PL188795B1

PL188795B1 - Związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie związku wiążącego się z receptorem trombopoetyny

Info

Publication number: PL188795B1
Application number: PL96323917A
Authority: PL
Inventors: William J. Dower; Ronald W. Barrett; Steven E. Cwirla; David J. Duffin; Christian M. Gates; Sherril S. Haselden; Larry C. Mattheakis; Peter J. Schatz; Christopher R. Wagstrom; Nicholas C. Wrighton
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2005-04-29
Also published as: US6083913A; NO317737B1; CA2223449A1; KR19990022576A; AU6163496A; DK0885242T3; CN1315870C; KR100436680B1; EP0885242B1; EP0885242A4; HU227678B1; CA2636432A1; EP1961760A2; DE69637473D1; HUP9900921A2; NO975705D0; ES2303338T3; ZA964814B; AR003431A1; WO1996040750A1

Abstract

1 . Zwiazek wiazacy sie z receptorem trombopoetyny, znamienny tym, ze zwiazek ten posiada mase czastecz- kowa mniejsza niz okolo 8000, i powinowactwo wiazania z receptorem trombopoetyny, wyrazone jako IC5 0 , nie wiek- sze niz okolo 100 µM; i tym, ze zwiazek ten obejmuje sekwencje aminokwasów: X 1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 gdzie X 1 jest C, L, M, P, Q, V; X2 jest F, K, L, N, Q, R, S , T lub V; X3 jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V. 15. Zwiazek wiazacy sie z receptorem trombopoetyny, znamienny tym, z e .......................................................... 16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze jako substancje aktywna zawiera zwiazek wiazacy sie z receptorem trombopoetyny, posiadajacy mase czasteczkowa mniejsza niz okolo 8000, powinowactwo wiazania z receptorem trombopoetyny, wyrazone jako IC5 0 , nie wieksze niz okolo 100 µM i obejmujacy nastepujaca sekwencje aminokwasów: 30. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze jako substancje aktywna zawiera zwiazek wiazacy sie z receptorem trombopoetyny, wybrany sie z grupy skladajacej sie z:................................................................................... 31. Zastosowanie zwiazku wiazacego sie z receptorem trombopoetyny, posiadajacym mase czasteczkowa mniej- sza niz okolo 8000, powinowactwo wiazania z receptorem trombopoetyny, wyrazone jako IC 5 0 . nie wieksze niz okolo 100 µM; i tym, ze zwiazek ten obejmuje sekwencje aminokwasów: X 1 X2 X3 X4 X6 X7 gdzie X 1 jest C, L, M, P, Q, V; X2 jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V do wytwarzania leku do leczenia pacjentów cier- piacych z powodu chorób hematologicznych, które wrazliwe sa na leczenie agonista trombopoetyny. 45. Zastosowanie zwiazku wiazacego sie z receptorem trombopoetyny, wybranym z grupy skladajacej sie z:...... PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie związku wiążącego się z receptorem trombopoetyny.

Niniejszy wynalazek dostarcza peptydów i związków, które wiążą i aktywują receptor trombopoetyny (c-mpl lub TPO-R), bądź w inny sposób działają jako agoniści TPO. Wynalazek znajduje zastosowanie w dziedzinie biochemii i chemii medycznej, a zwłaszcza zapewnia agonistów TPO do stosowania w leczeniu chorób u ludzi.

Megakariocyty są komórkami pochodzącymi ze szpiku kostnego, które są odpowiedzialne za wytwarzanie płytek krwi w krążeniu. Chociaż u większości gatunków stanowią mniej niż Q,25% komórek szpiku kostnego, ich objętość jest >1Q razy większa od objętości typowych komórek szpiku. Patrz Kuter i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 111Q4-111Q8 (1994). Megakariocyty przechodzą proces znany jako endomitoza, w wyniku, którego zachodzi podział ich jąder, ale nie zachodzi podział komórkowy i dlatego wzrasta ilość komórek poliploidalnych. W odpowiedzi na obniżoną liczbę płytek krwi, wzrasta szybkość endomitozy, tworzą się megakariocyty o wyższej ploidalności i ilość megakariocytów może wzrosnąć 3-krotnie. Patrz Harker J. Clin. Invest. 47-458-465 (1968). Z kolei, w odpowiedzi na podwyższoną liczbę płytek krwi, obniża się szybkość endomitozy, tworzą się megakariocyty o niższej ploidalności, a ilość megakariocytów może obniżyć się o 5Q%.

Dokładny fizjologiczny mechanizm sprzężenia zwrotnego, dzięki któremu masa znajdujących się w krążeniu płytek krwi reguluje szybkość endomitozy i ilość megakariocytów szpiku kostnego, nie jest znany. Obecnie uważa się, że czynnikiem trombopoetycznym w krążeniu, zaangażowanym w tej pętli sprzężenia zwrotnego jest trombopoetyna (TPO). Bardziej szczegółowo, wykazano, że TPO jest głównym regulatorem humoralnym w sytuacjach obejmujących małopłytkowość. Patrz, np. Mietcalf Nature 369: 519-520. W kilku badaniach wykazano, że TPO zwiększa liczbę płytek krwi, zwiększa wielkość płytek krwi i zwiększa wbudowywanie izotopu do płytek krwi zwierząt będących biorcami. Szczegółowo, uważa się, że TPO wpływa na megakariocytogenezę na kilka sposobów: (1) powoduje ona zwiększenie wielkości i ilości megakariocytów; (2) powoduje wzrost zawartości DNA, w formie poliploidalności, w megakariocytach; (3) zwiększa endomitozę megakariocytów; (4) powoduje wzmożone dojrzewanie megakariocytów; i (5) powoduje wzrost procentu komórek prekurso188 795 rowych, w postaci małych komórek dodatnich pod względem acetylocholinoesterazy, w szpiku kostnym.

Ponieważ płytki krwi (trombocyty) konieczne są do krzepnięcia krwi, a gdy ich ilości są bardzo niskie, pacjent narażony jest na poważne ryzyko zgonu w wyniku katastrofalnego krwotoku, TPO ma potencjalne użyteczne zastosowania zarówno w diagnozie, jak i leczeniu różnych zaburzeń hematologicznych, na przykład chorób powodowanych głównie defektami płytek krwi. Przeprowadzone z TPO próby kliniczne wskazywały, że TPO można bezpiecznie podawać pacjentom. Ponadto, ostatnie badania stworzyły podstawę planowania skuteczności terapii TPO w leczeniu małopłytkowości, a zwłaszcza małopłytkowości powstającej w wyniku chemioterapii, radioterapii lub przeszczepu szpiku kostnego jako leczenia raka lub chłoniaka. Patrz, np. McDonald (1992) Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14: 8-21 (1992).

Gen kodujący TPO sklonowano i scharakteryzowano. Patrz Kuter i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994); Barley i in. Cell 77: 1117-1124 (1994); Kaushansky i in. Nature 369: 568-571 (1994); Wendling i in. Nature 369: 571-574 (1994) oraz Sauvage i in. Nature 369: 533-538 (1994). Trombopoetyna jest glikoproteiną o co najmniej dwóch postaciach, o pozornych masach cząsteczkowych 25 kDa i 31 kDa i wspólnej N-końcowej sekwencji aminokwasowej. Patrz Bartley i in. Cell 77: 1117-1124 (1994). Okazało się, że trombopoetyna posiada dwa odrębne regiony rozdzielone potencjalnym miejscem rozszczepienia ArgArg. Region aminokońcowy jest w dużym stopniu konserwatywny u człowieka i myszy i posiada pewną homologię do erytropoetyny oraz interferonu a i interferonu b. Region karboksykońcowy wykazuje szerokie zróżnicowanie gatunkowe.

Opisano sekwencje DNA i sekwencje kodowanego peptydu TPO-R człowieka (znanego także jako c-mpl). Patrz Vigon i in. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89: 5640-5644 (1992). TPO-R jest członkiem rodziny receptora czynnika wzrostowego hematopoetyny, charakteryzującej się wspólnym wzorem strukturalnym domeny zewnątrzkomórkowej, obejmującym cztery konserwatywne reszty C w części N-końcowej oraz motywem WSXWS w pobliżu regionu transbłonowego. Patrz Bazan Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6934-6938 (1990). Dowody na to, że receptor ten odgrywa funkcjonalną rolę w hemopoezie obejmują obserwacje, że jego ekspresja ograniczona jest do śledziony, szpiku kostnego lub wątroby płodowej u myszy (patrz Souyri i in. Cell 63: 1137-1147 (1990)) i do megakariocytów, płytek krwi i komórek CD34+ u ludzi (patrz Methia i in. Blood 82: 1395-1401 (1993)). Ponadto, ekspozycja komórek CD34+ na syntetyczne oligonukleotydy antysensowne wobec RNA mpl 20 znacząco hamuje pojawianie się kolonii megakariocytów, nie wpływając na tworzenie kolonii erytroidalnych lub mieloidalnych. Niektórzy badacze postul^ą że receptor działa jako homodimer, podobnie jak w przypadku receptorów G-CSF i erytropoetyny.

Dostępność sklonowanych genów TPO-R ułatwia badania agonistów tego ważnego receptora. Dostępność zrekombinowąnego białka receptora umożliwia badania oddziaływań receptor-ligand z zastosowaniem różnych losowych i półlosowych układów wytwarzania różnorodnych peptydów.

Układy te obejmują układ „peptydy na plazmidach” opisany w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 270 170 i 5 338 665; układ „peptydy na fagu” opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 07/718 577, złożonym 20 czerwca 1991 r., w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 07/541 108, złożonym 20 czerwca 1990 r. i w Cwirla i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382 (1990); układ „polisomów” opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerze 08/300 262, złożonym 2 września 1994 r., które jest kontynuacją w części zgłoszenia opartego na zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerze 08/144 775, złożonym 29 października 1993 r. oraz w międzynarodowym opisie patentowym PCT numer 95/11992; układ „kodowanej biblioteki syntetycznej” opisany w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 08/146 886, złożonym 12 listopada 1993 r., 07/946 239, złożonym 16 września 1992 r. i 07/762 522, złożonym 18 września 1991 r., oraz układ „syntezy immobilizowanego polimeru na bardzo dużą skalę” opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 143 854; publikacji patentowej PCT numer 90/15070, opublikowanej 13 grudnia 1990 r.; zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 07/624 120, złożonym 6 grudnia 1990 r.; Fodor i in.

188 795

Science 251: 767-773 (2/1991); Dower i Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-180 (1991) i zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 07/805 727, złożonym 6 grudnia 1991 r.; każde z powyższych zgłoszeń patentowych i publikacji włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Powolne odtwarzanie poziomów płytek krwi u pacjentów cierpiących na małopłytkowość jest poważnym problemem i skłania do usilnych poszukiwań agonisty czynnika wzrostowego krwi zdolnego do przyspieszania regeneracji płytek krwi. Niniejszy wynalazek dostarcza właśnie takiego agonisty.

Przedmiotem wynalazku jest związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, charakteryzujący się tym, że związek ten posiada masę cząsteczkową m^^^e:^;zą niż około 8000, powinowactwo wiązania z receptorem trombopoetyny, wyrażone jako IC50 nie większe niż około 100 μM; i tym, że związek ten obejmuje sekwencje aminokwasów:

X, X2 X3 X4 X5 X6 X7 gdzie Χ1 oznacza C, L, M, P, Q, V; Χ2 oznacza F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; Χ3 jest C,

F, I, L, M, R, S, V lub W; Χ4 oznacza którykolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; Χ5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V. W korzystnym rozwiązaniu taka sekwencja aminokwasową może być cykliczna. W innym korzystnym rozwiązaniu sekwencja ta może być dimeryczna.

W następnym korzystnym rozwiązaniu związek według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów:

C Χ2 Χ3 Χ4 Χ5 X6 X7 gdzie Χ2 oznacza K, L, N, Q, R, S, T lub V; Χ3 oznacza C, F, I, L, M, R, S lub V; Χ4 oznacza którykolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; Χ5 jest A, D, E, G, S,

V lub Y; X6 oznacza C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a Χ7 oznacza C, G, I, K, L, M, N, R lub V.

W bardziej korzystnej wersji wynalazku, związek obejmuje sekwencję, która zawiera Χ4, który oznacza A, E, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T lub W, a w najkorzystniejszym rozwiązaniu związek charakteryzuje się tym, że Χ2 oznacza S lub T; Χ3 oznacza L lub R; X6 oznacza R; Χ5 oznacza D, E lub G; X6 oznacza F, L lub W; a Χ7 oznacza I, K, L, R lub V.

W innej korzystnej wersji związek według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów:

X 8 C X2 X3 X X5 X6 Χ7 w której Χ2 oznacza F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; Χ3 oznacza C, F, I, L, M, R, S, V lub W; Χ4 oznacza którykolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; Χ5 oznacza A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 oznacza C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; Χ7 oznacza C,

G, I, K, L, M, N, R lub V; a X8 oznacza którykolwiek z 20 kodowanych genetycznie aminokwasów.

Korzystnie związek według wynalazku obejmuje sekwencję w której X₈ oznacza G, S,

Y lub R.

Jeszcze bardziej korzystnie związek obejmuje sekwencję aminokwasów: G G C T L R E WLHGGFCGG.

Możliwa jest jeszcze inna korzystna odmiana realizacji wynalazku, w której związek według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ G X, X₂ Χ3 Χ4 X₅ W X₇ gdzie Χ1 oznacza L, M, P, Q, lub V; Χ2 oznacza F, R, S lub T; Χ3 oznacza F, L, V lub W; Χ4 oznacza A, K, L, M, R, S, V lub T; Χ5 oznacza A, E, G, K, M, Q, R, S lub T; Χ7 oznacza C, I, K, L, M, lub V; a X₈ oznacza którykolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów.

Bardziej korzystnie związek według wynalazku charakteryzuje się tym, że Χ1 oznacza P; Χ2 oznacza T; Χ3 oznacza L; Χ4 oznacza R; Χ5 oznacza E lub Q; Χ7 oznacza I lub L. Również korzystnie związek według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

188 795

X9 X8 G X, X2 X₃ X X5 W X7 oznacza X8 jest A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T lub V; a X9 oznacza A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T lub V. ...

W związku według wynalazku, w sekwencji aminokwasowej X8 korzystnie oznacza D, E lub K; a Xę oznacza A lub I.

Korzystnie związek według wynalazku charakteryzuje się tym, że związek wybiera się z grupy składającej sięzGGCADGPTLREWISFCGG;GNADGPTLRQWLE GRRPKN;GGCADGPTLREWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS; SIEGPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRDT;CADGPT LREWISFC oraz IEGPTLRQWLAARA.

Przedmiotwm wynalazku jest ponadto związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, charakteryzujący się tym, że związek ten wybiera się z grupy składającej się z:

CADGPTLREWISFC [Acc]- CADGPTLREWISFC - [amid] = CADGPTLREWISFC-Hl2 ;i

I 1

I |

CH₂-----------------------£

IEGPTLRQWLAARA

I

IEGPTLRQWLAARA (Pala) - K [NH₂]

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że jako substancję aktywną zawiera związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, posiadający masę cząsteczkową mniejszą niż około 8000, powinowactwo wiązania z receptorem trombopoetyny, wyrażone jako IC50, nie większe niż około 100 μΜ i obejmujący następującą sekwencję aminokwasów:

Xl X₂ Χ3 Χ4 Χ5 X6 Χ7 gdzie Xi jest C, L, M, P, Q, V; X₂ oznacza F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 oznacza C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X4 oznacza którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X5 oznacza A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X(, oznacza C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna charakteryzuje się tym, że wspomniana sekwencja aminokwasowa jest cykliczna, lub ewentualnie, w innym korzystnym rozwiązaniu, sekwencja aminokwasową może być dimeryczna.

W rozwiązaniu korzystnym kompozycji farmaceutycznej według wynalazku wspomniana sekwencja obejmuje sekwencję aminokwasów:

C X₂ Χ3 Χ4 Χ5 X₆ Χ7 gdzie X2 jest K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 oznacza C, F, I, L, M, R, S lub V; X4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, S, V lub Y; X₆ oznacza C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 oznacza C, G, I, K, L, M, N, R lub V.

Również korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera związek obejmujący sekwencję aminokwasową w której X4 oznacza A, E, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T

188 795 lub W. Bardziej korzystnie X₂ może oznaczać S lub T; X₃ może oznaczać L lub R; X₃ może oznaczać R; X5 może oznaczać D, E lub G; Xć może oznaczać F, L lub W; a X7 może oznaczać I, K, L, R lub V.

W innym korzystnym rozwiązaniu kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ C X₂ X₃ X4 X5 X6 X7 gdzie X₂ jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X₃ oznacza C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X,4 oznacza którykolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 oznacza C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; X7 oznacza C, G, I, K, L, M, N, R lub V; a Xg oznacza którykolwiek z 20 kodowanych genetycznie aminokwasów.

Bardziej korzystnie Xg jest G, S, Y lub R, a najbardziej korzystnie związek obejmuje sekwencję aminokwasów: GGC TLRE WL HG GF C G G.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ GX,X2X3 X4X5 wX7 gdzie Xt oznacza L, M, P, Q, lub V; X₂ oznacza F, R, S lub T; X3 oznacza F, L, V lub W; Xą jest A, K, L, M, R, S, V lub T; X5 oznacza A, E, G, K, M, Q, R, S lub T; X7 oznacza C, I, K, L, M, lub V; a X₈ oznacza którykolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów. Bardziej korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera związek obejmujący sekwencję aminokwasową w której Xj oznacza P; X₂ oznacza T; X3 oznacza L; Xą oznacza R; X5 oznacza E lub Q; X7 oznacza I lub L; a najbardziej korzystnie, związek ten obejmuje sekwencję aminokwasów:

Xq X8G X! X₂X3 X4 X5W X7 gdzie X8 oznacza A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T lub V; a Xq oznacza A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T lub V. Również bardzo korzystnie X8 oznacza D, E lub K; a X9 oznacza A lub I.

W najkorzystniejszym rozwiązaniu związek stanowiący substancję aktywną kompozycji według wynalazku można wybierać grupy składającej sięz: G G C A D G P T LR E W I S F CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTLREWISFCGG K;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SIEGPTLREWLTSRTPHS;LAIEG PTLRQWLHGNGRDT; CADGPTLREWISFC oraz IEGPTLRCQWL A ARA.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję aktywną którią jest związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, wybrany się z grupy składającej się z:

CADGPTLREWISFC

[Ac]- CADGPTLREWISFC - [amid]

O = CADGPTLREWISFC-NH2 ; i 1 1 i 1 ch₂-----------------------S

IEGPTLRQWLAARA

I

IEGPTLRQWLAARA (Pala) - K [NH2]

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku wiążącego się z receptorem trombopoetyny, który to związek jak wspomniano wcześniej, posiada masę cząsteczkową

188 795 mniejszą niż około 8000, powinowactwo wiązania z receptorem trombopoetyny, wyrażone jako IC50, nie większe niż około 100 pM; i który to związek obejmuje sekwencje aminokwasów:

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 gdzie X: jest C, L, M, P, Q, V; X2jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, L, . M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X5jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W. lub Y; a X7 jest C, G,.I, K, L, M, N, R lub V do wytwarzania leku do leczenia pacjentów cierpiących z powodu chorób hematologicznych, które wrażliwe są na leczenie agonistą trombopoetyny. Związek ten we wszystkich jego korzystnych, a powyżej opisanych, wykonaniach może służyć do wytwarzania leków do leczenia chorób hematologicznych wrażliwych na leczenie agonistą trombopoetyny.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związku wiążącego się z receptorem trembopeetyny, który to związek wybiera się z grupy składającej się z:

CADGPTLREWISFC

[Ac]- CADGPTLREWISFC - [amid]

O = CADGPTLREWISFC - NH2

CH2

IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA (Pala) - K [NH2] do wytwarzania leku do leczenia pacjentów cierpiących z powodu chorób hematologicznych, które wrażliwe są na leczenie agonistą trombopoetyny.

Wynalazek oparty jest na niespodziewanym odkryciu, że określone peptydy i mimetyki peptydów o niskich masach cząsteczkowych posiadają właściwość silnego wiązania się z TPO-R i mogą aktywować TPO-R. A zatem, takie peptydy i mimetyki peptydów użyteczne są do celów terapeutycznych w leczeniu stanów zależnych od TPO (np. małopłytkowości powstającej w wyniku chemioterapii, radioterapii lub transfuzji szpiku kostnego), jak również do celów diagnostycznych w badaniach mechanizmów hąmopoązy oraz namnażanie in vitro megaąariocytów i pobranych komórek prekursorowych.

Peptydy i mimetyki peptydów odpowiednie do celów terapeutycznych i/lub leczniczych posiadają IC50 około 2 mM 10 lub niższe, jak określono przez oznaczenie powinowactwa wiązania, jak przedstawiono w przykładzie 3 poniżej, w którym niższe IC50 skorelowane jest z silniejszym powinowactwem wiązania z TPO-R. Do celów farmaceutycznych, peptydy i peptydomimątyąi korzystnie maaąIC50 nie wyższe niż około 100 pM, ^,kerzystniąj nie wyższe niż 500 nM. W korzystnym rozwiązaniu, masa cząsteczkowa peptydu lub mimetyka peptydu wynosi od około 250 do około 8000.

Jeśli stosuje się je do celów diagnostycznych, peptydy i mimetyki peptydów znakuje się wykrywalnym znacznikiem, a zatem, peptydy i mimetyki peptydów bez takiego znacznika służąjaąo produkty pośrednie w przygotowywaniu znakowanych peptydów i mimetyków peptydów.

188 795

Figury 1A-B ilustrują wyniki oznaczenia funkcjonalnego w obecności różnych peptydów; oznaczenie opisano w przykładzie 2. Figura 1A jest graficznym przedstawieniem wyników oznaczenia proliferacji komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R dla wybranych peptydów według wynalazku:

§ oznacza wyniki dlaGGCADGPTLREWISFCGGK (biotyna);

X oznacza wyniki dlaGGCADGPTLREWISFCGG;

Δ oznacza wyniki dlaLAIEGPTLRQWLHGNGRDT;

O oznacza wyniki dlaGN AD GPTLRQ W LEG RR P KN; i + oznacza wyniki dlaTIKGPTLRQWLKSREHTS.

Figura IB jest graficznym przedstawieniem wyników uzyskanych z tymi samymi peptydami i macierzystą linią komórkową.

Figura 2A-C przedstawia wyniki oligomeryzacji peptydów z zastosowaniem oznaczenia proliferacji komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R. Figura 2A przedstawia wyniki oznaczenia dla skompleksowanego biotynylowanego peptydu (AF 12285 ze streptawidynę (SA)) dla linii komórkowych zarówno stransfekowanej, jak i macierzystej. Figura 2B przedstawia wyniki oznaczenia dla wolnego biotynylowanego peptydu (AF 12285) dla linii komórkowych zarówno stransfekowanej, jak i macierzystej. Figura 2C przedstawia wyniki oznaczenia dla samej streptawidyny dla linii komórkowych zarówno stransfekowanej, jak i macierzystej.

Figury 3A-G przedstawiają wyniki szeregu doświadczeń kontrolnych, pokazujących aktywność TPO, peptydów według niniejszego wynalazku, EPO i peptydów wiążących EPO-R w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem albo linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R oraz odpowiadającej jej linii macierzystej, albo linii komórek zależnych od EPO. Figura 3A przedstawia wyniki dla TPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R i jej odpowiadającej linii macierzystej. Figura 3B przedstawia wyniki dla EPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R i jej odpowiadającej linii macierzystej. Figura 3C przedstawia wyniki dla skompleksowanego peptydu biotynylowanego (AF 12285 ze streptawidynę (SA)) i skompleksowanej postaci biotynylowanego peptydu wiążącego EPO-R (AF 11505 z SA) w linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R. Wyniki dla odpowiadającej macierzystej linii komórkowej przedstawiono na figurze 3D. Figura 3E przedstawia wyniki dla TPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek zależnych od EPO. Figura 3F przedstawia wyniki dla EPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek zależnych od EPO. Figura 3G przedstawia wyniki dla skompleksowanego biotynylowanego peptydu (AF 12885 ze streptawidynę (SA)) i skompleksowanej postaci biotynylowanego peptydu wiążącego EPO-R (AF 11505 z SA) w linii komórek zależnych od EPO.

Figury 4A-C ilustrują konstruowanie bibliotek peptydyna-plazmidach w wektorze pJS142. Figura 4A przedstawia mapę restrykcyjną i pozycje genów. Plazmid, w którym utworzono bibliotekę, obejmuje terminator transkrypcji rrnB, gen bla dla umożliwienia selekcji na ampicylinie, region wewnątrzgenowy faga Ml3 (Ml3 IG) dla umożliwienia uwolnienia jednoniciowego DNA, miejsce początku replikacji plazmidu (ori), dwie sekwencje lacO_i oraz gen araC dla umożliwienia pozytywnej i negatywnej regulacji promotora araB kierującego ekspresję, genu fuzyjnego lac. Figura 4B przedstawia sekwencję regionu klonującego w końcu 3' genu lac 1, wiecznie z wykorzystywanymi podczas konstruowania biblioteki miejscami Sfil i Eagl. Figura 4C przedstawia ligację połączonych oligonukleotydów biblioteki, ON-829 i ON-830, w miejscach Sfil pJS142 w celu utworzenia biblioteki. Pojedyncze przerwy w sekwencji wskazują miejsca ligacji.

Figury 5Λ-Β ilustrują klonowanie w wektorach MBP pELM3 i pELM15. Figura 5A przedstawia sekwencję końca 3' genu fuzyjnego malE, włącznie z sekwencję kodującą MBP, łącznika poliasparaginowego, miejscem rozszczepiania przez proteazę, czynnik Xa i dostępnymi miejscami klonowania. Pozostałe części wektora pochodzą z pMALc2 (pELM3) i pMALp2 (pELM15), dostępnych w New England Biolabs. Figura 5B przedstawia sekwencję wektorów po przeniesieniu fragmentu biblioteki BspEII-Scal do pELM3/pELM15 strawionych Agel-Scad. Przenoszone sekwencje obejmują sekwencję GGG, kodującą łącznik peptydowy z biblioteki pJS142.

188 795

Figura 6A przedstawia mapę restrykcyjną i pozycje genów dla konstruowania biblioteki dimerów domen „hełmowych” w wektorze pCMG14. Plazmid biblioteki obejmuje: terminator transkrypcji rrnB, gen bla dla umożliwienia selekcji na ampicylinie, region wewnętrzgenowy faga M13 (M13 IG) dla umożliwienia uwalniania jednoniciowego DNA, miejsce początku replikacji plazmidu (orz), jedną sekwencję lacO_£ oraz gen araC dla umożliwienia pozytywnej i negatywnej regulacji promotora araB kierującego ekspresję genu fuzyjnego dimerów domen „hełmowych”. Figura 6b przedstawia sekwencję regionu klonującego w końcu 3' genu dimerów domen hełmowych”, włącznie z wykorzystywanymi podczas konstruowania biblioteki miejscami Sfil i Eagl. Figura 6C przedstawia ligację połączonych oligonukleotydów ON-1679, ON-829 i ON-830 w miejscach Sfil pCMG14 w celu utworzenia biblioteki. Pojedyncze przerwy w sekwencji wskazują miejsca ligacji.

Figury 7 i 9 przedstawiają wyniki dalszych oznaczeń określających aktywność peptydów i mimetyków peptydów według wynalazku. W oznaczeniu tym u myszy wywołano małopłytkowość stosując karboplatynę. Figura 7 przedstawia typowe wyniki otrzymywane, gdy myszy Balb/C traktuje się karboplatyną (125 mg/kg, dootrzewnowo) w dniu 0. Linie przerywane przedstawąją nietraktowane zwierzęta z trzech doświadczeń. Linia ciągła przedstawia grupy traktowane karboplatynę w trzech doświadczeniach. Grube ciągłe linie przedstawiają, dane historyczne. Figura 8 przedstawia wpływ miareczkowania karboplatynę na liczbę płytek krwi u myszy traktowanych wskazanymi ilościami karboplatyny (w mg/kg, dootrzewnowe (ip) w dniu 0). Figura 9 przedstawia poprawę indukowanej karboplatyną małopłytkowości w dniu 10 pod wpływem peptydu AF12513 (513). Karboplatynę (CBP; 50-125 mg/kg, dootrzewnowo) podawano w dniu 0. AF12513 (1 mg/kg, dootrzewnowo) podawano w dniach 1-9.

Poniższe definicje podano w celu zilustrowania i zdefiniowania znaczenia oraz zakresu różnych terminów stosowanych tu do opisu wynalazku.

„Agonistą” odnosi się do aktywnego biologicznie liganda, który wiąże się z komplementarnym do niego biologicznie aktywnym receptorem i aktywuje go albo powodując odpowiedź biologiczną receptora, albo wzmacnia ist^^^e^cą uprzednio aktywność receptora.

„Farmaceutycznie dopuszczalne sole” odnoszą się do nietoksycznych soli metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych i amonowych, powszechnie stosowanych w przemyśle farmaceutycznym, włącznie z solami sodu, potasu, litu, wapnia, magnezu, baru, amoniowych i protaminy cynkowej, które przygotowuje się metodami dobrze znanymi w nauce. Termin obejmuje również nietoksyczne sole addycyjne z kwasami, które ogólnie rzecz biorąc przygotowuje się przez reakcje zwięzków według tego wynalazku z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym. Reprezentatywne sole obejmują chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, wodorosiarczan, octan, szczawian, walerianian, oleinian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosylan, cytrynian, maleinian, fumaran, bursztynian, winian, napsylan i podobne.

„Farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem” odnosi się do tych soli, które zachowuję skuteczność biologiczną i właściwości wolnych zasad i które nie są biologicznie lub z innych względów niepożądane, utworzonych z kwasów nieorganicznych, takich jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy i podobne, oraz kwasów organicznych, takich kwas octowy, kwas propionowy, kwas glikolowy, kwas pirogronowy, kwas szczawiowy, kwas jabłkowy, kwas malonowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas cynamonowy, kwas migdałowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas salicylowy i podobne. W celu zapoznania się z opisem farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami jako proleków patrz Bundgaard, H., supra.

„Farmaceutycznie dopuszczalny ester” odnosi się do tych estrów, które zachowuj,, po hydrolizie wiązania estrowego, skuteczność biologiczną i właściwości kwasu karboksylowego lub alkoholu i nie są biologicznie lub z innych względów niepożądane. W celu zapoznania się z opisem farmaceutycznie dopuszczalnych estrów jako proleków patrz Bundgaard, H., red., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estry te zazwyczaj tworzy się z odpowiadającego kwasu karboksylowego i alkoholu. Ogólnie rzecz biorąc, tworzenie estrów można przeprowadzić stosując konwencjonalne techniki syntezy. (Patrz np. March Advanced Organie Chemistry wyd. 3, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1985), str. 1157,

188 795 i odnośniki cytowane tamże, oraz Mark i in. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1980)). Składnik alkoholowy estru będzie na ogół obejmował (i) alkohol alifatyczny o długości C2-C12, który może zawierać lub nie zawierać jedno lub więcej podwójnych wiązań i może zawierać lub nie zawierać rozgałęzione łańcuchy węglowe, oraz (ii) alkohole aromatyczne lub heteroaromatyczne zawierajęce od 7 do 12 atomów węgla. Wynalazek ten uwzględnia również stosowanie tych kompozycji, które są zarówno estrami, jak tu opisano, a jednocześnie, ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami addycyjnymi z kwasami.

„Farmaceutycznie dopuszczalny amid” odnosi się do tych amidów, które zachowują, po hydrolizie wiązania amidowego, skuteczność biologiczny i właściwości kwasu karboksylowego lub aminy i nie są biologicznie lub z innych względów niepożądane. W celu zapoznania się z opisem farmaceutycznie dopuszczalnych amidów jako proleków, patrz Bundgaard, H., red., Design of Prodrugs. Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Amidy te zazwyczaj tworzy się z odpowiadającego kwasu karboksylowego i aminy. Ogólnie rzecz biorąc, tworzenie amidów można przeprowadzić stosując konwencjonalne techniki syntezy. (Patrz np. March Advanced Organic Chemistry. wyd. 3, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1985), str. 1152, oraz Mark i in. Encyclopedia of Chemical Technology,,. John Wiley & Sons, Nowy Jork (1980)). Wynalazek ten uwzględnia również stosowanie tych kompozycji, które są zarówno amidami, jak opisano w niniejszym opisie, jak i jednocześnie, ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami addycyjnymi z kwasami.

„Farmaceutycznie lub terapeutycznie dopuszczalny nośnik” odnosi się do podłoża nośnikowego, które nie zakłóca skuteczności aktywności biologicznej składników aktywnych i które nie jest toksyczne dla gospodarza lub pacjenta.

„Stereoizomer” odnosi się do związku chemicznego posiadającego taką samą masę cząsteczkową, skład chemiczny i budowę jak inny związek, ale o inaczej rozmieszczonych atomach. To jest, pewne identyczne reszty chemiczne mają inne orientacje w przestrzeni i, dlatego, w stanie czystym posiadają zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Jednakże, niektóre czyste stereoizomery mogą mieć skręcalność optyczne tak niewielką, że jest ona niewykrywalna za pomocą istniejącej aparatury. Związki według tego wynalazku mogą mieć jeden lub więcej asymetrycznych atomów węgla, i dlatego obejmują różne stereoizomery. Wszystkie stereoizomery są objęte zakresem wynalazku.

„Terapeutycznie lub farmaceutycznie skuteczna ilość” w odniesieniu do kompozycji według tego wynalazku dotyczy ilości kompozycji wystarczającej do indukcji pożądanego wyniku biologicznego. Wynikiem tym może być złagodzenie oznak, objawów lub przyczyn choroby, będź jakakolwiek inna pożądana zmiana w układzie biologicznym. W niniejszym wynalazku, wynik będzie zazwyczaj obejmował odpowiedzi immunologicznej i/lub zapalnej na infekcję lub uszkodzenie tkanki.

Reszty aminokwasowe w peptydach skraca się następująco: fenyloalanina to Phe lub F; leucyna to Leu lub L; izoleucyna to Ile lub I; metionina to Met lub M; walina to Val lub V; seryna to Ser lub S; prolina to Pro lub P; treonina to Thr lub T; alanina to Ala lub A; tyrozyna to Tyr lub Y; histydyna to His lub H; glutamina to Gln lub Q; asparagina to Asn lub N; lizyna to Lys lub K; kwas asparaginowy to Asp lub D; kwas glutaminowy to Glu lub E; cysteina to Cys lub C; tryptofan to Trp lub W; arginina to Arg lub R i glicyna to Gly lub G. Ponadto, Bu oznacza grupę butoksylowa, Bzl to grupa benzylowa, CHA oznacza cykloheksyloaminę, Ac to grupa acetylową, Me to grupa metylowa, Pen to penicyliamina, Aib to kwas aminoizomasłowy, Nva to norwalina, Abu to kwas aminomasłowy, Thi to tienyloalanina, Obn to grupa O-benzylowa, a hyp to hydroksyprolina.

Poza peptydami składającymi się tylko z aminokwasów występujących naturalnie, zapewnia się również peptydomimetyki lub analogi peptydów'. Analogi peptydów powszechnie stosuje się w przemyśle farmaceutycznym jako niepeptydowe leki o właściwościach analogicznych do właściwości wzorcowego peptydu. Te rodzaje związków niepeptydowych określa się terminem „mimetyki peptydów” lub „peptydomimetyki” (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber i Freidinger TINS str. 392 (1985) oraz Evans i in. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), które włączono do nin^^eszego opisu poprzez odnośniki literaturowe). Mimetyki peptydów, które są strukturalnie podobne do peptydów użytecznych terapeutycznie można stosować do wywoływana równoważnych lub wzmocnionych wpływów leczniczych lub pro188 795 filaktycznych. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do wzorcowego polipeptydu (tj. polipeptydu, który posiada aktywność biologiczną lub farmakologiczną), takiego jak naturalnie występujący polipeptyd wiążący receptor, ale posiadają jedno lub więcej wiązań peptydowych dowolnie zastąpionych wiązaniem wybranym z grupy składającej się z -CH2NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cis lub trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- i -CH₂SO- metodami znanymi w nauce i dalej opisanych w następujących odnośnikach: Spatola, A.F. w: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, red., Marcel Dekker, Nowy Jork, str. 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (marzec 1983), tom 1, numer 3, Peptide Backbone Modifications (przegląd ogólny); Morley, Trends Pharm. Sci. (1980) str. 463-468 (przegląd ogólny); Hudson, D. i in., Int J Pept Prot Res 14: 177-185 (1979) (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola,, i in. Life Sci 38: 1243-1249 (1986) (-CH₂-S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis i trans); Almquist i in. J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (1980) (-COCH₂-); Jennings-White i in. Tetrahedron Lett. 23: 2533 (1982) (-COCH₂-); Szelkę i in. europejskie zgłoszenie patentowe numer 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH2) ; Holladay i in. Tetrahedron Lett. 24: 4401-4404 (1983) (-C(OH)CH2-) oraz Hruby Life Sci 31: 189-199 (1982) (-CH₂S-), z których każde włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Szczególnie korzystnym wiązaniem niepeptydowym jest -CH₂NH-. Takie mimetyki peptydów mogą mieć znaczące zalety w stosunku do rozwiązań z polipetydami, obejmujące, na przykład, bardziej ekonomiczne wytwarzanie, większą stabilność chemiczną, wzmocnione właściwości farmakologiczne (półokres trwania, absorpcję, siłę działania, skuteczność itp.), zmienioną specyficzność (np. szeroki zakres aktywności biologicznych), obniżoną antygenowość i inne. Znakowanie peptydomimetyków zazwyczaj obejmuje kowalencyjne przyłączenie jednego lub więcej znaczników, bezpośrednio lub poprzez odstępnik (np. grupę amidową) w nie zakłócającej pozycji(ach) peptydomimetyków, które przewiduje się na podstawie ilościowych danych struktura/aktywność i/lub modelowania molekularnego. Takimi nie zakłócającymi pozycjami są ogólnie rzecz bioręc pozycje, które nie tworzy bezpośrednich miejsc oddziaływań z makrocząsteczką (ami) (np. cząsteczkami z nadrodziny immunoglobulin), z którymi peptydomimetyk wiąże się wywołując leczniczy wpływ. Uzyskiwanie pochodnych (np. znakowanie) peptydomimetyków nie powinno zasadniczo zakłócać pożądanej aktywności biologicznej lub farmakologicznej peptydomimetyka. Ogólnie, peptydomimetyki peptydów wiążących receptor wiążą się z receptorem z wysokim powinowactwem i posiadają wykrywalną aktywność biologicznią (tj. są agonistami lub antagonistami jednej lub więcej zmian fenotypowych zależnych od receptora).

Do tworzenia bardziej stabilnych peptydów można zastosować systematyczne podstawienie jednego lub więcej aminokwasów sekwencji wzorcowej D-aminokwasem tego samego typu (np. D-lizyna zamiast L-lizyny). Ponadto, peptydy o wymuszonej sekwencji zawierajęce sekwencję wzorcową lub zasadniczo identyczne odmiany sekwencji wzorcowej, można tworzyć metodami znanymi w nauce (Rizo i Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy), na przykład przez dodanie wewnętrznej reszty cysteiny zdolnej do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych, które przeprowadzają peptyd w postać cykliczną.

Syntetyczne lub nie występujące naturalnie aminokwasy odnoszą, się do aminokwasów, które nie występują naturalnie in vzvo, ale które, nie mniej jednak, można wprowadzić do opisywanych w niniejszym opisie struktur peptydów. Korzystnymi syntetycznymi aminokwasami są D-a-autinokwasy naturalnie występujących L-a-aminokwasów, jak również nie występujące naturalnie D- i L-a-aminokwasy o wzorze H₂NCHR5COOH, gdzie R'⁵ jest 1) niższą grupą alkilową. 2) grupę cykloalkilową zawierającą od 3 do 7 atomów węgla, 3) grupą, heterocykliczny zawie 1^404. od 3 uo 7 atomów węgla i 1 do 2 heteroatomów wybranych z grupy składającej się z atomów tlenu, siarki i azotu, 4) resztą aromatyczną zawierającą od 6 do 10 atomów węgla, ewentualnie posiadającą od 1 do 3 podstawników w części aromatycznej wybranych z grupy składającej się z grup hydroksylowej, niższej alkoksylowej, aminowej i karboksylowej, 5) grupę -alkileno-Y, gdzie grupa alkilenowa jest grupą alkilenową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, a Y wybiera się z grupy składającej się z (a) grupy hydroksylowej, (b) grupy aminowej, (c) grupy cykloalkilowej i cykloalkenylowej zawierającej od 3 do 7 atomów węgla, (d) grupy arylowej zawierajęcej od 6 do 10 atomów węgla, ewentualnie posiadającej

188 795 od 1 do 3 podstawników w części aromatycznej wybranych z grupy składającej się z grup hydroksylowej, niższej alkoksylowej, aminowej i karboksylowej, (e) grupy heterocyklicznej zawierającej od 3 do 7 atomów węgla i 1 do 2 heteroatomów wybranych z grupy składającej się z atomów tlenu, siarki i azotu, (f) -C(O)R2, gdzie R2 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, grup hydroksylowej, niższej alkilowej, niższej alkoksylowej i -NRk, gdzie R3 i R4 niezależnie wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru i niższej grupy alkilowej, (g) -S(O)n R6, gdzie n jest liczbę całkowite od 1 do 2, a r6 jest niższe grupę, alkilowy, i z zastrzeżeniem, że R5 nie określa łańcucha bocznego naturalnie występuj ącego aminokwasu.

Inne korzystne syntetyczne aminokwasy obejmują aminokwasy, w których grupa aminowa jest oddzielona od grupy karboksylowej więcej niż jednym atomem węgla, takie jak b-alanina, kwas g-aminomasłowy i podobne.

Szczególnie korzystne syntetyczne aminokwasy obejmują aminokwasy, na przykład, D-aminokwasy naturalnie występujących L-aminokwasów, L-1-naftylo-alaninę, L-2-naftyl o-alaninę, L-cykloheksyloalaninę, kwas L-2-aminoizomasłowy oraz sulfotlenkowe i sulfonowe pochodne metioniny (tj. HO0c-(H2NCH)CH2CH2-S(O)„R⁶), gdzie n i R są takie same, jak zdefiniowano powyżej, jak również pochodne metioniny z niższymi grupami alkoksylowymi (tj. HOOC-(H2NCH)CH2CH2-OR6, gdzie R6jest jak zdefiniowano powyżej).

„Wykrywalny znacznik” odnosi się do materiałów, które, jeśli są kowalencyjnie połączone z peptydami i mimetykami peptydów według tego wynalazku, umożliwiają wykrywanie peptydu i mimetyków peptydów in vivo u pacjenta, któremu podano peptyd lub mimetyk peptydu. Odpowiednie wykrywalne znaczniki są dobrze znane w nauce i obejmują, na przykład, izotopy promieniotwórcze, znaczniki fluorescencyjne (np. fluoresceinę) i podobne. Konkretny rodzaj wykrywalnego znacznika nie ma zasadniczego znaczenia i wybiera się go pod względem wykorzystywanego stopnia wyznakowania, jak również toksyczności znacznika przy wykorzystywanym stopniu wyznakowania.

Wybór znacznika pod względem takich czynników pozostaje w zakresie umiejętności specjalisty w tej dziedzinie.

Kowalencyjne łączenie wykrywalnego znacznika z peptydem lub mimetykiem peptydu prowadzi się konwencjonalnymi metodami dobrze znanymi w nauce. Na przykład, jeśli jako wykrywalny znacznik wykorzystuje się izotop promieniotwórczy 1^2SJ, kowalencyjne związanie 125j z peptydem lub mimetykiem peptydu można uzyskać przez wprowadzenie do peptydu lub mimetyka peptydu aminokwasu tyrozyny, a następnie jodowanie peptydu. Jeśli tyrozyna nie występuje w peptydzie lub mimetyku peptydu, wprowadzenie tyrozyny do końca N lub C peptydu lub mimetyka peptydu można uzyskać dobrze znanymi metodami chemicznymi. Podobnie, 3²P można wprowadzić do peptydu lub mimetyka peptydu jako grupę fosforanową przez, na przykład, grupę hydroksylową peptydu lub mimetyka peptydu stosując konwencjonalne metody chemiczne.

Niniejszy wynalazek zapewnia związki, które wiążą się z i aktywną TPO-R lub inaczej zachowuję się jak agonista TPO. Związki te obejmują „wiodący” związek peptydowy i związki „pochodne”, skonstruowane tak, aby miały takie same lub podobną strukturę molekularną lub kształt, jak związki wiodący, ale które różnię się od wiodących związków albo pod względem podatności na hydrolizę bądź proteolizę i/albo pod względem innych właściwości biologicznych, takich jak zwiększone powinowactwo do receptora. Niniejszy wynalazek zapewnia również kompozycje zawierajęce skuteczne ilość agonistów, a bardziej szczegółowo związku, który jest użyteczny do leczenia zaburzeń hematologicznych, a zwłaszcza małopłytkowości związanej z chemioterapią, radioterapią lub transfuzję szpiku kostnego.

Peptydy posiadające powinowactwo więzania z TPO-R można łatwo zidentyfikować stosując losowe układy wytwarzania różnorodnych peptydów poleczone z procesem wzbogacania pod względem powinowactwa.

Szczegółowo, losowe układy wytwarzania różnorodnych peptydów obejmują układ „peptydy na plazmidach” opisany w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych o numerach 5 270 170 i 5 338 665; układ „peptydy na fagu” opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/718 577, złożonym 20 czerwca 1991 r., które jest kontynuacją w części zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/541 108, złożonego 20 czerwca 1990 r. i w Cwirla i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:

188 795

6378-6382 (1990); „układ polisomów” opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/300 262, złożonym 2 września 1994 r., które jest kontynuacją w części zgłoszenia opartego na zgłoszeniu patentowym Stanów Ojednoczonych Ameryki numer kolejny 08/144 775, złożonym 29 paździenika 1993 r. oraz światowego opisu patentowego PCT numer 95/11992; układ „kodowanej biblioteki syntetycznej (ESL)” opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Ojednoczonych Ameryki numer kolejny 08/146 886, złożonym 12 listopada 1993 r., które jest kontynuaccą w części zgłoszenia patentowego Stanów Ojednoczonych numer kolejny 07/946 239, złożonego 16 września 1992 r., które jest kontynuacją w części zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/762 522, złożonego 18 września 1991 r., oraz układ „syntezy imobilizowanego polimeru na bardzo dużą skalę” opisany w opisie patentowym Stanów Ojednoczonych Ameryki numer 5 143 854; publikacji patentowej PCT numer 90/15070, opublikowanej 13 grudnia 1990 r.; zgłoszeniu patentowym Stanów Ojednoczonych Ameryki numer kolejny 07/624 120, złożonym 6 grudnia 1990 r.; Fodor i in. Science 251: 767-773 (2/1991); Dower i Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-180 (1991) i zgłoszeniu patentowym Stanów Ojednoczonych Ameryki numer kolejny 07/805 727, złożonym 6 grudnia 1991 r.

Stosując opisane powyżej procedury, na ogół tworzono losowe peptydy o długości określonej liczby reszt aminokwasowych (np. 12). Dla utworzenia zbioru oligonuk.ląotydów kodujących losowe peptydy, zastosowano motyw kodonowy (NKK)x, gdzie N jest nukleotydem A, C, G lub T (równomolowo; zależnie od zastosowanej metodologii, można wykorzystać inne nukleotydy), K jest G lub T (równomolowo), a x jest liczbą całkowitą odpowiadającą liczbie aminokwasów w peptydzie (np. 12) do określenia wszystkich z 32 możliwych kodonów, które mogą powstać z motywu NNK: 1 dla każdego z 12 aminokwasów, 2 dla każdego z 5 aminokwasów, 3 dla każdego z trzech aminokwasów i tylko jeden dla trzech kodonów stop. A zatem, motyw NNK koduje wszystkie aminokwasy, koduje tylko jeden kodon stop i zmniejsza zróżnicowanie kodonów.

W wykorzystanych układach losowe peptydy prezentowane były albo na powierzchni cząstki fagowej, jako część białka fuzyjnego obejmującego białko otoczki pili lub pVIII pochodnej faga fd (peptydy na fagu), albo jako białko fhzyjne z białkiem fuzyjnym Lacl-peptyd związanym z plazmidem (peptydy na plazmidach).

Faga lub peptydy, obejmujące DNA kodujęce peptydy, · identyfikowano i izolowano przez proces wzbogacania pod względem powinowactwa stosując immobilizowany TPO-R. Proces wzbogacania pod względem powinowactwa, niekiedy nazywany „odpłukiwaniem”, obejmuje wiele tur inkubowania faga, plazmidów lub polisomów z immobilizowanym receptorem, zbieranie faga, plazmidów lub polisomów, które wiążą receptor (wraz z towarzyszącym DNA lub mRNA), oraz wytwarzanie większej ilości zebranych fagów lub plazmidów (wraz z białkiem fuzyjnym Lacl-peptyd). Podczas wzbogacania zazwyczaj stosowano zewnębrzkomórkową domenę (ECD).

Po kilku turach wzbogacania pod względem powinowactwa, faga lub plazmidy i towarzyszące peptydy badano w oznaczeniu ELISA w celu określenia, czy peptydy więżę się specyficznie z TPO-R. Oznaczenie to prowadzono podobnie do procedur stosowanych w procesie wzbogacania pod względem powinowactwa, z tym wyjątkiem, że po usunięciu niez wiązanego faga studzienki zazwyczaj traktowano przeciwciałem królika skierowanym przeciw fagowi, następnie przeciwciałem kozy skierowanym przeciw immunoglobulinom królika, skoniugowanym z alkaliczną fosfatazą (AP). Ilość alkalicznej fosfatazy w każdej studzience oznaczano standardowymi metodami. Podobną, procedurę ELISA do stosowania w układzie peptydy na plazmidach opisano szczegółowo poniżej.

Przez porównanie studzienek testowych z kontrolnymi (bez receptora) można określić, czy białka fuzyjne wiążą się specyficznie z receptorem. Populacje fagów, dla których stwierdzono wiązanie z TPO-R, przeszukiwano stosując procedurę analizy kolonii z wykorzystaniem jako sondy monowaląncyjnągo receptora wyznakowanego izotopem promieniotwórczym. Sondę tą można utworzyć stosując kinaze białkową do fosforylacji kemptydowej sekwencji połączonej z końcem C rozpuszczalnego receptora. „Poddaną inżynierii” postać receptora TPO eksprymuje się następnie w komórkach gospodarza, zazwyczaj komórkach CHO. Po zebraniu przez PI-PCL receptorów, receptor testuje się pod względem wiązania

188 795 z TPO lub specyficznych wobec TPO-R klonów fagowych. Receptor znakuje się następnie 32p do uzyskania wysokiej aktywności właściwej do stsowania jako monowalencyjna sonda do identyfikacji ligandów o wysokim powinowactwie stosując analizę kolonii.

Peptydy, co do których stwierdzono, że wiążą się specyficznie z receptorem, zsyntetyzowano następnie jako wolne peptydy (np. bez faga) i testowano w oznaczeniu blokowania. Oznaczenie blokowania prowadzono w podobny sposób jako ELISA, z tym wyjątkiem, że przed białkiem fuzyjnym do studzienek dodawano TPO lub peptyd odniesienia (studzienki kontrolne były dwóch rodzajów: (1) bez receptora, i (2) bez TPO lub peptydu odniesienia). Białka fuzyjne, których wiązanie z receptorem było blokowane przez TpO lub peptyd odniesienia, zawierają peptydy, które SA korzystnymi związkami według wynalazku, w losowej części peptydowej.

TPO-R, jak również jego domenę zewnątrzkomórkową, wytworzono w zrekombinowanych komórkach gospodarza. Jedną z użytecznych postaci TPO-R konstruuje się stosując standardowe metody przez ekspresję białka w postaci białka rozpuszczalnego w komórkach gospodarza transformowanych bakulowirusem; inną użyteczną postać konstruuje się z peptydem sygnałowym sekrecji białek i glikofosfolipidowym miejscem zakotwiczającym w błonie. Tę postać miejsca zakotwiczającego nazywa się „końcem PIG”. Patrz Caras i Wendell Science 243:11.96-1198 (1989) i Lin i in. Science 249: 677-679 (1990).

Stosując układ końca PIG, można fosfolipazą C odszczepiać receptor od powierzchni komórek, w których zachodzi jego ekspresja (np. stransformowanych komórek CHO wyselekcjonowanych z zastosowaniem sortera komórek pod kątem wysokiego poziomu ekspresji receptora). Odszczepiony receptor nadal posiada karboksylokońcową sekwencję aminokwasów, nćaz.ywuną „końcem HPAP”, z białka sygnałowego do zakotwiczania w błonie, i można go immobilizować bez dalszego oczyszczania. Zrekombinowane białko receptora można immobilizować przez opłaszczanie studzienek płytek do mikromiareczkowania przeciwciałem, skierowanym przeciw końcowi HPAP (Ab 179 lub Mab 179), blokowanie niespecyficznego wiązania albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, a następnie wiązanie odszczepionego zrekombinowanego receptora z przeciwciałem. Stosując tę procedurę można przeprowadzić reakcję immobilizacji przy różnych stężeniach receptora, dla określenia optymalnej ilości dla danego preparatu, ponieważ różne preparaty zrekombinowanego białka często zawierają różne ilości pożądanego białka. Ponadto, należy upewnić się, że immobilizujące przeciwciało jest całkowicie zablokowane (stosujęc TPO lub jakiś inny związek blokujący) podczas procesu wzbogacania pod względem powinowactwa. Inaczej, niezablokowane przeciwciało może wiązać niepożądanego faga podczas procedury wzbogacania pod względem powinowactwa. Aby uniknąć tego problemu, do zablokowania miejsc, które pozostaję niezablokowane po immobilizacji receptora, można zastosować peptydy, które wiążą immobilizujące przeciwciało, lub receptor można po prostu immobilizować bezpośrednio w studzienkach płytek do mikromiareczkowania, bez pomocy przeciwciała immobilizującego. Patrz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/947 399, złożone 18 września 1992, włączone poprzez odnośnik literaturowy.

Jeśli stosuje się układy wytwarzania losowych peptydów, które umożliwiają. multiwalencyjne odddziaływania ligand-receptor, trzeba zdawać sobie sprawę, że gęstość immobilizowanego receptora jest ważnym czynnikiem w określaniu powinowactwa ligandów, które mogę wiązać się z immobilizowanym receptorem. Przy wyższych gęstościach receptora (np. jeśli każdą studzienkę opłaszczoną przeciwciałem skierowanym przeciw receptorowi traktuje się 0,25 do 0,5 mg receptora), bardziej prawdopodobne jest wystąpienie multiwalencyjnego wiązania, niż przy niższych gęstościach receptora (np. jeśli każdą studzienkę opłaszczoną przeciwciałem skierowanym przeciw receptorowi traktuje się 0,5 do I ng receptora). Jeśli występuje multiwalencyjne wiązanie, bardziej prawdopodobne będzie wyizolowanie ligandów o stosunkowo niskim powinowactwie, o ile nie stosuje się wysokich gęstości immobilizowanego receptora do identyfikacji związków wiodących i stosuje niższe gęstości receptora do izolowania związków pochodnych o wyższym powinowactwie.

Dla rozróżnienia peptydów o wyższym powinowactwie, często stosuje się monowalencyjnę sondę receptorową. Sondę tę można wytworzyć stosując kinazę białkowej A do fosforylacji kemptydowej sekwencji połączonej z końcem C rozpuszczalnego receptora. Następnie

188 795 w komórkach gospodarza, zazwyczaj komórkach CHO, prowadzi się ekspresję „poddanej inżynierii” postaci receptora TPO. Po zebraniu receptorów przez PI-PLC, receptor testuje się pod kątem wiązania z TPO lub specyficznym wobec TPO-R klonami faga. Receptor znakuje się następnie ²P do wysokiej aktywności właściwej dla stosowania jako monowalencyjna sonda do identyfikacji ligandów o wysokim powinowactwie przy zastosowaniu analizy kolonii.

Korzystne metody przeszukiwania mające ułatwić identyfikację peptydów, które wiążą się z TPO-R, obejmują najpierw identyfikację peptydów wiodących, które wiążą się z zewnętrzkomórkową domenę receptora, a następnie przygotowywanie innych peptydów, które przy^^m^^ia^ peptydy wiodący. Szczegółowo, stosując peptydy oparte na pII lub pVIII w układzie fagowym, można przeszukiwać losowe bibliotekę w celu odkrycia faga, który prezentuje peptyd wiążący się z TPO-R. DNA fagów sekwencjonuje się dla określenia sekwencji peptydów prezentowanych na powierzchi fagów.

Klony zdolne do specyficznego więzania TPO-R zidentyfikowano w losowej bibliotece pVIII 10-aminokwasowych peptydów liniowych i losowych bibliotekach pYIII 10- i 12-aminokwasowych peptydów cyklicznych. Sekwencje tych peptydów służą jako podstawa do konstruowania innych bibliotek peptydowych zaprojektowanych tak, aby zawierały z wysoką częstością pochodne wstępnie zidentyfikowanych peptydów. Biblioteki te można syntetyzować, tak, aby sprzyjały wytwarzaniu peptydów, które różni, się od peptydu wiążącego tylko nielicznymi resztami. Podejście to obejmuje syntezę oligonukleotydu z sekwencją kodującą więżący peptyd, z tym wyjątkiem, że raczej zamiast stosowania w syntezie czystych preparatów każdego z czterech trifosforanów nukleozydów, stosuje się ich mieszaniny (tj. jedne z korzystnych mieszanin do tego celu jest 55% „właściwego” nukleotydu i po 15% każdego z pozostałych trzech nukleotydów, a inną korzystną mieszanin;, do tego celu jest 70% „właściwego” nukleotydu i po 10% każdego z trzech pozostałych nukleotydów), tak że tworzy się pochodne sekwencji kodujęcej peptyd wiążący.

Do uzyskiwania pochodnych peptydów wiodących przez przygotowywanie bibliotek „mutagenezy motywu” stosowano różnorodne strategie. Obejmowały one tworzenie mutagenizowanej biblioteki pVIII fagemidu opartą na sekwencji wzorcowej mutagenizowanej z częstością 70:10:10:10 i wydłużonej z każdego końca resztami losowymi dla utworzenia klonów, które koduję sekwencję ΧΧΧΧ (C, S, P lub R) TLREWL ΧΧΧΧΧΧ (C lub S). Podobną wydłużoną mutagenizowaną bibliotekę skonstruowano stosując układ peptydy-na-plazmidach dla utworzenia klonów, które koduję sekwencję ΧΧΧΧΧ (C, S, P lub R) TLREWL XXXXXXX. Dodatkową wydłużoną mutagenizowaną. bibliotekę, XxXx (S, S, P lub R) TLREWL ΧΧΧΧΧΧ (C lub S), skonstruowano stosując układ prezentacji na polisomach. Wszystkie trzy biblioteki przeszukiwano eluujęc peptydy i jako sondę stosując monowa-lencyjny receptor wyznakowany izotopem promieniotwórczym.

Techniki „peptydy na plazmidach” zastosowano także do przeszukiwania i badań przez mutagenezę i opisano je bardziej szczegółowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 338 665, który wleczono do mniejszego opisu, dla wszelkich celów, poprzez odnośnik literaturowy. Zgodnie z tym podejściem, losowe peptydy łączy się z końcem C LacI przez ekspresję z wektora plazmidowego zawierającego gen fuzyjny. Wiązanie fuzji Lacl-plazmid z kodującym je DNA zachodzi poprzez sekwencje lacO plazmidu, tworząc stabilny kompleks peptyd-LacI-plazmid, który można przeszukiwać przez oczyszczanie na zasadzie powinowactwa (wzbogacanie) na immobilizowanym receptorze. Tak wyizolowane plazmidy można następnie ponownie wprowadzać do E. coli przez elektroporację dla amplifikacji wyselekcjonowanej populacji w celu przeprowadzenia dodatkowych tur przeszukiwania lub badania pojedynczych klonów.

Ponadto, badania przeszukiwania i mutagenezy losowych peptydów przeprowadzono stosując układ prezentacji z LacI o zmodyfikowanym końcu C, w którym obniżono wartościowość prezentacji (układ prezentacji z „dimerem domen hełmowych”). Biblioteki przeszukano i otrzymane wstawki DNA sklonowano jako populację w wektorze białka wiążącego maltozę (MBP) umożliwiającym ich ekspresję jako końca C białka fuzyjnego. Nieoczyszczone lizaty komórkowe z losowo pobranych pojedynczych klonów fuzyjnych z MBP oznaczano następnie pod kątem wiazania TPO-R, stosując procedurę ELISA, jak omówiono powyżej.

188 795

Badania z zastosowaniem mutagenezy peptydów przeprowadzono również stosując układ prezentacji na polisomach, jak opisano w będęcycm przedmiotem jednoczesnego postępowania patentowego zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/300 262, złożonym 2 września 1994, które jest kontynuację w części zgłoszenia opartego na zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/144 775, złożonego 29 października 1993 r. i światowym opisie patentowym PCT numer 95/11992, z których każde włączono do ninie] szego opisu, dla wszelkich celów, poprzez odnośniki literaturowe. Skonstruowano mutagenizowaną bibliotekę oparte na sekwencji X X X X (C, P, R lub S) t 1 r e 1 X X X X X X (C lub S), gdzie X oznacza losowy kodon NNK, a małe litery oznaczają kodony aminokwasów mutagenizowanych z częstością. 70:10:10:10 w pozycjach 1 i 2 i posiadających K (G lub T) w pozycji 3 kodonu. Bibliotekę wzbogacano przez 5 tur wobec receptora TPO, który zimmobilizowano na perełkach magnetycznych. Po piątej turze populację zamplifikowanę przez PGR sklonowano w pAFF6 i klony dodatnie w ELISA zsekwencjonowano. Sekwencje zsubklonowano w wektorze MBP i ich powinowactwa wiązania określono przez ELISA MBP.

W celu immobilizacji TPO-R do przeszukiwania polisomów, najpierw chemicznie skoniugowano Ab 179 z aktywowanymi grupami tosylowymi perełkami magnetycznymi (dostępnymi w Dynal Corporation) w sposób opisany przez producenta. Perełki inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej z przeciwciałem w 0,5 M buforze boranowym (pH 9,5). Perełki przemyto i połączono z TPO-R zawierającym koniec „HPAP”. Perełki opłaszczone przeciwciałem i receptor inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C i perełki przemyto ponownie przed dodaniem biblioteki polisomowej.

Przeszukanie opisanych powyżej różnych bibliotek pozwoliło uzyskać peptydy wiążące receptor TPO, przedstawione w tabelach 1 i 2 poniżej, jak również inne, tu nie wymienione.

Tabela 1

Peptyd

1

REGPTLRQ WM

SRGMTLREWL

EGPTLRGWLA

REGQTLKEWL

ERGPFWAKAC

REG PRC VM WM

CSGLTLREWLVC

CLTGPFVTQ WLYEC

CGEGLTLTQWLEHC

CRAGPTLLEWLTLC

CRQGPTLTAWLLEC

CADGPTLREWISFC

CELVGPSLMS WLTC

CGTEGPTLSTWLDC

CDQLGVTLSRWLEC

188 795 cd. tabeli 1

1

SGTGLTLREWLGSFSLLS

CPEGPTLLQWLKRGYSSC

RGDGPTLSQWLYSLMIMC

MVAGPTLREFIASLPIHC

SMQGPTFREWVSMMKVLC

SVQCGPTLRQWLAARNHLS

GNADGPTLRQWLEGRRPKN

SVRCGPTLRQWLAARTHLS

LAIEGPTLRQWLHGNGRDT

HGRVGPTLREWKTQVATKK

C ADGPTLREWISFC

ISDGPTLKEWLSVTRGAS

SIEGPTLREWLTSRTPHS

TIKGPTLRQWLKSREHTS

GNADGPTLRQWLEGRRPKN

SIEGPTLREWLTSRTPHS

ISDGPTLKEWLSYTRGAS

Tabela 2

Peptyd

1

CSLEDLRKRC

CRRSELLERC

CTFKQFLDGC

CTRGEWLRCC

CTLRQWLQGC

CTLEELRACC

CTREELMRLC

CQRADLINFC

CNRNDLLLFC

CTRTEWLHGC

CTLEFMNGC

CSLGELRRLC

CNINQLRSIC

CTMRQFLVCC

188 795 cd. tabeli 2

1

CTRSEWLERC

CTLHEYLSGC

CTREELLRQC

CTFREFVNGC

CSRADFLAAC

CSCAQVVQCC

CTLRQWILLGMC

CTLREWLHGGFC

CTLRAWLMSETC

CTLRAWLMESCC

CTFQVWKLARNC

CLLREWLDXRTC

CVLREWLLXXSC

CLLSEFLAGQQC

CSLRQYLDFGLGSC

CTLQELKQSSLYEC

CDLSELKTHGYAYC

CKLSDWLMNGVAAC

CSLQEFLSHGGYVC

CSLKEFLHSGLMQC

CTFRQLLEYGVSSC

CTMREFLVASGVAC

CTLAEFLASGVEQC

CTLKEWLVSHEVWC

CTLREFLSLGMNAC

CTLREFLDPTTAVC

CSLLEFLALGVALC

GGGRGCTLKQWKQGDCGRS

CNRSQLLAAC

CTLQQWLSGC

CTLREFKAGC

CTRAQFLKGC

CTLREFNRGC

CTLSDFKRGC

188 795 cd. tabeli 2

1

CTFRQWKEAC

CTLSEFRGGC

CTLQEFLEGC

CTLQQWKDGC

CTRSQWLEGC

CSLQEFKHGC

CTLGEWKRGC

CTLWGCGKRGC

CTLQEWRGGC

CTRLSGCWLC

CTRTQWLLDC

CTLAEFRRGC

CTSTQWLLAC

CSRSQFLRSC

CTLREWLEGC

CTLREFLMMGAC

CTLKEWLL WSSC

CTLLEWLRNPVC

CTLRQ WLGDA WC

CTLGQ WLQMGMC

CTLREWVFAGLC

CLLLEFLSGADC

CTLGEFLAGHLC

CRLREFLVDLTC

CSFRSWLVDQTC

CTLREWLEDLGC

CTLQD WL VS WTC

CTLSEWLSELSC

CTLMQWLGGWPC

CTLREWLSYGYC

CTLQEWLSGGLC

GSHGCTLREWLCMKIVPC

QWQGCTLRDC1LRGVFWS

SVNSCTLREFLTGCRVFC

SYDGCTLRHWLMDIYGDC

188 795 cd. tabeli 2

1

QRSGCTLRDWFLLNCLAS

NYRGCTLSQWFSEQIVGC

GRSGCTLREYLGGMCYLS

ASWYCTVPELMEMQLPEC

GSTGCTLREXLHMLGLDC

ACEGCTLRQWLEYVRVGC

AQRGCTLQYFVSYGXDMC

GVCGCTLREFLA1PHTSC

SEGGCTLREWVASSLANC

SNSRCTLREWIIQGCDFS

CLGCTLSQWRKRTRCDTH

YRGCSRAQLLGGECRKK

GRGCTLKQWKQGDCGRS

VRGGCALRDWVAGECFDWT

LWRGCTLNGFKSRHCGSPP

CTLRSWKHRGCAP

GRGCTRAQWLAGCTTGH

RAGCTLREFRKGCLAL

KRGCTLAEMIRGCCNRSN

GRGCTLKQWKQGDCGRS

RWRGCSLAKLKKGAACGRG

RGGCTLREWRRVRVIN

GRGCTLKQWKQGDCGRS

RYGCTRHQWLVGTCVRH

Wartości IC50 niektórych dodatkowych reprezentatywnych peptydów podano w tabeli poniżej. Do oceny wartości IC50 można stosować różne metody. Na przykład, oznaczenie ELISA wiązania równowagowego, z wykorzystaniem jako wskaźnika albo MBP-TPO, albo lacl-peptyd, zastosowano do określenia, czy peptydy hamuję wiązanie TPO z domenę zewnętrzkomórkową receptora TPO. Zazwyczaj wartości IC50 określano stosując wolny peptyd. Wartość IC50 można określić stosując wolny peptyd, który ewentualnie może mieć zamidowany koniec C, lub może on być przygotowany jako ester lub inny karboksyamid.

W celu dokładnego odtworzenia sewencji na fagu, często za aminokwasami N-końcowymi i C-końcowymi syntetycznego peptydu wprowadza się jedną lub dwie reszty glicyny. Nie uważa się tych glicyn za konieczne do wiązania lub aktywności. Podobnie, w celu dokładnego naśladowania sekwencji prezentowanych na polisomach, za C-końcowymi aminokwasami syntetycznych peptydów często wprowadza się sekwencję MAS. Także w tym przypadku sekwencji tej nie uważa się za konieczną do wiązania lub aktywności.

188 795

Wartościo IC50 wskazano symbolicznie oznaczeniami „-, „+” , i „ ++”. Na przykład, te peptydy, które wykazywały wartości IC50 powyżej 200 pM, wskazano jako Te peptydy, które wykazywały wartości IC50 mniejsze niż lub równe 200 jiM oznaczono „+”, podczas gdy te, które wykazywały wartości IC50 500 nm lub niższe wskazano przez Te peptydy, które wykazywały wartości IC50 równe lub bliskie punktu granicznego dla danego symbolu, wskazano oznaczeniem mieszanym, np. Te peptydy, dla których wartości IC50 nie określono, wymieniono jako „NO”. Wartość IC50 dla peptydów posiadajęcych strukturę G G C T L ReWlHGGFCGG wynosiła 50 nM łub mniej. (Należy zauważyć, że za aminokwasami N-końcowymi i C-końcowymi wprowadzono dwie reszty glicyny dla odtworzenia dokładnej sekwencji prezentowanej przez faga. Glicyn tych nie uważa się za konieczne do wiązania lub aktywności.)

Tabela 3

Peptyd	Powinowactwo
1	2
GGCADGPTLREWISFCGG	++
GNADGPTLRQWLEGRRPKN	++
GGCADGPTLREWISFCGGK	++
TIKGPTLRQWLKSREHTS	++
GPTLRQWL	-
LAIEGPTLRQWLHGNGRDT	-H-
SIEGPTLREWLTSRTPHS	++

Powyższe tabele, zwłaszcza tabela 3, ilustrują, że korzystny rdzeń peptyd obejmuje sekwencję aminokwasów:

X,X2 Χ3 Xx Χ5 X6 Χ7 gdzie X1 jest C, L, M, P, Q, V; X2 jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, Ł, M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X.5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S. T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X₇ jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V.

W korzystnym rozwiązaniu, rdzeń peptydu obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ G X, X2 X3 X, X5 W X₇ gdzie X1 jest L, M, P, Q, lub V; X2 jest F, R, S lub T; X3 jest F, L, V lub W; X4 jest A, K, L, M, R, S, V lub T; X5 jest A, E, G, K, M, Q, R, S lub T; a X₇ jest C, I, K, L, M, lub V; i każdą resztę X8 niezależnie od siebie wybiera się spośród którychkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów, ich stereoizomerycznych D-aminokwasów oraz nienaturalnych aminokwasów. Korzystnie, każdą resztę X₈ niezależnie od siebie wybiera się spośród którychkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów i ich stereoizomerycznych D-aminokwasów. W korzystnym rozwiązaniu, X1 jest P; X₂ jest T; X3 jest L; X4 jest R; X5 jest E lub Q; a X7 jest I lub L.

Korzystniej, rdzeń peptydu obejmuje sekwencję aminokwasów:

X9 X8 G X, X₂ X3 X4 X5 W X₇ gdzie X9 jest A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T lub V; a X₈ jest A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T lub V. Korzystniej, X9 jest A lub I; a X8jest D, E lub K.

Szczególnie korzystne peptydy obejmuję: GGCADGPTLREWISFCGG; GN ADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTLREWISFCGGK;TIKGP TLRQWLKSREHTS;SIEGPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQW LHGNGRDT; CADGPTLREWISFC oraz IEGPTLRQWLA^I^?V.

188 795

W dalszych rozwiązaniach wynalazku, peptydy korzystne do stosowania w tym wynalazku obejmują peptydy posiadające strukturę rdzenia obejmujęcę sekwencję aminokwasów:

C X2 X3 X x 5 X6 X7 gdzie Χ2 jest K, L, N, Q, R, S, T lub V; Χ3 jest C, F, I, L, M, R, S lub V; X* jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; Χ5 jest A, D, E, G, S, V lub Y; X₆ jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V. W korzystniejszym rozwiązaniu, Χ4 jest A, E, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T lub W. W dalszym rozwiązaniu, Χ2 jest S lub T; Χ3 jest L lub R; Xą jest R; Xs jest D, E lub G; X<, jest F, L lub W; a Χ7 jest I, K, L, R lub V. Szczególnie korzystne peptydy obejmują: GGCTLREWLHGGFCGG.

W dalszym rozwiązaniu, peptydy korzystne do stosowania w tym wynalazku obejmuję peptydy posiadające strukturę obejmującą sekwencję aminokwasów:

X8 C X2 X3 X X 5 X6 X 7 gdzie Χ2 jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; Χ3 jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; Χ4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; Xs jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; Xe jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V; a Xg jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie aminokwasów. W niektórych rozwiązaniach, Xg jest korzystnie G, S, Y lub R.

Peptydy i mimetyki peptydów posiadające IC50 wyższe niż około 100 mM nie wykazuję wystarczającego wiązania dla umożliwiania stosowania w diagnostycznych lub terapeutycznych aspektach tego wynalazku. Korzystnie, do celów diagnostycznych, peptydy i mimoetyki peptydów posiadają IC50 około 2 mM lub niższe, a do celów farmaceutycznych, peptydy i mimetyki peptydów posiadają IC50 około 100 μΜ lub niższe.

Sekwencja peptydu więżącego zapewnia również sposób określania minimalnej wielkości związku wiążącego TPOR według wynalazku. Stosuj ęc układ „kodowanej biblioteki syntetycznej” (ESL) lub układ „syntezy immobilizowanego polimeru na bardzo duże skalę”, można nie tylko określić minimalne, wielkość peptydu o takiej aktywności, ale również przygotować wszystkie z peptydów, które tworzę grupę peptydów różniących się od korzystnego motywu (lub pod względem wielkości motywu) jednią dwiema lub więcej resztami. Ten zbiór peptydów można następnie przeszukać pod kątem zdolności wiązania z receptorem TPO. Ten układ syntezy immobilizowanych polimerów, lub inne metodę syntezy peptydów można również zastosować do syntetyzowania skróconych analogów, analogów delecyjnych, analogów z podstawieniem i ich kombinacji, dla wszystkich ze związków peptydowych według wynalazku.

Peptydy i mimetyki peptydów według ninieeszego wynalazku oceniano również w oznaczeniu zależnej od trombopoetyny proliferacji komórek, opisanym bardziej szczegółowo w przykładzie 2 poniżej. Proliferację komórek mierzy się technikę inkorporacji 3H-tymidyny jako wskaź.nika proliferacji komórek (patrz Mossmann J. Immunol. Methods 65: 55 (1983)). Testowane peptydy stymulowały proliferację komórek Ba/F3 stransformowanych TPO-R w sposób zależny od dawki, jak przedstawiono na fig. 1A. Peptydy te nie miały żadnego wpływu na macierzystą linię komórkową jak przedstawiono na fig. IB.

Figury od 7 do 9 przedstawiają wyniki dalszego oznaczenia, w którym ocenia się aktywność peptydów i mimetyków peptydów według wynalazku. W oznaczeniu tym u myszy indukuje się małopłytkowość stosując karboplatynę. Figura 7 przedstawia typowe wyniki dla traktowania myszy Balb/C karboplatynę (125 mg/kg, dootrzewnowo) w dniu 0. Linie przerywane odpowiadają zwierzętom nietraktowanym z trzech doświadczeń. Linia ciągła odpowiada grupie traktowanej karboplatynę w trzech doświadczeniach. Grube ciągłe linie odpowiadają danym historycznym. Figura 8 przedstawia wpływ miareczkowania karboplatynę na liczbę płytek krwi u myszy traktowanych wskazanymi ilościami karboplatyny (w mg/kg, dootrzewnowe (ip) w dniu 0). Figura 9 przedstawia poprawę indukowanej karboplatynę małopłytkowości w dniu 10 pod wpływem peptydu AF12513 (513). Karboplatynę (CBP; 50-125 mg/kg, dootrzewnowo) podawano w dniu 0. AF125513 (1 mg/kg, ip) podawano w dniach 1-9. Wyniki te wykazują, że peptydy według wynalazku mogę prowadzić do poprawy małopłytkowości w modelu mysim.

188 795

Ponadto, niektóre peptydy według wynalazku można dimeryzować lub oligomeryzować, zwiększając w ten sposób powinowactwo i/lub aktywność związków. W celu zbadania wpływu, który dimeryzacja/oligomeryzacja peptydów wywiera na siłę działania naśladującego TPO w oznaczeniach proliferacji komórek, zsyntetyzowano analog peptydu GGCADGPT LREWISFCGGz biotynylowanym końcem C(GGCADGPTLREWISFCGG K (biotyna)). Peptyd preinkubowano ze streptawidynę w wolnym od surowicy RPMI zbuforowanym HEPES w stosunku molowym 4:1. Kompleks testowano pod kątem stymulacji proliferacji komórek Ba/F3 stransformowanych TPO-R, w sposób opisany powyżej, równolegle z wolnym biotynylowanym peptydem i niebiotynylowanym peptydem macierzystym. Figura 2A przedstawia wyniki oznaczenia dla skompleksowanego peptydu biotynylowanego (AF 12885 ze streptawidyną. (SA) dla zarówno stransformowanej, jak i macierzystej linii komórkowej. Figura 2B przedstawia wyniki oznaczenia dla wolnego biotynylowanego peptydu (AF 12285) dla zarówno stransformowanej, jak i macierzystej linii komórkowej. Figura 2C przedstawia wyniki oznaczenia dla samej streptawidyny dla zarówno stransformowanej, jak i macierzystej linii komórkowej. Figury te pokazują, że wstępnie utworzony kompleks był w przybliżeniu 10 razy silniejszy od wolnego peptydu.

Specyficzność wiązania i aktywność peptydów według wynalazku można również sprawdzać przez badanie reaktywności krzyżowej peptydów z receptorem erytropoetyny (EPO-R). EPO-R również jest członkiem rodziny receptorów czynnika wzrostowego, tak jak TPO-R. Peptydy według wynalazku, jak również TPO, EPO i znany peptyd wiążący EPO, badano w oznaczeniu proliferacji komórek stosujęc linię komórek zależnych od EPO. W oznaczeniu tym jako macierzystą linię komórkową wykorzystuje się FDCP-1, zależne od czynnika wzrostowego mysią multipotencjalną pierwotną linię prekursorowych komórek hemopoetycznych (patrz np. Dexter i in. J. Exp. Med. 152-1036-1047 (1981)). Ta linia komórkowa może proliferować, ale nie różnicować się jeśli umieści się ją w podłożu kondycjonowanym WEHI-3 (podłożu, które zawiera IL-3, numer ATCC T1B68). Macierzystą linię komórkową, transfekuje się ludzkim lub mysim EPO-R dla wytworzenia linii komórkowej FDCP-1-EPO-R. Ta stransfekowana linia komórek może proliferować, ale nie różnicować się w obecności ludzkiego lub mysiego EPO.

Komórki hodowano do osiągnięcia połowy gęstości fazy stacjonarnej w obecności niezbędnych czynników wzrostowych. .

Następnie komórki przemywano PBS i głodzono w ciągu 16-24 godzin w pełnym podłożu bez czynników wzrostowych. Po określeniu żywotności komórek, przygotowano roztwory podstawowe (w pełnych podłożach bez czynników wzrostowych) o gęstości około 10⁵ komórek na 50 mikrolitrów. Kolejne rozcieńczenia testowanych związków (zazwyczaj, peptydu w fazie wolnego roztworu, w przeciwieństwie do peptydu związanego z fagiem lub innego związanego peptydu bądź peptydu immobilizowanego) wykonuje się w 96-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych w objętości końcowej 50 mikrolitrów na studzienkę. Do każdej studzienki dodaje się komórki (50 mikrolitrów) i inkubuje się je w ciągu 24-48 godzin, po którym to czasie kontrole ujemne powinny być martwe lub w fazie spoczynku. Następnie proliferację komórek mierzy się technikami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak oznaczenie MTT.

Figury 3A-3G przedstawiają wyniki szeregu doświadczeń kontrolnych pokazujących aktywność TPO, peptydów według nin^^e szego wynalazku, EPO i peptydów wiążących EPO-R w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem albo linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R, albo odpowiadającej jej linii macierzystej. Figura 3A przedstawia wyniki dla TPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R i odpowiadającej jej linii macierzystej. Figura 3B przedstawia wyniki dla EPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R i odpowiadającej jej linii macierzystej. Figura 3C przedstawia wyniki dla skompleksowanego peptydu biotynylowanego (AF 12285 ze streptawidyną (SA)) i skompleksowanej postaci biotynylowanego peptydu wiążącego EPO-R (Af 11501 z SA) w linii komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R. Wyniki dla odpowiadającej macierzystej linii komórkowej przedstawiono na figurze 3D. Figura 3E przedstawia wyniki dla TPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek zależnych od EPO. Figura 3F przedstawia wyniki dla

188 795

EPO w oznaczeniu proliferacji komórek z zastosowaniem linii komórek zależnych od EPO. Figura 3G przedstawia wyniki dla skompląksowanego peptydu biotynylowanego (AF 12285 ze streptawidynę (SA) i skompleksowanej postaci bietynylowanego peptydu wiążącego EPO-R (AF 11501 z SA) w linii komórek zależnych od EPO. Wyniki te wykazuję, że peptydy według wynalazku wiążą i aktywuję TPO-R z wysokim stopniem specyficzności.

Peptydy według wynalazku można przygotowywać klasycznymi metodami znanymi w tej dziedzinie, na przykład stosując standardowe techniki syntezy na fazie stałej. Standardowe metody obejmują metody syntezy wyłącznie na fazie stałej, syntezy częściowo na fazie stałej, kondensacji fragmentów, klasycznej syntezy w roztworze, a nawet technikę rekombinacji DNA. Patrz np. Mer^field J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), wleczony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Syntezę na fazie stałej zazwyczaj rozpoczyna się od końca C peptydu stosujęc żywicę o zablokowanych grupach alfa-aminowych. Odpowiedni materiał wyjściowy można przygotować, na przykład, przez przyłączenie wymaganego alfaaminokwasu do chlorometylowanej żywicy, żywicy hydroksymetylowej lub żywicy benzohydryleaminewąj. Jedna z takich chloromątylowanych żywic sprzedawana jest pod nazwę fabryczną BIO-BEADS SX-1 przez Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, a przygotowywanie żywicy hydroksymątylowej opisali Bodonszky i in. Chem. Ind. (Londyn) 38: 1597 (1966). Żywicę brnzohydryloammewę (BHA) opisali Pietta i Marshall Chero. Commn. 650 (1970) i jest ona komercyjnie dtos^t^I^Inj w Rockman Instnimcnts, Inc., Pało Alto, CA, w postaci chlorowodorku.

A zatem, związki według wynalazku można przygotowywać przez sprzęganie aminokwasu o zablokowanej grupie alfa-aminowej z chloromątyktwaną. żywicę przy pomocy, na przykład, katalizatora wodorowęglanu cezu, zgodnie z metodę opisaną przez Gisina, Helv. Chim. Acta 56: 1467 (1973). Po wstępnym sprzęganiu, grupy blokujące grupy alfa-aminową usuwa się, wybierając spośród odczynników obejmujących roztwory kwasu trifluorooctewąge (TFA) lub kwasu solnego w rozpuszczalnikach organicznych w temperaturze pokojowej.

Grupami blokującymi grupy alfa-aminowe sę te, o których wiadomo, że są użyteczne w dziedzinie etapowej syntezy peptydów. Obejmuję, one grupy blokujące typu acylowego (np. formyle\wą trifluoroacet]ow'ą, acetylową), grupy blokujące typu uretanu aromatycznego (np. benkyleksykarbeilowę (Cbz) lub podstawione Cbz), grupy blokujące typu uretanu alifatycznego (np. t-butyloksykarbonylowy (Boc), izopropyloksyka^rbonylowych, cykloheksyloksykarbonylową) i grupy blokujące typu alkilowego (np. benzylowy, trifenylometylową). Korzystnymi grupami blokującymi są Boc i Fmoc. Grupa blokująca łańcuch boczny pozostaje nienaruszona podczas sprzęgania i nie jest odszckąpiana podczas odblokowywania grupy blokującej koniec aminowy lub podczas sprzęgania. Grupa blokująca łańcuch boczny musi być możliwa do usunięcia po zakończeniu syntezy końcowego peptydu i w warunkach reakcyjnych, które nie będą zmieniać docelowego peptydu.

Grupy blokujące łańcuch boczny Tyr obejmują grupę tątrahydropiranyiow’ą, tertbutylową, tritylowę, benzylową, Cb2, O-Br-Cbz i 2,5-dichlorebąnzylową. Grupy blokujące łańcuch boczny Asp obejmują grupę benzylowy, 2,6-dichktrobenzyiow’ą, metylową etylową i cyąlΌhąąsykjwą. Grupy blokujące łańcuchy boczne Thr i Ser obejmują grupę acetylową, bąnzoilewą, tritytową tetrahydropir<anyową benzylową. 2,6-dichlorobenzylową i Cbz. Grupą blokują łańcuch boczny Thr i Ser jest grupa benzylowa. Grupy blokujące łańcuch boczny Arg obejmują grupę nitrową, tosylową (Tos), Cbz, adamantyloksykarbonylomezytoilosulfonylowę (Mts) lub Boc. Grupy blokujące łańcuch boczny Lys obejmują grupę Cbz, 2-chlorebenzyktąsykarbonylową (2-Cl-Cbz), 2-bromobąnzyloksykarbenylową (2-BrCbz), Tos lub Boc.

Po usunięciu grupy blokującej grupę alfa-aminową, pozostałe zablokowane aminokwasy sprzęga się etapami w pożądanej kolejności. Na ogół stosuje się nadmiar każdego zablokowanego aminokwasu z odpowiednim aktywatorem grupy karboksylowej, takim jak dicykloheksylokarbediimid (DDC) w roztworze, na przykład, w mieszaninach chlorku metylenowego (CH2CI2), dimetyloformamidu (DMF).

Po ukończeniu pożądanej sekwencji aminokwasowej, pożądany peptyd odszczepia się od żywicowego nośnika przez traktowanie takim odczynnikiem, jak kwas trifluorooctowy lub fluorowodór (HF), który nie tylko odszczepia peptyd od żywicy, ale również odszczepia

188 795 wszystkie pozostające grupy blokujące łańcuchy boczne. Jeśli stosuje się żywicę chlorometylowaną, wynikiem traktowania fluorowodorem jest tworzenie wolnych kwasów peptydowych. Jeśli stosuje się żywicę benzohydryloaminowę, wynikiem traktowania fluorowodorem jest tworzenie wolnych amidów peptydowych. Alternatywnie, jeśli wykorzystuje się żywicę chlorometylowaną, peptyd o zablokowanych łańcuchach bocznych można odszczepić przez traktowanie żywicy ze związanym peptydem amoniakiem otrzymując pożądany amid o zablokowanych łańcuchach bocznych, lub alkiloaminę, otrzymując alkiloamid lub dialkiloamid o zablokowanych łańcuchach bocznych. Grupy blokujące łańcuchy boczne usuwa się następnie w zwykły sposób przez traktowanie fluorowodorem, otrzymując wolne amidy, alkiloamidy lub dialkiloamidy.

Procedury syntezy peptydów na fazie stałej są dobrze znane w nauce i opisano je dalej w Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San Francisco, (1969)).

Stosując układy „kodowanej biblioteki syntetycznej” lub „syntezy immobilizowanego polimeru na bardzo dużą skalę”, opisane w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numer kolejnych 07/492 462, złożonym 7 marca 1990 r.; 07/624 120, złożonym 6 grudnia 1990 r. oraz 07/805 727, złożonym 6 grudnia 1991 r., można nie tylko określić minimalną wielkość peptydu o takiej aktywności, ale także przygotować wszystkie z peptydów tworzących grupę peptydów różniących się od korzystnego motywu (lub minimalnej wielkości tego motywu) jedną, dwiema lub więcej resztami. Ten zbiór peptydów można następnie przeszukać pod kątem zdolności wiązania z TPO-R. Ten układ syntezy immobilizowanego polimeru lub inne metody syntezy peptydów można również stosować do syntetyzowania analogów skróconych i analogów delecyjnych oraz kombinacji analogów skróconych i delecyjnych wszystkich związków peptydowych według wynalazku.

Procedury te można również stosować do syntetyzowania peptydów, w których aminokwasy inne od 20 naturalnie występujących, genetycznie kodowanych aminokwasów podstawia się w jednej, dwóch lub więcej pozycjach każdego ze związków według wynalazku. Na przykład, naftyloalaninę można podstawić trypofan, ułatwiając syntezę. Inne syntetyczne aminokwasy, którymi można podstawiać peptydy według niniejszego wynalazku, obejmują L-hydroksypropylo, L-3,4-dihydroksy-fenyloalanylo, d aminokwasy, takie jak L-d-hydroksylizylo i D-d-metyloalanylo, L-a-metyloalanylo, b aminokwasy, oraz izochinolil. D aminokwasy i nie występujące naturalnie syntetyczne aminokwasy można także wprowadzać do peptydów według nin^i^ szego wynalazku.

Naturalnie występujące łańcuchy boczne 20 kodowanych genetycznie aminokwasów (lub D aminokwasów) można zastąpić innymi łańcuchami bocznymi, na przykład takimi grupami, jak grupa alkilowa, niższa grupa alkilowa, 4-, 5-, 6- do 7-członowa grupa cykloalkilową, grupa amidowa, grupa amidowa podstawiona niższa grupą alkilową, grupa amidowa podstawiona dwiema niższymi grupami alkilowymi, niższa grupa alkoksylową, grupa hydroksylowa, grupa karboksylowa i ich pochodne z niższymi estrami oraz 4-, 5-, 6- do 7-członowa grupa heterocykliczna. W szczególności, można wykorzystać analogi proliny, w których wielkość pierścienia reszty proliny zmienia się z 5 członowej na 4, 6 lub 7 członowy. Grupy cykliczne mogą być nasycone lub nienasycone, a jeśli są nienasycone, mogą być aromatyczne lub niearomatyczne.

Grupy cykliczne mogę być nasycone lub nienasycone, a jeśli są nienasycone, mogą. być aromatyczne lub niearomatyczne. Grupy heterocykliczne korzystnie zawierają, jeden lub więcej heteroatomów azotu, tlenu i/lub siarki. Przykłady takich grup obejmuję grupy furazanylową, furylową, imidazolidynylową, imidazolilową, imidazolinylową, izotiazolilową, izoksazolilową, morfolinylową. (np. morfolinową), oksazolilową, piperazynylową (np. 1 -piperazynyłowę), piperydyiową (np. 1-piperydyiową, piperydynową), piranylową, pirazynylową, pirazolidynylową, pirazolinylową, pirazolilową, pirydazynylową, pirydylową, pirymidynylową, pirolidynylową. (np. 1-pirolidynylową), pirolinylową, pirolilową, tiadiazolilową, tiazolilową, tienylową, tiomorfolinylową i (np. tiomorfolinową) i triazolilową. Te grupy heterocykliczne mogę być podstawione lub niepodstawione. Jeśli grupa jest podstawiona, podstawnikiem może być grupa alkilowa, alkoksylową, atom chlorowca, atom tlenu bądź podstawiona lub niepodstawiona grupa fenylowa.

188 795

Peptydy według tego wynalazku można łatwo modyfikować przez fosforylację, a inne metody przygotowywania peptydowych pochodnych związków według niniejszego wynalazku opisano w Hruby i in. ⁴⁵. A zatem, peptydowe związki według wynalazku służą, również jako podstawa do przygotowywania mimetyków peptydów o podobnej aktywności biologicznej.

Peptydowe związki według wynalazku, włącznie z peptydo-mimetykami, można modyfikować kowalencyjnie w celu uzyskania jednego lub więcej różnych polimerów niebiałkowych, np. glikolu polietylenowego, glikolu polipropylenowego lub polioksyalkenów w sposób przedstawiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 640 835, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 496 689, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 301 144, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 670 417, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 791 192 lub opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 179 337, z których wszystkie w całości włączono do nini^e szego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Specjaliści w tej dziedzinie będę wiedzieć, że dostępne są różne techniki konstruowania mimetyków peptydów o takiej samej lub podobnej aktywności biologicznej, jak odpowiadający związek peptydowy, ale o korzystnieeszej aktywności niż peptyd pod względem rozpuszczalności, stabilności oraz podatności na hydrolizę i proteolizę. Patrz, na przykład, Morgan i Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252 (1989). Poniżej opisano metody przygotowywania mimetyków peptydów o zmodyfikowanej N-końcowej grupie aminowej, C-końcowej grupie karboksylowej i/lub jednym lub więcej wiązaniu amidowym peptydu zmienionym na wiązanie nieamidowe. Jest zrozumiałe, że dwie lub więcej takich modyfikacji można łączyć w strukturze jednego mimetyka peptydu (np. modyfikację C-końcowej grupy karboksylowej i wprowadzenie pomiędzy aminokwasy w peptydzie więzania -CHĘ-karbaminiaiowego).

Peptydy zazwyczaj syntetyzuje się w postaci wolnego kwasu, ale jak zauważono powyżej, można je łatwo przygotować w postaci amidu lub estru. Można również modyfikować koniec aminowy i/lub karboksylowy związku peptydowego według wynalazku w celu utworzenia innych związków według wynalazku. Modyfikacje końca aminowego obejmują metylowanie (tj. -NHCH3 lub -NH(CH₂)₂ acetylowanie, dołączanie grupy karbobenzoilowej lub blokowanie końca aminowego jakąkolwiek grupą blokującą i zawierającą grupą, funkcyjną karboksylanu zdefiniowaną jako RCOO-, gdzie R wybiera się z grupy składającej się z grupy naftylowej, akrydynylowej, steroidylowej i grup podobnych. Modyfikacje końca karboksylowego obejmują zastępowanie wolnego kwasu grupę karboksyamidową lub tworzenie cyklicznego laktamu w końcu karboksylowym w celu wprowadzenia ograniczeń strukturalnych.

Modyfikacje końca aminowego są takie, jak opisano powyżej i obejmują alkilowanie, acetylowanie, dołączanie grupy karbobenzoilowej, tworzenie grupy sukcynimidowej itp. Szczegółowo, N-k.ońcową grupę aminową można następnie poddawać następującym reakcjom:

(a) tworzenia grupy amidowej o wzorze RC(O)NH-, gdzie R jest taki jak zdefiniowano powyżej, przez reakcję z halogenkiem kwasowym [np. RC(O)Cl] lub bezwodnikiem kwasowym. Zazwyczaj reakcję można prowadzić przez umożliwienie kontaktu ilości w przybliżeniu równomolowych lub nadmiaru (np. około 5 równoważników) halogenku kwasowego, z peptydero w obojętnym rozcieńczalniku (np. dichlorometanie), korzystnie zawierającym nadmiar (np. około 10 równoważników) trzeciorzędowej aminy, takiej jak diizopropyloetyloamina, dla usuwania kwasu tworzonego podczas reakcji. Pod innymi względami warunki reakcji są konwencjonalne (np. temperatura pokojowa w ciągu 30 minut). Alkilacja końcowej grupy aminowej zapewniająca podstawienie końca N niższą grupą alkilową, a następnie reakcja z halogenkiem kwasowym, jak opisano powyżej, prowadzi do powstania grupy alkiloamidowej w końcu N o wzorze RC(O)NR-;

(b) tworzenia grupy sukcynimidowej przez reakcję z bezwodnikiem bursztynowym. Jak uprzednio, można zastosować w przybliżeniu równomolową ilość lub nadmiar bezwodnika bursztynowego (np. około 5 równoważników) i grupę aminową przekształca się w grupę sukcynimidową metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie, obejmującymi zastosowanie nadmiaru (np. dziesięciu równoważników) trzeciorzędowej aminy, takiej jak diizopropyloetyloamina, w odpowiednim rozpuszczalniku obojętnym (np. dichlorometanie). Patrz, na przykład, Wollenberg i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 612 132, który w cało188 795 ści włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Jest zrozumiałe, że grupę bursztynową można podstawić na przykład grupę alkilową o długości C2-C6 lub podstawnikami -SR, które przygotowuje się w konwencjonalny sposób, w celu otrzymania podstawionej grupy sukcynimidowej w końcu N peptydu. Takie podstawniki alkilowe przygotowuje się przez reakcję niższych olefin (C2-C6) z bezwodnikiem maleinowym w sposób opisany przez Wollenberga i in., supra, a podstawniki -SR przygotowuje się przez reakcję RSH z bezwodnikiem maleinowym, gdzie R jest taki, jak zdefiniowano powyżej;

(c) tworzenia grupy benzyloksykarbonylo-NH- lub podstawionej grupy benzyloksykarbonylo-NH- przez reakcję z w przybliżeniu równoważną ilością lub nadmiarem CBZ-C1 (tj. chlorku benzyloksykarbonylowego) lub podstawionego CBZ-C1 w odpowiednim obojętnym rozcieńczalniku (np. dichlorometanie), korzystnie zawierającym trzeciorzędową aminę dla usuwania kwasu tworzonego podczas reakcji;

(d) tworzenia grupy sulfonoamidowej przez reakcję z równoważną ilością lub nadmiarem (np. 5 równoważnikami) R-S(O)2Cl w odpowiednim obojętnym rozcieńczalniku (dichlorometanie), dla przekształcenia końcowej grupy aminowej w sulfonoamidową, gdzie R jest taki, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, obojętny rozcieńczalnik zawiera nadmiar trzeciorzędowej aminy (np. dziesięć równoważników), takiej jak diizopropyloetyloamina dla usuwania kwasu tworzonego podczas reakcji. Pod innymi względami warunki reakcji są konwencjonalne (np. temperatura pokojowa w ciągu 3Q minut);

(e) tworzenia grupy karbaminianowej przez reakcję z równoważną ilością lub nadmiarem (np. 5 równoważnikami) R-OC(O)Cl lub R-OC(O)OC₍,H4-pNO2 w odpowiednim obojętnym rozcieńczalniku (np. dichlorometanie), dla przekształcenia końcowej grupy aminowej w karbaminianową, gdzie R jest taki, jak określono powyżej. Korzystnie, obojętny rozcieńczalnik zawiera nadmiar (np. dziesięć równoważników) trzeciorzędowej aminy, takiej jak diizopropyloetyloamina, dla usuwania kwasu tworzonego podczas reakcji. Pod innymi względami warunki reakcji są konwencjonalne (np. temperatura pokojowa w ciągu 3Q minut); i (f) tworzenia grupy mocznikowej przez reakcję z równoważną, ilością lub nadmiarem (np 5 równoważnikami) R-N=C=O w odpowiednim obojętnym rozcieńczalniku (np. dichlorometanie), dla przekształcenia końcowej grupy aminowej w grupę mocznikową (tj. RNHC(O)NH-), gdzie R jest taki, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, obojętny rozcieńczalnik zawiera nadmiar (np. około dziesięciu równoważników) -aminy trzeciorzędowej, takiej jak diizopropyloetyloamina. Pod innymi względami warunki reakcji są konwencjonalne (np. temperatura pokojowa w ciągu około 3Q minut).

Podczas przygotowywania mimetyków peptydów, w których C-końcową grupę karboksylową zastępuje się estrem (tj. -C(O)OR, gdzie R jest taki, jak zdefiniowano powyżej), wykorzystuje się żywice stosowane do przygotowywania kwasów peptydowych, i peptyd o zablokowanych łańcuchach bocznych odszczepia się zasadę w odpowiednim alkoholu, np. metanolu. Następnie usuwa się grupy blokujące łańcuchy boczne w zwykły sposób przez traktowanie fluorowodorem w celu otrzymania pożądanego estru.

Podczas przygotowywania mimetyków peptydów, w których C-końcową grupę karboksylowę zastępuje się amidem -C(O)NRk, jako stały nośnik do syntezy peptydów stosuje się żywicę benzohydryloaminową. Po zakończeniu syntezy, w wyniku traktowania fluorowodorem dla uwolnienia peptydu z nośnika, uzyskuje się bezpośrednio wolny amid peptydowy (tj. końcem jest -C(O)NH2). Alternatywnie, w wyniku stosowania podczas syntezy peptydów żywicy chlorometylowanej wraz z reakcją, z amoniakiem dla odszczepienia peptydu o zablokowanych łańcuchach bocznych z nośnika, otrzymuje się wolny amid peptydowy i po reakcji z alkiloaminą. lub dialkiloaminą uzyskuje się alkiloamid lub dialkiloamid o zablokowanych łańcuchach bocznych (tj. końcem C jest -C(O)NRR^!, gdzie R i R^! są takie, jak zdefiniowano powyżej). Grupy blokujące łańcuchy boczne usuwa się następnie w zwykły sposób przez traktowanie fluorowodorem, otrzymując wolne amidy, alkiloamidy lub dialkiloamidy.

W innym alternatywnym rozwiązaniu, można indukować cyklizację C-końcowej grupy karboksylowej C-końcowego estru przez wewnętrzne zastąpienie grupy -OH lub estru (-OR) grupy karboksylowej lub estru odpowiednio N-końcową grupą aminową z utworzeniem peptydu cyklicznego. Na przykład, po syntezie i odszczepieniu z otrzymaniem kwasu peptydowego, wolny kwas przekształca się w aktywowany ester odpowiednim aktywatorem grup kar32

188 795 boksytowych, takim jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC) w roztworze, na przykład w mieszaninach chlorku metylenowego (CH2CI2), dimetyloformamidu (DMF). Cykliczny peptyd tworzy się następnie przez wewnętrzne zastąpienie aktywowanego estru N-końcową grupą aminową. Wewnętrzną cyklizację, w przeciwieństwie do polimeryzacji, można wzmocnić przez zastosowanie bardzo rozcieńczonych roztworów. Takie metody są dobrze znane w tej dziedzinie.

Można również przeprowadzić cyklizację peptydów według wynalazku, lub wprowadzenie reszty dezaminowej lub dezkarboksylowej w końcach peptydu, tak że brak jest końcowej grupy aminowej lub karboksylowej, w celu obniżenia wrażliwości na proteazy lub dla ograniczenia konformacji peptydu. C-końcowe grupy funkcyjne związków według niniejszego wynalazku obejmują grupę amidową, grupę amidową, podstawionią ni:^^;zą grupę alkilową, grupę amidową podstawioną dwiema niższymi grupami alkilowymi, niższą grupi^ą alkoksylową, grupą hydroksylową i karboksylową oraz ich pochodne z niższymi estrami i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Inne metody przygotowywania peptydowych pochodnych związków według wynalazku opisano w Hruby i in. Biochem J. 268(2): 249-262 (1990), włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. A zatem, związki peptydowe według wynalazku służą również jako modele strukturalne niepeptydowych związków o podobnej aktywności biologicznej. Specjaliści w tej dziedzinie wiedzą że dostępne są różne techniki konstruowania związków 0 takiej samej lub podobnej pożądanej aktywności biologicznej, jak wiodącego związku peptydowego, ale o korzystniejszej od niego aktyw.ności pod względem rozpuszczalności, stabilności lub podatności na hydrolizę lub proteolizę. Patrz Morgan i Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252 (1989), włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Techniki te obejmują zastępowanie szkieletu peptydowego szkieletem składającym się z fosfonianów, amidanów, karbaminianów, sulfonoamidów, amin drugorzędowych i kwasów N-metyloaminowych.

Mimetyki peptydów, w których jedno lub więcej wiązań peptydowych [-C(O)BH-] zastąpiono takimi wiązaniami, jak wiązanie -CHh-karbaminianowe, wiązanie fosfoniowe, wiązanie -CH2-sulfonoamidowe, wiązanie mocznikowe, wiązanie przez aminę drugorzędową (-CH2NH-) i alkilowane wiązanie peptydowe [-C(O)NR6-, gdzie R⁶ jest niższą grupą alkilową], przygotowuje się podczas konwencjonalnej syntezy peptydów przez jedynie zastąpienie, podczas odpowiedniego punktu syntezy, odczynnika aminokwasowego odpowiednio zablokowanym analogiem aminokwasu.

Odpowiednie odczynniki obejmują, na przykład, analogi aminokwasów, w których grupę karboksylową zastąpiono resztą odpowiednią do tworzenia jednego z powyższych wiązań. Na przykład, jeśli pożądane jest zastąpienie wiązania -C(O)NR-w peptydzie wiązaniem -CH2karbaminianowym (-CH2OC(O)NR-), to najpierw grupę karboksylową (-COOH) odpowiednio zablokowanego aminokwasu redukuje się do grupy -CH2OH, którą następnie przekształca się konwencjonalnymi metodami w grupę funkcyjną -OC(O)C1 lub w grupę funkcyjną para-nitrowęglanową -OC(O)O-C6H4-p-NO2. Reakcja którejkolwiek z tych grup funkcyjnych z wolną aminą lub alkilowaną aminą na końcu N częściowo utworzonego peptydu znajdującego się na stałym nośniku prowadzi do tworzenia wiązania -CH2OC(O)NR. Dla bardziej szczegółowego opisu tworzenia takich wiązań -Cfk-karbaminianowych, patrz Cho i in. Science 261: 1303-1305 (1993).

Podobnie, zastąpienie wiązania amidowego w peptydzie wiązaniem fosfonianowym można uzyskać w sposób przedstawiony w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach kolejnych 07/943 805, 08/081 577 i 08/119 700, ujawnienia których włączono w całości uo niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Zastąpienie wiązania amidowego w peptydzie wiązaniem -CIT-sulfonoamidowym można uzyskać przez zredukowanie grupy karboksylowej (-COOH) odpowiednio zablokowanego aminokwasu do grupy -CH2OH, a następnie grupę hydroksylową przekształca się konwencjonalnymi metodami w odpowiednią grupę opuszczającą, taką jak grupa tosylowa. Reakcja tosylowanej pochodnej z, na przykład, kwasem tiooctowym, a następnie hydroliza i oksydacyjne chlorowanie zapewni grupę funkcyjną. -CH2-S(O)2Cl, która zastępuje grupę karboksylowę poza tym odpowiednio zablokowanego aminokwasu. Zastosowanie tego odpo188 795 wiednio zablokowanego analogu aminokwasu w syntezie peptydu zapewnia wprowadzenie wiązania -CH2S(O)2NR-, które zastępuje wiązanie amidowe w peptydzie, w ten sposób dając mimetyk peptydu. Dla bardziej pełnego opisu przekształcania grupy karboksylowej aminokwasu w grupę -CH2S(O)2Cl patrz, na przykład, Weinstein. Boris Chemistry & Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins. tom 7, str. 267-357, Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork (1983), który włączono do nin^^^szego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Zastąpienie wiązania peptydowego w peptydzie wiązaniem mocznikowym można uzyskać w sposób przedstawiony w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych numer kolejny 08/147 805, które to zgłoszenie włączono w całości do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Wiązania poprzez aminę drugorzędową, gdzie wiązanie -CH2NH- zastępuje wiązanie amidowe w peptydzie, można przygotować przez wykorzystanie, na przykład, odpowiednio zablokowanego analogu dipeptydowego, w którym wiązanie karbonylowe wiązania peptydowego zredukowano konwencjonalnymi metodami do grupy CH2. Na przykład, w przypadku diglicyny, wynikiem redukcji amidu do aminy będzie po odblokowaniu H2NCH2CH2NHCH2COOH, który stosuje się następnie w postaci z zablokowanym końcem N w kolejnej reakcji sprzęgania. Przygotowywanie takich analogów przez redukcję grupy karbonylowej wiązania amidowego w dipeptydzie jest dobrze znane w tej dziedzinie.

Odpowiednio zablokowany analog aminokwasu wykorzystuje się w konwencjonalnej syntezie peptydów w taki sam sposób, jakby był odpowiadającym aminokwasem. Na przykład, zazwyczaj w reakcji tej wykorzystuje się około 3 równoważników zablokowanego analogu aminokwasu. Stosuje się obojętny rozcieńczalnik organiczny, taki jak chlorek metylenowy lub DMF, i, jeśli jako produkt uboczny tworzy się kwas, rozpuszczalnik reakcyjny będzie zazwyczaj zawierał nadmiar aminy trzeciorzędowej do usuwania kwasu wytwarzanego podczas reakcji.

Jedną szczególnie korzystną aminą trzeciorzędową jest diizopropyloetyloamina, którą zazwyczaj stosuje się w 10-krotnym nadmiarze. W wyniku reakcji uzyskuje się wprowadzenie do mimetyka peptydu analogu aminokwasu posiadającego wiązanie niepeptydowe. Jeśli jest to pożądane, takie podstawienie można powtarzać, także od żadnego do wszystkich wiązań amidowych w peptydzie zostaje zastąpione wiązaniami nieamidowymi.

Można również, w celu obniżenia wrażliwości na proteazy lub ograniczenia konformacji peptydu, cyklizować peptydy według wynalazku, lub wprowadzać resztę dezaminową lub dezkarboksylową w końcach peptydu, tak że nie występuje końcowa grupa aminowa lub karboksylowa. C-końcowe grupy funkcyjne związków według niniejszego wynalazku obejmują grupę amidową, grupę amidową podstawioną niższą grupą alkilową, grupę amidową podstawioną dwiema niższymi grupami alkilowymi, niższą grupę alkoksylową, grupę hydroksylową i karboksylową oraz ich pochodne z niższymi estrami i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Przykłady cyklicznych związków podano w tabelach 4, 5, 6, 8 i 9.

Związki według niniejszego wynalazku mogą występować w postaci cyklicznej z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy grupami tiolowymi reszt cysternowych. Alternatywnie, można utworzyć międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy grupami tiolowymi 'reszt cysternowych, w celu uzyskania związku dimerycznego (lub oligomeru wyższego rzędu). Jedną lub więcej reszt cystein można także podstawić resztą homocysteiny. Te wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe pochodne dwusiarczkowe można przedstawić schematycznie jak pokazano poniżej:

188 795

Ρ^Η2>π gdzie m i n są niezależnie od siebie 1 lub 2.

Inne rozwiązania tego wynalazku zapewniają analogi tych pochodnych dwusiarczkowych, w których jeden z atomów siarki zastąpiono grupę CH₂ lub innym izosterem atomu siarki. Analogi te można przygotować poprzez zastąpienie wewnątrzcząsteczkowe lub międzycząsteczkowe, stosując metody znane w tej dziedzinie, jak przedstawiono poniżej:

gdzie p jest 1 lub 2. Specjalista w tej dziedzinie z łatwością zrozumie, że to zastąpienie można również przeprowadzić stosując inne homologi przedstawionej powyżej pochodnej kwasu a-amino-g-masłowego oraz homocysteinę.

Alternatywnie, koniec aminowy peptydu można zakończyć kwasem octowym podstawionym w pozycji alfa, gdzie podstawnik w pozycji alfa jest grupę opuszcz^ąc!. taką jak kwas a-chlorowcooctowy, na przykład kwas a-chlorooctowy, kwas a-bromooctowy lub kwas a-jodooctewy. Związki według niniejszego wynialazku można cyklizować lub dimeryzować poprzez zastąpienie grupy opuszczającej atomem siarki reszty cysteiny lub homocysteiny. Patrz, np., Barker i in. J. Med. Chem. 35: 2040-2048 (1992) i Or i in. J. Org. Chem. 56: 3146-3149 (1991), z których każdy włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Przykłady związków dimeryzowanych podano w tabelach 7, 9 i 10.

Związki według wynalazku są użyteczne in vitro jako unikalne narzędzia do zrozumienia biologicznej roli TPO, włącznie z ocenią wielu czynników uważanych za wpływające, i będące pod wpływem wytwarzania TPO i procesu wiązania receptora. Niniejsze związki s. również użyteczne w opracowywaniu innych związków, które wiążą i aktywuję TPO-R, ponieważ dostarczają one ważnych informacji o współzależnościach pomiędzy strukturę a aktywności., które powinny ułatwiać takie opracowywanie.

Związki s. również użyteczne jako współzawodniczę czynniki wiążące w oznaczeniach mających na celu przeszukiwanie nowych agonów receptora TPO. W takich rozwiązaniach

188 795 dotyczących oznaczeń związki według wynalazku można stosować bez modyfikacji, lub można je modyfikować w różnorodny sposób; na przykład przez znakowanie, takie jak kowalencyjne lub niekowalencyjne przyłączanie reszty, która bezpośrednio łub pośrednio zapewnia wykrywalny sygnał. W każdym z tych oznaczeń stosowane materiały można znakować albo bezpośrednio, albo pośrednio. Możliwości bezpośredniego znakowania obejmują takie grupy znacznikowe, jak znaczniki promieniotwórcze, jak ^J, enzymy (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3 645 090), takie jak peroksydaza i alkaliczna fosfataza oraz znaczniki fluorescencyjne (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3 940 475) umożliwiające monitorowanie zmiany intensywności fluorescencji, przesunięcie długości fali maksimum widma lub polaryzacji fluorescencji. Możliwości pośredniego znakowania obejmują biotynylację jednego składnika, a następnie wiązanie z awidynę sprzęgnięte z jedną z powyższych grup znaczników. W przypadkach, jeśli związki mają być przyłączane do stałego nośnika, mogę one również obejmować odstępniki lub łączniki.

Ponadto, w oparciu o ich zdolności wiązania z receptorem TPO, peptydy według niniejszego wynalazku można stosować jako odczynniki do wykrywania receptorów na żywych komórkach, utrwalanych komórkach, w płynach biologicznych, w homogenatach tkankowych, w oczyszczonych, naturalnych materiałach biologicznych itp. Na przykład, przez wyznakowanie takich peptydów można zidentyfikować komórki posiadające na powierzchni TPO-R. Ponadto, w oparciu o ich zdolności wiązania z receptorem TPO, peptydy według niniejszego wynalazku można stosować w barwieniu in situ, FACS (aktywowane fluorescencyjnie sortowanie komórek), blottingu typu Western, ELISA itp. Ponadto, w oparciu o ich zdolności wiązania z receptorem TPO, peptydy według niniejszego wynalazku można stosować w oczyszczaniu receptora lub oczyszczaniu komórek, u których na powierzchni zachodzi ekspresja receptorów TPO (lub wewnątrz komórek permjαbilizowanych).

Związki według niniejszego wynalazku można również wykorzystywać jako komercyjne odczynniki do różnych medycznych zastosowań badawczych i diagnostycznych. Zastosowania takie obejmują, ale nie ograniczają się do: (1) stosowania jako standard kalibracyjny do ilościowego oznaczania aktywności potencjalnych agonistów w TPO różnorodnych oznaczeniach funkcjonalnych; (2) stosowania do utrzymywania proliferacji i wzrostu zależnych od TPO linii komórkowych; (3) stosowania w strukturalnej analizie receptora TPO poprzez kokrystalizację; (4) stosowania do badania mechanizmu przekazywania sygnału TPO/aktywacji receptora; oraz (5) innych zastosowań badawczych i diagnostycznych, w których korzystna jest aktywacja receptora TPO lub taką aktywację dogodnie kalibruje się wobec znanej ilości agonu TPO, i podobnych.

Związki według niniejszego wynalazku można stosować do namnażania zn vztro megakariocytów i ich pobieranych komórek prekursorowych, zarówno łącznie z dodatkowymi cytokinami, jak i same. Patrz, np., DiGiusto i in. publikacja PCT numer 95/05843, którą włączono do niniej szego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Chemioterapia i radioterapie powoduję małopłytkowość przez zabijanie szybko dzielącej się, bardziej dojrzałej populacji megahariocytów. Jednakże, te działania terapeutyczne mogę również zmniejszać ilość i żywotność niedojrzałych komórek prekursorowych megaRariocytów o mniejszej aktywności mitotycznej. A zatem, poprawę małopłytkowości pod wpływem TPO lub związków według niniejszego wynalazku można przyspieszyć przez infuzję pacjentom po chemioterapii lub radioterapii populacji jego, lub jej, własnych komórek wzbogaconych przez hodowlę in v/tro w megakariocyty i niedojrzałe prekursory.

Związki według nini^^j szego wynalazku można również podawać zwierzętom stałocieplnym, włącznie z ludźmi, w celu aktywacji TPO-R in vivo. A zatem, niniejszy wynalazek obejmuje metody działania terapeutycznego na zaburzenia zależne od TPO, które obejmują podawanie związku według wynalazku w ilościach wystarczających do naśladowania wpływu TPO na TPO-R in vivo. Na przykład, peptydy i związki według wynalazku można podawać w celu leczenia różnych zaburzeń hematologicznych, obejmujących, ale nie ograniczonych do zaburzeń płytek krwi i małopłytkowości, szczególnie, jeśli wiążą się one z transfuzjami szpiku kostnego, radioterapią. i chemioterapią.

188 795

W niektórych rozwiązaniach wynalazku, pacjentom poddawanym chemioterapii lub radioterapii korzystnie najpierw podaje się antagonistów, a następnie podaje się agonistów TPO według wynalazku.

Aktywność związków według niniejszego wymalazku można oceniać albo in vitro, albo in vivo, w jednym z licznych modeli opisanych w McDonald Am. J. of Pediatrie Hematology/Oncology 14: 8-21 (1992), włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Według jednego rozwiązania, kompozycje według ninitejszego wynalazku użyteczne są do leczenia małopłytkowości związanej z transfuzjami szpiku kostnego, radioterapią lub chemioterapią. Związki podawane będą zazwyczaj profilaktycznie przed chemioterapią, radioterapią lub przeszczepem szpiku kostnego, bądź po takich działaniach.

A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycje farmaceutyczne, jako składnik aktywny zawierające co najmniej jeden z peptydów lub mimetyków peptydów według wynalazku, łącznie z nośnikiem lub rozcieńczalnikiem farmaceutycznym. Związki według tego wynalazku można podawać drogami podawania doustną, dopłucną, pozajelitową (iniekcja domięśniowa, dootrzewnowa, dożylna (IV) lub podskórna), przez inhalację (w postaci drobnego proszku), przezskómą, donosową, dopochwową, doodbytniczą lub podjęzykową, i można im nadawać postać dawkowania odpowiednią do każdej drogi podawania. Patrz, np., Bernstein i in. publikacja patentowa PCT numer WO 93/25221, Pitt i in. publikacja patentowa PCT numer WO 94/17784 oraz Pitt i in. europejskie zgłoszenie patentowe numer 613 683, z których każde włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Stałe postacie dawkowania do podawania doustnego obejmują kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich stałych postaciach dawkowania związek aktywny miesza się z co najmniej jednym obojętnym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak sacharoza, laktoza lub skrobia. Takie postacie dawkowania mogę również obejmować, zgodnie z normalne praktyką, dodatkowe substancje inne od obojętych rozcieńczalników, np. środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezowy. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek, postacie dawkowania mogą również zawierać środki buforujące. Tabletki i pigułki można ponadto przygotowywać z powłokami dojelitowymi.

Płynne postacie dawkowania do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy, z eliksirami zawierajęcymi obojętne rozcieńczalniki powszechnie stosowane w tej dziedzinie, takie jak woda. Poza takimi obojętnymi rozcieńczalnikami, kompozycje mogę zawierać również adiuwanty, takie jak środki zwilżające, środki emulgujące i zawieszające oraz środki słodzące, smakowe i zapachowe.

Preparaty według tego wynalazku do podawania pozajelitowego obejmują jałową, wodne i niewodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Przykładami niewodnych rozpuszczalników lub podłóż są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i olej kukurydziany, żelatynę i nadające się do iniekcji estry organiczne, takie jak oleinian etylowy. Takie postacie dawkowania mogą również zawierać takie adiuwanty, jak środki konserwujące, zwilżające, emulgujące i dyspergujące. Można je wyjaławiać przez, na przykład, sączenie przez sączek zatrzymujący bakterie, przez włączanie środków wyjaławiających do kompozycji, przez napromieniowywanie kompozycji lub przez ogrzewanie kompozycji. Można je również tworzyć stosując bezpośrednio przed użyciem jałową wodę lub jakieś inne podłoże iniekcyjne.

Kompozycje do podawania doodbytniczego lub dopochwowego są korzystnie czopkami, które mogę zawierać, poza substancją aktywnią zarobki, takie jak masło kakaowe lub wosk do czopków. Można również przygotowywać kompozycje do podawania donosowego lub poajęzykowego ze standardowymi zarobkami dobrze znanymi w tej dziedzinie.

Kompozycje zawierające związki można podawać w celach profilaktycznych i/lub leczniczych. W zastosowaniach leczniczych kompozycje podaje się pacjentowi już cierpiącemu na chorobę, jak opisano powyżej, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub przynajmniej częściowego zatrzymania objawów choroby i jej powikłań. Odpowiednią do realizacji tego celu ilość określa się jako „dawkę skuteczną terapeutycznie”. Ilości skuteczne w tym zastosowaniu zależeć będą od stopnia zaawansowania choroby oraz wagi i ogólnego stanu pacjenta.

188 795

Kompozycje według wynalazku można również kapsułkować, na przykład metody Tice i Bibi (w: Treatise on Controlled Drug Delivery, red. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y. (1992), str. 315-339).

W zastosowaniach profilaktycznych, kompozycje zawierające związki według wynalazku podaje się pacjentowi, podatnemu na lub w inny sposób zagrożonemu konkretną chorobą. Taką ilość określa się jako „dawkę skuteczną profilaktycznie”. Również przy takim stosowaniu, dokładne ilości zależą od stanu zdrowia i wagi pacjenta.

Ilości agonisty TPO konieczne do skutecznego leczenia zależeć będą od wielu różnych czynników, włącznie ze sposobem podawania, docelowym miejscem, stanem fizjologicznym pacjenta, i innymi podawanymi lekami. A zatem, dawki lecznicze powinno się stopniowo zwiększać w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności. Zazwyczaj dawki stosowane in vitro mogą dostarczyć pożytecznych wskazówek dotyczących ilości użytecznych w podawaniu in situ tych czynników. Testowanie na zwierzętach dawek skutecznych w leczeniu poszczególnych zaburzeń dostarczy dalszych wskazówek dotyczących dawek dla ludzi. Różne rozważania na ten temat opisano np. w Gilman i in. (red.) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 8, Pergamon Press (199Q); oraz Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 7, Mack Publishing Co., Easton, Pensylwania (1985); z których każde niniejszym włączono poprzez odnośnik literaturowy.

Peptydy i mimetyki peptydów według tego wynalazku są skuteczne w leczeniu stanów zależnych od TPO, gdy podaje się je w zakresie dawki od około Q,QQ1 mg do około 1Q mg/kg wagi ciała na dzień. Konkretna stosowana dawka zależy od konkretnego leczonego stanu, drogi podawania, jak również od opinii lekarza prowadzącego w zależności od takich czynników, jak stopień zaawansowania stanu chorobowego, wiek i stan ogólny pacjenta i podobne.

Chociaż powyżej opisano tylko preferowane rozwiązania wynalazku, należy sobie zdawać sprawę, że możliwe są modyfikacje i warianty wynalazku bez odchodzenia od ducha i zamierzonego zakresu wynalazku.

Przykład 1

Synteza peptydów na fazie stałej

Stosując technikę syntezy na fazie stałej Memfielda (patrz Steward i Young, Solid Phase Peptide Synthesis, wydanie 2, Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) oraz Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963) zsyntetyzowano różne peptydy według wynalazku wykorzystując zautomatyzowany aparat Milligen/Biosearch 96QQ lub syntezator peptydów Applied Biosystems Inc. Model 431 A. Peptydy syntetyzowano stosując standardowe protokoły Applied Biosystems Inc. System Software, wersja 1.Q1. Każde sprzęganie prowadzono w ciągu jednej do dwóch godzin z BOP (heksafluorofosforan benzotriazolilo-N-oksytrisdimetyloaminofosfoniowy) i HOBt (1-hydroksybenzotriazol).

Zastosowaną żywicą była żywica HMP lub PAL (Milligen/Biosearch), która jest usieciowaną żywicą, polistyrenową z kwasem 5-(4'-Fmoc-aminometylo-3,5'-dimetoksyfenoksy)-walerianowym jako łącznikiem. Wynikiem stosowania żywicy PAL jest uzyskanie karboksykońcowej amidowej grupy funkcyjnej po odszczepieniu peptydu od żywicy. Po odszczepieniu żywica HMP tworzy resztę kwasu karboksylowego w końcu C produktu końcowego. Większość odczynników, żywic i zablokowanych aminokwasów (wolnych lub na żywicy) zakupiono od Millipore lub Applied Biosystems Inc.

Do blokowania grup aminowych podczas procedury sprzęgania stosowano Fmoc. Blokowanie pierwszorzędowej grupy aminowej aminokwasów uzyskiwano stosując Fmoc, a grupami blokującymi łańcuchy boczne były grupa t-butylowa dla seryny, tyrozyny, asparaginy, kwasu glutaminowego i treoniny; grupa tritylowa dla glutaminy, Pmc (sulfonian 2,2,5,7,8-pentametylochroma) dla argininy; N-t-butyloksykarbonylowa dla tryptofanu; N-tritylowa dla histydyny i glutaminy oraz S-tritylowa dla cysteiny.

Usuwanie peptydów z żywicy i jednoczesne odblokowywanie grup funkcyjnych łańcuchów bocznych uzyskiwano przez traktowanie odczynnikiem K lub jego niewielkimi modyfikacjami. Alternatywnie, w syntezie tych peptydów o zamidowanym końcu karboksylowym, w pełni zsyntetyzowany peptyd odszczepiano mieszaninę 9Q% kwasu trifluorooctowego, 5% etanoditiolu i 5% wody, najpierw w temperaturze 4°C, a następnie podwyższając temperaturę do temperatury pokojowej. Odblokowane peptydy wytrącano eterem dietylowym. We wszyst38

188 795 kich przypadkach prowadzono oczyszczanie przez preparatywną wysokosprawną chromatografię cieczową, z odwróconymi fazami na kolumnie z żelem krzemionkowym związanym z Ci8 z gradientem acetonki-yl/woda w 0,1% kwasie trifluorooctowym. Homogenne peptydy charakteryzowano przez spektrometrię masową z bombardowaniem szybkimi atomami lub ąląktrorokpyłową i spektrometrię masową oraz analizę składu aminokwasowego, jeśli mogła mieć ona zastosowanie.

Przykład 2

Oznaczenia biologiczne

Aktywność biologiczną peptydów można mierzyć stosując oznaczenie proliferacji komórek zależnych od trombopoetyny. Mysie komórki Ba/F3 zależne od IL-3 stransfekowano ludzkim TPO-R o pełnej długości. W nieobecności IL-3 (podłoża kondycjonowane WEHI-3), proliferacja tych komórek zależna jest od TPO. Macierzysta, niestransfekowana linia komórkowa nie odpowiada na ludzki TPO, ale pozostaje zależna od IL-3.

Oznaczenia biologiczne prowadzono stosując obie powyższe linie komórkowe wykorzystujęc syntetyczne peptydy pochodzące z przeszukiwania biblioteki. Komórki hodowano w pełnych podłożach RPMI-10, zawierajęcych 10% kondycjonowaną podłoże WEHI-3, i dodawano do studzienek zawierających rozcieńczenia peptydu lub TPO w ilości 2 x 104 komóreą/studkiąnąę. Komórki inkubowano w ciągu 48 godzin w temperaturze 37°C w nawilżanej atmosferze 5% CO2 i aktywność metaboliczną oznaczano przez redukcję MTT do formazanu, z pomiarem absorbancji przy długości fali 570 nM mierzonej z zastosowaniem czytnika płytek ELISA. Testowane peptydy stymulowały proliferację komórek Ba/F3 stransfekowanych TPO-R w sposób zależny od dawki, jak przedstawiono na figurce 1. Peptydy te nie wywierają żadnego wpływu na macierzystą linię komórkową.

Przykład 3

Powinowactwo wiązania

Powinowactwa wiązania chemicznie zsyntetyzowanych peptydów z TPO-R mierzono w oznaczeniu współzawodniczego wiązania. Studzienki płytki do mikromiareczkowania opUszczano 1 mg streptawidyny, blokowano PBS/1% BSA, a następnie 50 ng biotynylowanego immobilizujęcege przeciwciała skierowanego przeciw receptorowi (Abl79). Następnie studzienki traktowano zebranym rozpuszczalnym TPO-R rozcieńczonym 1:10. Różne stężenia peptydu lub mimetyka peptydu mieszano ze stałą, ilością skróconej formy TPO, składającej się z reszt 1-156 połączonych z końcem C białka wiążącego maltozę (MBP-TPO156). Mieszaniny z peptydem MBP-TPO156 dodawano do studzienek opłaszczonych TPO-R, inkubewane w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C, a następnie przemywano PBS. Ilość MBP-TPO156, która ulegała związaniu w stanie równowagi mierzono przez dodawanie antysurowicy króliczej skierowanej przeciw MBP, a następnie kozią surowicę skierowaną przeciw IgG królika skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą. Ilość alkalicznej fosfatazy w każdej studzience określano następnie stosując standardowe metody.

Oznaczenie przeprowadzono w zakresie różnych stężeń peptydu i wyniki przedstawiono graficznie w taki sposób, że oś y przedstawia ilość związanego MBP-TPO156, a oś x przedstawia stężenie peptydu lub mimetyka peptydu. Następnie można określić stężenie, w którym peptyd lub mimetyk peptydu będzie obniżał o 50% (IC50) ilość MBP-TPO156 wiązanego z TPO-R. Przy stosowaniu opisanych powyżej warunków oznaczenia stała dysocjacji (Kd) dla peptydu powinna być podobna do mierzonego IC50.

Przykład 4 „Peptydy na plazmidach”

Wektor pJS142 stosuje się do konstruowania biblioteąi i pr^eds^i^c^wiono go na figurze 4. Do skonstruowania biblioteki konieczne są trzy sekwencje oligonukląotydowe: ON-829 (5' ACC ACC TCC GG); ON-830 (5' TTA CTT AGT TA) oraz specyficzny dla biblioteki oligonukleotyd będący przedmiotem zainteresowania (5' GA GGT GgT {NNK}n TAA CTA AGT AAA GC, gdzie (NNK)_n oznacza losowy region o pożądanej długości i sekwencji. Oligenukleotydy mogę zostać ufesforylowane w końcu 5' chemicznie podczas syntezy lub po oczyszczeniu z zastosowaniem kinazy polinukleotydowej. Łączy się je następnie w stosunku molowym 1:1:1 i liguje z wektorem.

188 795

Szczep E. coli, który korzystnie stosuje się do wzbogacania, posiada genotyp:A/sril-recA) endA1 nup(/ lon-11 sulAlAsAR// Δ(ompy-ff7?CC2ó6 AclpA319:.kan ólacl lac ZU.//8 można przygotować ze szczepu E. coli z E. coli Genetic Stock Center at Yale University (E coli b/r, oznaczenie Stock Center CGSC: 6573) o genotypie lon-11 suAl. Powyższy szczep E. coli przygotowuje się do stosowania w elektroporacji jak opisali Dower i in. Nucleic Acids Res. 16: 6127 (1988), z tym wyjątkiem, że na wszystkich etapach przemywania stosuje się 10% glicerol. Komórki testuje się pod kątem wydajności stosując 1 pg plazmidu Bluescript (Stratagene). Komórki te stosuje się do namnażania oryginalnej biblioteki i do amplifikacji wzbogaconej populacji po każdej turze wzbogacania.

Peptydy na plazmidach uwalnia się do wzbogacania z komórek przez łagodne trawienie enzymatyczne ścian komórkowych z zastosowaniem lizozymu. Po osadzeniu resztek komórkowych, nieoczyszczony lizat można bezpośrednio stosować w przypadku większości receptorów. Jeśli potrzebne jest pewne dodatkowe oczyszczenie kompleksów plazmidowych, można zastosować kolumnę do sączenia molekularnego dla usunięcia wielu obecnych w nieoczyszczonym lizacie zanieczyszczeń o niskich masach cząsteczkowych.

Wzbogacanie prowadzi się w buforze (HEKL) o niższym stężeniu soli, niż w większości buforów fizjologicznych. Wzbogacanie można prowadzić w studzienkach do mikromiareczkowania z receptorem immobilizowanym na nie blokującym przeciwciale monoklonalnym (Mab) lub przez wzbogacanie na perełkach lub na kolumnach. Bardziej szczegółowo, w pierwszej turze wzbogacania można zastosować 24 studzienki, z których każde opłaszczono receptorem. W drugiej turze zazwyczaj stosuje się sześć studzienek opłaszczonych receptorem (próbka PAN) i sześć studzienek bez receptora (próbka NC). Porównanie liczby plazmidów w tych dwóch próbkach może dostarczyć wskazówki, czy klony specyficzne pod względem receptora ulegają wzbogaceniu przy zastosowaniu procedury. „Wzbogacenie” definiuje się jako stosunek transformantów PAN do tych uzyskanych z próbki NC. 10-krotne wzbogacenie jest zazwyczaj wskazówką, że obecne są klony specyficzne pod względem receptora.

W późniejszych turach wzbogacania użyteczne jest zmniejszenie wyjściowej ilości lizatu w studzienkach dla obniżenia niespecyficznego wiązania tła kompleksów plazmidowych. W turze 2 zazwyczaj stosuje się 100 pl lizatu na studzienkę. W turze 3 stosuje się 100 pl lizatu rozcieńczonego 1/10 w HEKL/BSA. W dalszych turach wzbogacania zazwyczaj stosuje się wyjściowe ilość plazmidowych jednostek transformujących co najmniej 1000-krotnie wyższe od ocenionej pozostającej różnorodności.

Właściwości wiązania peptydów kodowanych przez pojedyncze klony zazwyczaj sprawdza się po 3, 4 lub 5 turach wzbogacania, w zależności od obserwowanych wartości. Zazwyczaj wykorzystuje się test ELISA, w którym wykrywa się specyficzne wobec receptora wiązanie białek fuzyjnych Lacl-peptyd. Normalnie LacI jest tetramerem, a najmniejsza funkcjonalna postać wiążąca DNA jest dimerem. Peptydy prezentowane są zatem na białku fuzyjnym w sposób multiwalencyjny. Zakładając, że w studzienkach można immobilizować receptor z wystarczający gęstością, peptydy połączone z LacI będą wiązać się z powierzchnią w kooperatywny, multiwalencyjny sposób. To kooperatywne wiązanie umożliwia wykrywanie przypadków wiązania z niskim samoistnym powinowactwem. Czułość tego oznaczenia jest zaletę pod tym względem, że łatwo można identyfikować wstępne przypadki wiązania z niskim powinowactwem, ale jest wadę pod tym względem, że sygnał w teście ELISA nie jest skorelowany z samoistnym powinowactwem peptydów. Fuzja peptydów z białkiem wiążącym maltozę (MBP), jak opisano poniżej, umożliwia testowanie w procedurze ELISA, gdzie siła sygnału jest lepiej skorelowana z powinowactwem. Patrz figura 5A-B.

DNA z klonów będących przedmiotem zainteresowania można przgotować w dwuniciowej formie stosując każda standarową procedurę minipreparatyki. Sekwencje kodujące interesujących pojedynczych klonów lub populacji klonów można przenosić do wektorów, które łączą te sekwencje w jednej ramce odczytu z genem kodującym MBP, białko które generalnie w roztworze występuje w postaci monomeru. Sklonowanie biblioteki w pJS142 tworzy miejsce restrykcyjne BspEI w pobliżu początku losowego regionu kodującego biblioteki. Trawienie enzymami restrykcyjnymi BspEI i Scal umożliwia oczyszczenie fragmentu DNA o długości około 900 bp, który można sklonować w jednym z dwóch wektorów, pELM3 (cytoplazmatyczny) lub pELM15 (periplazmatyczny), które są prostymi modyfikacjami odpo40

188 795 wiednio wektorów pMALc2 i pMALp2, dostępnych komercyjnie w New England BioLabs. Patrz figura 5A-B. Trawienie pELM3 i pELM15 enzymami restrykcyjnymi Agel i Scal umożliwia wydajne klonowanie fragmentu Bspl-Scal z biblioteki pJS142. Końce BspEI i Agel są kompatybilne dla ligacji. Ponadto, poprawna ligacja miejsc Scal ma zasadnicze znaczenie dla odtworzenia działającego genu bla (oporności na Amp), co pozwala na obniżenie poziomu klonów tła powstających w wyniku niepożądanych ligacji. Kierowana przez promotor tac ekspresję fuzji MBP-peptyd można następnie indukować IPTG.

Lizaty do testów ELISA wobec LacI lub MBP przygotowuje się z pojedynczych klonów stosując lizozym i usuwajęc nie rozpuszczalne pozostałości komórek przez wirowanie. Następnie lizaty dodaje się do studzienek zawierających immobilizowany receptor i do studzienek kontrolnych bez receptora. Wiązanie fuzji LacI lub MBP i peptydu wykrywa się przez inlkubację z króliczą antysurowicą poliklonalną skierowane przeciw LacI lub MBP, a następnie inkubację z wyznakowanymi alkaliczną fosfatazą kozimi drugimi przeciwciałami skierowanymi przeciw immunoglobulinom królika. Związaną alkaliczną fosfatazę wykrywa się stosując chromogenny substrat fosforan p-nitrofenylu.

Przykład 5

Układ „dimeru domen hełmowych”

Wariant techniki Lacl-peptydy-na plazmidach wykorzystuje białko wiążące DNA nazwane „dimerem domen hełmowych”. Wiązanie DNA przez represor lac E. coli zachodzi poprzez domenę „hełmowa” o długości około 60 aminokwasów. Dimer domen „hełmowych”, który wiaże operator lac, normalnie jest tworzony przez oddziaływania znacznie większej C-końcowej domeny o długości około 300 aminokwasów. Układ „dimeru domen hełmowych” wykorzystuje cząsteczki dimerów domen „hełmowych” zawierajęce dwie domeny „hełmowe” połączone krótkim łącznikiem peptydowym. Te białka wiąz. DNA wystarczająco stabilnie, aby umożliwiać wiązanie epitopu peptydowego prezentowanego na końcu C dimeru domen hełmowych” z plazmidem kodującym ten peptyd.

Losowe peptydy łączy się z końcem C dimeru domen „hełmowych”, który wiąże się z kodującym je plazmidem, tworząc kompleks peptyd-dimer domen „hełmowych”-plazmid; kompleks ten można przeszukiwać przez wzbogacanie. Układ dimer „domen hełmowychpeptydy na plazmidach” umożliwia większą selektywność pod względem ligandów o Wysokim powinowactwie, niż układ LacI. A zatem, układ dimerów domen „hełmowych” użyteczny jest do przygotowywania mutagennych bibliotek opartych na początkowo zachodzących wiązaniach z niskim powinowactwem i selekcji wariantów o wyższym powinowactwie tych początkowych sekwencji.

Biblioteki konstruuje się jak dla peptydów na plazmidach stosując wektor pCMG14 kodujący dimer domen „hełmowych” (patrz figura 6A-c). Obecność operatora lac nie jest wymagana do wiązania plazmidu z białkiem dimeru domen „hełmowych”. Biblioteki wprowadzono do szczepu bakteryjnego E. coli (lon-11 sw/A h.soR/7 (ompT-fCjpC) AclpA319:.kan ΔΙαοΙ lac ZU118 Δ(srl-recA) 306::Tn10 i zamplifikowano w warunkach podstawowej (A) indukcji promotora. Wzbogacanie dimerów domen „hełmowych” prowadzi się zgodnie z procedurami podobnymi do tych stosowanych dla bibliotek Lac, z wyjątkiem stosowania buforu HEK zamiast buforu HEKL i elucji plazmidów ze studzienek prowadzonej wodnym roztworem fenolu zamiast IPTG. Sekwencje uzyskane w wyniku wzbogacania bibliotek dimerów domen „hełmowych” często charakteryzuje się po przeniesieniu do wektora MBP, tak że można je testować w czułym na powinowactwo teście ELISA MBP, oraz że populacje klonów można również przez analizę kolonii z zastosowaniem znakowanego receptora.

Przykład 6

W przykładzie tym cykliczne związki poddano trzem oznaczeniom. Po pierwsze, w opisany powyżej sposób otrzymano wartości IC50. Ponadto, w celu obliczenia wartości EC50, przeprowadzono oznaczenie proliferacji komórek MTT. Ostatecznie, przeprowadzono oznaczenie z zastosowaniem mikrofizjometru (Molecular Devices Corp.). Zasadniczo, w oznaczeniu tym określano szybkość zakwaszania podłoża zewnątrzkomórkowego w odpowiedzi na stymulację receptora TPO związkami według wynalazku. Zakresy EC50 wskazano symbolicznie jak dla opisanych powyżej IC50. Wyniki podsumowano w tabeli 4.

188 795

Tabela 4

Struktura ^EC50 (^nH) EC (ⁿM ftolife- Mikroracja fizjoaetr

IC₅₀ (nM) [H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Cys) - [ NH₂ ]

S-S ++ ++ ++ [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NHj ] ++ ++ ++

CH₂ [H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Cys) - [ NH₂ ] ++ ++

NO [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys) - [ NH₂ ] + ++CH₃ [H]-(D-Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂ ] + +NO [H]-(Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂ ]

Cys +- + ++

188 795

Struktura

EC50 (nM) EC0 (nH)

Prlife- Mikro- IC55 racja fizjoTOtr [ H ] - (D-Pen)ADGPTLREWISF(D-Cys) - [ NH₂ ]

S-S + + ++ [ H] -(HoBocys)ADGPTLREWISF(Hoeocys)- [ NH_a ] + + ++ [ O=C-NH] -ADGPTLREWISF(Hoiocys)- [ NH₂ ] + ++ ch₂ [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Pen)-[NH₂ ]

I + ch₂-s +- +[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂ ] | | ++ +- ++

Ph-CH-S [H]-KADGPTLREWISFE-[NH₂ ]

II +- +- NO

NH-C=O

188 795

Struktura [H]-EADGPTLREWISFK-[NH₂ ]

I ‘

O=C-NHEC_5o (n«) EC5 (nH)

Prooife- Mikro- IC5 (nH) racja fizjonetr + NO [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH_a ] ++ + NO [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂ ] ++ +- NO [HN]-ADGPTLREWISFE-[NH₂ ] ' I

-c=o +- +- +[H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Pen) - [ NH₂ ]

NO +- +Przykład 7

W przykładzie tym produkty podstawień aminokwasów w pozycjach D, E, I, S lub F cyklicznego związku

CADGPTLREWISFC oznaczano pod kątem wartości EC50 i IC50 w sposób opisany powyżej. Wyniki badań z zastosowaniem mikrofizjometru podano w nawiasach. Wyniki podsumowano w tabeli 5 poniżej.

Tabela 5

CADGPTLREWISFC

Podstawienie	EC50 (nM) proliferacja komórek	IC50 (nM)
1	2	3
E - Q	++(+)	++
D-A	+ (+)	-H-

188 795 cd tabeli 5

1	2	3
I-A	+-(+)	+
S-A	++(++)	++
S - D-Ala	+	+
S - Sar	+-	++
S-Aib	++ (++)	++
S - D-Ser	++	++
S-Nva	++(++)	++
S - Abu	++	++
S - (N-Me-Ala)	+	+
S - (N-Me-Val)	+	+-
S - (N-Me-Ala)*	+	+-
S - (Nor-Leu)	++	++
S - (t-Bu-Gly)	+	++
S - [N-MeSerOBzl)]		+
S - (Homoser)	NO	NO
S - (N+Mj+Lju)	+	NO
F-A	+-(+)	++
F - D-Ala	+	++
F - D-Phe	+	++
F - Homo-Phe	++(++)	++
F-CHA	++(++)	++
F-Thi	++	++
F - (SwCBd))	++	++
F - (N-Me-Ala)	+-	+-
F - (fenylogly)	++(++)	++
F - (pirydyloala)	++	++
F - (p-nitrephą)	++(++)	++
F - (3,4-di-Cl-Phe)	++(+)	++
F - (p-Cl-Phe)	++	++
F - (2-Nal)	++(++)	++
F - (1-Nal)	++	++
F - (DiPh-Ala)	++	++
F - (N-Me-Phe)	++	NO
S,F - Ava(tioetąr)	+-	-H-
S,F - Ava(cys-cys)	+	++

188 795 cd. tabeli 5

1	2	3
S,F - Ava	+-	++
AD - delecja	+-(+)	NO
ADG - delecja	(+)	+

Ava = H₂NxA^A.COOH

Przykład 8

W przykładzie tym oceniano podstawienia aminokwasowe w związku [O = C ~ NH] -ADGPTLREWISF (CYS)

I I

CH₂-s w pozycjach D, S lub F, jak wskazano w tabeli 6 poniżej. Wartości ECsq i ICsq obliczano jak opisano powyżej. Wyniki badań z zastosowaniem mikrofizjometru podano w nawiasach.

Tabela 6 [O = C - NH] -ADGPTLREWISF (CYS)

CH₂-S

Podstawienie	EC50 (nM) proliferacja komórek	IC50 (nM)
D-E	(+)	NO
Postać wolnego kwasu	++(+)	NO
Addycja Gly w końcu C	++	++
S - Abu	++(++)	NO
F - DiPh-Ala	(++)	++
S,F - Abu, DiPh-Ala	+-(+)	++

188 795

Tabela 7

ECgo (nM) ECjg (nM)

Mikro- Prolife- IC₅0 fizjoaetr racja

O

II [Br+C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH_a ]

O ++ ++ ++

II [Br+C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH_Z] [H]-IEGPTLRQWLAARA | ++ ++ ++ [H]-IEGPTLRQWLAARA(B-AlaK-[NH_aj [H]-CIEGPTLRQWLAARA-[NH_a ] | ++ ++ ++ [ H ] -CIEGPTLRQWLAARA-[NH₂ ] [ H ] -CADGPTLREWISF-[NH₂ ] | ++ ++ ++ [H ] -CADGPTLREWISF-[NH₂ ] [ H ] -SVQCADGPTLRQWLAARNHLS-[NH_a ] | ++ ++ ++ [H ] -SVQCADGPTLRQWLAARNHLS-[NH_a ] [H]-MVGPTLRSGC-[NH₂ ] | NO +- +[ H ] -MYGPTLRSGC-[NH_a 3

188 795

	EC50 (nM) Mikro- fizjoietr	EC₅₀ (nK) Prolife- racja	ICf (nK)
CADGPTLREWISFC L 1	++	++	++
[Ac]-ADGPTLREWISFC 1 [AC]“ADGPTLREWISFC	++		++
ADGPTLREWISFC 1 ADGPTLREWISFC	++		++
[Ac]-DGPTLREWISFC 1 [Ac]-DGPTLREWISFC	++	++	++
[Ac]-GPTLREWISFC 1 [Ac]-GPTLREWISFC	NO	++	++
GPTLREWISFC 1 GPTLREWISFC	++	++	+
[Ac]-PTLREWISFC 1 [Ac]-PTLREWISFC	NO	++	++
PTLREWISFC 1 PTLREWISFC	++	++	+-
[Ac]-TLREWISFC 1 [Ac]-TLREWISFC	++	+-
TLREWISFC 1	++	+-	+-

TLREWISFC

188 795

Tabela 8

[ Η ] -CLLSEFLAGQQC·- [ NH₂ ]

I_I [H]-CTFQVWKLARNC”[NH_a) l_i [H]-CTLGQWLQMGMC-[NH₂ ]

I_1 [H]-CLTGPFVTQWLYEC-[NH_a ] I_I [H]”CTLREFLDPTTAVC-[NH₂ ] I_I [H]-CGTEGPTLSTWLDC-[NH₂ ] I_I [H]-CELVGPSLMSWLTC-[NH_a ] I_I [H 3-CSLKEFLHSGLMQC-[NH₂ ] [H]-CTLAEFLASGVEQC-[NH₂ ] I_| [H]-CTLKEWLVSHEVWC-[NH₂ ]

I_I [H]-CIEGPTLRQWLAARAC-[NH₂ ] I_I [H]“REGPTLRQWM-[NH₂ ] [H]-REGPTLRQWLMSRS-[NH₂ ]

188 795

Przykład 9

W przykładzie tym wartości EC50 i IC50 obliczano, jak opisano powyżej, dla dimerycznych związków wymienionych w tabeli 7 poniżej. Cykliczny monomer

CADGPTLREWISFC wł.czono dla porównania.

Związki z tabeli 8 były nieaktywne w maksymalnym testowanym stężeniu 10 pm.

W tabeli 9 porównano określone w opisany powyżej sposób wartości EC50 i IC50 dla cyklicznych lub dimeryzowanych wariantów IE G P T L R Q W L A A R A.

W tabeli 10 porównano skrócone formy dimeru (H)- IEGPTLRQWLAARA

I (H) -IEGPTLRQWLAARA (Bala) K - (NH₂)

Wartości EC50 i IC50 obliczano jak opisano powyżej. Wyniki badań z zastosowaniem mikrofizjometru podano w nawiasach.

Tabela 9

	EC₅₀ (nH) Hikro- fizjosetr	EC₅₀ (nH) Prolife- IC50 (nH) racja
[H 3-1EGPTLRQWLAARA-[NH₂ ]	NO	++ ++

[H]-CIEGPTLRQWLAARAC“[NH, ] 1_I

ł , 1 „ , ,1	NO	++	++
[H] -IEGPTLRQWLAARA- [NH₂ ]
\	++	++	++
[H 3-IEGPTLRQWLAARA(β-Ala)K-[NH₂ ]
[H 3-CIEGPTLRQWLAARA-[NH₂ 3	++	++	++

[H]-CIEGPTLRQWLAARA-[NH₂ j

188 795

Tabela 10 (H)~IEGPTLRQWLAARA (H)-IEGPTLRQWLAARA(B-Ala)K-(NH₂ )

Sekwencja	EC50 (nM) proliferacja komórek	IC50 (nM)
(Ac)-IEGPTLRQWLAARA 1 ( Ac)-IEGPTLRQWLAARA-BA-K(NH₂)	++	NO
(H)-IEGPTLRQWLAAR 1 (H)-IEGPTLRQWLAAR-BA-K(NH₂)	++	NO
(H)-IEGPTLRQWLAA 1 (H)-IEGPTLRQWLAA-BA-K(NH₂)	++ (++)	NO
(Ac)-EGPTLRQWLAARA 1 (Ac)-EGPTLRQWLAARA-BA-K(NH₂ )	NO	NO
(H)-EGPTLRQWLAARA 1 (H)-EGPTLRQWLAARA-BA-K-(NH₂)	++	NO
(H)-EGPTLRQWLAAR 1 (H)-EGPTLRQWLAAR-BA-K(NH₂)	++ (++)	NO
(Ac)-EGPTLRQWLAA 1 (Ac)-EGPTLRQWLAA-BA-K(NH₂)	++	NO
(H)-EGPTLRQWLAA 1 (H)-EGPTLRQWLAA-BA-K(NH₂)	++	NO

188 795

Przykład 1Q

W przykładzie tym wprowadzano różne podstawienia w pozycjach G, P i W w cyklicznym związku [H] - CADGPTLREWISFC - [NH₂]

I___1

Tabela 11 wymienia przykłady podstawionych związków, które wykazują aktywność agonów TPO. Podstawienia podane w skrótach w tabeli są następujące:

Tabela 11

[H]- CADGPTLREWISFC - [NH2]
G	P	W
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gaba	Pro	^Trp
Cpr-Gly	Pro	^Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Nal
Sar	Pro	^Trp
Cpr-Gly	L-Tic	Nal
Gly	D-Tic	D-Trp
Cpr-Gly	D-Tic	Trp
Gaba	Hyp(OBn)	Trp

188 795

Reszty zastępujące prolinę

ζχ

COOH

H

D-Pro

COOH

L-Pro

L-4-Hyp(0Bn)

COOH

''COOH

HNKwas L-pipekoSnowy Kwas D-pipeko!inowy

COOH

Kwas L-azetydymkarboksylowy

L-Tiq

188 795

Reszty zastępujące tryptofan

COOH

-COOH

ŃH₂

L-(Benzjoienylo)-alarina

D-2-Nal

COOH

>COOH

NH

L-Tic

188 795

Reszty zastępujące glicynę

COOH

Glicyna

COOH

H

Sarkozyna

HjN

COOH

0-alarana

Kwas 7-aminomastowy

COOH

N-penfyfoglicyna

N-cyklopropyłoglicyna

Przykład 11

W celu oszacowania możliwości wykorzystania myszy jako dogodnego gatunku do testowania, wykonano kilka doświadczeń in vitro mających na celu pomiar aktywności testowanych związków na receptor mysi. Najpierw komórki szpiku kostnego, pobrane z kości udowej 8- do 9-tygodniowych myszy Balb/C, inkubowano w ciągu 7 dni w płynnej hodowli z albo rhuTPO, albo różnymi stężeniami testowanych peptydów. Po zakończeniu okresu inkubacji hodowle zatężono stosując Cytospin, wybarwiono acetylocholinesterazę (AChe, marker mysich megakariocytów) i zliczano przez analizę mikroskopowy. Jedno (1) nM rhuTPO powodował wyrośnięcie bardzo dużych (>40 pm), nie przylegających komórek, w których ulegała wybarwimiu AChe. Komórki te okazały się dojrzałymi megakariocytami. O początkowo wysianej całkowitej ilości 106 komórek szpiku kostnego/ml (w hodowlach o objętości 50 ml) rozwijało się, jak oszacowano, 1 do 2 x 106 _meg_aą_aΓiocytów. Tę odpowiedź na TPO oznaczono jako „maksymalną”. Hodowle kontrolne, nie zawierające żadnych czynników wzrostowych, wytwarzały bardzo niewiele komórek dodatnich pod względem AChe. W oznaczeniu tym testowano kilka ze związków peptydowych w wysokim stężeniu i wyniki podsumowano w tabeli 12. Peptyd A w stężeniu 10 μΜ wywoływał maksymalną odpowiedź szpiku kostnego myszy. Stwiąrdkąnią to było pierwszym dowodem, że ta rodzina peptydów jest aktywna wobec receptora myszy. W drugim doświadczeniu komórki szpiku kostnego pobierano i hodowano w podłożu półstałym (metyloceluloza), albo nie zawierającym żadnych czynników, albo zawierającym 1 nM rhuTPO albo 10 pm Peptyd A. Po 7 dniach hodowli liczono kolonie dużych komórek (zakładając, że są to megakariocyty) i grupowano je w małe kolonie (3-5 ko188 795 mórek) lub duże kolonie (więcej niż 6 komórek). Wyniki przedstawiono w tabeli 13. Zarówno TPO, jak i testowane peptydy powodowały powstawanie zasadniczo większej liczby kolonii o obu wielkościach, niż zawierały hodowle ujemnych kontroli. Wskazuje to, że peptydy naśladują TPO pod względem zdolności do stymulowania namnażania populacji komórek prekursorowych megakariocytów.

W celu uzyskania bardziej ilościowego porównania aktywności testowanych związków na receptory mysie i ludzkie, receptor muTPO sklonowano i stransfekowano nim komórki BaF3. Wyizolowano populację komórek zależnych od TPO.

Tabela 12

Peptyd	Testowane stężenie (nM)	Odpowiedź
D	100 000	brak
C	40 000	maksymalna**
C + S.A.*	1000	maksymalna**
tylko S.A.	1000	brak
B	100 000	minimalna
A	10 000	maksymalna**
TPO (R & D)	1	„maksymalna”:

* Streptawidyna skompleksowana 2 biotynylowanym peptydem - stężenie przypuszczalnego kompleksu w stosunku 1:4 ** W porównaniu ze zrekombinowanę ludzką TPO ** 25-30% komórek z wybarwianę aCe po zatężeniu z zastosowaniem Cytospin Hodowle bez żadnych czynników - około 5% komórek z wybarwianę AChE (niższa liczba komórek)

Tabela 13

Związek	3-5 dużych komórek	6-12 dużych komórek
Brak czynników 1	2	1
Brak czynników 2	1	1
1nM TPO #1-1	15	6
1 nM TPO #1-2	12	1
1nM TPO #2-1	16	8
1 nM TPO #2-2	13	3
10 μΜ peptyd #1-1	25	10
10 μΜ peptyd #1-2	22	8
1# \|\|M ι·>2«Ή—t ΊΟ-. 1 1 \Z Ili. Ł	22	7
10 μΜ peptyd #2-2	21	10

Ujawnienia w tym zgłoszeniu wszystkich artykułów i od nośników literaturowych, włącznie z dokumentami patentowymi, w całości włączono dla wszelkich celów do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

188 795

ols αο

Logarytm stężenia peptydu

FIG. 2B

188 795

O.D. 570

188 795

O.D. 570 O.D. 570

FIG. 3B

188 795

FIG. 3C

O.D. 570

FIG. 3D

188 795

O.D. 570

Logarytm stężenia TPO

FIG.

O O O IA

Λ ♦ · ·

Logarytm stężenia EPO

FIG, 3F

188 795

O.D. 570

FIG. 3G

188 795

2479 Sal I 2479 Hinc II 2495 Hind HI

2392 XhoI 2435 Siu I 2454 Eag I

FIG· 4A

188 795 υ σι (0 U σ* σ υ σι

4J (0 σι υ

Η <

	σ	4
Η		U	0
		α	ο
U	ο	ο	ο
ω		ο	ο
X		Α	<
		u	□

υ << Η e* < 0 0

Wektor biblioteki pJS142, miejsca klonowania w końcu 3' genu lacl

O (tf rM υ

(0 w >4

	•Η		ο	u
	ΜΜ	0		u
	tn		rt	u
			£**
		(ϋ	ο	o
Η			υ
			ο	S
σι		u	ο	o
(0			ο	o
ca			ο	P
	Μ	ζ
			2
	4
	(X	>	ε-	2
	X		ρ	u
			ο	o
			u	o

ο ο ο υ ο ο υ ο ο υ ο £Ω

Λ

		01	0	o
W			H
	W		0	a
•H		<	0	0
MM	3		0	0
Ol	4J		σ	υ
	Ol	ca	rtj	.u
			σι	υ
			4-1	4
		0	σι	υ
			σι	υ
			u	4
		0	σι	υ

σι σ σ» σ > 4-» 4 σι σ σ» υ

Ο (0 4-1 υ σι σ» σ (0 U σ» σ σι σ σι σ σι σ 4J 4 (0 4J υ σι σι σ 4J <0 σι σ σ> σ

4J <0 σι σ ca •Η

W •Η

C σ

•rl £

Μ

4J α

•Η

0)

4J

Ο •Η

1—1 •Η

Λ σ

•Η

C

			u	4
		0	Ol	U
			σι	υ
			4J	4
		0	Ol	U
			Ol	υ
			4	u χ-
w		0	Ol	υ »
W			0	u ^wσι	\
Ol			0	Ol	<Μ
U)		01	0		C0
«			tn		»
	H		0	0	2
		<	0	0	η
	3		0	0
	4J		Ol	υ
	0)	ca	4	4-1
			0i	υ
			4J	4
		0	σι	υ
			σι	υ
			u	4
		0	Οι	υ
			Ol	υ
			Ol	υ
		>	ij	4
			σι	υ
			Ol	υ
		o	4	4J
			υ	σι
			O)	u
		ca	4	4J
			Ol	υ
			Ol	ο
		0	cn	υ
			01	υ
			4-1	4
		X	4	4-1

ο		S	«υ j	1		O
	0	0	o	1
	0	0	3	1
0	0	0	μ	1		0
	0	0	4J	1
	0	0	w	1
οι	0	0	c	1		01
		£	0	H
	0	0	X	a
ca		b·		(0	H	ta
	0	0		rM
	0	0		1	0
u		<		t	A	u

□ σι σι υ U (0 σι υ σι υ U (0 σι υ υ ο ο ο o u a u ο ο ο ο < Ε O 0 δ Η « ο ο ο

Θ

Ο

U,

188 795

Miejsca klonowania wektora pELM3/pEIM15MBP

Λ

w

Eh

rf

1-1

Eh

2

M

(0

o

0

X

w

rf

Eh

Ό

CO

0

1

0

C

rf

Eh

1

•H

l

o

0

X

rf

Eh

l

w

Eh

rf

<

0

V

Eh

0

Λ

O

0

1

0

σ

rf

Eh

CJ CJ

1

o

0

K

0

< e-*

CJ

0

4->

0

Ht

CJ CJ

Ul

Eh

rf

W

tj

Eh

rf

CJ

0

cu

0

rH

u o

H <

o

0

co

O U

Z

rf

Eh

Q

rf

E-*

Eh

H

0

CJ

0

r—ł

0

Eh rf

z

rf

Eh

d

>

Eh

rf

2

Eh

co

0

rf Eh

o

0

rf

Eh

0 0

z

*5

EH

X

0

2

Eh

H

rf

Eh

H

0 0 0 0

Eh

rf

<0

Eh

rf

u

0 0

z

rf

EH

d

Λ

CO

0

CO

2

Eh

•H

X

Eh

rf

s

Eh rf

d o

c

0 0

CJ

0

(0 £

0

0 0

z

rf

Eh

ω

o

w

CO

0

c N

2

Eh

Tł

c

Eh

rf

H

rf Eh

z

Eh rf

rf Eh

O 0 Ή e

X £ <0

o

rf 0

Eh 0

X 4) •U

rf Eh rf Eh

2

Eh

X

0

Eh <

rM

0 0

CJ

0

Eh Łk

Λ

rf Eh

z

&

Eh

K

ω

Eh

•rJ

2

Eh

X

Eh

43

rf Eh Eh rf

J

CJ

0

o

rf

•Ή

Λ

0 0

1

z

rf

Eh

υ

w

2

Eh

·*

d

ł

2

Eh

ω

0

<0

X

rf Eh

1

4J

φ

♦

2 Eh

t

CJ

0

CD

o

Eh rf

1

z

rf

Eh

H

X

0

5

•H

1

2

Eh

0

g

r—ł

1

<d

•H

43

cz Σ

1

CJ

0

£

0

C

•H

X

z z

1

z

rf

EH

CO

<

0

d

43

z z

1 J

2

Eh

0

5 0

V

'— —

1

CD

0

c Λ

Λ

Eh rf

1

w

CJ

0

>

Eh

rf

1-4

t

0

0 0

1 I

Eh

rf

H

0

ł

0 O

1

M

O

0

<—(

0

3

X

Eh rf

1

w

0

£

X

rf

Eh

N

•H

0

0 0

I

υ

rf

Eh

X

0

.C

0 0

1

(0

0

N

1

CO

0

Eh

rf

X

!tf

rf Eh

1

co

U

0

o

0

in ^4

i*d

0

0 0

V

Eh

rf

1-1

0

1

0 0

Λ

Eh

rf

Φ

0

s

1 1

0 0

1

z

rf

EH

CP Eh

0

w

1

Eh

0 0

1 I

rf

Eh

V

rf

Eh

X \

V

rf Eh

1 X

Eh

rf

Λ

0

ΓΌ

Λ

0 0

Eh

0

X

0

sę

1

OS

0 0

X

rf

Eh

rf

Eh

£

1

rf Eh

Σ 1

o

0

rf

Eh

X

1 1

rf EH

1

rf

Eh

ίθ

o

0

d

0

0 0

1

0

X

0

X

0 0

QQ tn o

C9

Lk

188 795

AIwNI 3916

Cia 1 5 Nsil 5 PpulOI

Eco47 III 4682

237 BsaB I 301 Aft II

384 EcoR V

Dra III 3348 BsaA I 3348 NgoM I 3245

Nae I 3245

2335 EcoK

Eam1105l 3000 Bsa I 2933 Gsu I 2915 Ase I 2829

Fspl 2780

Pvu I 2633 Scal 2522

670 BssH II

706 Nru I 715 BspE I

914 PUM I 1074 AgeI 1077 BslE II i 1097 BsmI - 1135 Mlu 1 “ 1239 BamHI ' 1300 Nhel

FIG. 6A

1456 Ecl136 I 1456 Sac.l 1471 Smal 1471 Xmal 1534 Rsrll

1640 Stul

1641 Sfil·

1654 Hpal 1659 Eagl 1662 Dsal 1666 Sfi I ·

1674 Mscl 1684 Accl 1684 Sali

1688 BspMI

1689 Sse8337 I 1696 Sphl 1702 Hindlll

188 795

Wektor biblioteki pCMG14, miejsca klonowania w końcu 3' genu olimeru domen hełmowych

tf	0
H	u
σι υ		u
Λ3	0	u
tf	u	0
W 55		A
	3

C4-

C5 0

Ol

P<

o

U 0 0 0 0 o o

o

Lu

188 795

Średnia liczba płytek krwi (x wz/ul)

Myszy BALB/c otrzymały karboplatynę w dniu 0 (125mg/kg,ip)

1. Linie przerywane przedstawiają kontrole z 3 doświadczeń

2. Linie ciągłe przedstawiają grupy traktowane karboplatyną z 3 doświadczeń

3. Grube ciągłe linie przedstawiają dane historyczne pochodzące z T.R.Urlich i in.

FIG 7 Blood 86(3) :971-976.1995

188 795

Wpływ miareczkowania karboplatyną na liczbę płytek krwi u myszy (mg/kg)

1200 _T

Średnia liczba płytek krwi(x 10‘3/μΙ)

1000 ··

800 ·

600

400 -

200

dzień

Karboplatyna (mg/kg,ip) podana w dniu 0

FIG. 8

188 795

Poprawa inkudowanej karboplatyna małopłytkowość w dniu 10, pod wpływem AF12513:

Średnia liczba płytek krwi (x 10'3/ul)

Miareczkowanie karboplatyną

1. Karboplatyną (CBP;125-50mg/kg,ip) podano w dniu 0

2. AF 12513 (513;lmg/kg;ip) podawano w dniach 1-9 p= <0.05

188 795

O.D. S70 °·°· ⁵⁷⁰

FIG. 1A

1.8·

1.61.41.210.80.60.40.2·

1E-8

AF1228S AF12193

AF12434 macierzy macierzy 'macierzy AF12359 macierzy macierzysAF12405:ta linia komórkowa i ta linia komórkowa sta linia komórkowa ta linia komórkowa a linia komórkowa ł=B=S= rrri1E-6

1E-7

Logarytm.stężenia peptydu

1E-S

FIG. 1B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, znamienny tym, że związek ten posiada masę cząsteczkową mniejszą niż około 8000, i powinowactwo wiązania z receptorem trombopoetyny, wyrażone jako IC50, nie większe niż około 100 μΜ; i tym, że związek ten obejmuje sekwencje aminokwasów:

X, X₂ X3 X4 Χ5 X6 X7 gdzie Xi jest C, L, M, P, Q, V; Χ2 jest F, K, L, N, Q, R, S, T łub V; Χ3 jest C, F, I, L, M,

R, S, V lub W; Χ4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; Χ5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V.
2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest cykliczna.
3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest dimeryczna.
4. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

C Χ2 Χ3 Χ4 X5 X6 Χ7 gdzie Χ2 jest K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, L, M, R, S lub V; Xą jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; Χ5 jest A, D, E, G, S, V lub Y; X(, jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V.
5. Związek według zastrz. 3, znamienny tym, że Χ4 jest A, E, G, H, K, L, M, P, Q, R,

S, T lub W.
6. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że Χ2 jest S lub T; Χ3 jest L lub R; X6 jest R; Χ5 jest D, E lub G; X6 jest F, L lub W; a Χ7 jest I, K, L, R lub V.
7. Związek według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ C X2 X3 X4 X5X6 X7 gdzie Χ2 jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; Χ3 jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, Τ, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V; a X8 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie aminokwasów.
8. Związek według zastrz. 7, znamienny tym, że X8 jest G, S, Y lub R.
9. Związek według zastrz. 7, znamienny tym, że związek obejmuje sekwencję aminokwasów: GGCTLREWLHGGFCGG.
10. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ G X, X2 X3 X4 X5W X7 gdzie Χ1 jest L, M, P, Q, lub V; X₂ jest F, R, S lub T; Xjjest F, L, V lub W; Χ4 jest A, K, L, M, R, S, V lub T; Χ5 jest A, E, G, K, M, Q, R, S lub T; Χ7 jest C, I, K, L, M, lub V; a X8 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów.
11. Związek według zastrz. 10, znamienny tym, że Χ1 jest P; X2 jest T; Χ3 jest L; X4 jest R; X5 jest E lub Q; Χ7 jest I lub L.
12. Związek według zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

X9 X8 G Χ1 Χ2 Χ3 X4 X5 w Χ7 gdzie X8 jest A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T lub V; a Χ9 jest A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T lub V.
13. Związek według zastrz. 12, znamienny tym, że X₈jest D, E lub K; a Χ9 jest A lub I.
14. Związek według zastrz. 13, znamienny tym, że związek wybiera się z grupy składającej sięz:GGCADGPTLREWISFCGG;GNADGPTLRQWLEGRRPK

188 795

N;GGCADGPTLREWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SIE GPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRDT;CADGPTL R E WI S F C oraz I E G P T L R Q W LA A RA.
15. Związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, znamienny tym, że związek ten wybiera się z grupy składającej się z:

CADGPTLREWISFC [Ac]- CADGPTLREWISFC- [amid]

O = CADGPTLREWISFC-Wł₂ ; i

Ch₂-----------------------S

IEGPTLRQWLAARA

I

IEGPTLRQWLAARA (,Bala) - K [NH2]
16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, posiadający masę cząsteczkową mniejszą niż około 8000, powinowactwo wiązania z receptorem trombopoetyny, wyrażone jako IC50, nie większe niż około 100 μΜ i obejmujący następującą sekwencję aminokwasów:

Xi Χ2 Χ3 Χ4 Χ5 Xć Χ7 gdzie X, jest C, L, M, P, Q, V; X₂ jest F, K, L, N, Q, R, S,T lub V; X₃ jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; Χ4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; Xsjest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X₆ jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że wspomniana sekwencja aminokwasowa jest cykliczna.
18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że wspomniana sekwencja aminokwasową jest dimeryczna.
19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że wspomniana sekwencja obejmuje sekwencję aminokwasów:

17X2X3X4X5X6X7 gdzie Χ2 jest K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, L, M, R, S lub V; Χ4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, S, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V.
20. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 18, znamienna tym, że X jest A, E, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T lub W.
21. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 20, znamienna tym, że X₂ jest S lub T; X3 jest L lub R; Xe jest R; X5 jest D, E lub G; X<; jest F, L lub W; a X7 jest I, K, L, R lub V.
22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

XsCX₂X3X4X5 X6 Χ7 gdzie X₂ jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q,

188 795

R, S, T, V lub Y; 'X₆ jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; Χ7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V; a Xg jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie aminokwasów.
23. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 22, znamienna tym, że Xs jest G, S, Y lub R.
24. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 22, znamienna tym, że związek obejmuje sekwencję aminokwasów: GGCTLREWLHGGFCGG.
25. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ G X, X2 XaX4 XsW X7 gdzie Xi jest L, M, P, Q, lub V; X2 jest F, R, S lub T; X3jest F, L, V lub W; X.4 jest A, K, L, M, R, S, V lub T; X5 jest A, E, G, K, M, Q, R, S lub T; X7 jest C, I, K, L, M, lub V; a X₈jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów.
26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że X, jest P; X2 jest T; X3 jest L; X4 jest R; X5 jest E lub Q; X7 jest I lub L.
27. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 26, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów:

X9 X₈ G X, X2 X3 X4X5 W X7 gdzie X8jest A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T lub V; a X9 jest A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T lub V.
28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że 4, X8jest D, E lub K; a X9 jest A lub I.
29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28, znamienna tym, że związek wybiera się z grupy składającej sięzGGCADGPTLREWISFCGG;GNADGPTLR Q W L E GRRP KN; G G C AD GP TL RE WI S F C G GK; TIK G P TL R Q W L K SREHTS;SIEGPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRD T; CADGPTLREWISFC oraz IEGPTLRQLAAR A.
30. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera związek wiążący się z receptorem trombopoetyny, wybrany się z grupy składającej się z:

CADGPTLREWISFC

J_1 ^; [Acc]- CADGPTLREWISFC - [amid] ;

O = CADGPTLREWISFC-NH2 ; i

I l_c

CH2-----------------------S

IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA (pala) - K [NH2] , oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
31. Zastosowanie ;aniązku wiążącego cię; o siceptorem trombopoetyny, posiadajscym masę cząsteczkową mniejszą niż około 8000, powinowactwo wiązania z receptorem trombopoetyny, wyrażone jako IC50, nie większe niż około 100 pM; i tym, że związek ten obejmuje sekwencje aminokwasów:

188 795

XlX₂X₃X4X6X7 gdzie Xi jest C, L, M, P, Q, V; X₂ jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X₃ jest C, F, I, L, .M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X₆ jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7jest C, G,. I, K, L, M, N, R lub V do wytwarzania leku do leczenia pacjentów cierpiących z powodu chorób hematologicznych, które wrażliwe są na leczenie agonistą trombopoetyny.
32. Zastosowanie, według zastrz. 31, znamienne tym, że do wytwarzania leku stosuje się związek którego aminokwasowa sekwencja jest cykliczna.
33. Zastosowanie, według zastrz. 31, znamienne tym, że do wytwarzania leku stosuje się związek którego aminokwasową sekwencja jest dimeryczna.
34. Zastosowanie, według zastrz. 31, znamienne tym, że do wytwarzania leku stosuje się związek, który obejmuje sekwencję aminokwasów:

C X₂ X₃ X4 X5 X6 X7 gdzie X₂ jest K, L, N, Q, R, S, T lub V; X₃ jest C, F, I, L, M, R, S lub V; X4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, S, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; a X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V.
35. Zastosowanie, według zastrz. 32, znamienne tym, że że Χ4 jest A, E, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T lub W.
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że X₂ jest S lub T; X₃ jest L lub R; X(, jest R; Xs jest D, E lub G; X(, jest F, L lub W; a X₇ jest I, K, L, R lub V.
37. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że związek obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ C X₂X₃ Χ4 x₅ x₆ x₇ gdzie X₂ jest F, K, L, N, Q, R, S, T lub V; X3 jest C, F, I, L, M, R, S, V lub W; X4 jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie L-aminokwasów; X5 jest A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V lub Y; X6 jest C, F, G, L, M, S, V, W lub Y; X7 jest C, G, I, K, L, M, N, R lub V; a X₈ jest którymkolwiek z 20 kodowanych genetycznie aminokwasów.
38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że X₈jest G, S, Y lub R.
39. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że związek obejmuje sekwencję aminokwasów: GGCTLREWLHGGFCGG.
40. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że związek obejmuje sekwencję aminokwasów:

X₈ G X, X₂ X3Xt XsW X₇ gdzie X1 jest L, M, P, Q, lub V; X2 jest F, R, S lub T; X₃ jest F, L, V lub W; X4 jest A, K, L, M, R, S, V lub T; X5 jest A, E, G, K, M, Q, R, S lub T; X7 jest C, I, K, L, M, lub V; a X8 jest którymkolwiek z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów.
41. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że X1 jest P; X₂ jest T; X3 jest L; X4 jest R; X5 jest E lub Q; X7 jest I lub L.
42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że związek obejmuje sekwencję aminokwasów:

X9 X8 G X1 X2 X3X4 X5W X7 gdzie X8 jest A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T lub V; a X<> jest A, C, E, G, I, L, M, P, R, Q, S, T lub V.
43. Zastosowanie według zastrz. 42, znamienne tym, że X₈ jest D, E lub K; a X< jest A lub I.
44. Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, że związek wybiera się z grupy składającej sięz: GGCADGPTLREWISFC G G; GN ADGPTLRQ WLEGR RPKN;GGCADGPTLREWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS; SIEGPTLREWLTSRTPHS;LAIEGPTLRQWLHGNGRDT;CADGP TLREWISFC oraz IEGPTLRQWLAARA.
45. Zastosowanie związku wiążącego się z receptorem trombopoetyny, wybranym z grupy składającej się z:

188 795

CADGPTLREWISFC f

[Ac]- CADGPTLREWISFC- [amid]

Q = CADGPTLREWISFC-NH₂ ;i

CH2

IEGPTLRQWLAARA

I

IEGPTLRQWLAARA (pala) - K [NH2] do wytwarzania leku do leczenia pacjentów cierpiących z powodu chorób hematologicznych, które wrażliwe są na leczenie agonistą trombopoetyny.