CZ134099A3 - Inhibitory serinových proteáz, zejména proteázy viru hepatitidy C NS3 - Google Patents

Description

Peptidy a sloučeniny schopné vazby na receptor trombopoetinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález poskytuje peptidy a sloučeniny, které se vážou na trombopoetinový receptor a aktivují jej (c-mpl nebo TPO-R) nebo jinak působí jako agonisté TPO. Vynález má použití v oblasti biochemie a lékařské chemie a poskytuje zvláště agonisty TPO pro použití při léčení onemocnění Člověka.

Dosavadní stav techniky io Tato přihláška navazuje na US patentovou přihlášku No.

08/485,301 ze 7. června 1995 a US patentovou přihlášku No. 08/478,128 ze 7. června 1995, jejichž obsah se zde uvádí jako referenční.

Megakaryocyty jsou buňky odvozené z kostní dřené, odpovědné — · is - za produkci -cirkulujících, krevních-.destiček.„Ačkoliv ~představují^^ <0,25 % kostní dřeně u většiny druhů, mají >10 x větší objem než typická buňka kostní dřeně (viz Kuter a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 11104 - 11108 (1994). Megakaryocyty podléhají procesu známému jako endomitóza, při kterém se replikují jejich jádra, ale >

neprobíhá buněčné dělení, čímž vznikají polyploidní buňky. Jako odpověď na snížený počet krevních destiček vzrůstá četnost endomitózy, vytvářejí se výšeploidní megakaryocyty a počet megakaryocytů může až trojnásobně stoupnout (viz Harker, J, Clin. Invesí, 47: 458 - 465 (1968). Naopak když se počet krevních destiček zvýší, četnost endomitózy klesá, > vytvářejí se nížeploidní megakaryocyty a počet megakaryocytů může poklesnout o 50 %.

; _r 5 Přesný fyziologický zpětnovazebný mechanismus, kterým hmota,

». i * < Ί. ' 1 cirkulujících destiček reguluje rychlost endomitózy; a počet

-2• · “ • · ·· » « · · · • ♦ · megakaryocytů kostní dřeně není znám. Za cirkulující trombopoetický faktor, který má zprostředkující funkci v této zpětnovazební smyčce, je nyní pokládán trombopoetin (TPO). Ukázalo se zvláště, že TPO je hlavním humorálním regulátorem v situacích zahrnujících trombocyíopenii (viz např. Metcalf, Nátuře, 369: 519 - 520 (1994). Ukázalo se, žé^-v několika studiích’zvyšoval TPO^Ju pokusných*zvířat počet krevních destiček, velikost krevních destiček a inkorporaci izotopu do destiček. Konkrétně se předpokládá, že TPO ovlivňuje megakaryocytopoézu několika způsoby: (1) zvyšuje velikost a počet io megakaryocytů; (2) zvyšuje obsah DNA v megakaryocytech ve formě polyploidie; (3) zvyšuje endomitózu megakaryocytů; (4) zvyšuje maturaci (zralost) megakaryocytů; a (5) zvyšuje procento prekurzorových buněk ve formě malých buněk acetylcholinesteráza pozitivních v kostní dřeni.

is Protože krevní destičky (trombocyty) jsou nezbytné pro srážení krve a pokud je jejich počet velmi nízký, pacient je ve vážném nebezpečí smrti způsobené masívním krvácením, TPO je potenciálně použitelný jak při diagnóze, tak i léčení různých hematologických ' ^: 'I· ' **' •.ιιΧι 11 IMI< i * ť. . iinmim . —mi wm., t.. . · ,ui poruch, například onemocnění způsobených primárně defekty krevních destiček. Začínající klinické pokusy s TPO ukázaly, že TPO je možno bezpečně podávat pacientům. Navíc poskytly poslední studie základ pro účinnou terapii TPO při léčení trombocytopenie, a zvláště trombocytopenie v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transplantace kostní dřeně při léčbě nádoru nebo lymfomu. (Viz např.

McDonald (1992), Am. J. Ped, Hematology/Oncology, 14: 8 - 21 (1992).

Gen kódující TPO byl klonován a charakterizován (viz Kuter a další. Proč. Nati, Acad. Sci. USA. 91: .11104 - 11108 (1994); Barley a další, Cell, 77: 1117 - 1124 (1994); Kaushansky a další, Nátuře. 369:

568 - 571 (1994); Wendling a další, Nátuře, 369: 571 - 574 (1994); a

Sauvage a další, Nátuře. 369: 533 - 538* (1994). Trombopoetin;. je ·«·· • » · · · * · • » · · * ·« i fc »» · * · « · · · · • « · * · *

-3glykoprotein, který má alespoň dvě formy se zdánlivými molekulovými hmotnostmi 25 kDa a 31 kDa se společnou sekvencí N-koncových aminokyselin (viz Bartley a další, Cell. 77: 1117 - 1124 (1994). Trombopoetin se zdá mít dvě rozdílné oblasti oddělené potenciálním s štěpícím místem Arg-Arg. Aminokoncová oblast je u člověka a myši vysoce konzervována a~má~ určitou......hómologii 's^ěrytropoétinem*' a interferonem-a a interferonem-b. Karboxylová koncová oblast

Pb_| | vykazuje širokou mezidruhovou divergenci.

* Byly popsány sekvence DNA a jimi kódované peptidové io sekvence u lidského TPO-R (znám také jako c-mpl) (viz Vígon a další,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5640 - 5644 (1992). TPO-R je členem rodiny hematopoetinového receptoru růstového faktoru, která je charakterizována společným strukturním návrhem extracelulární domény včetně čtyř konzervovaných zbytků C v N-koncové oblasti a motivu WSXWS těsně u transmembránové oblasti (viz Bazan, Proč.

Nati. Acad. Sci, USA. 87: 6934 - 6938 (1990). Důkazem skutečnosti, že tento receptor má funkční úlohu při hematopoéze, jsou pozorování, ______________ že jeho exprese se omezuje na slezinu, kostní dřeň nebo fetálnrjátra , u myši (viz Souyri a další, Cell, 63: 1137 - 1147 (1990) a na megakaryocyty, destičky a buňky CD34* u člověka (viz Methia a další,

Biood, 82: 1395 - 1401 (1993). Navíc expozice buněk CD34⁺ syntetickým oligonukleotidům pozitivním vzhledem k mpl RNA výrazně inhibuje výskyt kolonií megakaryocytů bez ovlivnění tvorby v erytroidních nebo myeloidních kolonií. Někteří pracovníci uvádějí, že [ 25 receptor funguje jako homodymer podobně jako je tomu v situaci s receptory pro G-CSF a erytropoetin.

Dostupnost klonovaných genů pro TPO-R umožňuje hledání agonistů tohoto důležitého receptoru. Dostupnost rekombinantního receptorového proteinu umožňuje studium interakce receptor - íigand

3o v, řadě systémů pro vytváření náhodné a semináhodné rozdílnosti = · ; i í: peptidů.· Tyto systémy používají systém: „peptidy na plazmidech“ • «

4··· * (peptides on plasmides) popisovaný v US patentech No. 5,270,170 a

5,338,665, systém „peptidy na fágu“ (peptides on phage) popisovaný v US patentové přihlášce No. 07/718,577 z 20. 6. 1991, US patentové přihlášce No. 07/541,108 z 20. 6. 1990 a v Cwirla a další, Proč, Nati.

Acad. Sci. USA, 87; 6378 - 6382 (1990); systém „polysom“ popisovaný „ patentové přihlášce No?08/300,262 z 2: 9.-1994, který navazuje™ na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO

95/11992; systém „kódované syntetické knihovny“ (encoded synthetic library) popisovaný v US patentových přihláškách No. 08/146,886 io z 12. 11. 1993, 07/946,239 z 16. 9. 1992 a 07/762,522 z 18. 9. 1991; a systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ (very lárge scale immobiltzed polymer synthesis) popisovaný v US patentu

No. 5,143,854; zveřejnění PCT patentu No. 90/15070, zveřejněn

13. 12. 1990; US patentové přihlášce No. 07/624,120 z 6. 12. 1990, is Fodor a další, Science, 251: 767 - 773 (2/1991); Dower a Fodor, Ann

Rep. Med. Chem.. 26: 271 - 180 (1991); a US patentové přihlášce No.

07/805,727 z 6. 12. 1991; přičemž uvedené patentové přihlášky a publikace se zde uvádějí jako referenční.

Vážným problémem u pacientů trpících trombocytopehii je pomalý návrat hladin krevních destiček, a proto se stalo urgentním hledání agonistů krevních růstových faktorů schopných urychlit regeneraci destiček. Předkládaný vynález takového^agonistu popisuje.

Podstata vynálezu

Vynález je v jedné části zaměřen na nový a neočekávaný objev, že definované peptidy s nízkou molekulovou hmotností a látky napodobující peptidy, mají silné vazebné schopnosti vůči TPO-R·.. a mohou TPO-R aktivovat. Tyto peptidy a látky napodobující peptidy jsou tedy použitelné pro terapeutické účely při léčení stavů podmíněných .TPO (např. trombocyťopeniev důsledku chemoterapie/ : / .

I • ·

• * ··»

« ·

-5•i í

radiační terapie nebo transfuze kostní dřeně), stejně jako pro diagnostické účely při studiu mechanismu hematopoézy a pro expanzi megakaryocytů a ohrožených buněk předchůdců.

Peptidy a peptidy napodobující látky vhodné, pro terapeutické s a/nebo diagnostické účely mají tCso přibližně 2 mM nebo nižší při stanovení vazebné afinity testem uvedeným v příkladu 3 níže, kde nižší ICso koreluje se silnější vazebnou afinitou vůči TPO-R. Pro farmaceutické účely mají peptidy a peptidomimetické látky s výhodou IC₅₀ ne větší než přibližně 100 μΜ, výhodněji ne více než 500 nM. Ve io výhodném provedení je molekulová hmotnost peptidu nebo peptid napodobující látky od přibližně 250 do přibližně 8000 daltonů.

Při používání pro diagnostické účely se peptidy a peptidy napodobující látky s výhodou značí detekovatelným markérem a peptidy a peptidy napodobující látky bez takového označení^ tedy slouží jako meziprodukty při přípravě značených peptidů a peptidy napodobujících látek.

ÍK·

Peptidy splňující definovaná kritéria pro molekulovou hmotnost a‘vazebnou afinitu'vůči TPO-R Obsahují-9 nebo-více-aminokyselin,které se vyskytují v přírodě nebo jsou syntetické. Peptidy napodobující látky zahrnují peptidy s jednou nebo více následujícími modifikacemi:

peptidy, kde jedna nebo. více peptidických vazeb (-C(O)NR-j byla nahrazena nepeptidickým spojením jako je spojení -CH₂-karbamát [-CH₂-OC(O)NR-]; fosfonátová vazba; vazba -CH₂-sulfonamid [-CH₂S(O)₂NR-]; močovinová vazba [-NHC(O)NH-]; vazba -CH₂-sekundární amin; nebo alkylovaná peptidylová vazba [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ znamená nižší alkyl];

peptidy, u kterých N-konec je derivatizován. na skupinu -NRR¹; skupinu -NRC(O)R; skupinu -NRC(O)OR; skupinu -NRS(O)₂R; skupinu -NHC(O)NHR, kde R a R¹ znamenají atom vodíku nebo nižší alkyl za ' podmínky, že; R a R¹ nejsou oba atomy vodíku; sukcinimidovou ; skupinu; skupinu benzylóxykarbonyl-NH- (CBZ-NH-); nebo skupinu i

• « * v .-6benzyloxykarbonyl-NH- s 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu zvolenými ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo; nebo peptidy, kde C-konec je derivatizován na skupinu -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny nižší alkoxy, a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou s nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl.

Výhodné peptidy a peptidy napodobující látky tedy s výhodou zahrnují sloučeniny:

(1) s molekulovou hmotností méně než přibližně 5000 daltonů, a (2) s vazebnou afinitou vůči TPO-R vyjádřenou jako ICso ne io větší než 100 μΜ, kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbami zvolenými ze skupiny:

-CH₂OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH₂S(O)₂NR-; vazba -CH₂NR-; a vazba -C(O)NR⁶-; a vazba -NHC(O)NH-, kde R znamená is atom vodíku nebo nižší alkyl a R⁶ je nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo látky napodobující ~ peptid je 'žvoleřfzFsklipifíy ~-NRR¹/'skupiny^--NRC(O)R; skupiny ~NRC(O)OR; skupiny -NRS(O)₂R; skupiny -NHC(O)NHR; sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-NH- s 1 až 3 substituenty na fenylovém kruhu, zvolenými ze skupiny nižší alkyl, nižší alkoxy, chloro a bromo, kde R a R’ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl, a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy, a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a atom dusíku nebo skupina -NR³R⁴ může být popřípadě aminová skupina N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu, a jejich fyziologicky přijatelné soli. ' - ' _; 7 ·· ► · *

F fc « » * * 4 • fc ·_·

-7• · · * • · · · • « fc fc · « fc fc

V dalším provedení je vynález zaměřen na značený peptid nebo látku napodobující peptid obsahující peptid nebo látku napodobující peptid uvedené dříve, které mají na sebe kovalentně navázán markér schopný detekce. V některých provedeních vynálezu zahrnují výhodné peptidy strukturu jádra obsahující sekvenci aminokyselin:

Xi X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X?

kde Xj znamená C, L, Μ, P, Q, V; X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo'V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, K, ίο M, Q, R, S, T, V nebo Y; Xe znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a

X₇ znamená C, G, l, K, L, Μ, N, R nebo V.

Ve výhodném provedení obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:

X_a G Xi X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ is kde Xj znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo T;

X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T;

........... ,X₅ znamená A,.E,.G,.K, M,A.R,.S,₄nebo^T;_tX₇jnamená C,J, K, L, M nebo V; a každý ze zbytků X₈ je nezávisle na sobě zvolen z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. jejich stereoizomerních D2o aminokyselin a nepřírodních aminokyselin. S výhodou je každý zbytek X₈ nezávisle zvolen z jakýchkoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin a jejich stereoizomerních D-aminokyselin. Ve výhodném provedení Xi znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená R; Xs znamená E nebo Q; a X₇ znamená I nebo L.

Výhodněji obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:

X_s X₃ G Xi X₂ X₃X₄ Xs W X₇ kde X₉ znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V; a X₈ znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V. Výhodněji je skupina X₉

-i ‘ a · t . · ř

A nebo I; a X₈ znamená D, E, nebo K: \ * 4 · « · • · ♦ 4 • 4

-8« · »4

Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCADGPTLREWISF CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL R E W I S F C G G K; T I K G P T L R Q W L K S R E Η T S; S I E G P T L R E W L T S R T P H S; L A I E G P T L R Q W L H G N G R D s T;CADGPTLREWISFC;alEGPTLRQWLAARA.

V dalším provedení vynálezu zahrnují výhodné peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu peptidy se strukturou jádra obsahující-sekvenci aminokyselin:

C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ io kde X₂ znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I,

L, M, R, S nebo V; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆ znamená C, F,

G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V. Ve výhodnějším provedení znamená X₄ A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R, S, T nebo W. V dalším provedení X₂ je S nebo T; X₃ je L nebo R; X₄ je R;

X₅ je D, E, nebo G; X₆ je F, L, nebo W; a X₇ je I, K, L, R, nebo V. Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCTLREWLHGGFČGG.

V dalším provedení jsou výhodnými peptidy’pro použití v^rámci * ' * předkládaného vynálezu peptidy se strukturou obsahující sekvenci

2o aminokyselin:

Xa C X₂ X₃ X₄ X§ X₃ X₇ kde X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F,

I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X₅ je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ je C, F,

G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. V některých provedeních je X₃ s výhodou G, S, Y, nebo R. /

Zde popisované sloučeniny jsou použitelné pro prevenci ιέ™/; _:-a léčení onemocnění podmíněných IPCh a ; zvláště pro - -léČenry.·. a hematologických poruch, včetně bez omezení trombocytopenie · ♦ · v důsledku chemoterapie, radiační terapie nebo transfuzí kostní dřeně. Předkládaný vynález tedy poskytuje také způsob léčení, při kterém se pacientovi s poruchou, která je vnímavá léčení agonistou TPO, podává terapeuticky účinná dávka nebo množství sloučeniny podle s předkládaného vynálezu.

Vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující jednu nebo více výše popsaných sloučenin a fyziologicky přijatelný nosič. Tyto farmaceutické prostředky mohou mít řadu forem včetně orálních dávkovačích forem stejně jako inhalovatelných prášků a roztoků a roztoků pro injekce a infuze.

Popis konkrétních provedení

I. Definice a obecné parametry

Následující definice se uvádějí pro ilustraci a definují význam a 15 rámec různých termínů, které se zde používají při popisu vynálezu.

„Agonista označuje biologicky aktivní ligand, který se váže na

---- . _ —svůj komplementární-biologicky*aktivní receptor a..aktivuje jej za vyvolání biologické odpovědi receptorů nebo za zvýšení již existující biologické aktivity receptorů.

a „Farmaceuticky přijatelné soli“ označují netoxický alkalický kov, kov alkalické zeminy a amonné soli běžně používané ve farmaceutickém průmyslu včetně sodíku, draslíku, lithia, vápníku, hořčíku, barya, amonia a protaminových zinkových solí, které se připravují v oboru známými způsoby. Termín také zahrnuje netoxické adíční soli s kyselinami, které se obvykle připravují reakcí sloučenin podle vynálezu s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou. Představiteli těchto solí jsou chlorid, bromid, sulfát, bisulfát, acetát, oxalát, valerát, oleát, laurát, borát, benzoát, laktát, fosfát, tosylát,

,.; ' λ„v i citrát,.maleát, fumarát, sukcinát, vínan, napsylát apod)._;.s · ;

• ·· « · # · ♦ · ·

-10“v (♦ ‘•Αι- 1« „Farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou“ označuje takové soli, které si zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti volných bází a které nejsou biologicky nebo jinak nežádoucí, vytvořené s anorganickými kyselinami, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, fosforečná apod. a organickými ''kyselinami, 'jako* je“Ičýselina' octová, propionová, glykolová, pyrohroznová, oxalová, jablečná, malonová, jantarová, maleinová, fumarová, vinná, citrónová, benzoová, skořicová, mandlová, metansulfonová, ethansulfonová, p-toluensulfonová, io salycilová apod. Pro popis farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinami jako prekurzorů je možno nalézt informace v Bundgaard,

H., výše.

„Farmaceuticky přijatelný ester“ označuje takové estery, které po hydrolýze esterové vazby zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti karboxylové kyseliny nebo alkoholu a nejsou biologicky nebo jiným způsobem nežádoucí. Popis farmaceuticky přijatelných esterů jako prekurzorů se uvádí v Bundgaard, Hl, red., Design, of Prodrugs. Elsevier Science Pubiishers, Amsterdam (1985). Tyto estery — - - - -I- - —*—- - — aw —V.*,— ........ .

se typicky tvoří z odpovídající karboaxylové kyseliny a alkoholu.

2o Obecně je možno tvorbu esterů provádět běžnými způsoby syntézy (viz např. March, Advanced Qrganic Chemistrv. 3. vyd., John Wiley & Sohs, New York (1985) str. 115? a tam uvedené odkazy a Mark a další, Encvclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, New York (1980). Alkoholová složka esteru bude obvykle obsahovat (i) C₂

- Ci₂ alifatický alkohol, který může nebo nemusí obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může nebo nemusí obsahovat rozvětvený uhlíkový řetězec nebo (ii) C7 - C12 aromatický nebo heteroaromatický alkohol. Tento vynález také předpokládá použití takových sloučenin, které jsou jak zde popisovanými estery, tak současně jejich farmaceuticky přijatelnými adičními solemi s kyselinami.

. , ' ' ¹ .· í - 1 - : > / i ·, · . > “ ··. · ·: ·' y

V,

I 9 9 • * • ·; · • * · • · ♦ ·

99 99 f * *· • •9 9 *

9 * • V V* „Farmaceuticky přijatelný amid“ označuje amidy, které po hydrolýze amidové vazby zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti karboxyiové kyseliny nebo aminu a nejsou biologicky nebo jiným způsobem nežádoucí. Popis farmaceuticky přijatelných amidů s jako prekurzorú léčiv je možno nalézt v Bundgaard, H., vyd. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Tyto amidy se typicky vytvářejí z odpovídající amidové kyseliny a aminu. Amidy je možno obecně vytvářet běžnými způsoby syntéz (viz např. March Advanced Organic Chemistry. 3. vyd., John Wiley & Sons, New York io (1985) str. 1152 a Mark a další, Encvclopedia of Chemical

Technology. John Wiley & Sons, New York (1980).

Tento vynález také předpokládá použití takových sloučenin, které jsou jak amidy, jak se zde popisují, tak i současně jejich farmaceuticky přijatelnými adičnímí solemi s kyselinami.

„Farmaceuticky nebo terapeuticky přijatelný nosič“ označuje nosné médium, které neinterferuje s účinností biologické aktivity aktivních sloučenin, a které není toxické pro hostitele nebo pacienta.

jStereoizomer“-označuje-chemickou sloučeninu ,.se~stejnou molekulovou hmotností, chemickým složením a uspořádáním jako jiná sioučenina, ale s odlišně seskupenými atomy. To znamená, že jsou stejné chemické skupiny rozdílně orientovány v prostoru a proto mají v čistém stavu . Některé Čisté stereoizomery však mohou mít optickou rotaci tak malou, že je současnými přístroji nedetekovatelná. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou mít jeden nebo více asymetrických atomů uhlíku, a proto zahrnují různé stereoizomery. Všechny stereoizomery se zahrnují do rámce předkládaného vynálezu.

„Terapeuticky nebo farmaceuticky účinné množství“ se používá pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu a označuje množství sloučeniny dostatečné pro indukci požadované biologické odpovědi.

i- ió 30,¾.Tato; odpověď <může ;být zmírnění příznaků nebo příčin onemocnění ^J nebo jakákoliv jiná požadovaná změna biologického systému.

-12·» • · »· • · ··* « · a · * · a· ·♦

V předkládaném vynálezu bude výsledek typicky zahrnovat snížení imunologické a/nebo zánětlivé odezvy na infekci při poranění tkáně.

Zbytky aminokyselin v peptidech se zkracují následujícím způsobem: fenylalanin je Phe nebo F; leucin je Leu nebo L; izoleucin je Ile nebo I; methionin je Met nebo M; valín je Val nebo V; serin je Ser nebo S; prolin je Pro nebo P; threonin je Thr nebo T; alanin je Ala nebo A; tyrozin je Tyr nebo Y; histidin je His nebo H; glutamín je Gin nebo Q; asparagin je Asn nebo N; lyzin je Lys nebo K; kyselina s. asparagová je Asp nebo D; kyselina glutamová je Glu nebo E; cystein je Cys nebo C; tryptofan je Trp nebo W; arginin je Arg nebo R; glycin je Gly nebo G. Dále Bu znamená butoxy, Bzl je benzyl, CHA je cyklohexylamin, Ac je acetyi, Me je methyl, Pen je penicilamin, Aib je kyselina aminoizomáselná, Nva je norvalin, Abu je kyselina aminomáselná, Thi je thienylalanin, OBn je O-benzyl, a hyp je is hydroxyprolin.

Navíc k peptidům obsahujícím pouze v přírodě se vyskytující aminokyseliny mohou být také poskytnuty analogy peptidú nebo

-... ~--------- .peptidy napodobujícíjátky „(peptidomimetika). Analogy peptidů se obvykle používají ve farmaceutickém průmyslu jako nepeptidová

2o léčiva s vlastnostmi analogickými k vlastnostem templátového peptidu. Tyto typy nepeptidových sloučenin se označují jako „peptidomimetika“ nebo „peptidy napodobující látky“ (Fáuchere, J., Adv, Drug Res., 15: 29 (1986); Veber a Freidinger, TINS, str. 392 (1985); a Evans a další, J, Med. Chem., 30: 1229 (1987). Peptidy . 25 napodobující sloučeniny, které mají podobnou strukturu jako terapeuticky použitelné peptidy, mohou být použity pro získání stejného nebo zvýšeného terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidy napodobující sloučeniny podobné vzorovému polypeptidu (tj. polypeptidu, který má biologickou nebo

3o farmakologickou účinnost), jako jsou v přírodě se vyskytující -polypeptidy, vážící se na receptor, ale mají jednu nebo více

I • ·· » · * I • · « «I peptidových vazeb, popřípadě nahrazenu vazbou zvolenou ze skupiny: -CH₂OH₂-, CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (cis a trans), -C0CH₂-, -CH(0H)CH₂- a -CH₂SO-, některým ze způsobů známých ze stavu techniky a dále popisovaných v následujících odkazech: Spatola, A. s F., Chemistry and Biochémistry of Amino Acids, Peptides, and

Proteins, B. Weinstein, red., Marcel Dekker, New York, str. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (březen 1983), díl' 1, vyd. 3, Peptide

Backbone Modifications (obecný přehled); Morley, Trends Pharm. Sci.

(1980), str. 463 - 468 (obecný přehled); Hudson, D. a další, Int. J. io Pept. Prot. Res., 14: 177 - 185 (1979) (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola a další. Life Sci., 38: 1243 - 1249 (1986) (-CH₂-S); Hann, J. Chem. Soc.

Perkin Trans. I, 307 - 314 (1982) (-CH=GH-, cis a trans); Almquist a další, J, Med. Chem. (23: 1392 - 1398 (1980) (-C0CH₂-); JenningsWhite a další, Tetrahedron Lett.. 23: 2533 (1982) (-COCH₂-); Szelke a další, evropská patentová přihláška EP 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH₂-); Holladay a další. Tetrahedron Lett.. 24: 4401 4404 (1983) (-C(OH)CH₂); a Hrubý. Life Sci.. 31: 189 - 199 (1982) .

(-CH₂-S-); které se zde všechny uvádějí jako referenční. Zvláště výhodnou népepťidovou vazbou je“CH₂NH-.‘Tyto peptidy napodobující-— látky mohou mít významné výhody proti provedením polypeptidů, například: ekonomičtější výroba, lepší chemická stabilita, zlepšené farmakologické vlastnosti (poločas, absorpce, schopnost působit účinnost apod.), změněná specifícita (např. šířka spektra biologického účinku), snížená antigenicita a další. Značení peptidy napodobujících látek obvykle zahrnuje připojení jednoho nebo více markérů, přímo nebo prostřednictvím můstku (spacer) (např. amidové skupiny) na neinterferující polohu (polohy) peptid napodobující látky, která se . . , předem,určí pomocí kvantitativních dat struktura - účinnost a/nebo molekulárního modelování. Takovými neinterferujícími polohami jsou

3o polohy, které nevytvářejí přímé kontakty s makromolekulou

;. „.(makromolekulami), (například molekuly.; širší, rodiny Jmunoglobulinú), ~» 'i . . . . ’ 'i··' .....

. ke. ikterým še peptid: nápodobující sloučenina váže za dosažení • 44

-14φ 4 44

Φ 4 4 * « 4 • 4 4 4 terapeutického účinku. Derivatizace (například značení) peptidy napodobujících látek by v podstatě neměla interferovat s požadovanou biologickou nebo farmakologickou účinností peptid napodobující látky. Obvykle se peptid napodobující látky peptidů vážících se na receptoru váží na receptor s vysokou afinitou a mají zjistitelnou biologickou účinnost (tj. agonistickou nebo antagonistickou k jedné nebo více receptorem podmíněných fenotypových změn.

Systematické nahrazování jedné nebo více aminokyselin obvyklé sekvence D-aminokyselinou stejného typu (například D-lyzin io namísto L-lyzinu) může být použito pro vytváření stabilnějších peptidů. Navíc mohou být v oboru známými metodami (Řízo a Gierasch, Ann. Rev. Biochem.. 61: 387 (1992) generovány uzavřené peptidy obsahující konvenční sekvencí nebo variaci v podstatě identickou s konvenční sekvenci; například přídavkem vnitřních cysteinových zbytků schopných vytvářet intramolekulární disulfidické můstky, které peptid cyklizují.

Syntetické aminokyseliny nebo v přírodě se nevyskytující ___aminokyseliny oznaČují_aminokyseliny,Jderé~se_nevyskytujry přírodě in vivo, ale které mohou být přesto začleněny do zde popisovaných struktur peptidů. Výhodnými syntetickými aminokyselinami jsou D-aaminokyseliny v přírodě se vyskytujících L-a-aminokyselin stejně jako v přírodě sé nevyskytující D- a L-a-amínokyseliny představované vzorcem H₂NCHR⁵COOH, kde R⁵ je 1) skupina nižšího alkylu, 2) cykloalkylová skupina složená ze 3 až 7 atomů uhlíku, 3) heterocykl ze

3 až 7 atomů uhlíku a 1 až 2 heteroatomů zvolených z atomů kyslíku, síry a dusíku, 4) aromatický zbytek tvořený 6 až 10 atomy uhlíku, popřípadě s 1 až 3 substituenty na aromatickém jádře, zvolenými ze skupiny hydroxyl, nižší alkoxylová, aminová a karboxylová skupina, 5) -alkylen-Y, kde alkylen je alkylenová skupina tvořená 1 až 7 atomy uhlíku a Y je zvoleno ze skupiny (a) hydroxylové, (b) aminové, (c) cýkloalkylové a cykloalkenylově Složených ze 3;až 7 atomů uhlíku, • · · « « • * I

Μ β · • ·

-15i -ϊ (d) arylové složené ze 6 až 10 atomů uhlíku, popřípadě s 1 až 3 substituenty na aromatickém jádře, zvolenými ze skupiny hydroxyl, nižší alkoxy, amino a karboxyl, (e) heterocyklické složené z 3 až 7 atomů uhlíku a 1 až 2 heteróatomů zvolených ze skupiny kyslíku, síry a dusíku, (f) -C(O)R², kde Ř² je zvoleno ze skupiny atom vodíku, hydroxyl, nižší alkyl, nižší alkoxyl a skupina -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě zvoleny ze skupiny atom vodíku nebo nižší alkyl, (g) skupiny -S(0)_nR⁶, kde n je celé číslo od 1 do 2 a R⁶ je nižší alkyl a s podmínkou, že R⁵ nedefinuje postranní řetězec v přírodě se io vyskytující aminokyseliny.

Další výhodné syntetické aminokyseliny zahrnují aminokyseliny, u kterých je aminoskupina oddělena od karboxylové skupiny více než jedním atomem uhlíku, jako je b-alanin, kyselina g-aminomáselná apod.

Zvláště výhodnými syntetickými aminokyselinami jsou například

D-aminokyseliny, v přírodě se vyskytujících L-aminokyselin, L-1naftylalanin, L-2-naftylalanin, L-cyklohexylalanin, kyselina L-2............ aminoizomáselná,-sulfoxidové .a _su lionové „deriváty methioninu (tj____

HOOC-(H₂NCH)CH₂CH₂-S(O)_nR⁶), kde n a R^e jsou jak definováno výše, stejně jako nižší alkoxyiový derivát methioninu (ti. HOOC(H₂NCH)CH₂CH₂-QR⁶, kde R⁶ je jak definováno výše).

„Detekovatelný markér“ označuje materiály, které při kovalentním navázání na peptidy á peptid napodobující látky podle vynálezu umožní detekci peptidu a peptid napodobující látky in vivo u pacienta, kterému byl peptid nebo peptid napodobující látka podán. Vhodnými detekovatelnými markéry jsou látky v oboru dobře známé, například radioizotopy, fluorescenční markéry (např. fluorescein) apod. Konkrétní použitý detekovatelný markér není kritický a volí se podle množství markéru, který má být použit, stejně jako jeho toxicity

3o, v použitém, množství,. Volba markéru vzhledem k těmto faktorům spadá . do rámce znalostí v oboru.

• · ·

-16Kovalentní připojení detekovateiného markéru k peptidu nebo peptid napodobující látce se provádí běžnými známými postupy. Když se například použije jako detekovatelný markér radioizotop ^12SI, kovalentního připojení ¹²⁵l k peptidu nebo peptid napodobující látce, může být provedeno zavedením aminokyseliny tyrozinu do peptidu nebo peptid napodobující látky a následnou jodací látky. Jestliže není tyrozin v peptidu nebo peptid napodobující látce přítomen, může být provedena v oboru známými způsoby inkorporace tyrozinu na N nebo C-konec peptidu nebo peptid napodobující látky. Podobně může být do peptidu nebo peptid napodobující látky ve formě fosfátové skupiny inkorporován ³²P, například prostřednictvím hydroxylové skupiny na peptidu nebo peptid napodobující látce, s použitím běžné chemické reakce.

II. Přehled

Předkládaný vynález poskytuje sloučeniny, které se vážou na TPQ-R a aktivují jej, nebo se jinak chovají jako agonisté TPO. Tyto sloučeniny obsahují „vzorové“ peptidové sloučeniny a ^odvozené sloučeniny“ konstruované tak, aby měly stejnou nebo podobnou

2o molekulární strukturu nebo tvar jako vzorové sioučeniny, ale odlišné od vzorových sloučenin buď s ohledem na vnímavost k hydrolýze nebo proteolýze a/nebo na jiné biologické vlastnosti, jako je zvýšená afinita k receptoru. Předkládaný vynález také poskytuje prostředky obsahující účinné množství agonisty TPO a zvláště prostředek, který je použitelný hematologických poruch, zvláště trombocytopenie spojené s chemoterapií, radiační terapií nebo transfuzemi kostní dřeně.

Rl* >

I · » · · · « · · ·

-17ill. Identifikace agonistů TPO

Peptidy s vazebnou afinitou k TPO-R mohou být snadno identifikovány vytvářením systémů s náhodnou různorodostí peptidů spojených s postupem afinitního obohacování.

Systémy pro vytváření náhodné různorodosti peptidů konkrétně zahrnují systém „peptidy na plazmidech“, popsaný v US patentech No. 5,270,170 a 5,338,665; systém „peptidy na fágu“, popsaný v US patentové přihlášce No. 07/718,577 z 20. 6. 1991, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 07/541,108 z 20. 6. 1990 a v Cwirla a io další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 87: 6378 - 6382 (1980); „polyzomový systém“ popisovaný v US patentové přihlášce No. 08/300,262 z 2. 9. 1994, která navazuje na US patentovou přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO 95/11992; systém „kódované syntetické knihovny“ (ESL) popisovaný v US patentové is přihlášce No. 08/146,886 z 12. 11. 1993, navazující na US patentovou přihlášku No. 07/946,239 z 16. 9. 1992, navazující na US patentovou přihlášku No. 07/762,522 z 18. 9. 1991; a systém „syntézy velmi .- ...rozsáhlého [mobilizovaného.polymeru“ (very large scale immobiiized^ polymer synthesis) popisovaný v US patentu No. 5,143,854; το zveřejnění PCT patentu No. 90/15070, zveřejněn 13. 12. 1990; US patentové přihlášce No. 07/624,120 z 6. 12. 1990, Fodor a další, Science, 251: 767 - 773 (2/1991); Dower a Fodor. Ann Rép. Med. Chem.. 26: 271 - 180 (1991); a US patentové přihlášce No.

07/805,727 z 6. 12.1991.

S použitím výše popsaných postupů byly obecně navrhovány náhodné peptidy tak, aby měly definovanou délku v počtu aminokyselinových zbytků (např, 12). Pro vytváření sbírky oligonukleotidů kódujících náhodné peptidy byl použit kodonový motiv (NNK)_X, kde N je nukleotid A, C, G nebo T (ekvimolárně; v závislosti

,.,5...:.; ,,3o. na použité, metodě, mohou být použity.další,nukleotidy), Kje.G nebo T (ekvimolárně) a x je celé číslo odpovídající počtu aminokyselin • · * * • · · · «« ·· ”· · ϊ

Φ· «φ « · · ? *>β

-18..ρ, .S _Γ.. -, -U v peptidu (např. 12) pro specifikaci jakéhokoliv z 32 možných kodonů vyplývajících z motivu NNK: 1 pro každou z 12 aminokyselin, 2 pro každou z 5 aminokyselin, 3 pro každou ze 3 aminokyselin a pouze

1. ze 3 stop kodonů. Motiv NNK tedy kóduje všechny aminokyseliny, s pouze jeden stop kodon a redukuje nerovnoměrnost kodonů.

V použitém systému byly náhodné peptidy předkládány buď na povrchu částice fágu, jako část fuzního proteinu obsahujícího buď plil nebo pVIH obalový protein derivátu fd fága (peptidy na fágu) nebo jako fuzní protein s fuzním proteinem Lad navázaným na plazmid io (peptidy na plazmidech).

Fág nebo plazmidy včetně DNA kódující peptidy byly , identifikovány a izolovány afinitním obohacovacím postupem s použitím imobilizovaného TPO-R. Afinitní obohacovací proces, někdy nazývaný „panning“, se skládá z několika cyklů inkubace fága plazmidú nebo polyzomů s imobilizovaným receptorem, izolace fága, plazmidů nebo polyzomů, které se vážou na receptor spolu s doprovázející DNA nebo mRNA a produkce většího množství fágů

- . - nebo plazmidů (spolu s.doprovázejícím fuzním proteinem Lacl-peptid)._

V průběhu afinitního obohacovacího procesu byla typicky používána

2o extraceluiární doména (ECD) TPO-R.

Po několika Cyklech afinitního obohacování byl fág nebo plazmidy a doprovázející peptidy testovány metodou ELISA s cílem určit, jestli se peptidy specificky vážou na TPO-R. Tento test byl prováděn podobně jako postupy používané v afinitním obohacovacím způsobu, s výjimkou toho, že po odstranění nenavázaného fága byly jamky typicky inkubovány s králičí anti-fágovou protilátkou, potom s alkalickou . fosfatázou (AP) konjugovanou s kozí antikráličí protilátkou. Množství alkalické fosfatázy v každé jamce bylo stanoveno standardními způsoby. Podobný postup ELISA pro použití , 3o. ...pro.systém peptidyna. plazmidech se popis,uje. podrobněji níže.. -;3

Porovnáním testovacích jamek s kontrolními jamkami (bez receptoru) je možno určit, zda se fuzní proteiny specificky vážou na receptor. Vzorky fága, u kterých bylo zjištěno, že se vážou na TPO-R, byly testovány pomocí vzorkování s přenosem kolonií s použitím.

radioaktivně značeného monovalentního receptoru. Tuto sondu je možno vyrobit fosforylací kemptidové sekvence fúzované k C-konci rozpustného receptoru s použitím proteinkinázy A. „Uměle vytvořená“, * forma receptoru TPO je potom exprimována v hostitelských buňkách, typicky buňkách CHO. Po sklizní PI-PLC receptorů byl receptor ♦ io testován na vazbu k TPO nebo TPO-R specifickým fágovým klonům.

. Receptor se potom značí až do dosažení vysoké specifické aktivity ³³p a je ho potom možno použít jako monovalentní sondy pro identifikaci tigandů s vysokou afinitou s použitím přenosu kolonií.

Peptidy, u kterých bylo zjištěno, že se specificky vážou na 15 receptor, byly potom syntetizovány jako volné peptidy (například bez fága) a testovány blokovacím testem. Blokovací test byl prováděn podobným způsobem jako ELISA s tím rozdílem, že TPO nebo referenční peptid byly přidávány do jamek před fuzním proteinem (kontrolní jamky byly dvou typů; (ifbez receptoru; a*(2) bež TPO nebo'

2o referenčního peptidu). Fuzní proteiny, pro které byla vazba na receptor blokována TPO nebo referenčním peptidem, obsahují v části náhodného peptidu peptidy, které jsou výhodnými sloučeninami podle vynálezu.

TPO-R, stejně jako jeho extracelulární doména, byly y 25 produkována v rekombinantních hostitelských buňkách. Jedna použitelná forma TPO-R se vytváří expresí proteinu jako rozpustného proteinu v bakulovirem transformovaných hostitelských buňkách s použitím standardních způsobů; další použitelná forma se vytvoří se signálním peptidem pro sekreci proteinu a pro připojení ukotvením na

3o glykofosfolipidovou membránu. Tato forma ukotvení se nazývá „PIG<* · · • · ·

- 20 * • · · · · · v « II ♦ · · · · · 1 > * ♦ * » «» « ’ · · »«·· 1 « · · *

V · · tailing“, viz Caras a Wendell, Science. 243: 1196 - 1198 (1989) a Lin a další, Science, 249: 677 - 679 (1990).

S použitím systému PIG-tailing je možno odštěpit receptor z < povrchu buněk, které jej exprimují (např. transformovaných buněk s CHO selektovaných na vysokou expresi receptoru pomocí třídiče buněk) fosfolipázou C. Odštěpený receptor stále ještě obsahuje karboxylovou termináiní sekvenci aminokyselin, nazývanou „HPAP tail“ ze signálního proteinu pro připojení na membránu a může být imobilizován bez dalšího čištění. Rekombinantní receptorový protein io může být imobilizován potažením jamek mikrotitračních destiček protilátkou anti-HPAP tail (Ab 179 nebo MAb 179), blokováním nespecifické vazby bovinním sérovým albuminem (BSA) v PBS a potom vazbou odštěpeného rekómbinantního receptoru na protilátku. S použitím tohoto postupu je možno provádět imobilizační reakci při různých koncentracích receptoru pro určení optimálního množství pro daný preparát, protože různé preparáty rekómbinantního proteinu často obsahují různá množství požadovaného proteinu. Navíc by se mělo zajistit, že imobilizovaná protilátka je (TPO nebo některou jinou blokovací sloučeninou) v průběhu postupu afinitního

2o obohacování úplně blokována. Jinak může neblokovaná protilátka vázat v průběhu postupu afinitního obohacování nežádoucího fága. Pro blokování nenavázaných míst, která zůstala po imobilizaci receptoru pro zabránění tomuto problému je možno použít peptidy, které se vážou na imobilizující protilátku nebo je možno jednoduše imobilizovat receptor přímo na jamky mikrotitračních destiček bez pomoci imobilizující protilátky. (Viz US patentová přihláška No. 07/947,339 z 18. 9. 1992, jejíž obsah se zde uvádí jako referenční.)

Při použití systémů vytváření náhodných peptidů, které dovolují multivalentní interakce ligand - receptor, je nutno připustit, že hustota imobilizovaného receptoru je důležitým faktorem při zjišťování afinity . ligandů,. které, se vážou na [mobilizovaný receptor. ,Při vyšších * c · * · c . . · fl' . · c* * c <r * «· * c f o- c· * c, <U '^,k *<w.

• · · c r t·

G ’ 1 · « « t: * C t C ’<

• * I*-Íiustotácli^:receptoru (například· každá Jamka potažená protilátkóďanti^Těceptór jě iňkubóvána^š 0,í25‘'až 0,5 mgreceptóruýje multiválentní. ’ vázba^pravděplídóhrtější * než při nízkých ''Hustotách^^řecěptořů ^(hapříkiad-káždá-jamka-potážěná prótiíátkoujánťi-rěcéptórse 'inkubuje *^;s ·0,5’ až*l^ňg¹ receptorů). Jestliže- se* vyskytuje múítiválěntní'vazba, ⁴ dojde’ s větší ·pravděpodobností k izolaci¹ ligándů' ^relativně⁷ nižší ^cafinitou, pokud se nepoužije.vyšších hustotjmóbiližovariéhó^ecěptořu. ^r pro''identifikaci’ vzorových r sloučenin 'á'⁷ použije Tšě<’ nižších'hustot ''receptorů pro iZÓlači'odvozených sloučenin s•vyŠsí^áfinitoiíJ⁷

Γί»ι$5Μ'ί > ss ’-'ί. 4· » (JftTwTPTCh tři 'h4j‘“'^íi'3vf^íř$£; * io Pro rozlišení mezi peptidy š vyšší afinitou se často používá

U’ . ‘Λ 70 .. «1* TΉ*3tMf. ^£ 10 ' ksíVC/fW monovalentm receptorová sonda. Tato sonda muže být vytvořena s . , ♦ '.ϊν-β ·<·ν použitím proteinkinázy·“Apro fosforyíaci kemptidové sekvence připojené k C-konci rozpustného receptorů. „Umělá forma“ receptorů. TPO se potom exprimujě“v hóstitelských buňkách; typicky v buňkách CHO. Po sklizni PI-PLC^Jrecěpťórú byl rečeptor testován na vazbu k 'TPO nebo k‘TPO-R specifickým fágóvým klónům: Receptor se potom značí až do vysoké^ř specifické aktivity ³³P pro použití jako ^r monovalentní sonda ’pro^? identifikaci Migandů* s · vysokou afinitou ™^;s použitím^Jpřenosů k^íonlíý^®®® ¹ Č ίτλϊ3·Τ

Rcv·.,·, ' π. ....

Výhodné metody screemngu pro umožněni identifikace peptidu.

A ·ς,ί5ίΡί-ί.5 nusttčfftu c. ;ϊίχ#*ύ ολ , _ *»w: ^νίϊί ’ fcípH#· ‘ které se vážou na TPO-R zahrnují nejprve identifikaci vzorových íf&wrtz (€.·£. ·· fA RJ ‘v. XXXXXXX peptidu, ktefe še‘ vázou na ěxtfáCélulařrii doménu receptorů á po“tóm ' S ψ'-ík u-b .·- Φ Λ přípravu dalších peptidu, ktere.se vzorovým peptidum podobají, protivní 'ííjV* knih**, X> .'>· ... .·

Konkrétně může být s použitím peptidú založených na plil nebo pVIII TLRFWt. XXXť íX «V r.JfcM .5? ú . ' -· ve fagovem systému proveden screening náhodné knihovny pro íi-C >ΉΙ»ΜΟ s ©íUfJ »Cr. í·... · “'·.

odhalení fága nesoucího peptid, který se váže na TPO-R. Fágové

- tnoroťií^n··' >

DNA jsou sekvenovány pro stanovení sekvencí peptidů nesených na povrčhů fágů·*-·* ^;iti - *-’ útoT-rnír* j·- ’

Klony schopné specificky se vázat na TPO-R byly identifikovaný * ·'» i- * .30 z náhodného lineárního 10-meru ' knihovny pVIII a náhodného cyklického . 10-meru á 12-rňeru ^knihoven pVIII. Sekvence těchto »*·' ·· ·

a · « a · • a · a a a a ·.»,· · a

9 9.«.

«9 9« 99

- ¢-22 |· ·Μ · peptidů slouží jako základ pro konstrukci dalších peptidových knihoven navržených tak, aby obsahovaly deriváty na počátku identifikovaných peptidů s vysokou frekvencí. Tyto knihovny mohou být syntetizovány tak, aby byla zvýhodněna produkce peptidů, které s se liší od vazebného peptidu pouze v několika zbytcích. Tento přístup zahrnuje syntézu oligonukleotidu s kódující sekvencí vazebného mm-peptidu*tak,-že-se’přÍTsyntéze-nepoužívá-čistýeh'preparátů-každého-zečtyř nukleosidtrifosfátů, ale používá se směsí čtyř nukleosidtrifosfátů (tj. jednou z výhodných směsí pro tento účel je 55 % „správného“ ία nukleotidu a 15 % každého z ostatních tří nukleotidů a další výhodnou směsí pro tento účel je 70 % „správného“ nukleotidu a 10 % každého z ostatních tří nukleotidů), aby došlo k vytvoření derivátů kódující sekvence vazebného peptidu.

Pro derivatizaci vzorových peptidů byla použita řada strategií vytvořením knihoven „mutageneze na určité téma“. Ty zahrnovaly pVIII fágmidovou mutagenetickou knihovnu založenou na konvenční sekvenci mutagenizované s frekvencí 70 ; 10 : 10 : 10 a prodloužené na každém konci náhodnými zbytky za vytvoření klonů zahrnujících sekvenci XXXX (C, S, P nebo R) TLREWLXXXXXX (C nebo S).

2o Podobná prodloužená/mutagenizovaná knihovna byla vytvořena s použitím systému peptidy na plazmidech za vytvoření klonů ..obsahujících sekvenci XXXXX (C, S, P nebo R) TLREWL XXXXXXX. S použitím polyzomového systému byla vytvořena další prodloužená/mutagenizovaná knihovna, XXXX (C, S, P, nebo R)

TLREWL XXXXXX (C nebo S). U všech tří knihoven byl proveden screening s elucí peptidu a testováním sondou s radioaktivně značeným monovalentním receptorem.

Pro screening'a' studia můťágenežě “býftakě pouzitpostůp „peptidy na plazmidech“, který se podrobněji popisuje v US patentu .9

No. 5,338,665, který se zde uvádí jako referenční. Podle tohoto způsobu se náhodné peptidy expresí ; z plazmidového vektoru.

• ·

- 23 v «*·» · · · · • · v · · » • · · · · « · · · · · 9

9 9 9 9 » ι> . * · nesoucího fuzní gen fuzují na C-konec Lacl. Dojde k připojení peptidů Lad na jeho kódující DNA pomocí sekvencí lacO na plazmidu za vytvoření stabilního komplexu peptid - Lacl - plazmid, který může být testován afinitním čištěním (panning) na imobilizovaném receptoru. s Takto izolované plazmidy mohou být potom znovu zavedeny do E. coli pomocí elektroporace pro amplifikaci vybrané populace pro další cykly screeningu nebo pro testování jednotlivých klonů.

Navíc byly prováděny studie mutageneze a screening náhodného peptidů s použitím modifikovaného C-koncového Lac-I io expresního systému, u kterého byla snížena expresní valence (systém typu „headpiece dimer“). Byl prováděn screening knihoven a výsledné inzerty DNA byly klonovány do vektoru maltózového vazebného proteinu (MBP), který dovolil jejich expresi jako C-koncového fuzního proteinu. Surové buněčné lyzáty z náhodně odpíchnutých jednotlivých fuzních klonů MBP byly potom testovány způsobem ELISA na vazbu k TPO-R jak bylo.popsáno výše.

Studie mutageneze peptidů byly také prováděny s použitím po [yzom ového systému jak se popisuje j/souvisej ící US patentové přihlášce No. 08/300,262, 2. 9. 1994, navazující na US patentovou

2o přihlášku No. 08/144,775 z 29. 10. 1993 a PCT WO 95/11992, které se zde uvádějí jako referenční. Byla vytvořena mutagenetická knihovna založená na sekvenci X X X X (C, P, R nebo S) 11 r e f I X X X X X X (C nebo S), kde X označuje náhodný kodon NNK a malá písmena představují kodony. aminokyselin obsahující mutagenezi

70:10:10:10v polohách 1 a 2 a K (G nebo T) v poloze 3 kodonu.

Byla provedena vazba technikou panning s pěti cykly na receptor TPO, který byl imobilizován na magnetických kuličkách. Po pátém cyklu bylo množství amplifikované PCR klonováno do pAFF6 a byly sekvenovány ELISA pozitivní klony. Sekvence byly subklonovány do vektoru MBP a pomocí MBP ELISA byly zjišťovány jejich vazebné afinity. ⁱ . . _; ·· ·♦»»

-24^v ·» *«

I · · · ·« ·* · ♦ ι * * i

Μ ··

Pro imobitizaci TPO-R pro screening polyzomů byla nejprve konjugována Ab 179 k tosylem aktivovaným magnetickým kuličkám (výrobek firmy Dynal Corporation) podle návodu výrobce. Kuličky byly inkubovány s protilátkou v 0,5 M borátovém pufru (pH 9,5) přes noc při pokojové teplotě. Potom byly kuličky promyty a spojeny s TPO-R obsahující konec „HPAP“. Kuličky potažené protilátkami a receptor byly inkubovány 1 hod při 4 °C a před přídavkem k polyzomové. knihovne byly kuličky promyty znovu, Screening různých výše popsaných knihoven poskytl peptidy vážící se na receptor TPO io ukázané v tabulkách 1 a 2 níže i další peptidy; které nejsou uvedeny.

'V «

► I *

- 25* ** ··*·

Tabulka 1

Peptid

REGPTLRQWM

REGPTLRQWM

SRGMTLREWL

EGPTLRGWLA

REGQTLKEWL

ERGPFWAKAC

R'E'G P'R'C V M W M ' ---***- ..........

CSGLTLREWLVC

CLTGPFVTQWLYEC

C.GEG.LTLTQWLEHC

CRAGPTLLEWLTLC

CRAGPTLLEWLTLC

CRQGPTLTAWLLEC

CADGPTLREWI SFC

CELVGPSLMSWLTC

CGTEGPTLSTWLDC

CDQLGVTLSRWLEC

SGTGLTLREWLGSFSLLS

CPEGPTLLQWLKRGYSSC

RGDGPTLSQWLYSLMIMC

MVAGPTLREFIASLPIHC

SMQGPTFREWVSMMKVLC ..

·· ·· » · · I

F · *· ·· 4 · i • · i

-26 v • · · · « · ► * k 4 » · · » · * ·

SVQCGPTLRQWLAARNHLS

GNAD6PTLRQWLEGRRPKN

SVRCGPTLRQWLAARTHLS............

LAIEGPTLRQWLHGNGRDT

HGRVGPTLREWKTQVATKK

CADGPTLREWISFC

1SDGPTLKEWLSVTRGAS

SIEGPTLREWLTSRTPHS

GNADGPTLRQWLEGRRPK.N

SIEGPTLREWLTSRTPHS

1 S D G PT.L.KE WLSVTRG AS

• 444 ·· 4444

• 4 .27♦ · 44 • 4 · · · • '6 4 Ο β

4i «4 4 4 *

Tabulka 2

Peptid

CSLEDLRKRC

CRRSELLERC

CTFKQFLDGC

CTRGEWLRCC

CTLRQWLQGC

CTLEELRACC

ΟΤΈΐΈΊΓΜΈΐΟ------------~

CQRADLINFC

CNRNDLLLFC

CTRTEWLHGC

CTLEFMNGC’

CSLGELRRLC -b *,'1—1*- —.· — - Μι»Ι**Ι''; 1l|* V * * ** *·“ > «1 · 1 ** ** * ***** UiJWÍM*··

CNINQLRS1C

CTMRQFLVCC

CTRSEWLERC'

CTLH EYLSGC

CTREELLRQC

CTFREFVNGC

CSRADFLAAC

CSCAQVVQCC

CTLRQWILLGMC

CTLREWLHGGFC

28' ·* *··*

CTLRAWLMSETC

CTLRAWLM ESCC

CTFQVWKLARNC

CLLREWLDXRTC

CVLREWLLXXSC

CLLSEFLAGQQC

CSLRQYLDFGLGSC

CTLGELKQSSLYEC

CDLSELKTH G YAY C

CKLSDWLMNGVAAC

CSLQEFLSHGGYVC

CSLKETLH.SG.LMQC

CTFRQLLEYGVSSC

CTM REF LVASGVAC <- —J -J. _ , B H*» RIMi' M. >«·Μ:·*-4 1 IMUih > «* (Γ· «W Illlϋ·ι|Ι -** * 4 ' «· K. 44»

CTLAEFLASGVEQC

CTLAEFLASGVEQC

CTLKEWLVSHEVWC

CTLREFLSLGMNAC

CTLREF LDPTTAVC

CSLLEFLALGVALC

GGGRGCTLKQWKQGDCGRS }

CNRSQLLAAC

CTLQQ WLSGC

CTLREFKAGC i -

00 ·· ··♦·

0 0 0 0 00 «0 0 0 • · 0

0 0

0 0 0 0

0 0 «0

CTRAQFLKGC

CTLREFNRGC

CTLSDFKRGC

CTF RQ WKEAC

CTLSEFRGGC

CTLQEFLEGC

CTLQQWKDGC

CTRSQWLEGC

CSÍQ,E'F'K'H’G'C*·“''------------------

CTLGEWKRGC

CTLWGCGKRGC

CTLQEWRGGC

C T R LS G C WLC

CTRTQWLLDC . . * . — ' * .» -T _ . . >** s—i**. r ,-u, . ' ,, j — milí» .X/ . Ifcn» Hť --1WUS nu

CTLAEFRRGC

CTSTQWLLAC

CSRSQFLRSC

CTLREWLEGC

CTLREFLLMGAC

CTLKEWLLWSSC

CTLLEWLRNPVC

CTLRQ WLG D AWC

CTLGQWLQMGMC

CTLRE.WVFAGLC -?v,

····

·· ♦· • β · • * β * · · · • · · fl flfl flfl ·« ·· fl flfl fl t fl fl· fl·*'· · flfl » • flfl

SNSRCTLREWIIQGCDFS

CLGCTLSQWRKRTRCDTH

YRGCSRAQLLGGECRKK

GRGCTLKQWKQGDCGRS

VR.GGC.ALRDWVAGE.CFDWT

L W R G C T L N G F K S R H C G S P E

CTLRSWKHRGCAP

GRGCTRAQWLAGCCTGH

RAGCTLREFRKGCLAL

KRGSTLAEMIRGCNRSN

GRGCTLKQWKQGDCGRS

RWRGC S.L A KL KK.G AAC G R G

R G G C T L R E W R R V R V I N

G.R G CJAX.Q.W.K Q G D C G RS._ , _______ _

RYGCTRHQWLVGTCVRH

Hodnoty IC₅o pro některé další příklady peptidů se uvádějí v další tabulce, Pro zjištění hodnot ICso je možno použít různých metod. Pro zjištění, jestli peptidy inhibují vazbu TPO na extracelulární doménu receptoru TPO, byla použita například metoda ELISA s rovnovážnou vazbou s použitím stopovací látky buď MBP-TPO nebo lacl-peptid. Typicky byly hodnoty IC₅o určovány s použitím volného peptidů. Hodnota ICso může být stanovena s použitím volného peptidů, který může být popřípadě amidován na C-konci nebo může být připraven jako ester nebo jiný karboxyamid.

-32···· · • ·♦ »· ··»» ·· ·· • · · · * · e « v a · · · · * »1 ·· *♦·· · • · · · « · *

Pro obnovení přesné sekvence vytvořené na fágu se Nkoncovým a C-koncovým aminokyselinám syntetických peptidů často předřazují jeden nebo dva glycinové zbytky. Předpokládá se, že tyto glyciny nejsou nezbytné pro vazbu nebo aktivitu. Podobně se pro

- napodobení přesné sekvence peptidů vytvořených na polyžomech předřazuje C-koncovým aminokyselinám syntetických peptidů sekvence MAS. Opět se předpokládá, že sekvence není nutné pro vazbu nebo aktivitu.

Hodnoty ICso se symbolicky označují symboly „+“ a io Například peptidy s hodnotami IC₅o vyššími než 200 μΜ se označují jako Peotiriy jsLJiqdnQtonoOC^njneažú^ označují jako „+“ a peptidy s hodnotami IC_S0 menšími než 500 nM se označují jako Peptidy s hodnotami IC50 v blízkosti rozhraní těchto symbolů se označují hybridním označením, např. Peptidy, u kterých nebyly hodnoty IC₅₀ stanoveny, se označují jako „N. D.“, Hodnota, ICso pro peptidy se strukturou: GGCTLREWLHGGFC G G byla 500 nM nebo méně. (Je třeba uvést, že N-koncovým a Ckoncovým aminokyselinám předcházely dva glyciny pro obnovené

“. lili ifliii !>»».,. l«iHI«m i HUI'm|iH ) BII | i MWI i.il W· -» n I ||i«P>· tp, w — ***« K «r·'· —**»' r- r -v · · np přesné sekvence vytvořené fágem. U těchto glycinů se předpokládá, že nejsou nutné pro vazbu nebo aktivitu.

’V *a »* • * · · · · a • · · · ♦ ···» • a · · a «· ♦ · a a · • · · ··*· · ·

- 33 »··· « • ··

Tabulka 3

Peptid	Afinita
GGCADGPTLREWISFCGG	++
GNADGPTLRQWLEGRRPKN	++
GGCADGPTLREWISFCGGK	++
TIKGPJLRQWLKSREHTS
GPTLRQWL	-
LAIEGPTLRQWLHGNGRDT	++
S I E G PTL R E W LT S R T P H S	++

Tabulky výše, zejména tabulka 3 ukazuje, že výhodný peptid jádra obsahuje sekvenci aminokyselin:

s X, X₂ X₃ X₄ X₅ X_s X₇ kde Xi znamená C, L, Μ, P, Q, V; X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, . φ- · · W -|·· n*· ·♦ W, *, + - * M- *· ‘· I*·· - — < *-><*!* iWt**** <*<!»>< »<,. HUHl nlWI* *<-“--«# V Ji r.« *I»'W

S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin: X₅ znamená A, D, E, G, K,

M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a io X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V,

Ve výhodném provedení obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:

X₃ G X, X₂ X₃ X₄ X_s W X₇ kde Xi znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo T;

X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S, V, nebo T;

X₅ znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; Xy znamená C, I, K, L, M nebo V; a každý ze zbytků X₃ je nezávisle na sobě zvolen z 20 ’ i ·?·»- ή geneticky kódovaných/ L-aminokyselin? .jejich stereoizqmerníchrD-:' »9 »« * «9 fc * · » a 9 t «I fc fcfc · «fcfcfc

9 fc 9 fc fc fc 99 O % 9 • fc fc fc fc fc fc fcfcfc ·· fcfcfc- fcfc ·· *· fc»

- 34 «««fc • fc »·»· aminokyselin a nepřírodních aminokyselin. S výhodou je každý zbytek X₈ nezávisle zvolen z jakýchkoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin a jejich stereoizomerních D-aminokyselin. Ve výhodném provedení Χ_Ί znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená

R; X₅ znamená E nebo Q; a X₇ znamená I nebo L.

Výhodněji obsahuje jádro peptidu sekvenci aminokyselin:

X₉ X₈ G Xi X₂ X₃ X₄ X_s W X₇ kde X₉ znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V; a X₈ znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V. Výhodněji je skupina X₉ io A nebo I; a X₈ znamená D, E, nebo K.

Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCADGPTLREWISF CGG;GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWlSFCGGKiTIKGPTLRQWLKSREHTS; S I E G PT L R E WLT S RT P H S; LAI E G P T L R Q WLH G N G R D

T;CA D G P TLR E WI S FC;alÉGPTLRQWLAARA.

V dalším provedení vynálezu zahrnují výhodné peptidy pro použití v rámci předkládaného vynálezu^ peptidy se strukturou jádra obsahující sekvenci aminokyselin:

C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ kdeX₂ znamená“ΚΓCTN7Q! ?R7STTnebóVfX₃zňamena“C“'F?I77

L, M, R, S nebo V; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných Laminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆ znamená C, F,

G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V. Ve výhodnějším provedení znamená X₄ A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R, S, T nebo W. V dalším provedení X₂ je S nebo T; X₃ je L nebo R; X₄ je R;

. Xs je D, E, nebo G;.X₈ je F, L, nebo W; a X₇ je I, K, L, ,R, nebo V.

Zvláště výhodnými peptidy jsou: GGCTLREWLHGGFCGG.

V dalším provedení jsou výhodnými peptidy pro použití v rámci i: ^předkládaného vynálezu peptidy. se' strukturou obsahující sekvenci' - J

3o aminokyselin:

< '^!• · ·♦· · » * · » · ·

I · 4 « · « β ···· • · i · • · ·* ·

-35X₈ C X₂ X₃ X₄ Xg Xs X?

kde X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F,

I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L. , aminokyselin; X_g je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ je C, F, .

5. G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ je C, G, I, K, L, Μ, N, R, nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin. V některých _t provedeních je X₈ s výhodou G, S, Y, nebo R.

•

Peptidy a peptidy napodobující látky s ICso větší než přibližně ^s 100 mM mají nedostatečnou vazbu pro umožnění buď při diagnostice io nebo pro terapeutické účely podle vynálezu. Pro diagnostické účely ; mají s výhoaou peptidy a pepuoy napoaoDUjici laiKy lUgo priDiizne 2 ' mM nebo menší a pro farmaceutické účely mají peptidy a peptidy napodobující látky ICso přibližně 100 μΜ nebo menší.

Sekvence vazebného peptidu také poskytuje způsob pro 15 stanovení minimální- velikosti vazebné sloučeniny TPO-R podle vynálezu. Použitím systému „kódované syntetické knihovny“ (ESL) nebo systém „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ je . — - možnoTiejen stanovit minimálníVělikosfpeptidú V tóuto*aktivitóuTálě také vyrobit všechny peptidy tvořící skupinu peptidů odlišných od výhodného motivu (nebo minimální velikosti tohoto motivu) v jednom, _ — dyou-TíeĎo-víČě-žbytčíčhrPotom'muže* byť proveden TcTeeňing' tohoto ‘ souboru peptidů na schopnost vazby na receptor TPO. Tyto systémy \ syntézy (mobilizovaných polymerů nebo další způsoby syntézy peptidů mohou být také použity pro syntézu kmenových analogů, delečních analogů, substitučních analogů a jejich kombinací všech peptidových sloučenin podle vynálezu.

Peptidy a peptidy napodobující látky podle předkládaného vynálezu byly také testovány v testu trombopoetin dependentní buněčné proliferace, jak se podrobněji popisuje v příkladu 2 níže.

-.Buněčná proliferace se Vměří: v*oboru známými způsoby, jako-jě · *’ ; « · ·· , i . ' ' ·¹ \ ¹ ‘ ·* stanovení MTT, které koreluje s inkorporací ³H-thymidinu jako • φ φφ φφφφ φφφφ φ φ φ φφφφ φφφ φ φ ·Φ • φ φ φ φφφφ « φφφφ |φ φ Φ «φ φφ φ» ·*

-36indikátoru buněčné proliferace (viz Mossmann, J. Immunol. Methods,

65: 55 (1983). Testované peptidy stimulovaly proliferaci TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3 v závislosti na dávce, jak je ukázáno na obr. 1A. Tyto peptidy nemají žádný účinek na rodičovskou buněčnou linii, jak je vidět v obr. 1B.

Obr, 7 až 9 ukazují výsledky dalšího testu vyhodnocujícího aktivitu peptidu a peptidy napodobujících látek podle vynálezu.

V tomto testu se pomocí karboplatiny vytvoří trombocytopenické myši.

Obr. 7 ukazuje typické výsledky při podání karboplatiny myši Balb/C io (125 mg/kg intraperitoneálně) v den 0. Čárkované přímky představují

-Reeěe*š®P.'á-''!-zv?rata ...so·..tří experimentuj——ěá+y—kárboplatinou ošetřené skupiny ve třech experimentech. Silné plné čáry ukazují historické údaje. . Obr. 8 zobrazuje účinek titrace karboplatiny na počty krevních destiček u myši, ošetřené uvedenými dávkami karboplatiny (v mg/kg, intraperitoneálně (íp), v den 0). Obr. 9 ukazuje odstranění kárboplatinou indukované trombocytopenie v den 10 peptidem AF12523 (513). Karboplatina (CBP; 50 - 125 mg/kg, ^ intraperitoneálně) byla podána v den 0. Peptid AF 12513 (1 mg/kg, ip)~____ byl podáván ve dnech 1 až 9. Tyto výsledky ukazují, že peptidy podle

2o vynálezu mohou v myším modelu zlepšovat trombocytopenii.

,———Určité-peptidy-podle-předkládaného-vynálezu-mohou-být- navíc-----------— dimerizovány nebo oligomerizovány a tím může být zvýšena jejich afinita a/nebo aktivita. Pro výzkum účinku, který má dimerizace/oligomerizace peptidů na TPO mimetickou schopnost v testech buněčné proliferace byl syntetizován na C-konci biotinylovaný analog peptidu GGCADGPTLREWISFCGG (GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin)). Peptid byl předem inkubován se streptavidinem v bezsérovém HEPES - pufrovaném RPMI v molárním poměru 4 : 1. Komplex byl testován na stimulaci .buněčné, proliferace TPO-R transfekovaných buněk. Ba/F3, jak bylo = - uvedeno výše^ spolu .'S- volným biotinylovaným; . peptidem, a ^; ; >

- 37 nebiotinylovaným rodičovským peptidem. Obr. 2A ukazuje výsledky testu pro komplexní bíotínylovaný peptid (AF 12885 se streptavidinem (SA) jak pro transfekované, tak i rodičovské buněčné linie. Obr. 28 ukazuje výsledky testu pro volný bíotínylovaný peptid (AF 12285) jak pro transfekované, tak i pro rodičovské buněčné linie. Obr. 2C ukazuje výsledky testu pro samotný streptavidin jak pro transfekované, tak i rodičovské buněčné linie. Tyto obrázky ukazují, že předem vytvořený komplex hyl přibližně 10 x účinnější, než volný peptid.

Specificita vazby a aktivity peptidu podle vynálezu byla io testována rovněž studiem křížové reaktivity peptidů pro ervtr_qo,o,etinov-ý recentnr (FPH-F) fpd.r _i.a—také člen rodiny · hematopoetinového receptoru růstového faktoru, jako je TPO-R. Peptidy podle vynálezu stejně jako TPO, EPO a známý EPO-vazebný peptid byly testovány v testu buněčné proliferace s použitím EPO15 dependentní buněčné linie. Tento test používá FDCP-1, buněčné linie myších multipotenciálních primitivních hematopoetických prekurzorových buněk, dependentních na růstový faktor (viz např. Dexter a další, J. Exp, Med., 152jJ036~-J0£7 (1981), jako rodičovské... buněčné linie. Tato buněčná linie může proliferovat, ale není schopna diferenciace, pokud roste v WEHI-3-kondicionovaném médiu (médium obsahující IL-3, ATCC No_L TW68). Rodičovská buněčná linie je trarišfekována lidským nebo myším EPO-R za vytvoření buněčné linie FDCP-1-EPO-R. Transfekované buněčné linie mohou proliferovat, ale v přítomnosti lidského nebo myšího EPO se nemohou diferencovat.

Buňky rostly v přítomnosti nutných růstových faktorů do poloviční hustoty ve stacionární fázi. Buňky byly potom promyty v PBS a hladověly 16 až 24 hodin v úplném médiu bez růstových faktorů. Po stanovení počtu životaschopných buněk byly vytvořeny zásobní roztoky (v úplném médiu bez růstových faktorů) s koncentrací přibližně

3o . 105_; buněk, na 50 μΙ. V 96-jamkových destičkách pro tkáňovou kultivaci . v 'sě; připraví sériová ředění testovaných-sloučenin, typický volnýďoztok · i

peptidu proti na fág navázanému nebo jiným způsobem navázanému nebo imobilizovanému peptidu, na konečný objem 50 μΙ na jamku. Do každé jamky se přidají buňky (50 μΙ) a inkubují se 24 až 48 hodin, přičemž v tomto okamžiku by měly negativní kontroly zahynout nebo s být v klidovém stavu. V oboru známými způsoby, jako je test MTT, se pak měří buněčná proliferace.

Obr. 3A - G ukazují výsledky série kontrolních experimentů ukazujících aktivitu TPO, peptidů podle předkládaného vynálezu, EPO a EPO-R vazebných peptidů v testu buněčné proliferace s použitím io buď TPO-R transfekované buněčné linie Ba/F3 a jí odpovídající ,, rodičovské Íinje n&bQ EPQr-depgndentPÍ bÍÍněčné linie a jí, odpovídající.

rodičovské linie. Obr. 3A zobrazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím TPO-R transfekované buněčné linie Ba/F3 a jí odpovídající rodičovské linie. Obr. 3B ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím TPO-transfekované buněčné linie Ba/F3 a odpovídající rodičovské linie. Obr. 3C ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný peptid (AF 12285 se streptavidinem (SA) _ ajtomplexní formu biotinylovaného EPO-R^ vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v TPO-R transfekované buněčné linii Ba/F3. Výsledky pro . odpovídající rodičovskou buněčnou linii jsou uvedeny v obr. 3D. Obr, 3E ukazuje výsledky ρω TPO v Jestu buněčné_ proliferace s použitím EPO-dependentní'buněčné linie. Obr. 3F ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3G ukazuje výsledky pro komplexní biotinylovaný

2s peptid (AF 12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formou biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v EPOdependentní buněčné linii. Tyto výsledky ukazují, že peptidy podle vynálezu se váží a aktivují TPO-R s vysokým stupněm specificity.

B ·

- 39 IV. Příprava peptidů a peptid napodobujících látek

A. Syntéza na pevné fázi

Peptidy podle vynálezu mohou být připraveny klasickými v oboru známými postupy, například použití standardních metod syntézy na pevné fázi. Standardní způsoby zahrnují syntézy prováděné výlučně na pevné fázi, způsoby syntézy prováděné < částečně na pevné fázi, kondenzaci fragmentů, klasickou syntézu z roztoků a dokonce i rekombinantní technologii DNA (viz například ^v Merrifield, J. Am. Chem. Soc,, 85: 2149 (1963). Na pevné fázi se ·» io syntéza typicky provádí od C-konce peptidu s použitím alfa-amíno cnranene pryskyřice, vhodné výchozí materiály túiihbU být například připraveny připojením požadované alfa-amino kyseliny na chloromethylovanou pryskyřici, hydroxymethylovou pryskyřici nebo benzhydrylaminovou pryskyřici. Jedna taková chloromethylovaná pryskyřice se dodává pod obchodním názvem BIO-BEADS SX-1, firma Bio Rad Laboratories, Richmond, CA a příprava hydroxymethylové pryskyřice se popisuje v Bodonszky a další, Chem. Ind,, (Londýn) 38:

------ 1597-(-1966). Benzhydrylaminová (BHA) pryskyřice-byla . popsána_ v Pietta a Marshail, Chem. Commn. 650 (1970) a je komerčně dostupná ve formě hydrochloridu u firmy Beckman Instruments, lne., -----------------Palo-Alto-CA^—--------------------------------—.----;----------------Sloučeniny podle vynálezu mohou být tedy připraveny λ navázáním alfa-amino chráněné aminokyseliny na chloromethylovanou pryskyřici s pomocí například katalyzátoru hydrogenuhličitanu česného způsobem popsaným v Gisin, Helv, Chim. Acta.. 56: 1467 (1973). Po počáteční vazbě se alfa-amino ochranná skupina odstraní reagencií zvolenou z roztoků kyseliny trifluoroctové (TFA) nebo chlorovodíkové (HCI) v organických rozpouštědlech při pokojové teplotě.

:.:, / : í ; u 30 - Alfa-amino ochranné ' skupiny jsou ‘ skupiny. známéř jako” ;

použitelné při postupné syntéze peptidů. Patří sem ochranné skupiny • · · · • I ··*»

-40acylového typu (například formyl, trifluoroacetyl, acetyi), aromatické ochranné skupiny urethanového typu (například benzyloxykarboyl (Cbz) a substituovaný Cbz), alifatické urethanové ochranné skupiny (například t-butyloxykarbonyl , (Boc), izopropyloxykarbonyl, s cyklohexyloxykarbonyl) a ochranné skupiny alkylového typu (například benzyl, trifenylmethyl). Výhodnými ochrannými skupinami jsou Boc a Fmoc. Ochranná skupina postranního řetězce zůstává v průběhu vazby intaktní a neodštěpuje se během odstraňování ochranných skupin chránících koncové aminoskupiny nebo v průběhu vazby.

Ochranné skupiny postranního řetězce musí být odstranitelné po ukončení syntézy konečného peptidu a za takových reakčních podmínek, které nebudou měnit konečný peptid.

Ochranné skupiny postranního řetězce pro Tyr zahrnují tetrahydropyranyi, terc.-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz a 2,515 dichlorbenzyl. Ochranné skupiny postranního řetězce pro Asp zahrnují benzyl, 2,6-dichlorbenzyl, methyl, ethyl a cyklohexyl. Ochranné skupiny postranního řetězce pro Thr a Ser zahrnují acetyi, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyi, benzyl, 2,6-dichlorbenzyl a Cbz. Ochrannou skupinou postranního řetězce pro Thr a Ser je benzyl. Ochrannými skupinami postranních řetězců pro Arg jsou nitro, tosyt (Tos), Cbz, . adamantyloxykarbonyl, mezitoylsulfonyl (Mts) nebo Boc. Ochranné skupiny postranních řetězců' pro Lýs zahrnují Cbz, 2chlorobenzyloxykarbonyí (2-CI-Cbz), 2-bromobenzyloxykarbonyi (2BrCbz), Tos, nebo Boc.

Po odstranění alfa-aminové ochranné skupiny postupně reagují zbývající chráněné aminokyseliny v požadovaném pořadí. Obvykle se používá spolu s vhodným aktivátorem karboxylové skupiny, jako je dicyklohexylkarbodiimid (DCC), přebytek každé chráněné aminokyseliny v roztoku například methylenchloridu (CH₂CI₂),

30. dimethylformamidu (DMF). . * _;í - „ « · • · * ·· • « ··· * · **· · · · * · * ·

..· ...........

-41Po ukončení syntézy požadované sekvence aminokyselin se požadovaný peptid odštěpí z pryskyřičného nosiče působením reagencie jako je kyselina trifluoroctová nebo fluorovodík (HF), které . nejen odštěpí peptid z pryskyřice, ale odštěpí i zbývající ochranné ... 5 skupiny postranního řetězce. Jestliže se použije chloromethylované pryskyřice, použitím fluorovodíku vzniknou volné kyseliny peptidu. Jestliže se použije benzhydrylaminové pryskyřice, působením , fluorovodíkem přímo vznikne amid volného peptidu. Alternativně při použití chloromethylované pryskyřice může být peptid s chráněným postranním řetězcem odštěpen působením amoniaku na pryskyřici s navázaným peotidem za poskytnutí požadovaného amidu s chráněným postranním řetězcem nebo působením alkylaminu za vzniku alkylamidu nebo dialkylamidu s chráněným postranním řetězcem. Ochranné skupiny postranního řetězce se potom odstraňují is obvyklým způsobem použitím fluorovodíku za vzniku volných amidů, alkylamidů nebo dialkylamidů.

Postupy syntézy peptidů na pevné fázi, které se uvádějí výše _________jsou v oboru,známy, a dále se.popisují v Stewart Solid Phase Peptide_____

Syntheses (Freeman and Co., San Francisco (1969).

Použitím „kódované syntetické knihovny“ nebo „syntézy velmi rozsáhlého imobilizovaného polymeru“ popisovaných v US patentové přihlášce No. 07/492,462, 7. 3. 1990; 07/624,120, 6. 12. 1990; a

07/805,727, 6. 12. 1991, je možno nejen stanovit minimální velikost • peptidu s danou aktivitou, ale je také možno připravit všechny peptidy

2s vytvářející skupinu peptidů odlišných od výhodného motivu (nebo minimální velikosti tohoto motivu) v jednom, dvou nebo více zbytcích. Tento soubor peptidů je potom možno testovat na schopnost vazby k TPO-R. Tento systém syntézy imobilizovaného polymeru nebo jiné způsoby syntézy peptidů mohou být také použity pro syntézu ^zkrácených analogů a delečních analogů a kombinací zkrácených a λ ι····.· :' dělečních analogů všech peptidových sloučenin podle vynálezu. -:

Té /'á η v ¢,' * ·, .·<Γ' η- ΰÝ, ¢, · O'W γ· t'

-42 10 ^ί? Β ? Syntetické ani inokýsélihý^t‘ⁿ^ ρνττ Α, τκ',Τ ,·» ;·*.· j ^r-vfvíví py?*rt|4_k '«/I fairt-ty'- .o ·;·· * ·, ' «\ .

Tyto^: postupy mohou'být také použitý pro syntézu' peptidu,

-ό·η;·ι ~.ó; r t-’’*:v7·’· ··. ^Tv~ h'. »· ί^Λ,··^ *λ u kterých jsou sloučeniny podle vynálezu substituovány v jedné, dvou _f ..ntjfv ··«,·♦,-*· tvií-ťj)’»-:! .r{W’'íp''’ffré^l«t^1,J ' jφ V' ů· jiThí Jnebo více polohách aminokyselinami jinými než je dvacet v přírodě se ·.·.·;.* i.· rr '·*1 <ϊϊ ·<γ. '··*·«. -rfiibo vyskytujících geneticky kódovaných, aminokyselin. Například pro ’ .·irv nv r ? w *·« usnadnění syntézy může být tryptofan substituován za naftylalanin. Jiné 'syntetické ámÍhókyšělíhýAkteřě’^f moBodf být⁷¹ substituovány^do peptidu podle/předkládaného* vynálezu;' zahrnují? C-hydróxýpřopyí/ L3,4-dihýdroxyfenylaÍariyÍ, d-ařninOkyselihy· jákó- L-d-hýdróxýlyzýl ^a Dd^methýíálányI, L-a-methylalaňýlí^! b-aminokýšeliny, izdchínoíyí.^ Db

....

ÍpApliriix pAHlé přAfUdádAOÁhgJyýnalpy^mAhffiÍ hýí také ‘aminokyseliny a'^í!šyntétické aminokyseliny, které se . nevyskytují .a /ŠA*·' ií i?, r ,1 i .· ' Λ f.. ΐ'3Ο v pří rodě Jdov vyj*:

*'Λ ‘Jě^t:řnóznb^náhVádit v ^přírodě? se* Vyskytující ••‘pOStranhí’· řěťězcě dvaceti genetický kódovaných- aminokyselin (nebo' ^aminokyselin) ^jinými poštránnímrrětěžčir'hapříkiad ákupíhaiWjákb je alkyl, nižší “alkyl,* cyklický í4<^5-řn · 6-^áž* 7-členný - alkylů amid nižšího alkylu;

a·’. '7' e i (Va trnvt/ t ^diálIčýl-amid^obs-árfújičUxížěí^áikylr^ňižšMálkoxyii.-hydfóxy.-^karboxy^ajejicí?^ nižší- 'esterové^ deriváty,^y a^ 4-, 5-, 6- až 7- člennými heterocyklickými skupinami. Použity mohou být zvláště analogy

- prolinu, ve kterých je 5- členný kruh prolinu změněn na 4-, 6- nebo 7.ů.-.ngifscuve .íHO:?.íd. λ. ................

- členný jkruhf Čyklické skupiny mohou být nasycené nebo nenasycené '··* flbftret ?.*· — -v i,». r,ít· “^,!i fy,·f f* Ή ·· a jestliže jsou henasycéne/mohou byť aromatické nebó nearoniaticke.

vytvófení JtátíA ” r;·⁴· · --^yr·

- Cyklické skupiny mohou být nasycené nebo nenasycené, jestliže pOXaqOVťřiym! tzoiw.$»d<y₍iii i y )i, ’ i ' , „ jsou nenasycené, , mohou být aromatické nebo nearomatické. ^e.i5)uO3A!-Ta, e«i9 /'/ho** *·

Heterocyklické skupiny s výhodou obsahují jeden nebo více íO :4*0· Η.» 'Mi ' f heteroatomú dusíku,, kyslíku a/nebo síry. Příklady takových skupin ··’ U ’ !’.K ' $ jr ' J f, . ' - \ zahrnují furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, · ' í¹' V ii,. * izothiazolyl, . izoxazoiyi, , morfolinyl (např. morfolino), oxazolyl, piperažinyl (najař.1 -piperazinyl),. piperidyl :.(napčA 1 -piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl,

V ? i i * m. » _# ta A ,W é 1^ f* . jp -4 i ¹ ? J W y J ta '¹ * , v £

A.

ο ο ·

• i’ • * ···· • · • a α • · ♦ • ♦ · »· 99 pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolídinyl (např. 1 -pyrroíidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, thiadiazolyl, thiazolyl, thienyl, thiomorfolinyl (např. thiomorfolino) a triazolyl. Tyto heterocyklické skupiny mohou být substituované nebo nesubstituované. Kde je skupina substituovaná, může být substituentem alkyl, alkoxy, halogen, kyslík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný fenyl.

Je možno také snadno modifikovat peptidy podle předkládaného vynálezu fosforylací a dalšími způsoby přípravy peptidových derivátů sloučenin podle předkládaného vynálezu, jak se popisuje v Hrubý a io další⁴². Peptidové sloučeniny podle vynálezu tedy slouží také jako základ pro přípravu peptidy napodobujících látek s podobnou biologickou účinností.

Peptidové sloučeniny podle vynálezu včetně peptidy napodobujících sloučenin mohou být kovalentně modifikovány na is jeden nebo více z řady neproteinových polymerů, například polyethylenglykol, polypropylenglykol nebo polyoxyaikeny, způsobem uvedeným v US patentu No. 4,640,835; US patentu No. 4,496,689; US patentu No. 4,301,144; US patentu No. 4,670,417; US patentu No.

4,791,192 nebo US patentu No. 4,179,337.

C. Koncové modifikace

Odborníkům v oboru je známo, že je dostupná řada způsobů pro vytváření peptid napodobujících látek se stejnými nebo podobnými požadovanými biologickými účinky jako je odpovídající peptidové 25 sloučenina, ale s výhodnější aktivitou než má peptid s ohledem na rozpustnost, stabilitu a vnímavost k hydrolýze a proteolýze (viz například Morgan a 'Gainóř, Ánn, Řep, Med. Chem.. 24: 243 - 252 (1989). V následující části se popisují způsoby výroby peptidy napodobujících látek modifikovaných na N-koncové aminoskupině, C3Ó í/íkóncové^ karboxylové ť skupině :a/nebó \ změnou? jedné f nebo; více amidových vazeb v peptidů na vazby neamidové. Je jasné, že v jedné peptid napodobující struktuře může být spojeno více takových modifikací (např. modifikace C-koncové karboxylové skupiny a zahrnutí -CH₂-karbamátové vazby mezi dvě aminokyseliny v peptidu).

s 1. Modifikace na N-konci

Peptidy se typicky syntetizují jako volné kyseliny, ale jak je . uvedeno výše, mohou být snadno připraveny jako amid nebo ester. Je také možno modifikovat aminový a/nebo karboxylový konec cectidcvvch sloučenin oodle uvnáiezu za wtvoření iinvch sloučenin io podle vynálezu. Modifikace aminového konce zahrnují methylaci (tj. -NHCH₃ nebo -NH(CH₃)₂), acetylaci, navázání karbobenzoylové skupiny nebo blokování aminového konce jakoukoliv blokovací skupinou obsahující karboxylátovou funkční skupinu definovanou vzorcem RCOO-, kde R je zvoleno ze skupiny naftyl, akridinyl, steroidyl a podobných skupin. Modifikace karboxylového konce zahrnují náhradu volné, kyseliny karboxamidovou skupinou nebo vytvoření cyklického laktamu na karboxylovém konci pro zavedení ” ’'spojených struktur molekul; ~ ™ —----- — . ,

Modifikace aminového konce jsou jak se uvádí výše a zahrnují alkylaci, acetylaci, přídavek karbobenzoylové skupiny, vytvoření sukcinimidové skupiny apod. Konkrétně může reagovat N-koncová aminoskupina následujícím způsobem:

(a) za vytvoření amidové skupiny vzorce RC(O)NH-, kde R je jak definováno výše, reakcí s halogenidem kyseliny (například RC(O)Cl) nebo anhydridem kyseliny. Typicky je možno reakci provádět uvedením do styku přibližně ekvimolárních množství nebo nadbytku (například přibližně 5 ekvivalentů) halogenidu kyseliny s peptidem v inertním rozpouštědle (například dichlormethanu), s výhodou obsahujícího přebytek (například 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jáko^ť,^; je ďiizopropylethylamin, pro -vychytávání kyseliny vytvůřené v průběhu reakce. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (například • 44«

-45 4 * ·

« · * ·

« · ”· ·

4« *1* · »· • 4 · · • 4 44

4 » 4 • · 4

4 4 4 pokojová teplota po dobu 30 minut). Alkylace terminální aminoskupiny za vytvoření substituce aminové skupiny nižším alkylem následovaná reakcí s halogenidem kyseliny jak je popsáno výše bude poskytovat Nalkylamidovou skupinu vzorce RC(O)NR-;

(b) za vytvoření sukcinimidové skupiny reakcí s anhydridem kyseliny jantarové. Jak bylo uvedeno dříve, přibližně ekvimolární množství nebo přebytek (např. přibližně 5 ekvivalentů) anhydridu kyseliny jantarové je možno použít a přeměnit aminovou skupinu na < sukcinimid v oboru známými způsoby včetně použití přebytku (např.

io 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethylamin ve

—. . ΠΠ,., , —whndnAm inprfním rnrnni ištědlft (např dichlormethan). Qdkazv ie.

možno nalézt například v Wollenberg a další, US patent No. 4,612,132. Je třeba rozumět, že sukcinátová skupina může být substituována například C₂-C₆ alkylovými nebo -SR substituenty, které se připravují běžným způsobem, za poskytnutí substituovaného sukcinimidu na N-konci'peptidů. Takové atkylové substituenty se připravují reakcí nižšího olefinu (C₂-C₆) s anhydridem kyseliny r maleinové způsobem popisovaným v publikaci Wollenberg a další, výše a substituenty -SR se připravují reakcí RSH s anhydridem r kyseliny maleinové, kde R je skupina jak byla definována výše;

(c) za vytvoření skupiny benzyloxykarbonyl-NH- nebo substituované skupiny benzyloxykarbonyl-NH- reakcí s přibližně ekvivalentním množstvím nebo s přebytkem sloučeniny CBZ-CI (tj. benzyloxykarbonylchlorid) nebo substituovanou sloučeninou CBZ-CI ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan) s výhodou obsahujícím terciární amin pro zachycení kyseliny vytvořené v průběhu reakce;

(d) za vytvoření sulfonamidové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo přebytkem (například 5 ekvivalentů) sloučeniny ; :: 30. j. R-S(Q)₂CI ve_;.vhodném. inertním, rozpouštědle (dichlormethan) φτοΛ , ·,..., , : převedení koncového^ aminu na sulfonamid; kde skupina R je jak

0 « 0

0 00

0 0 0

0 0

0^p

0 • 0

-46««V v

00 • 0

0

0 «0· «

ť> 0 0

i.

definována výše. S výhodou obsahuje inertní rozpouštědlo přebytek terciárního aminu (například 10 ekvivalentů) jako například diizopropylethyiamin pro zachycení vytvořené kyseliny. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (pokojová teplota, 30 min);

s (e) za vytvoření karbamátové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo nadbytkem (např. 5 ekvivalentů) sloučeniny R-OC(O)Cl nebo R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂ ve vhodném inertním rozpouštědle (např. dichlormethan) pro přeměnu koncového aminu na karbamát, kde skupina R je jak definována výše. Inertní rozpouštědlo io obsahuje s výhodou přebytek (přibližně 10 ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethyiamin, pro zachycení kyseliny vytvořené při reakci. Reakční podmínky jsou jinak obvyklé (například pokojová teplota, 30 minut); a (f) za vytvoření močovinové skupiny reakcí s ekvivalentním množstvím nebo přebytkem (například 5 ekvivalentů) sloučeniny r-N=C=Q ve vhodném inertním rozpouštědle (například dichlormethan) pro přeměnu koncového aminu na močovinovou (tj. skupinu RNHC(O)NH-), kde R~je*Jak_ definováno _výše. Inertm rozpouštědlo obsahuje s výhodou přebytek (například přibližně 10

2o ekvivalentů) terciárního aminu, jako je diizopropylethyiamin. Reakční podmínky jsou jinak normální (například pokojová teplota po dobu přibližně 30 minut). *

2. Modifikace C-konce

Při přípravě peptidy napodobujících látek, u kterých je Ckoncová karboxylové skupina nahrazena esterem (tj. -C(O)OR, kde R je jak definováno výše) se používá pryskyřic používaných pro přípravu peptidových kyselin, přičemž postranní řetězec chráněného peptidu se štěpí bází a vhodným alkoholem (například methanolem). Ochranné ^? V»} skupiny,postranního řetězce, se >p,otom: odstraní obvyklým, způsobem ; působením fluorovodíku za získání požadovaného esteru.

ÍUf -f 4 »C ·*· C 2, v C λ 1 »' :-·«> *1? & c * c- c ,r c *c, a * · * .* t <’¹ *· ·*· p· · frč · . í ϊ ί>^,: -:u n>

_c r, fc fc r, fcr »ň ' k' ji 4« i*| •V tlé' ·-trPřít přípravě2-peptid j nápodobujících látek, .. kde C-koncová •karboxylová. skupina’je;nahrazena amidem -C(O)NR³R⁴;,se jako pevný :nosič pro.syntézu peptidů*použije benzhydrylaminová pryskyřice. Po ukončení «syntézy, vede; působení; fluorovodíku pro uvolnění peptidů ^5 z nosiče přímo k volnému .amidu peptidů (tj. na C-konci je skupina -C(O)NH₂). Alternativně vzniká při použití chloromethylované pryskyřice při syntéze peptidů ve spojení s reakcí s amoniakem pro odštěpení^jpeptidů)š/chřáněným postranním řetězcem^ nosiče ívolný ; amid >peptidů) a/řéákčí ^rs álkylámihém jnebo^dialkylámineřn /vzniká io ^áikylámídMÍébó’ óialkyiamicf (tj?-?n2hO*k'onči^! je^škupinač- G(Q)NRR 5kde •R a RVjšóu jak děfihóvánofvýšé) šíčhráněným/póštránním 'řetězcem.

Ochranné skupiny z postranního řetězce- se · potom ‘odstraní obvyklým způsobem ^použitírh* -fluorovodíku^za·^póškyťnůtí^voiných ^r amidů, alkylámidů^neboídiálkýlamidů.'-^^ . '^íň ' ύ&η/ν? Z-'cr’ > / 'Τύ

V dalším alternativním- provedeni muže být indukovaná.·.··' ’ <,-·' Λ hsří.wih’?·'.*;. . _t.p..··? ¹ „v,, <

cyklizaceť C-koncoveiíkarboxylove skupiny nebo C-koncoveho esteru í , T »· .' ÍA •iř:?·-/ * «·!.·!!} ‘.'V* '· ř :

vnitřním odštěpením skupiny -OH'nebo esteru (-OR) karbóxylové *·*. <; · ď*T'. i Jfď » ‘v iv v , skupiny nebo esteru: s N-koncovou aminoskupinou za vytvořeni iJ -'-v·;·?' Ιζίρΐΐ*? >*-{».3 >·ύΐ; Áúííť-U/UJtiůíi';

cýklickeho peptidů. Například po synteze a stepem za poskytnuti 20 kysele formy peptidů se volna kyselina premem na aktivovaný ester & 'vhodnýiii^W áktivátórení$ Táíkarbóxylóvě³ ^skupiny? iXijákb^Wjě dičyklohéxýikarbodiimici- (ĎGCJ-V¹ roztoků hápříklád^riiethýlehčhlóřidů (CH2CI2);)⁵vé ’směsi s dimethylformamidem (DMF)?· Cyklický‘ peptid potom vzniká¹ vnitřní ^reakcí^ aktivovaného esteru s N-končóvým aminem. Vnitřní cýklizače narozdíl od polymerizacě může být zesílena ú použitím velmi zředěných roztoků. Tyto způsoby jsou v oboru dobře známy. .»·:.·*

Je možno provádět cykližaci peptidů podle vynálezu nebo zavedení desaminového nebo- déskarboxylového zbytku na konec peptidů tákže^Jf še ’^! již hevýskytůje^žádná^ koncová ^aminová nebo H iú karboxylová skupina/ a‘ taksé'snížívnímavOstk^fproteázámnebo sě •r_C *'* •λ ^; -'W gfj tří í*

U.xs v· P*. 7t-

[> · · · 9

99

9 · 9 9 * » 9 9 9

999« · * 9 9.·' • · · VB omezí konformační změny peptidu. C-koncovými funkčními skupinami sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou amid, nižší alkylamid, nižší dialkylamid, nižší alkoxy, hydroxy a karboxy a jejich nižší esterové deriváty a farmaceuticky přijatelné soli.

D. Modifikace kostry .

............ ..-S*>i«*IW**99**l*******lWW“*^********é»*fr**<****l^|****^e***<^^******^e“·’··'*·*·*“**··**·

Další způsoby výroby derivátů peptidů sloučenin podle předkládaného vynálezu se popisují v Hrubý a další, Biochem. J.. 268 (2): 249 - 262 (1990). Peptídové sfoučeniny podle vynálezu slouží také io jako strukturní modely pro nepeptidové sloučeniny s podobnou biologickou aktivitou. Odborníkům v oboru je známo, že pro vytváření sloučenin se stejnou nebo podobnou požadovanou biologickou aktivitou jako původní peptidová sloučenina, ale s výhodnější účinností než původní sloučenina co se týče rozpustnosti, stability a vnímavosti k hydrolýze a proteoiýze, je možno použít řadu způsobů (viz Morgan a Gainor, Ann. Rep. Med. Chem.. 24: 243 - 252 (1989). Mezi tyto způsoby patří náhrada peptídové kostry kostrou složenou zfosfonátů, amidátů, karbamátů, sulfonamidů, sekundárních aminů a N-methylaminových kyselin.

2o Peptidy napodobující látky, kde jedna nebo více z peptidylových vazeb (-C(O)NH-) byla nahrazena vazbami jako -CH₂-karbamátová vazba, fosfonátová vazba, -CH₂-sulfonamidová vazba, močovinová vazba, vazba sekundárního aminu (-CH₂NH-) a alkylovaná peptidylová vazba (-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl) se připravují běžnými způsoby syntézy peptidů pouhou substitucí vhodně chráněného analogu kyseliny za reagencií pro příslušnou aminokyselinu ve vhodném místě v průběhu syntézy.

Vhodnými reagenciemi jsou například analogy aminokyselin, ve kterých byla karboxylová skupina aminokyseliny nahrazena skupinou • v-3oϊ vhqdříduJpro vytvoření > jedné z výše uvedených vazeb:; Například pokud je třeba nahradit vazbu -C(O)NR- v peptidu vazbou flflflfl fl fl fl* • ·.>««· · · ·· • » * β · · · · · · · · «« ί» a · * · ··*fl* ··« fl· ··— fl· «·

- 49 -CH₂-karbamát (-CH₂OC(O)NR-), karboxylová skupina (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny se nejprve redukuje na skupinu -CH₂OH, která se potom přeměňuje běžnými způsoby na skupinu -OC(O)CI nebo skupinu para-nitrokarbonátovou -0C(O)Ó-CsH4-p-NO₂.

Reakce každé takové funkční skupiny s volným aminem nebo aikylovaným aminem na N-konci částečně vytvořeného peptidů navázaném ná pevném nosiči, vede k vytvoření vazby -CH₂0C(0)NR-. Podrobnější popis vytváření takových vazeb -CH₂-karbamát je možno nalézt v Cho a další, Science. 261: 1303 - 1305 (1993).

io Podobně náhrady amidové vazby v peptidů vazbou ϊ '.,.:. i foefonátovou—fiaiše—být dosaženo způsobem—m/ádžným u ιι.ς_ patentových přihláškách No. 07/943,805, 08/081,577 a 08/119,700.

Náhrady amidové vazby v peptidů vazbou -CH₂-sulfonamidovou může být dosaženo redukcí karboxylové skupiny (-COOH) vhodně chráněné aminokyseliny na skupinu-CH₂OH a přeměnou hydroxylové skupiny na vhodnou odštěpitelnou skupinu jako je skupina tosylová, běžnými způsoby. Reakce tosylovaného derivátu například s kyselinou

- thiooctovou - následovaná hydrolýzou - a- oxidační - ch lorací poskytne i.

funkční skupinu -CH₂-S(O)₂Cl, která nahradí karboxylovou skupinu

2o jinak vhodně chráněné aminokyseliny. Použití tohoto vhodně chráněného analogu aminokyseliny při syntéze peptidů poskytne zavedení vazby -CH₂S(O)₂NR-, která nahradí amidovou vazbu v peptidů a tím vznikne peptid napodobující látka. Úplnější popis přeměny karboxylové skupiny aminokyseliny na skupinu -CH₂S(O)₂CI je možno najít v Weinstein, Boris, Chemistrv & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins. díl 7, str. 267 - 367, Marcel Dekker, lne.,

New York (1983).

Náhrady amidové vazby v peptidů močovinovou vazbou je možno dosáhnout způsobem uvedeným v US patentové přihlášce No.

08/147,805: . · ·. ·.·; ':·. ...

4* ·# « · « • ·♦

4*4 4 * 4 ·

-50«44 » 4

Vazby sekundárního aminu, ve kterých vazba -CH₂NHnahrazuje amidovou vazbu v peptidů, mohou být připraveny použitím například vhodně chráněného dipeptidového analogu, ve kterém byla karbonylová vazba amidové vazby redukována na skupinu CH₂ běžnými způsoby. Například v případě diglycinu dojde redukcí amidu na amin po odstranění ochranných skupin ke vzniku sloučeniny H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOH, která se pak pro další reakce používá v Nchráněné _formě. Příprava takových analogů redukcí karbonylové skupiny amidové vazby v dipeptidu je v oboru dobře známa.

io Vhodně chráněné analogy aminokyselin se používají při běžné ——syntéae peptidů stejflýja-jftůsQbem. jato odpovídající snwfto&yseUay.-—

Například se při této reakci používají typicky přibližně tři ekvivalenty chráněného analogu aminokyseliny. Použije se inertního organického rozpouštědla jako je methylenchlorid nebo DMF a jestliže se jako is vedlejší produkt reakce vytváří kyselina, reakční rozpouštědlo obsahuje typicky přebytek terciárního aminu pro zachycení při reakci vytvořené kyseliny. Zvláště výhodným terciárním aminem je ___djizopropylethylamin, který ^s„e Jypicky_ používá^ přibhžně v.......

desetinásobném přebytku. Výsledkem reakce je zavedení analogu

2o aminokyseliny s nepeptidovou vazbou do peptid napodobující látky.

Tato substituce může být opakována podle potřeby, takže neamidovými vazbami se nahradí ód 0 až po veškeré amidové vazby.

Je také možno peptidy podle vynálezu cyklizovat nebo na konce peptidů zavádět desaminové nebo deskarboxylové zbytky, takže není přítomna žádná koncová aminová nebo karboxylová skupina, čímž se sníží vnímavost k proteázám nebo se omezí konformační změny peptidů. C-koncové funkční skupiny sloučenin podlé předkládaného vynálezu zahrnují amid, nižší alkylamid, nižší dialkylamid, nižší aikoxy, hydroxy a karboxy a jejich nižší esterové deriváty a jejich

3o farmaceuticky , přijatelné, soli. Příklady cykiizovaných sloučenin se ^; uvádějí ví'tabulkách 4, 5, 6, 8 a 9. ’ ^; ;

-51 4*44 .1 »·' 4 *

4- W · * , ··4 · 4 · 4 · ► * * í 4 · v * 4 Ϊ «4 • 4 4 1 fc 44

444 4 4

4 k

4b

E. Vytváření disuifidovvch vazeb

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou existovat v cyklizované formě s intramolekulární disulfidovou vazbou mezi s thiolovými Skupinami cysteinů. Alternativně může být vytvářena intermolekulární disulfidová vazba mezi thiolovými skupinami cysteinů za vytvoření dimerní (nebo výše oligomerní) sloučeniny. Jeden nebo více cysteinových zbytků může být také substituován homocysteinem. Tyto intramolekulární nebo intermolekulární disulfidové deriváty io mohou být schematicky znázorněny jak je uvedeno níže:

ΑΧ (CH₂)_m. (CH₂)n _S.Z kde man jsou nezávisle na sobě 1 nebo 2.

Další provedení tohoto vynálezu poskytuje analogy těchto disulfidových derivátů, ve kterých jeden z atomů síry byl nahrazen skupinou CH₂ nebo jinými izostery síry. Tyto analogy mohou být

2o připraveny intramolekulární nebo intermolekulární reakcí s použitím v oboru známých způsobů jak je ukázáno níže:

2s Br H

kde p je jedna nebo 2. Odborníku v oboru bude jasné, že tato reakce může probíhat také s použitím jiných homologů výše uvedenéhe derivátu kyseliny a-amino-g-máselné ukázaného výše a homocysteinu.

Alternativně může být amino konec peptidu zakončen alfaTD-SUbdtiLÚÓVbi ϊϋϋ kyóclifiuu ϋΰίυύυΰ, pFiGciliž ylí d-SUbS titUóiltčni jcodštěpiteiná skupina, jako je kyselina a-halogenoctová, například kyselina a-chloroctová, a-bromoctová nebo a-jodoctová. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být cyklizovány nebo dimerizovány reakcí odštěpitelné skupiny se sírou nebo cysteinovým is nebo homocysteinovým zbytkem (viz například Barker a další, J. Med.

Chem., 35: 2040 - 2048 (1992) a Or a další, J, Org. Chem., 56: 3146 - .... 3149 .(1991)., Příklady . dimenzovaných.— sloučenin- se. ,uvádějí———..

v tabulkách 7, 9 a 10.

2o V. Použitelnost

Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné in vitro jako jedinečné nástroje pro porozumění biologické úloze TPO, včetně vyhodnocení mnoha faktorů týkajících se vlivu na produkci a ovlivňování produkcí TPO a postupů vazeb na receptory.

Předkládané sloučeniny jsou také použitelné při vývoji jiných sloučenin, které se váží na TPO-R a aktivují jej, protože předkládané sloučeniny poskytují důležité informace o vztahu mezi strukturou a aktivitou, které by mohly tento vývoj umožnit.

»·«* « 4* ···· ·· ** »•6 4 · · 4 4 · 4 • 4 ♦ * · 4 4 44 i 4Ϊ * ·# ·· > 4 » li’ 4 i * 4 4 4 4 4· £-!·_· ·«· *· ·· ·♦ ·»'

-i

Sloučeniny jsou také použitelné jako kompetitivní vazné látky v testech určených ke screeningu nových agonistů receptoru TPO.

V provedení těchto testů mohou být sloučeniny podle vynálezu použity bez modifikace nebo mohou být radou způsobů modifikovány;

například značením, jako je kovafentní nebo nekovalentní připojení části, která přímo nebo nepřímo poskytuje detekóvatelný signál.

V jakémkoliv z těchto testů mohou být materiály značeny buď přímo ² nebo nepřímo. Možnosti pro přímé značení zahrnují skupiny markérů, jako jsou: radioaktivní markéry jako je ¹²⁵l, enzymy (US patent

1U ί i* a c nnn\ :_i._ ______— _Λ A.

ο,α*+υ,υ3υ), jdru je pei UAiuca^o α αιι\αιινι\α luaiaia^a a .markéry (US patent No. 3,940,475), schopné monitorování změny v intenzitě fluorescence, posunu vlnových délek nebo polarizace fluorescence. Možnosti nepřímého značení zahrnují biotinylaci jedné ze složek následovanou vazbou na avidin připojený na jednu z výše uvedených markerových skupin. Sloučeniny mohou také obsahovat spacery (mezerníky) nebo linkery v případech, kdy mají být připojeny na pevný nosič.

Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity '·«·** u f·- « fc*** i·. Λ**· - -v- + Μ ·»Ι·ΙΙ *'il I — > - J'*-.’ 'Μ-ί ta _ .<»*- -!·> * pro svou schopnost vázat se na receptor TPO pro detekování receptorů TPO u živých buněk, fixovaných buněk, v biologických tekutinách, ve tkáňovách homogenátech, u čištěných přírodních biologických materiálů apod. Například značením těchto peptidů je možno identifikovat buňky s receptory TPO-R na povrchu. Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO při in šitu barvení, FACS (fluorescencí aktivované třídění buněk), westernové biotování, ELiSA apod. Navíc mohou být peptidy podle předkládaného vynálezu použity pro svou schopnost vázat se na receptor TPO při čištění receptorů nebo při Čištění buněk exprimujících receptory TPO na povrchu buněk (nebo uvnitř permeabilizovaných buněk).

t 'i ·>· · ·» « ·»' · · · • · fc » · • i » » * · »· * · ' » k * · • · * ' · · » «

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako komerční činidla pro různá použití v medicíně a pro diagnostická použití. Tato použití zahrnují bez omezení: (1) použití jako kalibračního standardu pro kvantifikaci aktivit kandidátů na antagonisty TPO v celé řadě funkčních testů; (2) použití pro udržování proliferace růstu TPO-dependentních buněčných linií; (3) použití při strukturní analýze receptoru TPO pomocí kokrystalizace; (4) použití při výzkumu mechanismu přenos signálu TPO/aktivace receptoru; a (5) jiné výzkumy a diagnostická použití, kde dochází s výhodou in L· ι*ΛΛ Ař\lAi*i i TDř^ aa Ia4a αΙ/Ιη,αμα αα^αζΙΙαλ I/aIIUriiia iu i\ dnuvavi icvcpiuiu ir^ iicuu oc ιαιυ aMivauc puiiuuiiic kqiiuiujc proti známému množství agonisty TPO apod.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro expanzi megakaryocytů in vitro a jejich předchůdců, jak ve spojení s dalšími cytokiny nebo samy o sobě (viz například DiGiusto a další, is publikovaná PCT přihláška No. 95/05843). Chemoterapie a radiační terapie způsobují trombocytopenii usmrcováním rychle se dělící . zralejší populace megakaryocytů. Toto terapeutické působení může také snížit počet a životaschopnost nezralých, méně mitoticky . — . ^11 i- i- . >. . Μφ» .·. -- -I φφι» mi WUr. r»>0 | Ht < |H ¹ k WI WH * -»«H i-.. kl|— MQi aktivních prekurzorových buněk megakaryocytů. Léčení 20 trombocytopenie pomocí TPO nebo sloučeninami podle předkládaného vynálezu může být uspíšeno podáváním infuzí pacientům po chemoterapii nebo radiační terapii s jejich vlastními buňkami obohacenými o megakaryocyty a nezralé prekurzoty v kultuře in vitro.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány teplokrevným živočichům včetně člověka pro aktivaci TPO-R in vivo. Předkládaný vynález tedy zahrnuje způsoby terapeutického působení na poruchy spojené s TPO, které zahrnují podávání sloučeniny' podle vynálezu v dostatečném množství pro napodobení účinku TPO na

30· TPO-R in vivo. Například peptidy a sloučeniny podle vynálezu mohou byt /podávány pro lečem cele rady hematologičkých poruch; ^;vcetne «9 9 · · · 9'

9 ·· « 9 · · 9

9 9 • ·· · ·

* t ·

-59- ··· •9 ···· • 9 9 • 9 ι» · 9 t · ·' ·· 9« bez omezení poruch krevních destiček a trombocytopenie, zvláště při spojení s transfuzemi kostní dřeně, radiační terapií a chemoterapií.

V některých provedeních vynálezu se s výhodou nejprve podávají pacientům s chemoterapií nebo radiační terapií antagonisté

TPO a potom se jim podávají agonisté TPO podle vynálezu.

Účinnost sloučenin podle předkládaného vynálezu může být vyhodnocována buď in vitro nebo in vivo některým z četných modelů popsaných v McDonald, Am. J. of Pediatrie Hematology/Oncology. 14: 8-21 (1992).

io Podle jednoho provedení jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu použíteiné pro léčení írombocytopeníe spojené s^j traíiyfuzeíni kostní dřeně, radiační terapií nebo chemoterapií. Sloučeniny se typicky budou podávat preventivně před chemoterapií, radiační terapií nebo transplantací kostní dřeně nebo po takovém zákroku.

Předkládaný vynález tedy. také. poskytuje farmaceutické prostředky .obsahující jako aktivnhsložku:alespon jeden z peptidů nebo peptidy napodobujících látek podle vynálezu ve spojení s farmaceutickým nosičem nebodiluentem.' Sloučeniny' podle tohoto' vynálezu mohou být podávány orálně, pulmonárně, parenterálně (intramuskulárně, intraperitoneálně, intravenózně (IV) nebo subkutánně), inhalačně (prostřednictvím prostředku ve formě jemného prášku), * transdermálně, nazálně, vaginálně, rektálně nebo sublingválními cestami podávání a mohou být ve formě dávkovačích forem vhodných pro každou z těchto cest podávání (víz např.

Bernstein a další, publikovaná POT přihláška No. WO 93/25221; Pitt a další, publikovaná PCT přihláška No. WO 94/17784; a Pitt a další, evropská patentová přihláška 613,683).

Pevnými dávkovacími formami pro orální podávání jsou kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V těchto pevných dávkovačích ť do;formách -je. aktivní ¹ sloučenina > smíséna;tspolu .š' /alespoň jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem jako je sacharóza, laktóza • 4 ·♦

4 4 * ··

4 · 4

4 b

4«

44·4 4 44 «444

V ·· 9 4 « • · fc 4 4 ft 4 4 * 4 · ·' i · 4 · »1

5β*~ ··· ·· ** nebo škrob. Tyto dávkovači formy mohou, jak je tomu v normální praxi, obsahovat další látky jiné než inertní řediva, například kluzné látky, jako je stearan horečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek, mohou dávkovači formy obsahovat také pufrovací prostředky. Tablety a pilulky mohou být navíc připraveny s enterosolventními povlaky.

Kapalné dávkovači formy pro orální podávání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy spolu s elixíry, které obsahují běžně v oboru používaná řediva, jako je voda. Vedle těchto inertních řediv mohou prostředky také obsahovat adjuvantní látky, jako jsou snnáčedia, emulgační a suspendující prostředky a sladidla, ochucovact látky a parfémy.

Prostředky podle vynálezu pro parenterální podávání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Příklady nevodných rozpouštědel nebo vehikul jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako je olivový olej a obilný olej, želatina, a injikovatelné organické estery jako je ethyloleát.

Tyto dávkovači formy mohou také obsahovat adjuvantní látky ____jako jsou ochranné látky, smáčedla,-emulgátory.a-dispergující-látky.

Mohou být sterilizovány například filtrem zahdržujícím bakterie,

2o přidáním sterilizačních prostředků do farmaceutického prostředku, ozářením nebo zahřátím prostředku. Mohou být také vyrobeny bezprostředně před použitím pomocí sterilní vody nebo některého jiného sterilního injíkovatelného média.

Sloučeniny pro rektální nebo vaginální podávání jsou s výhodou 25 čípky, které mohou obsahovat navíc k aktivní látce vehikula, jako je kakaové máslo nebo čípkový vosk. Prostředky pro nazální nebo sublingvální podávání se rovněž připravují pomocí vhodných standardních, v oboru známých vehikul.

Prostředky obsahující sloučeniny podle vynálezu mohou být póďáVá^y: pro ^:prevěhtivní^: a/neboHécebné učély. Při terapeutických: r použitích se prostředky podávají pacientům trpícím onemocněním; jak

30' • t 0 0 ·'»··« » 0 0 0 000* a ? b · 00 0000 · b' 0 b 0 i· « « b

0 «0 00 0« 00 »«« v

-sřbylo popsáno výše, v množství dostatečném pro vyléčení nebo alespoň částečné zastavení příznaků onemocnění a jeho komplikací. Množství odpovídající dosažení tohoto cíle se definuje jako „terapeuticky účinná dávka“. Množství dostatečně účinné pro toto s použití bude záviset na vážnosti onemocnění a hmotnosti a celkovém stavu pacienta.

Prostředky podle vynálezu mohou být také zapouzdřeny do” mikropouzder, například metodou: Tíce and Bibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, vyd. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N. Y.

io (1992), str. 315 - 339.

—_ r _lí-i- __nroeilřaHUw Ahcahntírí Q I π i iř.pninv

W I - ....... ! Λ M ·Λΐ. , , podle vynálezu podávají pacientům vnímavým nebo pacientům s jiným rizikem konkrétního onemocnění. Takové množství se definuje jako „profylakticky účinná dávka“. Při tomto použití závisí opět přesné množství na stavu pacienta a jeho hmotnosti.

Množství antagonisty TPO nezbytného pro účinné léčení bude záviset na mnoha různých faktorech, včetně způsobu podávání, : cílového místa,’fyziologického stavu pacienta-a jiných podávaných, lécích. Léčebné dávky by měly být titrovány pro optimalizaci

2o bezpečnosti a účinnosti. Užitečné vodítko pro množství pro podávání in šitu těchto reagencií mohou poskytnout dávky používané in vitro. Dalším vodítkem pro dávkování u člověka může být testování na zvířatech účinných dávek pro léčení konkrétních onemocnění. Různé předpoklady se popisují například v Giiman a další, (vydavatelé),

Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics,

8. vydání, Pergamon Press (1990); a Remingtonů Pharmaceutícal Sciences, 7. vydání, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985).

Peptidy a peptidy napodobující látky podle vynálezu jsou účinné při léčení stavů podmíněných TPO při podávání v rozmezí dávek od í λ3.<_,·zéf.-a./.«o t,.přibližně:0,001 <.mg.: až přibližně .1:0.mg/kg tělesnéjhmotnoštiv za fden;

, /Konkrétní použitá dávka .se-řídí léčeným onemocněním, cestou

9 9 9 9 « fc • 9 99

- 5&*· ···· *

• • 9 i

t ··♦ > ·

I 9 9 k 9 9 · k * · • 9 99 podávání a úsudkem ošetřujícího lékaře v závislosti na faktorech, jako je vážnost stavu, věk a celkový stav pacienta apod.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 A-B ilustrují výsledky funkčního testu v přítomnosti s různých peptidů; test se popisuje v příkladu 2. Obr. 1A je grafické znázornění výsledků proliferačního testu buněk Ba/F3 transfekovaných TPO-R pro zvolené peptidy podle vynálezu:

označuje výsledky pro GGCADGPTLREWISFCGK (biotin);

ίο '^_T^ozn'ačůje^_výsi^,eaky^tpr^'G⁴'or-G^Á'C'*GP^LT’''l?-”ⁱ’2Ar>Í-S F C G ;

A označuje výsledky proLAlEGPTLRQWLHGNGRD

T;

• označuje výsledky proGNADGPTLRQWLEGRR.PK

N ; a + označuje výsledky proTIKGPTLRQWLKSREHT.S.

Obr. 1B je grafické znázornění výsledků se stejnými peptidy a rodičovskou buněčnou linií.

Obr. 2A-C ukazují výsledky⁴ oligomérizace peptidu s použitím 20 testu proliferace buněk Ba/F3 transfekovaných TPO-R. Obr. 2A ukazuje výsledky testu pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12285 se streptavidinem (SA) jak pro transfekovanou, tak i rodičovskou buněčnou linii. Obr. 2B ukazuje výsledky pro test volného biotinyiovaného peptidu (AF12285) jak pro transfekovanou, tak i rodičovskou buněčnou linii.

Obr. 3A-G ukazují výsledky řady kontrolních experimentů ukazujících aktivitu TPO, peptidů podle předkládaného vynálezu, EPO a vazebných peptidů EPO-R v testu buněčné proliferace s použitím fcw fcfcfc# fcfc · « ·' fc · · 'fcfc · fcfc fcfc fc · « «fcfcfc B fcfcfc) fcfcfc

B fc A· 'fcfc «fc fc t

• fcfcfc

-59*buď buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie nebo EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3A zobrazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její odpovídající rodičovské linie. Obr: 3B ukazuje výsledky pro EPO v testubuněčné proliferace s použitím buněčné linie Ba/F3 transfekované TPO-R a její ' odpovídající rodičovské linie? Obr. 3C ukazuje výsledky pro komplexní^ biotinylovaný peptid (AF12285 se streptavidinem (SA) a komplexní formu EPO-R vazebného peptidu (AF 11505 s SA) v buněčné linii io Ba/F3 transfekované TPO-R. Výsledky pro odpovídající rodičovskou linii jsou ukázány na obr. 3D. Obr. 3E ukazuje výsledky pro TPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3F ukazuje výsledky pro EPO v testu buněčné proliferace s použitím EPO-dependentní buněčné linie. Obr. 3G ukazuje výsledky

15' pro komplexní biotinylovaný peptid (AF12885 se streptavidinem (SA) a komplexní formu biotinylovaného EPO-R vazebného peptidu (AF11505 s SA) v EPO-dependentní.buněčné linii.· ť>

Obr, 4A-C ilustrují konstrukci knihoven typu peptidy na ' ”* * ’ ** “ ” ‘ ... - - .· «.»!,>.<> Ml,.'«.<-* Λ Λ,..» — .^· . . _Mrrt plazmidech ve vektoru pJS142. Obr. 4A ukazuje restrikční mapu a pozice genů. Plazmid knihovny obsahuje terminátor transkripce rrnb, gen bia pro umožnění selekce ampicilinem, intragenovou oblast fága M13 (M13 /G) pro> umožnění zpětného získání jednořetězcové DNA, počátek replikace plazmidu (on), dvě sekvence /acÓ_s a gen araC pro umožnění pozitivní a negativní regulace exprese fuzního genu lac řízené promotorem araB. Obr. 4B ukazuje sekvenci klonovací oblasti na 3' konci genu lac I včetně restrikčních míst Sfil a Eagl použitých při konstrukci knihovny. Obr. 4C ukazuje ligaci teplotně hybridizovaných ^; oligonukleotidů knihovny ON-829 a ON-830 k místům Sfil· plazmidu pJS142 za vytvoření knihovny. Jednoduché mezery v sekvenci označují místa ligace.

4·

• · « ě * *♦ • · · β ·

-60 Obr. 5A-B ilustruje klonování do vektorů pELM3 a pELM15 MBP. Obr. 5A ukazuje sekvenci na 3' konci fuzního genu malE včetně kódující sekvence MBP, polyasparaginového linkeru, Štěpícího místa proteázy faktoru Xa a dostupných klonovacích míst. Zbývající části vektorů se odvozují z pMALc2 (pELN3) a pMALp2 (pELM15) dostupných od formy New England Biolabs. Obr. 5B ukazuje sekvenci vektorů po přenosu fragmentu knihovny BspEII-Scal do pELM3/pELM15 štěpených Agel-Scal. Přenesená sekvence obsahuje sekvenci kódující GGG peptidový linker z knihovny pJS142.

Obr. 6A znázorňuje restrikční mapu a polohy genů při konstrukci .v i é v·· V.

a ' ·; i “κπΊ n o verrpT ii u ú v erio~(n cmq ρ i c Cc/d icn ér ríí í f iíp*·.»: o z knihovny zahrnuje: terminátor transkripce rrnB, gen bia pro umožnění selekce ampicilinem, intragenovou oblast fága M13 (M13 fG) pro umožnění znovuobnovení jednořetezcové DNA, počátek replikace plazmidů (ori), jednu sekvenci tacO_s a gen araC pro umožnění pozitivní a negativní regulace exprese fuzního genu přilbového dimeru řízeného promotorem araB. Obr. 6B znázorňuje

- sekvencí klonovací oblasti na ,3’konci přilbového dimerního genu_ včetně míst Sfil a Eagl používaných při konstrukci knihovny. Obr. 6C ukazuje ligaci teplotně hybridizovaného ON-1679, ON-829 a ON-830 na místa Sfil plazmidů pCMG14 pro vytvoření knihovny. Jednoduché mezery v sekvenci označují místa ligace.

Obr 7 až 9 ukazují výsledky dalších testů vyhodnocujících účinnost peptidů a peptidy napodobujících látek podle vynálezu. U myší používaných v tomto testu se karboplatinou vyvolá trombocytopenie. Obr. 7 ukazuje typické výsledky, jestliže se myším Balb/G v den 0 podá karboplatina (125 mg/kg intraperitoneálně). Čárkované přímky představují neošetřená zvířata ze tří experimentů. Plné čáry představují skupiny, kterým byla podána karboplatina ve ,, třech experimentech. Silné plné čáry.představují historická data. Obr. >\8 .znázorňuje'účinek titřáce^; karboplatiný na “ počty krevních destiček

I . · » · » * »« • * * * «

-61 u myší ošetřených uvedenými množstvími karboplatiny (v mg/kg, intraperitoneálně (ip) v den 0). Obr. 9 ukazuje zmírnění karbopiatinou indukované trombocytopenie v den 10 pomocí peptidu AF12513 (513). Karboplatina (CBP; 50 - 125 mg/kg, intraperitoneálně) byla podána s v den 0. AF12513 (1 mg/kg, ip) byl podáván ve dnech 1-9.

Ačkoliv v následujících příkladech se konkrétně popisují pouze výhodná provedení vynálezu, je zřejmé, že do rámce vynálezu spadají také jejictrmodifikace a variace.

• · ^T tu · rn^auvMiOvcuciirvyiiaicXů ¹ ......iwjiuiww...... ................. , ,

Příklad 1

Syntéza peptidu na pevné fázi

Různé peptidy podle vynálezu byly syntetizovány s použitím techniky syntézy na pevné fázi podle Merrifieida (viz Steward a Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. vyd., Pierce Chemical, Rockford, IL (1984) a Merrifieid, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963) na automatickém přístroji Milligen/Biosearch 9600 nebo na syntezátoru peptidú Applied Biosystems lne. Model 431A. Peptidy byly sestavovány s použitím standardních protokolů systému Applied

2o Biosystems lne., Software version 1.01.Každá vazebná reakce byla prováděna po dobu 1 až 2 hodin se sloučeninou BOP (benzotriazolyl N-oxtrisdimethylaminofosfoniumhexafluorofosfát) a HOBt (1-hydroxybenzotriazol).

Bylo použito pryskyřice HMP nebo PAL (Milligen/Biosearch), . která je zesítěnou polystyrénovou pryskyřicí s kyselinou 5-(4’-Fmocaminomethyl-3,5’-dimethoxyfenoxy)valerovou jako linkerem. Použití pryskyřice PAL vede po odštěpení peptidu z pryskyřice k vytvoření

-,. amidpvé funkční skupiny na karboxylovém konci. Po odštěpení .j , poskytne· pryskyřice HMP; skupinu karboxylové kyseliny na^?O-konci • · Φ ·

Φ' Φ ΦΦ

ΦΦ Φ φ Φ<

! Φ Φ Φ • Φ ·'·

-62Φ¹ φ'·

Φ·Φ φ'· · * φ

S 9 »' * φ β «I

Φ¹' ·'

Φ'ΐί finálního produktu. Většina reagencií, pryskyřic a chráněných aminokyselin (volných nebo navázaných na pryskyřici) byla zakoupena u firmy Milipore nebo Applied Biosystems lne.

Pro ochranu aminových skupin v průběhu vazby byla použita skupina Fmoc. Ochrana primárního aminu na aminokyselinách byla dosažena pomocí Fmoc a ochranné skupiny postranních řetězců byly t-butyl pro serin, tyrozin, asparagin, kyselinu glutamovou a threonin; trityl pro -glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-pentamethyichromasuifonát) pro arginin; N-t-butyloxykarbonyl pro tryptofan; N-trityl pro histidin io a glutamin; a S-trityl pro cystein.

Udstepem peptiau z pryskyřice a současné oasíidíičiii ' ochranných skupin z funkčních skupin postranních řetězců bylo ’ provedeno činidlem K nebo jeho mírnou modifikací. Alternativně při syntéze takových peptidů, které měly amidovaný karboxylový konec, is byl zcela uspořádaný peptid odštěpen směsí 90 % kyseliny trifluoroctové, 5 % ethandithiolu a 5 % vody zpočátku při teplotě 4 ^eC, která se postupně zvyšovala na pokojovou teplotu. Peptidy « —:—s-odstraněnými-ochrannými-skupinami-byly-sráženy-diethyletherem......................_.

Ve všech případech se prováděla purifikace pomocí preparativní

2o HPLC s reverzní fází na koloně s navázaným Ci₈ v gradientu acetinitril/voda v 0,1 % kyselině trifluoroctové. Homogenní peptidy byly charakterizovány hmotnostní spektrometrií s bombardováním rychlými atomy nebo hmotnostní spektrometrií s elektrorozprašováním a analýzou aminokyselin tam, kde to bylo použitelné.

Příklad 2

Biologické testy

Biologickou aktivitu peptidů je možno měřit s použitím těstu proliferace buněk dependentních na trombopoetinu. Myší IL-3 ΐ 3o,; depéndentní Ba/F3 buňky byly· třánsfékóvány š lidským TPO-Ř; * fl··* fl flfl fl · fl fl· ·^: · · · · fl fl · fl, ·- · · . ·· • fl flfl fl. flfl flflflfl fl fl, fl *!_u ·>. fl fli: . fll . « · . ·

-63-.......

s úplnou délkou. V nepřítomnosti IL-3 (kondicionované médium WEHI-3) jsou tyto buňky dependentní pro proliferaci na TPO. Rodičovská netransfekovaná buněčná linie neodpovídá na lidský TPO, ale zůstává IL-3 dependentní.

Biologické testy byly prováděny na obou těchto buněčných liniích s použitím syntetických peptidů odvozených ze screeningu knihovny. Buňky rostly v kompletním médiu RPMI-10 obsahujícím 10 % WEHI-3 kondicionovaného média, potom byly dvakrát promyty v PBS, resuspendovány v médiu neobsahujícím WEHI-3 io kondicionované médium a přidány do jamek obsahujících zředění

-i-ri-Tjij.—cbo TQ-Q._^v iq⁴ bⁱ-!něk/’.?!rr^>'^{f 11} Rn^kv. hyiv inkubovány 48 hodin při 37 ^eC ve zvlhčené atmosféře 5 % C0₂ a metabolická aktivita byla testována redukcí MTT na formazan, přičemž absorbance byla měřena při 570 nm na čtecím zařízení pro destičky ELISA. Testované peptidy stimulovaly proliferaci TPO-R transfekovaných buněk Ba/F3 v závislosti na dávce, jak je ukázáno na obr. 1. Tyto peptidy nemají žádný vliv na rodičovskou buněčnou linii.

Příklad 3

Vazebná afinita

Vazebné afinity chemicky syntetizovaných peptidů vůči TPO-R byly měřeny v kompetitivním vazebném testu. Jamky mikrotitrační destičky byly potaženy 1 mg streptavidinu, blokovány PBS/1 % BSA a potom inkubovány s 50 ng biotinylované antireceptorové imobilizační protilátky (Ab179). Jamky byly potom inkubovány se sklizní rozpustného TPO-R v ředění 1:10. Různé koncentrace peptidů nebo peptid napodobující látky byly smíseny s konstantním množstvím zkrácené formy TPO obsahující zbytky 1-156 fúzované k C-konci . maltózového vazebného proteinu (MBP-TPOiss)..Směsi peptidů MBP*30 ΤΡΟΐδβ· byly přidány do jamek, potažených 'TPO-R, inkubovány dvě ' hodiny při 4 °C a potom promyty PBS, Množství MBP-TPOiss, které • «· » · » · « · · aa ♦··

-64 » · * · • · * · · α· • · · · · « · · ·· • 4 *·· · · *b · · · bylo v rovnováze navázáno, bylo měřeno přídavkem králičího antiséra proti MBP, po kterém následovalo působení kozího protikráličího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Množství alkalické fosfatázy v každé jamce bylo potom určováno s použitím standardních metod.

s Test se provádí v širokém rozmezí koncentrací peptidu a výsledky jsou vyneseny do grafu tak, že osa y představuje množství navázaného MBP-TPO₁₅e a osa x představuje koncentraci peptidu nebo peptid napodobující látky. Je tak možno určit koncentraci, při které peptid nebo peptid napodobující látka sníží množství MBP10 ΤΡΟΐ5β navázané na imobilízovaný TPO-R o 50 % (IC₅₀). Disociační konstanta (Kd) pro peptid by měla být oodohná nfi.pp¹¹»;*: výč?· uvedených reakčních podmínek změřené hodnotě IC₅₀Příklad 4 is „Peptidy na plazmidech“

Vektor pJS142 se používá pro konstrukci knihovny a je ukázán na obr. 4. Pro konstrukci knihovny jsou nutné. tři,, sekvence-——oligonuklěotidů: ON-829 (5’ ACC ACC TCC GG); ON-830 (5’ TTA CTT AGT TA) a oligonukleotid specifický pro knihovnu, o který se zajímáme (5’ GA GGT GGT {NNK}„ TAA STA AGT AAA GC), kde {NNKJn označuje náhodnou oblast požadované délky a sekvence. . Oligonukleotidy mohou být v průběhu syntézy fosforylovány chemicky na 5’ konci nebo po purifikací pomocí polynukleotidkinázy. Potom se teplotně hybridizují v molárním poměru 1:1:1a navážou na vektor.

Kmen E. coli, který se s výhodou používá pro techniku panníngu, má genotyp: A(srt-recA) endA1 rtupG lon-11 sulA1 hsdR17 A(ompT-fepC)266 AclpA319::kan Alacl lac ZU118, který může být připraven z kmene E. coli získaného z Genetic Stock Center at Yale University (E. coli b/r, označení v centru CG.SC:6573) s genotypem Ion-11 sulA1, Výše popsaný kmen E. co// 'se pro' použití připravuje

4	44	4:	•	4'	4 4	4
•	4	4	•	·>	4 4	4-4
4	4	« *	4	4' 4	4« ·	4
♦ 4	4		• 4	•J	4	4

-65elektroporací, jak se popisuje v Dower a další, Nucleic Acids Res.. 16: 6127 (1988). kromě toho, že ve všech promývacích krocích se používá 10 % glycerol. Buňky jsou testovány na účinnost s použitím 1 pg plazmidů Bluescript (Stratagene). Tyto buňky se používají pro pěstování původní knihovny a pro zesílení obohacené populace po každém cyklu panningu.

Peptidy na plazmidech se z buněk uvolňují pro panning mírným enzymatickým štěpením buněčné stěny s použitím lysozymu. Po v zcentrifugování částí buněk lze pro většinu receptoru přímo použít io surový lyžát. Jestliže je zapotřebí nějakého dalšího čištění — ~:!2zrr.4ťCYý?h-' mcžnp pro odstranění mnoha z nízkomolekuíárních kontaminantů surového lyzátu gelové filtrační kolony.

Panning se provádí v pufru (HEKL) s nižší koncentrací soli než 15 většina fyziologických pufrů. Panning je možno provádět v mikrotitračních destičkách s receptorem imobilizovaným na neblokující monoklonální protilátce (MAb) nebo na kuličkách nebo * , „----------'kolonách?—Konkrétně je možno použít v~prvním.cyklu.panningu,24„.

jamek, přičemž každá jamka je pokrytá receptorem. Pro druhý cyklus

2o se typicky používá 6 jamek pokrytých receptorem (vzorek PAN) a 6 jamek bez receptoru (vzorem NC). Srovnávání počtu plazmidů v těchto dvou vzorcích může poskytnout informaci, zda jsou klony _v specifické vůči receptoru pomocí panningu obohaceny. „Obohacení“ se definuje jako poměr transformantů PAN ke transformantům získaným ze vzorku NC. Desetinásobné obohacení obvykle naznačuje to, že jsou přítomny klony specifické k receptoru.

V dalších cyklech panningu je užitečné snížit vstup lyzátu do jamek na nižší nespecifickou vazbu pozadí plazmidových komplexů.

V cyklu 2 se obvykle používá 100 μΙ lyzátu na jamku. V cyklu 3 se :·. , - 30 používá 100 μΙ lyzátu na jamku, zředěných v poměru 1/10 HEKL/BSA,

•	• a	a	•	9··	• a	a	•
•	a	a	•	a.	a- a	aa
š	a	• · 'r	a	• 1 1	• · a	•	•
* v		a	a ·	v	•	a	a

-66Pro další cykly panningu je vstup plazmid transformujících jednotek alespoň 1000 x větší než odhadované zbývající různorodostí.

Vazebné vlastnosti peptidů kódované jednotlivými klony se typicky vyšetřují po třech, čtyřech nebo pěti cyklech panningu, s v závislosti na hodnotách obohacení. Typicky se používá metody ELISA, která detekuje specifickou vazbu na receptor fuzními proteiny Lacl-peptid. Lad je normálně tetramer a minimální funkční jednotka vázající se na DNA je dimer. Peptidy se tedy ukazují na fuzním proteinu vícenásobně. 2a předpokladu, že v jamkách může být io imobilizována dostatečná hustota receptoru, se budou peptidy fn-ynuané k I ac.l uáyat na povrch kooperativním vícenásobným způsobem. Tato kooperativní vazba dovolí detekci výskytu vazby s malou vnitřní afinitou. Citlivost tohoto testu je výhodná v tom, že mohou být identifikovány počáteční úspěšné pokusy s nízkou afinitou, is ale je nevýhodná v tom, že signál při ELISA nekoreluje s vnitřní afinitou peptidů. Fuze peptidů k maltózovému vazebnému proteinu (MBP) jak je popsáno níže, dovolí testování ve formátu ELISA, kde síla signálu lepší koreluje s afinitou (viz obr. 5A-B).

DNA ze zajímavých klonů může být připravena ve 20 dvouřetězcové formě s použitím jakékoliv standardní metody miniprepu. Kódující sekvence zajímavých jednotlivých klonů nebo populací klonů mohou být převedeny do vektorů, kde jsou tyto sekvence fúzovány ve čtecím rámci s genem kódujícím MBP, proteinem, který se obvykle vyskytuje v roztoku jako monomer.

Klonování knihovny do pJS142 vytvoří restrikční místo BspEl v blízkosti počátku náhodné kódovací oblasti knihovny. Štěpením BspEl a Seal umožní čištění fragmentu DNA o velikosti přibližně 900 bp, který může být subklonován do jednoho ze dvou vektorů, pELM3 (cytoplazmatický) nebo pELM15 (periplazmatický), které jsou jednoduché modifikace vektorů pMALc2 a pMALp2, dostupných ; komerčně od firmy New England Biolabá (viz obr. 5A-B). Štěpení

Cl· ¢.- , f r U' <1 r ¢, t' 'F^c

Γ ‘ t.fc, ' ' ϊ,,ί.ι r <J <A <

•Mih, z 67 γ,Λ c ¢.

* tč— pELMS^/appELMISpAgel-^^Scahumožn^účinné klonování fragmentu BspEI-Scal· Zjknihovny pJSI42:«Konce BspEI a Agel jsou kompatibilní proj- ligacl· Navíc·,·je.^správná _ítligace míst^Scal -t.nýzbytná^pjrO; znovuvytvořeníjfunkčníhq-genu^/a/rez^stencejia^ampicilin).a^tímjiaro; snížení^^množstV:í_cklopu-vjpozadí z,nežádoucích provedenj^-ligace. Exprese fuzppeptidu MBP řízeného promotorem tac může potpm>být ^indu.^k.9Yána pomocí- íP,TG._{ťl X}a^-.tr j- ppatcXicí; úspteycft

-Lýz-áty-prb^ELLSA^:-£áčl·· nebo MBP sé^iř připrav ují-z- jedhotlivých· klónůMyzí buněk pomocí lysozymu a odstraněním nerozpustných částí ίο buněk centrifugách LyzátyJspUt potom přidány^doj jamek «obsahujících; imobilizovanv receptor.a do ^kontrolních jamek^bez receptoru. Vazba fúzí ,peptidů MBPýnebo-Laclv se detekuje, inkubací, s králičím polyklonálním antisérem^buďifíroti Lacl_f nebo< MBF?, následovanou inkubací s kozí antikráličí sekundární protilátkou značenou alkalickou i t * 4a*' 'W-iakřř ^/wr#··' i i! k M»* f « t >+ -nnl·> 1 t‘*»·< r-:,· jut-»- β 1_- J»4 *-<:/, ipifinw.

fosfatázou. Navázaná alkalická fosfatáza se detekuje chromogenním í f ' ·>Λ- -» ’ · l· ’,· substrátem p-nitrofenylfosfátem.

sa pro:·· j.. ?···.' · , prcvádi vod.,o \r-.cjkfR' 3 íP.\,

Systém „přilbového dimeru“

3) p73i4»WV'VrťiU Miíitw u Vi£ VIS UaCřf .ZdVuhV t i?'· *' ^r

J.- aOT v VCÍCT

2° 'tVáriantanctechniky yLacI^. peptidů ..nájiiplazmidech , _tpoužívá ‘ yazebnéhorprotěihu DNA, nazývaného přilbový dimer („headpiqce dimer“)sVazbaqpNA.r/ac yepresorem E. coli je zprostředkována přibližně 60 aminokyselinami „přilbové“ domény. Dimer přilbové

.... domény, který se váže na lac operátor se normálně vytváří asociací 25 mnohém delší C-koncové domény o délce přibližné 300 aminokyselin.

Systém „přilbového w dimeru“ využívá přilbového dimeru molekul obsahujícíchj; dva;/.přilbové úseky spojené krátkým peptidovým linkerem. íTyto -proteiny se i na^DNA vážou dostatečně stabilně, aby dovolily^Taašdciaci:peptÍdověhóťepitopu na C-konci přilbového, dimeru

3o. s plazmidem kódujícím tento; peptid: ?.»<i ' »’ - jf j|

-68 ♦ · ft· ♦ · * 4 O • « ·

Náhodné peptidy fuzují s C-koncem přilbového dimeru, který se váže na plazmid, který jej kóduje za vytvoření komplexu peptid přilbový dimer - plazmid, jehož screening je možno provést pomocí panningu. Přilbový dimer systému peptidy na plazmidech dovoluje s větší selektivitu pro ligandy s vysokou afinitou než systém Lacl. Systém přilbového dimeru je tedy použitelný pro přípravu můťagehetiČÉyčÍT“Rn ί hoven“ zalóžěřiýčhna*počátecniích^úšpěšnych’ sekvencích s nízkou afinitou a selekci variant těchto počátečních sekvencí s vyšší afinitou.

io Knihovny se konstruují jako v případě peptidů na plazmidech s použitím přilbového dimerního vektoru pCMG14 (viz obr. 6A-C). Přítomnost lac operátoru se pro vazbu plazmidu proteinem přilbového dimeru nevyžaduje. Knihovny byly zavedeny do bakteriálního kmene obsahujícího E. coli (lon-11 sulA1 hsdR17 (ompT-fepC) AcípA319::kan

Alacl lac ZU118 A(srl-recA) 306:;Tn10 a amplifikovány za podmínek bazální (A) indukce promotoru. Panning knihoven přilbového dimeru se provádí podobnými postupy jako u knihoven Lacl kromě toho, že na místo pufru HEKL se používá pufr HEK a eluce plazmidů z jamek se provádí vodným fenolem namísto IPTG, Sekvence z panningu

2o přilbového dimeru jsou často charakterizovány po převodu do vektoru MBP tak, že mohou být testovány afinitně citlivou metodou ELISA MBP a také tak, že populace klonů mohou být testovány přenosem kolonií se značeným receptorem.

Příklad 6

V tomto příkladu byly cyklizované sloučeniny testovány třemi způsoby. Zaprvé byly získány hodnoty ICso. jak bylo popsáno výše. Navíc byl proveden test proliferace MTT buněk jak bylo popsáno výše pro výpočet hodnot EC_So. Nakonec byl proveden mikrofyziometrický

30. test (Molecular Devices Corp.). V tomto testu se v podstatě měří rychlost okyselování extracelulárního média jako odezva na stimulaci

		44	4 4
	a		4 «	9 4	• 4
	4		• i 4 * ·	44	4 ·
	• 4		• 4 · 9		• 4

-69 receptoru TPO sloučeninami podle vynálezu. Rozsahy pro EC_So jsou symbolicky označeny jako pro IC_So popsané výše. výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Struktura EC50 (nM) 1C50 _________ _________ _________prolifer_mikrofvz.

[H]-(Pen)ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂] ++ ++ ++ [O=C-NH]-ADGPTLREWlSF(Cys)-[NH₂] ++ ++ ++

CHr [H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂]

S-S [0=C-N]-ADGPTLREWISF-(Cys)-[NH₂] ++ ++ ND

CH;

[H]-(D-Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂] + ND [H]-(Cys)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂] ++ [H]-(D-Pen)ADGPTLREWISF(D-Cys)-[NH₂] ++ [H]-(Homocys)ADGPTLREWISF(Homocys)-[NH₂] + + ++

- 7(3 + + ++ • 99 » *

9 9

9 ·

9 9 9

9·

9 9» *9 · 9 9

9 »

9 9 [O=C-NHl-ADGPTLREWlSF(Homocys)-[NH₂]

CH;

[O=C-NH]’ADGPTLREWíSF(Pén)-ÍNH₂]·

CH₂[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂]

Ph-C H—-S [H]-KADGPTLREWISFE-[HN₂] ++ + ++ + + ND

-NH-C=O [H]-EADGPTLREWISFK-[NH₂] r

O=C-NH[O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂]' /V-^s [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)-[NH₂] ' <'' -- —l [HN]-ADGPTLREWISFE-[NH₂]

I · · I ·· ......

[H]-(Pen)ADGPTLREWtSF(Pen)-[NH₂]

S--S + + ND ++ + ND ++ + ND + + ND

Příklad 7

V tomto příkladu byly testovány náhrady aminokyselin v polohách D, E, I, S, nebo F v cykiizované sloučenině ·« · 9 *«9· β »99 99 «« « 9 9 9 9 · · 999 9 9

9 «99* 9 9 ·

7ΐ*. ··» .........

999« 9

99 •9 9999

CADGPTLREWISFC 1_1 na hodnoty EC₅₀ a ICso jak bylo popsáno výše. Mikrofyziometrické výsledky se udávají v závorkách. Výsledky jsou s shrnuty v tabulce 5 níže.

Tabulka 5

CADGPTLREWISFC

E-Q	++(+)	++
D - A	+ (+)	++
1 - A	+ (+)	+
S -A	++ (++)	+ +
S - D-Ala	+	+
S - Sar	+	+ +
*— * «*· ** S - Aib	1 . — «rita · <' 1U-IH1»· . UM **«> í ++ (+)	- ÍT**L· ι».χ “· oj ^1«. Jtafe U ++
S - D-Ser	++	++
S - Nva	++ (++)	++
S - Abu	++	++
S - (N-Me-Ala)	+	+
S - (N-Me-Val)	+	+
S - (N-Me-Ala)*	+	+
S - (nor-Leu)		++
S - (t-Bu-Gly)	+	++
S - [N-Me-Ser(Bzl)]		+
S - (homoser)	ND	ND
S - (N-Me-Leu)	+	ND
F - A	„ .. ? +(+) ,	' ' - * '· ++

I • •a a a. · a a a * a a a a a · ·· a a ·· · ♦· aaaa ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

-72-.............

*»	Substituce	EC50 (nM) Buněč.prolifer.	IC50 (nM)
F - D-Ala F - F-Phe F - Homo-Phe F - CHA F-Thi F - (Ser(Bzl)) F - (N-Me-Ala) F - (fenygly) F - (pyridylala)	+ + ++ (++) ++ (++) ++ ++ + ++ (++) ++	++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++
	F - (p-nitrofe)	++ (++)	++
	F - (3,4-di-CI-Phe)	++ (+)	++
	F - (p-CI-Phe)	++	++
	F - (2-Nal)	++ (++)	++
	F-(1-Nal)	++	++
	F - (Diph-Ala)	++	++
	F - (N-Me-Phe)		ND
	S,F - Ava (thioether)	+	'++
	S,F - Ava(cys-cys)	+	++
	S.F - Ava	+	++
	AD-(de!ece	+ (+)	ND
	ADG - delece	(+)	+
i · 4	Ava = HsN^WCOOH
	Příklad 8
5	V tomto příkladu byly vyhodnoceny substituce aminokyselin ve
	sloučenině
J ·'.,’*·< i' ύ · . í ' Á.	(O=C-NH]-ADGPTLREW!SF(Cys) 1 .;	’ 1
	CH?	§

·· ·· « · · * [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)

I f .

ch₂-s v polohách D, S, nebo F jak je uvedeno v tabulce 6 níže. Hodnoty EC₅o a IC₅o byly vypočteny jak bylo popsáno výše.

s Mikrofyziometrické výsledky jsou v závorkách.

Tabulka 6 [O=C-NH]-ADGPTLREWISF(Cys)

CH₂·

Substituce	EC50 (nM) Buněč.prolif.	1C50 (nM)
D-E	<+)	ND
Forma volné kyseliny.	++ (+)	ND
Přidán Gly na aC-konci	++ _ U* > JWlNM	++
S - Abu	++ (++)	ND
F - DiPh-Ala	(++)	++
S,F - Abu, DiPh-Ala	- +(+) .	. ++ . .

Příklad 9

V tomto příkladu byly vypočteny hodnoty EC₅₀ a ICso jak se popisuje výše pro dimerní sloučeniny uvedené v tabulce 7 níže. Pro porovnání je zahrnut cyklizovaný monomer

CADGPTLREWISFC

• *« ·	9	·· · ·	« ·	• 9
• · ·	0 9	•	9 9	9
	9 *	6	9 ·	9
♦ *	• * ·	*	9 «« ·	•
9 O	• 9	9 · *	9	«

Sloučeniny z tabulky 8 byly při maximální koncentraci 10 μΜ neaktivní.

V tab. 9 byly určovány a porovnávány hodnoty EC₅₀ a ICso jak bylo popsáno výše pro cyklizované a dimenzované varianty I EG P T

LRQWLAARA.

V tab. 10 se porovnávají zkrácené formy dimeru (H)-IEGPTLRQWLAARA (H)-lEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-(NH₂)

Hodnoty ECso a IC₅₀ byly vypočteny jak se popisuje výše. io Mikrofyziometrické výsledky se udávají v závorkách.

Tabulka 7

EC50(nM) IC50(nM)

Mikrofyz. Prolif.

v, o

II [Br+C-NH]-ADGPTLREWISFČ-[NH₂]*----^++-^_m++

O

II [Br+C-NH]-ADGPTLREWISFC-[NH₂] [H]-IEGPTLRQWLAARA ++ ++ [H]-IEGPTl_RQWLAARA(p-Ala)Í-[NH₂] [H]-CIEGPTLRQWLAARA-[NH₂] ++ ++ [H]-CIEGPTLRQWLAAEA-[NH₂] [H1-CADGPTLREWISF-[NH₂] ++ ++ [H]-CADGPTLREWISF-[NH₂] ++ ++ ++ ++

-75fcfc·· * fc· fcfc · fc fcfc ·· > · · · · · I λ

• fc ·

F fcfc · fcfc ' ·· • •fcfc · fcfc · • « ·· [H]-SVGCGPTLRQWLAARNHLS-[NH₂] [H1-SVQCGPTLRQWLAARNHLS-[NH₂] ++ ++ ++ [Hj-MVGPTLRSGC-INHaJ [H]-MVGPTLRSGé-[NH₂]

ND

CADGPTIRWISFC I_1 ++ ++ ++ [Ac]-ADGPTLREWISFC rAcl-ADGPTLREWlSFC

ND ++ ++

ADGPTLREWISFťj)

ADGPTLREWISFC ++ ++ ++ [Acj-DGPTLREWISFC [Ac]-DGPTLREWISFC ++ ++ ++ • M '«Μ .t «*> I · [Ac]-GPTLREWISF(f [Ac]-GPTLREWISFC

ND ++ ++

GPTLREWISF^

GPTLREWISFC ++ ++ [Acj-PTLREWISFC

I [Acj-PTLREWISFC

ND ++ ++

PTLREWlSFCjl

PTLREWISFC ++ ++

-76k>4*iu '·

	• 4 4	• a
4 ·	♦ · * ·	Μ· β
	• 4 4 4	• 4
4 4 4	4* ··	4 ·

[Ac]-TLREWISFC [Ac]-TLREWISFC

TLREWlSFtjí

TLREWISFC

Tabulka 3 [H]-CTRAQFLKGC-[NH₂] [Π J - L· IN IŇ U t_ KOI Ό -1Ň Π ₂J L-1 [H]-CNRSQLLAACf-[NH₂l [H]-CTSTQWLLAC-[NH₂] [H]-CQRADLINFC-[NH₂]

I_l· , [HI-CLLSEFLAGQQC-[NH₂]

I _I [H]-CTFQVWKLAŘN^-[NH₂] ' [HI-CTLGQWLQMGM94N H₂] [HI-CLTGPFVTQWLYEC-[NH₂],.

[H]-CTLREFLDPTTAVC-[NH₂] [H]-fGTEGPTLSTWLDC-[NH₂] [Hj-CELVGPSLMSWLTC-[NH₂] [H]-^SLKEFLHSGLMQC-[NH₂] [H]-CTLAEFLASGVEQ(j:-[NH₂] [H1-CTLKEWLVSHEVWC-[NH₂] ++ (_?. ... MT-fl W · —•Τ-'··') Ν'Α·Τ , } í , ·ϊ ,

I.

fl · «	•	•	flflflfl	• ·	« 9
• ·	•	fl	*	fl ·	•
’·	•	fl	•	• ·	• ·
«	• fl	•	fl	« fl · fl	fl
fl	fl	fl	• «	•	fl

[H1-CIEGPTLRQWLAARAC-[NH₂1 [H]-REGPTLRQWM-[NH₂] [H]-REGPTLRQ WLMSRS-(NH₂J

Tabulka 9 ' EC50(nM) IC50(nM)

*	Mikrofyz.	Prolif.
[H]-l EGPTLRQ WLAARA-[NH2]	ND	++ . ++
JW.1,CICOD.T| QO.WI. Δ.ΑΡ„ΔΓ..ΓΜΝ-1	wn	++ ++.
L J Γ ........I 1 ”‘J
[H]-IEGPTLRQWLAARA \ [H]-IEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-[NH2]	++	++ ++
[Η]-<ρ 1EGPTLRQ WLAAEA-[N H2] [H]-CIEGPTLRQWLAAEA-[NH2]	++	++ .. ++

Tabulka 10 (H)-IEGPTLRQWLAAR^ (H)-lEGPTLRQWLAAEA(p-Ala)K-(NH₂)

Sekvence	EC50(nM) Buněč.prolif.	IC50(nM)
(Ac)-IEGPTLRQWLAARA (Ac)-1 EGPTLRQ WLAARA-pA-ll(NH2)	++	ND.
(H)- IEGPTLRQWLAAR	++	ND
(Η)-1 EGPTLRQ WLAAR-pA-K(NH2): č	; ΐ ·« r ; ;/ h ,

« ·

I <

• ·

(H)- IEGPTLRQWLA| (H)- IEGPTLRQWLAA-OA-K(NH2)	++(++)	ND
(Ac)-EGPTLRQWLAARA (Ac)-EGPTLRQWLAARA3A-K(NH2)	ND	ND
(H)-EGPTLRQWLAAR^ (H)-EG PTLRQ WLAARA-pA-K(N H2)	++	ND
(H)-EGPTLRQWLAAR (H)-EGPTLRQWLAAR-pA-K(NH2)	++(++)	ND
(Ac)-EGPTLRQWLAÝ	++	ND
(Ac)-EGPTLRQWLAA3A-K(NH2)
(H)-EGPTLRQWLA^ (H)-EGPTLRQWLAA-pA-K(NH2) ·	++	ND

Příklad 10

V tomto příkladu byly zaváděný různé substituce vVolóhách/G/ P a W v cyklizované sloučenině [H]-C AD G PT LR E W I S F C - [NH₂]

Tabulka 11 ukazuje příklady substituovaných sloučenin, které io vykazují aktivitu agonistů TPO. Substituenty uvedené v tabulce zkratkami jsou následující:

«4 ·· • 4 β

4 4 • · · · * ·

• 4

-79444* *· ·

Tabulka 11

[H]-CADGPTLREWISFC- [NH2]
G	P	W
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Sar	Hyp(OBn)	Nal ;
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gaba	Pro	Trp
Cpr-Gly	Pro	Trp
Sar	Hyp(OBn)	Nal
Gly	Pro	Trp
Gly	Pro	Nal
Sar I***1»*—úw 44W W HW4 Wnt·	' ,, Pro	~ ......... Trp _ _
Cpr-Gly	L-Tic	Nal
Gly	D-Tic	D-Trp
Cpr-Gly	D-Tič	Trp
Gaba	Hyp(OBn)	Trp

Náhrady prolinu

D-Pro L-Pra /\

COOH

Kyselina L-pipekolinová Kyselina D-pipekolinová

Π

HN-k \och

Kyselina L-azetidin karboxylová

COOH

L-Tic . D-Tic ' L-Oic

·♦♦♦	4	44	44 4 4	44	• 4
4	• 4	4 4	4	• ·	4
•	«	4 4	4	4 4	4*
v	4	• 4 4	4	* · 4 ·	4
• o	4	4 4	• *	4	4

Náhrady trvotofanu

DL-5-F-Trp

DL-5-Br-Trp

L-Tic

Náhrady qlvcinu	•«•a 4 ·· ··· 4 4 4 * · · 4 β 4 4 4 4 · · · · · · « 4 4 4 4 4 4 • 32 -·· ··· m ··
Η^'^ΟΟΟΗ
Glycin	Sarkosin

Μ, 'COQH 'COQH β-alanin

Kyselina y-aminomáselná

N-pentylglycin N-cyklopropylglycin •‘ϊ’· |Τ· '£ϊυ ''t' <' *

• · · · · 4 « 4 4

I,

Příklad 11

Pro testování vhodnosti myši jako běžného testovacího druhu bylo provedeno několik experimentů in vitro, navržených pro měření aktivity testovaných sloučenin na myším receptoru. Nejprve byly s inkubovány buňky kostní dřeně, sklizené z femorů 8 až 9 týdnů starých myší Balb/C, inkubovány 7 dnů v kapalné kultuře vždy s rhuTPO nebo různými koncentracemi testovaných peptidu. Na konci inkubačnf periody byly kultury koncentrovány odstředěním centrifugou Cytospin, barveny na acetylcholinesterázu (AChE, diagnostika myších io megakaryocytů) a počítány pod mikroskopem. 1 nM rhuTPO bylo uušaženo růštu”věimivěiicýčh(~>'ňěááněřěňtňičňOuňěk^ barvících se na AChE. Zdá se, že tyto buňky jsou zralé megakaryocyty. Z počátečního zaockování 10⁶ celkových buněk kostní dreně/ml (v 50 ml kulturách) se vyvinuto očekávaných

1 až 2 x 10⁶ megakaryocytů. Tato odezva na TPO byla označena jako „maximální“; Kontrolní kultury neobsahující přidané růstové faktory produkovaly velmi málo AChE pozitivních buněk. Několik peptidových . . ~~ sloučenin bylo-testováno tímto-testem -při-vyšších .koncentracích——— a výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Peptid A v koncentraci 10 μΜ produkoval maximální odpověď u buněk myší kostní dřeně. Toto zjištění bylo prvním důkazem, že tato rodina peptidů je na myším receptoru aktivní. V druhém experimentu byly sklizeny buňky kostní dřeně a kultivovány v polotuhém médiu (methylcelulóza) obsahujícím buď žádné faktory, 1 nM rhuTPO nebo 10 μΜ Peptidu A. Po sedmi dnech kultivace byly kolonie velkých buněk (u kterých se očekávalo, že jde o megakaryocyty) počítány a seskupeny do malých kolonií (3-5 buněk) nebo velkých kolonií (větší než 6 buněk). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. TPO a testované peptidy oba produkovaly podstatně více kolonií obou velikostí než tomu bylo v kulturách μ negativní, kontroly. To ukazuje, že, peptidy . napodobují TPO ve.své schopnosti stimulovat; expanzi populace/Mk/řprekurzořovýchí buněk. ; ' j í.: ’

-84Pro získání kvantitativnějšího srovnání účinnosti testovaných sloučenin na myší a lidské receptory byl klonován receptor muTPO a transfekován do buněk BaF3. Byla izolována TPO dependentní populace buněk.

Tabulka 12

Peptid	Testovaná koncentrace (nM) Odezva
*
D	100 000	žádná
C	40 000	maximální
C + S. A. *	1000	maximální
S. A. samotný	1000	žádná
B	100 000	minimální
A	10 000	maximální
TPO (R & D)	1	„maximální“

* Streptavídin v komplexu s bíotinylovaným peptidem - koncentrace zdánlivého komplexu 1 : 4.

io ** Porovnání s rekombinantním lidským TPO ** 25 až 30 % ACE barvících buněk na cytopspinu

Kultury bez růstových faktorů - přibližně 5 % AChE barvících buněk (nižší počet buněk)

9999

9 99*·

·· 99

-85Tabulka 13

Sloučenina	3-5 velkých buněk	6-12 velkých buněk
Bez faktorů	1	2	1
Bez faktorů	2	1	1
1 nM TPO	#1-1	15	6
1 nM TPO_	#1-2	12	1
1 nM TPO	#2-1	16	8
1 nM TPO	#2-2	13	3
- ... . .. .1 —--
10 μΜ Peptidu	# 1-1	25	10
10 μΜ Peptidu	# 1-2	22	8
10 μΜ Peptidu	#2-1	22	7
10 μΜ Peptidu	# 2-2	21	10

Zastupuje:

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina schopná vazby. na trombopoetinový receptor, vyznačující se tím, že má:

   5 (1) molekulovou hmotnost menší než přibližně 8000 daltonů, a (2) vazebnou afinitu ke trombopoetinovému receptoru vyjádřeno hodnotou IC_So ne větší než přibližně 100 μΜ.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, io že uvedenou sloučeninou je peptid a kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidu byly nahrazeny vazbou zvolenou ze skupiny vazba -CH₂OC(O)NR-; fosfonátová vazba; vazba

   -CH₂S(O)₂NR-; vazba -CH₂NR- a vazba -C(O)NR⁶-; a vazba is -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R^e _ _____znamená nižší ajkyl, ___ , _ _ ______ dále kde N-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky je zvolen ze skupiny -NRR¹; skupiny -NRC(O)R; skupiny -NRC(O)OR; skupiny -NRS(O)₂R; skupiny -NHC(O)NHR;

   2D sukcinimidové skupiny; skupiny beπzyloxykarbonyl·NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, která má na fenylovém kruhu od 1 do
3. 3 substitentů zvolených ze skupiny nižší alkyl, nižší ’ alkoxy, chloro a bromo, kde R a R¹ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl,

   25 a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou .v/!fc;

   ,, . ;· .·'

   I. j

   Uů/í/aír ^nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a: nižší alkyka kde TÁ-^aB^dusíkový^atórn skupiny -NR³R⁴ může; být popřípadě kmirtoýóů skupinou N-konce peptidů, takže dojde k vytvoření cyklického peptidů, a její fyziologicky přijatelné soli.

   5 3. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím,

   -- -- ··.· ž e-L-obsahuje. sloučeninu podl,e_nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
4. 4. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou, vnímavou k léčení io agonistou trombopoetinu, který zahrnuje podávání terapeuticky účinné dávky nebo množství sloučeniny podle nároku 1 pacientovi.
5. 5. Způsob podle nároku 4, kde sloučeninou podávanou pacientovi 15 je peptid, a kde žádná až všechny vazby -C(O)NH- peptidů byly nahrazeny vazbou zvolenou ze skupiny vazba -CH₂0C(0)NR-; fosfonátová vazba; vazba -CH₂S(O)₂NR-; vazba -CH₂NR- a vazba -C(O)NR⁶-; a vazba

   2o -NHC(O)NH-, kde R znamená atom vodíku nebo nižší alkyl a R⁶ znamená nižší alkyl, dále kde N-konec uvedeného peptidů nebo peptid napodobující látky je zvolen ze skupiny -NRR¹; skupiny -NRC(0)R; skupiny -NRC(O)OR; skupiny -NRS(0)₂R; skupiny -NHC(0)NHR;

   25 sukcinimidové skupiny; skupiny benzyloxykarbonyl-NH-; a skupiny benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, která má na fenylovém kruhu od 1 do 3 substitentů zvolených ze skupiny nižší alkyl, nižší ; alkoxy, chloro a brorno, kde.R a, R¹ jsou, nezávisle zvoleny ze 'ft···<··< ί·.ω s skupiny atom vodíku a nižšíalkyl; i'? π «η·τ -¾ ίκ·.ί ?

   4 4 • *

   4·· · » β ť β β . 4 β 4 · 4 · «4 4 44 ·· 4« ·♦ ··

   -88a ještě dále kde C-konec uvedeného peptidu nebo peptid napodobující látky má vzorec -C(O)R², kde R² je zvolen ze skupiny hydroxy, nižší alkoxy a -NR³R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku a nižší alkyl a kde

   5 dusíkový atom skupiny -NR³R⁴ může být popřípadě aminovou skupinou N-konce peptidu, takže dojde k vytvoření cyklického peptidu,.......i........i..............................................r...............

   a jeho fyziologicky přijatelné soli.

   io
6. 6. Sloučenina podle nároku 2, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

   Xi X₂ X₃ X₄ X_s X₆ X₇ kde Xi znamená C, L, Μ, P, Q, V; X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je

   15 jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T, V nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X₇ znamená C, G, I, K, L, M, N, R nebo V.

   X
7. 7. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sekvence aminokyselin má cyklizovanou strukturu.
8. 8. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sekvence aminokyselin má dimenzovanou strukturu.
9. 9. Sloučenina podle nároku 6, kde sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin

   C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ . -;/··

   -89»· a a a kde X₂ znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, 1, L, M, R, S nebo V; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; a X₇ znamená C, G, 1, s K, L, Μ, N, R nebo V.
10. 10. Sloučenina podle nároku 8, kde X₄ je A, E, G, Η, K, L, Μ, P, Q, R,'S, T nebo W.

    jo_1.1.._Sloučenina,podle., nároku J.0,_kd.e_X? znamená_S_nebo T; X₃ znamená L nebo R; X₆ znamená R; X₅ znamená D, E nebo G; X₆ znamená F, L nebo W; a X₇ znamená I, K, L, R nebo V.
11. 12. Sloučenina podle nároku 9, kde uvedená sloučenina obsahuje

    15 sekvenci aminokyselin:

    X₈ C X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ X₇ *-* wm·· .·. j**- *4. , * .^-|||| ||| ||H |i_ti m„ | „ .tofrA n, . - Μ . ..M»· “ » ..-[.-‘fUTH.

    kde X₂ znamená F, K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, I, L, M, R, S, V nebo W; X₄ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin; X₅ je A, D, E, G, K, M, Q, R, S, T,

    20 V nebo Y; X₆ je C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ je C, G, i, K,

    L, Μ, N, R, nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin.
12. 13. Sloučenina podle nároku 12, kde X₈ znamená G, S, Y nebo R.
13. 14. Sloučenina podle nároku 12, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin: GGCTLREWLHGGFCGG.

    Φ a

    0 ·

    -9015. Sloučenina podle nároku 6, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

    X_e G X, X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde Xi znamená L, Μ, P, Q, nebo V; X₂ znamená F, R, S nebo s T; X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, WI, R, S, . - V. nebo T: Xs znamená.A._E: G. K. M. Q.. R. S._nebo-T:. X?

    znamená C, I, K, L, M nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin io 16. Sloučenina podle nároku 15, kde Xi znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená R; X_s znamená E nebo Q; X₇ znamená I nebo L.

    17. Sloučenina podle nároku 16, kde uvedená sloučenina obsahuje
14. 15 sekvenci aminokyselin:

    X₉ X₈ G X, X₂ X₃ X₄ X₅ W X₇ kde X₃ znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V; a X₉ znamená A, C, E, G, i, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V;.

    20 18. Sloučenina podle nároku 17, kde X₈ znamená D, E nebo K; a

    X₉ znamená A nebo I.
15. 19. Sloučenina podle nároku 18, kde uvedená sloučenina je zvolena ze skupiny GGCADGPTLREWISFCGG;G NADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTLR EWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;SI EGPTLREWLTSRTPHS:LAIEGPTLRQWLH ?G N G R D T;.C A D,G .P T L R E W I S> F O; a I EG P T.L R Q : ' W L A A R A.

    • ·

    9 9 9

    4 · • · *

    - 91 •li
16. 20. Způsob podle nároku 4, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin

    C X₂ X₃ X4 X5 x_e x₇ kde X₂ znamená K, L, N, Q, R, S, T nebo V; X₃ znamená C, F, «i«^!^L^M^.R_řxSTnsbo*V;rX^jérjakáko!!v^zⁱ20*gěneíicky^rkódOvariých™

    L-aminokyselin; X₅ znamená A, D, E, G, S, V, nebo Y; X₆ znamená C, F, G, L, M, S, V, W nebo Y; X₇ znamená C, G, I, K, L, Μ, N, R nebo V.
17. 21. Způsob podle nároku 20, kde X₄ znamená A, E, G, Η, K, L, M, P, Q, R, S, T nebo W.
18. 22. Způsob, podle nároku 21, kde X₂ je S nebo T; X₃ je L nebo R;

    15 X₄ je R; X₅ je D, E, nebo G; X₆ je F, L, nebo W; a X₇ je I, K, L,

    R, nebo V.

    I
19. 23. Způsob podle nároku 22, kde uvedená sloučenina podávaná pacientovi obsahuje sekvenci aminokyselin: GGCTLREW

    2D LHGGFCGG.
20. 24. Způsob podle nároku 4, kde porucha ovlivnitelná léčením agonistou trombopoetinu je zvolena ze skupiny: hematologické poruchy a trombocytopenie v důsledku chemoterapie, radiační
21. 25 terapie nebo transfuzí kostní dřeně.

    25. Způsob podle nároku 4, kde uvedená sloučenina podávaná ?pacientovi obsahuje'sekvenci aminokyselin > , > r. ί ’ i .

    4 4 • 4 4 4' a «» 4 4 • * 4 • · a·· β • 4 a 4 « 4 «4

    X₈GX₁X₂X₃X₄X₅WX₇ kde Xi znamená L, Μ, P, Q, nebo V: X₂ znamená F, R_s S nebo

    T; X₃ znamená F, L, V, nebo W; X₄ znamená A, K, L, M, R, S,

    V_t nebo T; X_s znamená A, E, G, K, M, Q, R, S, nebo T; X₇ s znamená C, I, K, L. M nebo V; a X₈ je jakákoliv z 20 geneticky kódovaných L-aminokyselin.
22. 26. Způsob podle nároku 25, kde Xi znamená P; X₂ znamená T; X₃ znamená L; X₄ znamená R; X₅ znamená E nebo Q; X₇ znamená ίο I nebo L.
23. 27. Způsob podle nároku 26, kde uvedená sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin:

    X₉X₈GX₁X₂X₃X₄X₅WX₇ is kde X₈ znamená A, C, D, E, K, L, Q, R, S, T, nebo V a X₉ znamená A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T, nebo V;.
24. 28. Způsob podle nároku 27, kde X₈ znamená D, E nebo K; a X₉ znamená A nebo I.

    20 ....
25. 29. Způsob podle nároku 28, kde sloučenina podávaná pacientovi je zvolena ze skupiny GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN;GGCADGPTL REWISFCGGK;TIKGPTLRQWLKSREHTS;S z I E G P T L RE W LT S R T P H S; L A I E G P T L R Q W LH

    G N G R D T; C AD G PT L R E W I S F C; a I E G P T L R Q W L A A R A.

    » o · · • 9' 9 9

    9 9 9 9 9 • 9 9 9

    19 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 h 9 9 *9

    9 9 99 · 9 9

    -9330. Sloučenina, která se váže na trombopoetinový receptor, kde uvedená sloučenina je zvolena ze skupiny

    CADGPTLREWI SFC ;

    [Ac]- CADGPTLREWISFC- [amid] ;

    0 = C A D'G R T L R E W I S F C - NH₂ ; a f f

    CH₂-s

    IEGPTLRQWLAARA |U

    ΊΤ ů ΓΊ LfXUVVLAAKA (jjaia)-K [NH₂J
26. 31. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou vnímavou k léčení agonistou trombopoetinu, který zahrnuje podávání sloučeniny zvolené že skupiny