PT2104674E - Análogos de tiofeno para o tratamento ou prevenção de infeções por flavivírus - Google Patents

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PT2104674E
PT2104674E PT78455342T PT07845534T PT2104674E PT 2104674 E PT2104674 E PT 2104674E PT 78455342 T PT78455342 T PT 78455342T PT 07845534 T PT07845534 T PT 07845534T PT 2104674 E PT2104674 E PT 2104674E
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amino
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Sanjoy Kumar Das
Laval Chan Chun Kong
Carl Poisson
Constantin G Yannopoulos
Guy Falardeau
Louis Vaillancourt
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Virochem Pharma Inc
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Description

1
DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DE TIOFENO PARA O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE INFEÇÕES POR FLAVIVÍRUS" A presente invenção refere-se a novos compostos e método para o tratamento ou prevenção de infeções por Flavivírus, utilizando os novos compostos. A hepatite é uma doença com incidência em todo o mundo. É geralmente de natureza virai, apesar de haver outras causas conhecidas. A hepatite virai é a forma mais comum de hepatite. Aproximadamente 750.000 Americanos são afectados por hepatite em cada ano e, desses, mais de 150.000 são infectados com o virus da hepatite C ("VHC"). O VHC é um virus com genoma de cadeia simples de ARN de sentido positivo pertencente à família Flaviviridae e com relação próxima aos pestivírus, que inclui o vírus da cólera suína e o vírus da diarreia virai bovina (BVDV). Acredita-se que a replicação do VHC é realizada através da produção de uma cópia de uma cadeia complementar negativa de ARN. Devido à falta de um sistema eficiente de cultura para a replicação do vírus, o VHC é isolado a partir de plasma humano, tendo sido demonstrado por microscopia electrónica que tem um diâmetro de cerca de 50-60nm. O genoma do VHC é formado por uma cadeia simples de ARN de polaridade positiva, contém cerca de 9.600 nucleótidos que codificam uma poliproteina de 3009-3030 aminoácidos, que é clivada co- e pós-translacionalmente em proteínas virais maduras (core, El, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Acredita-se que as glicoproteinas estruturais, El e E2, são incorporadas no envelope lipídico virai e formam 2 heterodimeros estáveis. Acredita-se também que a proteica estrutural do core interage com o ARN virai do genoma para formar o nucleocapsideo. As proteínas não-estruturais designadas por NS2 a NS5 incluiem proteínas com funções enzimáticas envolvidas na replicação virai e processamento de proteínas, incluindo a polimerase, protease e helicase. A principal fonte de contaminação com o VHC é o sangue. A magnitude da infeção por VHC como um problema de saúde é ilustrada pela prevalência junto os grupos de alto risco. Por exemplo, 60% a 90% dos hemofílicos e mais de 80% dos dependentes de drogas injectáveis em países ocidentais são cronicamente infectados com VHC. Para os dependentes de drogas injectáveis a prevalência varia de cerca de 28% a 70% dependendo da população estudada. A proporção de novas infeções por VHC associadas a pós-transfusões reduziu acentuadamente recentemente devido aos avanços nas ferramentas de diagnóstico utilizadas para o rastreio de doadores de sangue. A combinação do interferão peguilado com a ribavirina é o tratamento de escolha para a infeção crónica por VHC. Este tratamento não providencia uma resposta virai sustentada (SVR) na maioria dos pacientes infectados com os genótipos mais prevalentes (la e lb) . Ainda, efeitos secundários significativos impedem a conformidade do regime actual e pode ser necessário uma redução da dose ou a descontinuação em alguns pacientes.
Assim sendo, existe uma grande necessidade para o desenvolvimento de agentes anti-virais para o tratamento ou prevenção de infeções por Flavivirus. 3
Em um aspecto, a presente invenção providencia um composto de fórmula I: 0)
ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis;
Onde: R1 é Ci-6 alquilo, C3_6 cicloalquilo, ou C6-i4 arilo o qual é substituído uma ou mais vezes por -NH(Ci_4 alquilo) ,-N (C1-4 alquilo)2/ hidroxilo, NH2, 3-12 membro heterociclo, ou NHS02C6-i8 arilo; Z é H, halogéneo, C1-6 alquilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2_6 alcenilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes por R10, ou C2_6 alcenilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes R10; X é N' .M, ‘R8
R 4 M é 4
R5 é ciclohexilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R13; R6 é
* t f
N
I
I I ou ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por R14; Y é COOR7, COCOOR7, P(0)0Ra0Rb, S(0)0R7, S(0)2OR7, tetrazol, con(r7)ch(r7)coor7,conr8r9, con (r7)-so2-r7, CONR7OH e halogéneo; R7, R8 e R9 são independentemente H, C1-12 alquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2-12 alcenilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2-12 alcenilo o qual é não- substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C6-14 arilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11, C7-16 aralquilo o qual é não-substituído ou 5 substituído uma ou mais vezes por R11, 5-12 membro heteroarilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11, 6-18 membro heteroaralquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes R , 3-12 membro heterociclo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R12, ou 4-18 membro heterociclo-alquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R12, ou R8 e R9 são considerandos em conjunto com o atomo de azoto para formar um 3 a 10 membro heterociclo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R12 ou um 5-12 membro heteroarilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11; e
Ra e Rb são independentemente escolhidos de H, C1-12 alquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2-12 alcenilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2-12 alcenilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C6-14 arilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11, C7-16 aralquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11, 5-12 membro heteroarilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11, 6-18 membro heteroaralquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11, 3-12 membro heterociclo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R12, ou 4-18 membro heterociclo-alquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R12, ou Ra and Rb são considerados em conjunto com átomos de oxigénio para formar um 5 a 10 membro heterociclo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10 ou um 5-12 membro heteroarilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11; 6 R10 é halogéneo, oxo, -NH2, -NH(Ci_4 alquilo), -N (C1-4 alquilo) 2, -CONH2, -C0NH(Ci_4 alquilo), -CON (C1-4 alquilo) 2, -NHCOH, -N (C1-4 alquilo) COH, -N (C1-4 alquilo) COC1-4 alquilo, -NHCOC1-4 alquilo, -C(0)H, - C(0)Ci-4 alquilo, carboxi, -C(0)0 C1-4 alquilo, hidroxi, Ci_4 alquilo, nitro, nitroso, azido, ciano, -S(0)o_2H, -S(O)0-2Ci-4 alquilo, -S02NH2, -S02NH(Ci-4 alquilo), -S02N (Ci_4 alquilo) 2, - NHS02H, -N (Ci_4 alquilo) S02H, -N (C1-4 alquilo) S02Ci-4 alquilo, ou -NHS02Ci-4 alquilo; R11 é halogéneo, C1-6 alquilo, C1-6 alquilo halogenado, C2-6 alcenilo, C2-6 alcinilo, Ci_6 alcoxi, -NH2, -NH(Ci_4 alquilo), -N (Ci-4 alquilo) 2, -CONH2, -CONH(Ci-4 alquilo), -CON (Ci-4 alquilo) 2, -NHCOH, -N (C4-4 alquilo) COH,-N (C4-4 alquilo) COC4-4 alquilo, -NHCOCi_4 alquilo, -C(0)H, -C(0)Ci_4 alquilo, carboxi, -C(0)0C4-4 alquilo, hidroxil, C1-6 alcoxi, nitro, nitroso, azido, ciano, -S(0)o-2H, -S (0) 0-2Ci-4 alquilo, S02NH2, -S02NH(Ci_4 alquilo), -S02N(Ci-4 alquilo) 2, -NHS02H, - N (C1-4 alquilo) S02H, - N (C1-4 alquilo) S02Ci-4 alquilo, ou - NHS02Ci-4 alquilo; R12 é is halogéneo, oxo, C4-6 alquilo, C4-6 alquilo halogenado, C2-6 alcenilo, C2_6 alcinilo, -NH2, -NH(C4-4 alquilo), -N (C4_4 alquilo) 2, -C0NH2, -C0NH(Ci-4 alquilo), CON (C4-4 alquilo) 2, -NHCOH, -N (C4_4 alquilo) COH, -N (C4_4 alquilo) COC4-4 alquilo, -NHC0Ci-4 alquilo, -C(0)H, -C(0)Ci-4 alquilo, carboxi, -C(0)0Ci-4 alquilo, hidroxil, C4_6 alcoxi, nitro, nitroso, azido, ciano, -S(0)o-2H, -S (0) o-2C4-4 alquilo, -S02NH2, -S02NH(Ci_4 alquilo), -S02N(C4-4 alquilo) 2, -NHS02H, -N (Ci-4 alquilo) S02H, - N (Ci-4 alquilo) S02C4-4 alquilo, ou - NHS02Ci_4 alquilo; R13 é OH, halogéneo, Ci_g alquilo, C1-6 alquilo halogenado, C1-6 alcoxi, C1-6 alcoxi halogenado, ciano, nitro, -NH2, - 7 NH(Ci-4 alquilo), -N (C1-4 alquilo) 2, -CONH2, -CONH(Ci-4 alquilo), -CON (C1-4 alquilo) 2, -NHCOH, -N (C1-4 alquilo) COH,-N(Ci_4 alquilo) COC1-4 alquilo, -NHCOC1-4 alquilo, -C(0)H, - C (0) C1-4 alquilo, carboxi, -C(0)0Ci-4 alquilo, -5 (0) 0-2Ci_4 alquilo, —SO2NH2, -S02NH(Ci-4 alquilo), -S02N (C1-4 alquilo) 2, N(Ci_4 alquilo) S02H, - N (C1-4 alquilo) S02Ci-4 alquilo, NHSO2C1-4 alquilo, C6-4-arilo, C6-4-ariloxi, ou C6-i4-ariloxi-Ci-6~alquilo; R14 é OH, halogéneo, Ci_6-alcoxi, Ci-6-alquilo, Ci_6-alquilo-CO-NH-, Ci-6-alquilo-CO-N (Ci-6-alquilo)-, ou 5 a 10 membro heteroarilo; e R14a é Ci-6-alquilo, C3-7-CÍcloalquilo, Ci-6-alquilo halogenado, Ci-6_alquilo-C0-, -S(0)o-2Ci-4 alquilo, 5 a 10 membro heteroarilo ou C6-i4-arilo. seu sal farmaceuticamente aceitável.
Os compostos da presente invenção são inibidores da polimerase do VHC. Surpreendentemente, foi verificado que os compostos da presente invenção, tendo um padrão especifico de substituição, exibem propriedades melhoradas relativamente a outros inibidores da polimerase VHC de tiofeno. Assim sendo, acredita-se que os compostos da presente invenção possuem um excelente potencial para o tratamento e prevenção de infeções de hepatite C.
Um outro aspecto da invenção é referente ao método para o tratamento ou prevenção de infeção virai por Flaviviridae em pacientes que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente efectiva de um composto, composição ou combinação da invenção.
Num outro aspecto da invenção é providenciado uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto da invenção e pelo menos um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Um outro aspecto da invenção é referente a uma combinação compreendendo um composto da invenção e um ou mais agentes adicionais escolhidos de inibidores de proteases serinas virais, inibidores de polimerase virai, inibidores da helicase virai, agentes imunomodeladores, agentes antioxidantes, agentes antibacterianos, vacinas terapêuticas, agentes hepatoprotectores, agentes anti-sense, inibidores da protease VHC NS2/3 e inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES).
Em um outro aspecto da invenção, é fornecido a utilização de um composto, composição ou combinação da invenção para o tratamento ou prevenção de infeção virai por Flaviviridae em pacientes.
Ainda é um outro aspecto da invenção a utilização de um composto, composição ou combinação da invenção para a inibição ou redução da actividade da polimerase virai num paciente.
Também é aspecto da invenção a utilização de um composto, composição ou combinação da invenção para a produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infeção virai por Flaviviridae em pacientes.
Uma concretização consiste nos compostos da presente invenção que compreendem aqueles em que os seguintes modos 9 de realização estão presentes, independentemente ou em combinação.
Em conformidade com o composto ou método preferido, os compostos da presente invenção são representados pela fórmula estrutural IA: (IA)
X
ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; onde X, Y e R1 são definidos acima.
De acordo com um outro composto ou método, os compostos da presente invenção são representados pela fórmula IB: fi
ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; onde X, Y e R1, R5 e R6 são definidos acima.
Segundo uma outra concretização, R1 nas fórmulas I, IA e IB é Ci_6 alquilo, C3-6 cicloalquilo os quais são não-substituidos ou substituídos uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N (CH3) 2, ou hidroxilo. 10
De acordo com uma concretização da invenção, R1 nas fórmulas I, IA e IB é Ci-6 alquilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2, ou hidroxilo.
Segundo outra concretização, R1 nas fórmulas I, IA e IB é C1-6 alquilo.
De acordo com uma concretização, R1 nas fórmulas I, IA e IB é R1 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo ou tert.-butilo.
Segundo uma concretização, R1 nas fórmulas I, IA e IB é ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclohexilo.
De acordo com outra concretização, R1 nas fórmulas I, IA e IB é fenilo.
Segundo uma concretização, Z na fórmula é H, halogéneo ou C1-6 alquilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes por R10.
De acordo com uma concretização, Z na fórmula é H, halogéneo ou C1-4 alquilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes por R10.
Segundo uma concretização, Z na fórmula I é H ou C1-4 alquilo.
De acordo com uma concretização, Z na fórmula I é H ou metilo.
Segundo uma concretização, Y nas fórmulas I, IA e IB é COOR7 e R7 é H, C1-12 alquilo o qual é não-substituido ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2-12 alcenilo o qual 11 é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, C2-12 alcinilo o qual é não-substituído ou substituído um ou mais vezes por R10 ou Ce-A arilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11.
De acordo com uma concretização, Y nas fórmulas I, IA e IB é COOR7 e R7 é H, Ci_6 alquilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R10, Ce-4 arilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por R11.
Segundo uma concretização, Y nas fórmulas I, IA e IB é COOR7 e R7 é H, C1-4 alquilo ou fenilo.
De acordo com uma concretização, Y nas fórmulas I, IA e IB é COOR7 e R7 é H, metilo ou etilo.
Segundo uma concretização, Y nas fórmulas I, IA e IB é COOR7 e R7 é H.
De acordo com uma concretização, R5 nas fórmulas I, IA e IB é ciclohexilo o qual é não-substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, halogéneo, C1-6 alquilo, C1-6 alquilo halogenado, C1-6 alcoxi, Ci_6 alcoxi halogenado, ciano, nitro, -NH2, -NH(Ci_4 alquilo) ou -N (C1-4 alquilo) 2.
Segundo outra concretização, R5 nas fórmulas I, IA e IB é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4.
De acordo com uma concretização, nas fórmulas I, IA e IB X é -NR6-CO-R5 e R5 é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4 e o substituinte da posição 4 é na posição trans relativamente ao carbonilo. 12
Segundo uma concretização, R5 nas fórmulas I, IA e IB é ciclohexilo o qual é não-substituído ou substituído na posição 4 por OH, halogéneo, Ci-6 alquilo, Ci-6 alquilo halogenado, Ci_6 alcoxi, Ci-6 alcoxi halogenado, ciano, nitro, -NH2, -NH(Ci-4 alquilo) ou -N (C1-4 alquilo) 2 ·
De acordo com uma concretização, nas fórmulas I, IA e IB X é -NR6-CO-R5 e R5 é ciclohexilo o qual é não-substituído ou substituído na posição 4 por OH, halogéneo, C1-6 alquilo, Ci-6 alquilo halogenado, C1-6 alcoxi, C1-6 alcoxi halogenado, ciano, nitro, -NH2, -NH(Ci-4 alquilo) ou -N (C1-4 alquilo) 2 onde o substituinte da posição 4 é na posição trans relativamente ao grupo carbonilo.
Segundo uma outra concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, halogéneo, C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi.
De acordo com uma concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é ciclohexilo substituído na posição 4.
Segundo uma outra concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4 e o substituinte da posição 4 é na posição trans relativamente ao grupo amino.
De acordo com uma concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é ciclohexilo substituído na posição 4 por OH ou C1-6 alcoxi.
Segundo uma concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é 13 Ρ,4* ΟΓ
I ι I Λ.· 14a e R e Ci-6 alquilo, Ci_6 alquilo halogenado, Ci_6 alquilo-CO-,-S (0) 0-2C1-4 alquilo, heteroarilo ou C6-i4_arilo.
De acordo com uma concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é R,.a /14
j 1 Ί 4 r e R e C1-6 alquilo, Ci_6 alquilo halogenado, Ci_6 alquilo-CO, -S (0) 0-2C1-4 alquilo, heteroarilo ou C6-i4-arilo.
Segundo uma concretização, R6 nas fórmulas I, IA e IB é
i » 14 e R14a é metilo, etilo, propilo ou isopropilo.
De acordo com outra concretização, nas fórmulas I ou IB R6 é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4 por OH, Ci-6 alquilo ou Ci_6 alcoxi onde o substituinte da posição 4 é na posição trans relativamente ao qrupo amino.
Segundo outra concretização, nas fórmulas I ou IB R6 é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4 por OH, Ci-6 alquilo ou Ci-6 alcoxi onde o substituinte da posição 4 é na posição trans relativamente ao grupo amino e R5 é ciclohexilo o qual é não-substituído ou substituído na posição 4 por OH, halogéneo, Ci-6 alquilo, Ci-β alquilo halogenado, Ci_6 alcoxi, Ci-6 alcoxi halogenado, ciano, nitro, -NH2, -NH(Ci-4 alquilo) ou -N (C1-4 alquilo) 2, onde o substituinte da posição 4 é na posição trans relativamente ao grupo carbonilo.
De acordo com uma concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos de fórmula (IB) ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo o qual é em cada caso não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, Halogéneo (por exemplo, F) C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo, C1-4 15 alquilo-CO-NH-, C1-4 alquilo-CO-N (C1-4 alquilo)- ou triazolilo; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-i4 arilo.
De acordo com uma concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo; R5 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, Halogéneo (por exemplo, F) C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo, C1-4 alquilo-CO-NH-, C1-4 alquilo-CO-N (C1-4 alquilo)- ou triazolilo; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-14 arilo.
De acordo com uma concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído na posição 4 por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; 16 R6 é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4 por OH, halogéneo (por exemplo, F) , C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo, C1-4 alquilo-CO-NH-, C1-4 alquilo-CO-N (C1-4 alquilo)- ou triazolilo; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-i4 arilo.
De acordo com uma concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci_6 alquilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído na posição 4 por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído na posição 4 por OH, halogéneo (por exemplo, F) , C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo, C1-4 alquilo-CO-NH-, C1-4 alquilo-CO-N (Ci_4 alquilo)- ou triazolilo; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-14 arilo.
De acordo com uma concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: 17 R1 é Ci-6 alquilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo ou C1-4 alquilo halogenado; Y é COOR7; e R7 é H ou C1-4 arilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi ou C1-4 alquilo; Y é COOR7; e R7 é H ou C1-4 alquilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos 18 compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi ou C1-4 alquilo; Y é COOR7; e R7 é H ou C1-4 alquilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi ou C1-4 alquilo; Y é COOR7; e R7 é H ou C1-4 alquilo. 19
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, tert.-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclohexilo, que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo ou C1-4 alquilo halogenado; Y é COOR7; e R7 é H ou C1-4 alquilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, tert.-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclohexilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; 20 R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, Ci-4 alcoxi,Ci_4 alquilo ou C1-4 alquilo halogenado; Y é COOR7; e R7 é H ou C1-4 alquilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, tert.-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclohexilo, que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, Ci_4 alquilo ou Ci_4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo ou Ci_4 alquilo halogenado; Y é COOH.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: 21 R1 é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, tert.-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclohexilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo ou C1-4 alcoxi; R6 é ciclohexilo o qual é substituído uma ou mais vezes por OH, F, C1-4 alcoxi, C1-4 alquilo ou C1-4 alquilo halogenado; Y é COOH.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N (CH3) 2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é
Pu·
22 14a R e Ci-6 alquilo, Ci-6 alquilo halogenado, Ci-6 alquilo-CO-, S (0) o_2Ci-4 alquilo, heteroarilo ou Ce-ΐΛ arilo; Y é COOR7; e R7 é H, Ci-i2 alquilo ou C6-i4 arilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é R14a / 14
14o R e Ci_6 alquilo, Ci_6 alquilo halogenado, Ci_6 alquilo-CO-, S (0) 0-2C1-4 alquilo, heteroarilo ou C6-i4 arilo; Y é COOR7; e R7 é H, Ci-11 alquilo ou C6-14 arilo. 23
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais f armaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N(CH3)2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é
R14a é C1-6 alquilo ou C1-6 alquilo halogenado; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-14 arilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: 24 R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é R1áa/ 14
* 1 1 or
✓R143 l· l· 14o R e C1-6 alquilo ou C1-6 alquilo halogenado; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-i4 arilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é C1-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N (CH3) 2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; 25 R6 é
t I I or
I R1áa ✓ 14 R14a é Ci_6 alquilo; Y é COOR7; e R7 é H, Ci-i2 alquilo ou Ce-ΐΛ arilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é R14a
N L J or
I l· ,R143
* I 26 R14a é Ci-6 alquilo; Y é COOR7; e R7 é H, Ci-12 alquilo ou Ce-14 arilo.
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo que em cada caso é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por -NH2, NHCH3, N (CH3) 2 ou hidroxilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi;
14o R e metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, tert.-butilo; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-14 arilo. 27
De acordo com outra concretização preferencial da invenção, os compostos da presente invenção são seleccionados dos compostos da fórmula (IB) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: R1 é Ci-6 alquilo ou C3-6 cicloalquilo; R5 é ciclohexilo o qual é não substituído ou substituído uma ou mais vezes por OH, C1-4 alquilo e/ou C1-4 alcoxi; R6 é
R14a é metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, tert.-butilo; Y é COOR7; e R7 é H, C1-12 alquilo ou C6-i4 arilo.
De acordo com um aspecto da invenção, os compostos da invenção são seleccionados entre os seguintes: ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL0-BUT-1-INIL0)-3-[ (TRAN S-4-ΗIDROXI- CICLOHEXILO)-(TRANS-4-METIL-CICL0HEXAN0 CARBONILO)-AMINO]-TI0FEN0-2-CARB0XÍLICO; 28 ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4-ΜΕΤΟΧΙ- CICLOHEXILO)-(TRANS-4- METIL-CICLOHEXANO CARBONILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4-METILO- CICLOHEXANO CARBONILO)-(CIS-4-[1,2,4]TRIAZOL-1-IL- CICLOHEXILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4-METILO- CICLOHEXANO CARBONILO)-(TRANS4-[1,2,4]TRIAZOL-1-IL- CICLOHEXILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(CIS-4-HIDROXI- CICLOHEXILO)-(TRANS-4-METILO-CICLOHEXANO CARBONILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4-METILO- CICLOHEXANO CARBONILO)-(1-METILO-PIPERIDINA-4-IL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; CLORIDRATO; ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4-METILO- CICLOHEXANO CARBONILO)-(4-CIS-[1,2,3]TRIAZOL-l-IL-
CICLOHEXILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO ÁCIDO 5-(3,3- DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4-METILO-CICLOHEXANO CARBONILO)-(TRANS-4-[1,2,3]TRIAZOL-1-IL- CICLOHEXILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; e ÁCIDO 5-(3,3-DIMETILO-BUT-l-INILO)-3-[(TRANS-4- FLUOROCICLOHEXILO)-(TRANS-4-METIL-CICLOHEXANO CARBONILO)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO.
Numa concretização, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto de acordo com a invenção aqui descrita e pelo menos um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Numa outra concretização, a presente invenção providencia uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto de acordo com a invenção aqui descrita e 29 compreende ainda a administração de pelo menos um agente adicional seleccionado entre inibidores de proteases serinas virais, inibidores de polimerase virai, inibidores da helicase virai, agentes imunomodeladores, agentes antioxidantes, agentes antibacterianos, vacinas terapêuticas, agentes hepatoprotectores, agentes anti- sense, inibidores da protease VHC NS2/3 e inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES).
Noutra concretização da invenção, é fornecida uma combinação compreendendo pelo menos um composto de acordo com a invenção aqui descrita e um ou mais agentes adicionais, seleccionados de inibidores de proteases serinas virais, inibidores de polimerase virai, inibidores da helicase virai, agentes imunomodeladores, agentes antioxidantes, agentes antibacterianos, vacinas terapêuticas, agentes hepatoprotectores, agentes anti- sense, inibidores da protease VHC NS2/3 e inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES).
Numa realização de combinação, o composto e o agente adicional são administrados sequencialmente.
Numa outra concretização de combinação, o composto e o agente adicional são administrados simultaneamente.
As combinações acima referidas podem ser, convenientemente, apresentadas para a utilização em formulações farmacêuticas e estas formulações farmacêuticas compreendem a combinação como acima definida, juntamente com o veiculo farmaceuticamente aceitável e que constitui um outro aspecto da invenção. 30
Os agentes adicionais para as composições e combinações incluem, por exemplo, ribavirina, amantadina, merimepodib, Levovirin, Viramidine e Maxamine.
O termo "inibidor de protease serina virai" como aqui utilizado significa um agente que é efectivo para inibir a função da protease serina virai, incluindo a protease serina VHC num mamífero. Inibidores de protease serina VHC incluem, por exemplo, os compostos descritos em WO 99/07733 (Boehringer Ingelheim), WO 99/07734 (Boehringer Ingelheim), WO 00/09558 (Boehringer Ingelheim), WO 00/09543 (Boehringer Ingelheim), WO 00/59929 (Boehringer Ingelheim), WO 02/060926 (BMS), WO 2006039488 (Vertex), WO 2005077969 (Vertex), WO 2005035525 (Vertex), WO 2005028502 (Vertex) WO 2005007681 (Vertex), WO 2004092162 (Vertex), WO 2004092161 (Vertex), WO 2003035060 (Vertex), WO 03/087092 (Vertex), WO 02/18369 (Vertex) ou W098/17679 (Vertex). O termo "inibidor de polimerase virai" como aqui utilizado significa um agente que é efectivo para inibir a função da polimerase virai, incluindo a polimerase VHC num mamífero. Inibidores de polimerase VHC incluem não-nucleósidos, por exemplo, os compostos descritos em: WO 03/010140 (Boehringer Ingelheim), WO 03/026587 (Bristol Myers
Squibb); WO 02/100846 Al, WO 02/100851 A2, WO 01/85172 AI(GSK), WO 02/098424 Al (GSK), WO 00/06529 (Merck), WO 02/06246 Al (Merck), WO 01/47883 (Japan Tobacco), WO 03/000254 (Japan Tobacco) e EP 1 256 628 A2 (Agouron). Ainda, outros inibidores de polimerase VHC também incluem analogos de nucleósidos, por exemplo, os compostos descritos em: WO 01 /90121 A2 (Idenix), WO 02/069903 A2 (Biocryst Pharmaceuticals Inc.) e WO 02/057287 A2(Merck/Isis) e WO 02/057425 A2 (Merck/Isis). 31
Exemplos específicos de inibidores nucleósidos de uma polimerase VHC incluem R1626/R1479 (Roche), R7128(Roche), MK-0608 (Merck), R1656, (Roche-Pharmasset) e Valopicitabine (Idenix).
Exemplos específicos de inibidores de uma polimerase VHC incluem JTK-002/003 e JTK-109 (Japan Tobacco), HCV-796 (Viropharma), GS-9190(Gilead) e PF-868,554 (Pfizer). 0 termo "inibidor de helicase virai" como aqui utilizado significa um agente que é efectivo para inibir a função da helicase virai, incluindo helicase de Flaviviridae num mamífero. "Agente imunomodelador" como aqui utilizado significa agentes que são efectivos para aumentar ou potenciar a resposta do sistema imunitário num mamífero. Agentes imunomodeladores incluem, por exemplo, interferões classe I (tais como, interferões α-, β-,δ- e Ω-, τ-interferões, interferões consensus e asialo-interferões) , interferões classe II (tais como, γ-interferões) e interferões peguilados. 0 termo "interferão classe I" como aqui utilizado significa interferão seleccionado do grupo de interferões que se ligam ao receptor tipo 1. Inclui ambos os interferões classe I produzidos naturalmente ou sinteticamente. Exemplos de interferões classe I incluem interferões α-, β-,δ- e Ω-, ι-interferões, interferões consensus e asialo-interferões. 0 termo "interferão classe II" como aqui utilizado significa interferão seleccionado do grupo de interferões que se ligam ao receptor tipo II. Exemplos de interferões classe II incluem γ-interferões.
Agentes antisense incluem, por exemplo, ISIS-14803.
Exemplos específicos de inibidores da protease VHC NS2/3 incluem BILN-2061 (Boehringer Ingelheim) SCH-6 e SCH-503034/Boceprevir(Schering-Plough),VX-50/telaprevir(Vertex) 32 and ITMN-B (InterMune), GS9132 (Gilead), TMC-435350(Tibotec/Medivir), ITMN-191 (InterMune), MK-7009 (Merck).
Inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES9 incluem ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals) e os compostos descritos em WO 2006019831 (PTC therapeutics).
Numa concretização, o agente adicional é o a-interferão, ribavirina, Silybum marianum, interleucina-12, amantadina, ribozima, timosina, N-acetilcisteina ou ciclosporina.
Numa outra concretização, o agente adicional é o a-interferão IA, α-interferão 1B, α-interferão 2A ou a-interferão 2B. O interferão está disponível nas formas interferões peguilados e não peguilados. Interferões peguilados, incluem PEGASYStm e Peg-introntm. A dose recomendada de PEGASYStm monoterapia para a hepatite C crónica é 180mg (1,0 mL frasco ou 0,5 mL seringa pré-cheia) uma vez por semana durante 48 semanas através de administração subcutânea no abdómen ou na coxa. A dose recomendada de PEGASYStm quando utilizado em combinação com a ribavirina para hepatite C crónica é de 180 mg (1,0 mL ou 0,5 mL frasco ou seringa pré-cheia) uma vez por semana. A dose diária de ribavirina é 800 mg a 1500 mg administradas oralmente em duas doses divididas. A dose deverá ser individualizada ao paciente dependendo das caracteristicas da doença base (isto é, genótipo), resposta à terapia e regime de tolerância. A dose recomendada do regime Peg-introntm é 1.0 mg/Kg/semana subcutaneamente durante uma semana. A dose deverá ser administrada no mesmo dia da semana.
Quando administrada em combinação com a ribavirina, a dose recomendada de Peg-introntm é 1,5 yg/Kg/semana. 33
Numa concretização, o inibidor protease serina virai é inibidor protease serina flaviviridae.
Numa concretização, o inibidor polimerase virai é o inibidor polimerase flaviviridae.
Numa outra concretização, o inibidor helicase virai é inibidor helicase flaviviridae.
Em outras concretizações: 0 inibidor protease serina virai é inibidor protease serina VHC; 0 inibidor polimerase virai é inibidor polimerase VHC; o inibidor helicase virai é inibidor helicase VHC.
Numa concretização, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de infeção virai por Flaviviridae no hospedeiro, compreendendo a administração no hospedeiro de uma quantidade terapeuticamente efectiva de pelo menos um composto de acordo com a fórmula I.
Numa concretização, a infeção virai é selecionada de infeções por Flavivirus.
Numa realização, a infeção por Flavivirus é virus da hepatite C (VHC), virus da diarréia virai bovina (BVDV), vírus da cólera suína, vírus da dengue, vírus da encefalite japonesa ou vírus da febre-amarela.
Numa realização, a infeção por Flavivirus é virus da hepatite C (VHC).
Numa concretização, a presente invenção providencia um método para o tratamento ou prevenção de infeção virai por Flaviviridae no hospedeiro, compreendendo a administração no hospedeiro de uma quantidade terapeuticamente efectiva de pelo menos um composto de acordo com a invenção aqui descrita, e ainda compreende a administração de pelo menos um agente adicional seleccionado entre inibidores de 34 proteases serinas virais, inibidores de polimerase virai, inibidores da helicase virai, agentes imunomodeladores, agentes antioxidantes, agentes antibacterianos, vacinas terapêuticas, agentes hepatoprotectores, agentes anti-sense, inibidores da protease VHC NS2/3 e inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES).
Numa realização, é fornecido um método para a inibição ou redução da actividade da polimerase virai no hospedeiro através da administração de uma quantidade terapeuticamente efectiva de um composto de acordo com a invenção aqui descrita.
Numa concretização, é fornecido um método para a inibição ou redução da actividade da polimerase virai no hospedeiro através da administração de uma quantidade terapeuticamente efectiva de um composto de acordo com a invenção aqui descrita e ainda a administração de um ou mais inibidores da polimerase virai.
Numa concretização, a polimerase virai é a polimerase virai flaviviridae.
Numa outra concretização, a polimerase virai é a ARN polimerase ARN dependente.
Numa realização, a polimerase virai é a polimerase VHC.
As combinações acima referidas podem ser, convenientemente, apresentadas para a utilização em formulações farmacêuticas e estas formulações farmacêuticas compreendem a combinação acima definidas juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável e que, assim, consiste num outro aspecto da invenção.
Os componentes individuais para utilização no método da presente invenção ou combinações da presente invenção podem ser administradas quer sequencialmente ou simultaneamente em separado ou cominado com outras formulações farmacêuticas. 35
Numa realização, a presente invenção fornece a utilização de um composto de acordo com a invenção aqui descrita para o tratamento ou prevenção de infeção virai Flaviviridae num hospedeiro.
Numa concretização, a presente invenção providencia a utilização de um composto de acordo com a invenção aqui descrita para a produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infeção virai Flaviviridae num hospedeiro.
Numa concretização, a presente invenção fornece a utilização de um composto de acordo com a invenção aqui descrita para a inibição ou redução da actividade da polimerase virai num hospedeiro.
Será apreciado pelos peritos na especialidade que os compostos de acordo com a presente invenção possam existir como estereoisómeros (por exemplo, ópticos (+ e -) , geométricos (cis e trans) e isómeros conformacionais (axial e equatorial). Todos estes estereoisómeros estão incluídos no âmbito da presente invenção.
Será apreciado pelos peritos na especialidade que os compostos de acordo com a presente invenção possam conter um centro quiral. Os compostos da fórmula podem então existir na forma de dois isómeros ópticos diferentes (isto é, enantiómeros (+) e (-)). Todos estes enantiómeros e suas misturas incluindo misturas racémicas estão incluídas no âmbito da presente invenção. 0 isómero óptico ou enantiómero pode ser obtido através de um método bem conhecido do estado da técnica, tal como HPLC quiral, resolução enzimática e auxiliar quiral.
Numa realização, os compostos da presente invenção são providenciados na forma de um único enantiómero em pelo menos 95%, pelo menos 97% e pelo menos 99% livre do enantiómero correspondente. 36 E uma concretização, o composto da presente invenção ser na forma enantiómero ( + ) em pelo menos 95% livre do enantiómero (-) correspondente. É uma concretização, o composto da presente invenção ser na forma enantiómero (+) pelo menos 97% livre do enantiómero (-) correspondente. É uma concretização, o composto da presente invenção ser na forma enantiómero (+) pelo menos 99% livre do enantiómero (-) correspondente. É uma concretização, o composto da presente invenção ser na forma enantiómero (-) pelo menos 95% livre do enantiómero (+) correspondente. É uma concretização, o composto da presente invenção ser na forma enantiómero (-) pelo menos 97% livre do enantiómero (+) correspondente. É uma concretização, o composto da presente invenção ser na forma enantiómero (-) pelo menos 99% livre do enantiómero (+) correspondente. São ainda fornecidos sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção. Pelo termo sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos entende-se aqueles que derivam de ácidos ou bases inorgânicas ou orgânicas farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de ácidos adequados incluem ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, trifluoroacético, cítrico, metanossulfónico, fórmico, benzóico, malónico, naftaleno-2-sulfónico e ácido benzenossulfónico.
Outros ácidos como o oxálico, além de não serem farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis como intermediários na obtenção de compostos da invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 37
Sais derivados de aminoácidos também estão incluídos (por exemplo L-arginina, L-lisina).
Sais derivados de bases apropriadas incluem metais alcalinos (por exemplo, sódio, litio, potássio), metais alcalino-terrosos (por exemplo, cálcio, magnésio) , amónio, sais NR4 + (em que R é C4-4 alquilo), colina e trometamina. Uma referência a seguir para um composto de acordo com o invento inclui esse composto e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. A referência doravante a um composto de acordo com a invenção inclui o composto e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Numa realização da invenção, o sal farmaceuticamente aceitável é o sódio.
Numa realização da invenção, o sal farmaceuticamente aceitável é o litio.
Numa realização da invenção, o sal farmaceuticamente aceitável é o potássio.
Numa realização da invenção, o sal farmaceuticamente aceitável é a trometamina.
Numa realização da invenção, o sal farmaceuticamente aceitável é a L-arginina.
Será apreciado pelos peritos na especialidade que os compostos de acordo com a presente invenção possam existir em diferentes formas polimórficas. Como conhecido no estado da técnica, polimorfismo é a capacidade de um composto para cristalizar em mais que uma estrutura distinta cristalina ou "polimórfica". Um polimorfo consiste na fase cristalina sólida de um composto com pelo menos dois arranjos diferentes ou formas polimórficas da molécula desse composto no estado sólido. Formas polimórficas de um dado composto são definidas pela mesma fórmula quimica ou 38 composição e são distintas na estrutura química como as estruturas cristalinas de dois compostos químicos diferentes.
Será também apreciado pelos peritos na especialidade que os compostos de acordo com a presente invenção possam existir em diferentes formas de solvato, por exemplo, hidratos. Solvatos dos compostos da invenção podem também ser formados quando moléculas do solvente são incorporadas na estrutura da rede cristalina da molécula do composto durante o processo de cristalização.
Se não for definido de uma outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como normalmente entendido por um perito na especialidade à qual pertence esta invenção. Em caso de divergência, a presente especificação, incluindo as definições, prevalecerão. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não limitativos. 0 termo "alquilo" representa um radical de hidrocarboneto linear, ramificado ou cíclico. Os termos "alcenilo" e "alcinilo" representam um radical de hidrocarboneto linear, ramificado ou cíclico o qual tem um ou mais ligações duplas ou triplas na cadeia. Exemplos do alquilo, alcenilo e alcinilo incluem, mas não estão limitados a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo, hexilo, iso-hexilo, neo-hexilo, alilo, vinilo, acetilenilo, etilenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, isobutenilo, hexenilo, butadienilo, pentenilo, pentadienilo, hexenilo, hexadienilo, hexatrienilo, heptenilo, heptadienilo, heptatrienilo, octenilo, octadienilo, octatrienilo, octatetraenilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclo-hexenilo, ciclo-hexilo e 39 ciclohexdienilo. Quando indicado o "alquilo", "alcenilo" e "alcinilo" podem ser opcionalmente substituídos como no caso dos halo-alquilos nos quais um ou mais átomos de hidrogénio são substituídos por um halogéneo, por exemplo, um haleto de alquilo. Exemplos de haletos de alquilo incluem, mas não estão limitados a, trifluorometilo, difluorometilo, fluorometilo, triclorometilo, diclorometilo, clorometilo,trifluoroetilo, difluoroetilo, fluoroetilo, tricloroetilo, dicloroetilo, cloroetilo, clorofluorometilo, clorodifluorometilo, diclorofluoroetilo. Além dos halogéneos, onde indicado, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo também podem ser opcionalmente substituídos por, por exemplo, oxo, NRdRe, - CONRdRe, =NO-Re, NRdCORe, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, Ci-6 alquiloxi, C2-6 alceniloxi, C2-6 alceniloxi, -N (Rd) C (=NRe) -NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, -N (Rh) CONRdRj, S(0)o-2Ra/ C(0)Ra, C(0)0Ra, NRaC (0) Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=0Rb, e/ou NRaC00Rb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2-4 alcenilo ou C2-4 alcinilo.
Os termos "cicloalquilo" e "cicloalcenilo" representam um hidrocarboneto cíclico alquilo ou alcenilo, respectivamente, e pretende-se que incluam monocíclico (por exemplo, ciclo-hexilo), espiro (por exemplo, espiro [2.3] hexanilo) , fundido (por exemplo, biciclo [4.4.0] decanilo) e ponte (por exemplo, biciclo [2.2.1] heptanilo) nas cadeias do hidrocarboneto.
Os termos "alcoxi", "alceniloxi" e "alciniloxi" representam uma cadeia alquilo, alcenilo ou alcinilo, respectivamente, que estão covalentemente ligados a um átomo adjacente através de um átomo de oxigénio. Tal como os grupos alquilo, alcenilo ou alcinilo, onde indicado, os grupos alcoxi, alceniloxi e alciniloxi também podem ser opcionalmente substituídos. Exemplos incluem, mas não são 40 limitativos, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentiloxi, isopentiloxi, neopentiloxi, terc-pentiloxi, hexiloxi, iso-hexiloxi, trifluorometoxi e neohexiloxi. Os grupos alcoxi, alceniloxi e alciniloxi podem ser opcionalmente substituídos por, por exemplo, oxo, NRdRe, - CONRdRe, NRdCORe, carboxi, C (=NRd)NReRf, azido, ciano, -N (Rd) C (=NRe) -NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, Ci_6 alquilo, C2-6 alcenilo ou C2-6 alcinilo, -N (Rh) CONRiRj, S(O)0-2Ra, C(0)Ra, C(0)0Ra, ,=NO-Re, NRaC (O) Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=ORb, e/ou NRaCOORb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, Ci_4 alquilo, C2-4 alcenilo ou C2-4 alcinilo. O termo "arilo" representa uma cadeia carbocíclica que contém pelo menos um anel benzenóide (pode ser monocíclico ou policíclico) e, se indicado, pode opcionalmente ser substituído por um ou mais substituintes. Exemplos incluem, mas não limitativos, fenilo, tolilo, dimetilfenilo, aminofenilo, anilinilo, naftilo, antrilo, fenantrilo ou bifenilo. Os grupos arilo podem ser opcionalmente substituídos por, por exemplo, halogénios, NRdRe, - CONRdRe, NRdCORe, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, -N (Rd) C (=NRe) -NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, -N (Rh) CONRiRj, C1-6 alquilo, C2-6 alcenilo ou C2-6 alcinilo, C1-6 alquiloxi, C2-6 alceniloxi, C2-6 alceniloxi, S (O) o_2Ra, opcionalmente substituído no membro 5-12 do heteroarilo, opcionalmente substituído no membro 6-18 do heteroaralquilo, opcionalmente substituído no membro 3-12 do heterociclo, opcionalmente substituído no membro 4-18 do heterociclo-aquilo, C(0)Ra, C(0)0Ra, NRaC(0)Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=ORb, e/ou NRaCOORb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2-4 alcenilo ou C2-4 alcinilo. O termo "aralquilo" representa um grupo arilo ligado ao atomo adjacente por um alquilo, alcenilo ou alcinilo. Tal 41 como os grupos arilos, quando indicado, os grupos aralquilos também podem ser, opcionalmente, substituídos. Exemplos incluem, mas não são limitativos, benzilo, benzidrilo, tritilo, fenetilo, 3-fenilpropilo, 2-fenilpropilo, 4-fenilbutilo e naftilmetilo. Quando indicado, os grupos aralquilos podem ser opcionalmente substituídos por, por exemplo, halogénios, NRdRe, - CONRdRe, NRdCORe, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, -N (Rd) C (=NRe) -NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, -N (Rh) CONRiRj, Ci-6 alquilo, C2-6 alcenilo ou C2-6 alcinilo, Ci-g alquiloxi, C2-6 alceniloxi, C2-6 alceniloxi, S (0) 0-2Ra, opcionalmente substituído no membro 5-12 do heteroarilo, opcionalmente substituído no membro 6-18 do heteroaralquilo, opcionalmente substituído no membro 3-12 do heterociclo, opcionalmente substituído no membro 4-18 do heterociclo-aquilo, C(0)Ra, C(0)0Ra, NRaC (0) Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=0Rb, e/ou NRaC00Rb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2-4 alcenilo ou C2-4 alcinilo. 0 termo "heterociclo" representa um não aromático, opcionamante substituído, saturado ou parcialmente saturado, onde a cadeia cíclica é interrompida por pelo menos um heteroatomo, seleccionado entre o oxigénio (0) , enxofre (S) ou azoto (N) . Heterociclos podem ser anéis monocíclicos ou policíclicos. Exemplos incluem, mas não são limitativos, azetidinilo, dioxolano, morfolinilo, morfolino, oxetanilo, piperazinilo, piperidilo, piperidino, ciclopenta pirazolilo, ciclopenta-oxazinilo, ciclopenta-furanilo. Quando indicado, os grupos heterocíclicos podem ser, opcionalmente, substituídos por, por exemplo, halogénios, oxo, NRdRe, - C0NRdRe, =N0-Re, NRdC0Re, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, -N (Rd) C (=NRe) -NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, -N (Rh) CONRiRj, Ci-6 alquilo, C2-6 alcenilo, C2-6 alcinilo, C7-12 aralquilo, C6-i2 aril, C1-6 alquiloxi, C2-6 42 alceniloxi, C2-6 alceniloxi, S (0) o-2Ra/ Ce-ιο aril, C6-10 ariloxi, C7-10 arilalquilo, C6-10 aril- C1-10 alquiloxi, C(0)Ra, C (0) 0Ra, NRaC(0)Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=0Rb, e/ou NRaC00Rb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2-4 alcenilo ou C2-4 alcinilo. 0 termo "heterociclo-alquilo" representa um grupo heterociclo, opcionamente substituído" ligado ao atomo adjacente por um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo. É entendido que no membro 5-18 da cadeia heterociclo-alquilo, o membro 5-18 representa os átomos que estão presentes em ambos, a cadeia heterocíclica e o grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo. Por exemplo, os grupos seguintesestão englobados por o membro 7 do heterociclo-alquilo (* representa o ponto de ligação):
Quando indicado, os grupos heterociclo-alquilo podem ser, opcionalmente, substituídos por, por exemplo, halogénios, oxo, NRdRe, -C0NRdRe, NRdC0Re, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, -N (Rd) C (=NRe)-NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, N (Rh) CONRiRj, C1-6 alquilo, C2-6 alcenilo, C2_6 alcinilo, Ci_6 alquiloxi, C2_6 alceniloxi, C2_6 alciniloxi, S(0)o-2Raí C6_i0 aril, C6-io ariloxi, C7-10 arilalquilo, C6-io aril- Ci_i0 alquiloxi, C(0)Ra, C(0)0Ra, NRaC(0)Rb, =N0-Re, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=0Rb, e/ou NRaC00Rb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2_4 alcenilo ou C2-4 alcinilo. 43 0 termo "heteroarilo" representa uma cadeia cíclica aromática, opcionalmente substituída, onde a cadeia cíclica é interrompida por pelo menos um heteroatomo seleccionado entre o oxigénio (0) , enxofre (S) ou azoto (N) . Heterociclos podem ser anéis monocíclicos ou policíclicos. Exemplos incluem, mas não são limitativos, azepinilo, aziridinilo, azetilo, diazepinilo, ditiadiazinilo, dioxazepinilo, ditiazolilo, furanilo, isoxazolilo, isotiazolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, oxiranilo, oxazinilo, oxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo, piridilo, piranilo, pirazolilo, pirrolilo, pirrolidinilo, tiatriazolilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tiazolilo, tienilo, tetrazinilo, tiadiazinilo, triazinilo, tiazinilo, tiopiranilo, furoisoxazolilo, imidazotiazolilo, tienoisotiazolilo, tienotiazolilo, imidazopirazolilo, pirrolopirrolilo, tienotienilo, tiadiazolopirimidinilo, tiazolotiazinilo, tiazolopirimidinilo, tiazolopiridinilo, oxazolopirimidinilo, oxazolopiridilo, benzoxazolilo, benzisotiazolilo, benzotiazolilo, imidazopirazinilo, purinilo, pirazolopirimidinilo, imidazopiridinilo, benzimidazolilo, indazolilo, benzoxatiolilo, benzodioxolilo, benzoditiolilo, indolizinilo, indolinilo, isoindolinilo, furopirimidinilo, furopiridilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, tienopirimidinilo, tienopiridilo, benzotienilo, benzoxazinilo, benzotiazinilo, quinazolinilo, naftiridinilo, quinolinilo, isoquinotinilo, benzopiranilo, piridopiridazinilo e piridopirimidinilo. Quando indicado, os grupos heteroarilo podem ser, opcionalmente, substituídos por, por exemplo, halogénios, NR-dE-er -CONRdRe, NRdC0Re, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, -N (Rd) C (=NRe)-NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, N (Rh) CONRiRj, Ci-6 alquilo, C2-6 alcenilo, C2-6 alcinilo, C1-6 44 alquiloxi, C2-6 alceniloxi, C1-6 alciniloxi, S(0)o-2Ra/ C6-10 aril, C6-10 ariloxi, C7-10 arilalquilo, C6-10 aril-Ci-10 alquiloxi, C (0) Ra, C(0)0Ra, NRaC (0) Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=0Rb, e/ou NRaC00Rb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2_4 alcenilo ou C2_4 alcinilo. 0 termo "heteroaralquilo" representa um grupo heteroarilo, opcionalmente substituído, ligado a um atomo adjacente por um alquilo, alcenilo ou alcinilo. Quando indicado, os grupos heteroaralquilo podem ser, opcionalmente, substituídos por, por exemplo, halogénios, NRbRe, -CONR^Re, NRdCORe, carboxi, -C (=NRd) NReRf, azido, ciano, -N (Rb) C (=NRe)-NRfRg, hidroxilo, nitro, nitroso, -N (Rh) CONRiRj, C1-6 alquilo, C2-6 alcenilo, C2-6 alcinilo, C1-6 alquiloxi, C2-6 alceniloxi, C1-6 alciniloxi, S (0) o^Ra/· C6-io aril, C6-io ariloxi, C7-10 arilalquilo, C6-10 aril-Ci-10 alquiloxi, C(0)Ra, C(0)0Ra, NRaC (0) Rb, S02NRaRb, NRaS02Rb, NRaS02NRbRc, CRaN=0Rb, e/ou NRaC00Rb, onde Ra-Rj são cada um independentemente H, C1-4 alquilo, C2-4 alcenilo ou C2-4 alcinilo. É entendido que no membro 6-18 da cadeia heteroaralquilo, o membro 6-18 representa os átomos que estão presentes em ambos, a cadeia heterocíclica e o grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo. Por exemplo, os grupos seguintes estão englobados por o membro 7 do heteroaralquilo (* representa o ponto de ligação):
átomo de cloro, átomo de bromo ou átomo de iodo. 45 0 termo "amidino" representa -C (=NRd) NReRf onde Ra, Re e Rf são independentemente seleccionados de H, Ci-io alquilo, C2-10 alcenilo, C2-10 alcinilo, Ce-12 aril e C7-12 aralquilo, ou Re e Rf são considerados juntos com o azoto, ao qual eles estão ligados para formar, opcionalmente, um membro 4-10 heterociclico substituído ou um membro 5-12 heteroarilo substituído. O termo "guanidino" representa -N (Rd) C (=NRe) -NRfRg onde Rd, Re, Rf e Rg são independentemente seleccionados de H, C1-10 alquilo, C2-10 alcenilo, C2-10 alcinilo, C6-12 aril e C7-12 aralquilo, ou Rf e Rg são considerados juntos com o azoto, ao qual eles estão ligados para formar, opcionalmente, um membro 4-10 heterociclico substituído ou um membro 5-12 heteroarilo substituído. O termo "amido" representa -CONRdRe e -NRdCORe onde Rd e Re são independentemente seleccionados de H, C1-10 alquilo, C2-10 alcenilo, C2-10 alcinilo, C6-12 aril e C7-12 aralquilo, ou Rd e Re são considerados juntos com o azoto, ao qual eles estão ligados (ou o átomo de azoto e o grupo CO no caso de -NRdCORe) para formar, opcionalmente, um membro 4-10 heterociclico substituído ou um membro 5-12 heteroarilo substituído. 0 termo "amino" representa um derivado da amónia obtido pela substituição de um ou mais átomos de hidrogénio e inclui -NRdRe, onde Rd e Re são independentemente seleccionados de H, C1-10 alquilo, C2-10 alcenilo, C2-10 alcinilo, C6-12 aril e C7-12 aralquilo, ou Rd e Re são considerados juntos com o azoto, ao qual eles estão ligados para formar, opcionalmente, um membro 4-10 heterociclico substituído ou um membro 5-12 heteroarilo substituído. O termo "sulfoamido" representa S02NRdRe, -NRdS02Re onde Rd e Re são independentemente seleccionados de H, C1-10 alquilo, C2-10 alcenilo, C2-10 alcinilo, C6-i2 aril e C7-12 aralquilo, ou 46
Rd e Re são considerados juntos com o azoto, ao qual eles estão ligados (ou o átomo de azoto e o grupo CO no caso de -NRdCORe) para formar, opcionalmente, um membro 4-10 heterociclico substituído ou um membro 5-12 heteroarilo substituído.
Quando existe um átomo de enxofre, este pode estar presente em diferentes níveis de oxidação, isto é, S, SO ou S02. Estes níveis de oxidação estão dentro do âmbito da presente invenção. O termo "independentemente" significa que um substituinte pode ser o mesmo ou uma definição diferente para cada item. Os termos "hospedeiro" ou "paciente" significam homem ou mulher, por exemplo, criança, adolescente ou adulto.
Será considerado que a quantidade do composto da invenção necessário para a utilização no tratamento possa variar não apenas no caso particular do composto seleccionado, mas também na via de administração, na natureza da condição para a qual o tratamento é necessário e a idade e condição do paciente e será em última análise à discrição do assistente médico ou veterinário. No entanto, em geral uma dose adequada estará na gama de cerca de 0,1 a cerca de 750 mg/Kg de peso do corpo por dia, por exemplo, no intervalo de 0,5 a 60 mg/Kg/dia, ou, por exemplo, na gama de 1 a 20 mg/Kg/dia. A dose desejada pode ser convenientemente apresentada numa dose única ou como doses divididas e administradas em intervalos apropriados, por exemplo, duas, três, quatro ou mais doses por dia. O composto é convenientemente administrado na forma de dosagem unitária, por exemplo, contendo 10 a 1500 mg, preferencialmente 20 a 1000 mg, mais preferencialmente 50-700 mg de ingrediente ativo por dose unitária. 47
Idealmente, o ingrediente ativo deve ser administrado para alcançar um pico nas concentrações plasmáticas do composto ativo de cerca de 1 a cerca de 75 mM, cerca de 2 a 50 mM, cerca de 3 a cerca de 30 mM. Tal pode ser alcançado, por exemplo, por injecção intravenosa de uma solução 0,1 a 5% do ingrediente ativo, opcionalmente, em solução salina, ou administrado oralmente um bolus contendo cerca de 1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo. Os níveis sanguíneos desejáveis podem ser mantidos por uma infusão contínua para prover cerca de 0,01 a cerca de 5,0 mg/Kg/hora ou através de infusões intermitentes contendo cerca de 0,4 a cerca de 15 mg/Kg do ingrediente ativo. Quando os compostos da presente invenção ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são utilizados em combinação com um segundo agente terapêutico ativo contra o mesmo vírus, a dose de cada composto pode ser a mesma ou diferir daquela quando o composto é utilizado sozinho. As doses apropriadas serão facilmente definidas por os peritos na especialidade.
Embora seja possível que, para utilização na terapia, um composto da invenção possa ser administrado tal como se encontra e isolado, é no entanto, é preferível que seja administrado como uma composição farmacêutica. A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo os compostos da presente invenção ou seu derivado farmaceuticamente aceitável juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos. O portador (es) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não deletérios para o seu recipiente.
As composições farmacêuticas incluem as adequadas para a administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bucal 48 e sub-lingual), transdérmica, vaginal ou parentérica (incluindo sub-cutânea, intramuscular, intravenosa) ou numa forma adequada para a administração por inalação ou insuflação. As formulações podem ser, onde apropriado, ser convenientemente apresentadas em unidades de dosagem discretas e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Todos os métodos incluem o passo de colocar em associação o composto ativo com transportadores liquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos e, posteriormente, se necessário, moldar o produto na formulação desejada.
As composições farmacêuticas adequadas para administração oral podem convenientemente ser apresentadas em unidades discretas, tais como cápsulas, pilulas ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; em pó ou grânulos; em solução, suspensão ou em emulsão. 0 ingrediente ativo pode também ser apresentado como um bolus, electuário ou uma pasta. Os comprimidos e as cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionais, tais como, agentes de ligação enchimento, lubrificantes, desintegrantes ou agentes molhantes. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica. As preparações liquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires ou podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veiculo adequado antes da utilização. Tais preparações liquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspensão, agentes emulsionantes, veiculos não-aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), ou conservantes.
Os compostos de acordo com a invenção também pode ser formulados para administração parentérica (por exemplo, por 49 injecção, injecção de bolus ou infusão contínua) e podem ser apresentados em forma de dose unitária em ampolas, em seringas pré-cheias, infusão de pequeno volume ou em recipientes de multi-dose com a adição de um conservante. As composições podem ser na forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como, de suspensão, de estabilização e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó, obtido por isolamento asséptico do sólido estéril ou por liofilização a partir de uma solução, para constituição com um veículo adequado, o qual será estéril, água apirogênica, antes da utilização.
Para administração tópica na epiderme, os compostos de acordo com a invenção podem ser formulados como pomadas, cremes ou loções, ou como um adesivo transdérmico. Tais adesivos transdérmicos podem conter promotores de penetração, tal como, linalol, carvacrol, timol, citral, mentol e t-anetole. As pomadas e cremes podem, por exemplo, ser formulados com uma base aquosa ou oleosa, com a adição de adequados agentes espessantes e/ou gelificantes. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e em geral também contêm um ou mais agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, dispersantes agentes de suspensão, agentes espessantes ou agentes corantes.
As composições adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas que compreendem o ingrediente ativo numa base aromatizada, normalmente a sacarose e acácia ou tragacanto; as pastilhas compreendendo o ingrediente ativo numa base inerte, tais como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e colutórios que compreendem o ingrediente ativo num veículo líquido adequado. 50
As composições farmacêuticas adequadas para administração rectal, em que o veiculo transportador é um sólido, são, por exemplo apresentadas como supositórios de dose unitária. Os veiculos adequados incluem manteiga de cacau e outros materiais comummente utilizados na técnica, e os supositórios podem ser convenientemente formados através da mistura do composto ativo com o veículo transportador amolecido ou derretido, seguido por arrefecimento e moldagem em moldes.
As composições adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou sprays contendo, para além do ingrediente ativo, os veículos transportadores adequados conhecidos na técnica.
Para a administração intra-nasal, os compostos da invenção podem ser utilizados como um pulverizador líquido ou pó dispersível ou sob a forma de gotas. As gotas podem ser formuladas com uma base aquosa ou não-aquosa compreendendo também um mais agentes dispersantes, agentes solubilizantes ou agentes de suspensão. Os sprays líquidos são convenientemente distribuídos através de um recipiente pressurizado.
Para administração por inalação os compostos de acordo com a invenção são convenientemente administrados a partir de um insuflador, nebulizador ou uma embalagem pressurizada ou outros meios convenientes ao fornecimento de um aerossol. As embalagens pressurizadas podem compreender um propulsor adequado, tal como, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, o dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada através de uma válvula para libertar uma quantidade medida. Alternativamente, para a administração por inalação ou 51 insuflação, os compostos de acordo com a invenção podem assumir a forma de uma composição em pó seco, por exemplo, uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como, a lactose ou amido. A composição em pó pode ser apresentada em forma de dosagem unitária em, por exemplo, cápsulas ou cartuchos ou, por exemplo, embalagens de gelatina ou blister, a partir das quais o pó pode ser administrado com o auxilio de um inalador ou insuflador.
Quando desejado, as formulações acima descritas podem ser adaptadas para a libertação sustentada do ingrediente ativo.
Um composto de fórmula (I) pode ser preparado através da reacção do composto de fórmula (II):
X
Hal
Pg (II) com o composto de fórmula:
sob condições convencionais de acoplamento Sonogashira; em que; 52 X é definido acima, por exemplo, -NR6-CO-R5,
Ri, R6 e R5 são definidos aqui, Pgi é OH ou um grupo protetivo carboxilico, Hal é Cl, Br ou I (por exemplo, Br), É ainda uma concretização, Pgi é metoxi ou tert-butoxi. É uma concretização, Pgi é metoxi. A reacção de acoplamento Sonogashira é um método bem conhecido para a produção de compostos que compreendem acetileno. As condições para tal reacção de acoplamento são bem conhecidas do estado da técnica e podem ser
encontradas, por exemplo, nos exemplos do presente pedido em Yamaguchi et al (Synlett 1999, No. 5, 549-550) ou em Tykwinski et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 1566-1568. A presente invenção também inclui intermediários que podem ser úteis na síntese de compostos de fórmula (I) . Alguns intermediários representados pela fórmula W
onde; R2, H ou o grupo amino protetivo (por exemplo, Boc (tert-butoxicarbonilo), Cbz (benziloxicarbonilo)) e Pgi é OH ou um grupo protetivo carboxilico. É concretização, Pgi é metoxi ou tert-butoxi. É uma concretização, Pgi é metoxi. É outra concretização, R2 é H. É uma concretização, R2 é Boc. 53
Intermediários especificos incluem, mas não estão limitados, os compostos listados na tabela A:
54
De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um processo para a preparação de compostos de fórmula I onde X usa um intermediário da fórmula 3a ou 10a ou 10b.
compreendendo 55
De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um processo para a preparação de compostos de fórmula I onde X é
compreendendo a utilização de um intermediário da fórmula 3a ou 10a ou 10b.
De acordo com um aspecto da invenção é fornecido um processo para a preparação de compostos da fórmula I, onde Rl é 3,3-dimetil-but-l-inil compreendendo a utilização de um intermediário da fórmula 9a ou 9b.
De acordo com um aspecto da invenção é fornecido um processo para a preparação de compostos da fórmula I, onde Rl é 3,3-dimetil-but-l-inil e R6 é 4-[ 1,2,3]triazol-l-il-ciclohexilo compreendendo a utilização de um intermediário da fórmula 4a.
De acordo com um aspecto da invenção é fornecido um processo para a preparação de compostos da fórmula I, onde Rl é 3,3-dimetil-but-l-inil e R6 é 4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexilo compreendendo a utilização de um intermediário da fórmula 5a.
Os seguintes esquemas gerais e exemplos são fornecidos para ilustrar várias formas de realização da presente invenção e não devem ser considerados como uma limitação ao âmbito de proteção. Será apreciado por peritos na especialidade que outros compostos da presente invenção podem ser obtidos por substituição, genericamente ou especificamente, dos reagentes descritos e/ou condições operacionais utilizadas nos seguintes exemplos. Métodos de sintese para a obtenção de compostos 56 de tiofeno são também descritos nos pedidos de patentes US No. 6.881.741, USSN 10/730, 272 pedido a 09 de dezembro de 2003, USSN 11/042, 442 pedido a 26 de janeiro de 2005, USSN 11/433, 749 apresentado em 15 de maio de 2006, W002/100851, US 2004-0116509, W02004/052885, US 2005-0009804, W02004/052879 e US 2004-0192707. Os compostos alcinilo de tiofeno são também revelados em WO 2006/072347 e WO 2006/072348.
Nos exemplos anteriores e nos exemplos seguintes, todas as temperaturas são apresentadas em graus Celsius; e, salvo indicação em contrário, todas as partes e percentagens são em peso.
As seguintes abreviaturas podem ser utilizadas do seguinte modo: Boc terc-butoxicarbonilo DCC 1,3-diciclohexilcarbodiimida DCE 1,2-dicloroetano DCM diclorometano DIPEA N,N-diisopropiletilamina DMF N,N-dimetil-formamida EToAc acetato de etilo Hal halogéneo LAH hidreto de litio e aluminio MeOH Metanol TFA Ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano LDA diisopropilamida de litio TLC Cromatografia de camada fina RBO Frasco de fundo redondo
Todas as purificações por HPLC foram realizadas utilizando coluna C18 de fase reversa embalada com partículas de 5ym. 57 0 diâmetro da coluna era de 19mm e comprimento de lOOmm. O eluente era um gradiente adequado de acetonitrilo e água com 3 mM de concentração de HC1.
Exemplo 1
Preparação de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxi-ciclo-hexil)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amido]-tiofeno-2-carboxílico
HO
Passo I
Uma suspensão de éster metilico de ácido 3-amino-5-bromo-tiofeno-2-carboxílico (17,Og, 72,0mmol) em THF seco (21mL) é tratada com 1,4-ciclo-hexanodiona monoetileno cetal 58 (ll,3mg, 72,0mmol), seguido de dicloreto de dibutilestanho (1,098 g, 3, 6mmol) . Após 5 min é adicionado fenil silano (9,74mL, 79,2mmol) e a mistura da reacção é agitada durante a noite à temperatura ambiente. Após concentração, o residuo é dissolvido em EtOAc lavado com NaHCCb e depois com salmoura. A camada orgânica é separada, seca em Na2S04, filtrada e concentrada. 0 material bruto é diluído em hexano (500 mL). Após a filtração, do filtrado é evaporado até ficar seco para formar éster metílico de ácido 5-bromo-3-(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofeno-2-carboxílico (24,79g, 92% de rendimento).
Ref: W02004/052885
Passo II A-Preparação de cloreto de ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil:
Cloreto de oxalilo (M em DCM, 117 mL) é adicionado gota a gota a uma suspensão de ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil (16,6g, 117mmol) em DCM (33mL) e DMF (0,lmL) e a mistura de reacção é agitada durante 3h à temperatura ambiente. O DCM é removido sob pressão reduzida e o resíduo é co-evaporado com DCM. O resíduo é dissolvido em tolueno para fazer uma solução de 1M. B-Preparação do composto alvo: A uma solução de 1M de cloreto de ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil é adicionado a uma solução de éster metílico de ácido 5-bromo-3-(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofeno-2-carboxílico(24,79g, 65mmol) em tolueno (25mL), seguido de piridina (5,78mL, 71,5mmol). A mistura 59 resultante é então agitada durante 16 h ao refluxo. A mistura de reacção é diluída com tolueno (60mL) e arrefecida a 5°C. Após a adição de piridina (12mL) e MeOH (5,6mL), a mistura é agitada durante 2 horas a 5°C. A suspensão branca é filtrada e o tolueno é adicionado ao filtrado. A fase orgânica é lavada com ácido cítrico a 10%, NaHC03 aquoso saturado, seca (Na2SCU) e concentrada. O resíduo é triturado com hexano (1500mL) em ebulição. A mistura de reacção é deixada a arrefecer até à temperatura ambiente. O balão de reacção é imerso em banho de gelo e com agitação, durante 30 min; o sólido branco é separado por filtração e lavado com hexano frio (225mL). O sólido é purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, utilizando 20% de EtOAc:hexano como eluente para obter o composto final de éster metílico de ácido 5-bromo-3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (10,5g, 32%) .
Passo III O éster metílico de ácido 5-bromo-3-[(1,4-dioxa- espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil ciclohexanocarbonil)- amino]-tiofeno-2-carboxílico (8,6g, 17mmol) é dissolvido em tetrahidrofurano (lOOmL) e tratado com solução de HC1 3N (50mL). A reacção é agitada a 40°C durante 3h. A mistura de reacção é evaporada sob pressão reduzida. O resíduo é dissolvido em EtOAc e lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCCp. A camada orgânica é separada, seca em Na2SC>4, filtrada e concentrada para dar éster metílico de ácido 5-bromo-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(4-oxo-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico sólido (7,4 g, 95%) . 60
Passo IV A uma solução fria (0°C) de éster metílico de ácido 5-bromo-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(4-oxo-ciclohexil) -amino]-tiofeno-2-carboxílico (5, 9g, 12, 9inmol) em 50mL de MeOH sob uma atmosfera de N2, é adicionado NaBH4 (250mg; 6,4mmol) em porções (aprox. 30min.) Após a adição estar completa e verificado se a reacção está completa por TLC (hexano:EtOAc 1:1), é adicionado lOmL de HC1 a 2% e agita-se durante 15min. A mistura de reacção é concentrada sob vácuo até ficar seca. A mistura de reacção é recuperada com água (25mL) e extraida com EtOAc. As fases orgânicas são combinadas e secas sobre MgS04 e concentradas até ficarem secas. O residuo é purificado por cromatografia em coluna de silica gel, utilizando EtOAc:hexano (1:1) como eluente para se obter éster metilico de ácido 5-bromo-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metilciclohexano-carbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (4,5g, 77% de rendimento) como um sólido.
Passo V A uma solução de compostos de éster metilico de ácido 5-bromo-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metilciclohexano-carbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (500mg, l,09mmol) e 3,3-dimetil-but-l-ino (385mg, 4,69mmol) em DMF (0,5mL), são adicionados trietilamina (l,06mL) e tris(dibenzilidenoacetona) dipaládio (0) (70mg, 0,08mmol) e a mistura de reacção é agitada sob condições de refluxo durante 16h sob uma atmosfera de N2. O DMF e trietilamina são removidos sob pressão reduzida e o residuo é dividido entre água e acetato de etilo. A camada orgânica 61 é separada, seca (Na2SC>4) , concentrada e o residuo é purificado por cromatografia em coluna utilizando acetato de etilo e hexano (1:2) como eluente para se obter éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil- ciclohexanocarbonil)amino]-tiofeno-2-carboxílico sólido, 330 mg (66%).
Passo VI O éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxiciclohexil)- (trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)amino]-tiofeno-2-carboxilico (0,lOg, 0,22mmol) é dissolvido numa mistura de 3:2:1 de THF:metanol:H2O (5,0mL) e tratado com uma solução de LÍOH.H2O IN (0,65mL, 0,65mmol). Após 2h de agitação a 60°C, a mistura de reacção é concentrada sob pressão reduzida num evaporador rotativo. A mistura é repartida entre acetato de etilo e água. A camada aquosa é acidificada com HC1 0,1N. A camada de EtOAc foi separada e seca em Na2S04. A filtração e a remoção do solvente foram efectuadas sob pressão reduzida num evaporador rotativo, seguido da purificação por cromatografia em coluna utilizando-se metanol e diclorometano (1:9) como eluente para se obter o ácido 5-(3, 3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico sólido, 30mg (30%). ESI-(MH):444,3. 62
Exemplo 2:
Preparação de 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metoxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amlno]-tiofeno-2-ácido carboxilico
Passo I A uma solução de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)- amino]-tiofeno-2-carboxílico (0,200g, 0,435mmol) em DMF seco (2,0mL) é adicionado iodometano (0,136mL, 2,18mmol), a mistura é arrefecida a 0°C, e é adicionado NaH (suspensão a 60% em óleo, 35mg, 0,87mmol) em porções ao longo de 5min. A mistura é agitada a 0°C durante lh e 40 min, é parada pela adição de água e acidificada com HC1 2N. A mistura é diluída com acetato de etilo e lavada com salmoura. A fase orgânica é separada, seca em Na2S04 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, com eluição 0 -► 50% de acetato de etilo em hexano para originar éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metoxi-ciclohexil)- (trans-4-metil- ciclohexanocarbonil)amino]-tiofeno-2-carboxílico (65mg, 32%) . 63
Passo II 0 Éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metoxi-ciclohexil)- (trans-4-metil- ciclohexanocarbonil)amino]-tiofeno-2-carboxílico do passo I é hidrolisado tal como descrito anteriormente (Esquema 1, passo VI) para originar o ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metoxi-ciclohexil)-(trans-4-metil ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxilico sólido (65mg, 32%). ESI-(M-H): 458,3.
Exemplo 3: Ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-enil)-3-[(trans-4-hidroxi- ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexano-carbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico
64
Passo I
Uma suspensão de éster metílico do ácido 3-amino-tiofeno-2-carboxílico (5,0g, 31,85mmol) em THF seco (9mL) é tratada com 1,4-ciclo-hexanodiona monoetileno cetal (5,0g, 32,05mmol), seguido de dicloreto de dibutilestanho (482mg; l,59mmol). Após 5 min, é adicionado fenil-silano (4,3mL, 34,96mmol) e a mistura de reacção é agitada durante a noite à temperatura ambiente. Após concentração, o residuo é dissolvido em EtOAc e lavado com NaHCCb seguida de salmoura. A fase orgânica é separada, seca (Na2SC>4) , filtrada e concentrada. 0 residuo é purificado por cromatografia em coluna utilizando 30% de acetato de etilo em hexano como eluente para originar éster metílico de ácido 3-(l,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofeno-2- carboxílico(4,5g, 47% de rendimento).
Procedimento alternativo: O éster metílico do ácido 3-amino-tiofeno-2-carboxílico (1 eq.) é dissolvido em diclorometano, seguido por 1,4-ciclohexanodiona monoetileno acetal (2 eq.) para obter uma solução ligeiramente amarela. Esta solução é adicionada à suspensão de NaBH(OAc)3 (2,2 eq.) em diclorometano. O ácido acético (2,4 eq.) é adicionado gota a gota durante um período de 15min. A suspensão resultante é agitada a 20-25°C sob N2 durante 24 h. A reacção é suprimida através da adição de água e agitada durante lh. A fase de diclorometano é separada, tratada com água e agitava novamente durante mais lh. A fase de diclorometano é separada e adicionada a uma solução saturada de NaHCCb, agitando-se a 20-25°C durante 20 min. Alguns dos sólidos brancos residuais são filtrados e, em seguida, a fase 65 orgânica é separada, seca (Na2SC>4) e evaporada. Adiciona-se metanol ao resíduo e evapora-se até ficar seca. 0 resíduo colocado em metanol e é agitado durante 2h a 0 o C. A suspensão é filtrada por vácuo e o bolo de filtração resultante é lavado com metanol frio. O sólido branco é seco sob vácuo a 35-40°C durante aproximadamente 20h para originar o composto pretendido do título.
Passo II A- Preparação de cloreto do ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil:
Cloreto de oxalilo (2M em diclorometano, 17mL) é adicionado gota a gota a uma suspensão de ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil (2,3g, 16,2mmol) em diclorometano (5mL) e DMF (0,lmL) . A mistura de reacção é agitada durante 3h à temperatura ambiente. Os voláteis são removidos sob pressão reduzida para se obter o cloreto do ácido bruto, o qual é usado directamente na reacção seguinte. 0 cloreto do ácido carboxílico B-trans-4-Metilciclohexil é adicionado a uma solução de éster metílico de ácido 3-(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofeno-2-carboxílico(2,4g, 8,08mmol) em tolueno (18mL), seguido por piridina (0,7mL). A mistura resultante é então agitada ao refluxo durante 16h. A mistura de reacção é diluída com tolueno (7mL) e arrefecida a 5°C. Após a adição de piridina (l,5mL) e MeOH (0,8mL), a mistura é agitada durante 2h a 5°C. O sólido branco é filtrado e lavado com tolueno. O filtrado é lavado com ácido cítrico a 10%, aq. NaHCCb, seco (Na2SC>4) e concentrado. 0 sólido é purificado por cromatografia de coluna de sílica gel utilizando 20% de EtOAc:hexano como eluente para se 66 obter éster metílico de ácido 3-[ (1,4-dioxaespiro[4.5]dec-8-il) - (trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico(2,3g, 68%).
Procedimento alternativo: A uma solução de ácido trans-4-metilciclohexil (1,8 eq.) em tolueno sob azoto é adicionado anidro DMF. A mistura de reacção é agitada e é adicionado cloreto de tionilo (2,16 eq.) ao longo de 3-5 min. A mistura é então agitada durante 3 horas à temperatura ambiente. Quando a reacção está completa, o tolueno é adicionado à mistura de reacção. A solução é, então, evaporada sob pressão reduzida de azoto para a metade de seu volume. A solução é dissolvida em tolueno para se obter uma solução de cloreto de ácido IN. 0 3 - (1,4-Dioxa-espiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofeno-2-ácido carboxilico éster metilico (1 eq.) e piridina (2 eq.) são adicionados à solução de cloreto de ácido (1 N). A mistura de reacção é agitada em refluxo durante 15h. Uma vez completada a reacção, a mistura de reacção é arrefecida até à temperatura ambiente, e em seguida são adicionados metanol e tolueno. A mistura de reacção é agitada durante 1 hora à temperatura ambiente e uma solução aquosa saturada de NaHCCU é adicionada. A fase orgânica é separada, seca (Na2SC>4) e evaporada até cerca de 4 volumes de solvente. À solução é adicionado 4 volumes de heptano, com agitação. 0 balão de reacção é imerso num banho de gelo e agita-se durante 120 minutos, um sólido de cor bege é separado por filtração e lavado com heptano frio, em seguida seca-se durante a noite em estufa de vácuo para se obter o composto pretendido do titulo. 67
Passo III 0 n-BuLi (2 eq.) é adicionado gota a gota durante 10 minutos a uma solução fria (-40°C) de diisopropilamina (1 eq.) em THF seco. A mistura de reacção é agitada à mesma temperatura durante 30 min. Em seguida, uma solução de éster metilico de ácido 3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil-ciclo-hexano-carbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (1 eq) em THF é adicionada gota a gota (35 minutos), mantendo a temperatura interna por volta dos -40 0 C. A mistura de reacção é agitada durante 30 min e uma solução de iodo (2 eq.) em THF é adicionada, gota a gota, com agitação durante 30 min à mesma temperatura, antes de ser adicionada uma solução de NH4CI saturada. A mistura de reacção é diluida com acetato de etilo e água. A fase orgânica é separada e lavada com uma solução de tiossulfato de sódio a 5%. A fase orgânica é separada, seca (Na2SC>4) e evaporada a uma suspensão e depois é adicionado heptano. A suspensão é agitada a 0 0 C durante 30 min, filtrada e lavada com heptano para se obter éster metilico de ácido 3—[(1,4— dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxilico. MS encontrado (electropulverização): (M+H): 548,21
Passo IV A 25 mL de RBF sob azoto, são adicionados éster metilico de ácido 3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxilico (1 eq.), iodeto de cobre (0,025 eq.) e tris(dibenzilidenoacetona) dipaládio (0) (0,01 eq.). De seguida são adicionados DMF, trietilamina (2,5 eq.) e 3,3- 68 dimetil-but-l-ino (2 eq.) e a mistura da reacção é agitada a 40 °C durante 2 horas sob uma atmosfera de N2. A mistura de reacção é filtrada em celite e lavada com acetato de etilo. A solução é diluida com água e
extraida duas vezes com acetato de etilo. As fases orgânicas são combinadas e lavadas três vezes com água. A fase orgânica é separada, seca (Na2S04) , evaporada para cerca de 2mL e, em seguida, é adicionado 8mL de heptano. Evapora-se até 2-4mL e arrefece-se num banho de gelo. O sólido branco formado é filtrado, lavado com heptano e seco no forno para se obter éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo V O éster metilico de ácido 5-(3,3-Dimetilo-but-l-inil)-3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (1 eq.) é dissolvido em tetra-hidrofurano e tratado com uma solução 3,6 N de HCl. A reacção é agitada a 40°C durante 5h. A água é então adicionada e a mistura de reacção é arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura de reacção é extraida com acetato de etilo (2X50mL). Os extractos combinados são lavados com 25mL de uma solução aquosa saturada de NaHC03 e 2X50mL de água. A fase orgânica é concentrada até um óleo espesso, e 50 mL de heptano é adicionado à mistura para precipitar o composto desejado, o qual é filtrado para originar de éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-(4-oxo-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico. 69
Passo VI 0 éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil) -3-[(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-(4-oxo-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico(1 eq.) é dissolvido em THF. A água é adicionada à mistura de reacção e esta é arrefecida até -25°C. Uma porção sensata de NaBH4 (0,5 eq.) é adicionada, mantendo a temperatura abaixo de -20°C. A mistura é agitada durante 2 horas à temperatura de -25°C, HC1 2N é então adicionado e a solução é aquecida até à temperatura ambiente. As fases são separadas e a fase aquosa é lavada com EtOAc. As fases orgânicas são combinadas, lavadas com solução salina, secas sobre Na2S04 e concentradas até à secura para originar éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico como uma mistura de isómeros 93:7. A mistura em bruto cis/trans é recristalizada em metanol para obter >99% do isómero trans.
Passo VII 0 mesmo procedimento, tal como descrito anteriormente, (exemplo 1, passo VI) é realizado para a obtenção de ácido 5- (3,3-dimetil-but-l-inil-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil) -(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico. MS encontrado (electropulverização): (M-H): 444.3
Exemplo 4: Ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil- ciclohexanocarbonil)-(cis-4-[1,2,3]triazol-l-il- 70 ciclohexil)-amino]-tiofeno“2-carboxilico e ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil) -3" [ (trâns-4-metil-ciclokexanocaxbonil) -(trans-4-[1,2,3]triazol"l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico
Passo I A uma solução de ácido 3-amino-5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-tiofeno-2-carboxílico (exemplo 9) (0,387g, l,6mmol) e 4- [1,2,3]triazol-l-il-ciclohexanona (0,27g, l,6mmol) em THF seco é adicionado dicloreto de dibutilestanho (0,024g, 0,080mmol) seguido de fenilsilano (0,276mL, 2,2mmol). A mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente. O solvente é evaporado sob pressão reduzida e o resíduo é diluído em acetato de etilo. A fase orgânica é lavada com água e salmoura, seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna de sílica gel, utilizando um gradiente de 50-100% de acetato de etilo em hexano para obter o éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil- 71 but-l-inil)—3—(4—[1,2,3]triazol-l-il-ciclo-hexilamino)-tiofeno-2-carboxílico.
Passo II A uma solução de 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4-[1,2,3] triazol-l-il-ciclo-hexilamino-tiofeno-2-ácido carboxílico éster metílico (0,20g, 0,50mmol) em tolueno (lmL) é adicionada uma solução de cloreto de ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil 1M (l,0mL, l,0mmol) e piridina (0,046mL, 0,58mmol). A mistura é agitada durante a noite a 105°C e diluída com acetato de etilo. A fase orgânica é lavada com NaHC03Sat (2x) e salmoura. A fase orgânica é seca com sódio sulfato, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. 0 resíduo é purificado por cromatografia em coluna de sílica gel (20% de acetato de etilo/hexano para 100% de acetato de etilo, seguido por 10% MeOH/acetato de etilo) para originar o éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo III O éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexil) -amino]-tiofeno-2-carboxílico (0,13g, 0,25mmol) é hidrolisado com hidróxido de lítio, tal como descrito anteriormente (Exemplo 1, passo VI) para se obter, após purificação por HPLC, o isómero puro de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(cis-4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico e ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4- 72 metil-ciclohexanocarbonil)-(trans-4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico. MS encontrado (electropulverização): (M+H) : 497.4
Exemplo 5: Ácido 5-(3,3-Dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil- ciclohexanocarbonil) -(cis-4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico e ácido 5-(3,3-Dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(trans-4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico
Passo I A aminação redutora u r metílico de ácido 3-amino-5- ' 1 ) ~ t ' (3,3-dimetil-but-l'in:L lofeno-2-carboxílico (0,237g; l,0mmol) e 4 —[1,2 a 4 ^ a2ol~l-il-ciclohexanona (0,170g, l,0mmol) é realizada mesmas condições, anteriormente 73 descritas, utilizando dicloreto de dibutil-estanho e fenilsilano para originar éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclo-hexilamino)-tiofeno-2-carboxilico.
Passo II 0 éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexilamino)-tiofeno-2-carboxilico (0,27g, 0,70mmol) é acilado com cloreto de ácido carboxilico trans-4-metilciclohexilo, como descrito anteriormente, para formar o éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxilico.
Passo III: 0 éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[ (trans-4.-metil-ciclohexanocarbonil) - (4 - [1,2,4] triazol-l-il-ciclohexil) -amino]-tiofeno-2-carboxílico (0,244g, 0,48mmol) é hidrolisado com hidróxido de litio, tal como descrito anteriormente, (Exemplo 1, passo VI) para obter, após purificação por HPLC, o isómero puro de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3- [(trans-4-metilciclohexanocarbonil)-(cis-4-[l,2,4] triazol-l-il-ciclo-hexil)-amino]-tiofeno-2-carboxilico e ácido 5 - (3,3-Dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(trans-4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexil) -amino]-tiofeno-2-carboxilico. MS encontrado (electropulverização): (M+H): 497.4
Exemplo 6: Ácido 5-(3,3-Dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil- ciclohexanocarbonil)-(trans-4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico
Passo I A uma solução de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(cis-4-hidroxi-ciclo-hexil)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)- amino]-tiofeno-2-carboxílico (0,92g, 75 2,0mmol) em lOmL de CH2CI2, é adicionado, a 0°C, cloreto metanossulfonilo (0,31mL, 4,0mmol) seguido por trietilamina (0,56mL, 4,0mmol). A mistura de reacção é agitada à temperatura ambiente durante 24 horas e tratada com água. A fase aquosa é extraída duas vezes com CH2CI2. A fase orgânica é seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para originar éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(cis-4-metanossulfoniloxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo II A uma solução de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil) -3-[(cis-4-metanossulfoniloxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (l,16g, 2,00mmol) em 10 mL de DMF é adicionada azida de sódio (0,65g, lOmmol). A mistura de reacção é agitada durante 48h a 50°C. A mistura é diluída com acetato de etilo, lavada três vezes com água e uma vez com salmoura. A fase orgânica é seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para originar 3-[ (trans-4-azido-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-tiofeno-2- ácido carboxílico éster metílico.
Passo III
Uma solução de éster metílico de ácido 3-[(trans-4-azido-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-tiofeno-2-carboxílico (1,Og,
2,0mmol) em trimetilsililacetileno (l,4mL, lOmmol) é tratada em forno de microondas a 120°C durante 2h. A 76 mistura é concentrada sob pressão reduzida e o residuo é purificado através de cromatografia em coluna de silica gel (5% de acetato de etilo/hexano para 100% de acetato de etilo) para formar éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-{ (trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-[trans-4- (4-trimetilsilanil-[l,2,3]triazol-l-il)-ciclohexil]-amino}-tiofeno-2-carboxilico.
Passo IV
A uma solução de éster metilico de ácido 5-(3, 3-dimetil-but-l-inil)-3-{(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-[trans-4- (4-trimetilsilanil-[l,2,3]triazol-l-il)-ciclohexil]-amino}-tiofeno-2-carboxilico (0,48g, 0,82mmol) em THF (2,0mL) é adicionado TBAF 1,0M em THF (l,23mL, l,23mmol). A mistura de reacção é agitada durante 24 horas e tratada com água e solução de cloreto de amónio saturado. A fase aquosa é extraida com acetato de etilo. A fase orgânica é lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O residuo é purificado através de cromatografia em coluna de silica gel (50% acetato de etilo/hexano para 100% de acetato de etilo) para formar éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(trans-4- [1.2.3] triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo V O éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-ΙΕ (trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(trans-4- [1.2.3] triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2- carboxílico (0,27g, 0,52mmol) é hidrolisado com hidróxido 77 de lítio, como anteriormente descrito (exemplo 1, passo VI), para se obter, após purificação por HPLC, o ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(trans-4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexil)-amino]-tiofene-2-carboxílico. MS encontrado (electropulverização): (M+H): 497.4
Intermediário 2: 4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexanona
Passo I
Uma mistura de ácido metanossulfónico 1,4-dioxa- espiro[4.5]dec-8-ilo (2,80g, ll,9mmol) e azida de sódio (3,86g, 59,3mmol) em 50 mL de DMF seca foi agitada durante 20 horas a 100°C sob azoto. A mistura final é arrefecida até à temperatura ambiente, diluida com salmoura e extraída com três porções de éter. As fases orgânicas são combinadas, secas sobre Na2SC>4 e concentradas para formar 78 8-azido-l,4-dioxa-espiro[4.5]decano.
Passo II
Uma mistura de 8-azido-l, 4-dioxa-espiro[4.5]decano (l,00g, 5,43mmol) e 1-(trimetilsilil)-propino (3,76mL; 27,lmmol) é submetida a microondas, a 120°C durante 2h. A mistura é concentrada sob vácuo para remover o excesso de 1-(trimetilsilil)-propino e é obtido 1-(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-4-trimetilsilanil-lH-[l,2,3]triazol bruto.
Passo III
Uma solução de 1-(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-4-trimetilsilanil-lH-[1,2,3]-triazol (l,60g, 5,68) em 41mL de THF seco é tratada com uma solução 1M de fluoreto de tetrabutilamónio em THF (9,0mL, 9,0mmol). A mistura resultante é agitada durante 48 horas à temperatura ambiente sob azoto. É diluída com EtOAc, lavada com solução aquosa saturada de cloreto de amónio, água e salmoura, seca sobre Na2SC>4 e concentrada para formar 1-(1,4-dioxa-espiro [4.5] dec-8-il)-lH-[1,2,3]triazol.
Passo IV 0 1-(1,4-Dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-lH-[l,2,3]triazole (l,06g, 5,06mmol) é submetido ao mesmo procedimento que o passo intermediário III para a obtenção de 4-[1,2,3] triazol-l-il-ciclo-hexanona como um sólido branco. 79
Intermediário 1: 4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexanona
Passo I 0 éster de ácido metanossulfónico 1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il é preparado de acordo com: Cheng, Yu Chen, Wu, Shou Chien; Hsin, Wei Ling; Tam, S. William. Coll. Med. Chem., Natl. Taiwan Univ., Taipei, Taiwan. Journal of Medicinal Chemistry (1992), 35(12), 2243-7.
Passo II
Uma solução de éster de ácido metanossulfónico 1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il (567mg, 2,40mmol) e 1,2,4-triazol (232mg, 3,36mmol) em DMF seco (5,00 mL) é tratada com hidreto de sódio a 60% (125mg, 3,12mmol) à temperatura ambiente e sob azoto. A mistura resultante é agitada a 65°C durante 72h. É adicionada água gelada (75 mL), extraídas três porções de 75 mL de EtOAc. As fases orgânicas são combinadas, secas sobre Na2S04 anidro e concentradas. O sólido é purificado através de cromatografia em coluna de silica gel, utilizando um gradiente de EtOAc a 100% para 5% de MeOH:EtOAc como eluente, para originar 80 o composto final 1-(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-1H.[1,2,4]triazol, como um sólido branco.
Passo III
O l-(l,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-lH-[l,2,4]triazol (379mg, l,81mmol) é dissolvido numa mistura 1:1 de THF e uma solução aquosa de HC1 3N (9mL). A mistura resultante é agitada a 40°C durante 5h. A maior parte do THF é removido sob vácuo e, em seguida, a mistura restante é neutralizada com uma solução aquosa de NaOH 3N até um pH básico ser atingido. São extraídas com 3 porções de lOmL de diclorometano. As fases orgânicas são combinadas, secas sobre Na2SC>4 anidro e concentradas para proporcionar 4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexanona como um sólido branco ceroso.
Exemplo 7:
Preparação de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-fluoro-ciclohexil)-(trans-4-metilciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico
A uma suspensão de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(cis-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclo- 81 hexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico (102mg,
0,23mmol) em CH2C12 seco (2mL) é adicionado DAST (Dietilaminosulfurtrifluoreto) (90yL, 0,69mmol), e a mistura é agitada durante 4h à temperatura ambiente. Em seguida, diluida com CH2C12, adiciona-se água à mistura, e é agitada vigorosamente durante 20min. A fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4, concentrada e o resíduo é purificado por HPLC para a obtenção de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-fluorociclohexil)-(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico. MS encontrado (electropulverização): [M+H]: 448,30
Exemplo 8:
Preparação de cloridrato do ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(1-metil-piperidina-4-il)-amino]-tiofeno-2-carboxílico
o 82
Passo I A uma solução de éster metílico de ácido 3-(terc-butoxicarbonil)amino-5-bromo-tiofeno-2-carboxílico(4,566g, 13,58mmol) em DMF seco (40 mL) são adicionados iodeto de cobre (I) (52mg, 0,27mmol), Pd2dba3 (622mg, 0,68mmol) e trietilamina (9,46mL, 67,9mmol) e a mistura é desoxigenada fazendo borbulhar azoto através da solução durante 10 min. Seguidamente, são adicionados à mistura tertbutilacetileno (6,62mL, 54,32mmol) e BINAP (676mg, l,09mmol) e é aquecida a 60°C durante a noite sob azoto. A mistura é diluida com CH2CI2 e filtrada através de lavagem de celite com CH2C12. O filtrado é lavado com salmoura, a fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4, concentrada e o resíduo é purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, eluindo com um gradiente de EtOAc em hexano para obter éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-butl-inil)-3-(terc-
butoxicarbonil)amino-tiofeno-2-carboxílico. 1H NMR (CDCI3)õ, ppm: 1,27 (s,9H), 1,51 (s,9H), 3,84 (s,3H), 7,87 (s,1H), 9,24 (br.s, 1H) . MS encontrado (electropulverização): [M+H] 338,17
Passo II A uma solução de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-butl-inil) -3-(terc-butoxicarbonil)amino-tiofeno-2-carboxílico (4,344g, 9,58mmol) em CH2C12 (30mL) é adicionado ácido trifluoroacético (30mL), e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante a noite. Em seguida, é evaporada até à secura, o resíduo obtido é redissolvido em CH2C12 e lavado com NaHC03 e salmoura. A fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4 e concentrada para obter 3,135 83 g de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-amino-tiofeno-2-carboxílico. 1H RMN (CDCI3) δ, ppm: 1,28 (s, 9H) , 3,80 (s,3H), 5,36 (br.s,2H), 6,49 (s,lH) MS encontrado (electropulverização): [M+H] 238,11
Passo III A uma solução de éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-amino-tiofeno-2-carboxilico (1,512g, 5,97mmol) e N-terc-butoxicarbonil-piperidina-4-ona (l,189g, 5, 97mmol) em 2mL de THF seco é adicionado dicloreto de dibutil-estanho (181 mg, 0,60mmol) e a mistura é agitada durante 10 min à temperatura ambiente, sob azoto. Em seguida, é adicionado fenilsilano (810mL, 6,57mmol) e a mistura é agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. São ainda adicionados 595mg de N-terc-butoxicarbonil-piperidin-4-ona, 90mg de dicloreto de dibutil-estanho e 405mL de fenilsilano e a mistura é agitada durante mais 24h. Em seguida, a mistura é diluída com CH2CI2, lavada com salmoura, a fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4 e concentrada para originar 5,142g de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(N-tert- butoxicarbonil-piperidina-4-il)amino-tiofeno-2-carboxílico bruto.
Passo IV O cloreto de ácido carboxílico trans-4-metilciclohexil (23,88mmol) e piridina (2,89mL, 35,82mmol) são adicionados a uma solução de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(N-tert-butoxicarbonil-piperidina-4-il)amino-tiofeno-2-carboxílico do passo III (5,142g) em tolueno seco 84 (50mL). A mistura é submetida a refluxo durante 24h, em seguida, depois de estar à temperatura ambiente, é adicionado de piridina (l,0mL) e MeOH (5mL). Em seguida, a mistura é diluída com CH2CI2, lavada com salmoura, a fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4, e concentrada para se obter 5,198g de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-ciclohexanocarbonil)-(N-tert-butoxicarbonil-piperidina-4-il)amino]-tiofeno-2-carboxílico, contendo quantidades variáveis de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metilciclohexanocarbonil)-(piperidina-4-il)-amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo V 0 produto do passo IV (5,198g) é dissolvido em 30mL de CH2CI2 e tratado com 20mL de ácido trifluoroacético. A mistura é agitada à temperatura ambiente, durante a noite, seguidamente é evaporada até à secura, o resíduo obtido é redissolvido em CH2CI2 e lavado com NaHCCb e salmoura. A fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4 e concentrada para se obter 5,340g de éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-(piperidina-4-il)amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo VI A uma solução do produto do passo V (5,340g) em 1,2-dicloroetano (60mL) adiciona-se formaldeído (1.94mL de uma solução aquosa 37%, 23,88mmol), seguido por triacetoxiborohidreto de sódio (2,403g, ll,34mmol) em porções durante 20 min. A mistura é agitada à temperatura ambiente, durante a noite, em seguida, é adicionada água à 85 mistura e é extraída com CH2CI2. A fase orgânica é lavada com NaHC03 e salmoura, seca sobre Na2SC>4, concentrada e purificada através de cromatografia em coluna de sílica gel, eluindo com 0-10% de MeOH em CH2CI2 para obter éster metílico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metilciclohexanocarbonil)-(l-metil-piperidina-4-il)-amino]-tiofeno-2-carboxílico.
Passo VII O produto do Passo VI (281mg, 0,61mmol) é hidrolisado com hidróxido de lítio, tal como descrito anteriormente (Exemplo 1, passo VI) para formar, após purificação por HPLC, cloridrato do ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-(1-metil-piperidina-4-il-amino]-tiofeno-2-carboxílico. MS encontrado (electropulverização): [M+H]: 445,29
Exemplo 9 Ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxi- ciclohexil)-{trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico 86
Passo I O éster metílico de ácido 3-[(1, 4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxílico (a partir do Exemplo 3) foi dissolvido em tetrahidrofurano e tratado com uma solução de HCl 3N. A reacção é agitada a 40°C durante 3 h. A mistura de reacção é evaporada sob pressão reduzida. A mistura é dissolvida em EtOAc e lavada com uma solução aquosa saturada de NaHC03. A fase orgânica é separada, seca sobre Na2SC>4, filtrada e concentrada para obter o composto referido no titulo.
Passo II A uma solução fria (0°C) de éster metilico de ácido 5-iodo- 87 3-[(trans-4-metil-ciclo-hexanocarbonil)-(4-oxo-ciclohexil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico em MeOH sob uma atmosfera de N2, é adicionado em porções NaBH4 com agitação. Depois da reacção estar completa, é adicionado 2% HC1 e agita-se durante 15 min. A mistura da reacção é concentrada sob vácuo até à secura. 0 residuo é dividido entre água e EtOAc. A fase orgânica é separada, seca sobre
MgSCg e concentrada até à secura. 0 residuo é purificado por cromatografia em coluna de silica gel utilizando EtOAc:hexano como eluente para obter o composto referido no titulo.
Passo III A uma solução de éster metilico de ácido 3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxílico e etinil-trimetil- silano em DMF, são adicionados trietilamina e tris (dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) e a mistura de reacção é agitada a 60°C, durante 16 horas sob uma atmosfera de N2. 0 DMF e trietilamina são removidos sob pressão reduzida e o residuo é dividido entre água e acetato de etilo. A fase orgânica é separada, seca (Na2S04) , concentrada e o residuo é purificado por cromatografia em coluna utilizando acetato de etilo e hexano (1:2) como eluente para obter o composto referido no titulo.
Passo IV 2-cloro-2- 0 éster metilico de ácido 3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanicarbonil)-amino]-5-trimetil-silanilefenil-tiofeno-2-carboxílico e metilpropano são adicionados a diclorometano e a cloreto de aluminio à temperatura de -78°C. A mistura de reacção é agitada à mesma temperatura durante 6 horas. A mistura de reacção é vertida sobre água e diluida com diclorometano. A fase orgânica é separada, seca (Na2SC>4) e concentrada. 0 residuo é purificado por cromatografia em coluna, utilizando acetato de etilo e hexano para se obter o composto referido no titulo.
Ref: J. Chem. Soe. Chem. Commun. De 1982, 959-960.
Passo V 0 éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-[(trans-4-hidroxi-ciclohexil)-(trans-4-metil-ciclohexanocarbonil)-amino]-tiofeno-2-carboxílico é dissolvido numa mistura 3:2:1 de THF:metanol:H20 e tratado com uma solução de LÍOH.H2O IN. Após 2 h de agitação a 60°C, a mistura de reacção é concentrada sob pressão reduzida num evaporador rotativo. A mistura é repartida entre acetato de etilo e água. A camada de água é acidificada com HC1 0,1N. A camada EtOAc foi separada e seca sobre Na2SC>4. O solvente é removido e o residuo é purificado por cromatografia de coluna utilizando diclorometano e metanol (1:9) como eluente para obter o composto referido no titulo. 89
Tabela 1
Lista de Compostos de acordo com a presente invenção Estrutura Nome químico Massa* 1 HC HSC CH> °H ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-HIDROXI-CICLOHEXIL)-(TRANS-4-METILCICLOHEXANOCARBONIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M-H): 444.3 2 q.C\% h/ oh ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-ΜΕΤΟΧΙ-CICLOHEXIL)-(TRANS-4-METILCICLOHEXANOCARBONIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M-H): 458.3 3 A ph, N-| hscí!W^I^p0 η/ Th ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-METILCICLOHEXANOCARBONIL)-(ClS-4-[1,2,4]TRIAZOL-i-IL-CICLOHEXIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M+H): 497.4 4 Λ ΡΊ·»Ν Λ FHj N“4 „ jT^ oh h3c ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-METILCICLOHEXANOCARBONIL)-(TRANS-4-[1,2,4]TRIAZOL-1-IL-CICLOHEXIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M+H): 497.4 90 5 H,C CH> °H ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[ (CIS-4-HIDROXICICLOHEXIL)-(TRANS-4- METILCICLOHEXANOCARBONIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M-H): 444.52 6 β \. yP *φ ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-METIL-CICLOHEXANOCARBONIL)-(1-METIL-PIPERIDINA-4-IL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO; HIDROCLORETO (M+H): 445.29 7 v£Wvr° *4 0H ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-METIL-CICLOHEXANOCARBONIL)-(4-CIS - [1,2,3]TRIAZOL-l-IL-CICLOHEXIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M+H): 497.4 8 •C% r·^ h/ ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l-INIL)-3-[(TRANS-4-METIL-CICLOHEXANOCARBONIL)-(TRANS-4-[1,2,3]TRIAZOL-1-IL-CICLOHEXIL)-AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO (M+H): 497.4 91
9 f ÁCIDO 5-(3,3-DIMETIL-BUT-l- (M+H): íf INIL)-3-[(TRANS-4-FLUORO- 448.30 CICLOHEXIL)-(TRANS-4-METIL- CICLOHEXANOCARBONIL)- h/5·* oh AMINO]-TIOFENO-2-CARBOXÍLICO *As análises de massa espectral são registadas utilizando espectrometria de massa com electropulverização.
Exemplo 10: Avaliação dos compostos num ensaio de ARN Polimerase ARN-dependente do VHC
As seguintes referências são citadas 1. Behrens, S., Tomei, L., De Francesco, R. (1996) EMBO 15, 12-22 2. Harlow, E, e Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbord Laboratory. Cold Spring
Harbord. NY. 3. Lohmann, V., Kõrner, F., Herian, U., e Bartenschlager, R. (1997) J. Virol. 71, 8416-8428 4. Tomei, L., Failla, C., Santolini, E., De Francesco, R., e La Monica, N. (1993) J Virol 67, 4017-4026
Os compostos são avaliados através de um ensaio de polimerase in vitro contendo a ARN polimerase do VHC ARN-dependente recombinante purificada (proteína NS5B). A VHC NS5B é expressa em células de insecto utilizando um baculovirus recombinante como vetor. Os procedimentos experimentais utilizados para a clonagem, expressão e purificação da proteína VHC NS5B encontram-se abaixo descritos. Seguidamente, são apresentados detalhes dos 92 ensaios com a ARN polimerase ARN-dependente para a avaliação dos compostos.
Expressão da proteína NS5B VHC em células de insectos: 0 ADNc codificante para toda a proteína NS5B da estirpe VHC-BK, genótipo lb, foi amplificado por PCR utilizando os primers NS5Nhe5' (5'-GCTAGCGCTAGCTCAATGTCCTACACATGG-3') e XhoNS53'(5'-CTCGAGCTCGAGCGTCCATCGGTTGGGGAG-3') e o plasmídeo pCD 3,8-9,4 como template (Tomei et al, 1993). Os primers NS5Nhe5' e XhoNS53' contêm dois locais Nhel e Xhol (sequências sublinhadas), respectivamente, na extremidade 5'. 0 fragmento de ADN amplificado foi clonado no plasmídeo de expressão bacteriano pET-21b (Novagen) entre os locais de restrição Nhel e Xhol, para formar o plasmídeo pET/NS5B. Este plasmídeo foi, posteriormente, utilizado como template para amplificar por PCR a região que codifica NS5B, utilizando o os primers NS5B-H9 (5'- ATACATATGGCTAGCATGTCAATGTCCTACACATGG-3') e NS5B-R4 (5 ' -GGATCCGGATCCCGTTCATCGGTTGGGGAG-3'). 0 primer NS5B-H9 abrange uma região de 15 nucleótidos no plasmídeo pET-21b seguido pelo codão iniciador da tradução (ATG) e 8 nucleótidos correspondentes à extremidade 5' da região que codifica para NS5B (nt. 7590-7607 na sequência de VHC com o número de acesso M58335). O primer NS5B-R4 contém dois locais BamHI (sublinhado) seguido por 18 nucleótidos correspondentes à região em torno do codão de paragem no genoma do VHC (nt. 9365-9347). A sequência amplificada, de l,8kb, foi digerida com Nhel e BamHI e ligada a um plasmídeo predigerido pBlueBacII (Invitrogen). O plasmídeo recombinante resultante foi designado por pBac/NS5B. As células Sf9 foram co-transfectadas com 3yg de pBac/NS5B, 93 juntamente com 1 yg de ADN de baculovírus linearizado (Invitrogen), tal como descrito no protocolo do fabricante. Seguidamente a duas rondas de purificação de placas, um baculovirus recombinante-NS5B, BacNS5B, foi isolado. A presença da proteina NS5B recombinante foi determinada por análise de Western blot (Harlow e Lane, 1988) de células Sf9 infectadas com BacNS5B, utilizando um antisoro policlonal de coelho (anti-NS5B) criado contra uma versão marcada com His da proteina NS5B expressada em E.coli. A infeção de células Sf9 com este virus purificado em placa foram realizados em frascos rotativos de um litro, a uma densidade celular de 1,2 x 106 células/mL e com uma multiplicidade de infeção de 5.
Preparação de uma proteína recombinante NS5B solúvel:
As células Sf9 foram infectadas como acima descrito. Decorridas sessenta horas pós-infeção, as células foram colhidas e, em seguida, lavadas duas vezes com tampão salino de fosfato (PBS). As proteínas totais foram solubilizadas como descrito em Lohmann et al. (1997) e com algumas modificações. Em resumo, as proteínas foram extraídas em três passos, Sl, S2, S3, utilizando os tampões de lise (LB)I, LBII e LBIII (Lohmann et al, 1997). A composição de LBII foi modificada de modo a conter 0,1% de Triton X-100 e 150mM de NaCl para reduzir a quantidade de proteína NS5B solubilizada neste passo. Ainda, foi evitada a sonificação dos extractos celulares em todo o protocolo, de forma a preservar a integridade da estrutura proteica. 94
Purificação de NS5B recombinante utilizando cromatografia liquida e rápida de proteínas (FPLC): A proteina solúvel NS5B na fracção S3 foi diluida para reduzir a concentração de NaCl a 300mM, em seguida, incubadas em descontinuo com esferas DEAE-Sepharose (Pharmacia-Amersham) durante 2 horas e a 4°C, tal como descrito por Behrens et al. (1996). 0 material não ligado foi separado por centrifugação durante 15 min a 4°C, a 25000rpm utilizando um rotor SW41 (Beckman). 0
sobrenadante foi depois diluido para reduzir a concentração de NaCl para 200mM e, subsequentemente, carregado, com um caudal de 1 mL/min, numa coluna de heparina HiTrap® de 5mL (Amersham-Pharmacia) ligada a um sistema FPLC® (Amersham-Pharmacia). As proteínas que ficaram ligadas foram eluidas em fracções de lmL, utilizando um gradiente de NaCl continuo de 0,2 a 1M, em 25 mL de volume. As fracções que contêm NS5B foram identificadas por electroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), seguida de western blotting usando o anti-soro anti-NS5B, numa diluição de 1:2000. As fracções positivas foram recolhidas e o tampão de eluição foi substituído por 50mM de NaPCh pH 7,0, 20% de glicerol, 0,5% de Triton X-100 e lOmM DTT, utilizando uma coluna PD-10 (Amersham-Pharmacia). A amostra foi introduzida numa coluna SP HiTrap® de lmL (Amersham-Pharmacia), com um caudal de 0,lmL/min. As proteínas que ficaram ligadas foram eluidas através de um gradiente continuo de 0 a 1M de NaCl ao longo de um volume de 15mL. As fracções eluidas foram analisadas por SDS-PAGE e Western blotting. Alternativamente, as proteínas foram visualizadas, após SDS-PAGE, através de coloração de prata utilizando o kit de coloração de prata Plus (BioRad) como descrito pelo fabricante. As fracções positivas foram 95 testadas quanto à actividade de RdRp (ver abaixo) e as mais ativas foram seleccionadas e recolhidas numa solução de glicerol a 40% e a -70°C.
Ensaio in vitro de proximidade de cintilação VHC RdRp Flashplate (ENSAIO STREP-FLASH) para avaliação dos análogos:
Este ensaio consiste em medir a incorporação de [3H] UTP radiomarcado num primer-template polyrA/biotina-oligo dT, colocado na superfície de uma micropalca Flashplates™ revestida com estreptavidina-cintilante (NEN Life Science Products inc, MA, USA, SMP 103A) . Uma solução de polyrA 400ng/pl (Amersham Pharmacia Biotech) foi misturada volume a volume, com 5'-biotina-oligo dT15 a 20 pmol/μΐ. O template e os primers foram desnaturados a 95°C durante 5 minutos e depois incubados a 37°C durante 10 minutos. Os primers-template foram subsequentemente diluídos em Tris-HCI contendo o tampão e deixaram-se a ligar aos flashplates revestidos com estreptavidina, durante a noite. 0 material não ligado foi descartado; os compostos foram adicionados a uma solução de 10μ1, seguido por 10 μΐ de uma solução contendo 50mM de MgCl2, lOOmM de Tris-HCI pH 7,5, 250mM de NaCl e 5mM de DTT. A reacção enzimática foi iniciada através da adição de 30μ1 da solução que contém a enzima e o substrato, para obter as seguintes concentrações: 25μΜ de UTP, 1 pCi[3H]UTP e lOOnM de HCV NS5B recombinante. As reacções RdRp decorreram durante 2 horas à temperatura ambiente, sendo que após esse tempo, os poços foram lavados três vezes com 250pL de uma solução de NaCl 0,15 M, ar seco a 37°C, e contados utilizando um contador de cintilação líquida (Wallac Microbeta Trilex, Perkin-Elmer, MA, EUA) . 96
Exemplo 11
Ensaio de cultura de células para a replicação do ARN VHC da Luciferase "repórter"
Os compostos da presente invenção são inibidores da polimerase de VHC. Surpreendentemente, verificou-se que os compostos de acordo com a presente invenção e tendo um padrão específico de substituição, exibem um índice terapêutico melhorado, relativamente a outros análogos de tiofeno.
As linhas celulares de replicação Huh-7, 5,2 e ET, que são derivadas a partir da linha celular de hepatocarcinoma Huh-7, foram mantidas em cultura, tal como geralmente descrito em Krieger, N; Lohmann, V; Bartenschlager, R. Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations. J. Virol. 2001, 75, 4614-4624. No Huh- 7, 5,2 células contêm a construção l389luc-ubi-neo/NS3- 3'/5.1 do replicão elevadamente adaptado a cultura celular, que transporta, além do gene de neomicina, uma cópia integrada para o gene da luciferase do pirilampo (Krieger, N; Lohmann, V; Bartenschlager, R. Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations. J. Virol. 2001, 75, 4614-4624). Esta linha celular permite a medição da replicação do ARN do VHC e a tradução pela medição da atividade da luciferase. Foi demonstrado anteriormente que a atividade da luciferase traduz exactamente o nível do ARN do replicão nestas células (Krieger, N; Lohmann, V; Bartenschlager, R. Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations. J. Virol. 2001, 75, 4614-4624). O Huh-7, a linha celular ET tem as mesmas características relativamente às mencionadas para a linha celular Huh-7, 5.2, com excepção 97 de que as células ET são mais robustos e contêm uma mutação adaptativa no gene VHC NS4B, em vez de NS5A. Ambas as linhas celulares foram mantidas em cultura em nivel sub-confluente (< 8 5 %), pois o nivel do ARN do replicão é mais elevado em células a proliferar ativamente. 0 meio de cultura utilizado para a passagem das células consiste no meio DMEM (Gibco BRL Laboratories, Mississauga, ON, Canadá) suplementado com 10% de soro fetal bovino com 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais, e 350ug/mL de G418 de concentração final. As células foram incubadas a 37 °C, em atmosfera de 5% de CO2 e com passagem duas vezes por semana para manter a sub-confluência. Aproximadamente 3000 células viáveis Huh-7, 5,2 ou ET (ΙΟΟμΙ) foram plaqueadas em cada poço de uma placa branca opaca de 96 poços, placa de microtitulação. O meio de cultura utilizado para o ensaio foi o mesmo descrito acima, com excepção de não conter G418 e vermelho de fenol. Após um periodo de incubação de 3-4 horas a 37°C, numa incubadora de CO2 a 5%, os compostos (ΙΟΟμΙ) foram adicionados em várias concentrações. As células foram, posteriormente, incubadas durante 4 dias a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%. Seguidamente, o meio de cultura foi removido e as células foram lisadas através da adição de 95pL de tampão luciferase (substrato de luciferina em detergente tamponado). Os lisados celulares foram incubados à temperatura ambiente e protegidos da luz directa durante pelo menos 10 minutos. Foi realizada a leitura das placas para contagem da luciferase utilizando uma luminómetro (Wallac MicroBeta Trilux, Perkin Ether™, MA, EUA).
As concentrações inibidoras a 50% (IC50S) para o efeito inibidor foram determinadas através das curvas da dose 98 resposta utilizando onze concentrações por composto em duplicato. As curvas foram ajustadas aos dados através de uma análise de regressão não-linear e IC50S foram interpolados utilizando a curva resultante do software GraphPad Prism, versão 2.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).
Exemplo 12: Avaliação dos compostos nos 21 aminoácidos do terminal C truncado do genótipo NS5B do VHC, estirpe lb, através de um ensaio da enzima BK
As referências seguintes são citadas: • Tomei, L., Failla, C., Santolini, E., De Francesco, R., e La Monica, N. (1993) J Virol 67, 4017-4026 • Lesburg, C. A. et al. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase from hepatitis C virus reveals a fully encircled active site. Nat. Struct. Biol. 6, 937-943 (1999). • Ferrari, E. et al. Characterization of soluble hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase expressed in Escherichia coli. J. Virol. 73, 1649-1654 (1999).
Os compostos são avaliados utilizando um ensaio de polimerase in vitro contendo a ARN polimerase do VHC ARN-dependente recombinante purificada (proteína NS5B), expressa em células bacterianas. Os procedimentos experimentais utilizados para a clonagem, expressão e purificação da proteína NS5B do VHC encontram-se abaixo descritos. Seguidamente, são descritos os ensaios da ARN polimerase ARN-dependente para testar os compostos. 99
Expressão da proteína NS5B do VHC em células de insectos:
Expressão e purificação da proteína NS5B do VHC
Uma forma solúvel recombinante, que representa os 21 aminoácidos do terminal C truncado do genótipo NS5B do VHC, estirpe lb, enzima BK (Tomei et ai, 1993), que contém um tag de hexa-histidina no terminal N foi clonada e expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) . A enzima truncada foi purificada tal como descrito em Lesburg et al. (1999) e em
Ferrari et al. (1999), com pequenas modificações.
Resumidamente, os lisados bacterianos solúveis foram colocados numa coluna de afinidade de níquel quelante HiTrap (GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canadá). A enzima ligada foi eluída utilizando um gradiente de imidazol. 0 imidazol foi removido do tampão das frações recolhidas utilizando colunas de dessalinização PD-10 (GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canadá). Uma purificação adicional foi realizada fazendo passar a preparação proteica numa coluna de Sepharose HiTrap SP (GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canadá) para permuta catiónica, utilizando um gradiente de NaCl para a eluição. Posteriormente, o tampão foi mudado para lOmM Tris pH 7,5, glicerol a 10%, 5mM DTT, 600mM NaCl, utilizando uma coluna PD-10. As frações positivas foram testadas para a actividade da polimerase ARN dependente e as fracções mais ativas foram reunidas e armazenadas a -70°C.
Ensaio In Vitro NS5B A medição do efeito inibitório dos compostos sobre a actividade de polimerização NS5B do VHC foi realizada através da avaliação da quantidade de UTP radiomarcado 100 incorporado pela enzima no ARN recém-sintetizado utilizando um homopolimero como template/primer de ARN. Resumidamente, um oligonucleótido (oligo dT) de ADN 15-mer 5' biotinilado emparelhado com um template de ARN homopolimérico poli rA é capturado na superficie da esfera revestida com estreptavidina (GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canadá). Essencialmente, os compostos foram testados a várias concentrações (0,005 a 200 ym) num volume final de 50 μΐ de reacção de mistura, consistindo em 20mM Tris-HCl pH 7,5, 5mM de MgCl2, lmM de DTT, 50mM de NaCl, 50nM enzima purificada NS5B, 250ng de polyrA/oligodT15 (Invitrogen, Burlington, Ontário, Canadá), 15μΜ de UTP não radioativo e 1 yCi de [3H]UTP (3000Ci/mmol; GE Healthcare, Baie d'Urfe, QC, Canadá). A actividade de polimerização da enzima NS5B do VHC é quantificada através da medição da incorporação do substrato (3HJUTP radiomarcado para o crescimento do primer 3' e a detecção é alcançada pela contagem do sinal utilizando um contador de cintilação liquida(Wallac MicroBetaTrilux, ™ da Perkin Elmer, MA, EUA) .
Ensaio de incorporação de [3H]timidina
Um total de 1000-2000 células/poço foram colocadas em placas de 96 poços num volume de 150yL de meio DMEM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) suplementado com 10% de FBS (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) e 2mM de glutamina (Life Technologies, Inc.). A penicilina e estreptomicina (Life Technologies, Inc.) são adicionadas a 500U/mL e 50 yg/mL de concentração final, respectivamente. Após incubação de 18h a 37°C,numa atmosfera de 5% de CO2, o meio foi removido e substituído por meio de cultura com compostos diluídos. Foram testadas, em triplicado, seis 101 diluições em série de duas vezes de fármacos. Após uma incubação de 72h, é adicionado um volume de 50yL de uma solução a 10 mCi/mL de [3H] metil-timidina (Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, III,. 2 Ci/mmol) em meio de cultura e as placas são incubadas durante mais 18 horas a 37°C. As células são depois lavadas com um tampão salino com fosfato (PBS), tratadas com tripsina durante 2min, e recolhidas num filtro de fibra de vidro usando um colector de células Tomtec (Tomtec, Orange, Conn). Os filtros são secos a 37°C durante lh e colocados num saco com 4,5mL de um cocktail de cintilação liquida (Wallac Oy, Turku, Finlândia). A acumulação de [3H]metil-timidina, que representa as células viáveis replicantes, é medida através de um contador de cintilação liquida (1450 Microbeta; Wallac Oy). Ref. SOP: 265-162-03. Para esta experiência, as linhas celulares utilizadas são: Huh-7 ET (células derivadas da linha celular Huh-7 (carcinoma hepatocelular humano) e que contenha um replicão sub-genómico do VHC) , Molt-4 (sangue periférico, leucemia linfoblástica aguda, humana), DU-145 (carcinoma da próstata, metástase cerebral, humano), Hep-G2 (carcinoma hepatocelular humano), e células SH-SY5Y (neuroblastoma, humano).
Análise de Dados
As concentrações citotóxicas a 50% (CC50s) para a toxicidade das células são determinadas a partir de curvas de resposta à dose utilizando seis a oito concentrações em triplicado por composto. As curvas são efetuadas através de pontos dos dados utilizando uma análise de regressão não-linear e os valores de IC50 são interpoladas a partir da curva resultante utilizando o software GraphPad Prism, versão 2.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). 102 TI: Rácio de CC50/IC50 em células replicão VHC (células Huh-7 ET) do Exemplo 12. Quando os compostos são testados mais do que uma vez, a média de TI é fornecido. A tabela 2 apresenta os indices terapêuticos (Tis) dos compostos seleccionados, representativos da invenção relativamente a outros inibidores tiofeno da polimerase do VHC.
Tabela 2
Composto TI 1 ++++++ 2 + + + 3 ++++++ 4 + + + 5 ++++++ 6 ++++++ 7 + + + + + 8 ++++++ 9 ++++++ A + + B + + C + D + + + + E + + + F + + G + + + H + I + + TI +: <100 ++: 100-1000 103 +++: 1000-2000 ++++: 2000-4000 +++++: 4000-6000 ++++++: >6000
104
Os compostos A-I podem ser sintetizados como descrito nas Patentes US N 0 6.881.741, W002/100851, W02004/052885 ou WO 2006/072347.
Exemplo 13 - Estabilidade em microssomas humanos e de rato e indução em cultura de hepatócitos humanos
Certos compostos de acordo com a presente invenção e tendo um padrão de substituição especifico, apresentam uma melhor estabilidade do microssoma e/ou indução em hepatócitos humanos em relação a outros análogos de tiofeno. Por exemplo, os compostos 1 e 2 apresentaram um melhor perfil de estabilidade do microssoma e de relativamente ao composto E. 105
Estabilidade em microssomas humanos e de rato
Cada composto é incubado em microssomas hepáticos (1,6 mg/mL) a 37°C sob condições oxidativas e de glucuronidação (l,5mM NADPH e l,5mM UDPGA em tampão fosfato, pH = 7,4). As incubações que não contenham NADPH e UDPGA são utilizadas como controlo. Os compostos são incubados a 50uM a 0 e 60 minutos. A reacção é parada através da adição de um volume igual de acetonitrilo. A mistura é centrifugada e o sobrenadante é analisado por HPLC/UV ou MS/MS. A percentagem original remanescente corresponde à área do composto inicial na incubação de 60 minutos versus a área do composto inicial no minuto zero e incubação xlOO.
Indução de hepatócitos humanos em cultura
A indução é realizada em hepatócitos humanos criopreservados ou cultivados. As células são cultivadas em colagénio durante 48 horas. Após este período, as células são doseadas com meio de incubação recém-colocado, contendo o composto a testar ou o indutor de controlo positivo, a rifampicina. As concentrações finais dos compostos a testar nas incubações são 1, 10 e 100 mM, enquanto que o controlo positivo é testado a 10 mM. Os controlos negativos (NC) , consistiram na incubação de células com 0,1% de teor final de DMSO. 0 tratamento da célula é prosseguido durante um total de 48 horas de incubação com meios frescos e com o composto a testar ou o indutor de controlo, substituídos diariamente. No final do período de indução, os meios contendo o indutor é removido e as células são lavadas duas vezes com 200ul de tampão de Krebs-Henseleit contendo 12mM 106 HEPES, pH 7,4 (tampão de KH). A indução de CYP3A4 é medida através da actividade utilizando como substrato a testosterona e através de niveis de mARN. Para a actividade de CYP3A4, é adicionado tampão de KH fresco, enriquecido com a testosterona 200mM e as células são incubadas durante 30 minutos a 37°C. No final do período de incubação, o meio é removido e analisado por HPLC/MS para a determinação 6-beta-hidroxi-testosterona. A indução máxima (100% de indução) é determinada através do tratamento com rifampicina a 10 mM. O potencial para os compostos a testar causarem a indução do CYP3A é descrito como uma percentagem de indução máxima obtida com um indutor clássico. Para determinação do nível de mARN, os hepatócitos são recolhidos e o ARN total é preparado utilizando Qiagen RNeasy Purification Kit (Mississauga, ON), de acordo com as instruções do fabricante. Os cADNs dos hepatócitos são sintetizados a partir do ARN total utilizando M-MLV transcriptase reversa (Invitrogen, Carlbad, CA), com o primer universal (Roche Diagnostic, Alemanha). A análise da expressão específica de ARNm em amostras de ARN total é realizada por PCR quantitativo em tempo real utilizando Applied Biosystem's ABI Prism 7700 Sequence Detection System. Os primers utilizados para CYP3A4 são 5'-TCA GCC TGG TGC TCC TCT ATC TAT-3', o forward primer, e 5'-AAG CCC TTA TGG TAG GAC AAA ATA TTT-3', o reverse primer. A sonda utilizada foi de 5'/56-FAM/TCC AGG GCC CAC ACC TCT GCC T/36-TAMSp/-3'. Os dados são normalizados para mARN ribossomal 18S (VIC), com detecção em tempo real. A análise de dados e testes estatísticos são realizados utilizando Microsoft Excel. Os resultados podem ser reportados como a fold change da expressão do gene em relação ao grupo controlo de acordo com a seguinte fórmula: 107
ACt = Ct FAM - Ct VIC AACt = ACt Composto Candidato - ACt Controlo "Fold Induction": 2 -AACt
Os exemplos anteriores podem ser repetidos com semelhante sucesso substituindo, genericamente ou especificamente, os descritos reagentes e/ou condições desta invenção para aqueles utilizados nos exemplos descritos. A partir da descrição anterior, um perito na especialidade pode facilmente verificar as características essenciais desta invenção e pode fazer várias alterações e modificações da invenção dentro do âmbito das reivindicações anexas.
Listagem de Sequências <110> Vírochem Pharrna ínc. <120> Thíophene anatogues for íhe treatment or preveníion of fiavívirus infectíons <13Õ> 134 805 <150> US 60/858,930 <151 >2006-11-15 <160> 7 <170> Paíentln version 3.4 <21G> 1 108
«211> 30 «212> DNA «213> AififlcM «22ϋ> <223> PCR primar NSSNheS' <4ϋΰ> 1 gclagpgcta gcfcaaígte cáacacaigg 30 <210>2 <211> 30 <212> DNA <213> Afifida! <220> «223» PCR primar XhoNSS3' <400> 2 ctcgagctcg agc-giccate gg^gggag 30 <21 &> 3 <211» 36 <212» DNA «213> Artificial «228» «223» PCR primar NSSEPHS «408» 3 alscalalgg dsgca^ic asigiodarc acaigg <210» 4 <211» 30 <212» DNA <213» ÂrfMda! <220» <223» PCR: primer NS5B-R4 <400» 4 gga&cggs! ccqgacatc ggtlggggag <21:0» 5 <211» 24 <212» DNA <213» Artificial <220» <223» PCR primer <400» 5
Icagsciggí gcfcdcisí stat 24 <210»6 <211» 27 <212» DNA <213» Artificia! 110 <220> <223> FCR primer <400>6 asgcccilat ggíaggaosa aatattí <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Afllfcsa! <22:Q> <223> Probe <40S>7
IccagggccG acaccldgc ct
Lisboa, 19 de Julho de 2013

Claims (12)

1/ REIVINDICAÇÕES 1. Um Composto
CKa ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Uma composição farmacêutica compreendendo o composto da reivindicação 1 e pelo menos um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
3. Uma combinação farmacêutica compreendendo o composto da reivindicação 1 e pelo menos um agente adicional.
4. Uma combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que o referido, pelo menos um, agente adicional é seleccionado entre inibidores de proteases serinas virais, inibidores de polimerase virai, inibidores da helicase virai, agentes imunomodeladores, agentes antioxidantes, agentes antibacterianos, vacinas terapêuticas, agentes hepatoprotectores, agentes anti-sense, inibidores da 2/ protease VHC NS2/3 e inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES).
5. Uma combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, em que o referido, pelo menos um, agente adicional é seleccionado entre a ribavirina e α-interferão.
6. Uma combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, em que o referido, pelo menos um, agente adicional é seleccionado entre a ribavirina e α-interferão peguilado. 7. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização num método de tratamento de infeção virai de Hepatite C, num hospedeiro. 8. 0 composto para a utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o método compreende ainda a administração de pelo menos um agente adicional. 9. 0 composto para a utilização de acordo com a reivindicação 8, onde o referido, pelo menos um, agente adicional é seleccionado entre inibidores de proteases serinas virais, inibidores de polimerase virai, inibidores da helicase virai, agentes imunomodeladores, agentes antioxidantes, agentes antibacterianos, vacinas terapêuticas, agentes hepatoprotectores, agentes anti-sense, inibidores da protease VHC NS2/3 e inibidores do local interno de entrada no ribossoma (IRES).
10. O composto para a utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o referido, pelo menos um, 3/ agente adicional é seleccionado entre a ribavirina e α-interferão. 11. 0 composto para a utilização da reivindicação 8, em que o referido, pelo menos um, agente adicional é seleccionado entre a ribavirina e a-interferão peguilado. 12. 0 composto para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, onde o referido hospedeiro é humano.
13. Um composto escolhido entre: éster metilico de ácido 3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metilciclohexanocarbonilo)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxílico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4-[1,2,3]triazol-l-il-ciclohexilamino)-tiofeno-2-carboxilico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4-[1,2,4]triazol-l-il-ciclohexilamino)-tiofeno-2-carboxílico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(tert-butoxicarbonilo)amino-tiofeno-2-carboxilico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-amino-tiofeno-2-carboxilico; éster metilico de ácido 3-[(trans-4- hidroxiciclohexil)-(trans-4-etilciclohexanocarbonilo)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxilico; ou éster metilico de ácido 3-[(trans-4- hidroxiciclohexil)-(trans-4-metil- ciclohexanocarbonilo)-amino]-5-trimetil-silaniletinil-tiofeno-2-carboxilico. 4/
14. Utilização de um composto: éster metilico de ácido 3-[(1,4-dioxa-espiro[4.5]dec-8-il)-(trans-4-metilciclohexanocarbonilo)-amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxílico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4 - [ 1,2,3]triazol-l-il-ciclohexilamino)-tiofeno-2-carboxílico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(4 - [ 1,2,4]triazol-l-il-ciclohexilamino)-tiofeno-2-carboxilico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-(tert-butoxicarbonilo)amino-tiofeno-2-carboxilico; éster metilico de ácido 5-(3,3-dimetil-but-l-inil)-3-amino-tiofeno-2-carboxílico; éster metilico de ácido 3-[(trans-4- hidroxiciclohexil)-(trans-4-etilciclohexanocarbonilo) -amino]-5-iodo-tiofeno-2-carboxilico; ou éster metilico de ácido 3-[(trans-4- hidroxiciclohexil)-(trans-4-metil- ciclohexanocarbonilo)-amino]-5-trimetil-silaniletinil-tiofeno-2-carboxílico. para a sintese de um composto como definido na reivindicação 1. 5/
15. Um sal farmaceuticamente aceitável do composto
17. Uma combinação farmacêutica compreendendo a) o composto 6/
b) α-interferão peguilado; e c) ribavirina.
18. Uma combinação farmacêutica da reivindicação 17 para utilização num método para o tratamento de infeção virai de Hepatite C, num hospedeiro. Lisboa, 19 de Julho de 2013
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