wird.
  • Gewisse Peptidliganden und Hybridmoleküle, insbesondere jene, die ErbB2 binden, jedoch keine Agonisten-assoziierte Reaktion auslösen, sind beispielsweise bei der Hemmung von Tumorzelleninvasion und Metastase zweckdienlich, wie hierin unten vollständiger beschrieben wird. Beispielsweise kann ein Tumor, der ErbB2-Rezeptoren exprimiert (insbesondere einer, der ErbB2 überexprimiert), unter Verwendung eines an ein zytotoxisches Mittel gebundenen Peptidliganden oder Hybridmoleküls behandelt werden oder indem ein Prodrug auf ErbB2 exprimierende Zellen abgezielt wird.
  • A. Konstruktion von Effektorfunktionen
  • Es kann beispielsweise wünschenswert sein, die Multimerisierungsdomäne von Hybridmolekülen der vorliegenden Erfindung bezüglich einer Effektorfunktion zu modifizieren, um beispielsweise die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Krebsbehandlung zu erhöhen. Beispielweise kann/können (ein) Cysteinrest(e) in eine Immunglobulin-Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Intraketten-Disulfidbindungen in dieser Region ermöglicht wird. Das so erzeugte homo- oder heterodimere Hybridmolekül kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder erhöhte komplementvermittelte Zellabtötung und antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Hybridmoleküle mit verstärkter Anti tumoraktivität können unter Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzern wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben ebenfalls hergestellt werden.
  • Alternativ dazu kann ein heterodimeres Hybridmolekül konstruiert werden, das doppelte Fc-Regionen aufweist und dadurch verstärkte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten aufweisen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
  • B. Konjugate
  • Die Erfindung betrifft außerdem Konjugate, die die Peptidliganden von irgendeinem der hierin beschriebenen Hybridmoleküle umfassen, die an ein zytotoxisches Mittel konjugiert sind, wie z.B. ein chemotherapeutisches Mittel, wie z.B. ein Proteintoxin oder zytotoxisches Medikament oder Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder ein Fragment davon), oder ein radioaktives Isotop (das ist ein Radiokonjugat).
  • Zur Erzeugung derartiger Immunokonjugate zweckdienliche chemotherapeutische Mittel sind beschrieben worden. Ein chemotherapeutisches Mittel ist eine chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Krebs, einschließlich Karzinomen, Lymphomen, Blastomen, Sarkomen und Leukämien, zweckdienlich ist. Beispiele für chemotherapeutische Mittel umfassen aus Mikroorganismen isolierte Antibiotika, wie z.B. die Calicheamicine (Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 3464–3466 (1987); Hinman et al., Cancer Res. 53, 3336–3342 (1993)), Maytansinoide (wie z.B. jene, die in Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8618–8323 (1996), beschrieben sind), Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid, Cyclophosphamid, Thiopeta, Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitosantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, ein Mitomycin, Nicotinamid, ein Espeeramicin, Melphalan und jegliches verwandte Stickstoff senfgas, und endokrine Therapeutika (wie z.B. Diethylstilbestrol, Tamoxifen, LHRH-antagonisierende Medikamente, ein Progestin, ein Anti-Progestin usw.)
  • Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nicht-bindende aktive Fragmente von Diphtherie-Toxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Proteine aus Aleurites fordii, Dianthin-Proteine, Proteine aus Phytolaca americana (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordicacharantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene.
  • Eine Vielzahl von Radionukliden ist zur Herstellung von radiokonjugierten Peptidliganden oder Hybridmolekülen verfügbar. Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re. Kohlenstoff-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhaftes Komplexierungsmittel zur Konjugation eines Radionucleotids an das Hybridmolekül.
  • Konjugate des Peptidliganden oder Hybridmoleküls und eines zytotoxischen Mittels werden hergestellt unter Verwendung einer Vielzahl an bifunktionellen Proteinkopplungsmitteln, wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiven Estern (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie z.B. Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazoniumderivate (wie z.B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie z.B. Tolyen-2,6-diisocyanat) und Bis-aktive Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol). Beispielweise kann ein Ricin-Immunotoxin im Wesentlichen wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform können der Peptidligand oder die Hybridmoleküle. an einen „Rezeptor" (wie z.B. Streptavidin) zum Einsatz beim Tumor-Pretargeting konjugiert werden, wobei das Peptidliganden- oder Hybridmolekül-Rezeptor-Konjugat einem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung von ungebunde nem Konjugat aus dem Kreislauf unter Verwendung eines Clearing-Mittels und anschließender Verabreichung eines „Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
  • C. Liposomen
  • Die hierin offenbarten Hybridmoleküle oder Peptidliganden können auch als Liposomen formuliert werden. Die Hybridmoleküle enthaltenden Liposomen werden durch Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. durch jene, die in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und in den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben sind. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
  • Insbesondere zweckdienliche Liposomen können mit dem Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung erzeugt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst. Liposomen werden durch Filter definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu liefern. Beispielsweise können Hybridmoleküle, die eine hierin beschriebene konstante Immunglobulindomäne umfassen, wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben über eine Disulfidaustauschreaktion an die Liposomen konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
  • D. Enzymvermittelte Prodrug-Therapie
  • Die Peptidliganden oder Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung können außerdem in der Art und Weise von Antikörpern der antikörperabhängigen enzymvermittelten Prodrug-Therapie (ADEPT) verwendet werden, indem der Peptidligand oder die Hybridmoleküle an ein Prodrug-aktivierendes Enzym konjugiert werden, das ein Prodrug (z.B. ein chemotherapeutisches Peptidyl-Mittel, siehe WO 81/01145) zu ei nem aktiven Antikrebsmedikament umsetzt. Siehe beispielsweise WO 88/07378 und US-Patent Nr. 4.975.278.
  • Die Enzymkomponente des für die Therapie vom ADEPT-Typ zweckdienlichen Konjugats umfasst jegliches Enzym, das dazu fähig ist, an einem Prodrug in einer Weise zu agieren, dass es zu seiner aktiveren, zytotoxischen Form umgesetzt wird. Enzyme, die im Verfahren dieser Erfindung zweckdienlich sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Alkalische Phosphatase, die zur Umsetzung von Phosphat enthaltenden Prodrugs zu freien Medikamenten zweckdienlich ist; Arylsulfatase, die zur Umsetzung von Sulfat enthaltenden Prodrugs zu freien Medikamenten zweckdienlich ist; Cytosin-Deaminase, die zur Umsetzung von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin zum Antikrebsmedikament 5-Fluoruracil zweckdienlich ist; Proteasen, wie z.B. Serratia-Protease, Thermolysin, Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie z.B. Cathepsine B und L), die zur Umsetzung von Peptid enthaltenden Prodrugs zu freien Medikamenten zweckdienlich sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, zweckdienlich zur Umsetzung von Prodrugs, die D-Aminosäure-Substituenten enthalten; Kohlenhydrat spaltende Enzyme, wie z.B. β-Galactosidase und Neuraminidase, die zur Umsetzung von glykosylierten Prodrugs zu freien Medikamenten zweckdienlich sind; β-Lactamase, die zur Umsetzung von mit β-Lactamen derivatisierten Medikamenten zu freien Medikamenten zweckdienlich ist; und Penicillin-Amidasen, wie z.B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, zweckdienlich zur Umsetzung von an ihren Aminstickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisierten Medikamenten zu freien Medikamenten. Alternativ dazu können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, die auf dem Gebiet der Erfindung auch als „Abzyme" bekannt sind, verwendet werden, um die Prodrugs der Erfindung zu freien Medikamenten umzusetzen (siehe z.B. Massey, Nature 328, 457–458 (1987)). Peptidliganden/Hybridmolekül-Abzym-Konjugate können wie hierin beschreiben zur Abgabe des Abzyms an eine Tumorzellenpopulation hergestellt werden.
  • Enzyme können kovalent an die Hybridmoleküle durch Techniken gebunden werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z.B. die Verwendung der oben erörterten heterobifunktionellen Vernetzungsmittel. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest den Peptidligandenabschnitt des Hybridmoleküls der Erfindung umfassen, der an zumindest einen funktionell aktiven Abschnitt eines Enzyms der Erfindung gebunden ist, unter Anwendung DNA-Rekombinationsverfahren konstruiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind (siehe z.B. Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984)).
  • E. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Peptidliganden der Erfindung umfassen, können auf jegliche geeignete Art und Weise verabreicht werden, einschließlich parenteral, topisch, oral oder lokal (wie z.B. als Aerosol oder transdermal) oder jegliche Kombination davon. Geeignete Regime umfassen außerdem eine anfängliche Verabreichung durch intravenöse Bolusinjektion, gefolgt von wiederholten Dosen in einem oder mehreren Intervallen.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen der Verbindungen der Erfindung werden zur Lagerung hergestellt, indem eine den Peptidliganden enthaltenden Verbindung mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen vermischt wird. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Empfänger in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechin; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Komplexierungsmittel, wie z.B. EDTA; Zucker, wie z.B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Proteinkomplexe); und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEENTM, PLURONICSTM oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Die Zusammensetzungen hierin können außerdem je nach Notwendigkeit für die jeweilige behandelte Indikation mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich nicht gegenseitig nachteilig beeinflussen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, weitere Moleküle wie z.B. Antikörper bereitzustellen, die an EGFR, ErbB2 (z.B. ein Antikörper, der einen anderen Liganden auf ErbB2 bindet), ErbB3, ErbB4 oder Gefäßendothelfaktor (VEGF) in der einen Formulierung binden. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Cytokin, wachstumshemmendes Mittel und/oder herzschützendes Mittel umfassen. Derartige Moleküle sind in geeigneter Weise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind.
  • F. Diagnostizieren und Prognostizieren einer Störung
  • Störungen zur Prognose und Diagnose unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise gutartige und bösartige Tumoren, die durch die Überexpression des ErbB2-Rezeptors gekennzeichnet sind, z.B. eine Krebsform, wie z.B. Brustkrebs, Plattenepithelkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, Dickdarmkrebs, Kolon-Rektum-Krebs, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkrebs, Nierenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs, hepatisches Karzinom und verschiedene Typen von Kopf- und Nackenkrebs. Daher kann der Nachweis und/oder die Messung von Erb2 in einer Probe bei der Diagnose, Stadiumeinteilung, Ermittlung des Schweregrads und Prognose im Allgemeinen verwendet werden.
  • Die beschriebenen Diagnosetechniken können verwendet werden, um den Fortschritt der Therapie zu verfolgen. Bei einem Patienten, der einer therapeutischen Behandlung unterzogen wird, die in einer Erhöhung oder Verminderung der Menge an Erb2-tragenden Zellen resultiert, kann die Menge an Erb2-tragenden Zellen in einer Probe als zweckdienliches Maß für den Erfolg oder das Fehlschlagen der Behandlung dienen. Folglich kann die Wirkung einer therapeutischen Behandlung bei einem Patienten unter Anwendung eines Verfahrens festgestellt werden, das die Messung der Menge an Erb2 in geeigneten Zeitabständen umfasst, die in einer Probe von Gewebe exprimiert wird, von dem vermutet wird, dass es Erb-2-exprimierende Zellen enthält. Die Gesamtmenge an Erb2 wird mit einem „Basislinien"- oder „Kontroll"-Wert verglichen, der in Abhängigkeit von der Krankheit und der Behandlung die Menge an Erb2 in einer ähnlichen Probe aus einem normalen Patienten, aus dem Patienten vor dem Ausbruch der Krankheit oder während der Krankheitsremission oder aus dem Patienten vor dem Beginn der Therapie sein kann. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Erfindung kann den in einer bestimmten Situation zu verwendenden geeigneten Basislinienwert ohne übermäßiges Experimentieren leicht feststellen.
  • Es kann jegliches auf dem Gebiet der Erfindung zur Messung von Analyten bekannte Verfahren bei der praktischen Durchführung der Messung von Erb2 in einer Probe unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Derartige Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme unter Anwendung von Techniken wie z.B. Radioimmuntests, Enzymimmuntests (EIA), vorzugsweise der Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA), „Sandwich"-Immuntests, Präzipitationsreaktionen, Geldiffusionsreaktionen, Immunodiffusionsreaktionen, Agglutinationstests, Komplementfixierungstests, immunoradiometrische Tests, Fluoreszenzimmuntests, Protein-A-Immuntests und Immunoelektrophoresetests, um einige wenige zu benennen. Über Beispiele von bevorzugten Immuntestverfahren siehe die US-Patente Nr. 4.845.026 (4. Juli 1989) und 5.006.459 (9. April 1991).
  • Für diagnostische und prognostische Anwendungen wird eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, typischerweise ein hierin oben beschriebenes Hybridmolekül, mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert und verwendet, um Erb-2 in einer Probe wie oben beschrieben nachzuweisen. Es sind zahlreiche Marker verfügbar, die vorzugsweise zu den folgenden Kategorien gruppiert werden können:
    • (a) Radioisotope, wie z.B. 35S, 14C, 125I, 3H und 131I. Die Hybridmoleküle können mit dem Radioisotop unter Anwendung der Techniken markiert werden, die beispielsweise in Current Protocols on Immunology, Bd. 1 und 2, Coligen et al. (Hrsg.), Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991), beschrieben sind, und die Radioaktivität kann unter Anwendung von Szintillationszählung gemessen werden.
    • (b) Fluoreszenzmarker, wie z.B. Komplexe seltener Erden (Europiumkomplexe) oder Fluoreszein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Lissamin, Phycoerythrin und Texasrot, sind verfügbar. Die Fluoreszenzmarker können an die Hybridmoleküle unter Anwendung von Techniken konjugiert werden, die beispielsweise in Current Protocols in Immunology, siehe oben, offenbart sind. Fluoreszenz kann unter Verwendung eines Fluorimeters quantifiziert werden.
    • (c) Es sind verschiedene Enzymsubstratmarker verfügbar, und US-Patent Nr. 4.275.149 stellt einen Überblick einiger davon bereit. Das Enzym katalysiert vorzugsweise eine chemische Veränderung des chromogenen Substrats, die unter Anwendung verschiedener Techniken gemessen werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbänderung bei einem Substrat katalysieren, die spektralphotometrisch gemessen werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz oder Chemilumineszenz eines Substrats verändern. Techniken zur Quantifizierung einer Änderung der Fluoreszenz werden oben beschrieben. Das chemilumineszierende Substrat wird durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt und kann dann -Licht emittieren, das gemessen werden kann (beispielsweise unter Verwendung eines Chemiluminometers), oder gibt Licht an einen Fluoreszenzakzeptor ab. Beispiel enzymatischer Marker umfassen Luciferasen (z.B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase; US-Patent Nr. 4.737.456), Luciferin, 2,3- Dihydrophthalazindione, Malatdehydrogenase, Urease, Peroxidase, wie z.B. Meerrettichperoxidase (HRPO), Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen (z.B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucos-6-phosphatdehydrogenase), heterozyklische Oxidasen (wie z.B. Uricase und Xanthinoxidase), Lactoperoxidase, Mikroperoxidase und dergleichen. Techniken zum Konjugieren von Enzymen an Antikörper werden in O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in: Methods in Enzym. 73, J. Langone und H. Van Vunakis (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 147–166 (1981), beschrieben.
  • Beispiele für Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen beispielsweise:
    • (i) Meerrettichperoxidase (HRPO) mit Wasserstoffperoxidase als Substrat, worin die Wasserstoffperoxidase einen Farbstoffvorläufer (z.B. Orthophenylendiamin (OPD) oder 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinhydrochlorid (TMB)) oxidiert;
    • (ii) Alkalische Phosphatase (AP) mit para-Nitrophenylphosphat als chromogenes Substrat; und
    • (iii) β-D-Galactosidase (β-D-Gal) mit einem chromogenen Substrat (z.B. p-Nitrophenyl-β-D-galactosidase) oder fluorogenen Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosidase.
  • Zahlreiche andere Enzym-Substrat-Kombinationen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung verfügbar. Für einen allgemeinen Überblick über diese siehe US-Patente Nr. 4.275.149 und 4.318.980.
  • In den oben beschriebenen Tests wird ein Hybridmolekül vorzugsweise an eine Festphasenunterlage oder einen Festphasenträger gebunden. Unter „Festphasenunterlage" oder „Festphasenträger" wird jeder Träger verstanden, der zur Bindung eines Antigens oder Antikörpers fähig ist. Wohlbekannte Unterlagen oder Träger um fassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetite. Die Beschaffenheit des Trägers kann entweder bis zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich zum Zwecke der vorliegenden Erfindung sein. Das Trägermaterial kann einen nahezu beliebigen möglichen strukturellen Aufbau aufweisen, solange das gekoppelte Molekül fähig ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Folglich kann der Trägeraufbau kugelförmig, wie z.B. eine Perle, oder zylindrisch sein, wie z.B. in der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder der äußeren Oberfläche eines Stabs. Alternativ dazu kann die Oberfläche eben sein, wie z.B. ein Blatt, Teststreifen usw. Bevorzugte Träger umfassen Polystyrolperlen. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung kennen zahlreiche andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörper oder Antigen oder sind fähig, dieselben durch Anwendung routinemäßiger Experimente herauszufinden.
  • Es kann ein Sandwich-Immuntest eingesetzt werden, d.h. dass Erb2 durch ein Verfahren nachgewiesen oder gemessen wird, umfassend das Binden eines ersten Antikörpers oder Hybridmoleküls an das Erb2-Antigen und Binden eines zweiten Antikörpers oder Hybridmoleküls an das Erb2 sowie das immunspezifische Nachweisen oder Messen des vom ersten sowie zweiten Antikörper oder Hybridmolekül gebundenen Erb2. Die ersten und zweiten Antikörper können monoklonale Antikörper sein, und einer der beiden oder beide der ersten und zweiten können Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung sein. In diesem Test bindet der Peptidligandenabschnitt des Hybridmoleküls vorzugsweise an eine Stelle, die sich von der des ersten Antikörpers unterscheidet (wie sich z.B. durch das Fehlen der kompetitiven Hemmung zwischen dem Antikörper und dem Hybridmolekül um Bindung an das Antigen widerspiegelt). Alternativ dazu kann der erste oder zweite Antikörper ein polyklonaler Antikörper sein.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Illustration bereitgestellt und schränken den Schutzumfang der Erfindung nicht ein. Die Offenbarungen aller Zitate in der Patentschrift sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
  • Beispiele
  • Beispiel I
  • Identifizierung und Reifung von HER2-bindenden Peptiden
  • Verfahren
  • Phagenbibliotheken – Polyvalente Peptid-Zufallssequenz-Phagenbibliotheken (Tabelle 1) wurden unter Anwendung einer Kunkel-Mutagenese des Templats pB2479.g8 im Großmaßstab hergestellt. Dieses Phagemid enthält den Tac-Promotor und die mal-Signalsequenz, 3 Stoppcodons und eine an gVIII fusionierte Linkersequenz und umfasst die LacIq- und Ampicillinresistenzgene. Die Peptidbibliotheken werden daher polyvalent auf Phagen als Fusionen an pVIII mit der Fähigkeit exprimiert, die Kopiezahl mit IPTG zu regulieren. Jede Bibliothek hat eine Diversität von über 109 Klonen.
  • Tabelle 1
    Figure 00630001
  • Selektionsbedingungen – HER2-ECD wurde direkt an Maxisorp-Platten in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 9,3, unter Verwendung von 5 μg/ml über Nacht bei 4°C immobilisiert. Die Wells wurden unter Verwendung von 1% BSA enthaltendem PBS (PBS-BSA) 1 Stunde lang bei 25°C geblockt. Die Phagen aus den oben beschriebenen Bibliotheken wurden zu 7 Gruppen wie in Tabelle 1 gezeigt zusammengefasst. Phagen aus jedem Pool wurden in HER2-ECD enthaltenden Wells in PBS-BSA 2 Stunden lang bei 25°C inkubiert; im Allgemeinen wurden etwa 5 × 1010 Phagen zu Beginn jedes Umlaufs zugegeben. Ungebundene Phagen wurden durch wiederholtes Waschen mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS (PBS-Tween) entfernt; verbleibende Phagen wurden mit 500 mM KCl, 10 mM HCl, pH 2, eluiert. Die eluierten Phagen wurden dann in XL1-Blue-Zellen mit dem Helferphagen VCSM13 (Stratagene) über Nacht bei 37°C amplifiziert. IPTG (10 μM) wurde nur den anfänglichen Phagenbibliotheken und während der Amplifikation nach Umlauf 1 zugegeben; spätere Umläufe vertrauten auf der basalen Expression des tac-Promotors zur Hervorbringung der Peptid-pVIII-Expression. Anreicherung wurde durch Titrieren der Anzahl an Phagen festgestellt, die an einen mit dem Target beschichteten Well im Vergleich zu einem mit BSA beschichteten Well banden.
  • HER2-Phagenbindungstest – Die Hemmung der Bindung von Phagen, die eine einzige Kopie von Peptid 1.1FI an ihrer Oberfläche präsentieren (Tabelle 1), an die immobilisierte extrazelluläre Domäne von Erb2 (HER2-ECD, Hudziak et al., J. Biol. Chem. 266, 24109–15 (1991)) wurde unter Anwendung eines Phagen-ELISA überprüft. HER2-ECD wurde direkt an Maxisorp-Platten (Nunc) in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 9,3, unter Verwendung von 5 μg/ml über Nacht bei 4°C immobilisiert. Wells wurden unter Verwendung von 1% BSA enthaltendem PBS (PBS-BSA) 1 Stunde lang bei 25°C geblockt. Verdünnungen von 1.1.FI-Fc in PBS-BSA wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von 1.1FI präsentierenden Phagen an die immobilisierte HER-2-ECD zu blockieren. Die Mikrotiterplatte wurde mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS (PBS-Tween) gewaschen und die an HER2-ECD gebundenen Phagen mit einem monoklonalen Anti-gVIII/HRP-Antikörperkonjugat (Amersham Pharmacia Biotech) detektiert. Die Menge an gebundenem HRP wurde un ter Verwendung von ABTS/H2O2-Substrat und Beobachtung der Änderung bei 405 nm gemessen.
  • Ergebnisse
  • Selektion polyvalenter Peptid-Phagen, die an HER2-ECD binden – Polyvalente Peptid-Bibliotheken wurden in 7 Pools (Tabelle 1) gegen immobilisierte HER2-ECD sortiert. Polyvalenter Phagendisplay (Scott et al., Science 249, 386–390 (1990)) wurde verwendet, um die Bindung über Aviditätseffekte zu verstärken. Anreicherung, die Anzahl an Phagen, die von einem mit HER2-ECD beschichteten Well eluiert wurden, geteilt durch die Anzahl von Phagen, die von einem mit BSA beschichteten Well eluiert wurden, ist in 4 für die Umläufe 3 und 4 gezeigt. Die DNAs aus Zufallsklonen in jedem Pool wurden sequenziert, und die abgeleiteten Peptidsequenzen sind in Tabelle 2 dargestellt. Pool 1 wurde von einem einzigen Klon eingenommen, während andere Pools mehrere Sequenzen enthielten.
  • Unter Anwendung eines Phagenbindungstests wurde für die Phagenklone 1.1, 5.1 und 7.1 gefunden, dass sie immobilisierte HER2-ECD banden, nicht jedoch an immobilisiertes BSA oder nahe verwandtes HER3 oder HER4, was darauf hinweist, dass sie HER2-ECD spezifisch erkannten (5). Die Sequenzen dieser Klone wurden der partiellen Randomisierung unterzogen, um auf Klone höherer Affinität neu zu selektieren.
  • Tabelle 2
    Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Beispiel II
  • Verfahren
  • Partielle oder vollständige Randomisierung an monovalenten Phagen – Monovalente Bibliotheken, die eine einzige Kopie eines Peptids an der Phagenoberfläche präsentieren, das über eine Linkersequenz an das von gIII kodierte Schwanzprotein fusioniert ist, wurden unter Anwendung von einzelsträngiger Templat-gerichteter Mutagenese (Kunkel et al., Met. Enz. 204, 125–139 (1991)) eines ähnlichen Phagemiden pB2479.g3 konstruiert. In diesem Vektor ist die kodierende Sequenz für gVIII durch ein gIII ersetzt worden, und zusätzlich ist das CMPr-Gen in eine einzigartige hincII-Stelle im AMPr-Gen insertiert worden. Die Änderung der Medikamentresistenz wurde konstruiert, um Verunreinigung durch verwandte, obgleich schwächer affine polyvalente Klone zu eliminieren, die die Population über Aviditätseffekte übernehmen könnten (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378–6382 (1990)). Partiell randomisierte Bibliotheken wurden konstruiert, um eine Tendenz für die aus den anfänglichen polyvalenten Bibliotheken identifizierten Peptidsequenzen beizubehalten, während eine Mutationsrate von 50% an jeder Aminosäureposition erlaubt wurde. Diese Mutationsrate wurde erlangt, indem die Oligos mit einem 70-10-10-10-Gemisch von Basen synthetisiert wurden (wobei jede Base in der dotierten Region des Oligos unter Verwendung eines Gemischs gekoppelt wird, das 70% der Base, die zur Sequenz der Wildform beiträgt, und jeweils 10% der anderen 3 Basen enthält). Im Gegensatz dazu wurde die vollständige Randomisierung in Bibliotheken erlangt, indem Oligos unter Verwendung von NNS für bestimmte Codons synthetisiert wurden, um Abschnitte eines präsentierten Peptids vollständig zu randomisieren, während andere Abschnitte der Sequenz konstant gehalten wurden.
  • Ergebnisse
  • Partielle Randomisierung von Peptid-Phagen – Die anfänglichen Peptidbibliotheken, die konstruiert wurden, kodierten für eine mögliche Diversität von mehr als 2020 (1026) verschiedenen Klonen, während die tatsächlichen Bibliotheken, die hergestellt wurden, nur etwa 109 Klone enthielten; ein unglaublich kleiner Bruchteil der möglichen Diversität. Um die Suche einzuengen und dennoch die Peptiddiversität im Bereich der anfänglich selektierten Peptide weiter zu erkunden, wurde eine partielle Randomisierungstechnik eingesetzt. Diese Technik behält eine Tendenz für die Sequenz der Wildform bei, während eine Mutationsrate von 50% (auf Aminosäureebene) an jeder Aminosäureposition eingeführt wird; folglich würde ein Phagenpräsentiertes Peptid von 20 Aminosäuren 10 Zufallsmutationen erlangen. Zusätzlich brachte die Erwartung weiterer Affinitätsverbesserungen die Erfinder dazu, diese Bibliotheken an monovalenten Phagen zu konstruieren (gIII) (Bass et al., Proteins: Struct. Funct. Genet. 8, 309 (1990); Lowman et al., Biochemistry 30, 10832 (1991)), um Aviditätseffekte zu eliminieren.
  • Monovalente partielle Randomisierungsbibliotheken der Klone 1.1, 5.1 und 7.1 wurden konstruiert und 4 Umläufe lang an HER2 sortiert. Eine Anreicherung von > 10.000fach wurde für Bibliotheken 1.1 und 7.1 beobachtet; jedoch wurde keine Anreicherung von Bibliothek 5.1 beobachtet. Wiederum wurden Zufallsklone selektiert und sequenziert; die abgeleiteten Peptidsequenzen aus Klonen in Bibliotheken 1.1 und 7.1 sind in 15 dargestellt. Mehrere Aminosäurepositionen in den Bibliotheken 1.1 und 7.1 wurden zu 100% beibehalten, dennoch wurden an vielen dieser Positionen mehrere Codons beobachtet. Nach partieller Randomisierung stark beibehaltene Reste könnten für die Bindung entweder durch direkte Kontakte oder aus strukturellen Gründen entscheidend sein.
  • Volle Reifung von HER2-bindenden Sequenzen – Um die Affinitätsreifung von Sequenzen der Klasse 1 zu vervollständigen, wurde ein dritter Satz von Bibliotheken mit fixierten Positionen, die zu 100% konserviert worden waren, und verbleibenden, vollständig randomisierten Positionen konstruiert. Zusätzlich wurde die Rolle von die Disulfidschleife der Klasse-1-Sequenz flankierenden Resten behandelt, indem Bibliotheken konstruiert wurden, bei denen einer der amino- und carboxyterminalen Abschnitte fehlte. Daher wurden 3 monovalente Bibliotheken wie in 16 beschrieben konstruiert. Eine Anreicherung von > 500fach wurde mit jeder Bibliothek mit dem Um lauf 4 beobachtet; die Sequenzen aus Zufallsklonen sind in 16 dargestellt. Obgleich diese Bibliotheken, die bis zu 10 Positionen vollständig randomisierten, bei weitem nicht vollständig waren, demonstrierte ein Vergleich der Volllängen- und aminoterminal trunkierten Bibliotheken eine Bevorzugung eines zusätzlichen Disulfids in der C-terminalen Region der Klasse-1-Sequenz. In beiden Bibliotheken findet sich das zusätzliche Disulfid an 2 Orten. In der dritten Bibliothek schließt die Trunkation der C-terminalen Positionen die Selektion eines zusätzlichen Disulfids an diesen Orten aus. Abgesehen von der Selektion eines zusätzlichen Disulfids sind die an anderen randomisierten Positionen selektierten Reste ziemlich verschiedenartig.
  • Beispiel III
  • Verfahren
  • Peptidsynthese – Peptide wurden entweder durch manuelle oder automatisierte (Milligan 9050) Fmoc-basierte Festphasensynthese in einem Maßstab von 0,25 mmol unter Verwendung eines PEG-Polystyrolharzes synthetisiert (Bodanszky et al., Int. J. Peptide and Protein Res. 23(1), 111 (1984)). Die Seitenkettenschutzgruppen wurden entfernt und das Peptid mit 95% Trifluoressigsäure (TFA) und 5% Triisopropylsilan vom Harz abgespalten. Eine gesättigte Iodlösung in Essigsäure wurde zur Oxidation von Disulfidbindungen zugesetzt. Peptide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines 0,1% TFA enthaltenden Wasser/Acetonitril-Gradienten gereinigt. Die Peptide waren mittels analytischer HPLC zu > 95% rein, und ihre Identität wurde mittels Massenspektrometrie verifiziert.
  • Produktion von Peptid-Z-Fusionen – Auf Bindung an HER2-ECD selektierte Phagen-Peptide wurden aus E. coli (27C7) als Fusionen an die Z-Domäne aus Protein A exprimiert und sekretiert. Es wurden Oligos konstruiert, um die kodierende Sequenz für die Phagen-Peptidsequenzen zwischen der stII-Signalsequenz und der Z-Domäne in ein die Z-Domäne enthaltendes Plasmid (pZCT) zu insertieren. Die Zellen wurden in phosphatlimitiertem Medium gezüchtet, und Peptid-Z-Fusionen wurden aus dem Medium unter Verwendung einer IgG-Affinitätssäule wie beschrieben gereinigt (Dennis et al., Proteins: Struct. Funct. Genetics 15, 312–321 (1993)). Die IgG-affinitätsgereinigte Peptid-Z-Fusion wurde unter Verwendung von NHS-LC-Biotin (Pierce) biotinyliert und mittels Massenspektrometrie charakterisiert.
  • Peptid-Z-Fusionen, die Multimere bildeten, konnten in Monomer und Dimer enthaltende Fraktionen durch Größenausschlusschromatographie an einer Superdex-75-Säule in PBS getrennt werden.
  • Entfernung der Z-Domäne aus gereinigten Peptid-Z-Fusionen – Die Entfernung der Z-Domäne aus gereinigten Peptid-Z-Fusionen wurde durch Verdauen der Fusion mit Trypsin erzielt. Trypsin (1 Gew.-%) wurde 4 Stunden lang bei 37°C in 100 mM Tris, pH 8,0, und 10 mM CaCl2 zugegeben. Das Peptid, frei von der Z-Domäne, wurde dann an einer C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten von 20 bis 50% in 0,1% TFA gereinigt.
  • Konstruktion von Her2-Fc-Expressionsvektor – Standardmäßige DNA-Rekombinationsverfahren wurden zur Konstruktion eines rekombinanten Transfervektors auf Basis des Vektors pVL1393 (Pharmingen) verwendet (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); D. R. O'Reilly, L. K. Miller und V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York (1994)). Das von pVL1393 hergeleitete Plasmid pbPH.His wurde mit Nco I und Sma I linearisiert und mit Alkalischer Phosphatase aus Garnelen behandelt (M. A. Dwyer et al., J. Biol. Chem. 274, 9738–9743 (1999)). Der Fc-Abschnitt des menschlichen IgG1 wurde erlangt als ein Fragment von 700 Basenpaaren durch Restriktionsverdau unter Verwendung von Nde I und anschließender Behandlung mit Klenow und Nco I eines anderen von pVL1393 hergeleiteten Plasmids pVL1393.IgG. Die Signalsequenz für MIP.5 wurde vor der Fc-Sequenz als ein mit EcoR I verdautes PCR-Fragment eingeführt, enthalten in dem Fragment ist eine Asc-I-Stelle. Die Asc-I-Stelle tritt im Anschluss an die mutmaßliche Signalsequenz-Spaltstelle auf. Nach der Ligation wurden kompetente Zellen von E. coli XL-1 Blue transformiert, und es wurden Bakterien auf das korrekte rekombinante Plasmid (pVL1393.MIP.5sig.Fc) mittels DNA-Sequenzanalyse selektiert. Danach wurde pVL1393.MIP.5sig.Fc mit Asc I und Stu I linearisiert und mit Alkalischer Phosphatase aus Garnelen behandelt. Der linearisierte Vektor wurde dann mit einem synthetischen DNA-Stück mit kompatiblen Enden ligiert. Das synthetische DNA-Insert wurde durch Anellieren von 2 Oligos mit den Sequenzen: 5'-CGC GCC CAG GTG TAC GAG TCC TGG GGA TGC ATC GGC CCC GGC TGC GCC TGC CTG CAG GCC TGC CTG GGA GGC GGG AGC TCC GGC-3' (Seq.-ID Nr. 159) und 5'-GCC GGA GCT CCC GCC TCC CAG GCA GGC CTG CAG GCA GGC GCA GCC GGG GCC GAT GCA TCC CCA GGA CTC GTA CAC CTG GG-3' (Seq.-ID Nr. 160) gebildet, die für die Peptidsequenz 1.1FI einschließlich einem GGGSSG-Linker (Seq.-ID Nr. 130) kodieren.
  • Nach der Ligation wurden kompetente Zellen von E. coli XL-1 Blue transformiert, und es wurden Bakterien auf das korrekte rekombinante Plasmid (pVL.1393.MIP5.1.1FI-Fc) mittels DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung des dRhodamin-Farbstoff-Terminatorverfahrens und eines automatisierten DNA-Sequenzierers (Applied Biosystems ABI Model 373) selektiert. Der rekombinante Transfervektor wurde unter Verwendung einer Mini-Prep von Qiagen gereinigt und zur Konstruktion von rekombinantem Baculovirus verwendet.
  • Rekombinantes Baculovirus wurde nach Cotransfektion von Sf9-Zellen mit dem Transfervektor und der linearisierten Baculovirus-DNA der Wildform (Autographacalifornica-nuclear-polyhedrosis-virus (AcNpV), Pharmingen) erzeugt. Eine primäre Amplifikation des rekombinanten Baculovirus erzielte nachweisbare Proteinexpression. Anschließende Plaque-Reinigung und Titration des Virusbestands wurde mittels Plaque-Tests durchgeführt. Standardverfahren wurden wie früher beschrieben eingesetzt (D. R. O'Reilly, L. K. Miller und V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York (1994)).
  • Zellkultur – Anhaftende Kulturen von Spodoptera-frugiperda-(Sf9-)Insektenzellen (ATCC CRL 1711) wurden bei 28°C in mit GRACE's (JRH Biosciences, Nr. 51942-78P), mit Glutamin, Streptomycin/Penicillin und 10% Fötalkälberserum (hitzeinakti viert für 30 Minuten bei 56°C) ergänztem Hink-Insektenmedium TNM-FH gehalten. Die Kulturen wurden alle 3 Tage passagiert. Spinner-Kulturen von High-5-Zellen (Trichoplusia ni, BT1.TN.SB1-4 (Invitrogen)) (500 ml bei 2,0 × 106 Zellen/ml) wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 0,5 infiziert und 60 Stunden nach Transfektion geerntet. Suspensionskulturen wurden in Spinnerflaschen bei 28°C unter Verwendung von proteinfreiem Insektenzellkulturmedium ESF-921 (Expression Systems LLC, Nr. 96-001) gehalten. Die Kulturen wurden alle 3 Tage auf eine Anfangsdichte von 106 Zellen/ml passagiert.
  • Peptid-Fc-Reinigung – Im Anschluss an das optimierte Infektionsprotokoll wurden die High-5-Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 800 × g bei 4°C entfernt. Der geklärte Überstand (0,5 l) wurde unter Verwendung eines Nalgene-Filters mit 0,45 μm filtriert und auf eine 0,5 ml große Hi-Trap-Protein-A-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgegeben, die mit PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) bei 25°C äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit 20 ml PBS wurde die Säule mit 3 ml 0,2 N HOAc eluiert, und Peptid-Fc enthaltende Fraktionen wurden lyophilisiert und bei 4°C gelagert.
  • SDS-PAGE – Proben wurden reduziert und nicht reduziert an einer 4–20%igen Tris-Glycin-SDS-PAGE (Novex) gemeinsam mit vorgefärbten Proteinmolekulargewichtsmarkern (SeaBlue, Novex) unter Anwendung des Verfahrens von Laemmli (U.K. Laemmli, Nature 227, 680–685 (1970)) analysiert.
  • Proteinsequenzierung – Aus den infizierten Sf9-Zell-Überständen gereinigtes 1.1FI-Fc wurde der SDS-PAGE unterzogen und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Elektroblotting auf Immobilon-PSQ-Membranen von Millipore wurde 1 Stunde lang bei 250 mA Konstantstrom in einer Trans-Blot-Transferzelle von BioRad durchgeführt (P. Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, 10035–10038 (1987)). Die PVDF-Membran wurde mit 0,1% Coomassie-Blau R-250 in 50% Methanol gefärbt, 0,5 Minuten und dann 2–3 Minuten lang mit 10% Essigsäure in 50% Methanol entfärbt. Die Membran wurde gründlich mit Wasser gewaschen und vor der Lagerung bei –20°C trocknen gelassen. Die 1.1FI-Fc-Bande bei etwa 50 kD wurde herausgeschnitten, und die ersten 11 Reste wurden unter Verwendung eines mit einem On-line-PTH-Analysators ausgestatteten Sequenzieres (Applied Biosystems, Modell 494A) sequenziert. Peaks wurden mit Software von Justice Innovation unter Verwendung von Nelson-Analytical-760-Schnittstellen integriert. Die Sequenzinterpretation wurde an einem DEC Alpha durchgeführt (W. J. Henzel, H. Rodriguez und C. Watanabe, J. Chromatog. 404, 41–52 (1987)).
  • HER2-Konkurrenz-ELISA – Die Bindung von 1.1FI-Fc an HER2-ECD wurde unter Anwendung eines Konkurrenz-ELISA festgestellt. Proben wurden in PBS-BSA titriert und auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Bindung von 40 nM biotinyliertem 1.1.FI-Z an HER2-ECD, die wie oben beschrieben an Mikrotiterplatten immobilisiert war, zu blockieren. Nach einer einstündigen Inkubation wurde die Platte mit PBS-Tween gewaschen, und es wurde Streptavidin/HRP-Konjugat (Streptavidin-POD, Roche Molecular Biochemicals) 30 Minuten lang zugegeben. Die Platten wurden nochmals mit PBS-Tween gewaschen und die gebundene HRP unter Verwendung von ABTS/H2O2-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories) getestet und die Absorption bei 405 nm gemessen. Die Absorption bei 405 nm wurde gegen die Konzentration von ursprünglich zum Well zugegebener 1.1FI-Fc aufgetragen. Sigmoide Kurven wurden an eine Gleichung mit 4 Parametern mittels nichtlinearer Regressionsanalyse angepasst (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11, 431–441 (1963)); die Konzentration von 1.1FI-Fc, die erforderlich war, um ein halbmaximales Signal im Test zu liefern, wurde aus den Kurven berechnet und wird als der IC50-Wert bezeichnet.
  • Zellbindung – HER2 exprimierende Zellen (BT 474 [3+], MDA 361 [+2] und BaF3 [0+]) wurden mit Trypsin abgelöst, zweimal mit Waschpuffer (0,5% BSA, 1 mM NaOH enthaltendes PBS) gewaschen und in jeweils 0,5 × 106 Zellen enthaltende Fraktionen aufgeteilt. Die Zellen wurden in 0, 0,5 oder 5 μM 1.1.FI-Zb enthaltendem Waschpuffer suspendiert, zweimal mit Waschpuffer gewaschen und in Streptavidin-PE enthaltendem Waschpuffer suspendiert, zweimal mit Waschpuffer gewaschen und der FACS-Analyse unterzogen.
  • Charakterisierung von Peptiden, die HER2-ECD binden – Peptid HER201 wurde entsprechend dem partiell randomisierten Phagenklon 1.1.2 (15) synthetisiert. Zusätzlich wurde auch einem repräsentativen Klon 1.1.FI (16) entsprechendes Peptid HER212, hergeleitet von der vollständig randomisierten Bibliothek voller Länge, synthetisiert. Aufgrund der Anwesenheit von 2 Disulfiden in diesem Peptid wurden orthogonale Schutzgruppen für die Cysteine verwendet, um eine 1–2- und 3–4-Disulfidanordnung zu induzieren. Diese Anordnung wurde wegen der Reihenfolge vermutet, in der sich die Disulfidbindungen während des Selektionsprozesses entwickelten.
  • Zusätzlich wurden dieses Peptid und eine aus dem Consensus der Bibliothek 7.1 (15) (7.1c) stammende Peptidsequenz aus E. coli exprimiert und sekretiert, und zwar als Fusion an die Z-Domäne von Protein A (1.1.FI-Z und 7.1c-Z genannt), wo die Oxidation von Cystein auftreten darf, wie sie während der Phagenproduktion stattfindet. Das 1.1.FI-Z-Präparat wurde biotinyliert (1.1.FI-Zb) und an immobilisiertes HER2 mit einer EC50 von 2 nM bezogen auf die Gesamtproteinkonzentration gebunden (6) und diente als Reagens für den Konkurrenz-ELISA.
  • Die Peptide HER201, HER212 sowie die rekombinanten Proteinfusionen 1.1.FI-Z und 7.1c-Z wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von 1.1.FI-Zb an immobilisiertes HER2 zu blockieren (7). HER201 und 7.1c-Z hatten IC50-Werte von 300 bzw. 1.100 nM. Interessanterweise wiesen HER212 und 1.1.FI-Z, die von derselben Phagen-Peptid-Sequenz abstammten, drastisch unterschiedliche IC50-Werte auf: 9 μM bzw. 50 nM. Eine der Erklärungen könnte sein, dass eine andere Disulfidanordnung bei der Synthese von HER212 erzwungen wurde. Außerdem offenbarte die SDS-PAGE-Analyse von 1.1.FI-Z (8B) (Spur S) ein heterogenes Gemisch, wahrscheinlich aufgrund von durch intermolekulare Disulfiden verursachter Multimerisierung. Die massenspektroskopische Analyse bestätigte die Gegenwart von Dimer 1.1.FI-Z, während HER212 nur als Monomer zugegen war.
  • Das 1.1.FI-Z-Präparat wurde unter Verwendung von Superdex 75 weiter zu Monomer und Dimer enthaltenden Fraktionen gereinigt (8A und 8B). Überraschenderweise deckte sich HER2-Bindungsaktivität bei Testung im HER2-Konkurrenz-ELISA mit den Dimerfraktionen und nicht mit den Monomerfraktionen (8B und 8C).
  • Außerdem wurde 1.1.FI-Z mit Trypsin verdaut, um die Z-Domäne zu entfernen, sowie der Umkehrphasen-HPLC unterzogen. Fraktionen aus der HPLC wurden auf ihre Fähigkeit getestet, im HER2-Konkurrenz-ELISA zu konkurrieren. Die aktive Fraktion hatte eine Masse, die der Sequenz von HER212 entsprach, enthielt jedoch auch Dimer. Diese Fraktion hatte eine IC50 von 3 nM im HER2-Konkurrenz-ELISA bezogen auf die Proteinkonzentration.
  • In einem Versuch, die Dimerbildung zu erleichtern, wurde ein Expressionsvektor konstruiert, in dem die Aminosäuresequenz von 1.1.FI vor der Fusion mit der Z-Domäne zweimal wiederholt war (9). Obwohl dieses „Einzelkettendimer" ((FI)2-Z genannt) bei Expression auch Dimer produzierte, war die hauptsächlich gebildete Spezies Monomer (9B). Außerdem wurde die aktive Spezies bei Fraktionierung an einer Superdex-75-Säule (9A) und Testen im HER2-Konkurrenz-ELISA nunmehr als Monomer identifiziert (9B und 9C). (FI)2-Z hatte eine ähnliche Affinität für HER2 wie das 1.1.FI-Z-Dimer (IC50 = 20 nM).
  • Bindungsstelle am HER2 – Um zu testen, ob Sequenzen der Klasse 1 und Klasse 7 an dieselben oder an unabhängige Stellen am HER2 banden, wurde die Bindung der Phagenklone aus Klasse-1- und Klasse-7-Bibliotheken an immobilisiertes HER2 in Gegenwart von HER201 oder 7.1c-Z untersucht. Aus 10A und 10B ist offensichtlich, dass HER201 und 7.1c-Z die Bindung von Phagen der Klasse 1 sowie Klasse 7 blockieren, was nahe legt, dass beide Klassen an dieselbe Stelle am HER2 binden. Eine nähere Betrachtung der in diesen beiden Klassen erhaltenen Sequenzen offenbarte eine Kernhomologieregion (11).
  • Die Bindungssttelle der Klasse-1- und Klasse-7-Peptide scheint auch dahingehend eine neue Stelle am HER2 zu sein, dass monoklonale Antikörper gegen HER2 nicht direkt mit der 1.1.FI-Phagenbindung an immobilisiertes HER2 konkurrierten (12). Ansteigende Konzentrationen verschiedener monoklonaler Antikörper wurden zur Blockierung der 1.1.FI-Phagenbindung an immobilisiertes HER2 ohne Wirkung hinzugefügt. Es wird angenommen, dass die Verminderung der Bindung bei sehr hohen Konzentrationen von 3H4 (> 100 nM) aus einer indirekten Wirkung resultieren, da die Affinität dieses monoklonalen Antikörpers für HER2 unter 100 pM beträgt.
  • Zellbindung – 1.1.FI-Zb wurde auf seine Fähigkeit getestet, auf Zellen exprimiertes HER2 zu erkennen. Drei Zelltypen, die HER2 in unterschiedlichen Ausmaßen exprimierten, wurden untersucht: BT 474 [3+] (3 × 106 Rezeptoren/Zelle), MDA 361 [2+] (4 × 105 Rezeptoren/Zelle) und eine Kontrollzelllinie, die HER2 nicht exprimiert, BaF3. Mittels FACS-Analyse zeigte sich, dass 1.1.FI-Zb proportional zur Anzahl von HER2 von Rezeptoren, die pro Zelle exprimiert wird, und zur Konzentration von verwendetem 1.1.FI-Zb an Zellen bindet (13).
  • Peptid-Fc-Fusionen – Für die 1.1.FI-Sequenz kodierende DNA wurde über einen Linker an ein Fc aus einem IgG1 fusioniert und in Baculovirus exprimiert. Das resultierende Protein wurde an einer Protein-A-Säule gereinigt und unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE charakterisiert (14). Eine eindeutige Molekulargewichtsverschiebung wird unter diesen beiden Bedingungen beobachtet, was eine Dimerisierung des Fc nahe legt. Dieses Molekül weist beim Testen seiner Fähigkeit, 1.1FI-Phagenbindung an immobilisiertes HER2 zu blockieren, eine IC50 von 3 nM auf. Beim Testen im HER2-Konkurrenz-ELISA wies 1.1FI-Fc eine ähnliche IC50 wie 1.1FI-Z auf, was darauf hinweist, dass die 1.1FI-Sequenz vollauf fähig war, HER2 bei Fusionierung an Fc zu binden (17).
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Claims (36)

  1. Isolierter Peptidligand, der HER2 in einem In-vitro-Test bindet, worin für den Peptidliganden die Formel: Xaa(1-14)-Cys-Xaa16-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(21-27) (Seq.-ID Nr. 90) gilt, worin Xaa(1-14) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und vierzehn Aminosäuren umfasst; Xaa16 eine aus der aus Met, Thr, Cys und Ile bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa(21-27) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und sieben Aminosäuren umfasst.
  2. Peptidligand nach Anspruch 1 mit der folgenden Formel: Xaa(1-7)-Cys-Xaa9-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(14-20) (Seq.-ID Nr. 92), worin Xaa(1-7) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und sieben Aminosäuren umfasst; und Xaa9 eine aus der aus Met, Ile, Thr oder Cys bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa(14-20) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und sieben Aminosäuren umfasst.
  3. Peptidligand nach Anspruch 2 mit der folgenden Formel: Xaa(1-7)-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(14-20) (Seq.-ID Nr. 161).
  4. Peptidligand mit der Formel AZA, worin A der Peptidligand nach Anspruch 3 ist und "Z" für eine optionale Linkerdomäne steht.
  5. Isolierter Peptidligand, der HER2 in einem In-vitro-Test bindet, worin für den Peptidliganden die Formel Xaa(1-5)-Trp-Xaa7-Cys-Xaa9-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa(14-20) (Seq.-ID Nr. 93) gilt, worin Xaa(1-5) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und fünf Aminosäuren umfasst, Xaa7 für Gly steht, Xaa9 für Ile steht und Xaa(14-20) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und sieben Aminosäuren umfasst.
  6. Peptidligand nach Anspruch 5 mit der folgenden Formel: Xaa(1-3)-Glu-Xaa5-Trp-Gly-Cys-Ile-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa14-Xaa15-Leu-Xaa(17-20) (Seq.-ID Nr. 91), worin Xaa(1-3) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und drei Aminosäuren umfasst, Xaa5 eine Aminosäure ist, Xaa14 eine Aminosäure ist, Xaa15 eine Aminosäure ist, Xaa19 eine Aminosäure ist und -Xaa(17-20) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und vier Aminosäuren umfasst.
  7. Peptidligand nach Anspruch 6, worin Xaa(1-3) nicht vorhanden ist oder aus der aus: Gln-Arg-Asn-, Leu-Ser-Pro-, Glu-Asn-Trp-, Ala-Ser-His-, Lys-Leu-Asn-, Thr-Gln-Ala-, Ala-Pro-Arg-, Gln-Val-Tyr-, Arg-Thr-Glu-, Phe-Ala-Gly-, Thr-Ala-Arg-, Arg-Pro-His-, Asn-Val-Cys-, Cys-Ile-Asp-, Tyr-Glu-Trp-, Arg-Trp-Asp-, His-Trp-Met-, Asn-Trp-Pro-, Phe-Asn-Trp-, Phe-Ser-Gly-, Gly-Gly-Trp-, Leu-Trp-Phe-, Gly-Ile-Pro-, Trp-Trp-Thr-, Leu-Gly-Trp-, Ser-Pro-Trp-, Arg-Gly-Trp- bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa5 aus der aus: Ala, Thr, Met, Val, Arg, Glu, Asp, Ser, Gln, Pro, Gly, Phe und Lys bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa14 aus der aus: Glu, Lys, Arg, Asp, Ser, Ala, Asn, Gly, Pro und Gln bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa15 aus der aus: Met, Phe; Ala, Met, Cys, Gln, Glu, Ala, Trp, Phe, Leu, Val, Tyr, Trp bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und -Xaa(17-20) ein vier Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: -Xaa17-Xaa18-Cys-Xaa20 ist.
  8. Peptidligand nach Anspruch 7, worin -Xaa(17-20) aus der aus: -Gln-Ala-Cys-Met (Seq.-ID Nr. 102), -Leu-Gln-Cys-Trp (Seq.-ID Nr. 103), -Met-Ser-Cys-Val (Seq.-ID Nr. 104), -Leu-Arg-Cys-Ile (Seq.-ID Nr. 105), -Gln-Ala-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 106), -Leu-Ser-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 107), -Ile-Gly-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 108), -Leu-Ala-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 109), -Leu-Ser-Cys-Ile (Seq.-ID Nr. 110), -Met-Asn-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 111), -Leu-Arg-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 112), -Leu-Lys-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 113), -Leu-Gly-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 114), -Leu-Asn-Cys-Ile (Seq.-ID Nr. 115), -Met-Gly-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 116) und -Met-Ala-Cys-Leu (Seq.-ID Nr. 117) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  9. Peptidligand nach Anspruch 6, worin -Xaa(17-20) ein vier Aminosäuren umfassendes Peptid, bestehend aus der folgenden Formel: -Cys-Xaa18-Xaa19-Cys, ist, worin Xaa18 eine Aminosäure ist und Xaa19 eine Aminosäure ist.
  10. Peptidligand nach Anspruch 9, worin -Xaa(17-20) aus der aus: -Cys-Ala-Trp-Cys (Seq.-ID Nr. 118), -Cys-Ser-Trp-Cys (Seq.-ID Nr. 119), -Cys-Glu-Pro-Cys (Seq.-ID Nr. 120), -Cys-Asp-Trp-Cys (Seq.-ID Nr. 121), -Cys-Glu-Trp-Cys (Seq.-ID Nr. 122), -Cys-Asn-Trp-Cys (Seq.-ID Nr. 123) und -Cys-Gly-Trp-Cys (Seq.-ID Nr. 124) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  11. Isolierter Peptidligand, der sich an HER2 in einem In-vitro-Test bindet und für den die Formel: Xaa(1-10)-Glu-Xaa12-Trp-Xaa14-Cys-Cys-Gly-Pro-Gly-Cys-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa(24-27) (Seq.-ID Nr. 126) gilt, worin Xaa(1-10) nicht vorhanden ist oder zwischen 1 und 10 Aminosäuren umfasst; Xaa12 eine Aminosäure ist; Xaa14 eine Aminosäure ist; Xaa21 eine Aminosäure ist; Xaa22 eine Aminosäure ist; Xaa23 eine aus der aus Val und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist und Xaa(24-27) nicht vorhanden ist oder zwischen einer und vier Aminosäuren umfasst.
  12. Peptidligand nach Anspruch 11, worin Xaa(1-10) ein zehn Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: -Cys-Xaa(2-7)-Cys-Xaa9-Gly- ist; Xaa(24-27) ein vier Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: Xaa(24-26)-Cys ist, worin Xaa(2-7) ein sechs Aminosäuren umfassendes Peptid ist und Xaa(24-26) ein drei Aminosäuren umfassendes Peptid ist.
  13. Peptidligand mit der Formel BZB, worin B der Peptidligand nach Anspruch 12 ist und "Z" für eine optionale Linkerdomäne steht.
  14. Peptidligand mit der Formel AZB, worin A der Peptidligand nach Anspruch 3 und B der Peptidligand nach Anspruch 12 ist und worin "Z" für eine optionale Linkerdomäne steht.
  15. Peptidligand nach Anspruch 12, worin Xaa(1-10) ein zehn Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: Cys-Xaa2-Trp-Val-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa9-Gly- (Seq.-ID Nr. 127) ist.
  16. Peptidligand nach Anspruch 15, worin Xaa(1-10) ein zehn Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: Cys-Xaa2-Trp-Val-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa9-Gly- (Seq.-ID Nr. 127) ist und Xaa2 eine aus der aus Ala und Ser bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa5 eine aus der aus Ser, Leu, Ala, Arg und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa6 eine aus der aus Phe, Val und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa7 eine aus der aus Asp, Gln, Tyr, Trp, Leu und His bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa9 eine aus der aus Gly, Phe und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist.
  17. Peptidligand nach Anspruch 16, worin Xaa(1-10) ein zehn Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: Cys-Ser-Trp-Val-Leu-Xaa6-Xaa7-Cys-Gly-Gly- (Seq.-ID Nr. 162) ist.
  18. Peptidligand nach Anspruch 17, worin Xaa(1-14) ein drei Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: Xaa24-Xaa25-Xaa26 ist und Xaa24 eine aus der aus Trp, Val, Gly und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa25 eine aus der aus Asn, Lys, Asp, Glu und His bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa26 eine aus der aus Ala, Ser und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist.
  19. Peptidligand nach Anspruch 17, worin Xaa(24-26) ein drei Aminosäuren umfassendes Peptid mit der folgenden Formel: Xaa24-Xaa25-Xaa26 ist und Xaa24 eine aus der aus Trp, Val, Gly und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa25 eine aus der aus Asn, Lys, Asp, Glu und His bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa26 eine aus der aus Ala, Ser und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist.
  20. Peptidligand nach Anspruch 19, worin Xaa24 für Val; Xaa25 für Asn; und Xaa26 für Ala steht.
  21. Polypeptid, umfassend: (a) einen Peptidliganden nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und (b) eine Immunglobulinsequenz der konstanten Region.
  22. Polypeptid nach Anspruch 21, ferner eine Linkersequenz umfassend.
  23. Polypeptid nach Anspruch 21 oder 22, worin die Immunglobulinsequenz der konstanten Region die konstante Domäne einer IgG-Schwerkette ist.
  24. Polypeptid nach Anspruch 23, worin die Sequenz der konstanten Region die CH3-Domäne einer Immunglobulinschwerkette umfasst.
  25. Polypeptid nach Anspruch 24, ferner umfassend die Gelenksregion einer Immunglobulinschwerkette.
  26. Polypeptid nach Anspruch 25, worin die Sequenz der konstanten Region zumindest funktionell aktive Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer immunglobulinschwerkette umfasst.
  27. Polypeptid, das einen Peptidliganden nach einem der Ansprüche 1 bis 20 umfasst, der ferner eine zusätzliche funktionelle Gruppierung umfasst.
  28. Polypeptid nach Anspruch 27, worin die zusätzliche funktionelle Gruppierung aus der aus einem zytotoxischen Mittel und einem Enzym bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  29. Polypeptid nach Anspruch 27, worin die zusätzliche funktionelle Gruppierung ein zytotoxisches Mittel ist.
  30. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Peptidliganden nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder das Polypeptid nach einem der Ansprüche 21 bis 29 und einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger.
  31. Isoliertes DNA-Molekül, das für den Peptidliganden nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder das Polypeptid nach einem der Ansprüche 21 bis 29 kodiert.
  32. DNA-Molekül nach Anspruch 31, ferner umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die operabel an das DNA-Molekül gebunden ist.
  33. Expressionsvektor, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 31, worin die Kontrollsequenz von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt wird.
  34. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 33 transformiert ist.
  35. Verfahren zur Expression eines DNA-Moleküls, das für einen Peptidliganden kodiert, in einer Wirtszelle, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 34 unter Bedingungen, die für Expression des Peptidliganden geeignet sind.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, ferner umfassend das Gewinnen des Peptidliganden aus dem Kulturmedium.
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