DE112017005457T5

DE112017005457T5 - Fc-bereich von aglykosylierten antikörpern zur krebsbehandlung

Info

Publication number: DE112017005457T5
Application number: DE112017005457.5T
Authority: DE
Inventors: Sang Taek Jung; Migyeong Jo
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Kookmin University
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Kookmin University
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2019-07-11
Also published as: GB2571036A; US20190352396A1; US20220348654A1; GB201907421D0; AU2017348982A1; AU2017348982B2; GB2571036B; US11414493B2; WO2018079997A1

Abstract

Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Fc-Domäne enthält, in der ein Teil einer Aminosäuresequenz einer humanen Fc-Domäne eines humanen Antikörpers mit einer anderen Aminosäuresequenz substituiert ist, oder einen dieselbe enthaltenden aglycosylierten Antikörper. Die Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung wird durch Substituieren eines Teils einer Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Fc-Domäne durch eine andere Aminosäuresequenz optimiert. Deshalb ist sie bei der Behandlung von Krebs aufgrund einer überlegenen selektiven Bindungsfähigkeit an FcγRIIIa unter den Fc-Rezeptoren nützlich und kann als homogener aglycosylierter Antikörper durch Bakterienkultur hergestellt werden.

Description

[Technischer Bereich]
Die vorliegende Offenbarung betrifft einen für die Krebsbehandlung nützlichen Fc-Bereich von aglykosylierten Antikörpern und ein Verfahren zu dessen Vorbereitung.
[Stand der Technik]
Mit der weltweiten Entwicklung der Biotechnologie wie genetische Rekombination, Zellkultivierung usw. wurden Forschungen zur Struktur und Funktion von Proteinen aktiv durchgeführt. Sie tragen wesentlich zur Verbesserung der Lebensqualität bei, indem sie das Verständnis biologischer Phänomene fördern und den Mechanismus verschiedener Krankheiten erklären und so den Weg zur effektiven Diagnose und Behandlung von Krankheiten ebnen. Insbesondere seit der Entwicklung der Hybridom-Technologie, die monoklonale Antikörper durch Fusion von B-Zellen mit Myelomzellen produziert, im Jahr 1975 (Kohler und Milstein, Natur256: 495-497, 1975), werden Forschungen und Entwicklungen aktiv in der Immuntherapie unter Verwendung therapeutischer Antikörper in klinischen Bereichen wie Krebs, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Infektionen usw. durchgeführt.
Therapeutische Antikörper gelten als eine der wirksamsten Krebstherapien, da sie im Vergleich zu den vorhandenen niedermolekularen Arzneimitteln eine sehr hohe Zielspezifität aufweisen, eine geringe biologische Toxizität und wenig Nebenwirkungen aufweisen und eine bessere Plasmahalbwertszeit von etwa 3 Wochen aufweisen. In der Tat beschleunigen große globale Pharmaunternehmen und Forschungsinstitute ihr Tempo in der Forschung und Entwicklung von therapeutischen Antikörpern, die durch gezielte Bindung ankrebserregende Faktoren und Krebszellen diese wirksam entfernen. Zu den führenden Pharmaunternehmen, die therapeutische Antikörper entwickeln, gehören Roche, Amgen, Johnson & Johnson, Abbott, BMS, usw. Insbesondere erzielt Roche mit den drei repräsentativen therapeutischen Antikörpern Herceptin, Avastin und Rituxan einen beachtlichen Gewinn, der sich im Jahr 2012 auf rund 19,5 Milliarden Dollar Umsatz weltweit belief und führt den weltweiten Markt für Antikörpermedikamente an. Johnson & Johnson, der Entwickler von Remicade, wächst auf dem globalen Antikörpermarkt ebenfalls schnell. Es ist auch bekannt, dass andere pharmazeutische Unternehmen wie Abbott, BMS usw. viele therapeutische Antikörper in der letzten Entwicklungsstufe haben. Somit ersetzen Biopharmazeutika, einschließlich therapeutischer Antikörper, die für Zielkrankheiten spezifisch sind und wenig Nebenwirkungen haben, rasch niedermolekulare Arzneimittel, die auf dem globalen Pharmamarkt vorherrschend sind.
Einer der wichtigsten Mechanismen therapeutischer Antikörper ist, Immunzellen zu rekrutieren und sie auf Antigene zu richten. Die Fc-Domäne des Antikörpers spielt eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Immunzellen und antikörperabhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC). Insbesondere hängt die ADCC-Funktion des Antikörpers von der Wechselwirkung mit den auf der Oberfläche vieler Zellen vorhandenen Fc-Rezeptoren (FcR) ab. Menschliche Fc-Rezeptoren werden in 5 Typen eingeteilt. Der Typ der rekrutierten Immunzellen wird durch den Fc-Rezeptor bestimmt, an den der Antikörper gebunden ist. Dementsprechend ist ein Versuch, den Antikörper zu modifizieren, um spezifische Zellen zu rekrutieren, auf therapeutischem Gebiet sehr wichtig.
Die meisten der bisher gemachten Versuche bestanden jedoch darin, die Fc-Domäne unter Verwendung von von Säugetieren exprimierten IgG-Molekülen zu modifizieren. Die Säugetierantikörper sind glykosyliert. An den Fc-Bereich des glycosylierten Antikörpers angehängte Glycan-Ketten ermöglichen dem Antikörper an den Fc-Rezeptor zu binden durch Stabilisierung der Proteinstruktur. Im Gegensatz dazu fehlt den in Bakterien produzierten aglykosylierten Antikörpern an den mit dem Fc-Bereich verknüpften Glycan-Ketten. Daher können sie nicht an die Fc-Rezeptoren binden und zeigen keine ADCC-Funktion. Wenn daher ein aglykosylierter Antikörper entwickelt wird, der an den Fc-Rezeptor binden kann, kann der Antikörper unter Verwendung von Bakterien anstelle von Tierzellen hergestellt werden, was zu Kostensenkungen führt.
Außerdem besteht das Problem, dass, obwohl der Säugetierantikörper mit dem modifizierten Fc-Bereich eine erhöhte Bindungsfähigkeit an einen spezifischen Fc-Rezeptor aufweist, unerwünschte Immunantwort auftreten kann, da er die Bindungsfähigkeit auch an andere Fc-Rezeptoren beibehält. Es gibt fünf Haupt-FcyRs für den Menschen. Vier der Rezeptoren induzieren Immunaktivierung oder Entzündungsreaktion, und FcγRIIb induziert Immunhemmung oder eine entzündungshemmende Reaktion. Die meisten der natürlich produzierten Antikörper oder rekombinanten glykosylierten Antikörper binden sowohl an die aktivierenden als auch an die inhibierenden Fc-Rezeptoren. Die ADCC-induzierende Fähigkeit eines Antikörpers hängt von dem Verhältnis seiner Fähigkeit zur Bindung an aktivierendes FcγR und der Fähigkeit zur Bindung an inhibitorisches FcγRIIb (A/I-Verhältnis) ab (Boruchov et al. J Clin Invest115 (10): 2914-23, 2005). Da FcγRIIb jedoch eine 96 %-ige Sequenzidentität mit aktivierendem FcγR teilt, schlägt der Versuch, das A/I-Verhältnis durch die Einführung genetischer Mutation in den glykosylierten Antikörper zu erhöhen, fehl.
Unter den verschiedenen Immunzellen, die am Mechanismus der Abtötung von Krebszellen unter Verwendung von derzeit klinisch verwendeten therapeutischen IgG-Antikörpern beteiligt sind, ist inzwischen bekannt, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) die stärkste Krebszellen abtötende Wirkung haben. Anders als andere Immunzellen (z. B. Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen) exprimieren die NK-Zellen auf ihren Oberflächen FcγRIIIa und exprimieren nicht FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb und FcγRIIIb. Um den Mechanismus zum Abtöten von Krebszellen im Unterschied zu den bestehenden therapeutischen Antikörpern zu maximieren, ist es daher wichtig, die Affinität für FcγRIIIa, exprimiert auf der Oberfläche der NK-Zellen, durch Optimierung des Fc-Bereichs des IgG-Antikörpers zu verbessern.
Die oben gegebene Beschreibung des Standes der Technik dient nur dazu, das Verständnis des Hintergrunds der vorliegenden Offenbarung zu verbessern, und sollte nicht als dem durchschnittlichen Fachmann auf dem verwandten Gebiet bekannt aufgefasst werden.
[Offenbarung]
[Technisches Problem]
Die Erfinder der vorliegenden Offenbarung haben beständige Anstrengungen unternommen, um einen aglykosylierten Antikörper zu entwickeln, der kein Heterogenitätsproblem der vorhandenen glykosylierten Antikörper aufweist und eine verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa, exprimiert auf der Oberfläche von NK-Zellen, aufweist. Als Ergebnis haben sie festgestellt, dass die Bindungsfähigkeit an FcγRIIIa selektiv zwischen Fc-Rezeptoren durch Optimierung stark verbessert wird, indem ein Teil einer Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Fc-Domäne durch eine andere Aminosäuresequenz substituiert wird und dadurch die Krebszellen abtötende Wirkung von NK-Zellen verstärkt wird.
Die vorliegende Offenbarung ist darauf gerichtet, ein Polypeptid bereitzustellen, das eine Fc-Domäne enthält, in der ein Teil einer Aminosäuresequenz einer humanen Antikörper Fc-Domäne mit einer anderen Aminosäuresequenz substituiert ist.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, einen das Polypeptid enthaltenden aglykosylierten Antikörper bereitzustellen.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, ein Nukleotidmolekül bereitzustellen, das das Polypeptid codiert.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, einen Vektor bereitzustellen, der das Nukleotidmolekül enthält.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, eine Wirtszelle bereitzustellen, die den Vektor enthält.
Die vorliegende Offenbarung ist auch auf die Bereitstellung einer Zusammensetzung gerichtet, die das Polypeptid, den aglykosylierten Antikörper, das Nukleotidmolekül oder den Vektor enthält.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Krebs bereitzustellen, das einen Schritt des Verabreichens des Polypeptids, des aglykosylierten Antikörpers, des Nukleotidmoleküls oder des Vektors einschließt.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids oder des aglykosylierten Antikörpers bereitzustellen.
Die vorliegende Offenbarung ist auch darauf gerichtet, ein Verfahren zum Screenen eines Polypeptids bereitzustellen, das eine an FcγRIIIa bindende Fc-Domäne enthält.
Andere Zwecke und Vorteile der vorliegenden Offenbarung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen ersichtlich.
[Technische Lösung]
In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Polypeptid bereit, das eine Fc-Domäne enthält, in der ein Teil einer Aminosäuresequenz einer Fc-Domäne humaner Antikörper mit einer anderen Aminosäuresequenz substituiert ist.
Die Erfinder der vorliegenden Offenbarung haben beständige Anstrengungen unternommen, um einen aglykosylierten Antikörper zu entwickeln, der kein Heterogenitätsproblem der vorhandenen glykosylierten Antikörper aufweist und eine verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa, exprimiert der auf der Oberfläche von NK-Zellen, aufweist. Als Ergebnis haben sie festgestellt, dass die Bindungsfähigkeit an FcγRIIIa selektiv zwischen Fc-Rezeptoren durch Optimierung stark verbessert wird, indem ein Teil einer Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Fc-Domäne durch eine andere Aminosäuresequenz substituiert wird, wodurch die Krebszellen abtötende Wirkung von NK-Zellen verstärkt wird.
Ein Antikörper ist ein Protein, das spezifisch an ein bestimmtes Antigen bindet. Ein natürlicher Antikörper ist ein heterodimeres Glykoprotein von etwa 150.000 Dalton, das üblicherweise aus zwei identischen leichten Ketten (L) und zwei identischen schweren Ketten (H) besteht.
Die in der vorliegenden Offenbarung verwendeten humanen Antikörper bestehen aus fünf Hauptklassen von IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Speziell handelt es sich um IgG. Ein durch Papain verdauter Antikörper ergibt zwei Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment. Der Fc-Bereich wird aus dem humanen IgG-Molekül hergestellt, da der N-Terminus von Cys 226 durch Papain gespalten wird (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).
Die Fc-Domäne der Antikörper kann eine Fc-Domäne des IgA-, IgM-, IgE-, IgD- oder IgG-Antikörpers oder eine Variante davon sein. In einer beispielhaften Ausführungsform ist die Domäne eine Fc-Domäne des IgG-Antikörpers (z. B. Fc-Domäne des IgG1-, IgG2a-, IgG2b-, IgG3- oder IgG4-Antikörpers). In einer beispielhaften Ausführungsform kann die Fc-Domäne die IgG1-Fc-Domäne sein (z. B. die Fc-Domäne des Anti-HER2-Antikörpers, insbesondere die Fc-Domäne von Trastuzumab). Das die Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung enthaltende Polypeptid kann überhaupt nicht glykosyliert sein, oder nur ein Teil des Polypeptids (z. B. die Fc-Domäne) kann glykosyliert sein. Das Polypeptid kann ferner zusätzlich zu der Fc-Domäne einen oder mehrere von einem Antikörper abgeleiteten Bereich enthalten. Zusätzlich kann das Polypeptid ferner eine von Antikörpern abgeleitete Antigen-Bindungsdomäne enthalten. Mehrere Polypeptide können auch einen Antikörper oder ein Protein vom Antikörpertyp bilden.
In der vorliegenden Offenbarung folgt die Nummerierung der Aminosäurereste der Fc-Domäne des Antikörpers dem üblicherweise verwendeten Kabat-Nummerierungssystem (Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, 5. Auflage, US Department of Health und Human Services NIH-Veröffentlichung Nr. 91-3242 (1991).
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 8 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem: S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D and M428L ein.
In einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wird die aglycosylierte Fc-Domäne mutiert, um an ein oder mehrere von FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, FcγRIIIb oder FcαRI zu binden. Die mutierte aglycosylierte Fc-Domäne kann 10 % oder weniger, 20 % oder weniger, 30 % oder weniger, 40 % oder weniger, 50 % oder weniger, 60 % oder weniger, 70 % oder weniger, 80 % oder weniger, 90 % oder weniger, 100 %, 2-fach oder höhere, 3-fach oder höhere, 4-fach oder höhere, 5-fach oder höhere, 6-fach oder höhere, 7-fach oder höhere, 8-fach oder höhere, 9-fach oder höhere, 10-fach oder höhere oder 20-fach oder höhere Bindungsfähigkeit an einen oder mehrere der obigen Fc-Rezeptoren im Vergleich zur glykosylierten Wildtyp-Fc-Domäne aufweisen.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung weist die im Polypeptid der vorliegenden Offenbarung enthaltene Fc-Domäne eine verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa auf, im Vergleich zu der Fc-Domäne, die nicht mit den obigen 8 Aminosäuren substituiert ist.
Nach den Beispielen der vorliegenden Offenbarung bindet die Fc-Domäne mit nur substituierten S298G, T299A, N390D, E382V und M428L (Fc1004, US-Patent Nr. 8,952,132 ) nicht an FcγRIIIa wie die Wildtyp-Fc-Domäne und die Fc-Domäne mit nur substituierten T299A, K326I, A327Y und L328G (A/IYG, US-Patent Nr. 8,815,237 ) zeigt auch eine sehr geringe Erhöhung der Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa im Vergleich zur Wildtyp-Fc-Domäne. Im Gegensatz dazu zeigt die Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung, die die obigen 8 Aminosäuresubstitutionen einschließt, eine signifikant verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa im Vergleich zu der Wildtyp-Fc-Domäne, Fc1004 oder A/IYG (Beispiele 3 und 4).
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung umfasst die Aminosäuresubstitution der vorliegenden Offenbarung eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuresubstitution, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus C226R, F243L, K246E, T250I, I253N, V264E, T307S, C347R, T350A, S400T und N421S nach dem Kabat-Nummerierungssystem.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung weist die Fc-Domäne mit 9 oder mehr substituierten Aminosäuren in der vorliegenden Offenbarung, eine verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa auf, im Vergleich zu der Fc-Domäne mit nur den 8 substituierten Aminosäuren S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
Nach den Beispielen der vorliegenden Offenbarung weist die Fc-Domäne mit 9 oder mehr substituierten Aminosäuren eine um 40 % oder mehr erhöhte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa auf, im Vergleich zu der Fc-Domäne, mit nur den 8 Aminosäuren substituiert (MG42: 40 % oder mehr; MG61: 50 % oder mehr; MG54, MG59 und MG86: 200 % oder mehr; MG14 und MG87: 300% oder mehr; MG48: 500 % oder mehr; 6A-6C).
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 9 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: S298G, T299A, T307S, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 9 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, C347R, E382V, N390D und M428L.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 10 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, T350A, E382V, N390D und M428L.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 10 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: T250I, I253N, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 10 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D, N421S und M428L.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließtdie substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 11 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, T350A, E382V, N390D, N421S und M428L.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung schließt die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung die folgenden 11 Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem ein: C226R, F243L, K246E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung einen aglykosylierten Antikörper bereit, der das Polypeptid enthält.
In der vorliegenden Offenbarung bedeutet der Begriff „Antikörper“ einen polyklonalen Antikörper, einen monoklonalen Antikörper, einen humanen Antikörper und einen humanisierten Antikörper und Fragmente davon.
Alle derzeit im Handel erhältlichen therapeutischen Antikörper werden durch Tierzellkultivierung hergestellt. Wenn die Antikörper hergestellt werden, werden die Antikörperproteine durch verschiedene Zuckervarianten (Kohlenhydratvarianten) modifiziert. In dieser Hinsicht bewirkt die Glycan-Heterogenität eine Variation in der Wirksamkeit und Stabilität der Antikörper, und für die Reinigung, Analyse und Qualitätskontrolle (QC) während des Vorbereitungsprozesses der Antikörper sind hohe Kosten erforderlich.
Im Vergleich zu den glykosylierten Antikörpern, die das kostspielige Tierzellkultivierungssystem erfordern, können aglykosylierte Antikörper in großem Maßstab in Bakterien produziert werden und weisen eine überlegene, hervorragende Leistung in Bezug auf Geschwindigkeit und Kosten auf. Während das an der Asn297-Aminosäure des glykosylierten Antikörpers gebildete N-verknüpfte Glycan eine kritische Rolle in der Struktur und Funktion des Antikörpers spielt, hat der Fc-Bereich des aglycosylierten Antikörpers eine geschlossene Struktur mit geschlossenem CH2-Bereich oder eine sehr flexible Struktur im Unterschied zu dem glykosylierten Antikörper Fe, der in tierischen Zellen produziert wird. Daher kann der aglykosylierte Antikörper nicht an FcγRIIIa binden, was eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung und Aktivierung von NK-Zellen spielt und keine Krebszellen abtötende Wirkung zeigt.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt der Antikörper durch Optimierung des Fc-Bereichs der aglykosylierten Antikörper (8 Aminosäuresubstitutionen von S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L) einen maximalen Krebszellen abtötenden Mechanismus durch eine verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa, exprimiert auf der Oberfläche von NK-Zellen, während er in Bakterien mit geringen Kosten ohne das Problem der Glykan-Heterogenität produziert werden kann.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Nukleotidmolekül bereit, das das Polypeptid kodiert, einen Vektor, der das Nukleotidmolekül enthält, oder eine den Vektor enthaltende Wirtszelle.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids bereit, das eine Fc-Domäne humaner Antikörper enthält, die Folgendes einschließt:

a) einen Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle, die einen Vektor enthält, der ein Nukleotidmolekül enthält, das das oben beschriebene Polypeptid codiert; und
b) einen Schritt zur Gewinnung des von der Wirtszelle exprimierten Polypeptids.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Herstellung eines aglykosylierten Antikörpers bereit, der Folgendes einschließt:

a) einen Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle, die einen aglykosylierten Antikörper exprimiert, der das oben beschriebene Polypeptid enthält; und
b) einen Schritt zum Reinigen des von der Wirtszelle exprimierten Antikörpers.

Das Nukleotidmolekül der vorliegenden Offenbarung kann ein isoliertes oder rekombinantes Nukleotidmolekül sein und schließt nicht nur ein- und doppelkettige DNA und RNA, sondern auch entsprechende komplementäre Sequenzen ein. Wenn das „isolierte Nukleotid“ ein aus einem natürlichen Ursprung isoliertes Nukleotid ist, ist das Nukleotid ein Nukleotid, abgetrennt von nahegelegenen Gensequenzen getrennt ist, die im isolierten Genom einer Person vorhanden sind. Für Nukleotide, z. B. PCR-Produkte, cDNA-Moleküle oder Oligonukleotide, die enzymatisch oder chemisch aus einer Matrize synthetisiert werden, können die mit diesen Verfahren hergestellten Nukleotide als isolierte Nukleotidmoleküle verstanden werden. Ein isoliertes Nukleotidmolekül kann eine Komponente eines Fragments oder eines größeren Nukleotidkonstrukts sein. Ein Nukleotid ist „operabel verknüpft“, wenn es mit einer anderen Nukleotidsequenz in eine funktionelle Beziehung gebracht wird. Zum Beispiel ist DNA für einePräsequenz oder einen Sekretions-Leader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist, ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Polypeptidsequenz beeinflusst oder eine Ribosomen-Bindungsstelle operabel an eine kodierende Sequenz gebunden ist, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden“, dass die verknüpften DNA-Sequenzen durchgehend sind und, im Falle eines Sekretions-Leaders, durchgehend sind und im gleichen Leserahmen vorhanden sind. Enhancer müssen jedoch nicht durchgehend sein. Die Verknüpfung wird durch Ligation an geeigneten Restriktionsenzymstellen erreicht. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden synthetische Oligonukleotid-Adaptoren oder -Linker nach üblichen Verfahren verwendet.
In der vorliegenden Offenbarung bezieht sich der Begriff „Vektor“ auf einen Träger, geeignet zur Einführung einer Nukleotidsequenz in eine Zelle, geeignet die Nukleotidsequenz zu replizieren. Die Nukleotidsequenz kann exogen oder heterolog sein. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Cosmid oder ein Virus (z. B. ein Bakteriophage) sein, ist jedoch darauf nicht beschränkt. Der Fachmann kann den Vektor nach der Standardrekombinationstechnologie konstruieren (Maniatis et al. Molekulares Klonen, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc., NY, 1994, usw.).
In der vorliegenden Offenbarung bezieht sich der Begriff „Expressionsvektor“ auf einen Vektor, der eine Nukleotidsequenz enthält, die wenigstens einen Teil eines transkribierten Genprodukts codiert. In einigen Fällen wird das RNA-Molekül in ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid posttranslatiert. Der Expressionsvektor kann verschiedene regulatorische Sequenzen enthalten. Ein Vektor oder ein Expressionsvektor kann zusätzlich zu einer regulatorischen Sequenz, die die Transkription und Translation reguliert, eine Nukleotidsequenz enthalten, die eine andere Funktion bereitstellt.
In der vorliegenden Offenbarung bezieht sich der Begriff „Wirtszelle“ auf eine Zelle eines beliebigen transformierbaren Organismus, einschließlich eines Eukaryonten und eines Prokaryoten, der den Vektor replizieren oder ein durch den Vektor codiertes Gen exprimieren kann. Die Wirtszelle kann durch den Vektor transfektiert oder transformiert werden, was einen Prozess bedeutet, durch den ein exogenes Nukleotidmolekül abgegeben oder in die Wirtszelle eingeführt wird.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung ist die Wirtszelle der vorliegenden Offenbarung eine Bakterienzelle, insbesondere eine Gram-negative Bakterienzelle. Die Zelle ist für die vorliegende Offenbarung insofern geeignet, als sie eine periplasmatische Region der inneren und äußeren Membran aufweist. Spezifische Beispiele der Wirtszelle nach der vorliegenden Offenbarung schließen die Zelle von E coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Haemophilus influenza, Bordotella pertussis, Erwinia amylovora, Rhizobium sp. usw. ein, sind jedoch darauf nicht beschränkt.
Bei dem Herstellungsverfahren nach der vorliegenden Offenbarung kann die Reinigung des Antikörpers Filtration, Anionenaustausch- oder Kationenaustauschchromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Affinitätschromatographie oder eine Kombination davon einschließen. Speziell kann Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Screenen eines Polypeptids bereit, das eine Fc-Domäne enthält, die an FcγRIIIa bindet, welches Folgendes einschließt:

a) einen Schritt zum Aufbau einer Bibliothek eines Polypeptids, das eine Fc-Domäne enthält, die 8 Aminosäuresubstitutionen (S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L) einschließt, in die eine zufällige Punktmutation eingeführt wurde; und
b) einen Schritt des Screenens eines Polypeptids, das eine Fc-Domäne enthält, die an FcγRIIIa aus der Bibliothek bindet.

Die substituierte Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung kann ferner zusätzlich zu den 8 Aminosäuresubstitutionen eine Aminosäuresubstitution einschließen.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf ein Verfahren zum Screenen eines Polypeptids, das eine Fc-Domäne enthält, die an FcγRIIIa bindet, welches Folgendes einschließt:

a) einen Schritt zum Aufbau einer Bibliothek eines Polypeptids, das eine Fc-Domäne enthält, die 8 Aminosäuresubstitutionen von S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L nach dem Kabat-Nummerierungssystem einschließt, zu dem eine zufällige Punktmutation zusätzlich eingeführt wurde; und
b) einen Schritt des Screenens eines Polypeptids, das eine Fc-Domäne mit verbesserter Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa aus der Bibliothek enthält im Vergleich zu der Fc-Domäne mit nur den 8 Aminosäuren substituiert.

In den Beispielen der vorliegenden Offenbarung wurde eine Fc-Bibliothek unter Verwendung einer Bakterienzelle (speziell E. coli) etabliert und Varianten, die eine hohe Affinität für FcγRIIIa zeigen, wurden daraus gescreent (Beispiele 5 und 6).
Die zusätzliche Aminosäuresubstitution der Fc-Domäne ist nicht besonders eingeschränkt. Sie schließt spezifisch eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuresubstitutionen ein, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 226, 243, 246, 250, 253, 264, 307, 347, 350, 400 und 421 nach dem Kabat-Nummerierungssystem, spezieller eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuresubstitutionen, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus C226R, F243L, K246E, T250I, I253N, V264E, T307S, C347R, T350A, S400T und N421S.
Das Screening-Verfahren nach der vorliegenden Offenbarung kann ein Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungs- (FACS) Screenen oder andere automatisierte Durchflusszytometrietechnik verwenden. Die Instrumente zur Durchführung der Durchflusszytometrie sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für die Instrumente schließen FACSAria, FACS Star Plus, FACScan und FACSort (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C (Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colo.), und MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) ein. Im Allgemeinen schließt die Durchflusszytometrietechnik die Abtrennung von Zellen oder anderen Partikeln aus einer flüssigen Probe ein. Typischerweise besteht der Zweck der Durchflusszytometrie darin, die abgetrennten Teilchen auf eine oder mehrere Eigenschaften zu untersuchen (beispielsweise das Vorhandensein eines markierten Liganden oder anderer Moleküle). Die Partikel werden nach Größe, Brechung, Lichtstreuung, Opazität, Rauheit, Form, Fluoreszenz usw. von einem Sensor sortiert, während sie einzeln fließen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung eine Zusammensetzung bereit, die ein Polypeptid enthält, das eine Fc-Domäne enthält, die die oben beschriebene Aminosäuresubstitution einschließt, ein Nukleotidmolekül, das dasselbe codiert, einen Vektor, der dasselbe enthält, oder einen aglykosylierten Antikörper, der das Polypeptid enthält.
In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung ist die Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern oder Behandeln von Krebs.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann Folgendes enthalten: (a) das Polypeptid, aglykosylierten Antikörper, Nukleotidmolekül oder Vektor; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Krebs bereit, das einen Schritt des Verabreichens einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Polypeptids, aglycosylierten Antikörpers, Nukleotidmoleküls oder Vektors an einen Patienten einschließt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung eine Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Verhindern oder Behandeln von Krebs bereit, die ein Polypeptid enthält, das eine Fc-Domäne enthält, die die oben beschriebene Aminosäuresubstitution, ein Nukleotidmolekül, das dasselbe codiert, einen Vektor, der einen Vektor, der dasselbe enthält, oder einen aglykosylierten Antikörper, der das Polypeptid enthält, einschließt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann enthalten: (a) das Polypeptid, aglykosylierten Antikörper, Nukleotidmolekül oder Vektor; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Der in der vorliegenden Offenbarung zu verhindernde oder zu behandelnde Krebs ist nicht beschränkt und schließt Lymphome wie Leukämie, akute lymphatische Leukämie, akute nichtlymphozytische Leukämie, chronische lymphatische Leukämie, chronische myeloische Leukämie, Hodgkin-Krankheit, nicht-Hodgkin-Lymphom, multiples Myelom, usw. ein, solide Tumore im Kindesalter, wie Hirntumor, Neuroblastom, Retinoblastom, Wilms-Tumor, Knochentumor, Weichteilsarkom usw., und gewöhnliche solide Tumore bei Erwachsenen wie Lungenkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Harnwegskrebs, Gebärmutterkrebs, Mundkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom und andere Hautkrebserkrankungen, Magenkrebs, Eierstockkrebs, Gehirntumor, Leberkrebs, Larynxkrebs, Schilddrüsenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hodenkrebs usw.
Der pharmazeutisch akzeptable Träger, der in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, wird üblicherweise zur Herstellung verwendet und schließt Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärke, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginat, Gelatine, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup, Methylcellulose, Methylhydroxybenzoat, Propylhydroxybenzoat, Talkum, Magnesiumstearat, Mineralöl usw. ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann ferner zusätzlich zu den oben beschriebenen Bestandteilen ein Gleitmittel, ein Feuchthaltemittel, ein Süßungsmittel, einen Geschmacksstoff, einen Emulgator, ein Suspendiermittel, ein Konservierungsmittel usw. enthalten. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und Zubereitungen sind ausführlich in Remington's Pharmaceutical Sciences (19. Auflage, 1995) beschrieben.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann oral oder parenteral, speziell parenteral verabreicht werden. Zum Beispiel kann es durch intravenöse Injektion, topische Injektion, intraperitoneale Injektion usw. verabreicht werden.
Eine geeignete Verabreichungsdosis der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Formulierungsverfahren, dem Verabreichungsverfahren, dem Alter, dem Körpergewicht, dem Geschlecht und dem pathologischen Zustand eines Patienten, der Ernährung, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate und der Ansprechempfindlichkeit. Ein normal ausgebildeter Arzt kann auf einfache Weise eine Verabreichungsdosis bestimmen und vorschreiben, die für die gewünschte Behandlung oder Prävention wirksam ist. In einer spezifischen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung beträgt eine tägliche Verabreichungsdosis der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung 0,0001-100 mg/kg.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann als Formulierung für eine Einzeldosis- oder Mehrfachdosisformulierung unter Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen Trägers und/oder Hilfsstoffs nach einem Verfahren hergestellt werden, das vom durchschnittlichen Fachmann aus einem Bereich, zu dem die vorliegende Offenbarung gehört, leicht ausgeführt werden. Die Formulierung kann in Form einer Lösung in einem öligen oder wässrigen Medium, einer Suspension, einer Emulsion, einem Extrakt, einem Pulver, einem Granulat, einer Tablette oder einer Kapsel vorliegen und kann ferner ein Dispergiermittel oder ein Stabilisierungsmittel enthalten.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann entweder allein oder in Kombination mit einer üblichen Chemotherapie oder Strahlentherapie verwendet werden. Die kombinierte Therapie kann bei der Behandlung von Krebs wirksamer sein. Ein chemotherapeutisches Mittel, das zusammen mit der Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann, schließt Cisplatin, Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Bisulfan, Nitrosoharnstoff, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, Etoposid, Tamoxifen, Taxol, Transplatin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin, Methotrexat, usw. ein. Die Strahlentherapie, die zusammen mit der Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann, schließt Röntgenstrahlung, γ-Strahlung usw. ein.
[Vorteilhafte Effekte]
Die Merkmale und Vorteile der vorliegenden Offenbarung können wie folgt zusammengefasst werden:

(i) Die vorliegende Offenbarung stellt ein Polypeptid bereit, das eine Fc-Domäne enthält, in der ein Teil einer Aminosäuresequenz einer humanen Fc-Domäne des Antikörpers mit einer anderen Aminosäuresequenz substituiert ist, oder einen dieselbe enthaltenden aglycosylierten Antikörper.
(ii) Die vorliegende Offenbarung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids oder des aglykosylierten Antikörpers bereit.
(iii) Die Fc-Domäne der vorliegenden Offenbarung besitzt durch Optimierung durch Substituieren eines Teils einer Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Fc-Domäne durch eine andere Aminosäuresequenz eine überlegene Bindungsfähigkeit an FcγRIIIa selektiv zwischen Fc-Rezeptoren und ist für die Behandlung von Krebs nützlich. Sie kann durch Bakterienkultur als homogener aglykosylierter Antikörper hergestellt werden.

Figurenliste

1 zeigt ein Bild von gereinigtem tetramerem FcγRIIIa (links, SDS-PAGE) und ein ELISA-Ergebnis (rechts) zur Untersuchung seiner Aktivität.
2 zeigt ein ELISA-Ergebnis zur Untersuchung der Aktivität von mit Alexa 488 Flour fluoreszenzmarkiertem tetramerem FcγRIIIa.
3 vergleicht die Bindungsfähigkeit von A/IYG und Fc1004 für FcγRIIIa.
4 vergleicht die Bindungsfähigkeit von A/IYG und Fc1004-IYG für FcγRIIIa.
5 zeigt schematisch den Aufbau einer Fc-Bibliothek aglykosylierter Antikörper auf der Basis von Fc1004-IYG.
6A-6C vergleichen die Bindungsfähigkeit von FcγRIIIa-Fc-Varianten mit hoher Affinität, die durch ein Bibliothekscreenen mit einem Durchflusszytometer gescreent wurden (a und b: Vergleich von Wildtyp, A/IYG, Fc1004-IYG, MG42, MG59, MG87 and MG48; c: Vergleich von Wildtyp, A/IYG, Fc1004-IYG, MG61, MG86, MG54 und MG14).
7 zeigt ein Bild, das eine SDS-PAGE von gereinigten gescreenten Varianten und Kontrollen (Wildtyp, A/IYG) zeigt.
8 zeigt ein Ergebnis der Analyse der Affinität von Varianten für verschiedene FcyRs durch ELISA.
9A - 9B zeigen ein SPR-Analyseergebnis von Varianten (a. Bindungsfähigkeitsanalyse für FcγRIIIa (V158); b. Bindungsfähigkeitsanalyse für FcγRIIIa (F158)).
10 zeigt ein Ergebnis der Untersuchung des HER2-Expressionsniveaus von MCF-7 und SKBR-3.
11 zeigt ein Ergebnis der ADCC-Tendenzanalyse in Abhängigkeit von dem Verhältnis von Effektorzelle zu Zielzelle.
12 zeigt ein Ergebnis der Analyse der Krebszellen abtötenden Wirkung von Varianten unter Verwendung von humanen PBMC, SKBR-3 und MCF-7.

[Modus für die Erfindung]
Im Folgenden wird die vorliegende Offenbarung anhand von Beispielen detailliert beschrieben. Die folgenden Beispiele dienen jedoch nur zur Veranschaulichung und für den durchschnittlichen Fachmann in dem Bereich ist es offensichtlich, dass der Umfang der vorliegenden Offenbarung nicht durch die Beispiele begrenzt ist.
Beispiele
Beispiel 1: Fc-Varianten-Klonierung zur Darstellung von aglykosyliertem Antikörper auf der bakteriellen inneren Membran als IgG voller Länge (A/IYG, Fc1004-IYG)

Um die A/IYG-Variante ( US-Patent Nr. 8,815,237 ) und Fc1004-IYG als IgG voller Länge darzustellen, wurde jede Fc-Variante als ein Plasmid vom Typ einer schweren Kette konstruiert. Ein pMopac12-PeIB-VH-CH1-CH2-CH3 (Wildtyp)-FLAG-Plasmid wurde für die T299A-Substitution in zwei Fragmente aufgeteilt und jeder Strang wurde mit der Vent-Polymerase (New England Biolabs) unter Verwendung von MJ#36, MJ#43/MJ#42 und MJ#37-Primern amplifiziert. Die zwei Fragmente wurden durch Assemblierungs-PCR unter Verwendung von MJ#36 und MJ#37-Primern in einem pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(T299A)-FLAG-Plasmid, SfiI (New England Biolabs) Schneiden und Ligieren mit T4-DNA-Ligase (Invitrogen) konstruiert. Die 326lYG-Substitution wurde unter Verwendung des Plasmids als Matrize und unter Verwendung der MJ#36, MJ#39/MJ#38 and MJ#37-Primer nach demselben Verfahren durchgeführt (Konstruktion von pMopac12-PeIB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG)-FLAG). Dann wurde pMopac12-PeIB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004-IYG)-FLAG durch Einführen einer 326IYG-Punktmutation in pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004)-FLAG unter Verwendung der gleichen MJ#36, MJ#39/MJ#38 and MJ#37-Primer konstruiert. [Tabelle 1] In dem Experiment verwendete Primer

Primer #	Nukleotidsequenz (5'→3')
MJ#36 (SEQ ID NR. 17)	CGCAGCGAGGCCCAGCCGGCCATGGCGGAGGTT
	CAATTAGTGGAATCTG
MJ#43 (SEQ ID NO 18)	GGACGCTGACCACACGGTACGCGCTGTTGTACTG CTCCTCCCG
MJ#42 (SEQ ID NO 19)	CGGGAGGAGCAGTACAACAGCGCGTACCGTGTGG TCAGCGTCC
MJ#37 (SEQ ID NO 20)	CGCAATTCGGCCCCCGAGGCCCCTTTACCCGGGG ACAGGGAG
MJ#39 (SEQ ID NO 21)	GGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGCCATAAATGTTGG AGACCTTGCATTTGTACTCCTTG
MJ#38 (SEQ ID NO 22)	CAAGGAGTACAAATGCAAGGTCTCCAACATTTATG GCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC
MJ#45 (SEQ ID NO 23)	CGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT
MJ#46 (SEQ ID NO 24)	CGCAATTCCGGCCCCCGAGGCCCC
MJ#44 (SEQ ID NO 25)	ACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCG
MJ#2 (SEQ ID NO 26)	CTGCCCATGTTGACGATTG
MJ#49 (SEQ ID NO 27)	CGCAGCGAGCGCGCACTCCATGGCGGAGGTTCAA TTAGTGGAATCTG
MJ#50 (SEQ ID NO 28)	CCCTAAAATCTAGACCTTTACCCGGGGACAGGGAG

Beispiel 2: Herstellung von tetramerem FcγRIIIa und Fluoreszenzmarkierung unter Verwendung von Alexa 488 Fluor
Das pMAZ-FcγRIIIa (V158)-FLAG-Streptavidin-His-Plasmid wurde in 300 ml HEK 293F-Zellen exprimiert und Affinitätschromatographie wurde unter Verwendung von 1 ml Ni-NTA-Agarose (Qiagen)-Aufschlämmung durchgeführt. Nach dem Kultivieren wurde die suspendierte Kultur 10 Minuten bei 7000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde unter Verwendung von 25x PBS äquilibriert und dann durch einen 0,2 µm-Flaschenaufsatzfilter (Merck Millipore) filtriert. Nach Zugabe von mit PBS äquilibrierter Ni-NTA-Aufschlämmung und 16-stündigem Rühren bei 4 °C wurde die Lösung durch eine Polypropylensäule (Thermo Fisher Scientific) geleitet. Nachdem die Durchgangslösung genommen und erneut an ein Harz gebunden worden war, wurde sie nacheinander mit 50 ml 1 × PBS, 25 ml von 10 mM Imidazolpuffer, 25 ml von 20 mM Imidazolpuffer und 200 µl von 250 mM Imidazolpuffer gewaschen. Nach dem Eluieren mit 2,5 ml 250 mM Imidazolpuffer und Ersetzen des Puffers mit PBS durch Amicon Ultra-4 (Merck Millipore) wurde das gereinigte Protein mittels SDS-PAGE untersucht (1). Die Aktivität des gereinigten Proteins wurde durch Analyse der Bindung an Rituxan (Roche) mittels ELISA untersucht, und 1 mg wurde entnommen und unter Verwendung des Alexa Fluor 488-Proteinmarkierungskits (Thermo Fisher Scientific) fluoreszenzmarkiert. Nach der Fluoreszenzmarkierung wurde die Aktivität durch ELISA analysiert (2). Dadurch wurde hochreines aktives tetrameres FcγRIIIa erfolgreich hergestellt, und die Aktivität des Proteins blieb selbst nach der Fluoreszenzmarkierung mit Alexa 488 Flour erhalten.
Beispiel 3: Vergleich der Bindungsfähigkeit von Wildtyp, Fc1004 und A/IYG für FcγRIIIa
Da die zu analysierenden Klone Plasmide sind, die für die schwere Kette kodieren, wurden pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3 (Wildtyp)-FLAG, pMopac12-PeIB-VH-CH1-CH2-CH3(Fc1004)-FLAG and pMopacl2-PeIB-VH-CH1-CH2-CH3(A/IYG)-FLAG, E.coli Jude 1 cells (F' [Tn10(Tei^r) proAB⁺IacI^qΔ(IacZ)M15] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dIaczAM15 ΔIacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara leu)7697 gaIU galKrpsLendA1nupG) (Kawarasaki et al., 2003) mit dem pBAD30-Km-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc-Plasmid transformiert, so dass schwere Ketten und leichte Ketten in der periplasmatischen Region exprimiert werden konnten. Nach 16-stündiger Kultivierung in 5 ml Terrific Broth (TB, BD) enthaltend 2% Glucose (Sigma-Aldrich) bei 37°C wurden 5,5 ml TB in einen 100 ml-Kolben für die Impfung mit 1:100 übertragen. Nach der Kultivierung zu OD₆₀₀ = 0,6, gefolgt von Abkühlen bei 25 °C und 250 U/min für 20 Minuten, wurde die Überexpression 20 Stunden bei 25 °C und 250 U/min durch Zugabe von 0,2 % Arabinose und 1 mM IPTG durchgeführt. Nach der Überexpression waren die Zellen OD₆₀₀ normalisiert und durch Zentrifugation bei 14000 U/min für 1 Minute geerntet. Ein Waschverfahren zum Resuspendieren der Zellen durch Zugabe von 1 ml von 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) und 1 Minute Zentrifugieren wurde zweimal wiederholt. Nach dem Resuspendieren der Zellen in 1 ml STE [0,5 M Sucrose, 10 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA (pH 8,0)] wurde die äußere Membran der Zellen durch Rotation bei 37 °C für 30 Minuten entfernt. Nach dem Zentrifugieren, Verwerfen des Überstands und Resuspendieren durch Zugabe von 1 ml Lösung A [0,5 M Saccharose, 20 mM MgCl₂, 10 mM MOPS, pH 6,8] wurde die Zentrifugation durchgeführt. Nach Resuspendieren in 1 ml einer Lösung, die durch Mischen von 1 ml Lösung A und 20 µl von 50 mg/ml Lysozymlösung erhalten wurde, wurde die Peptidoglycanschicht durch 15-minütiges Rotieren bei 37 °C entfernt. Nach dem Zentrifugieren, Entfernen des Überstands und Resuspendieren in 1 ml PBS wurden 300 µl entnommen und Sphäroplasten durch Rotation bei Raumtemperatur fluoreszenzmarkiert, nachdem 700 µl PBS und fluoreszenzmarkiertes tetramerisches FcγRIIIa-Alexa 488-Flour zugegeben wurden. Nach dem Markieren und einmaligem Waschen mit 1 ml PBS wurde die Analyse unter Verwendung des Guava-Instruments (Merck Millipore) durchgeführt (3). Als Ergebnis zeigten alle Wildtyp-Fc, A/IYG und Fc1004 Mittelwerte von 30-42, was darauf schließen lässt, dass die Bindung an FcγRIIIa nicht gut stattfindet.
Beispiel 4: Vergleich der Bindungsfähigkeit von A/IYG und Fc1004-IYG für FcγRIIIa
pMopac12-PeIB-VH-CH1-CH2-CH3 (IYG)-FLAG und pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3 (Fc1004-IYG)-FLAG wurden so hergestellt, dass schwere Ketten und leichte Ketten im periplasmatischen Raum durch Transformation von E. coli Jude-1-Zellen zusammen mit dem pBAD30-Km-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc-Plasmid exprimiert werden konnten. Nach 16-stündiger Kultivierung der Zellen bei 37 °C in 5 ml TB, enthaltend 2% Glucose, wurden 5,5 ml TB in einen 100 ml-Kolben zur 1:100 Beimpfung übertragen. Nach der Kultivierung zu OD₆₀₀ = 0,6, gefolgt von Abkühlen bei 25 °C und 250 U/min für 20 Minuten, wurde die Überexpression 20 Stunden bei 25 °C und 250 U/min durch Zugabe von 0,2% Arabinose und 1 mM IPTG durchgeführt. Nach der Überexpression waren die Zellen OD₆₀₀ normalisiert und durch Zentrifugation bei 14000 U/min für 1 Minute geerntet. Ein Waschverfahren zum Resuspendieren der Zellen durch Zugabe von 1 ml von 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) und 1 Minute Zentrifugieren wurde zweimal wiederholt. Nach dem Resuspendieren der Zellen in 1 ml STE [0,5 M Sucrose, 10 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA (pH 8,0)] wurde die äußere Membran der Zellen durch Rotation bei 37°C für 30 Minuten entfernt. Nach dem Zentrifugieren, Verwerfen des Überstands und Resuspendieren durch Zugabe von 1 ml Lösung A [0,5 M Saccharose, 20 mM MgCl₂, 10 mM MOPS, pH 6,8] wurde die Zentrifugation durchgeführt. Nach Resuspendieren in 1 ml einer Lösung, die durch Mischen von 1 ml Lösung A und 20 µl von 50 mg/ml Lysozymlösung erhalten wurde, wurde die Peptidoglycanschicht durch 15-minütiges Rotieren bei 37°C entfernt. Nach dem Zentrifugieren, Entfernen des Überstands und Resuspendieren in 1 ml PBS, wurden 300 µl entnommen und Sphäroplasten durch Rotation bei Raumtemperatur fluoreszenzmarkiert, nachdem 700 µl PBS und fluoreszenzmarkiertes tetramerisches FcγRIIIa-Alexa 488-Flour zugegeben wurden. Nach dem Markieren und einmaligem Waschen mit 1 ml PBS wurde die Analyse unter Verwendung des Guava-Instruments (Merck Millipore) durchgeführt (4). Als Ergebnis betrug die Fluoreszenzsignalintensität von Fc1004-IYG 199,85, was dem 8,4-fachen des Wildtyps (23,92) entspricht. Dementsprechend wurde bestätigt, dass die Bindungsfähigkeit von Fc1004-IYG im Vergleich zu A/IYG (41.24, 1,7-faches des Wildtyps), der bekanntermaßen die höchste Affinität für FcγRIIIa unter den derzeit bekannten aglycosylierten Antikörper-Fc-Varianten aufweist, signifikant verbessert war.
Beispiel 5: Konstruktion einer aglykosylierten Antikörperbibliothek basierend auf Fc1004-IYG
Um eine aglykosylierte Antikörper-Fc-Bibliothek basierend auf Fc1004-IYG zu konstruieren, wurden eine fehleranfällige PCR und Assemblierungs-PCR unter Verwendung von pMopac12-PelB-VH-CH1-CH2-CH3 (Fc1004-IYG)- FLAG als Matrize durchgeführt. Die fehleranfällige PCR-Technik unter Verwendung von Taq-Polymerase (Invitrogen) wurde verwendet, um eine zufällige Punktmutation in den Fc (CH2-CH3)-Bereich einzuführen. Die Punktmutation wurde in 0,5% der Nukleotide des Fc-Gens voller Länge unter Verwendung von MJ#45 und MJ#46-Primern eingeführt. Der vordere Bereich von Fc war so gestaltet, dass er sich mit Fab überlappte, sodass eine Assemblierung als schwere Ketten möglich war. Das gesamte PCR-Produkt vom Typ der schweren Kette wurde konstruiert, indem eine herkömmliche PCR für den Fab (VH- CH1)-Bereich unter Verwendung von MJ#36 und MJ#44-Primern und Vent-Polymerase durchgeführt wurde und dann eine Assemblierungs-PCR durchgeführt wurde, um das Fab-Fragment mit dem Fc-Fragment unter Verwendung der MJ#36 und MJ#46-Primer zu ligieren Dann wurde nach Sfi-Restriktionsenzymbehandlung und -ligation, die Fc-Bibliothek aglykosylierter Antikörper vom Typ der schweren Kette durch Transformation in Jude-1-Zellen konstruiert (Bibliotheksgröße: 1,14 × 10⁹, experimentelle Fehlerrate: 0,457%). Nach Erhalt des Gens aus der Bibliothek und anschließender Transformation in Jude-1-Zellen, die mit pBAD30-Km-PelB-VL-Ck-NlpA-VL-Ck-His-cMyc transformiert wurden, wurde eine Bibliothek, in der der IgG voller Länge auf der inneren Membran von E. coli gezeigt wurde, konstruiert (5).
Beispiel 6: Screenen der konstruierten Bibliothek mittels Durchflusszytometrie und Auswahl von Varianten MG42, MG48, MG59, MG87 usw. (Bestätigung der Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa)

Die konstruierte Bibliothek wurde in 25 ml TB, enthaltend 2% Glucose, in einem 250 ml-Kolben entfaltet, in einer Phiole (1 ml) 4 Stunden bei 37 °C inkubiert und dann in einem 2,5 I-Kolben in 110 ml TB für 1:100 Beimpfung übertragen. Nach der Kultivierung zu OD₆₀₀ = 0,6, gefolgt von Abkühlen bei 25 ºC und 250 U/min für 20 Minuten, wurde die Überexpression 20 Stunden bei 25 ºC und 250 U/min durch Zugabe von 0,2% Arabinose und 1 mM IPTG durchgeführt. Nach der Überexpression waren die Zellen OD₆₀₀ normalisiert und durch Zentrifugation bei 14000 U/min für 1 Minute geerntet. Nach Herstellen von Sphäroplasten wie oben beschrieben, wurden die Zellen mit tetramerem FcγRIIIa-Alexa 488 Flour markiert und dann einmal mit 1 ml PBS gewaschen. Schließlich wurde die in 1 ml PBS resuspendierte Probe mit 20 ml PBS verdünnt und nur die Zellen, die obere 3 %-Signale emittierten, wurden unter Verwendung des S3-Zellensortierers (BioRad) sortiert. Die getrennten Zellen wurden erneut sortiert. Gene wurden aus den sortierten Zellen durch PCR unter Verwendung von MJ#36 und MJ#2-Primern und Taq-Polymerase (Biosesang) amplifiziert. Dann wurde eine Subbibliothek durch Sfi-Restriktionsenzymbehandlung, Ligation und Transformation erhalten, in der die Gene der sortierten Zellen amplifiziert wurden. Nach Wiederholen dieses Verfahrens für insgesamt 5 Runden wurden Varianten, die eine hohe Affinität für FcγRIIIa aufwiesen, durch Analyse von mehr als 90 einzelnen Klonen ausgewählt ( 6A und 6B, Tabelle 2, Position der Mutation folgt dem Kabat-EU-Nummerierungssystem (Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, 5. Auflage, US-Ministerium für Gesundheit und menschliche Dienste, NIH-Veröffentlichungsnr. 91-3242, 1991). [Tabelle 2] Punktmutation der Hauptvarianten

Fc-Varianten	Punktmutation
A/IYG (SEQ ID Nr. 5)	T299A, K326I, A327Y, L328G
Fc1004 (SEQ ID Nr. 3)	S298G, T299A, E382V, N390D, M428L
Fc1004-IYG (SEQ ID Nr. 7)	S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D, M428L
MG42 (SEQ ID Nr. 9)	(Fc1004-IYG)+264E, 350A, 421S
MG48 (SEQ ID Nr. 11)	(Fc1004-IYG)+264E, 350A
MG59 (SEQ ID Nr. 13)	(Fc1004-IYG)+264E
MG87 (SEQ ID Nr. 15)	(Fc1004-IYG)+264E, 421S

Zusätzlich zu diesen Varianten wurden die Varianten, die eine höhere Affinität für FcγRIIIa als A/IYG aufweisen, zusätzlich gescreent (MG61: (Fc1004-IYG) + T307S, MG86: (Fc1004-IYG) + C226R + F243L + K246E MG54: (Fc1004-IYG) + T2501 + I253N, MG14: (Fc1004-IYG) + C347R) (6C).
Beispiel 7: Klonierung zur Expression von gescreenten Varianten in Tierzellen sowie deren Expression und Reinigung
Um MG59, MG87 und MG48 unter den gescreenten Varianten zusammen mit Wildtyp und A/IYG als Kontrollen herzustellen, wurden in IgG-Formen, die in HEK293F-Zellen löslich sind, pMAZ-IgH (Wildtyp), pMAZ-IgH (A/IYG), pMAZ-IgH (MG59), pMAZ-IgH (MG87) und pMAZ-IgH (MG48) durch Amplifizieren des ‚VH-CH1-CH2-CH3‘-Bereichs, der die schwere Kette kodiert, durch PCR unter Verwendung der Vent-Polymerase und MJ#49 und MJ#50-Primern, gefolgt von einer Behandlung mit BssHII und Xbal Restriktionsenzyme (New England Biolabs) und Ligation konstruiert. Zur Expression als IgG wurden sie zusammen mit dem pMAZ-lgL-Plasmid in HEK 293F-Zellen co-transfektiert und transient im 300 ml-Maßstab exprimiert. Nach dem Kultivieren und Entfernen des Mediums durch Zentrifugieren bei 7000 U/min für 10 Minuten wurde der Überstand mit 25x PBS äquilibriert und durch ein 0,2 µm Flaschenaufsatzfilter (Merck Millipore) filtriert. Nach Zugabe von 1 ml Protein-A-Agarose (Genscript)-Aufschlämmung, die mit PBS äquilibriert war, und Rühren bei 4 °C für 16 Stunden wurde die Lösung durch eine Polypropylensäule (Thermo Fisher Scientific) geleitet. Nachdem die Durchgangslösung genommen und erneut an ein Harz gebunden worden war, wurde sie durch Fließenlassen von 10 CV (Säulenvolumen) oder mehr von 1x PBS gewaschen. Nach Eluieren mit 3 ml 100 mM Glycin-HCI (pH 2,7) wurde das Eluat sofort mit 1 ml 1 M Tris (pH 8,0) neutralisiert. Nachdem der Puffer durch Amicon Ultra-4 (Merck Millipore) durch PBS ersetzt wurde, wurde das gereinigte Protein mittels SDS-PAGE (BioRad) untersucht (7). Es wurde bestätigt, dass das Protein in Form von IgG (150 kDa) auf der SDS-PAGE mit hoher Reinheit gereinigt wurde.
Beispiel 8: ELISA-Analyse von Varianten zur Bestätigung der Bindungsfähigkeit von FcRs
50 µl jeder IgG-Fc-Variante, verdünnt mit 0,05 M Na₂CO₃ (pH 9,6) bis 4 µg/ml wurden 16 Stunden bei 4 ºC auf der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden aus Polystyrol mit hoher Bindefläche (Costar) fixiert und bei Raumtemperatur mit 100 µl von 5 % BSA (in 0,05 % PBST) für 2 Stunden blockiert. Nach 4-maligem Waschen mit 180 µl 0,05% PBST wurden 50 µl FcRs, die seriell mit einer Blockierungslösung verdünnt wurden, zu jeder Vertiefung gegeben. Nach dem Waschen wurde die Antikörperreaktion 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Verwendung von 50 µl Anti-His-HRP-Konjugat (Sigma-Aldrich) bzw. Anti-GST-HRP-Konjugat (GE Healthcare) durchgeführt. Nach Zugabe von 50 µl 1-Step Ultra TMB-ELISA-Substratlösung (Thermo Fisher Scientific) zur Farbentwicklung wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl 2 M H₂SO₄ beendet und die Analyse wurde unter Verwendung des Epoch-Mikroplatten-Spektrophotometers (BioTek) durchgeführt (8). Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt. Die Bindungsfähigkeit für die FcRs (FcγRI, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcRn) wurde durch die ELISA-Analyse bestätigt.
Beispiel 9: Messung von K_D-Werten von FcγRIIIa und Trastuzumab-Varianten nach SPR

Die Bindungsfähigkeit der Trastuzumab-Varianten wurde mit BIAcore T200 (GE Healthcare) gemessen. Nach dem Fixieren des aglycosylierten Wildtyp-Antikörpers (Aglyco-T), A/IYG, glykosylierten Wildtyp-Antikörpers (Glyco-T; hergestellt durch Kultivieren von HEK 293F-Zellen), Herceptin (klinisches Arzneimittel, hergestellt in CHO-Zellen), MG48 und MG59 auf einem CM5-Chip durch Aminkupplung, dimeres FcγRIIIa-V158-GST, FcγRIIa-F158-GST unter Verwendung von HBS-EP-Puffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCI, 3,4 mM EDTA und 0,005% P20-Tensid) (GE Healthcare) wurde injiziert und die Bindungsfähigkeit wurde analysiert (9). Die Regeneration des CM5-Chips wurde nacheinander unter Verwendung von 50 mM Glycin (pH 3,9), 50 mM Glycin (pH 9,5) und 3 M NaCl durchgeführt. Das bivalente 2:1-Analytmodell der Software BIAevaluation 3.2 (GE Healthcare) wurde zur Berechnung der Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_D) monovalenter Rezeptorbindung (Tabelle 3) verwendet. [Tabelle 3] SPR K_D-Werte der Varianten

	K_D(M)		Vergrößerung um
	FcγRIIIa (158V)	FcγRIIIa (158F)	(V/F)
Aglyco-T	N.D	N.D	0
A/IYG	1,110 × 10^-6	1,737 × 10^-5	1
Glyco-T (HEK)	1,200 × 10^-7	5,782 × 10^-6	9,25 / 3,00
Herceptin (CHO)	8,418 × 10^-8	5,142 × 10^-6	13,19/3,38
MG48	6,793 × 10^-8	6,763 × 10^-7	16,34 / 25,68
MG59	1,070 × 10^-7	1,049 × 10^-6	10,37 / 16,56

Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die in der vorliegenden Offenbarung gescreenten MG48 und MG59 Bindungsfähigkeiten zeigen, die für FcγRIIIa-V158 bis zu 16-fach und für FcγRIIa-F158 bis zu 25-fach oder mehr im Vergleich zu A/IYG verbessert waren.
Beispiel 10: Untersuchung des HER2-Expressionsniveaus in SKBR-3- und MCF-7-Zielzellen
Die Zellen wurden auf einer 100 mm-Schale (80 %-ige Konfluenz) kultiviert. Nach Entfernung des Mediums und einmaligem Waschen mit DPBS wurden die Zellen mit 1,5 ml Accutase (Merck Millipore) behandelt und 2-3 Minuten bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nachdem Bestätigung, dass die Zellen am Boden der Schale hafteten, wurden 6 ml eines Zellkulturmediums zugegeben. Nachdem die gesamte Lösung einschließlich der Zellen mit einer 10 ml-Pipette entnommen worden war, wurde die Lösung in ein 15 ml-Röhrchen übertragen und 3 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Nach vollständigem Entfernen der Lösung aus dem 15 ml-Röhrchen und Zugabe von 5 ml DPBS und gutem Mischen mit den Zellen wurde die Zentrifugation 3 Minuten bei 1200 U/min durchgeführt. Nach Entfernen des DPBS aus dem Röhrchen und Zugabe von 3 ml Waschpuffer (PBS + 1 % BSA) und gutem Mischen mit den Zellen, wurde die Zentrifugation 3 Minuten bei 1200 U/min durchgeführt und der Waschpuffer wurde aus dem Röhrchen entnommen. Nach zweimaligem Wiederholen des Waschvorgangs wurde schließlich 1 ml Waschpuffer zugegeben und gut mit den Zellen gemischt. FACS-Röhrchen (Falcon) wurden für die Nichtfärbung, Isotyp-Kontrolle (normales menschliches IgG-Alexa 488) bzw. Trastuzumab-Alexa 488 hergestellt. Die Zellen wurden gezählt und 1×10⁵ Zellen/300 µl in jedes Röhrchen übertragen. Nach 15-minütigem Blockieren bei 4 °C wurde die Zentrifugation durchgeführt und der Überstand entfernt. 100 µl Waschpuffer wurden in das FACS-Röhrchen gegeben und gut mit den Zellen gemischt. 1 µg Isotypkontrolle und Trastuzumab-Alexa 488 wurde zugegeben, mit Ausnahme des nicht färbenden Röhrchens. Nach dem Blockieren von Licht mit Aluminiumfolie und Durchführen einer Antikörperreaktion bei 4 °C für 30 Minuten, wurde die Zentrifugation durchgeführt und der Überstand entfernt. Die verbleibenden Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml Waschpuffer gewaschen. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Nach Zugabe von 300 µl Laufpuffer (PBS) zu jedem Röhrchen und gutem Mischen mit den Zellen, wurde eine FACS-Analyse durchgeführt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass SKBR-3 eine viel höhere HER2-Expression als MCF-7 aufwies (10). Dementsprechend wurde bestätigt, dass SKBR-3, die eine höhere HER2-Expression aufweisen, als adäquatere Zielzellen als MCF-7 für die Bewertung der ADCC-Aktivität der Antikörperprobe geeignet ist.
Beispiel 11: Vorversuch zur Bestimmung des Verhältnisses von Effektorzelle (PBMC): Zielzelle (SKBR-3, MCF-7) für ADCC

Nach dem Kultivieren von SKBR-3- und MCF-7-Zielzellen, wurden die Zielzellen auf eine V-Boden-Platte mit 96 Vertiefungen (Corning) mit 1×10⁴ Zellen/50 µl/Vertiefung ausgesät und anschließend wurden 10 µl Trastuzumab (20 µg/ml) pro Vertiefung zugegeben. PBMCs (CTL, Tabelle 4) wurden schnell in einem 37 °C Wasserbad aufgetaut und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit DNase I behandelt. Nach dem Zählen der Zellen wurde eine ausreichende Anzahl von PBMCs in jede Vertiefung gegeben. [Tabelle 4] Daten von PBMC-Spendern

Beispiel ID #	Ethnizität	Alter	Geschlecht	ABO/PH
20091026	Kaukasisch	24	Männlich	A/POS
20100412	Hispanisch	30	Männlich	A/POS
HHU20120530	Afroamerikanisch	35	Männlich	AB/POS
HHU20130318	Asiatisch	38	Männlich	A/POS
HHU20150924	Asiatisch/Filipino	40	Männlich	A/POS

Das Verhältnis von Effektorzelle zu Zielzelle wurde auf 1,5625:1, 3,125:1, 6,25:1, 12,5:1 und 25:1 eingestellt. Nach 1-minütiger Zentrifugation bei 100xg wurden die Zellen bei 37 °C im CO₂-Inkubator für 4 Stunden kultiviert. 4 Stunden später wurde die Platte 3 Minuten bei 300xg zentrifugiert. 50 µl des Überstands wurden entnommen und auf eine SpectraPlate-Platte mit 96 Vertiefungen (PerkinElmer) übertragen. Dann wurde die Inkubation bei Raumtemperatur 30 Minuten lang durchgeführt, nachdem 50 µl CytoTox 96 ^® Reagenz (Promega) pro Vertiefung zugegeben wurden. Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer Stopplösung wurde die Absorbanz bei 490 nm gemessen. Dieses Verfahren wurde dreimal in Duplikaten wiederholt und der Mittelwert genommen. Als Ergebnis zeigte der ADCC-Assay unter Verwendung von SKBR-3 (1×10⁴ Zellen/Vertiefung) mit hoher HER2-Expression als Zielzellen und Verwendung von PBMC als Effektorzellen eine von der Effektorzellzahl abhängige Zunahme der Zytotoxizität. Obwohl MCF-7 mit niedriger HER2-Expression auch eine von der Effektorzellzahl abhängige Zunahme der Zytotoxizität zeigte, war die Zunahme geringer als bei SKBR-3, das eine höhere HER2-Expression zeigte ( 11). Die höhere Zytotoxizität für SKBR-3 mit hohem HER2-SKBR-3 als für MCF-7 mit niedriger HER2-Expression lässt vermuten, dass die Zytotoxizität HER2-spezifisch ist. In Anbetracht des Unterschieds in der Verteilung der FcγRIIIa-F/V-Varianten in den als Effektorzellen verwendeten PBMCs wurde bestimmt, dass das Verhältnis von Effektorzelle zu Zielzelle zur Bewertung der ADCC-Aktivität 25:1 oder mehr betragen sollte (Tabelle 5). [Tabelle 5] ADCC-Aktivität in Abhängigkeit um Verhältnis von Effektorzelle zu Zielzelle

Effektor zu Ziel % Cytotoxizität

SKBR-3 MCF-7

1,5625 : 1 1,65 0,23

3,125 : 1 2,00 0,98

6,25 : 1 13,54 1,01

12,5 : 1 17,47 7,00

25 : 1 40,21 10,38
Beispiel 12: Vergleich der ADCC-Aktivität von Herceptin-Varianten unter Verwendung humaner PBMC
SKBR-3- und MCF-7-Zellen wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen (V-Boden) mit 1 × 10⁴ Zellen/50 µl pro Vertiefung ausgesät, und 10 µl der Testsubstanz wurden mit 0, 0,032, 0,16, 0,8, 4 und 20 µg/ml in jede Vertiefung zugesetzt. Fünf einzelne PBMC-Proben wurden schnell in einem 37 ºC-Wasserbad aufgetaut und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit DNase I behandelt. Nachdem die Zellen gezählt und 2.5×10⁵ Zellen/50 µl PBMC in jede Vertiefung hinzugefügt wurden, wurde die Platte 1 Minute bei 100xg zentrifugiert und dann im CO₂ Inkubator bei 37 °C für 4 Stunden kultiviert. 4 Stunden später wurde die Platte herausgenommen und 3 Minuten bei 300xg zentrifugiert. Nach der Entnahme von 50 µl des Überstands und Übertragen auf eine SpectraPlate 96-Well-Platte wurden 50 µl CytoTox 96^® Reagenz zu jeder Vertiefung zugesetzt und die Reaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer Stopplösung wurde die Absorbanz bei 490 nm gemessen. Dieses Verfahren wurde dreimal in Duplikaten wiederholt und der Mittelwert wurde als % Cytotoxizität dargestellt. Die SKBR-3-Zellen mit HER2-Expression zeigten eine hohe Zytotoxizität in % von 4-31%, während die MCF-7-Zellen mit niedriger HER2-Expression eine niedrige % Zytotoxizität von 2-15% zeigten. Dementsprechend wurde bestätigt, dass die Zytotoxizität der Testsubstanz zielspezifisch ist. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die Krebszellen abtötendende Wirkung im Vergleich zu dem aglykosylierten Antikörper des Wildtyps und dem humanen IgG-Antikörper deutlich verbessert ist (12).
Fachleute werden erkennen, dass die in der vorstehenden Beschreibung offenbarten Vorstellungen und spezifischen Ausführungsformen leicht als Grundlage zum Modifizieren oder Entwerfen anderer Ausführungsformen zum Durchführen der gleichen Zwecke der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können. Diese Fachleute werden auch erkennen, dass solche äquivalenten Ausführungsformen nicht vom Geist und Umfang der Offenbarung abweichen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen dargelegt sind.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 8952132 [0029]
US 8815237 [0029, 0074]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Boruchov et al. J Clin Invest115 (10): 2914-23, 2005 [0006]

Claims

Ein Polypeptid, umfassend eine Fc-Domäne eines humanen Antikörpers, die Fc-Domäne umfassend die folgenden Aminosäuresubstitutionen nach dem Kabat-Nummerierungssystem: a) Substitutionen von 8 Aminosäuren von S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L; und b) eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus C226R, F243L, K246E, T250I, I253N, V264E, T307S, C347R, T350A, S400T und N421S.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 9 Aminosäuresubstitutionen umfasst: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 9 Aminosäuresubstitutionen umfasst: S298G, T299A, T307S, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 9 Aminosäuresubstitutionen umfasst: S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, C347R, E382V, N390D und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 10 Aminosäuresubstitutionen umfasst: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, T350A, E382V, N390D und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 10 Aminosäuresubstitutionen umfasst: T250I, I253N, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 10 Aminosäuresubstitutionen umfasst: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D, N421S und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 11 Aminosäuresubstitutionen umfasst: V264E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, T350A, E382V, N390D, N421S und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die folgenden 11 Aminosäuresubstitutionen umfasst: C226R, F243L, K246E, S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Fc-Domäne, umfassend die Aminosäuresubstitution, eine verbesserte Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa im Vergleich zur Fc-Domäne mit nur 8 Aminosäuren von substituierten S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D and M428L und M428L aufweist.
Aglykosylierter Antikörper, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1.
Nukleotidmolekül, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 1.
Vektor, umfassend ein Nukleotidmolekül nach Anspruch 12.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 13.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.
Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1, den aglykosylierten Antikörper nach Anspruch 11, das Nukleotidmolekül nach Anspruch 12 oder den Vektor nach Anspruch 13.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Verhindern oder Behandeln von Krebs ist.
Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Krebs, umfassend einen Schritt der Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Polypeptids nach Anspruch 1, des aglycosylierten Antikörpers nach Anspruch 11, des Nukleotidmoleküls nach Anspruch 12 oder des Vektors nach Anspruch 13 an einen Patienten.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend eine Fc-Domäne eines humanen Antikörpers, umfassend: a) einen Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle, umfassend einen Vektor, umfassend ein Nukleotidmolekül, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 1; und b) einen Schritt zur Gewinnung des von der Wirtszelle exprimierten Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung eines aglykosylierten Antikörpers, umfassend: a) einen Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle, exprimierend einen aglykosylierten Antikörper, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1; und b) einen Schritt zum Reinigen des von der Wirtszelle exprimierten Antikörpers.
Verfahren zum Screenen eines Polypeptids, umfassend eine an FcγRIIIa bindende Fc-Domäne, umfassend: a) einen Schritt zum Aufbau einer Bibliothek eines Polypeptids, umfassend eine Fc-Domäne, umfassend 8 Aminosäuresubstitutionen von S298G, T299A, K326I, A327Y, L328G, E382V, N390D und M428L, nach dem Kabat-Nummerierungssystem, zu dem eine zufällige Punktmutation zusätzlich eingeführt wurde; und b) einen Schritt des Screenens eines Polypeptids, umfassend eine Fc-Domäne mit verbesserter Bindungsfähigkeit für FcγRIIIa aus der Bibliothek im Vergleich zu der Fc-Domäne, mit den 8 Aminosäuren substituiert.