PT2609923T - Processo para a cristalização de 2-(((s)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (s)-isopropilo - Google Patents

Processo para a cristalização de 2-(((s)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (s)-isopropilo Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO PROCESSO PARA A CRISTALIZAÇÃO DE 2-(((S)-(PERFLUOROFENOXI)(FENOXI)FOSFORIL)AMINO)PROPANOATO DE (S)-
ISOPROPILO
Prioridade
Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente US N° 61Ó319.513, depositado em 31 de Março de 2010, Pedido de Patente US N° 61Ó319.548, depositado em 31 de Março de 2010, e Pedido de Patente US N° 12Ó783.680, depositado em 20 de Maio de 2010.
Campo da Invenção São revelados no presente documento fosforamidatos nucleosídicos e sua utilização como agentes para tratar doenças virais. Estes compostos são inibidores da replicação de ARN virai dependente de ARN e são úteis como inibidores da HCV N55B polimerase, como inibidores da replicação de HCV e para o tratamento de infeção por hepatite C em mamíferos.
Antecedentes A infeção pelo vírus da hepatite (HCV) é um grande problema de saúde que conduz a doença hepática crónica, tal como cirrose e carcinoma hepatocelular, num número substancial de indivíduos infetados, estimado ser 2-15 % da população mundial. Estima-se que existam 4,5 milhões de pessoas infetadas só nos Estados Unidos, de acordo com o U.S. Center for #isease Control. #e acordo com a
Organização Mundial da Saúde, existem mais de 200 milhões de indivíduos infetados em todo o mundo, com pelo menos 3 a 4 milhões de pessoas a serem infetadas cada ano. Uma vez infetadas, cerca de 20 % das pessoas eliminam o vírus, mas o resto pode ser veículo do HCV para o resto das suas vidas. #ez a vinte por cento dos indivíduos infetados cronicamente desenvolvem eventualmente cirrose que destrói o fígado ou cancro. A doença virai é transmitida por via parentérica através do sangue e produtos do sangue contaminados, agulhas contaminadas, ou sexualmente e verticalmente de mães infetadas ou mães portadoras aos seus filhos. Os tratamentos atuais para a infeção por HCV, que estão restritos à imunoterapêutica com interferão-a recombinante sozinho ou em combinação com o análogo de nucleósido ribavirina, são de benefício clínico limitado. Além disso, não existe uma vacina estabelecida contra HCV. Consequentemente, existe uma necessidade urgente para agentes terapêuticos melhorados que combatam eficazmente a infeção crónica por HCV. 0 virião do HCV é um vírus ARN de cadeia positiva envelopado com uma única sequência genómica oligorribonucleotídea de cerca de 9600 bases que codifica uma poliproteína de cerca de 3.010 aminoácidos. Os produtos da proteína do gene HCV consistem nas proteínas estruturais C, El, e E2, e nas proteínas não estruturais NS2, MS3, NS4A e NS4B, e NS5A e NS5B. Pensa-se que as proteínas não estruturais (NS) providenciam a maquinaria catalítica para a replicação viral. A NS3 protease liberta NS5B, a ARM polimerase dependente de ARN da cadeia poliproteica. HCV NS5B polimerase é necessária para síntese de um ARN de cadeia dupla de um ARN virai de cadeia simples que serve como um molde no ciclo da replicação do HCV. Portanto, Assim, NS5B polimerase é considerada ser um componente essencial no complexo de replicação do HCV (K. Ishi,áetá al., Heptology, 1999, 29: 1227-1235Â V. Lohmann,á etá al.,
Virology, 1998, 249: 108-118) . A inibição da HCV NS5B polimerase previne a formação do ARN de HCV de cadeia dupla e, portanto, constitui uma abordagem atrativa ao desenvolvimento de terapêuticas antivirais específicas do HCV. 0 HCV pertence a uma família muito maior de vírus que partilham muitas características comuns. VírusáFlaviviridae A família de vírus Flaviviridae compreende pelo menos três gêneros distintos: pestivírus, que causam doença em gado e porcosà flavivírus, que são a causa principal de doenças, tais como a febre do dengue e a febre amarelaà e hepacivírus, cujo único membro é HCV. 0 género flavivírus inclui mais de 6 8 membros separados em grupos com base no parentesco serológico (Calisherã etã al. , J. Gen. Virol, 1993,70,37-43). Os sintomas clínicos variam e incluem febre, encefalite e febre hemorrágica (Fields Virology, Editores: Fields, B. N., Knipe, #, SYL , e Howley, P. M.,
Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, PA, 1996, capítulo 31, 931-959). Flavivírus de preocupação global que estão associados com doença humana incluem os vírus da Febre Hemorrágica do #engue (#HF), vírus da febre amarela, síndrome de choque e vírus da encefalite Japonesa (Halstead, S. B,, Rev. Infect. #is., 1984, 6, 251-264Ã
Halstead, S. B., Science, 239:476-481, 1988Ã Monath, T. P,, New Eng. J. Med, 1988,319,64 1-643). 0 género pestivírus inclui vírus da diarreia virai bovina (BV#V), vírus da febre suína clássica (CSFV, (CSFV, também designada vírus da cólera suína) e vírus da doença da fronteira (B#V) das ovelhas (Moennig, V.áetáal. Adv. Vir. Res. 1992, 41,53-98). As infeções por Pestivírus de animais de quinta domesticados (gado, porcos e ovelhas) causam perdas económicas significativas em todo o mundo. BV#V causa doença mucosal em gado e é de importância económica significativa para a indústria dos animais de quinta (Meyers, G. e Thiel, H.J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-118Ã Moennig V. ,áetáal., Adv. Vir.
Res. 1992, 41,53-98). Os pestivírus humanos não foram tão extensivamente caracterizados como os pestivírus animais. Contudo, pesquisas serolõgicas indicam exposição a pestivírus considerável em seres humanos.
Pestivírus e hepacivírus são grupos de vírus estreitamente relacionados dentro da família Flaviviridae. Outros vírus estreitamente relacionados nesta família incluem o vírus GB A, os agentes tipo A do vírus GB, vírus GB B e vírus GB C (também designado vírus da hepatite G, HGV), 0 grupo hepacivírus (vírus da hepatite CÃ HCV) consiste num número de estreitamente relacionados, mas genotipicamente diferenciáveis, vírus que infetam seres humanos. Existem pelo menos 6 genótipos de HCV e mais de 50 subtipos. #evido às semelhanças entre pestivírus e hepacivírus, combinado com a fraca capacidade dos hepacivírus crescerem eficientemente em cultivo celular, o vírus da diarreia virai bovina (BV#V) é frequentemente utilizado como um substituto para estudar o vírus HCV. A organização genética de pestivírus e hepacivírus é muito semelhante. Estes vírus de ARN de cadeia positiva possuem um quadro de leitura aberta grande único (ORF) que codifica todas as proteínas virais necessárias para a replicação do vírus. Estas proteínas são expressas como uma poliproteína que é co- e pós-traducionalmente processada por ambas proteinases celular e codificada pelo vírus para produzir as proteínas virais maduras. As proteínas virais responsáveis pela replicação do ARN do genoma virai estão localizadas dentro aproximadamente do terminal carboxi. #ois terços do ORF são designados proteínas não estruturais (NS). A organização genética e o processamento da poliproteína da porção de proteína não estrutural do ORF para pestivírus e hepacivírus são muito semelhantes. Para ambos pestivírus e hepacivírus, as proteínas não estruturais (NS) maduras, em ordem sequencial do terminal amino da região codificante da proteína não estrutural para o terminal carboxi do ORF, consistem em p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, e NS5B.
As proteínas NS de pestivírus e hepacivírus partilham domínios de sequência que são característicos de funções proteicas específicas. Por exemplo, Por exemplo, as proteínas NS3 de vírus em ambos grupos possuem motivos de sequências de aminoácido característicos de serina proteinases e de helicases (Gorbalenyaá etá al. , Nature, 1988, 333, 22Ã Bazan and Fletterick Virology, 1989, 171, 637-639Ã Gorbalenyaá etá al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 3889-3897) . #e forma semelhante, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm os motivos característicos de ARN polimerases dirigidas a ARN (Koonin, E. V. e #olja, V.V., Crir. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993, 28, 375-430).
Os papéis e funções reais das proteínas NS de pestivírus e hepacivírus no ciclo de vida do vírus são diretamente análogos. Em ambos casos, a NS3 serina proteinase é responsável por todo o processamento proteolítico dos precursores de poliproteína a jusante da sua posição no ORF (Wiskerchen e Collett, Virology, 1991,184, 341-350Â Bartenschlageráetá al. , J. Virol. 1993, 67, 3835-3844Ã Eckartá etá al. Biochem. Biophis. Res. Comm. 1993,192, 399-406Ã Grakouiá etá al., J. Virol. 1993, 67, 2832-2843À Grakouiáetáal., Proc. Natl. Acad Sei. USA 1993, 90, 1Q5S3-10587Â Hijikataáetáal., J. Virol. 1993, 67, 4665-4675Ã Tomeá etá al. , J. Virol., 1993, 67, 4017-4026) . A proteína NS4A, em ambos casos, atua como um co-fator com a NS3 serina protease (Bartenschlageráetáal., J. Virol. 1994, 68, 5045-5055Ã Faillaá etá al. , J. Virol. 1994, 68, 3753-3760Ã Xuáetáal., J. Virol., 1997, 71:5312-5322). A proteína NS3 de ambos vírus também funciona como uma helicase (Kim etáal., Biochem. Biophis. Res. Comm., 1995, 215, 160-166Â Jin and Peterson, Arch. Biochem. Biophys., 1995, 323, 47-53Â Warrener and Collett, J. Virol. 1995, 69,1720-1726). Finalmente, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm a atividade prevista de ARN polimerases dirigidas a ARN (Behrensáetáal., EMBO, 1996, 15, 12-22À Lechmannáetáal., J. Virol., 1997, 71, 8416-8428Â Yuanáetáal., Biochem. Biophis. Res. Comm. 1997,232,231-235Ã Hagedorn, documento PCT WO 97Ó12033Ã Zhongáetáal., J. Virol., 1998, 72, 9365-9369).
Atualmente, existem opções de tratamento limitadas para indivíduos infetados com o vírus da hepatite C. A opção terapêutica atualmente aprovada é a utilização de imunoterapêutica com interferão-α recombinante sozinho ou em combinação com o análogo de nucleósido ribavirina. Esta terapêutica é limitada na sua eficácia clínica e apenas 50 M dos pacientes tratados respondem à terapêutica, ©rtanto, existe uma necessidade significativa para terapêuticas mais eficazes e novas para fazer face à necessidade médica não satisfeita colocada pela infeção pelo HCV.
Um número de alvos moleculares potenciais para o desenvolvimento de fármacos de antivirais que atuam diretamente como terapêuticas anti-HCV foi agora identificado incluindo, mas não são limitado a, a NS2-NS3 autoprotease, a N3 protease, a N3 helicase e a NS5B polimerase. A ARN polimerase dependente de ARN é absolutamente essencial para a replicação do genoma ARN senso positivo de cadeia simples e esta enzima despoletou interesse significativo entre os químicos médicos.
Inibidores de HCV NS5B como terapêuticas potenciais para infeção por HCV foram revistos: Tan, S .“L. , α . ,
Nature Rev. #rug #iscov., 2002, 1.867-881Ã Walker, M.P.ãetã al., Exp. Opin. Investigational #rugs, 2003, 12, 1269-1280Â Ni, Z- J.,áetáal., Current Opinion in #rug #iscovery and #esenvolvimento, 2004, 7, 446-459Ã Beaulieu, P. L. , et O t- c2 c-t 1. . , Current Opinion in Investigational #rugs, 2004, 5, 838-850Â Wu, J,,ãetáal., Current #rug Targets-Infectious #isorders, 2003, 3, 207-219Ã Griffith, R.C., etáal,, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 2004, 39, 223-237Â Carrol, S.,ãetáal., Infectious #isorders- #rug Targets, 2006, 6, 17-29. 0 potencial para a emergência de estirpes resistentes ao HCV e a necessidade de identificar agentes com cobertura de genõtipo ampla suporta a necessidade de continuar os esforços para identificar nucleósidos novos e mais eficazes como inibidores de HCV NS5B.
Os inibidores de nucleósidos da NS5B polimerase podem atuar tanto como um substrato não natural que resulta na terminação de cadeia ou como um inibidor competitivo que compete com a ligação do nucleótido à polimerase. Para funcionar como um terminador de cadeia o análogo de nucleósido tem de ser captado pela célula e convertidoáiná vivo num trifosfato para competir pelo local de ligação do nucleótido à polimerase. Esta conversão em trifosfato é vulgarmente mediada por quinases celulares que partilham requisitos estruturais adicionais num potencial inibidor de polimerase nucleósido. Infelizmente, isto limita a avaliação direta de nucleósidos como inibidores da replicação do HCV a ensaios baseados na célula capazes de fosforilaçãoáínásítu.
Em alguns casos, a atividade biológica de um nucleósido é impedida pelas suas características de substrato fracas para uma ou mais das quinases necessárias para o converter na forma trifosfato ativa. A formação do monofosfato por uma nucleósido quinase é geralmente vista como a etapa limitante da taxa dos três eventos de fosforilação. Para contornar a necessidade da etapa inicial de fosforilação no metabolismo de um nucleósido ao análogo trifosfato ativo, a preparação de profármacos fosfato adequados foi reportada. Mostrou-se que os profármacos fosforamidatos nucleósidos são precursores do nucleósido trifosfato ativo e inibem a replicação virai quando administrados a células completas infetadas virais (McGuigan, C.,áetáal., J. Med. Chem., 1996, 39, 1748-1753Ã Valette, G.,áet áal., J. Med. Chem., 1996, 39, 1981-1990Ã
Balzarini, J.,áetáal., Proc. National Acad Sei USA, 1996, 93, 7295-7299Â Siddiqui, A. Q.,áet áal,, J. Med. Chem., 1999, 42, 4122-4128Ã Eisenberg, E. J., áetáal., Nucleosides, Nucleotides e Nucleic Acids, 2001, 20, 1091-1098Ã Lee,
W.A.,á etá al. , Antimicrobial Agents e Chemotherapy, 2005, 49, 1898)Ã documento US 2006Ó0241064Ã e documento WO 2 Ο Ο 7Ó0 95269.
Limitando também a utilidade dos nucleósidos como agentes terapêuticos viáveis é, por vezes, as suas fracas propriedades físico-químicas e farmacocinéticas. Estas propriedades fracas podem limitar a absorção intestinal de um agente e limitar a captação no tecido ou célula alvo. Para melhorar as suas propriedades, foram empregues profãrmacos de nucleósidos. Foi demonstrado que a preparação de fosforamidatos nucleósidos melhora a absorção sistémica de um nucleósido e além disso, a fração fosforamidato destes "pró-nucleótidos" é mascarada com grupos lipofílicos neutrais para obter um coeficiente de partição adequado para otimizar a captação e transporte para a célula aumentando dramaticamente a concentração intracelular do análogo nucleósido monofosfato relativo a administrar o nucleósido parental sozinho. Hidrólise mediada por enzima da fração fosfato éster produz um nucleósido monofosfato em que a taxa limitando a fosforilação inicial é desnecessária. Para este fim, o Pedido de Patente US 12ÓQ53.Q15, que corresponde ao documento WO 2008Ó121634 e documento US 2010Ó0016251, descreve um número de profármacos de fosforamidato de nucleósido, muitos dos quais apresentam atividade num ensaio de HCV. Vários compostos revelados no documento US 2010Ó0016251 foram testados como um candidato potencial clínico para aprovação pela F#A. 0 pedido PCT PCTÓLTS2010Ó035641 revela fosforamidatos nucleosídicos, e processos para preparã-los, os quais são inibidores de replicação viral de ARN 5 dependente de ARN e são úteis como inibidores de HCV NS5B polimerase, como inibidores de replicação de HCV e para o tratamento de infeção por hepatite C em mamíferos. 0 pedido PCT PCTÕLTS2011Õ030767 revela um fosforamidato de nucleósido purina e seu hidrato em forma cristalina ou semelhante a cristal.
Sumário da Invenção #e acordo com a presente invenção, proporciona-se um processo para preparar 2- ( ( (S) (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil)amino) propanoato de (S)-isopropilo cristalino representado pela fórmula
que compreende: cristalizar 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo a partir de uma segunda composição que compreende a) uma primeira composiçãoà b) pentafluorofenolÁ c) uma base não nucleofílica e d) uma composição líquidaà em que a primeira composição compreende 2-(((S)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2-(((R)~ (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo, e em que a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um anti - solvente, em que o dito 2-(((S)-(perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S) -isopropilo é útil na preparação de um composto de fórmula 4 e seus respetivos diastereómeros à base de fósforo representados pelas fórmulas Sp-4 e RP-4.
Formas de realização preferidas da invenção são apresentadas nas reivindicações dependentes do conjunto de reivindicações anexo.
Rtôvô ^Sa HecsonViAC!
Figura 1. #ifratograma de XR# de alta resolução de 4. Figura 2. #ifratograma de XR# de alta resolução de RP-4. Figura 3. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4 (Forma 1).
Figura 4. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4 (Forma 1).
Figura 5. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4·CH2C12 (Forma 2) .
Figura 6. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4*CHC13 (Forma 3) .
Figura 7. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4 (Forma 4).
Figura 8. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4 (Forma 5).
Figura 9. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4 (amorfo). F 3L c·!· ίΐί C5 . Estrutura Cristalina de Raios X para SP-4 (Forma 1)
Figura 11. Estrutura (Isotrópica) Cristalina de Raios X para SP-4*CH2C12 (Forma 2)
Figura 12. Estrutura (Anisotrópica) Cristalina de Raios X para SP-4-CH2Cl2 (Forma 2) F ôL cij r 13 . Estrutura Cristalina de Raios X para SP- 4*CHC13 (Forma 3)
Figura 14, Espetro de FT-IR de 4,
Figura 15. Espetro de FT-IR de RP-4.
Figura 16. Espetro de FT-IR de SP-4
Figura 17, Análise de TGA e #SC de 4,
Figura 18. Análise de TGA e #SC de RP-4.
Figura 19. Análise de TGA e #SC de SP-4.
Figura 2 0A. Estrutura Cristalina de Raios X para 8 (SP-isómero) (molécula N° 1 da unidade assimétrica).
Figura 20B. Estrutura Cristalina de Raios X para 8 (SP-isómero) (molécula N° 2 da unidade assimétrica).
Figura 21. #ifratograma de XR# de alta resolução de SP-4 (Forma 6).
Figura 22A. Estrutura Cristalina de Raios X para 2- ( ( (S) -(perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo (molécula N° 1 da unidade assimétrica). Figura 22B. Estrutura Cristalina de Raios X para 2- ( ( (S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo (molécula N° 2 da unidade assimétrica). Descrição Pormenorizada da Invenção Definiçõesá A frase "um" ou "uma" entidade, conforme é utilizada no presente documento, refere-se a uma ou mais dessa entidade por exemplo, um composto refere-se a um ou mais compostos ou pelo menos um composto. Como tal, Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", "pelo menos um" podem ser utilizados alternadamente no presente documento.
Os termos "opcional" ou "opcionalmente", conforme utilizados no presente documento, significam que um evento ou circunstância subsequentemente descritos pode, mas não precisa de, ocorrer e que a descrição inclui casos onde o evento ou circunstância ocorre e casos em que não. Por exemplo, "ligação opcional" significa que a ligação pode ou não estar presente e que a descrição inclui ligações simples, duplas ou triplas. 0 termo "P ®" significa que o átomo de fósforo é quiral e que tem uma designação correspondente de Cahn-Ingold-Prelog de "R" ou "S", que têm os seus significados aceites simples. 0 termo "purificado," como é descrito no presente documento, refere-se à pureza de um dado composto. Por exemplo, um composto é "purificado" quando o dado composto é um componente principal da composição, isto é, pelo menos 50 ã póp puro. Assim, "purificado" abrange pelo menos 50 ã póp pureza, pelo menos 60 ã póp pureza, pelo menos 70 ã de pureza, pelo menos 80 á de pureza, pelo menos 85 á de pureza, pelo menos 90 ã de pureza, pelo menos 92 ã de pureza, pelo menos 94 ã de pureza, pelo menos 96 á de pureza, pelo menos 97 á de pureza, pelo menos 98 á de pureza, pelo menos 99 ã de pureza, pelo menos 99,5 á de pureza, e pelo menos 99,9 ã de pureza, em que "substancialmente puro" abrange pelo menos 97 ã de pureza, pelo menos 98 á de pureza, pelo menos 99 á de pureza, pelo menos 99,5 á de pureza, e pelo menos 99,9 ã de pureza 0 termo "metabolito," como é descrito no presente documento, refere-se a um composto produzido inávivo após administração a um indivíduo em necessidade do mesmo. 0 termo "cerca de" (também representado por ~) significa que o valor numérico indicado é parte de um intervalo que varia dentro do erro experimental padrão. A expressão "substancialmente como mostrado em..." um padrão de XRP# especificado significa que as posições de pico mostradas no padrão de XRP# são substancialmente as mesmas, dentro da inspeção visual ou recorrer listas de picos selecionados (± 0,2 °2Θ) . Um perito ordin0 rio entende que as intensidades podem variar dependendo da amostra. 0 termo "substancialmente anidro" significa que uma substância contém no m0 ximo 10 ã em peso de 0 gua, preferentemente no m0 ximo 1 á em peso de 0 gua, mais preferentemente no m0 ximo 0,5 ã em peso de 0 gua, e mais preferível no m0 ximo 0,1 á em peso de 0 gua.
Um solvente ou anti-solvente (como usado em reações, cristalização, etc. ou rede eóou solventes adsorvidos) inclui pelo menos um de um Ci a C8 álcool, um C2 a C8 éter, um C3 a C7 cetona, um C3 a C7 éster, um Cl a C2 clorocarbono, um C2 a C7 nitrilo, um solvente misturado, um C5 a C12 hidrocarboneto saturado, e um C6 a C12 hidrocarboneto aromático. 0 Ci a C8 álcool refere-se a um álcool cíclicoõacíclico eóou de cadeia linearóramifiçada que tem tal número de carbonos. 0 Ci a C8 álcool inclui, mas não se limita a, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, isobutanol, hexanol, e ciclohexanol. 0 C2 a C8 éter refere-se a um éter cíclicoóacíclico eóou de cadeia linearóramif içada que tem tal número de carbonos. 0 C2 a C8 éter inclui, mas não se limita a, dimetil éter, dietil éter, di-isopropil éter, di-n-butil éter, metil- t-butil éter (MTBE), tetrahidrofurano, e dioxano A C3 a C7 cetona refere-se a uma cetona cíclicaóacíclica eóou de cadeia linearóramifiçada que tem tal número de carbonos. A C3 a C7 cetona inclui, mas não se limita a, acetona, metil etil cetona, propanona, butanona, metil isobutil cetona, metil butil cetona, e ciclohexanona. 0 C3 a C7 éster refere-se a um éster cíclicoóacíclico eóou de cadeia linearóramif içada que tem tal número de carbonos. 0 C3 a C7 éster inclui, mas não se limita a, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de n-butilo, etc. 0 Ci a C2 clorocarbono refere-se a um clorocarbono que tem tal número de carbonos. 0 Ci a C2 clorocarbono inclui, mas não se limita a, clorofórmio, cloreto de metileno (#CM), tetracloreto de carbono, 1,2-dicloroetano, e tetracloroetano.
Um C2 a C7 nitrilo refere-se a um nitrilo que tem tal número de carbonos. 0 C2 a C7 nitrilo inclui, mas não se limita a, acetonitrilo, propionitrilo, etc.
Um solvente misturado refere-se a um solvente comummente utilizado em química orgânica, que inclui, mas não se limita a, dietileno glicol, diglima (dietileno glicol dimetil éter), 1,2-dimetoxi-et.ano, dimetilf ormamida, dimetilsulfóxido, etileno glicol, glicerina, hexametilfosforamida, triame de hexametilfósforo, N-metil-2- pirrolidinona, nitrometano, piridina, trietil amina, e ácido acético. 0 termo C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado refere-se a um hidrocarboneto cíclicoóacíclico eóou de cadeia linearóramifiçada. 0 C5 a C12 hidrocarboneto saturado inclui, mas não se limita a, n-pentano, éter de petróleo (ligroína), n-hexano, n- heptano, ciclohexano, e cicloheptano. 0 termo C6 a Ci2 aromático refere-se a hidrocarbonetos substituídos e não substituídos que têm um grupo fenilo como sua cadeia principal. Hidrocarbonetos preferidos incluem benzeno, xileno, tolueno, clorobenzeno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, xilenos, com tolueno sendo mais preferido. 0 termo "halo" ou "halogénio" como é usado no presente documento, inclui cloro, bromo, iodo e fluoro. 0 termo "grupo de bloqueio" refere-se a um grupo químico que exibe as seguintes caraterísticas. 0 "grupo" é derivado de um "composto de proteção." Grupos que são seletivos para hidroxilos primários sobre hidroxilos secundários que podem ser colocados sob condições consistentes com a estabilidade do fosforamidato (pH 2-8) e transmitir ao produto resultante propriedades físicas substancialmente diferentes permitindo uma separação mais fácil do produto grupo 3'-fosforamidato-5'-novo a partir do composto desejado não reagido. 0 grupo precisa reagir seletivamente com bom rendimento para dar um substrato protegido que é estável para as reações projetadas (veja-se
Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed. T. W. Greene e P. G. M. Wuts, John Wiley Á Sons, Nova York, N.Y., 1999) . Exemplos de grupos incluem, mas não se limitam a: benzoilo, acetilo, benzoilo fenil-substituído, tetrahidropiranilo, tritilo, #MT (4,4'-dimetoxitritil), MMT (4- monometoxitritil), trimetoxitritilo, grupo pixilo (9-fenilxanten-9-il), tiopixilo (9-feniltioxanten-9-il) ou 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX), etc.Á C(0)-alquilo, C(0)Ph, C(0)arilo, CH20-alquilo, CH20-arilo S02-alquilo, S02-arilo, terc-butildimetilsililo, terc- butildifenilsililo. Acetais, tais como MOM ou THP e semelhantes são considerados grupos possíveis. Compostos fluorados são também contemplados contanto que possam ser unidos ao composto e possam ser seletivamente removidos passando através de uns meios de extração em fase sólida fluorosa (FluoroFlash®). Um exemplo específico inclui um análogo de tritilo fluorado, análogo de tritilo 1-[4-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecil)fenil)-1,1-difenilmetanol. Outros análogos fluorados de tritilo, BOC, FMOC, CBz, etc. são também contemplados. Cloretos de sulfonilo como cloreto de p-toluenossulfonilo podem reagir seletivamente na posição 5'. Ésteres poderiam ser formados seletivamente tal como acetatos e benzoatos. Anidridos dicarboxílicos tais como anidrido sucínico e seus derivados podem ser usados para gerar uma ligação éster com um ácido carboxílico livre, tais exemplos incluem, mas não se limitam a oxalilo, malonilo, sucinilo, glutarilo, adipilo, pimelilo, superilo, azelailo, sebacilo, ftalilo, isoftalilo, tereftalilo, etc. 0 ácido carboxílico livre aumenta a polaridade dramaticamente e pode também ser usado como um cabo para extrair o produto de reação em fases aquosas suavemente básicas tais como soluções de bicarbonato de sódio. 0 grupo fosforamidato é relativamente estável em meios ácidos, assim os grupos que requerem condições ácidas de reação, tais como, tetrahidropiranilo, poderiam também ser usados. 0 termo "grupo de proteção" que é derivado de um "composto de proteção," tem o seu significado comum e simples, isto é, pelo menos um grupo de proteção ou bloqueio é ligado a pelo menos um grupo funcional (por exemplo, -OH, -NH2, etc.) que permite a modificação química de pelo menos um outro grupo funcional. Exemplos de grupos de proteção, incluem, mas não se limitam a, benzoilo, acetilo, benzoilo fenil-substituído, tetrahidropiranilo, tritilo, #MT (4,4'-dimetoxitritil), MMT (4-monometoxitritil), trimetoxitritilo, grupo pixilo (9-fenilxanten-9-il) , tiopixilo (9-feniltioxanten-9-il) ou 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX), etc. C(0)-alquilo, C(0)Ph, C(0)arilo, C(0)0(alquilo de cadeia curta), C(0)0(alquileno de cadeia curta)arilo (por exemplo,-C(0)0CH2Ph), C(0)0arilo, CH20-alquilo, CH20-arilo, S02-alquilo, S02-arilo, um grupo de proteção que compreende pelo menos um átomo de silício, tal como, terc-butildimetilsililo, terc-butildifenilsililo, Si(alquilo de cadeia curta)20Si(alquilo de cadeia curta)20H (tal como,
Si (iPr) 20Si (iPr) 20H. 0 termo "composto de proteção," como é usado no presente documento e a não ser que de outro modo definido, refere-se a um composto que contém um "grupo de proteção" e que é capaz de reagir com um composto que contém grupos funcionais que são capazes de serem protegidos. 0 termo "grupo abandonante", como é usado no presente documento, tem o mesmo significado ao perito (Advanced Organic Chemistry: reactions, mechanisms and structure -Quarta Edição por Jerry March, John Wiley e Sons Ed.A 1992 páginas 351-357) e representa um grupo que é parte de e unido a uma molécula substrato numa reação onde a molécula substrato passa por uma reação de deslocamento (com, por exemplo, um nucleófilo), o grupo abandonante é então deslocado. Exemplos de grupos abandonantes incluem, mas não se limitam a: halogénio (F, Cl, Br, e I), preferentemente
Cl, Br, ou 1A tosilato, mesilato, triflato, acetato, canforsulfonato, arilóxido, e arilóxido substituído com pelo menos um grupo de remoção de eletrão (por exemplo, p-nitrofenóxido, 2-clorofenóxido, 4-clorofenóxido, 2,4- dinitrofenóxido, pentafluorofenóxido, etc.), etc. 0 termo "grupo de remoção de eletrão" está de acordo com o seu significado comum no presente documento. Exemplos de grupos de remoção de eletrão incluem, mas não se limitam a, um halogénio, -N02, -C(0)(alquilo de cadeia curta), C(0)(aril), -C(0)0(alquilo de cadeia curta),-C(0)0(aril), etc. 0 termo "reagente básico", como é usado no presente documento, significa um composto que é capaz de deprotonar um grupo hidroxilo. Exemplos de reagentes básicos incluem, mas não se limitam a, um (alquilóxido de cadeia curta)óxido ((alquilo de cadeia curta)0M) em combinação com um solvente alcoólico, onde (alquilóxidos de cadeia curta)óxidos incluem, mas não se limitam a, Me0“, Et0~, nPrO“, JPrO”, cBuO~, íAmO- (iso-amilóxido) , etc., e onde M é um catião de metal alcalino, tal como LiA, NaA, KA, etc. Solventes alcoólicos incluem (alquilo de cadeia curta)OH, tal como, por exemplo, MeOH, EtOH, rTrOH, 2PrOH, fcBuOH, íAmOH, etc. Bases não alcoxi podem também ser usadas tal como hidreto de sódio, hexametildisilazano de sódio, hexametildisilazano de lítio, diisopropilamida de lítio, hidreto de cálcio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, #BU, #BN, reagentes de Grignard, tais como (alquilo de cadeia curta)Mg(halogénio), que incluem, mas não se limitam a MeMgCl, MeMgBr, tBuMgCl, tBuMgBr, etc. 0 termo "base" abrange o termo "reagente básico" e pretende-se que seja um composto que é capaz de desprotonar um composto que contém protão, isto é, uma base de Bronsted. Além dos exemplos indicados acima, exemplos adicionais de uma base incluem, mas não se limitam a piridina, colidina, 2,6-(alquilo de cadeia curta)-piridina, dimetil-anilina, imidazol, N-metilimidazol, pirazol, N-metil-pirazol, trietilamina, di-isopropiletilamina, etc. 0 termo "base não nucleofílica" significa um composto que é capaz de atuar como uma base de Bronsted, mas tem baixa nucleofilicidade. Exemplos de base não nucleofílicas incluem, mas não se limitam a, carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di- isopropi1etilamina, trietilamina, quinuclidina, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8- diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-C 1-6-alquil-piridina, um a2,4,6-tri-Cl-6-alquil-piridina, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno, e 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano. 0 termo "grupo de remoção de eletrão" é de acordo com o seu significado comum. Exemplos de grupos de remoção de eletrão incluem, mas não se limitam a, um halogénio (F, Cl, Br, ou I), -N02, -C(0)(alquilo de cadeia curta), C(0)(aril), -C(0)0(alquilo de cadeia curta),-C(0)0(aril) , etc. 0 termo "co-cristalatos" inclui co-cristalatos de 4, Rp-4, ou Sp-4 em combinação com sais, que abrangem sais farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "sais," como é descrito no presente documento, refere-se a um composto que compreende um catião e um anião, que pode ser produzido por meio da protonação de um fração aceitadora de protão eóou desprotonação de um fração dadora de protão. #everia ser indicado que protonação da fração aceitadora de protão resulta na formação de uma espécie catiõnica em que a carga é equilibrada pela presença de um anião fisiológico, ao passo que desprotonação da fração dadora de protão resulta na formação de uma espécie aniónica em que a carga é equilibrada pela presença de um catião fisiológico. A frase "sal farmaceuticamente aceitável" significa um sal que é farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e semelhantesà ou formados com ácidos orgânicos, tais como ácido glicõlico, ácido pirúvico, ácido lático, ácido malónico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfõnico, ácido etanossulfõnico, ácido 1,2-etanodissulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido 4-clorobenzenossulfõnico, ácido 2-naftalenossulfõnico, ácido 4-toluenossulfónico, ácido canforsulfónico, ácido lauril sulfúrico, ácido glucónico, ácido glutâmico, ácido salicílico, ácido mucónico e semelhantes ou (2) sais de adição de base formados com as bases conjugadas de qualquer dos ácidos inorgânicos listados anteriormente, em que as bases conjugadas compreendem um componente catiónico selecionado entre NaÀ, KA, Mg2À, Ca2Â, NHgR! "4_gA, em que R" ' é um Ci_3 alquilo e g é um número selecionado entre 0, 1, 2, 3, ou 4. #everá ser compreendido que todas as referências a sais farmaceuticamente aceitáveis incluem formas de adição de solvente (solvatos) ou formas cristalinas (polimorfos), conforme definido no presente documento, do mesmo sal de adição de ácido. 0 termo "alquilo" refere-se a um resíduo de hidrocarboneto de cadeia ramificada ou não ramificada, saturada, monovalente contendo 1 a 30 átomos de carbono. 0 termo "Ci-M alquilo" refere-se a um alquilo compreendendo 1 a M átomos de carbono, onde M é um número inteiro com os seguintes valores: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30. 0 termo "Ci_4 alquilo" refere-se a um alquilo contendo 1 a 4 átomos de carbono, 0 termo "alquilo de cadeia curta" indica um resíduo de hidrocarboneto de cadeia simples ou ramificada compreendendo 1 a 6 átomos de carbono. "Ci_2o alquilo" conforme utilizado no presente documento, refere-se a um alquilo compreendendo 1 a 20 átomos de carbono. "Ci-io alquilo" conforme utilizado no presente documento, refere-se a um alquilo compreendendo 1 a 10 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquilo incluem, mas não são limitados a, grupos alquilo de cadeia curta incluem metilo etilo, propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo ou pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, heptilo, e octilo. 0 termo (ar)alquilo ou (heteroaril)alquilo indicam que o grupo alquilo é opcionalmente substituído por um grupo arilo ou um heteroarilo, respetivamente. 0 termo "alquenilo" refere-se a um radical da cadeia hidrocarboneto não substituído com 2 a 10 átomos de carbono com uma ou duas ligações duplas olefínicas, preferentemente uma ligação dupla olefínica. 0 termo "C2-m alquenilo" refere-se a um alquenilo compreendendo 2 a N átomos de carbono, onde N é um número inteiro com os seguintes valores: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. 0 termo "C2-io alquenilo" refere-se a um alquenilo compreendendo 2 a 10 átomos de carbono, 0 termo "C2-4 alquenilo" refere-se a um alquenilo compreendendo 2 a 4 átomos de carbono, Exemplos incluem, mas não são limitados a, vinilo, 1-propenilo, 2-propenilo (alilo) ou 2-butenilo (crotilo). 0 termo "arilo", conforme utilizado aqui, e a menos que seja de outra forma especificado, refere-se a fenilo (Ph) , bifenilo ou naftilo substituído ou não substituído, preferencialmente o termo arilo refere-se a fenilo substituído ou não substituído. 0 grupo arilo pode ser substituído com uma ou mais frações selecionadas entre hidroxilo, F, Cl, Br, I, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfõnico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato e fosfonato, seja desprotegidos ou protegidos conforme necessário, conforme conhecido daqueles peritos na especialidade, por exemplo, conforme ensinado em T.W. Greene e P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3a edição, John Wiley Á Sons, 1999. 0 termo "arilóxido," como é usado no presente documento, e a não ser que de outro modo especificado, refere-se a fenóxido substituído ou não substituído (PhO-), p-fenil-fenóxido (p-Ph-PhO-), ou naftóxido, preferentemente o termo arilóxido refere-se a fenóxido substituído ou não substituído. 0 grupo arilóxido pode ser substituído com uma ou mais frações selecionadas a partir dentre hidroxilo, F, Cl, Br, I, -C(0)(alquilo de cadeia curta), -C(0)0(alquilo de cadeia curta), amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato, e fosfonato, não protegido, ou protegido conforme for necessário, como é conhecido aos peritos na especialidade, por exemplo, como ensinado em T.W. Greene e P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3a ed., John Wiley Á Sons, 1999. 0 termo "preparação" ou "forma farmacêutica" destina-se a incluir ambas as formulações sólidas e líquidas do composto ativo e um perito na especialidade apreciará que um ingrediente ativo pode existir em diferentes preparações dependendo da dose desejada e parâmetros farmacocinéticos. 0 termo "excipiente" como é usado no presente documento refere-se a um composto que é usado para preparar uma composição farmacêutica, e é geralmente segura, não tóxica e não é biologicamente nem de outro modo indesejável, e inclui excipientes que são aceitáveis para utilização veterinária bem como utilização farmacêutica humana. 0 termo "cristalino" refere-se a uma situação onde uma amostra sólida de SP-4 ou RP-4 tem caraterísticas cristalinas quando determinado por difração de raios X de pó ou uma técnica de raios X de cristal único. 0 termo "semelhante a cristal" refere-se a uma situação onde uma amostra sólida de SP-4 ou RP-4 tem caraterísticas cristalinas quando determinado por um meio, por exemplo, visualmente ou por meio de microscopia ótica ou polarizante, mas não tem caraterísticas cristalinas quando determinado por outro meio, por exemplo, difração de raios X de pó. Métodos de determinar visualmente a cristalinidade de uma amostra sólida por meio visual ou por meio de microscopia ótica ou polarizante são revelados em USP Ú695> e Ú776>. Uma amostra sólida de SP-4 ou RP-4 que é "semelhante a cristal" pode ser cristalina sob certas condições, mas pode tornar-se não cristalina, quando submetida a outras condições. 0 termo "amorfo" refere-se a uma situação onde uma amostra sólida de SP-4 ou RP-4 não é nem cristalina nem semelhante a cristal.
Formasádeárealização
Revela-se no presente documento um composto representado pela fórmula 4:
4 em que P® representa um átomo de fósforo quiral. #evido ao átomo de fósforo quiral, o composto representado pela fórmula 4 compreende dois diastereõmeros designados como RP-4 e SP-4. 0 composto representado pela fórmula 4 pode também ser parte de um solvato, um hidrato, ou um solvatoóhidrato misturado. 0 solvato é designado como 4-nS, enquanto o hidrato é designado como 4*mH20, onde S é um solvente em rede, n varia numa quantidade de número inteiro ou número não inteiro de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia numa quantidade de número inteiro ou número não inteiro de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula 4 poderia não existir como um solvato ou hidrato, mas têm uma certa quantidade vantajosa de solvente adsorvido (S) ou água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0 H em peso a cerca de 10 0 em peso com base no peso do composò representado pela fórmula 4. 0 composto representado pela fórmula 4 e seus solvatos e hidratos do mesmo é cristalino, semelhante a cristal, ou amorfo.
Também se revela no presente documento um composto representado pela fórmula RP-4
:
Rp-4 0 composto representado pela fórmula RP-4 pode também ser parte de um solvato, um hidrato, ou um solvatoóhidrato misturado. 0 solvato é designado como RP-4*nS, enquanto o hidrato é designado como SP-4-mH20, onde S é um solvente em rede, n varia numa quantidade de número inteiro ou número não inteiro de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia numa quantidade de número inteiro ou número não inteiro de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula RP-4 poderia não existir como um solvato, hidrato, ou solvatoóhidrato misturado, mas têm uma certa quantidade vantajosa de solvente adsorvido (S) , água, ou ambos S e água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0 I em peso a cerca de 10 E em peso cofoase no peso do composto representado pela fórmula RP-4. 0 composto representado pela fórmula RP-4 e seus solvatos e hidratos do mesmo é cristalino, semelhante a cristal, ou amorfo.
Também se revela no presente documento um RP-4 cristali no.
Também se revela no presente documento um RP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 6.6, 7,1, 9,0, 11,6, 17,9, 20,7, 24,1, 24,4, e 26,2.
Também se revela no presente documento um RP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 6.6, 7,1, 9,0, 11,0, 11,6, 12,0, 16,0, 17,9, 19,6, 20,7, 21,0, 21,7, 21,9, 22,2, 23,1, 24,1, 24,4, 26,1, 27,3, 27,7, e 28,2.
Também se revela no presente documento um J?P-4 cristalino que tem um padrão de difração de XRP# substancialmente como mostrado na Fig. 2.
Também se revela no presente documento um RP-4 que tem os seguintes picos de FT-IR (cm"1) : 1742, 1713, 1679, 1460, 1377, 1259, 1157, e 1079.
Também se revela no presente documento um JRP-4 que tem um espetro de FT-IR substancialmente como mostrado na Fig. 15 .
Também se revela no presente documento um RP-4 substancialmente puro.
Também se revela no presente documento um i?P-4 substancialmente puro cristalino.
Também se revela no presente documento um RP-4 substancialmente puro amorfo.
Também se revela no presente documento um composto representado pela fórmula SP-4:
0 composto representado pela fórmula SP-4 pode também ser parte de um solvato, um hidrato, ou um solvatoóhidrato misturado. 0 solvato é designado como SP-4*nS, enquanto o hidrato é designado como SP-4-mH2Q, onde S é um solvente em rede, n varia numa quantidade de número inteiro ou número não inteiro de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia numa quantidade de número inteiro ou número não inteiro de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula SP-4 poderia não existir como um solvato ou hidrato, mas têm uma certa quantidade vantajosa de solvente adsorvido (S) ou água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0 I em peso a cerca delO M em peso com base no peso do composto representado pela fórmula Sp-4. 0 composto representado pela fórmula SP-4 e seus solvatos e hidratos do mesmo é cristalino, semelhante a cristal, ou amorfo.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino.
Também se revela no presente documento um £P-4 monoclínico cristalino, preferentemente que tem os seguintes parâmetros de célula unitária um ~ 12,88 Ã, b ~ 6.17 Â, c ~ 17,73 A, e β ~ 92,05°.
Também se revela no presente documento um SP-4 monoclínico cristalino, preferentemente que tem os seguintes parâmetros de célula unitária um ~ 20,09 Â, b ~ 6,10 A, c ~ 23,01 A, e β ~ 112,29°.
Também se revela no presente documento um SP-4 monoclínico cristalino, preferentemente que tem os seguintes parâmetros de célula unitária um ~ 12,83 Ã, b ~ 6,15 A, c ~ 17,63 A, e β ~ 91,75°.
Também se revela no presente documento um SP-4 monoclínico cristalino, preferentemente que tem os seguintes parâmetros de célula unitária um ~ 12,93 Ã, b ~ 6.18 A, c ~ 18,01 A, e β ~ 96,40°.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 5,2, 7,5, 9,6, 16,7, 18,3, 22,2.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 5,0, 7,3, 9,4, e 18,1.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 4.9, 6,9, 9,8, 19,8, 20,6, 24,7, e 26,1.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 6.9, 9,8, 19,7, 20,6, e 24,6.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 5.0, 6,8, 19,9, 20,6, 20,9, e 24,9.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 5,2, 6,6, 7,1, 15,7, 19,1, e 25,0.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem reflexões 2Θ de XRP# (°) em cerca de: 6.1, 8,2, 10,4, 12,7, 17,2, 17,7, 18,0, 18,8, 19,4, 19,8, 20,1,20,8, 21,8, e 23,3.
Também se revela no presente documento um SP-4 cristalino que tem um padrão de difração de XRP# substancialmente como mostrado em qualquer um de Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7, Fig. 8, e Fig. 21.
Também se revela no presente documento um SP-4 que tem os seguintes picos de FT-IR (cm'1) em cerca de: 1743, 1713, 1688, 1454, 1378, 1208, e 1082.
Também se revela no presente documento um SP-4 que tem um espetro de FT-IR (cm-1) substancialmente como mostrado na Fig. 7.
Também se revela no presente documento SP-4 substancialmente puro.
Também se revela no presente documento SP-4 substancialmente puro cristalino.
Também se revela no presente documento SP-4 substancialmente puro amorfo.
Dosagem,áAdministração,áeáUtilização
Também se revela no presente documento uma composição para o tratamento eóou profilaxia de qualquer dos agentes virais usando qualquer dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4. Os agentes virais possíveis incluem, mas não estão limitados a: vírus da hepatite C, vírus da hepatite B, vírus da hepatite A, vírus West Nile, vírus da febre amarela, vírus do dengue, rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da diarreia virai bovina, vírus da encefalite japonesa, ou os vírus pertencentes aos grupos de Pestivírus, hepacivírus, ou flavivírus.
Também se revela no presente documento uma composição para o tratamento de qualquer dos agentes virais revelados no presente documento, em que a dita composição compreende um meio farmaceuticamente aceitável selecionado dentre um excipiente, veículo, diluente, e meio equivalente e qualquer dos compostos 4, RP-4, ou Sp-4, que se destina a incluir seus hidratos, solvatos, e quaisquer formas cristalinas de qualquer dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 ou seus hidratos e solvatos dos mesmos.
Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados numa ampla variedade de formas farmacêuticas de administração oral e veículos. A administração oral pode ser feita na forma de comprimidos, comprimidos revestidas, cápsulas de gelatina moles e duras, soluções, emulsões, xaropes ou suspensões. Os compostos 4, Rp-4, ou SP-4 são eficazes quando administrados por administração por supositório, entre outras vias de administração. A forma de administração mais conveniente é geralmente a oral utilizando um regime de dosagem diária conveniente que pode ser ajustado de acordo com a severidade da doença e da resposta do paciente à medicação antiviral.
Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 juntamente com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes convencionais, podem ser colocados na forma de composições farmacêuticas e dosagens unitárias. As formas de composições farmacêuticas e de dosagens unitárias podem ser compreendidas de ingredientes convencionais em proporções convencionais, com ou sem compostos ativos adicionais e as formas farmacêuticas unitárias podem conter qualquer quantidade eficaz adequada do ingrediente ativo em igual medida com o intervalo de dosagem diário pretendido a ser utilizado. As composições farmacêuticas podem ser utilizadas como sólidos, tais como comprimidos ou cápsulas cheias, semissólidos, pós, formulações de libertação prolongada ou líquidos, tais como suspensões, emulsões ou cápsulas cheias para utilização oral ou na forma de supositórios para administração retal ou vaginal. Uma preparação típica conterá cerca de 5 % a cerca de 95 % de composto ou compostos (póp) ativos.
Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser administrados em separado, mas serão geralmente administrados misturados com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmacêuticos adequados selecionados em relação à via de administração pretendida e a prática farmacêutica convencional.
Preparações em forma sólida incluem, por exemplo, pós, comprimidos, pastilhas, cápsulas, supositórios e grânulos dispersáveis. Um veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias que também podem atuar como diluentes, agentes aromatizantes, solubilizadores, lubrificantes, agentes de suspensão, ligant.es, conservantes, agentes desintegrantes de comprimidos ou um material encapsulante. Em pós, o veículo geralmente é um sólido finamente dividido que é uma mistura com o componente ativo finamente dividido. Nos comprimidos, o componente ativo é geralmente misturado com o veículo com a necessária capacidade de ligação em proporções adequadas e compactadas na forma e tamanho desejados. Veículos adequados incluem, mas não se limitam a, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera com baixa fusão, manteiga de cacau e semelhantes. Preparações de forma sólida podem conter, além do componente ativo, corantes, aromatizantes, estabilizadores, tampões, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, espessantes, agentes solubilizadores e semelhantes. Exemplos de formulações sólidas são exemplificados no documento EP 0524579À documento US 2002Õ0142050Â documento US 2004Ó0224917Ã documento US 2005Ó0048116Â documento US 2005Ó0058710Â documento US 2006Ó0034937Ã documento US 2006Ó0057196Â documento US 2Q06Ó01S8570Â documento US 2007Ó0026073Ã documento US 2007Ó0059360Ã documento US 2007Ó0077295Á documento US 2007Ó0099902Â documento US 2008Ó0014228Â documento US 6.267.985Â documento US 6.294.192Â documento US 6.383.471À documento US 6.395.300Ã documento US 6.569.463Â documento US 6.635.278Ã documento US 6.645.528Â documento US 6.923.988Â documento US 6.932.983Â documento US 7.060.294Ã e documento US 7.462.608.
As formulações líquidas que também são adequadas para administração oral incluem formulação líquida incluindo emulsões, xaropes, elixires e suspensões aquosas. Estas incluem preparações de forma sólida que se pretende que sejam convertidas em preparações de forma líquida brevemente antes de utilização. Exemplos de formulação líquida são exemplificados nas Patentes US M° 3.994.974Ã 5.695.784Ã e 6.977.257. Emulsões podem ser preparadas em soluções, por exemplo, em soluções de propilenoglicol aquosas ou podem conter agentes emulsionantes, tais como lecitina, monooleato de sorbitano ou acácia. Suspensões aquosas podem ser preparadas dispersando o componente ativo finamente dividido em água com material viscoso, tal como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e outros agentes de suspensão bem conhecidos.
Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados para administração como supositórios. Uma cera com baixa fusão, tal como uma mistura de glicéridos de ácidos gordos ou manteiga de cacau é primeiro derretida e o componente ativo é disperso homogeneamente, por exemplo, agitando. A mistura homogénea derretida é depois vertida em moldes de tamanho conveniente, permitida arrefecer e solidificar.
Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados para administração vaginal. Pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou vaporizadores contendo além do ingrediente ativo tais veículos conforme são conhecidos na especialidade como sendo apropriados. Certas destas formulações podem também ser usadas em conjunto com um preservativo com ou sem um agente espermicida.
As formulações adequadas juntamente com excipientes, diluentes e veículos farmacêuticos são descritas em Remington: The Science e Practice of Farmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edição, Easton, Pensilvânia. Um cientista de formulação habilitado pode modificar as formulações dentro dos ensinamentos da especificação para providenciar numerosas formulações para uma via de administração particular sem tornar as composições que contêm os compostos contemplados no presente documento instáveis ou comprometer sua atividade terapêutica.
Adicionalmente, os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados em conjunto com lipossomas ou micelas. Como lipossomas, é contemplado que os compostos purificados possam ser formulados numa maneira conforme revelado nas Patentes US N° 4.797.285Â 5.013.556Â 5.077.056Ã 5.077.057Á 5.154.930Â 5.192.549Á 5.213.804Ã 5.225.212Á 5.277.914Á 5.316.771Â 5.376.380Â 5.549.91QÂ 5.567.434Â 5.736.155À 5.827.533Ã 5.882.679Ã 5.891.468Ã 6.060.080A 6.132.763A 6.143.321A 6.180.134A 6.200.598A 6.214.375A 6.224.9Ο3A 6.296.87ΟA 6.653.455A 6.680.068A 6.726.925À 7.060.689Á e 7.070.801. Como micelas, é contemplado que os compostos purificados possam ser formulados numa maneira conforme revelado nas Patentes US N° 5.145.684 e 5.091.188.
Também se revela no presente documento uma utilização de qualquer dos compostos 4, i?p-4, ou SP-4 no fabrico de um medicamento para o tratamento de qualquer condição que seja o resultado de uma infeção por qualquer um dos seguintes agentes virais: vírus da hepatite C, vírus West Nile, vírus da febre amarela, vírus do dengue, rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A, vírus da diarreia virai bovina e vírus da encefalite japonesa. 0 termo "medicamento" significa uma substância usado num método de tratamento eóou profilaxia de um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a substância inclui, mas não se limita a, uma composição, uma formulação, uma forma farmacêutica, e semelhantes, que compreende qualquer dos compostos 4, i?p-4, ou SP-4. É contemplado que a utilização de qualquer dos compostos 4, Rp-4, ou SP-4 no fabrico de um medicamento, para o tratamento de qualquer das condições antivirais reveladas no presente documento, em separado ou em combinação com um outro composto revelado no presente documento.
Também se revela no presente documento um método de tratamento eóou profilaxia num indivíduo em necessidade dos mesmos, em que o dito método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer dos compostos 4, Rp-4, ou SP-4 ao indivíduo. É pretendido que um indivíduo em necessidade dos mesmos é um que tem qualquer condição que seja o resultado de uma infeção por qualquer dos agentes virais revelados no presente documento, que inclui, mas não se limita a, vírus da hepatite C, vírus West Nile, vírus da febre amarela, vírus do dengue, rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A, vírus da diarreia viral bovina ou virus da encefalite japonesa, vírus da família flaviviridae ou pestivírus ou hepacivírus ou um agente viral que causa sintomas equivalentes ou comparáveis a qualquer dos vírus listados acima. 0 termo "indivíduo" significa um mamífero, que inclui, mas não se limita a, gado, porco, ovelha, galinha, peru, búfalo, lama, avestruz, cães, gatos e seres humanos, preferentemente o indivíduo é um ser humano. É contemplado que no método de tratamento de um indivíduo dos mesmos revelados no presente documento pode ser qualquer dos compostos contemplados no presente documento, em separado ou em combinação com um outro composto revelado no presente documento. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz", conforme utilizado aqui, significa uma quantidade necessária para reduzir os sintomas de doença num indivíduo. A dose será ajustada aos requisitos individuais em cada caso particular. Essa dosagem pode variar dentro de limites amplos dependendo de numerosos fatores, tais como a severidade da doença a ser tratada, a idade e estado de saúde geral do paciente, outros medicamentos com os que o paciente está a ser tratado, a via e forma de administração e as preferências e experiência do profissional médico envolvido. Para administração oral, uma dosagem diária de entre cerca de 0,001 e cerca de 10 g, incluindo todos os valores entre, tal como 0,001, 0,0025, 0,005, 0,0075, 0,01, 0,025, 0,050, 0,075, 0,1, 0,125, 0,150, 0,175, 0,2, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, e 9,5, por dia deveriam ser apropriados em monoterapêutica eóou em terapêutica de combinação. Uma dosagem diária particular é entre cerca de 0,01 e cerca de 1 g por dia, incluindo todos os valores incrementais de 0,01 g (isto é, 10 mg) entre, uma dosagem diária preferida de cerca de 0,01 e cerca de 0,8 g por dia, mais preferentemente cerca de 0,01 e cerca de 0,6 g por dia, e o mais preferível cerca de 0,01 e cerca de 0,25 g por dia, cada de que incluindo todos os valores incrementais de 0,01 g em entre. Em geral, o tratamento é iniciado com uma grande "dose de carga" inicial para reduzir ou eliminar rapidamente o vírus seguido da diminuição da dose para um nível suficiente para prevenir reincidência da infeção. Um perito ordinário no tratamento de doenças descritas aqui será capaz, sem experimentação indevida e com base no conhecimento, experiência e nas revelações deste pedido, de verificar a quantidade terapeuticamente eficaz do composto revelado no presente documento para uma dada doença e paciente. A eficácia terapêutica pode ser verificada a partir de testes da função hepática incluindo, mas não limitado a, níveis proteicos, tais como de proteínas do soro (por exemplo, albumina, fatores de coagulação, fosfatase alcalina, aminotransferases (por exemplo, alanina transaminase, aspartato transaminase), 5'-nucleosidase, γ-glutaminiltranspeptidase, etc.), síntese de bilirrubina, síntese de colesterol e síntese de ácidos biliaresà uma função metabólica hepática, incluindo, mas não limitada a, metabolismo do hidrato de carbono, metabolismo do aminoácido e amónia. Em alternativa, a eficácia terapêutica pode ser monitorizada medindo ARN do HCV, Os resultados destes testes permitirão otimizar a dose.
Também se revela no presente documento um método de tratamento eóou profilaxia num indivíduo em necessidade dos mesmos, em que o dito método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto representado por qualquer dos compostos 4, J?p-4, ou Sp-4 e uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente antiviral em que a administração é simultânea ou alternativa. É entendido que o tempo entre a administração alternativa pode variar entre 1-24 horas, que inclui qualquer sub-intervalo dentro destes incluindo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, e 23 horas.
Exemplos de "outro agente antiviral" incluem, mas não se limitam a: inibidores de protease NS3 do VHC (veja-se documento EP 1881001, documento US 2003187018, documento US 2005267018, documento WO 2003006490, documento WO 200364456, documento WO 2004094452, documento WO 2005028502, documento WO 2005037214, documento WO 2005095403, documento WO 2007014920, documento WO 2007014921, documento WO 2007014922, documento WO 2007014925, documento WO 2007014926, documento WO 2007015824, documento WO 2008010921, e documento WO 2008010921)Ã Inibidores de protease NS5B do VHC (veja-se documento US 2004229840, documento US 2005154056, documento US 2005-98125, documento US 20060194749, documento US 20060241064, documento US 20060293306, documento US 2006040890, documento US 2006040927, documento US 2006166964, documento US 2007275947, documento US 6784166, US20072759300, documento WO 2002057287, documento WO 2002057425, documento WO 2003010141, documento WO 2003037895, documento WO 2003105770, documento WO 2004000858, documento WO 2004002940, documento WO 2004002944, documento WO 2004002977, documento WO 2004003138, documento WO 2004041201, documento WO 2004065367, documento WO 2004096210, documento WO 2005021568, documento WO 2005103045, documento WO 2005123087, documento WO 2006012078, documento WO 2006020082, documento WO 2006065335, documento WO 2006065590, documento WO 2006093801, documento WO 200702602, documento WO 2007039142, documento WO 2007039145, documento WO 2007076034, documento WO 2007088148, documento WO 2007092000, e documento W02007095269)Ã inibidores de protease NS4 do VHC (veja-se documento WO 2005067900 e documento WO 2007070556)Ã
Inibidores de protease NS5a do VHC (veja-se documento US 2006276511, documento WO 2006035061, documento WO 2006100310, documento WO 2006120251, e documento WO 2006120252)Â agonistas do recetor do tipo Toll (veja-se documento WO 2007093901)Á e outros inibidores (veja-se documento WO 2000006529, documento WO 2003101993, documento WO 2004009020, documento WO 2004014313, documento WO 2004014852, e documento WO 2004035571)Ã e compostos revelados no Pedido de Patente US N° 120053,015, depositado em 21 de Março de 2008 (documento US 2Q10Ó0016251), interferão-α, interferão-β, interferão-α pegilado, ribavirina, levovirina, viramidina, outro inibidor de HCV polimerase nucleosídico, um inibidor de HCV polimerase não nucleosídico, um inibidor de HCV protease, um inibidor de HCV helicase ou um inibidor de fusão de HCV.
Quando qualquer dos compostos 4, Rp-4, ou SP-4 são administrados em combinação com outro agente antiviral, a atividade pode ser aumentada em relação ao composto parental. Quando o tratamento é terapêutica de combinação, tal administração pode ser concorrente ou sequencial em relação à dos derivados de nucleósidos. "Administração concorrente", conforme é utilizado no presente documento, inclui assim administração dos agentes simultânea ou em deferentes tempos. A administração de dois ou mais agentes ao mesmo tempo pode ser conseguida por uma única formulação contendo dois ou mais ingredientes ativos ou pela administração substancialmente simultânea de duas ou mais formas de dosagem com um único agente ativo.
Será entendido que as referências no presente documento ao tratamento se estendem à profilaxia, bem como ao tratamento das condições existentes. Além disso, o termo "tratamento" de uma infeção por HCV, conforme é utilizado no presente documento, também inclui tratamento ou profilaxia de uma doença ou de uma condição associada com ou mediada pela infeção por HCV ou os sintomas clínicos da mesma.
Preparação
Também se revela no presente documento um processo para preparar qualquer um de compostos 4, RP-4, ou SP-4, que compreende: a) fazer reagir um isopropil-alanato, A, um di-GA-fenilfosfato, B, 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C- metiluridina, 3, e uma base para obter uma primeira mistura que compreende pelo menos um de SP-4 e RP-4
A B 3 em que X é uma base de conjugado de um ácido, n é 0 ou 1, e GA é um grupo abandonante b) fazer reagir a primeira mistura com um composto de proteção para obter uma segunda mistura que compreende pelo menos um de SP-4 protegido e RP-4 protegidoà e c) submeter opcionalmente a segunda mistura a cristalização, cromatografia, ou extração com a finalidade de obter 4, SP-4, ou RP-4. #e acordo com a revelação, o alanato de isopropilo pode estar presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferentemente, substancialmente anidro. #e acordo com a revelação, a base pode ser N-meti1imidazol. #e acordo com a revelação, a razão molar de A-a-B-a-3 pode ser de cerca de 1,6-a-l,3-a-l. #e acordo com a revelação, o composto de proteção pode ser: t — buti1 — dimeti1 — si1i1 — cloreto.
Também se revela no presente documento um processo para preparar SP-4 ou RP-4, que compreende: a) fazer reagir um isopropil-alanato, A, um di-GA-fenilfosfato, B, 2'- deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina, 3, e uma base para obter uma primeira mistura que compreende pelo menos um de SP-4 e Rp - 4
A B 3 em que X é uma base de conjugado de um ácido, n é 0 ou 1, e GA é um grupo abandonante e b) submeter opcionalmente a segunda mistura a cristalização, cromatografia, ou extração com a finalidade de obter purificado SP-4 ou RP-4. #e acordo com a revelação, o processo para preparar Rp-4 pode incluir adicionalmente purificar ainda a segunda mistura ou o RP-4 purificado por meio de dissolução ou suspensão da segunda mistura ou a mistura de RP-4 purificado num solvente opcionalmente seguido de semear com i?P-4 cristalinoà e adicionar suficiente anti-solvente para obter RP-4 cristalino, #e acordo com a revelação, o processo para preparar SP-4 pode incluir adicionalmente purificar ainda a segunda mistura ou o SP-4 purificado por meio de d) dissolução ou suspensão da segunda mistura ou o SP-4 purificado num solvente seguido de semear com SP-4 cristalino em cerca da temperatura ambiente colher um primeiro sólido a maioria do qual compreende SP-4Á dissolver o primeiro sólido num solvente na sua temperatura de refluxoà e arrefecer ou adicionar um anti-solvente para obter um segundo sólido. #e acordo com a revelação, o processo para preparar SP-4 pode incluir adicionalmente purificar ainda SP-4 por meio de d) dissolução ou suspensão da segunda mistura ou a mistura de SP-4 purificado num primeiro solvente seguido de adição de um anti-solvente de modo a obter uma primeira composição em que o solventeóanti-solvente residual é removido por meio de decantação para obter um resíduoà tratar o resíduo com uma solução que contém o primeiro solvente e anti-solvente para produzir uma segunda composição de acordo com o qual após reduzir a pressão propicia um primeiro sólidoà dissolver ou suspender o primeiro sólido usando um segundo solvente de modo a obter uma terceira composiçãoà adicionar sementes de cristal de Sp-4 à terceira composiçãoà colher um segundo sólidoà dissolver ou suspender o segundo sólido num terceiro solvente, opcionalmente aquecido à temperatura de refluxo do terceiro solvente para obter uma quarta composição, e, se for necessário, arrefecer a quarta composição para obter um terceiro sólido que compreende SP-4 que é colhido por meio de filtração. #e acordo com a revelação, no processo para a preparação de SP-4, SP-4 pode ser purificado ainda pela segunda mistura ou o SP-4 purificado por meio de d) adicionar sílica gel à segunda mistura ou o SP-4 purificado seguido de evaporação de solvente para proporcionar uma suspensão secaà agitar a suspensão seca numa primeira combinação de solventeóanti-solvente para obter uma primeira suspensão húmida decantar a primeira combinação de solventeóanti-solvente da primeira suspensão húmida para obter uma segunda suspensão húmida e uma primeira composiçãoà adicionar à segunda suspensão húmida uma segunda combinação de solventeóanti-solvente seguido de agitação decantar a segunda combinação de solventeóanti-solvente da segunda suspensão húmida para obter uma terceira suspensão húmida e uma segunda composiçãoà repetir opcionalmente as etapas g)-h) na terceira suspensão húmida ou suspensões húmidas adicionais evaporar o solvente da segunda composição, e opcionalmente qualquer composição adicional obtido a partir da etapa opcional i) para obter um primeiro sólido dissolver ou suspender o primeiro sólido numa solução que contém um terceiro solvente e opcionalmente um quarto solvente para obter uma terceira composiçãoà adicionar opcionalmente sementes de cristal de Sp-4 à terceira composiçãoà obter da terceira composição um segundo sólido que compreende SP-4à e recristalizar opcionalmente o segundo sólido usando um terceiro solvente para obter um terceiro sólido que compreende SP-4.
Um perito ordinário apreciará que os compostos podem ser separados por meio de extração tradicional, cristalização tradicional ou técnicas cromatográficas tradicionais. AS técnicas cromatográficas tradicionais incluem, mas não se limitam a, cromatográfia em sílica gel (usando, por exemplo, 3-5 % de metanol em #CM ou 4-6 % de isopropanol em #CM) para produzir níveis aumentados de um isómero (50-100 %) e, em seguida, cristaliza-lo. Alternativamente, poderia ser usado cromatográfia de fase reversa (usando, por exemplo, 1-30 % de acetonitrilo-fase móvel aquosa). Além disso, os compostos podem ser isolados por meio de cromatográfia de fluido supercrítico SFC com dióxido de carbono como o solvente principal e alcoóis tais como metanol como um modificador, preferentemente usando os meios quirais apropriados, tais como, #aicel Chiralpack IA. Alternativamente, cromatográfia de SMB pode ser utilizada usando os meios quirais apropriados, tais como, #aicel ChiralPack IA, usando uma mistura de solventes tais como hexanosóisopropanol ou solventes únicos tal como acetato de e t i 1 o.
Também se revela no presente documento um processo para preparar SP-4, que compreende: a) fazer reagir um isopropil-alanil-fosforamidato com um 3 3'-0-protegido ou não protegido, e um reagente básico para obter uma composição que compreende SP-4 protegido ou não protegido
(protegidoáouánãoáprotegido) mistura de diastereómeros em que o isopropil-alanil-fosforamidato está compreendido de uma mistura de diastereómeros representado pelas seguintes estruturas:
c c em que a razão de C:C' é de cerca de 1:1. #e acordo com a revelação, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio e a razão de C:C' é maior que ou igual a cerca de 1:1. #e acordo com a revelação, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio e a razão de C:C' é maior que cerca de 1:1. #e acordo com a revelação, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio e a razão C: C' é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1. #e acordo com a revelação, o GA' pode ser selecionado dentre, 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2-nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4- diclorofenóxido, e pentafluorofenóxido, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio, e a razão de CíC' pode ser pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1.
Também se revela no presente documento um processo para preparar Sp-4, que compreende: a) fazer reagir um isopropil-alanil-fosforamidato (C) com um 3 3'-O-protegido ou não protegido, e um reagente básico para obter uma composição que compreende SP-4 protegido ou não protegido
3 C em que Z é um grupo de proteção ou hidrogénio GA' é um grupo abandonanteà e b) submeter opcionalmente o SP-4 protegido ou não protegido obtido a cromatografia, extração, ou cristalização com a finalidade de obter SP-4 protegido ou não protegido purificado. #e acordo com a revelação, GA' pode ser tosilato, canforsulfonato, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo de remoção de eletrãoà mais preferentemente, GA' é selecionado dentre 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2-nitrofenóxido, 2-cloro- 4-nitrofenóxido, 2,4-diclorofenóxido, ou pentafluorofenóxido. #e acordo com a revelação, quando SP-4 é protegido, isto é, Z não é hidrogénio, o processo refere-se ainda à desproteção de SP-4 protegido. #e acordo com a revelação, a reação pode ser conduzida num solvente aprótico polar, tal como, tetrahidrofurano ou outro solvente etéreo um sendo em separado ou em combinação um com o outro ou com um C2 a C7 ni trilo, tal como acetonitrilo. 0 processo revelado pode compreender ainda 1) fazer reagir (GA')P(0) (GA)2, em que GA, independente de GA', é um grupo abandonante, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (GA')P(0) (GA) (NHAla-2Pr) seguido da reação de (GA')P(O) (GA) (NHAla-3Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura que compreende C e Cf, (ii) fenol e uma primeira base para obter (GA')P(0) (GA) (OPh) seguido da reação de (GA')P(0)(GA)(OPh) com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura que compreende C e C", ou (iii) combinar isopropil-alanato, fenol, e pelo menos uma base para obter uma mistura que compreende C e C' ou 2) fazer reagir (PhO)P(O) (GA)2, em que GA é um grupo abandonante, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (PhO)P(O) (GA) (NHAla-2Pr) seguido da reação de (PhO)P(O) (GA) (NHAla-^Pr) com um precursor de grupo abandonante (GA'H) e uma segunda base para obter uma mistura que compreende C e C' ,
c c e submeter a mistura a cromatografia ou cristalizar a mistura para obter C. #e acordo com a revelação, o alanato de isopropilo pode estar presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferentemente, substancialmente anidro.
Também se revela no presente documento um processo para preparar RP-4, que compreende: a) fazer reagir um isopropil-alanil-fosforamidato com um 3 3'-O-protegido ou não protegido, e um reagente básico para obter uma composição que compreende i?P-4 protegido ou não protegido
(protegidoáouánâoáprotegido) mistura de diastereómeros em que o isopropil-alanil-fosforamidato está compreendido de uma mistura de diastereómeros representado pelas seguintes estruturas:
c c em que a razão de C' :C é de cerca de 1:1. #e acordo com a revelação, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio e a razão de C':C pode ser maior que ou igual a cerca de 1:1. #e acordo com a revelação, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio e a razão de C':C pode ser maior que cerca de 1:1. #e acordo com a revelação, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio e a razão de C:C' pode ser pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1. #e acordo com a revelação, o GA' pode ser p-nitrofenóxido, o reagente básico pode ser cloreto de t-butilmagnésio, e a razão de C':C pode ser pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1.
Também se revela um processo para preparar J?P-4 que compreende: a) fazer reagir um isopropil-alanil-fosforamidato (C') com um 3 3'-O-protegido ou não protegido, e um reagente básico para obter uma composição que compreende J?P-4 protegido ou não protegido
3 a em que Z é um grupo de proteção ou hidrogénioà GA' é um grupo abandonanteà e b) submeter opcionalmente o RP-4 protegido ou não protegido obtido a cromatografia, extração, ou cristalização com a finalidade de obter purificado RP-4 protegido ou não protegido. #e acordo com a revelação, GA' pode ser tosilato, canforsulfonato, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo de remoção de eletrãoÀ mais preferentemente, GA' é selecionado dentre p-nitrofenóxido, 2,4-dinitrofenóxido, e pentafluorofenóxido. #e acordo com a revelação, quando RP-é ê protegido, isto é, Z não é hidrogénio, o processo pode referir-se ainda a desproteger i?P-4 protegido. A reação pode ser conduzida num solvente aprótico polar, tal como, tetrahidrofurano ou outro solvente etéreo um sendo em separado ou em combinação um com o outro ou com um C2 a C7 nitrilo, tal como acetonitrilo. 0 processo revelado pode compreender ainda 1) fazer reagir (GA')P(0) (GA)2, em que GA, independente de GA', é um grupo abandonante, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (GA')P(0) (GA) (NHAla-2Pr) seguido da reação de (GA')P(0) (GA) (NHAla-2Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura que compreende C e C', (ii) fenol e uma primeira base para obter (GA')P(0)(GA)(OPh) seguido da reação de (GA')P(0)(GA)(OPh) com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura que compreende C e C' , ou (iii) combinar isopropil-alanato, fenol, e pelo menos uma base para obter uma mistura que compreende C e C' ou 2) fazer reagir (PhO)P(O)(GA)2, em que GA', independente de GA, é um grupo abandonante, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (PhO)P(O) (GA) (NHAla-^Pr) seguido da reação de (PhO)P(O) (GA) (NHAla- 2Pr) com um precursor de grupo abandonante e uma segunda base para obter uma mistura que compreende C e C' ,
c c e submeter a mistura a cromatografia ou cristalizar a mistura para obter C'. #e acordo com a revelação, o alanato de isopropilo pode estar presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferentemente, substancialmente anidro.
Também se revela no presente documento uma composição obtida pelos processos revelados. Também se revela no presente documento uma composição obtida por qualquer uma das revelações exemplificadas a seguir. A composição assim obtida pode ser cristalina, semelhante a cristal, amorfa, ou uma combinação das mesmas.
Também se revela no presente documento um composto 3
3 em que Z é um grupo de proteção ou hidrogénioÀ que é útil para a preparação de RP-4 ou SP-4,
Também se revela no presente documento um composto que tem a seguinte estrutura
3a : Z = -C (0) CH2CH2C (0) CH3 3b: Z = -C(0)0CH2Ph 3c: Z = "Si(Me)2tBu
3d: Z = -Si (iPr)2OSi (iPr)2OH
Também se revela no presente documento um composto, seu sal, hidrato, solvato, ou combinação do mesmo, representado pelas seguintes estruturas
c c ou onde GA' é um grupo abandonante, que é útil para a preparação de RP-4 ou SP-4, #e acordo com a revelação, GA' pode ser tosilato, canforsulfonato, um arilóxido, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo de remoção de eletrão. #e acordo com a revelação, GA' pode ser selecionado dentre 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2- nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4- diclorofenóxido, ou pentafluorofenóxido. #e acordo com a revelação, GA' pode ser pentafluorofenóxido ou 4-nitro-fenóxido.
Também se revela no presente documento o composto C, em que GA' é 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2- nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4- diclorofenóxido, ou pentafluorofenóxido.
Também se revela no presente documento o composto C, em que GA' é 4-nitrofenóxido ou pentafluorofenóxido.
Também se revela no presente documento o composto C, em que GA' é 4-nitrofenóxido.
Também se revela no presente documento o composto cristalino C, em que GA' é 4-nitrofenóxido.
Também se revela no presente documento o composto C, em que GA' é pentafluorofenóxido.
Também se revela no presente documento o composto cristalino C, em que GA' é pentafluorofenóxido.
Também se revela no presente documento um processo para preparar um composto representado pela fórmula estrutural
C cristalizar o composto de uma composição, que compreende a) uma primeira composiçãoà b) um segundo precursor de grupo abandonante c) uma base não nucleofílicaÁ e d) uma composição líquida em que a primeira composição compreende o composto e seu diastereómero à base de P correspondente. #e acordo com a revelação, a quantidade em mol do composto e a quantidade em mol de seu diastereómero à base de P pode ser a mesma ou diferente. #e acordo com a revelação, a quantidade em mol do composto pode ser maior que a quantidade em mol de seu diastereómero à base de P correspondente ou vice-versa. #e acordo com a revelação, o segundo precursor de grupo abandonante pode ser 2,4-dinitrofenol, 4-nitrofenol, 2-nitrofenol, 2-cloro-4-nitrofenol, 2,4-diclorofenol, ou pentafluorofenol. #e acordo com a revelação, GA' pode ser pentafluorofenóxido. #e acordo com a revelação, o segundo precursor de grupo abandonante pode ser pentafluorofenol. #e acordo com a revelação, a quantidade de pentafluorofenol pode variar de cerca de 0,01 mol equivalentes a cerca de 10 mol equivalentes em relação à quantidade em mol do composto e seu diastereõmero à base de P e todos os mol equivalentes entre estes. A quantidade de pentafluorofenol pode variar de cerca de 0,1 mol equivalentes a cerca de 1 mol equivalentes em relação à quantidade em mol do composto e seu diastereómero à base de P e todos os mol equivalentes entre estes. #e acordo com a revelação, a cristalização pode ocorrer numa temperatura que varia de cerca de -10 °C a cerca de À40 °C e todos os valores de temperatura entre estes. #e acordo com a revelação, a cristalização pode ocorrer em cerca da temperatura ambiente. #e acordo com a revelação, a base não nucleofílica pode ser selecionada dentre carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropi1etilamina, trietilamina, quinuclidina, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-Ci-s-alqui 1 - pi r idina, uma 2,4,6-tri-Ci-g - alqui 1 -piridina, e misturas dos mesmos. #e acordo com a revelação, a base não nucleofílica pode ser trietilamina ou 1,8-diazabicicloundec- 7-eno. #e acordo com a revelação, a base não nucleofílica pode ser trietilamina. #e acordo com a revelação, a base não nucleofílica pode estar presente numa quantidade que varia de cerca de 0,01 mol equivalentes a cerca de 10 mol equivalentes, e todos os mol equivalentes entre estes, em relação à quantidade molar total do composto e seu diastereõmero à base de P. #e acordo com a revelação, a base não nucleofílica pode estar presente numa quantidade que varia de cerca de 0,1 mol equivalentes a cerca de 1 mol equivalentes, e todos os mol equivalentes entre estes, em relação à quantidade molar total do composto e seu diastereõmero à base de P. #e acordo com a revelação, a solubilidade do composto pode ser menor que a solubilidade de seu diastereómero à base de P correspondente na composição líquida ou vice-versa. #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender pelo menos um de um solvente e um anti-solvente, #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender pelo menos um de um Ci a C8 álcool, um C2 a C8 éter, uma C3 a C7 cetona, um C3 a C7 éster, um Ci a C2 clorocarbono, um C2 a C7 nitrilo, um C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado, e um C6 a C22 hidrocarboneto aromático. #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, um C5 a CI2 hidrocarboneto saturado, e um C6 a C12 hidrocarboneto aromático. #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, e um C5 a C12 hidrocarboneto saturado. #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender pelo menos um de acetato de etilo, t-butil-metiléter, e hexano. #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender acetato de etilo e hexano. #e acordo com a revelação, a composição líquida pode compreender t-butilmetiléter e hexano. #e acordo com a revelação, a quantidade de composição líquida pode variar de cerca de 1 ml a cerca de 10 ml por cada grama da primeira composição e todos os valores em mlõg entre estes. A revelação pode compreender ainda adicionar composto cristalino à composição. A revelação pode compreender ainda adicionar cerca de 0,1 a cerca de 1 B em peso, e tdos os valores em 0 em peso entre estes, de composto cris&lino à primeira composição. A revelação pode compreender ainda a) fazer reagir PhOP(O) (GA) 2 e 2Pr -Ala-NH2»HC1 na presença de uma primeira base para obter (PhO)P(O) (GA) (NHAla-iPr)Á b) fazer reagir (PhO)P(O) (GA) (NHAla-2Pr) com um primeiro precursor de grupo abandonante (GA'H) na presença de uma segunda base para obter a composição que compreende o composto e seu diastereómero à base de P em que GA e GA' , independente um do outro, são grupos abandonante sà em que o primeiro precursor de grupo abandonante e o segundo precursor de grupo abandonante são os mesmos ou diferentesA e em que a primeira base e a segunda base são os mesmos ou diferentes. A invenção refere-se a um processo para preparar 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo cristalino que tem a seguinte estrutura, que compreende:
cristalizar 2- ( ( (S)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo de uma segunda composição que compreende a) uma primeira composiçãoà b) pentafluorofenolà c) uma base não nucleofílica e d) uma composição líquidaà em que a primeira composição compreende 2-(((S)-(perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2 -(((R)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo, e em que a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um anti- solvente. A quantidade em mol do 2-(((S)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo e a quantidade em mol do 2 -(((R)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)- isopropilo pode ser a mesma ou diferente. A quantidade em mol do 2-(((S)~ (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo pode ser maior que a quantidade em mol do 2-(((R)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo. A quantidade de pentafluorofenol pode variar de cerca de 0,01 mol equivalentes a cerca de 10 mol equivalentes (e todos os valores em mol equivalente entre estes) em relação à quantidade em mol de 2-(((S)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2-(((R)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo. A quantidade de pentafluorofenol pode variar de cerca de 0,1 mol equivalentes a cerca de 1 mol equivalentes (e todos os valores em mol equivalente entre estes) em relação à quantidade em mol de 2-(((S)-(perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2-(((R)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo.
No processo da presente invenção, a cristalização ocorre numa temperatura que varia de cerca de -10 °C a cerca de À40 °C e todos os valores de temperatura entre estes. A cristalização pode ocorrer em cerca da temperatura ambiente.
No processo da presente invenção, a base não nucleofílica pode ser selecionada dentre carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropi1etilamina, trietilamina, quinuclidina, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8- diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-Ci-s-alquil-piridina, uma 2,4,6-tri-C:L-S-alquil-piridina, e misturas dos mesmos. A base não nucleofílica pode ser trietilamina ou 1,8-diazabicicloundec-7-eno. A base não nucleofílica pode ser trietilamina. A base não nucleofílica pode estar presente numa quantidade que varia de cerca de 0,1 a cerca de 1 mol equivalentes (e todos os valores em mol equivalente entre estes) em relação à quantidade molar total de 2-(((S)~ (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2-(((R)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo. A solubilidade de 2-(((S)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo pode ser menor que a solubilidade de 2-(((R)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo na composição líquida. #e acordo com a invenção, a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um anti-solvente. A composição líquida pode compreender pelo menos um de um C a C8 álcool, um C2 a C8 éter, uma C3 a C7 cetona, um C3 a C7 éster, um C a C2 clorocarbono, um C2 a C7 nitrilo, um C5 a C12 hidrocarboneto saturado, e um C5 a C:L2 hidrocarboneto aromático. A composição líquida pode compreender pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, um C5 a C12 hidrocarboneto saturado, e um C6 a Ci2 hidrocarboneto aromático. A composição líquida pode compreender pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, e um C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado. #e acordo com a invenção, a composição líquida compreende pelo menos um de acetato de etilo, t-butil-metiléter, e hexano. A composição líquida pode compreender acetato de etilo e hexano. A composição líquida pode compreender t-butil-metiléter e hexano. A quantidade de composição líquida pode variar de cerca de 1 a cerca de 10 ml por cada grama (e todos os valores em mlõg entre estes) da primeira composição. 0 processo da invenção pode compreender ainda adicionar 2- ( ( (S)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo cristalino à segunda composição, por exemplo, adicionar cerca de 0,1 a cerca de 1 á em peso (e todos os valores em á em peso entre estes) de 2-(((S)~ (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo cristalino com base no peso total de 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo na primeira composição.
Também se revela no presente documento 2-(((S)-(perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo cristalino obtido pelo processo acima.
Também se revela no presente documento um processo para preparar 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2- il)metoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)- isopropilo, que compreende: cristalizar 2-(((S)~ (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo de uma segunda composição que compreende a) uma primeira composição b) pentafluorofenolà c) uma base não nucleofílica e d) uma composição líquida em que a primeira composição compreende 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2-(((R)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo.
Também se revela no presente documento um processo para preparar 2-( ( (S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidinl(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2- il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)- isopropilo, que compreende: colocar em contato 2-(( (S)- (perfluorofenoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo com um produto obtido por meio da reação de um haleto de t-butilmagnésio com 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5 -(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona com um haleto de t-butilmagnésio. #e acordo com a revelação, a colocação em contato pode ocorrer num meio que tem uma temperatura que varia de cerca de 0 °C a cerca de 40 °C e todos os valores de temperatura entre estes. #e acordo com a revelação, a colocação em contato pode ocorrer num meio que tem uma temperatura que varia de cerca de 0 °C a cerca de 30 °C e todos os valores de temperatura entre estes. #e acordo com a revelação, a razão molar de haleto de t-butilmagnésio a l-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidina-2,4 (1H,3H)-diona pode variar de cerca de 2 a cerca de 2,2. #e acordo com a revelação, a razão molar de haleto de t-butilmagnésio a 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5 -(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona pode ser de cerca de 2,1. #e acordo com a revelação, o haleto de t-butilmagnésio pode ser cloreto de t-butilmagnésio.
Também se revela no presente documento um processo para preparar 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4- dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2- il)metoxi) (fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)- isopropilo substancialmente puro, que compreende: obter 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4- dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroxi-4- metiltetrahidrofuran- 2 - il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)- isopropilo de acordo com a revelação, e cristalizar o assim formado 2-(((S)- (((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2- il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo.
Também se revela no presente documento um análogo marcado isotopicamente de RP-4 ou SP-4. 0 termo análogo "marcado isotopicamente" refere-se a um análogo de RP-4 ou Sp-4 que é um "análogo deuterado", um "análogo 13C-marcado," ou um "análogo deuteradoÓ13-C-marcado." 0 termo "análogo deuterado" significa um composto descrito no presente documento, de acordo com o qual um LH-isótopo, isto é, hidrogénio (H) , é substituído por um 2H-isõtopo, isto é, deutério (#) . A substituição de deutério pode ser parcial ou completa. A substituição de deutério parcial significa que pelo menos um hidrogénio é substituído por pelo menos um deutério. Por exemplo, para RP-4 ou SP-4, um perito ordinário pode contemplar pelo menos os seguintes análogos deuterados parciais (onde "dn" representa n-número de átomos de deutério, tais como, para um grupo isopropilo n = 1-7, enquanto para um grupo fenilo, n = 1-5), bem como aqueles representados a seguir.
Embora os grupos metilo representados acima sejam mostrados como sendo completamente deuterados, será reconhecido que variações deuteradas parciais são também possíveis, tais como, -C#H2 e -C#2H. Marcadores isotópicos na furanose e base são também contemplados. #e modo similar, os termos "análogo 13C-marcado" e "análogo deuteradoÓ13-C-marcado" referem-se a um composto descrito no presente documento, de acordo com o qual o átomo de carbono é enriquecido com um 13C-isõtopo o que significa que o grau de enriquecimento excede a abundância natural usual de cerca de 1,1 %.
Exemplos Não sendo para estar limitado por meio de exemplo, os seguintes exemplos servem para facilitar uma melhor compreensão da descrição.
AspetosáSintéticos
Com a finalidade de preparar o nucleósido uridina, pode-se tirar vantagem de um intermediário de citidina tribenzoilada avançado na síntese de certos análogos 3',5'-diacilados de 3 (veja-se a seguir) já produzidos eficientemente numa escala de planta piloto (veja-se documento WO 2006Õ031725 ou documento US 200600122146.).0 seguinte método foi encontrado como sendo escalável e económico.
í 2 3 3',5'-O-dibenozil-2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4- benzoilcitidina (1) é obtida por um método revelado no documento WO 2006Ó031725 e documento WO 2008Ó045419. 1 é tratado com ácido acético aquoso a 7 0 0 para formar 3 ' , 5 '-0-dibenozil-2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C- metiluridina (2) . Os ésteres benzoílicos podem ser hidrolisados por um número de métodos também, por exemplo, alcóxidos em solvente alcoólico, tal como metóxido de sódio em metanol, carbonato de potássio em metanol, ou análogos de etanol, alquilaminas tais como metilamina em metanol, butilamina etc. Amónia metanólica foi escolhida para o trabalho numa escala maior. 0 produto uridina (3) pode ser purificado por meio de cristalização para proporcionar um rendimento de 70 0 a partir da citidina tribenzoilda (1).
Numerosos procedimentos da literatura detalham diferentes vias e condições para preparar fosforamidatos usando diversos equivalentes de dobra de reagentes. Veja-se, por exemplo, McGuigan etáal. J. Med. Chem. 2005, 48, 3504-3515 e McGuigan etáal. J. Med. Chem. 2006, 49, 7215.
Para o trabalho à escala do processo, existe somente um exemplo presentemente conhecido, que é revelado em Lehsten etá al. , Org. Process Res. #ev. 2002, 6, 819-822 ("Lehsten"). Nesta referência, os autores introduzem o conceito de um "procedimento one~pot" em que um sal cloridrato de aminoácido e diclorofosfato de fenilo são feitos reagir juntamente com N-metilimidazol em diclorometano. #epois disso, o nucleõsido é adicionado para formar o produto 5'-0-fosforamidato desejado, que no presente caso produziria um composto representado pela fórmula 4. Infelizmente, o procedimento de Lehsten apresentou inconvenientes. Por exemplo, o procedimento de Lehsten utilizou um excesso muito grande de reagentes que se tornou necessário adicionar ao custo e dificuldade de purificação cromatográfica. Além disso, Lehsten sugeriu que poderia ser controlada a seletividade da reação no 5'-hidroxilo sobre o 3'-hidroxilo em comparação com uma referência da literatura através da utilização de temperaturas mais baixas e adição lenta do nucleósido.
4 5 6 51-0-fosforamidato 31-0-fosforamidato 3',5‘-bis-0“ fosforamidato (2 diastereómeros) (2 diastereômeros) (4 diastereómeros)
Usando o procedimento de Lehsten para os compostos revelados no presente documento proporcionou cerca de 1-5 EI de diastereómeros de 3'-0-fosforamidato mono-substituídos (5) e cerca de 10-30 EI do produto bis-substituído (6) . Como a polaridade dos diastereómeros 3'- foi muito similar aos 5'-diastereómeros desejados (4), a separação cromatográfica foi muito desafiadora. 0 aumento de escala do processo foi quase impossível sem descartar uma porção substancial dos 5' -diastereómeros menos polares (4) ou aceitar um nível mais alto de contaminação dos 3'-diastereómeros (5). Num aumento de escala de 50 g inicial, o produto resultante continha uma contaminação de 3'-diastereõmero (5) de cerca de 3 EI , que co-eluiu com o menos polar do 5'-diasteeõmero (4) . São revelados no presente documento condições de reação que utilizam quantidades menores de reagentes e um método para remover seletivamente a impureza dos diastereómeros de 3'-O-fosforamidato (5) com uma separação cromatográfica mais fácil deste modo propiciando os diastereómeros de 5'-O-fosforamidato desejados com uma pureza muito mais alta (4).
Para a estequiometria do reagente, foi feito um estudo em que a estequiometria dos reagentes foi sistematicamente alterado e os resultados foram monitorizados por RMN de fósforo da reação em bruto como Lehsten tinham relatado. Nos mais bem-sucedidos é executado, o rendimento isolado e a pureza do produto desejado foram comparados. Observou-se que o 5'-hidroxilo primário reage a um ritmo mais rápido do que o 3'-hidroxilo secundário. Isto cria uma situação de competição entre o progresso da reação de consumir todo o nucleósido de partida e converter produtos 5'- e 3'-monosubstituídos (4 e 5) aos produtos 5',3'-bis substituídos (6). 0 produto 3'-monosubstituído converte ao produto bis a uma taxa mais rápida do que o produto 5!-mono-substituído, por isso, é possível reduzir o nível de contaminação de 31-diastereómero empurrando a reação mais aos produtos bis-substituídos. Mo entanto, com um meio eficaz para remover os 3'-diastereómeros, a reação pode ser otimizada para produzir mais do 5!-diastereómero desejado sem que tenha que sacrificar tanto do 5'- diastereómero a ser convertido ao bis-substituído (6). Foi também observado que o cloridrato de aminoácido é muito higroscópico. Como qualquer água presente iria consumir uma quantidade equivalente do reagente de diclorofosfato de fenilo, deve ser tomado cuidado para manter o aminoácido substancialmente anidro ou ele deve ser feito substancialmente anidro antes de usar. Em suma, Lehsten tinha relatado que a razão ótima de aminoácidos em relação a diclorofosfato de fenilo em relação a nucleósido foi 3,5:2,5:1 respetivamente. Encontrou-se que que a razão ótima de aminoácido em relação a diclorofosfato de fenilo em relação a nucleósido de cerca de 1,6 a cerca de 1,3 a cerca de 1 é ótima sob condições em que o 3'-diastereómero pode ser eficientemente removido e quando o cloridrato de aminoácido é substancialmente anidro. Ao utilizar uma menor quantidade dos reagentes, uma economia de custos é realizada juntamente com uma simplificação da separação cromatogrãfica do produto desejado a partir de reagente de subprodutos e do nível reduzido de bis diastereõmeros.
Num procedimento alternativo, um derivado 3'-hidroxi-bloqueado de 3 foi preparado usando um grupo de bloqueio de t-butildimetilsililo em duas etapas. Este foi convertido, em seguida, ao seu derivado de 5'-fosforamidato. A intenção era de que o grupo sililo pudesse então ser removido e não haveria 3' isómeros (5) ou 3',5'-bis fosforamidatos (6). Uma abordagem similar foi demonstrada por Borch e Fries (Patente US 5.233.031) num rendimento global baixo num fosforamidato de alquilo.
Outra abordagem alternativa foi utilizar a síntese direta e, em seguida, utilizar a química para ajudar a diferenciar as impurezas de 3' -diastereómero 5 dos 5'-diastereómeros desejados 4 para ajudar a separação. #esejou-se que um grupo reagisse seletivamente com o hidroxilo primário livre da impureza de 3'-O-fosforamidato 5 sobre o hidroxilo secundário livre do 5'-O-fosforamidato desejado 4. Foi também desejado que o grupo de bloqueio mudasse significativamente a polaridade do produto 5'-0-bloqueado 3'-O-fosforamidato resultante a partir do 5'-0-fosforamidato desejado 4. Não haveria etapa extra necessária para remover o grupo de bloqueio como os 5'-diastereómeros desejados 4 não seriam alterados. Os 3'-diastereómeros quimicamente alterados permitiriam então uma separação cromatográfica mais fácil ou separação por meio de suportes sequestrantes especiais ou por meio de extrações.
Especificamente, o grupo de bloqueio terc-butildimetilsililo (tB#MS) satisfaz estes critérios e foi o primeiro a ser demonstrado e subsequentemente utilizado numa escala de multi-quilograma. Sob certas condições, tais como em piridina como solvente e base, o grupo tB#MS reage com elevada seletividade na posição hidroxilo primário sobre a posição hidroxilo secundário 3'. A reação de fosforamidato utiliza N-metilimidazol (NMI) como uma base. Na presença de NMI, a sililação é menos seletiva. #e preferência, a quantidade de NMI deve ser reduzida. Isto pode ser conseguido facilmente, após a reação de fosforamidato por meio de lavagem da solução de reação com ácido clorídrico a 1 N. 0 NMI e o nucleósido de partida remanescente são removidos, deixando uma mistura em bruto de produtos de produtos mono e bis substituídos e subprodutos de reagente. Este é então dissolvido em piridina e tratado com cloreto de terc-butildimetilsililo. 0 produto 3'-monosubstituído 5 é convertido em algumas poucas horas ou menos ao 5'-0-tB#MS-3'-0-fosforamidato 7. 0 progresso da reação pode ser monitorizado por meio de HPLC. A polaridade deste produto sililado 7 é menor que a do bis-fosforamidato 6 e é prontamente removido por meio de cromatografia. Usando este método, foi possível reduzir o nível de 3' -monof osf oramidato 5 a menos de 0,1 % do 5'-produto 4 em comparação com 1-3 % sem o tratamento com sililo. #e modo similar, o tratamento com cloreto de dimetoxitrifenilmetilo (#MT-C1) sob as mesmas condições funcionou t.ão bem. Era também mais fácil de identificar o produto da reação de #MT por meio de TLC como moléculas contendo #MT de mancha laranja brilhante sobre aquecimento ou exposição ao ácido. Pode-se também imaginar muitos outros grupos de bloqueio, tal como mencionado acima.
Ambas as condições de reação e o sequestro da 3'-impureza são métodos gerais e poderiam ser aplicados à maioria dos fosforamidatos nucleosídicos com um hidroxilo 3' livre. A fração de fosforamidato poderia ser qualquer combinação de éster de aminoácido e álcool aromático. A fração de nucleósido poderia ser qualquer nucleósido em que um 5' fosforamidato levaria a um 5'-monofosfato e poderia ser metabolizado ainda à forma 5'-trifosfato. 0 seguinte esquema é o esquema de reação principal ilustrado para preparar isopropil L-alanato fenil fosforamidato de 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina com o produto maior como o 5'-0-fosforamidato desejado (4, dois diastereómeros) e o produto menor como o 3'-0-fosforamidato (5, dois diastereómeros) e o 3',5' -bis-O-fosforamidato (6, quatro diastereómeros). Os reagentes são adicionados nas razões estequiométricas como descrito no método de seção de preparação. A reação é deixada que prosseguisse até cerca de 5 % do material de partida permanecer como julgado por meio da visualização de UV em cromatografia em camada fina (TLC) . Também UPLCÓMS mostrou que aproximadamente 10 % do 3',5' bis-fosforamidato β tinha sido formado em comparação com o 5'-produto desejado. Após extinguir e um tratamento final aquoso ácido, o resíduo bruto da camada orgânica foi preparado para a sililação. Sob as condições de reação descritas, o grupo sililo preferentemente reagido com o 5'-hidroxilo livre do 3'-0-fosforamidato para formar 7. A reação foi continuada até que o 3'-0-fosforamidato não estivesse mais detetável por meio de UPLCÓMS.
51-0-fosforamidato 3-0-fosforamidato 3', 51-bis-0- fosforamidato (2 diastereómeros) (2 diastereómeros) (4 diastereómeros)
31-0-fosforamidato-51-O-tBDMS (2 diastereõmeros)
Após o tratamento final da reação de sililação, o produto desejado é submetido a cromatografia em sílica gel e é eluído cora um gradiente de metanol em diclorometano (1-40).0 5'-monofosforamidato desejado 4 elui por útimo. MétodoádeáPreparação
Exemplo de Referência 1. Preparação de 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3)
Num balão de 10 L, foi adicionado 3', 5'-O-dibenozil- 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4-benzoilcitidina (500 g, 0,874 mol) e ácido acético aquoso a 70 0 (7,5 L). Asolução
foi aquecida até o refluxo (110 °C) durante 20 h. A TLC indicou uma reação completa (Rf 0,6 em 5 0 de metaol em diclorometano (#CM)). A mistura foi arrefecida até a temperatura ambiente e diluída com água (2 L). Após agitação durante 2 h, o precipitado resultante foi colhido por meio de filtração e o sólido foi enxaguado com água (5 L) e seco na atmosfera à temperatura ambiente durante 12 h para proporcionar 360 g (88 0 ) . Este intermediário dibenzoiluridina foi usado diretamente na seguinte etapa adicionando-o todo a amónia metanólica preparada recentemente (5,4 L, cerca de 25 0 ) a 0 °C. Esta temperatura foi mantida durante 3 h e, em seguida, deixada
que se aquecesse até 15 °C durante 24 h. A TLC indicou uma reação completa (Rf 0,4 em 10 ã de metanol em #CM) . A mistura de reação foi filtrada através de um leito de Celite e concentrada sob pressão reduzida para dar o produto bruto (216 g) . 0 produto bruto foi agitado com acetato de etilo (325 ml) durante 3 h à temperatura ambiente. 0 sólido resultante foi colhido por meio de filtração e lavado com acetato de etilo (216 ml). 0 sólido foi seco sob vIEI cuo à temperatura ambiente durante 4h para proporcionar 160 g (78 ã) do produto desejado em 98,7 ã HPLC pureza. 1H-RMN (#MS0-ds) δ 11,44 (s 1, 1H, NH), 7,95 (d, 1H, C-6H) , 5,97 (d, 1H, C-1'H), 5,64 (d, 1H, C-5H), 3,84-3,77 (m, 3H, C-5'-Ha, C-3'H. C-4'H), 3,63-3,60 (m, 1H, C5'-Hb), 1,23 (d, 3H, C-2'-CH3). ES-MS M-l 259.
Exemplo de Referência 2. Preparação de éster isopropílico do ácido (S)-2 -{[(IR,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiônico (4)
Sinónimo: mistura diastereomérica de 5'-0-(Isopropil-L-alanato, fosforamidil)-2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metil- uridina de fenilo.
Um balão de três tubuladuras de 5 L foi equipado com um agitador mecânico, salmoura banho com gelo, termómetro interno, e uma atmosfera de azoto. 0 balão foi carregado com cloridrato de éster isopropílico L-alanina (82,0 g, 0,490 mol) e diclorometano anidro (0,80 L) . Enquanto isto se estava agitando, diclorofosfato de fenilo (85,0 g, 0,40 mol) foi adicionado num lote e agitado. Enquanto se mantinha a temperatura interna entre -5 a 5 °C, uma solução de N-metilimidazol (NMI, 250 g, 3,07 mol) em diclorometano (250 ml) foi adicionada ao longo de um período de uma meia hora. A solução foi deixada a agitar durante 1 h neste intervalo de temperatura. 2'-#eoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-uridina (3, 80,0 g, 0,307 mol) foi adicionada a 0 °C numa porção e, em seguida, o balão de reação foi deixado que se aquecesse lentamente no banho de salmoura. Em 1 h, a temperatura interna foi de até -2 °C. A TLC (5 á de metanol em #CM) a 1 h mostrou que mais de 50 á de nucleósido foi consumido. 0 banho foi removido e o balão de reação alcançou a temperatura ambiente ao longo de 1 h mais. A TLC após 3 h e a 5 h total mostrou que 95 á do nucleósido de partida foi consumido. A mistura de reação foi extinta por meio da adição de metanol (100 ml) e agitação da reação durante 5 minutos. A mistura de reação foi lavada com HC1 a 1 N (2 X 500 ml) seguido de solução de bicarbonato de sódio saturado (2 X 500 ml) . A camada orgânica separada foi seca em sulfato de sódio anidro (50 g) e filtrada. A solução foi evaporada sob pressão reduzida e, em seguida, sob alto vácuo até a secura para dar o produto bruto como um óleo viscoso (170 g) . Os RMN do produto bruto (31P e 1H) foram tomados. 0 3^-RMN indicou cerca de 1 á da integração de fósforo total foi devido à presença do 3' isómero 5.
Ao produto bruto foi adicionada piridina anidra (1700 ml) . 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida e, em seguida, sob alto vácuo com a finalidade de reduzir o conteúdo de água da mistura bruta através de co-evaporação. 0 óleo resultante foi redissolvido em piridina anidra (500 ml) e, em seguida, foi adicionado cloreto de t-butildimetilsililo em excesso (9,0 g, 60 mM) . A reação foi agitada à temperatura ambiente. 0 progresso da reação foi monitorizado por meio de UPLC/MS. Após 3 horas, a impureza 3' 5 poderia não mais ser detetada e a reação foi extinta pela adição de metanol (50 ml). A reação foi evaporada sob pressão reduzida a um óleo. 0 resíduo foi dissolvido em acetato de etilo (1,5 L) e lavado com HC1 a 1 N (2X 500 ml) , seguido de solução de bicarbonato de sódio saturado (2 X 500 ml) . A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro (50 g) , filtrada e evaporada sob pressão reduzida para dar o produto bruto como um óleo amarelo pálido.
0 óleo bruto foi diluído com o mesmo volume de diclorometano e carregado num cartucho de sílica gel de 2,5 Kg num módulo de compressão radial a 100 psi de pressão de ar. Usando uma bomba de gradiente a 6 0 psi e uma taxa de fluxo de 400 mlómin, o cartucho foi lavado com cloreto de metileno (4L) seguido de um gradiente de 1-4 0 de etanol em cloreto de metileno (48 L) . A maioria das impurezas maiores (fosfato de di-(isopropilalanil)fenilo, 3',5'-bis fosforamidato (6), aduto de 3 '-fosforamidat.o-5 ' -TB#MS (7)) eluiu com gradiente de ~3 0 . 0 produto desejado elúu entre 3 e 4 ã de metanol. As frações contendo produto foram classificadas em dois lotes. 0 primeiro continha quantidades pequenas de impurezas superiores e o último foi produto puro. 0 primeiro conjunto de frações continha quantidades pequenas de impurezas menos polares (impurezas superiores) tais como o 3',5'-bis fosforamidato e o fosfato di-alanilfenilo e principalmente o diastereómero Rp e foi necess0 ria uma segunda purificação em coluna. (A terminologia relativa, superior vs. inferior refere-se à eluição em cromatografia em sílica gel de fase normal, onde o "isõmero superior" significa o isómero que elui primeiro.) 0 segundo conjunto de frações não tem uma quantidade significativa de impurezas -justo o RP restante e principalmente os diastereómeros SP. Foi depois recombinado com as frações duas vezes em coluna. 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida e a espuma branca resultante foi seca adicionalmente (0,20 mmHg) durante 1 h para dar 42 g do lote impuro (4:1 isõmero superior vs inferior com base em JiP-RMN) e 3 8 g do lote puro (1:3 isómero superior vs inferior). 0 lote impuro foi recolocado em coluna de um modo similar para dar 3,8 g de isõmero superior 97 á puro (conjunto de fração separado) e 36 g de produto puro numa razão 4:1. Os dois lotes principais foram dissolvidos em #CM, combinados, evaporados sob pressão reduzida e secos (50 °C, 0,2 mmHg, 24 h) para obter 74 g (45,7 S ) de produto puro4 com uma razão diastereomérica de 48: 51, como uma espuma branca, pf cerca de 75-85 °C.
Com a finalidade de produzir um amorfo sólido da mistura diastereomérica, 74 g da espuma branca foram agitados com t-butil metil éter (750 ml) resultando numa solução parcial e um resíduo sólido gomoso. Enquanto se agita, heptanos (750 ml) foram adicionados lentamente e a suspensão foi mecanicamente agitada durante 1 hora até a maioria da goma ter sido convertida a um sólido branco. 0 sólido foi raspado com uma espátula e a suspensão resultante foi filtrada. 0 sólido foi lavado com heptanos (4 X 50 ml) e seco sob vácuo (50 °C, 0,2 mmHg, 24 h) para dar um pó amorfo branco (64 g) com um amplo intervalo de fusão de cerca de 70-80 °C. LH e J1P RMN conformaram com a estrutura e HPLC mostrou uma pureza de 99,8 E com ma razão diastereomérica de 46:54 (também confirmado por 3iP RMN) . Método alternativo para preparar uma mistura sólida de 4. Após cromatografia, o resíduo foi co-evaporado com diclorometano duas vezes (5 mlóg) e seco durante 24 h a 35-40 °C a 35-45 mTorr. 0 resíduo de espuma foi crivado através de uma tela de 250 micron e seco adicionalmente sob as mesmas condições até que o diclorometano residual estivesse abaixo de 400 ppm como medido por meio de CG aérea. 0 pó amorfo fino branco pérola a branco resultante tem um intervalo de temperatura de transição de vidro de 53,7 a 63,5 °C.
Caraterização da mistura de isómeros (4): 1H-RMN (C#C13) δ 10,05 (S 1, 1H, NH, SP) , 10,00 (s 1, 1H, NH, RP) , 7,49 (d, 1H, C6-H, SP) , 7,36 (m, 5H, C6-H, RP, aromático), 7,23-7,14 (m, 6H, RPÕSP, aromático), 6,18 (d 1, 2H, Cl'-H,
RpÕSp) , 5,63 (d, 1H, C5-H, SP) , 5,58 (d, 1H, C5-H, RP) , 5,01 (m, 2H, CH-(CH3)2, RpÓSp) , 4,46-4,33 (m, 8H, C- 5'-H2, ala- NH, C3' - OH, RpÓSp), 4,12 (m, 2 H, ala-CH-CH3, RPÓSP) , 4,01- 3,85 (m, 4H, C3'-H, C4'-H, RPÓSP) , 1,39-1,22 (m, 12H, todo CH3, RpOSp) . J1P-RMN (C#C13) δ 3,60 (RP) , 3,20 Sp em relação a trifenilfosfato a -17,80 ppm. ES-MS ΜΆ1 530,2. Análise Elemental: S calculada (incluindo 0,2 9 H de água mo encontrado por análise de Karl Fisher) C, 49,75Ã H, 5,54Â N, 7,90, F, 3,58, P, 5,84. Encontrado H : C, 49,50ÂH, 5,44Â N, 7,85Â F, 3,62À P, 6,05.
Discussãoásobreáaáseparaçãoádeáisõmeros 0 composto 4 devido à quiralidade no fósforo está compreendido de dois diastereómeros, que são designados como Sp-4 e RP-4. A atribuição estereoquímica foi feita com base em análise de raios X de cristal único de SP-4. Ambos RP-4 e SP-4 deram produto cristalino.
Os procedimentos para a cristalização são delineados a seguir.
£{1-4 iíjj-4
Exemplo de Referência 3.
Cristalização do isómero RP-4. A fração submetida a cromatografia continha o primeiro eluído, o isómero RP-4 menos polar (3,8 g, 97 0 puro) foi dissolvido em isopropanol (36 g) e diluído com heptanos até ficar opaco (72 g) . A solução foi semeada e agitada à temperatura ambiente durante 5 h. 0 sólido resultante foi colhido por meio de filtração a vácuo, lavado com heptanos (2x20 ml) e seco (50 °C, 0,2 mm, 24 h) a 2,3 g de agulhas brancas muito pequenas pf 136,2-137,8 °C. A pureza de HPLC do material resultante foi encontrada como sendo de 99,02 0 .
Rp-4 : 1H-RMN (C#C13) δ 9,10 (s 1, 1H, NH) , 7,36 (m, 2H, o- aromático), 7,26-7,16 (m, 4 H, C6-H, m,p-aromático), 6,16 (d 1, 1H, Cl' -H) , 5,58 (d, 1H, C5-H), 5,01 (sept, 1H, CH- (CH3) 2), 4,52-4,47 (m, 2H, C-5'-H2), 4,10 (d, 1H, C3'-H), 4,02-3,76 (m, 4H, ala- NH, C3 1 - OH, C4!-H, ala- CH - CH3), 1,37-1,20 (m, 12H, todo CH3) .
Exemplo de Referência 4. Preparação e cristalização de SP- 4. Método 1: Precipitação direta a partir do material bruto 4: a uma solução agitada de cloridrato de éster isopropílico L-alanina (10,5 g, 61,5 mmol, azeotropicamente seco, duas vezes, com 50 ml de tolueno cada vez) em diclorometano (100 ml) foi adicionado fenildiclorofosfato (7,5 ml, 50 mmol) à temperatura ambiente. A mistura foi arrefecida até -10 °C e, em seguida, foi adicionada uma solução de NMI (30,5 ml, 384,3 mmol) em 30 ml de diclorometano ao longo de um período de 3 0 min. Após completar a adição, a mistura foi agitada entre -10 e -15 °C durante 1 h. À mistura acima foi adicionado 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3) (10 g, 38,4 mmol) num lote e a
mistura foi agitada a uma temperatura abaixo de -10 °C durante 3 h e, em seguida, lentamente deixada que se aquecesse até 20 °C (6 h) . A mistura foi agitada nesta temperatura durante a noite (15 h) e, em seguida, extinta com 10 ml de metanol. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi redissolvido em EtOAc (200 ml) . A camada de EtOAc foi lavada com água (100 ml) , HC1 a 1 N (3x75 ml), solução de NaHC03 aquoso a 2 % (50 ml) e salmoura (50 ml) . A camada orgânica foi seca em Na2S04, filtrada e concentrada. 0 resíduo foi seco sob alto vácuo durante 2 h para dar uma espuma branca (22 g). A espuma acima foi dissolvida em 33 ml de #CM e, em seguida, foram adicionados 65 ml de IPE (isopropil éter) para dar uma solução saturada. A solução foi filtrada através de uma almofada pequena de Celite e o filtrado foi agitado com sementes de SP-4 durante 72 h à temperatura ambiente (cerca de 22 °C - note que o arrefecimento da suspensão até 0 °C levou a saída de óleo do produto bruto). 0 sólido branco foi filtrado, lavado com ΙΡΞ (20 ml) e seco para dar 4,58 g (mistura de -85:15 de SP-4:RP-4 respetivamente como determinado por 31P RMN) de um pó branco. 0 sólido acima foi suspenso em 23 ml de #CM e, em seguida, submetido a refluxo durante 3 h. A mistura foi arrefecida até a temperatura ambiente e agitada durante 15 h. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com 4,5 ml de #CM frio e seco sob alto vácuo a 45 °C para dar SP-4 puro, pf 93,9-104,7 °C, pureza de HPLC 99,74 0 (3,11 g, 15,20 do nucleósido uridina). SP-4 1H - RMN (C#C13) δ 8,63 (s 1, 1H, NH) , 7,47 (d, 1H, C6-H), 7,30 (m, 2H, o-aromático), 7,26-7,18 (m, 3H, m,p- aromático), 6,18 (dl, 1H, Cl'-H), 5,70 (d, 1H, C5-H), 5,02 (sept, CH-(CH3)2), 4,53 (m, 2H, C-5'-H2), 4,11 (d, 1H, C3 '-H) , 3,97 (m, 3H, C3'-0H, C4'-H, ala-CH-CH3) , 3,77 (s 1, 1H, ala-NH) , 1,39 (d, 3H,C2'-CH3), 1,37 (d, 3H, ala-CH3) , 1,24 (d, 6H, CH-(CH3)2). Método 2: Saída de óleo do material bruto 4: a uma solução agitada de cloridrato de éster isopropílico L-alanina (20,6 g, 123 mmol, azeotropicamente seco, duas vezes, com 75 ml de tolueno cada vez) em diclorometano (200 ml) foi adicionado fenildiclorofosfato (14,9 ml, 100 mmol) à temperatura ambiente. A mistura foi arrefecida até -10 °C e, em seguida, foi adicionada uma solução de NMI (61,3 ml, 769 mmol) em 60 ml de diclorometano ao longo de um período de 30 min. Após completar a adição, a mistura foi agitada entre -10 °C e -15 °C durante 1 h. Ã mistura acima foi adicionada 2'-deoxi-2'- fluoro-2!-C-metiluridina (3) (20 g, 76,9 mmol) num lote e a mistura foi agitada a uma temperatura abaixo de -10 °C durante 3 he, em seguida, lentamente deixada que se aquecesse até 20 °C (6 h) . A mistura foi agitada nesta temperatura durante a noite (15 h) e, em seguida, extinta com 10 ml de metanol. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi redissolvido em EtOAc (400 ml) . A camada de EtOAc foi lavada com água (2 00 ml), HC1 a 1 N (3x100 ml), solução de MaHC03 aquoso a 2 % (100 ml) e salmoura (50 ml) . A camada orgânica foi seca em Na2S04, filtrada e concentrada. 0 resíduo foi seco sob alto vácuo durante 2 h para dar uma espuma branca (43 g) . A espuma acima foi dissolvida em 86 ml de EtOAc num balão de fundo redondo de duas tubuladuras equipado com um agitador mecânico. Enquanto se agitava, 100 ml de heptano foram adicionados lentamente e a suspensão foi agitada durante 1 h. A camada de topo foi decantada e o resíduo foi de novo agitado com 50 ml de 2:3 EtOAcÓheptano soluções durante 10 min e, em seguida, decantado. 0 resíduo foi seco sob alto vácuo para dar uma espuma branca (31 g). A espuma acima foi dissolvida em 46 ml de #CM e, em seguida, foi adicionado 95 ml de IPE para dar uma solução saturada. A solução foi filtrada através de uma almofada pequena de Celite e o filtrado foi agitado com sementes de Sp-4 durante 72 h à temperatura ambiente. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com IPE (30 ml) e seco para dar 7,33 g (mistura de -85:15 de SP-4 : RP- 4 respetivamente como determinado por 31P RMN) de pó branco. 0 sólido acima foi suspenso em 36 ml de #CM e, em seguida, submetido a refluxo durante 3 h. A mistura foi arrefecida até a temperatura ambiente e agitada durante 15 h. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com 7,5 ml de #CM frio e seco sob alto vácuo a 45 °C para dar >99 % de SP-4 puro, (4,78 g, 11,6 % do nucleósido uridina). Método 3: Carga de sílica gel de material bruto 4: 5,0 g de material bruto 4 foram produzidos do mesmo modo que para a mistura de diastereõmeros justo antes da etapa de cromatografia em coluna partindo com aproximadamente 2,5 g de 2'-deoxi-2!-fluoro-2'- C-metiluridina (3). 0 material bruto foi dissolvido em 10 ml de #CM e 10 g de sílica gel foram adicionados à solução. 0 solvente foi evaporado para dar uma suspensão seca. A suspensão foi agitada com 40 ml de 50 % de EtOAcÓhexanos durante 15 min e, em seguida, filtrado. A sílica gel foi lavada com 10 ml adicionais de 50 ã de EtOAcÓhexanos. A sílica gel foi então lavada com 15 ã de MeOHÓ#CM (100 ml) e colhida separadamente. 0 solvente foi evaporado e seco sob alto vS cuo para dar 4,0 g de resíduo (espuma). 0 resíduo foi dissolvido em #CM (6 ml) e, em seguida, foi adicionado ~9 ml de IPE para preparar uma solução saturada. A mistura foi então suavemente agitada durante a noite com sementes de 5P-4 à temperatura ambiente. 0 sólido branco foi filtrado e lavado com IPE (5 ml) para dar 1,28 g de produto. 31P RMN revelou que o produto acima contém 77:23 mistura de SP-4 : RP-4 respetivamente. Esta foi recristalizado a partir de 20 ml de #CM para obter 0,75 g de >99 ã de 5P-4 puro (cerca de 12 ã do nucleósido uridina) . Esta preparação de SP-4 não requer a etapa de sililação como foi feito para a mistura, assim todo o procedimento de reação é mostrado acima. Aspetos de formas polimórficas e cristalinas únicas de SP-4 são apresentados a seguir. Método 4: 40,0 g de mistura 1:1 de 4 foram dissolvidos em 90 ml de diclorometano. #iisopropiléter (70 ml) foi adicionado à solução acima para dar uma solução saturada. (A quantidade de diisopropil éter pode variar com base na pureza do produto.) A solução foi semeada com SP-4 puro (> 99 ã) e a mistura foi suavemente agitada com uma barra agitadora à temperatura ambiente durante 20 h (formação de sólido foi observada após 2 h) . 0 sólido foi filtrado, lavado com 4 0 ml da mistura de diisopropiléteródiclorometano (1:1) e seco para dar um sólido branco (16,6 g, 89,35 ã SP-4 puro por meio de RMN) . Este sólido foi suspenso em 83 ml de diclorometano e submetido a refluxo durante 3 h. A suspensão foi arrefecida até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. 0 sólido foi filtrado e lavado com 10 ml de #CM frio. 0 sólido foi seco sob vS cuo para dar g-4 (13,1 g, 99,48 á puro por meio de HPLC). 11 g deste sólido foi redissolvido em 330 ml de #CM sob condições quentes. A solução foi arrefecida até a temperatura ambiente e deixada nesta temperatura durante a noite. 0 produto cristalino foi filtrado e seco para dar 10,5 g de SP-4 (99,74 ã por meio de HPLC).
Os compostos SP-4 e RP-4 podem alternativamente ser preparados, de acordo com a revelação, por meio da reação de nucleósido (protegido ou não protegido) 3 com um isopropil-alanil-fosforamidato (mistura de C e C' , C ou C'), como mostrado na seguinte equação.
P.#. Howes etáal. Nucleosides, Nucleotides Á Nucleic Acids 2003, Vol. 22, N° 5-8, pp. 687-689 ("Howes") revela 2'- e 5'-fosforamidatos obtidos por uma reação com cloreto de t-butilmagnésio. Neste documento, Howes revela que quando um nucleósido 3'-deoxi-citidina é reagido com éster metílico do ácido (S)-2-[cloro-fenoxi-fosforilamino] propiónico na presença de 1,2 equivalentes de cloreto de t-butilmagnésio, fosforilação seletiva na 2'-posição ocorreu, mas que com um equivalente adicional de fosforilação seletiva de cloreto de t-butilmagnésio na 5'-posição ocorreu. Esta revelação deveria ser contrastada com essa que é revelada em Esquema 1 de Howes.
Exemplo de Referência 5-1. Preparação de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico
A uma solução agitada de fosforodicloridato de 4-nitrofenilo 12,8 g, 50 mmol) em diclorometano (100 ml) foi adicionada uma solução de fenol e trietilamina (7,7 ml, 55 mmol) em diclorometano (100 ml) a -78 °C ao longo de um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura durante 30 min e, em seguida, transferido a outro balão de fundo redondo que contém cloridrato de éster isopropílico L-alanina (8,38 g, 50 mmol) em diclorometano (100 ml) a 0 °C. À mistura foi adicionada uma segunda porção de trietilamina (14,6 ml, 105 mmol) ao longo de um período de 15 min. A mistura foi agitada a 0 °C durante lhe, em seguida, o solvente foi evaporado. 0 resíduo foi triturado com acetato de etilo (150 ml) e o sólido branco foi retirado por filtração. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo pálido. 0 composto bruto foi submetido a cromatografia usando gradiente de 0-20 % de acetato de etiloóhexanos para dar o produto (17 g, 83 % de rendimento) como uma mistura de diastereómeros em cerca de uma razão 1:1. 31P RMN (162 MHz, DMS0-d6) : δ -0,31, - 0,4 7À ΧΗ RMN (400 MHz, DMS0-d6) : δ 8,31-8,27 (m, 2H), 7,51-/,37 (m, 4H), 7,27-7,19(m, 3H), 6,70-6,63(m, 1H), 4,85-4,78(m, 1H), 3,97-3,86(m, 1H), 1,21-1,19 (m, 3H) , 1,11-1,09 (m, 6H)Â MS (ESI) m/z 407 (M-l)EI . 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -2,05, -2,10À XH RMN (400 MHz, CDC13) : δ 8,22 (d, J = 9,2 Hz, 2H) , 7,41-7,33 (m, 4H) , 7,26-7,18 (m, 3H), 5,05-4,96(m, 1H), 4,14-4,05(m, 1H), 3,93-3,88 (m, 1H) , 1,38 (d, J = 6,8 Hz, 3H) , 1,22 (dd, J = 6,2 & 3,0 Hz, 6H)Â MS (ESI) mÓz 407 (M-l)EI .
Exemplo de Referência 5-2. Preparação de SP-4/RP-4.
A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)- 1H- pirimidina-2,4-diona (13 0 mg, 0,5 mmol) em THF seco (1,5 ml) foi adicionada uma solução a 1,0 M de cloreto de terc-butilmagnésio (1,05 ml, 1,05 mmol, 2,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 5 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(4- nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico (mistura 1:1 de isómeros, 408 mg, 1 mmol) em THF (1,5 ml) foi adicionado gota a gota ao longo de um período de 5 min. A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 48 h e, em seguida, extinta com NH4C1 saturado aquoso (20 ml) . A mistura foi dividida em partições entre acetato de etilo (50 ml) e água (20 ml). 0 extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para dar um resíduo amarelo pálido. A cromatografia em coluna do resíduo usando gradiente de 0-2 % de MeOHÓdiclorometano deu um sólido espumoso branco (125 mg, 47 % de rendimento, mistura de SP-4/RP-4 em cerca de uma razão de 3,05:1,0).
Exemplo de Referência 6. Preparação e isolamento não cromatográfico de éster isopropílico do ácido (S)-2 - [ (S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico
0 cloridrato de éster isopropílico L-alanina (330 g, 1,97 mol) foi pré-seco por meio de co-evaporação com tolueno (2 x 400 ml) sob pressão reduzida e, em seguida, seco num forno a vácuo (50 °C, 0,2 mmHg, 17 h) . A uma solução agitada de fosforodicloridato de 4- nitrofenilo (500,0 g, 1,953 mol) em diclorometano anidro (3,0 L) foi adicionada uma solução de fenol (183,8 g, 1,953 mol) e trietilamina (300 ml, 2,15 mol) em diclorometano (900 ml) a -60 °C temperatura interna ao longo de um período de 3 horas. A mistura foi agitada nesta temperatura durante 30 min adicionais e, em seguida, deixada que se aquecesse até -5 °C ao longo de 2,5 horas. 0 éster de aminoácido pré-seco foi adicionado a -5-0 °C sob uma atmosfera de azoto ao longo de 10 min. 0 resíduo de sal de aminoéster no balão de adição foi transferido à mistura de reação via enxagúe com diclorometano (2 x 100 ml) . A mistura foi agitada a 0 °C durante 40 min e uma segunda porção de trietilamina (571 ml, 4,10 mol) foi adicionada ao longo de um período de 40 min a 0 °C. A mistura foi agitada a Q~10 °C durante 3 h e, em seguida, o sólido branco (cloridrato de trietilamina) foi retirado por filtração e enxaguado com diclorometano (3 x 300 ml) . 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com metil t-butil éter (MTBE, 4 L) . 0 sal de sólido adicional assim formado foi retirado por filtração e enxaguado com MTBE (3 x 150 ml). 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um óleo de cor castanho claro limpo. 0 resíduo foi co-evaporado com hexanos (2 x 140 ml) para remover qualquer MTBE residual e seco ainda sob vácuo a 40 °C durante 2 horas. 0 resíduo seco foi misturado com diisopropil éter (IPE, 1,1 L) e agitado a 5 °C num banho de água com gelo. Uma quantidade pequena de sementes de cristal do SP-isómero desejado do produto foi adicionada à solução e a mistura foi agitada a 5 °C durante ao longo de 22 h para formar uma suspensão meio espessa. Esta foi deixada que repousasse num congelador (-10 °C) durante 44 h. 0 produto precipitado foi colhido via filtração e enxaguado com solventes misturados pré-arrefecidos de IPE e hexanos (1:1,3 x 190 ml). 0 sólido foi seco sob vácuo (0,5 mm Hg) à temperatura ambiente até que um peso constante fosse obtido para dar 227,23 g (rendimento: 28,5 %) como um pó branco sólido. A razão de dois diastereómeros SP:RP foi 9,6501 com base em JiP RMN (162 MHz, #MS0-d5, δ -0,31 (SP) , -0,47). 0 produto foi recristalizado por meio de dissolução em IPE (840 ml) enquanto se aquecia num banho a 60 °C. A solução acima foi agitada à temperatura ambiente durante 1 he, em seguida, uma quantidade pequena de sementes de cristal de isómero de Sp foi adicionada. 0 põ branco sólido foi formado dentro de 2 horas e o balão foi armazenado num congelador (-10 °C) durante 16 horas. Um sólido cristalino fino e branco obtido foi filtrado, lavado com IPE pré-arrefecido (3x 50 ml) e seco sob vácuo (ambiente, 0,5 mm Hg) a um peso constante para dar um sólido fofo branco (177,7 g, 22 0 de radimento global ou 44 E de rendimento global com base em redimento teórico do isómero SP) com uma razão diastereomérica de 48Ó1 com base em P-RMN. Pf 62-66 °C. 31P RMN (162 MHz, DMS0-d6): δ -0,31Ã 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6) : δ 8,30-8,27 (m, 2H) , 7,49 (d, J = 8,8 Hz, 2H) , 7,41-7,37 (m, 2H) , 7,23-7,19 (m, 3H), 6,66 (dd, J = 13,6, 10,0 Hz, 1H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,97-3,86 (m, 1H), 1,19 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,10 (d, J = 6,4 Hz, 6H)Ã 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -2,05Â (162 MHz, #MS0-d6) : δ -0,31Ã 3H RMN (400 MHz, CDC13) : δ 8,22 (d, J = 9,2 Hz, 2H) , 7.41- 7,33 (m, 4H) , 7,26-7,18(m, 3H) , 5,05-4,96 (m, 1H) , 4,14-4,05 (m, 1H) , 3,93-3,88(m, 1H) , 1,38 (d, J = 6,8 Hz, 3H) , 1,22 (dd, J = 6,2 Á 3,0 Hz, 6H)Ã ’’H RMN (400 MHz, #MS0-d6) : δ 8,30-8,27 (m, 2H) , 7,49 (d, J = 8,8 Hz, 2H) , 7.41- 7,37 (m, 2H), 7,23-7,19 (m, 3H), 6,66 (dd, J - 13,6, 10,0 Hz, 1H) , 4,86-4,78 (m, 1H) , 3,97-3,86 (m, 1H) , 1,19 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,10 (d, J = 6,4 Hz, 6H) MS (ESI) m/z 407 (M-l)À. A estereoquímica de 8 (SP-isómero) foi confirmado por meio de cristalografia de raios X de cristal único, veja-se pormenores proporcionados a seguir.
Exemplo de Referência 7. Separação da mistura diastereomérica éster isopropílico do ácido (S)-2- [ (4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico por meio de SFC
Um amostra da mistura de diastereómeros (4,8 g) enriquecida com o RP-isómero foi submetida a SFC usando uma coluna ChiralPak A#-H (2x15 cm) e eluída com 35 ã de isopropanol em dióxido de carbono a 100 bar. Uma carga de injeçãode 4 ml de amostra numa concentração de 17 mgõml de metanol foi usada. 0 RP-isómero [éster isopropílico do ácido (S)-2~ [ (R) - (4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico] eluiu primeiro. As frações apropriadas das múltiplas execuções foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida para dar 2,9 g do RP-isõmero [éster isopropílico do ácido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxifosforilamino] propiónico] como um óleo viscoso amarelo claro e 1,9 g do SP-isõmero [éster isopropílico do ácido (S)-2-[ (S)- (4- nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico] como um sólido branco. #ados analíticos de RP-isómero são similares aos do produto isolado pelo método de cristalização acima.
Dados analíticos para éster isopropílico do ácido (S)-2 -[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico (8, RP-isómero) : 31P RMN (162 MHz, #MS0-d6): δ - 0,4 7Ã ΧΗ RMN (400 MHz, #MS0-d6): δ 8,30-8,27 (m, 2H), 7,46-7,38 (m, 4H) , 7,27-7,20 im, 3H), 6,68 (dd, J = 13,8, 10,2 Hz, 1H), 4,86-4,77 (m, 1H) , 3,97-3,86 (m, 1H) , 1,20 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,10 (dd, J = 6,2, 2,2 Hz, 6H)Â MS (ESI) m/z 407 (M- 1) À.
Exemplo de Referência 8-1. Preparação de éster isopropílico do ácido 2- [ (4-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico racémico (±):
A uma solução agitada de fosforodicloridato de 4-cloro-fenilo (2,45 g, 10,0 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionada uma solução de fenol (0,94 g, 10 mmol) e trietilamina (1,56 ml, 11 mmol) em diclorometano (20 ml) a -78 °C ao longo de um período de 2 0 min. A mistura foi agitada nesta temperatura durante 30 min e, em seguida, transferida a outro balão de fundo redondo que contém cloridrato de éster isopropílico L-alanina (1,67 g, 10 mmol) em diclorometano (50 ml) a 0 °C. À mistura foi adicionado um segundo lote de trietilamina (2,92 ml, 21 mmol) ao longo de um período de 15 min. A mistura foi agitada a 0 °C durante lhe, em seguida, o solvente foi
evaporado. 0 resíduo foi triturado com acetato de etilo (30 ml) e o sólido branco foi retirado por filtração. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo pálido. 0 composto bruto foi submetido a cromatografia usando Igradiente de 0-20 0 de acetaò de etiloóhexanos para dar o produto (2,0 g, 50 H de rendimento) como uma mistura de diastereómeros em cerca de uma razão 1:1. 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -1,58, -1,62Â 1H RMN (400 MHz, CDC13) : δ 7,06-7,51 (m, 8H) , 7,15-7,28 (m, 2H) , 7,29-7,47 (m, 2H) , 4,0-4,10 (m, 1H) , 3,82-3,88 (m, 3H) , 1,35-1,36 (dd, 6H)Â 1,19-1,22 (m, 3H) . MS (ESI) m/z 398 (M-l)Â. 0 produto resultante é purificado por meio de extração, cristalização, ou cromatografia, como indicado acima.
Exemplo de Referência 8-2 . Preparação de 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4 -fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2 il)metoxi)(fenoxi)- fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo (4). A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)- 1H- pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (2-[(4-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico racémico (4,08 g, 10 mmol) em THF (15 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 10 min. A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 72. A TLC co-manchada com o produto autêntico mostrou que ao redor de 5 á do produto desejado tinha sido formado em comparação com o nucleósido de partida.
Exemplo de Referência 9-1. Preparação de éster isopropílico do ácido 2- [ (2-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico racémico (±).
A uma solução agitada de fosforodicloridato de 2-cloro-fenilo (9,8 g, 40 mmol) em diclorometano (80 ml) foi adicionada uma solução de fenol (3,76 g, 40 mmol) e trietilamina (6,16 ml, 44 mmol) em diclorometano (80 ml) a -78 °C ao longo de um período de 2 0 min. A mistura foi agitada nesta temperatura durante 30 min e, em seguida, transferida a outro balão de fundo redondo que contém cloridrato de éster isopropílico L-alanina (6,7 g, 40 mmol) em diclorometano (150 ml) a 0 °C. À mistura foi adicionada uma segunda porção de trietilamina (11,6 ml, 84 mmol) ao longo de um período de 15 min. A mistura foi agitada a 0 °C durante 1 he, em seguida, o solvente foi evaporado. 0 resíduo foi triturado com acetato de etilo (100 ml) e o sólido branco foi retirado por filtração. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo pálido. 0 composto bruto foi submetido a cromatografia usando Igradiente de 0-20 0 de acetato de etilo/hexnos para dar o produto (11,3 g, 72 0 de rendimento) com uma mistura de diastereómeros em cerca de uma razão 1:1. 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -1,58, -1,61; 1H RMN (400 MHz,CDC13) : δ 7,06-7,51 (m, 8H) , 5,02-5,94 (m, 1H) , 4,10-4,16(m, 1H), 3,31-3,94 (m, 1H), l,18-l,35(m, 3H), 1,38-1,40 (dd, 6H) ; MS (ESI) m/z 398 (M-l) + . 0 produto resultante é purificado por meio de extração, cristalização, ou cromatografia, como indicado acima.
Exemplo de Referência 9-2. Preparação de 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4 -fluoro- 3 -hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2 il)metoxi)(fenoxi)-fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo. A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)- 1H-pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (2- [ (2- cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico (racémico 4,08 g, 10 mmol) em THF (15 ml) foi adicionado gota a gota ao longo de um período de 10 min. A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 72 h. A TLC co-manchada com o produto autêntico mostrou que ao redor de 5-10 % do produto desejado tinha sido formado em comparação com o nucleósido de partida.
Exemplo de Referência 10-1. Preparação de éster isopropílico do ácido 2 - [(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico racémico (+).
A uma solução agitada de fosforodicloridato de pentafluorofenilo (6,0 g, 20 mmol) em diclorometano (40 ml) foi adicionada uma solução de fenol e trietilamina (3,08 ml, 22 mmol) em diclorometano (40 ml) a -78 °C ao longo de um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura durante 30 min e, em seguida, transferida a outro balão de fundo redondo que contém cloridrato de éster isopropílico L-alanina (3,35 g, 20 mmol) em diclorometano (100 ml) a 0 °C. Ã mistura foi adicionado um segundo lote de trietilamina (5,84 ml, 42 mmol) ao longo de um período de 15 min. A mistura foi agitada a 0 °C durante lhe, em seguida, o solvente foi evaporado. 0 resíduo foi triturado com acetato de etilo (60 ml) e o sólido branco foi retirado por filtração. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo pálido como uma mistura de diastereómeros em cerca de uma razão 1:1. 3lP RMN (162 MHz, CDC13) : δ -0,49,-0,58. 0 produto resultante é purificado por meio de extração, cristalização, ou cromatografia, como indicado acima.
Exemplo de Referência 10-2. Preparação de mistura diastereomérica éster isopropílico do ácido (S)-2 -[(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico e isolamento de diastereómero único éster isopropílico do ácido (S)-2 - [(S)- (2,3,4,5,6- pentafluorofenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico via resolução dinâmica induzida por cristalização com colheitas múltiplas.
A um balão de três tubuladuras de fundo redondo de 2 L equipado com um agitador mecânico e termómetro de temperatura baixa foram adicionados 60 g (284 mmol) de diclorofosfato de fenilo e 300 ml de diclorometano anidro. A solução foi arrefecida até 0 °C sob atmosfera de azoto e sal cloridrato de alanato de íso-propilo (seco em forno a vácuo, 47,7 g, 284 mmol) foi adicionado rapidamente como um sólido. A mistura foi agitada e arrefecida até -55 °C num banho de acetona-gelo seco. Uma solução de 60,32 g de trietilamina (596 mmol) em 300 ml de diclorometano foi adicionada através de um funil de adição ao longo de 70 minutos. A mistura opaca branca foi agitada a -55 °C durante meia hora e, em seguida, a temperatura foi elevada até -5 °C lentamente ao longo de 1,5 h. Uma mistura pré-arrefecida (temperatura ambiente) de pentafluorofenol (52,42 g, 284 mmol) e trietilamina (32,11 g, 317 mmol) em 180 ml de diclorometano foi adicionada à mistura via um funil de adição ao longo de 1 h a 0 °C e a mistura resultante foi agitada a 0 °C durante 4 horas. 0 precipitado branco (TEA®HC1) foi retirado por filtração e enxaguado com diclorometano (3x 50 ml) . 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo sólido branco foi triturado em 880 ml de t-butil metil éter (TBME) à temperatura ambiente durante uma hora. A suspensão branca foi filtrada e sólido foi enxaguado com TBME (3x 150 ml). 0 sólido foi distribuído numa mistura de acetato de etilo (600 ml) e água (150 ml). A camada orgânica foi separada e lavada com água (3 x 100 ml). A camada orgânica foi seca em MgS04 e concentrada para proporcionar 29,92 g (66 mmol) de produto (Sp-isómero, como confirmado por meio de cristalografia de raios X, infra) como um sólido de penas brancas. 0 filtrado a partir da trituração de TBME acima foi concentrado sob pressão reduzida a um resíduo sólido branco e o sólido foi triturado em 450 ml de acetato de etilo e hexanos misturados (20:80, vóv) à temperatura ambiente durante 75 minutos. 0 sólido (sólido 1) foi colhido por meio de filtração e enxaguado com 20 % de acetato de etilo em hexanos (75 ml, 2x 3 0 ml) . 0 licor mãe foi concentrado para fornecer um sólido branco pérola que foi triturado em 20 ã de acetato de etilo em hexanos (185 ml) à temperatura ambiente durante 17 horas. Um sólido branco (sólido 2) foi colhido por meio de filtração e enxaguado com 20 ã de acetato de etilo em hexanos (2 x 10 ml) . 0 sólido 1 e o sólido 2 foram combinados e dissolvidos em 1,2 L de acetato de etilo. A solução foi lavada com l§3 gua (3x 150 ml) salmoura (50 ml) e seca em MgS04. A solução foi concentrada sob pressão reduzida para proporcionar 72,8 g (161 mmol) de produto puro. A quantidade total de produto foi 102,72 g (226 mmol, 80 ã) . ΧΗ RMN (C#C13, 400 MHz) δ: 7,38-7,33 (m, 2 H), 7,27-7,24 (m, 2 H), 7,23-7,19 (m, 1H), 5,04 (hept, 1 H) , 4,18-4,09 (m, 1 H) , 4,01-3,96 (m, 1H) , 1,45 (d, 3 H) , 1,25 (dd, 6 H) . 31P RMN (C#C13, 162 MHz) δ: -0,50.
Exemplo de Referência 10-3: Preparação de mistura diastereomérica éster isopropílico do ácido (S)-2 -[(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico e isolamento de diastereómero único éster isopropílico do ácido (S)-2 - [ (S)- (2,3,4,5,6- pentafluorofenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico via resolução dinâmica induzida por cristalização numa única colheita. A um balão de três tubuladuras seco de 1 L equipado com um termómetro de baixa temperatura e um agitador mecânico foi carregado fosforodicloridato de fenilo (25 g, 118,5 mmol). #iclorometano anidro (125 ml) foi adicionado e a solução foi arrefecida até 0 °C. 0 sal de éster de alanina (seco em forno) (19,86 g, 1 eq) foi adicionado rapidamente sob N2 enquanto se agitava. A solução foi arrefecida até cerca de -50 °C (temperatura interna (num banho com gelo secoóacetona sob N2) . Uma solução de trietilamina (25,2 g, 2,1 eq) em #CM (125 ml) foi adicionada gota a gota via um funil de adição ao longo de 0,5 h a -50 °C e a suspensão branca resultante foi agitada em cerca de -50 °C durante 0,5 h. A mistura foi deixada que se aquecesse até 0 °C ao longo de 1,5 h e, em seguida, uma solução arrefecida pré-misturada de pentafluorofenol (21,82 g, 1 eq) e TEA (13,2 g, 1,1 eq) (cuidado: calor libertado enquanto se misturava pentaf luorof enol e TEA) em 75 ml de #CM foi adicionado ao longo de 0,5 h a 0 °C via um funil de adição. A mistura foi agitada a 0 °C durante 4 h adicionais. A mistura foi filtrada através de um funil de Buchner e o cloridrato de trietilamina sólido colhido foi enxaguado com #CM (3 x 40 ml). 0 filtrado foi verificado por meio de 31P-RMN (razão de cerca de 1,14:1 favoreceu o SP-diastereómero - pico de campo baixo) e foi dividido em duas partes de igual peso. Uma delas foi concentrada sob pressão reduzida. 0 resíduo sólido branco (31 g) foi triturado numa mistura de EtOAc e hexanos (150 ml, 20:80, vóv) a TA durante 17 h permitindo tempo para resolução dinâmica do isómero SP menos solúvel. A suspensão branca foi filtrada e sólido foi enxaguado com 2 0 % de EtOAc em hexanos (2x 2 5 ml) . 0 sólido (22,58 g) foi verificado por meio de ’H-RMN e 31P-RMN e continha produto como um isómero contaminado com sal cloridrato de trietilamina. 0 sólido foi dissolvido e dividido em partições em 310 ml de EtOAc e 100 ml de água. Após separação da camada orgânica, a camada aquosa foi extraída de volta com EtOAc (50 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com água (3x 80 ml), salmoura (50 ml) e seca em MgS04. A solução foi concentrada sob pressão reduzida e, em seguida, seca sob alto vácuo a TA a um peso constante para fornecer 17,36 g de produto como um sólido branco a partir da metade da reação. 0 rendimento é 64 %. 0 licor mãe do acima foi concentrado a um resíduo gomoso (7,89 g) que continha os reagentes com uma razão de 1:1,2 (desejadoõnão desejado) com base em 31P-RMN.
Exemplo de Referência 10-4. Preparação de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico #CM (11,5 L) foi carregado no reator de vidro seco e limpo. Fenildiclorofosfato (2,3 kg, 10,9 mol) foi carregado ao reator sob azoto. A solução foi então arrefecida até 0 °C. Cloridrato de isopropiléster L-alanina (1,83 kg, 10,9 mol) foi então adicionado numa porção e continuou-se a agitação durante 30 min. A massa de reação foi arrefecida até -50 °C temperatura interna usando um banho de gelo secoóacetona. Uma mistura de TEA (2,1 eq, 3,17 L) em #CM (11,5 L) foi adicionada à solução de reação acima lentamente ao longo de um período de 8 h para manter a temperatura interna entre ~40 até -50 °C. Após completar a adição, a reação foi mantida no mesmo intervalo de temperatura durante cerca de 1 h. A mistura foi deixada que se aquecesse até 0 °C ao longo de cerca de 4 h.
Enquanto isso, noutro reator, #CM (6,9 L) foi carregado, e, em seguida, pentaflurofenol (2,0 Kg, 10,9 mol) foi adicionado sob azoto. A solução foi arrefecida até 0 °C, então TEA (1,1 eq, 1,65 L) foi adicionado à solução de pentafluorofenol (exotérmica) ao longo de um período de cerca de 2 h. A solução resultante por sua vez foi lentamente adicionada à primeira solução que contém o diclorofosfato de fenilo e éster de aminoãcido enquanto se mantinha a temperatura entre 0 a 5 °C ao longo de um período de cerca de 7 h. Após a conclusão da adição, a agitação foi continuada neste intervalo de temperatura durante cerca de 4 h. 0 progresso da reação foi monitorizado por meio de HPLC. Quando menos de 5 % de pentafluorofenol permaneceu, a reação foi interrompida. Note que HPLC quiral indicou uma mistura uniforme de diastereómeros do produto neste momento. A suspensão de reação foi filtrada através de um filtro de Nutsche para remover a maioria do sal cloridrato de trietilamina suspenso. 0 bolo de sal foi lavado com quantidade em excesso de #CM (9 L) e esta lavagem foi adicionada ao filtrado principal. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida a 35 °C para dar um resíduo sólido. 0 resíduo sólido foi coevaporado com hexano (4 L) para reduzir adicionalmente níveis de #CM residual. A este sólido residual foi adicionado 20 ã de MTBEÓHexano 6 L e a suspensão foi agitada durante cerca de 17 h à temperatura ambiente e monitorizada por meio de HPLC. 0 pH da solução permaneceu básico devido ao TEA residual. #urante este tempo, uma resolução dinâmica ocorreu em que o sólido precipitado foi o SP-4 isómero desejado e o sobrenadante permaneceu em equilíbrio entre SP-4 e RP-4. A suspensão foi passada através de um filtro de
Nutsche e o produto desejado sólido, ainda contaminado com cloridrato de TEA, foi lavado com 50 de MTBEÕHexao (1 L). 0 sólido foi dissolvido em acetato de etilo (35 L) e a solução foi lavada com água (3 x 35 L) e salmoura (10 L) e, em seguida, a solução foi seca em sulfato de sódio sólido, filtrada, concentrada sob pressão reduzida mantendo a temperatura do reator abaixo de 44 °C. 0 resíduo sólido foi co-evaporado com hexano (4 L) . 0 reator foi levado até a temperatura ambiente e 5 0 de MTBEÓHexano (5 L) foi adicionado. A suspensão espessa foi agitada durante 15 min e, em seguida, o sólido foi colhido por meio de filtração. 0 sólido colhido foi lavado com hexano (2,5 L) e seco sob alto vácuo à temperatura ambiente a um peso constante para dar o produto final (SP- 4) como um sólido branco, 2,6 kg (53 0 )Ã 99,5 0 puro por meio de HPLC, 0,4 0 do OQtRP-4. Exemplo de Referência 10-5 . Preparação de 2 -((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4 - fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2 il)metoxi)(fenoxi)- fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo. A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)- 1H- pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THE seco (50m L) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiõnico racémico bruto (4,08 g, 10 mmol) em THF (15 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 10 min, A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 72 h. A TLC co-manchada com o produto autêntico mostrou que ao redor de 40-50 S do produto desejado tinha sidoformado em comparação com o nucleósido de partida.
Exemplo de Referência 10-6. Preparação de 2 -((S)- (((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4 - fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2- il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato de (S)- isopropilo (Sp-4) usando éster isopropílico do ácido (S)-2 -[(S)- (2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiõnico e purificação por meio de cristalização somente.
A uma solução agitada de 3 (10 g, 38,46 mmol, seco sob vácuo a 50 °C durante 20 h) em THF seco (16 5 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio em THF (47,5 ml, 80,77 mmol) ao longo de um período de 20 min enquanto se mantinha o balão num banho de água fria (5 °C) sob uma atmosfera de azoto. Após completar a adição, banho frio foi removido e a suspensão branca foi agitada à temperatura ambiente (20 °C) durante 30 min. Uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluorofenoxi)-fenoxifosforilamino] propiõnico (20,9 g, 46,11 mmol) em THF anidro (165 ml) foi então adicionada à mistura de reação ao longo de um período de 30 min. A mistura foi agitada à temperatura ambiente (20 °C) durante 3,5 h. A agitação foi continuada durante 1,5 h adicionais, em qual estágio a TLC indicou >95 á de conversão e nenhuma diferença significativa em intensidade de impureza de 3' , 5' -£>ís-fosforamidato a partir de 2 h. A mistura de reação foi extinta com NH4C1 aq. saturado (10 ml) e, em seguida, o solvente foi evaporado a 25 °C. 0 resíduo foi dividido em partições entre acetato de etilo (400 ml) e mistura de cloreto de amónio saturado (60 ml)Óãgua (20 ml) . A camada orgânica foi separada, lavada com cloreto de amónio saturado (80 ml) e água (3 x 60 ml). A camada aquosa a este ponto foi mantida separadamente. A camada orgânica foi lavada com 5 0 de carbonato de sódio aq. (3 x 50 ml) e água (2 x 60 ml) . A primeira camada aquosa foi extraída com acetato de etilo adicional (100
ml) , lavada com água (2 x 20 ml) e, em seguida, a camada aquosa obtida a partir das lavagens de carbonato de sódio foi extraída com o mesmo extrato de acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com água (2 x 20 ml) e combinada com o lote principal. As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas para dar um sólido espumoso (19,32 g). 0 resíduo foi dissolvido em 60 ml de diclorometano (um sólido branco foi retirado por precipitação e um bolo foi formado em cerca de cinco minutos) e, em seguida, foi adicionado 25 ml de IPE. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com mistura 1:1 de IPEÓdiclorometano (20 ml) frio (0 °C) e seco para dar 11,77 g (58 0 de rendimento) do produto como um sólido banco
amorfo. 0 sólido acima foi redissolvido em diclorometano (350 ml) , filtrado e evaporado sob pressão atmosférica (temperatura do banho 45 °C) a um volume de -120 ml. A solução foi deixada que repousasse à temperatura ambiente (21 °C) durante 20 h. 0 sólido cristalino branco (solvato diclorometano) foi colhido por meio de filtração, lavado com diclorometano (10 ml) frio (0 °C) e seco sob alto vácuo durante 4 h à temperatura ambiente para dar um produto não solvatado puro (10,62 g, 52 0 de rendimento) como gulhas brancas. A pureza de HPLC 99,8 EI . As propriedades spetrais corresponderam-se com aqueles valores relatados no presente documento.
Exemplo de Referência 10-7. Preparação de 2 - ( (S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)- 4 -fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2- iDmetoxi) (fenoxi) fosforilamino) propanoato de (S) - isopropilo (Sp-4) usando éster isopropílico do ácido (S)-2 -[(S)- (2,3,4,5,6-pentafluoro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico, condições de reação modificadas e tratamento final e purificação por meio de cristalização somente.
A uma suspensão agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran- 2-
il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona (3,5,0 g, 19,1 mmol, seca sob vácuo a 50 °C durante 20 h) em THF seco (75 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio em THF (23,7 ml, 40,35 mmol) usando um funil de adição ao longo de um período de 3 0 min a -5 °C. A suspensão branca foi agitada nesta temperatura durante 30 min e, em seguida, aquecida até a temperatura ambiente (20 °C) em cuja temperatura foi agitada durante 30 min adicionais. A mistura de reação foi arrefecida até 5 °C e, em seguida, foi adicionada uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[ (S)-(2,3,4,5,6- pentafluorofenoxi)-fenoxifosforilamino] propiónico (10,45 g, 23,06 mmol) em THF (50 ml) ao longo de um período de 30 min. A mistura foi agitada a 5 °C durante 18 h, arrefecida até -5 °C e, em seguida, extinta com HC1 a 2 N (25 ml) . Tolueno (100 ml) foi adicionado à mistura e aquecido até a temperatura ambiente. Após 20 min as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com HC1 a 1 N (2 x 10 ml) , S gua (10 ml) , N§C03 aquoso a5ã (4x10 ml), 0 gua (2 x 10 ml) e salmoura (10 ml) . Todas as camadas aquosas foram re-extraídas com tolueno (20 ml), lavadas com Na2C03 aquoso a5ã (2x5 ml), 0 gua (10 ml) e salmoura (5ml). A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada a um volume aproximado de 20 ml. #iclorometano (20 ml) foi adicionado à solução e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 h. 0 sólido foi filtrado, lavado com mistura 1:1 de MTBEÓ#CM (2 x 10 ml) e seco sob alto vácuo para dar um sólido branco (7,7 g). HPLC do sólido neste indicou 98,21 0 de g-4, 0,18 E de 3 não reagido e 0,6 7 S de impureza de 3',5'-bi fosforamidato. 0 sólido acima de SP-4 foi redissolvido em diclorometano (77 ml, aquecido num recipiente a pressão a 55 °C) e deixado que repousasse à temperatura ambiente durante 20 h. 0 sólido cristalino foi filtrado lavado com diclorometano frio (5 ml, 0 °C) e seco sob alto vácuo para dar o produto puro como um sólido branco (6,9 g, 68 0 de rendimento, 99,79 0 puro por meio de HPLC). A preparação e purificação de C ou Cf proporciona o acesso direto a SP-4 ou RP-4, como ilustrado nos seguintes exemplos.
Exemplo de Referência 11.
Preparação de SP-4 (32 mg-escala) : a uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi- 5- hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il) -lH-pirimidina- 2,4-diona 3 (32 mg, 0,12 mmol) em THF seco (1 ml) foi adicionada uma solução a 1 M de cloreto de t-butilmagnésio (0,26 ml, 0,26 mmol, 2,1 equiv) ) à temperatura ambiente ao longo de um período de 3 min. Após 3 0 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiõnico (8, SP-isómero) em THF (0,5 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 3 min. A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 4 2 h e, em seguida, extinta com NH4C1 saturado aquoso (10 ml) . A mistura foi dividida em partições entre acetato de etilo e água. 0 extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro e concentrado. O resíduo foi submetido a cromatografia usando gradiente de 0-4 % de metanolódiclorometano para dar SP-4 como sólido espumoso (29 mg, 44,5 % de rendimento). 1H e 31P RMN confirmam o que é revelado no presente documento. Exemplo de Referência 12.
Preparação de SP-4 (2,6 g-escala, sem cromatografia): a uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi- 5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico (8, Sp-isómero, 4,08 g, 10 mmol) em THF (15 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 10 min. A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 6 0 h e, em seguida, extinta com NH4C1 saturado aquoso (20 ml) . A mistura foi dividida em partições entre acetato de etilo (150 ml) e sequencialmente, Ma2C03 aquoso a 10 % (3 x 20 ml) e água (20 ml) . 0 extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para dar um resíduo amarelo pálido (3,8 g) . 0 resíduo foi dissolvido em diclorometano (7,6 ml) e, em seguida, agitado durante 20 h à temperatura ambiente. O sólido branco foi filtrado, lavado com 1:1 IPEÓdiclorometano (5 ml) e seco sob vácuo para dar o produto puro como sólido branco (1,85 g, 35 0 de rendimento).
Exemplo de Referência 13. Preparação de SP-4 usando NaHMDS: A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi- 5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il) -1H- pirimidina-2,4-diona (71 mg, 0,27 mmol) em THF seco (2,0 ml) foi adicionada uma solução a 2,0 M de sódio bis(trimetilsilil)amida (NaHM#S) em THF (270 ml, 0,54 mmol) a -78 °C ao longo de um período de 2 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(S)-(4-Nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propiónico (8, SP-isómero, 111 mg, 0,27 mmol) em THF (1 ml) foi adicionada à mistura. A mistura de reação foi deixada a agitar nesta temperatura durante 2 h e, em seguida, aquecida até -20 °C em cuja temperatura foi agitada durante 20 h adicionais. A TLC indicou ~30 % de material de partida de nucleósido não reagido. Por este motivo, 0,5 equivalente adicional do reagente (55 mg, 0,14 mmol) em THF (0,5 ml) foi adicionado à mistura de reação e agitado durante outras 6 h. A mistura de reação foi extinta com solução de cloreto de amónio aquoso saturado e, em seguida, dividida em partições entre acetato de etilo e água. 0 extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro e concentrado para dar um resíduo castanho claro. A cromatografia em coluna do produto bruto usando gradiente de 0-5 % de metanol/diclorometano deu SP-4 (22 mg, 15 % de rendimento), 3' -fosforamidato (5, SP-isómero, 11,5 mg, 16 % de rendimento) e bis fosforamidato (6, SP, SP-isómero, 12,6 mg) .
Exemplo de Referência 14. Preparação de Rp-4 (260 mg-escala): A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il) -1H- pirimidina-2,4-diona (260 mg, 1 mmol) em THF seco (6 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (1,23 ml, 2,1 mmol, 2,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 5 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico (8, RP-isõmero) em THF (3 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 3 min, A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 96 h e, em seguida, extinta com NH4C1 saturado aquoso (10 ml) . A mistura foi dividida em partições entre acetato de etilo (50 ml) e água (2 x 20 ml) . 0 extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para dar um resíduo amarelo pálido (490 mg). 0 resíduo foi submetido a cromatografia usando gradiente de 0-5 % de metanol/diclorometano para dar o produto como um sólido branco (160 mg, 30 % de rendimento). A preparação de SP-4 ou RP-4 pode também ser alcançada por meio da reação de 3 3'-protegido com o reagente apropriado C ou C' ou uma mistura que contém C e C' , como ilustrado nos seguintes exemplos.
Exemplo de Referência 15. Preparação de SP-4 com 3a como um Intermediário Sintético
Exemplo de Referência 15-1. Síntese de 5' -0-terc-
ButildimetilsNil-2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (9): A uma solução agitada de 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3, 81,1 g, 312 mmol) em piridina seca (750 ml) foi adicionada gota a gota uma solução de TB#MSC1 (103,19 g, 685,6 mmol) em piridina seca (500 ml) ao longo de um período de 45 min à temperatura ambiente. A reação foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 24 h. Metanol (85 ml) foi adicionado à mistura de reação e foi deixado a agitar durante 10 min e, em seguida, os solventes foram retirados por destilação sob pressão reduzida. Água quente (45 °C) (1 L) foi adicionada à massa de reação e a mistura extraída com acetato de etilo (2 x 500 ml), lavada com água (1 x 500 ml) . A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro. Acetato de etilo foi retirado por destilação e o resíduo obtido foi co-evaporado com tolueno (2 x 500 ml) para dar bruto 9 como uma espuma branca. Rendimento = 116,9 g (quantitativo). LH RMN (C#C13, 300 MHz): δ 0,1 (s,6H), 0,91 (s, 9H), 1,22 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,50 (s, 2H) , 3,75-4,05 (m,4H), 5,54 (d, 1H, J = 9 Hz), 5,73 (s, 1H), 6,0 (d, 1H, J = 18 Hz), 7,81 (d, 1H, J = 9
Hz), 8,57 (1, s, 1H), 11,1 (s, 1H).
Exemplo de Referência 15-2. Síntese de 5'-0-(terc-Butildimetilsilil)-3'-0-levulinil-2'-deoxi-2'-fluoro 2'-C-metil-uridina (10): A uma solução agitada de nucleósido 9 (116,9 g, 312,1 mmol) em #CM (1 L) foi adicionado #MAP (30,5 g, 249,7 mmol) e esta foi deixada a agitar a TA durante 2 0 min. Uma solução de anidrido levulínico (133,6 g, 642,3 mmol) em #CM (200 ml) foi adicionada à mistura e deixada a agitar durante 24 h. A TLC da mistura indicou que a reação estava completa. Água fria (500 ml) foi adicionada e a mistura agitada durante 20 min. As camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada com solução de bicarbonato de sódio sat. (2 x 250 ml), seca em sulfato de sódio anidro e, em seguida, o solvente foi destilado sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo. Rendimento bruto: 197,6 g (135 %). 0 material foi usado como tal na seguinte etapa. LH RMN (C#C13, 300 MHz) δ 0,11 (s, 6H), 0,94 (s, 9H), 1,34 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,22 (s, 3H), 2,6-2,89 (m, 4H), 3,72 (m, 1H), 4,01 (d, 1H, J = 12 Hz), 4,23 (d, 1 H, J = 9 Hz), 5,33 (dd, 1H, J = 15 Hz), 5,73 (d, 1H, J = 6 Hz), 6,26 (d, 1H, J = 15
Hz), 8,12 (d, 1H, J = 12 Hz), 8,72 (1, s, 1H).
Exemplo de Referência 15-3. Síntese de 3'-0-levulinil-2'-deoxi-2'-fluoro 2'-C-metil-uridina (3a): 0 material bruto 10 (197,6 g, -312,1 mmol) foi dissolvido em #CM (1 L) ao qual foi adicionado TEA.3HF (50,3 g, 312,1 mmol) e deixado a agitar durante a noite à temperatura ambiente. A TLC da mistura indicou cerca de 50 0 de conclusão de reação. Outro equivalente de TEA3HF (50,3 g, 312,1 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi deixada a agitar durante 6 h. A TLC neste momento indicou cerca de 10 0 de material de partida não ragido. Outros 0,25 eq de TEA.3HF (12,5 g, 78,0 mmol) foram adicionados e a mistura de reação foi deixada a agitar durante a noite. A mistura de reação foi concentrada até a secura para dar um óleo amarelo. 0 material bruto de todos os lotes foi purificado por meio de cromatografia em coluna em sílica gel (0-2 ã de MeOH em #CM) para dar 124,1 g de 3'-levulinato como uma espuma branca sólido (rendimento de 90 E purificado ao longo de três etapas de 2'-deoxi2'~ fluoro-2'-C- metiluridina). 1H RMN: (C#C13, 400 MHz) δ 1,55 (d, 3H, CH3, J = 20 Hz), 2,36 (s, 3H, CH3) , 2,8-3,03 (m, 5H, CH2CH3) , 3,91-3,96 (dd, 1H, CH"), 4,2-4,25 (m, 1H, CH'), 4,34 (dd, 1H, CH, J = 8 Hz), 5,25 (dd, 1H, J =16 Hz), 5,93 id, 1H, J = 8 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 8 Hz), 9,18 (s, 1H) .
Exemplo de Referência 15-4. Síntese estereosseletiva de éster (S)-isopropílico do ácido (S)-2-{[(IR,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l- il)-4-(R)-fluoro-3-(4-oxopentanoi1)-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiónico (11) : A uma solução do nucleósido (3a, 1,00 mmol, 358 mg) em 5 ml de THF anidro que foi arrefecida até 0 °C foi adicionado tBuMgCl (1,7 M em THF, 2 eq) e deixando-se aquecer até a temperatura ambiente e agitado durante meia hora. A esta mistura foi adicionado o reagente (cerca de 97 ã de pureza quiral) éster isopropílico do 0 eido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiónico (8, SP-isõmero) (408 mg, 1,00 mmol, 1,00 eq.) num lote e deixando-se agitar a ta. Após 16 h, havia ~30 á de material de partida restante. A mistura de reação foi extinta com 10 ml de solução de NH4C1 saturado, e a fase aquosa foi extraída com acetato de etilo (3 x25 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura e seca em sulfato de sódio anidro e evaporada até a secura para dar uma espuma amarela pálida (500 mg) . Esta foi purificada por meio de cromatografia em sílica gel usando 2-5 0 de metanol em cloreto de metileno para dar o produto como uma espuma branca (275 mg) de cerca de 97 B de pureza quiral P e material de partida não reagido (162 mg) . Com base no material de partida consumido, o rendimento foi 76 0 .31P RMN (C#C13, 162 MHz) : 3,7 pprn ΧΗ RMN (C#C13, 400 MHz) : δ 1,22 (dd, 6H, J = 6,4 Hz), 1,37 (s, 3H), 1,58 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,63-2,9 (m, 4H), 4,0 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,2-4,33 (m, 1H), 4,57 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,96-5,00 (sept, 1H), 5,2
(dd, 1H, J = 9 Hz), 5,42 (d, 1H, J - 8 Hz), 6,19 (d, 1H, J = 18 Hz), 7,15-7,35 (m, 5H) , 7,5 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,2 (1, s, 1H) .
Exemplo de Referência 15-5. Síntese de éster (S) -isopropílico do ácido (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l-il)-4 -(R)-fluoro-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiónico (Sp-4)
Uma solução de sulfito de sódio foi preparada por meio da adição de Na2S203 (1,51 g) e Na2S205 (0,57 g) em água (25 ml). A uma solução do levulinato (11, 250 mg, 0,40 mmol) em THF anidro (2,5 ml) foi adicionado 1,0 ml da solução de sulfito de sódio. Esta foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 4 h. A mistura de reação foi deitada em água (15 ml) e extraída com acetato de etilo (3x25 ml) seca e evaporada para dar quantitativamente um produto sólido branco com cerca de 97 S de pureza quiral P que se correspondia às propriedades físicas e espetrais de SP-4 produzido diretamente a partir do nucleósido não protegido. Exemplo de Referência 16. Procedimento alternativo para preparar SP-4 a partir de 3a. A uma solução agitada de éster (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l-il) -4- f luoro-2-hidroximetil-4-metil-tetrahidro-furan-3-ílico do ácido 4-oxo-pentanoico (3a, 210 mg, 0,59 mmol) em THF seco (1,5 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (1,07 ml, 1,82 mmol) à temperatura ambiente ao longo de um período de 2 min. Inicialmente, um precipitado branco foi observado e após 10 min a mistura de reação tornou-se uma solução amarela escura. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)-2-[ (S)-(4-nitrofenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propiónico (8 (SP-isómero), 382 mg, 0,94 mmol) em THF (1,5 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 3 min. A mistura foi aquecida a 4 0 °C durante 5 h em cujo tempo TLC e 1H RMN indicou menos que 2 % de material de partida não reagido. A reação foi extinta com cloreto de amónio aquoso saturado e, em seguida, dividida em partições entre acetato de etilo e água. A camada orgânica combinada foi lavada com 10 % solução de Na2C03 aquoso (3 x 10 ml) , seguido de água. A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrado para dar resíduo de cor castanho (410 mg) . 0 produto bruto foi dissolvido em tetrahidrofurano (1,0 ml) e, em seguida, foi adicionada uma solução aquosa da mistura de sulfito de sódio (37 mg, 0,295 mmol) e metabisulfito de sódio (224 mg, 1,18 mmol) em 1 ml de água. A mistura foi aquecida a 45 °C durante 20 h em qual estágio somente cerca de 10 % de conversão foi observado por meio de TLC, por este motivo o sulfito de sódio adicional (74 mg) e metabisulfito de sódio (448 mg) foi adicionado e o aquecimento foi continuado durante 52 h adicionais. Neste tempo, uma conversão de cerca de 4 0 % foi observada por meio de TLC. A mistura de reação foi dividida em partições entre água e acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrada para dar um resíduo castanho (210 mg). A cromatografia em coluna do resíduo usando gradiente de 0-5 I de MeOHÕ#CM deu aterial de partida não reagido (89 mg) e SP-4 (57 mg, 18 E de rendimento, 24 0 com base em material de partida recuperado).
Exemplo de Referência 17. Preparação de SP-4 com 3c como um Intermediário Sintético
Sp-4
Exemplo de Referência 17-1. Preparação de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4 -(terc-butildimetilsilaniloxi)-3 -fluoro-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidrofuran-2-il]-lH-pirimidina-2,4-diona, 12. A uma solução de 3 (10,0 g, 38,43 mmol) em piridina (50 ml) foram adicionados diclorometano (50 ml). A solução foi arrefecida até 0 °C. Ã solução foi adicionado cloreto de 4,4'-dimetoxitritilo (14,32 g, 42,27 mmol) e a solução foi agitada a 0 °C durante 5 h. Metanol (5 ml) foi adicionado para extinguir a reação. A solução foi concentrada até a secura sob pressão reduzida e o resíduo foi dividido em partições entre acetato de etilo (500 ml) e água (50 ml) . A solução orgânica foi lavada com salmoura (50 ml) e seca (sulfato de sódio, 4 g) . 0 solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em diclorometano (100 ml) . Ã solução foram adicionados imidazol (7,83 g, 115 mmol) e cloreto de t- butildimetilsililo (8,68 g, 57,6 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h. Metanol foi adicionado para extinguir a reação (5 ml) e o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dividido em partições entre acetato de etilo (500 ml) e água (50 ml). A solução orgânica foi seca (sulfato de sódio, 4 g) e evaporado sob pressão reduzida. 0 resíduo foi purificado por meio de cromatografia em coluna (10-4 0 % de EtOAc em Hexano) para dar produto intermediário 5'-0-#MT-3'-0-tB#MS. Este é por sua vez tratado com 1 % de ácido trifluoroacético em diclorometano (200 ml) . A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. Água (20 ml) foi adicionada e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante outra 1 h. Metanol (5 ml) foi lentamente adicionado e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante outra 1 h. Hidróxido de amónio foi adicionado para ajustar o pH da solução a 7. A solução orgânica foi separada, seca (sulfato de sódio, 4 g) e evaporada até a secura sob pressão reduzida. 0 resíduo foi purificado por meio de cromatograf ia em sílica gel em coluna (1-5 % de metanol em diclorometano) para dar 12 como um sólido branco 7,5 g em 50 % de rendimento ao longo das três etapas. ΧΗ RMN (#MS0-d6) δ (ppm) 11,48 (s 1, 1H, NH), 7,94 (d, 1H, H-6), 6,00 (d, 1H, Η-1') , 5,69 (d, 1H, H- 5), 4,06 (dd, 1H, 3' -H) , 3,85 (m, 2H, H-5'um, H-4'), 3,58 (d 1, 1H, H-5'b), 1,27 (d, 3 H, 2 — CH3) , 0,89 (s, 9H, C(CH3)3), 0,12 (s, 6H, S i (CH3 )2) -
Exemplo de Referência 17 -2. Preparação de Sp-4 usando 1 -[(2R,3R,4R,5R)-4 -(terc-butildimetilsNaniloxi)-3 -fluoro-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidrofuran-2-il]-IH-pirimidina- 2,4-diona (3c). A uma solução agitada de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)-3 -fluoro-5-hidroximetil-3 -metiltetrahidro-furan-2-il]-lH-pirimidina-2,4-diona (12, 374 mg, 1 mmol) em THF seco (3 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (1,8 ml, 3,1 mmol)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 2 min„ Inicialmente, um precipitado branco foi observado e após 10 min a mistura de reação tornou-se uma solução amarela escura limpa. Após 3 0 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S) - 2-[ (S)-(4-nitrofenoxi)-fenoxi- fosforilamino]-propiónico (8, SP-isõmero, 653 mg, 1,6 mrnol) em THF (2,5 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 3 min. A mistura foi aquecida a 40 °C durante 20 h em cujo tempo TLC e iH RMN indicou menos que 5 % de material de partida não reagido. A mistura de reação foi extinta com cloreto de amónio aquoso saturado e, em seguida, dividida em partições entre acetato de etilo e água. A camada orgânica foi lavada com solução de Na2C03 aquoso a 10 % (3 x 10 ml), seguido de água (20 ml) . A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrada para dar um resíduo castanho que contém 3c (850 mg) . 0 produto bruto foi dissolvido em tetrahidrofurano (2 ml) e foi adicionado 0,8 ml de ácido fórmico aquoso a 80 % à temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida a 50 °C durante 96 h. Uma conversão de cerca de 7 0 % foi observada por meio de TLC. A mistura de reação foi deitada em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio e, em seguida, dividida em partições entre acetato de etilo e água. A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrada para dar resíduo castanho (220 mg). A cromatografia em coluna do resíduo usando gradiente de 0-5 % de MeOH/#CM deu material de partida não reagido (21 mg) e Sp-4 (77 mg, 3 5 % de rendimento, 3 9 % de rendimento com base em material de partida recuperado).
Exemplo de Referência 18. Preparação de SP-4 com 3d como um Intermediário Sintético
iSp-4
Exemplo de Referência 18-1. Preparação de 3d A uma solução agitada de 3 em piridina (20 ml) a 0 °C foi adicionado TIP#S-C1 gota a gota ao longo de um período de 15 min. A mistura foi lentamente deixada que se aquecesse até a temperatura ambiente em cuja temperatura foi agitada durante 16 h. A piridina foi evaporada e o resíduo foi co-evaporado com tolueno (50 ml). 0 resíduo foi então triturado com hexanos e o precipitado branco foi retirado por filtração usando uma almofada de Celite. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um sólido espumoso (12,97 g). 0 produto bruto (13) foi redissolvido em tetrahidrofurano (75 ml) e foi adicionada uma solução aquosa de TFA (75 ml, 1:1 TFAÓágua) a 0 °C ao longo de um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura durante 6 h. A TLC indicou ~5 EI de mateial de partida. A mistura de reação foi extinta com NaHC03 saturado aquoso até pH 8 e, em seguida, extraída com acetato de etilo. 0 extrato orgânico combinado foi lavado com água, seco e concentrado para dar um sólido cristalino branco. Trituração adicional do sólido com hexanos (30 ml) deu um sólido branco que foi filtrado e seco sob alto vácuo para dar 3d (10,1 g, 84 % de rendimento ao longo de 2 etapas). 1H RMN (400 MHz, CDC13) : δ 8,83 (s 1, 1H) , 7,94 (d 1, J = 6,0 Hz, 1H), 6,10 (dl, J = 18,4 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,2 Hz, 1H) , 4,43 (s 1, 1H) , 4,36 (dd, J = 22,6, 9,0 Hz, 1H), 4,27 is 1, 1H), 4,10 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 4,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 3,92 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 1,39 (d, J = 22,0 Hz, 3H), 1,11-0,92 (m, 28H).
Exemplo de Referência 18-2. Preparação de SP-4 A uma solução agitada de 3d (52 0 mg, 1 mmol) em THF seco (5 ml) foi adicionada uma solução a 1,7 M de cloreto de terc-butilmagnésio (1,8 ml, 3,1 mmol, 3,1 equiv)) à temperatura ambiente ao longo de um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico do ácido (S)- 2-[ (S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxifosforilamino] propiónico (8, Sp-isómero, 653 mg, 1,6 mmol) em THF (1 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 3 min. A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 60 h. 1H e 31P RMN da amostra bruta indicou mistura de diastereómeros em cerca de 1:0,76. A mistura de reação foi extinta com NH4C1 saturado aquoso (20 ml) . A mistura foi dividida em partições entre acetato de etilo (150 ml) e sequencialmente, Na2C03 aquoso a 10 % (3 x 20 ml) e água (20 ml) . 0 extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para dar um resíduo amarelo pálido (14, 878 mg). 0 composto acima, 14, foi redissolvido em tetrahidrofurano (3 ml) e, em seguida, foi adicionado ácido fórmico aquoso a 80 %. A mistura foi aquecida a 55 °C durante 20 h. A mistura de reação foi arrefecida até 0 °C, e, em seguida, extinta com bicarbonato de sódio saturado aquoso (pH 7,0). A mistura de reação foi então dividida em partições entre acetato de etilo e água. A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio e concentrada para dar 560 mg do resíduo. 0 resíduo foi submetido a cromatografia usando gradiente de 0-5 % de metanolódiclorometano para dar material de partida não reagido (14, 242 mg) e SP-4 (80 mg, 15 % de rendimento) como um sólido branco.
Exemplo de Referência 19. Preparação de SP-4 Isotopicamente Marcado
20 21
Exemplo de Referência 19-1. Preparação de 1- ((6aR,8R,9R,9aS)-9-hidroxi-2,2,4,4-tetraisopropiltetrahidro-6H-furo[3,2- f3 [1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 16
Uridina (15, 100,0 g, 409,5 mmol) foi co-evaporada até a secura com piridina anidra (600 ml) e ressuspensa em piridina anidra (700 ml). A esta suspensão fina agitada foi adicionado 1,3-dicloro-1,1,3,3 -tetraisopropildisiloxano (13 5,7 g, 4 82,5 mmol) ao longo de 6 0 min à temperatura ambiente. Após agitação a suspensão fina durante 17 h à temperatura ambiente, a reação foi extinta por meio da adição de metanol (20 ml) e, em seguida, concentrada sob pressão reduzida. 0 resíduo foi dividido em partições entre acetato de etilo (1,5 L) e água (2 L) . A camada orgânica foi lavada adicionalmente com 5 % de ácido clorídrico (2 x 1 L) , salmoura (500 ml), seca em sulfato de sódio sólido (50 g) , filtrada e concentrada sob pressão reduzida ao produto bruto, cerca de 250 g. 0 resíduo foi submetido a uma coluna de filtração usando sílica gel (1,75 kg) e um gradiente de acetato de etilo em hexanos 20-65 %. As frações de produto puro como julgado por uma TLC homogénea (Rf 0,55 em 1:1 hexanos-acetato de etilo) foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida e secas (40 °C, 0,2 mm Hg, 24 h) para proporcionar 145,5 g (76 %) de 16 como uma espuma branca sólido. Uma fração adicional (35 g) de ligeiramente impura 16 foi também colhida. 1H RMN (#MS0-ds) δ (ppm) 11,35 (s, 1H, NH) , 7,66 (d, 1H, Já= 7,6 Hz, H-6), 5,57 (d, 1H, Ja = 4,8 Hz, 2!-OH), 5,50-5,49 (m, 2H, 1'-H e H-5), 4,14-4,18 (m, 3H, 2’, 3’, 4'-H), 3,97-3,87 (m, 2H, 5'-Ha e Hb) , 1,02-0,95 (m, 28H, CH(CH3)2).
Exemplo de Referência 19-2. Preparação de 1-((6aR,8R,9aR)-2,2,4,4 -tetraisopropil- 9-oxotetrahidro-6H-furo[3,2-f3 [1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 17 A um balão redondo de três tubuladuras seco foram adicionados #CM anidro (600 ml) e #MS0 (30,82 g, 394,5 mmol) . A solução foi arrefecida até -78 °C num banho de gelo seco/acetona sob uma atmosfera de azoto. Anidrido trifluoroacético (puro, 77,7 g, 369,8 mmol) foi adicionado via uma seringa ao longo de 40 min e propiciou uma mistura opaca. À mistura uma solução de derivado de uridina 16 em #CM (600 ml) foi adicionada gota a gota ao longo de 75 min a ”78 °C via um funil de adição. A mistura heterogénea foi agitada durante 2 h a -78--65 °C e, em seguida, trietilamina anidra (92 ml) foi adicionada via uma seringa rapidamente para formar uma solução amarela clara limpa. Após lha temperatura baixa, a reação foi completada como mostrado por meio de TLC (30 % de EtOAc em hexanos) . 0 banho de arrefecimento foi removido e a mistura de reação foi aquecida lentamente até a temperatura ambiente ao longo de 1 h. A reação foi extinta por meio da adição de NH4C1 sat. (180 ml) . Água (200 ml) foi adicionada e camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída de novo com #CM (3 00 ml) . A camada orgânica combinada foi lavada com água (3x 4 00 ml), salmoura (150 ml), e seca em Na2S04. A remoção de solvente propiciou um resíduo castanho pegaj oso. 0 resíduo de óleo bruto (continha traço de #CM) foi armazenado durante a noite no congelador. Após este período durante a noite, algum sólido cristalino foi observado no óleo. 0 óleo foi dissolvido em 500 ml de hexanos à temperatura ambiente. A solução foi armazenada no congelador durante 24 horas e mais sólido foi formado. 0 sólido foi colhido via filtração e enxaguado com 10 % de #CM frio em hexanos (1 L) para remover a maior parte da cor laranja. 0 sólido (17) foi seco sob vácuo durante 2 h e, em seguida, ar seco durante 24 h. 0 sólido pesava 21 g após secagem a 50 °C sob vácuo. 0 filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado via cromatografia em coluna (10-70 % de acetato de etilo em hexanos) para proporcionar uns 37 g adicionais (rendimento combinado de 97 %) de 17 como um solido laranja claro.
Exemplo de Referência 19-3. Preparação de 1-((2R,3S,4R,5R)- 3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3 -13C- perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 18
Magnésio (3,53 g, 147 mmol), lavado com ácido clorídrico aquoso a 5 ã e seco (50 °C, 0,2 mm Hg, 24 h) , foi colocado num balão de fundo redondo de duas tubuladuras equipado com um agitador magnético e um condensador, 0 balão foi preenchido com gS s 0 rgon e, em seguida, tér anidro (80 ml) foi adicionado. Ao magnésio em éter foi
adicionado lentamente iodeto de metilo perdeuterio- 1JC (15,06 g, 110,3 mmol) , que gerou uma reação exotérmica. Após a mistura de reação ter sido arrefecida, o sobrenadante foi transferido a uma solução de composto seco 17 (50 °C, 0,2 mm Hg, 15 h) (10,0 g, 20,63 mmol) em THF anidro (1 L) a -50 °C ao longo de 20 min. A temperatura foi deixada que se elevasse até
-40 °C e a mistura foi agitada de entre -40 até -25 °C durante 4 h. Após a conclusão da reação, a mistura foi diluída com EtOAc (1 L) a -50 °C e, em seguida, salmoura (300 ml) foi adicionada lentamente. A camada orgânica foi separada e, em seguida, lavada com solução de cloreto de amónio saturado (3 00 ml x 2) e seca com sulfato de sódio. Após filtração e concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em MeOH (250 ml). Fluoreto de amónio (12 g) e TBAF (400 mg) foram adicionados. A mistura resultante foi agitada a 90 °C durante 7 he, em seguida, concentrada com sílica gel (20 g) sob pressão reduzida. Após secagem minuciosa a vlXI cuo, o resíduo obtido fd> purificado por meio de cromatografia flash em sílica gel em coluna (MeOH:CH2Cl2 = 1:20 a 1:10) parra dar o composto 18 (5 g, 46 á) como um sólido branco. 1H RMN (#M50-d6) δ (ppm) 11,26 (s, 1H, NH), 7,65 (d, 1H, Já= 8,4 Hz, H- 6), 5,77 (d, 1H, Já= 2,4 Hz, Η-1'), 5,57 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5), 5,46 (d, 1H, iTã= 5,2 Hz, HO -31 ) , 5,24 (d, 1H, 2,4 Hz, HO - 2'), 5,14 (t, 1H, Já= 5,6 Hz, HO-5'), 3,74-3,56 (m, 4H, H- 3', 4', 5', 5") .
Exemplo de Referência 19-4. Preparação de acetato de ((2R,3R,4S,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidm- 1(2H)-il)-4-hidroxi- 4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il) metilo, 19 A uma solução de composto 18 (5,00 g, 19,1 mmol) em piridina anidra (100 ml) foi adicionado anidrido acético (3 ml) à temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante 15 h, diluída com EtOAc (2 50 ml) , lavada com S gua (50 ml x 3) , e seca com sulfato de sódio. Após filtração e concentração, o resíduo foi purificado por meio de cromatografia flash em coluna (MeOH 0 a 5 % em CH2C12) para dar o composto 19 (4,0 g, 6 8 %) como um sólido cinza.
Exemplo de Referência 19-5. Preparação de acetato de ((2R,3R,4R,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4 -fluoro-4- 13C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2-il) metilo, 20 A uma solução de composto 19 (2,33 g, 6,73 mmol) em CH2C12 anidro (60 ml) foi adicionado #AST (1,33 ml, 10,1 mmol) a -78 °C lentamente. A mistura resultante foi agitada durante 30 min após ser exposta à temperatura ambiente. Uma escala de duas reações de 2,33 g e uma escala de uma reação de 1,00 g foram conduzidas exatamente do mesmo modo. Todas as quatro misturas de reação foram combinadas, diluídas com CH2C12 (3 00 ml) , e lavadas com água com gelo (100 ml x 2) e, em seguida, solução de NaHC0:3 aquoso frio (100 ml x 2) . Após a secagem, filtração, e concentração, o resíduo foi purificado por meio de cromatografia flash em sílica gel em coluna (EtOAc 0 % a 50 % em hexanos, o composto saiu ao redor de 48 %) para dar o composto 20 (2,0 g, 24 % a partir do total 7,99 g de composto 19) como um sólido branco. 1H RMN (C#C13) δ (ppm) 8,27 (s, 1H, NH) , 7,55 (d, 1H, Já= 8,4 Hz, H-6) , 6,17 (d, 1H, J = 18,8 Hz, H-l1), 5,78 (dd, 1H, Jú = 1,2, 8,4 Hz, H-5), 5,12 (dd, 1H, J = 9,6,21,6 Hz, H-3'), 4,40-4,31 (m, 3H, H-4 ' , 5', 5"), 2,19 (s, 3H, CH3) , 2,15 (s, 3H, CH3) .
Exemplo de Referência 19-6. Preparação de 1-((2R,3R,4R,5R)- 3-f luoro-4-hidroxi-5- (hidroximetil) -3 -13C-perdeuteriometil-tetrahidrofuran-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H-diona, 21 A uma solução de composto 20 (2 g, 5,74 mmol) em metanol (20 ml) foi adicionado n-butilamina (6 ml) . A mistura resultante foi agitada a ta durante 15 h e concentrada com sílica gel a vácuo. 0 resíduo obtido foi purificado por meio de cromatografia flash em sílica gel em coluna (MeOH 0 a 10 0 em C£E12) para dar o composto 21 (1,3 g, 85 0 ) como um sólido branco. 1H RMN (C#30#) δ (ppm) 8,08 (d, 1H, Já= 8,0 Hz, H-6), 6,13 (d, 1H, Já= 18,4 Hz, H-11 ) , 5,70 id, 1H, Ja= 8,0 Hz, H- 5), 3,99 id, 1H, iJ"a= 13,6 Hz, H-5'), 3,97-3,91 (m, 2H, H-3!, 4'), 3,80 (dd, 1H, J = 2,0, 12,8 Hz, H - 5") , ESMS (MÀ1) estimado 265, observado 265 .
Exemplo de Referência 19-7. Preparação de 2 - ((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il) -4- f luoro-3- hidroxi- 4-13C- perdeuteriometiltetrahidrofuran-2- il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato de (S)- isopropilo, 22 A uma solução do nucleósido não protegido 21 (207 mg, 0,783 mmol) e iV-metilimidazol (0,4 ml, 5 mmol) em THF (4 ml) foi adicionado o fosforocloridato pré-elaborado em THF (1,0 M, 2,35 ml, 2,35 mmol) a 0 °C gota a gota. A reação foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente ao longo de 1 h e, em seguida, água (1 ml) e EtOAc (5 ml) foram adicionados. A solução orgânica foi lavada com citrato de sódio sat. aq. mono básico (2x2 ml), NaHC03 sat. aq. (1 x 2 ml), seca (MgS04) e concentrada sob pressão reduzida. 0 material bruto foi purificado por meio de sílica cromatografia em coluna usando 0 a 5 0 JPr OH em CH2C12 como eluentes para dar o fosforamidato, 22 (216 mg, 52 H , mistura 1:1 de P-diastereõmeros) como um sólido branco: 1H RMN (400 MHz, #MS0-ds) δ 11,54 (s, 1H) , 7,56 (d, J = 6,8
Hz, 1H), 7,40-7,35 (m, 2H), 7,23-7,18 (m, 3 H), 6,14-5,96 (m, 2H) , 5,89 (dd, J = 5,6, 25,6 Hz, 1H) , 5,55 (t, J = 8,4
Hz, 1H) , 4,85 (dq, Jâ= 1,6, 6,0 Hz, 1H) , 4,44-4,32 (m, 1H) , 4,25 (m, 1H), 4,06-3,98 (m, 1H), 3,86-3,70 (m, 2H), 1,30-1,08 (m, 9H)Â 31P RMN (162 MHz, #MS0-ds) δ 4,90, 4,77Ã LRMS (ESI) [M À H]À calculado para C2i13CH27#3FN309P 534,5, encontrado 534,4.
Exemplo de Referência 19-8. Preparação de ácido (2S)-2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il) -4-fluoro-3-hidroxi-4- 13C-perdeuteriometiltetrahidrofuran-2 -il)metoxi)(hidroxi)fosforil)amino)propanoico, 23
Fosforamidato 22 (147 mg, 0,276 mmol) foi suspenso em trietilamina (2 ml) e água (0,5 ml), e aquecido a 60 °C durante 30 h. Então os componentes voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. 0 material bruto foi purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica gel por meio da eluição com 50-70 á de JPr OH em CH2C12 e então, 0 a 2 0 á de NH40H em 2Pr OH para dar 23 como um sólido branco (95 mg, 83 0 ) : 1H RMN (4 00 MHz, #MS0-ds) δ 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 5,98 (d, J = 19,2 Hz, 1H) , 5,52 (d, Já = 8,4 Hz, 1H) , 4,02-3,81 (m, 4H) , 1,10 (d, Já = 6,8
Hz, 3H)Ã 31P RMN (162 MHz, #MS0-ds) δ 8,12Ã LRMS (ESI) [M Ã H]Â calculado para C1213CH17#:3FN:309P 416,3, encontrado 416,4. PropriedadesádeáAmostrasádeáRP-4, á4, áeáSP-4
As amostras de RP-4, 4, e SP-4 foram analisadas por meio de difração de pó de raios X (XRP#) , espetrometria de ressonância magnética nuclear (RMN), espetroscopia infravermelho de transformada de Fourier (FT-1R), calorimetria de varrimento diferencial (#SC), análise gravimétrica térmica (TGA), adsorção de vapor gravimétrica (GVS), solubilidade Aquosa termodinâmica, e cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).
Exemplo de Referência 20. Difração de pó de raios X
As amostras de RP-4, 4, e SP-4 foram analisadas por meio de difração de pó de raios X (XRP#) sob o seguinte regime. a. Bruker AXS/Siemens D5000
Os padrões de difração de pó de raios X foram colhidos num difratómetro Siemens #5000 usando radiação Cu Kc* (40 kV, 40 mA) , goniómetro Θ-Θ, divergência de V20 e fendas de recebimento, um monocromador secundário de grafite e um contador de cintilação. O desempenho do instrumento é verificado usando um padrão Corundum certificado (NIST 1976) . 0 software usado para a colheita de dados foi #iffrac Plus XRP# Commander v2.3.1 e os dados foram analisados e apresentados usando #iffrac Plus EVA v 11.0.0.2 ou v 13.0.0.2.
Condições ambientais
As amostras executadas sob condições ambientais foram preparadas como espécimes de placa plana usando pó como recebido. Aproximadamente 35 mg da amostra foram suavemente embalados numa cavidade cortada em obreia de silício de fundo zero polida (510) . A amostra foi girada no seu próprio plano durante a análise. Os pormenores da colheita de dados são: intervalo angular: 2 a 42°2ΘΆ tamanho de etapa: 0,05°29Ã e tempo de colheita: 4 s.etapa"1.
b. Bruker AXS C2 GADDS
Os padrões de difração de pó de raios X foram colhidos num difratómetro Bruker AXS C2 GA##S usando radiação Cu Ka (40 kV, 40 mA), fase XYZ automatizada, microscópio de vídeo laser para posicionamento de auto-amostra e um detetor de área bidimensional HiStar. Ótica de raios X consiste num único espelho multicamada Gôbel acoplado com um colimador de orifício de 0,3 mm. A divergência dos feixes, ou seja, o tamanho efetivo do feixe de raios X na amostra, foi de aproximadamente 4 mm. Um modo de varrimento contínuo Θ-Θ foi utilizado com uma distância de amostra - detetor de 2 0 cm que dá um intervalo efetivo de 2Θ de 3,2°-29,7°. Tipicamente, a amostra será exposta ao feixe de raios X durante 120 segundos. 0 software usado para a colheita de dados foi GA##S para WNT 4.1.16 e os dados foram analisados e apresentados utilizando #iffrac Plus EVA v 9.0.0.2 ou v 13.0.0.2.
Condições ambientais
As amostras executadas sob condições ambientais foram preparadas como espécimes de placas planas usando põ como recebido sem moagem. Aproximadamente 1-2 mg de amostra foram ligeiramente pressionadas sobre uma lâmina de vidro para obter uma superfície plana. #ifração de pó de raios X (XRP#) 4 foi encontrado por XRP# como sendo amorfo (veja-se Fig. 1) . A análise de alta resolução de XRP# de RP-4 preparado de acordo com o Exemplo 3 confirmou um sólido cristalino que exibe um padrão de põ diferente a esse do Sp-4 (preparado de acordo com o Exemplo 4, Método 4), que foi também confirmado como sendo um sólido cristalino. Os resultados de XRP# para RP-4 e SP-4 são mostrados no Quadro 1 com todos os picos exibindo uma intensidade de <5 % (RP-4) e <3 % (SP-4) excluído.
Quadro 1. Dados de XRPD para RP-4 e SP-4.
Uma amostra de SP-4 foi moída com um pilão e almofariz, e, em seguida, sucessivamente passada através de crivos de 500 e 250 pm para produzir a amostra como um pó fino. Esta amostra foi reanalisada por meio de XRP# de alta resolução, confirmando que nenhuma alteração de forma ocorreu.
Exemplo de Referência 21. Estudos de cristalização para SP- 4.
Sp-4 cristalino exibe polimorfismo. Assim, a revelação refere-se parcialmente a SP-4 cristalino e suas formas polimórficas individuais. SP-4 pode existir em pelo menos cinco formas polimórficas, designadas como Formas 1-5. Além disso, Sp-4 amorfo pode também ser preparado. Uma cristalização típica trata de dissolver cerca de 100 mg de Sp-4 num volume apropriado de solvente de cristalização (acetonitrilo (5 vol), clorofórmio (5 vol) , acetato de n-butilo (7 vol), diclorometano (50 vol), anisol (7 vol), e 1:1 MTBEÓheptano (50 vol)) e, em seguida, permitindo a evaporação da solução a 5 °C. Várias formas cristalinas foram obtidas, mas cada forma, após filtração eóou secagem, propiciou a Forma 1.
As Formas 1, 2 e 3 são uma forma não-solvatada, 1:1 solvato #CM e 1:1 solvato clorofórmio, respetivamente, como foi confirmado por meio de análise de raios X de cristal único e XRP#. As Formas 4 e 5 foram obtidas a partir de cristalização de SP-4 das soluções de acetonitrilo e anisol, respetivamente. #ados suficientes não podem ser recolhidos para determinar se as Formas 4 e 5 sâo não solvatadas, hidratadas ou solvatadas uma vez que cristais únicos de qualidade suficiente não foram obtidos. As Formas 4 e 5 transformam-se na Forma 1 na filtração. #uas formas cristalinas adicionais são obtidas após cristalização de Sp-4 a partir de acetato de n-butilo ("BuAc) e uma solução que contém metil-'butil éter (MTBE) e heptanoà após filtração ambas as formas cristalinas convertem-se na Forma 1. As Formas 2 e 3 também se transformam na Forma 1 em isolamento. A Forma 1 é uma forma não-solvatada, que exibe uma endotermia de fusão larga com uma temperatura inicial de 94,3 °C e AHfus de 24,0 kJ mol'1. Um padrão adicional de XRP# de Forma 1 de SP-4 é representado na Figura 4. Conversão de Referência de SP-4, Forma 1 a SP-4, Forma 6 A Forma 1 pode ser convertida à Forma 6 de pelo menos duas maneiras.
Primeiro, ao permitir que os cristais de Forma 1 finos sejam expostos à humidade atmosférica durante vários dias, um mono-hidrato da Forma 1 é produzido com um aspeto de uma goma solidificada. Após a trituração do sólido para obter um pó fino mono-hidrato, o padrão de XRP# mantém-se consistente com a Forma 1. Após repouso num recipiente aberto durante 6-10 semanas, o material moído muda lentamente para a Forma 6 como um sólido anidro. A Forma 1 é estável durante pelo menos 2 anos num recipiente vedado.
Em alternativa, a Forma 1 pode ser suspensa em 5-50 mgóml de água à temperatura ambiente e ao longo de algumas horas ser transformada na Forma 6. A eficiência do processo de transformação da água pode ser melhorada por aquecimento da água a um ponto de dissolver mais a Forma 1 e para aumentar a fluidez da porção imiscível de SP-4 a partir de uma goma dura a uma suspensão de óleo a cerca de ou acima. Ao longo do tempo, a Forma 6 pode começar a cristalizar a
50 °C. O arrefecimento posterior da suspensão a 0-10 °C conduz a uma elevada recuperação de sólido. A cristalização de água também remove mais vestígios de impurezas polares, levando à melhoria da pureza total. A redissolução da Forma 6 em solvente orgânico como tal como diclorometano ou acetonitrilo seguido de cristalização fornece a Forma 1, mesmo ao semear com a Forma cristalina 6. A um balão de fundo redondo de uma tubuladura seco de 100 ml equipado com um septo de borracha e uma barra magnética foi carregado 1,04 gramas de SP-4, Forma 1. A pureza de HPLC 9 9,7 %. Carregados 4 0 ml de água #1.
Iniciou-se agitação da suspensão vigorosamente, enquanto se aquecia a 50 °C. Uma vez que a temperatura atingiu 50 °C, a solução homogénea foi principalmente mantida durante 60 min, tempo durante o qual os sólidos começaram a precipitar a partir da solução, formando uma suspensão fina. A suspensão foi arrefecida até 20 °C ao longo de 90 min e mantida durante 16 horas a 20 °C, seguido de posterior arrefecimento a 0-5 °C ao longo de 30 min e mantida a 0-5 °C durante 2,5 horas. A suspensão foi filtrada num funil de frita de vidro de porosidade média e lavada com 10 ml de água arrefecida com gelo. 0 bolo húmido foi seco por sucção durante 2 horas antes da secagem num forno a vácuo durante a noite durante 23 horas a 50 °C. Isolados 0,88 g (84,6 % de recuperação) de SP-4, Forma 6. A Forma 6 tem um ponto de fusão de cerca de 124,5-126 °C.
Exemplo de Referência 21-1. SP-4 Forma 1
Uma lista de picos da Forma 1 de SP-4 é apresentada no Quadro 2.
Exemplo de Referência 21-2. Forma 2 de SP-4
Um padrão de XRP# da Forma 2de SP-4 é representado na Figura 5.
Uma lista de picos da Forma 2 de SP-4 é apresentada no Quadro 3«
Exemplo de Referência 21-3. Forma 3 de SP-4
Um padrão de XRP# da Forma 3de SP-4 é representado na Figura 6.
Uma lista de picos da Forma 3 de SP-4 é apresentada no Quadro 4.
Exemplo de Referência 21-4. Forma 4 de SP-5
Um padrão de XRP# da Forma 4 de SP-4 é representado na Figura 7.
Uma lista de picos da Forma 4 de SP-4 é apresentada no Quadro 5.
Exemplo de Referência 21-5. Forma 5 de SP-4
Um padrão de XRP# da Forma 5 de SP-4 é representado na Figura 8.
Uma lista de picos da Forma 5 de SP-4 é apresentada no Quadro 6.
Exemplo 21-5. Forma 6 de Sp-4
Um padrão de XRP# da Forma 6 de SP-4 é representado na T? Ί rm ts 91
Uma lista de picos da Forma 6 de SP-4 é apresentada no seguinte quadro.
Exemplo de Referência 21-7. SP-4 (Amorfo)
Um padrão de XRP# para SP-4 amorfo é representado na Figura 9.
Exemplo de Referência 22. Cristalografia de raios X de Cristal Único de SP-4 e seus solvatos
Exemplo de Referência 22-1. Cristalografia de raios X de Cristal Único de Sp-4 (Forma 1) A Figura 10 mostra uma estrutura cristalina de raios X para a Forma 1 de Sp-4. Neste documento, a figura mostra uma vista de moléculas de Forma 1 da estrutura de cristal que mostra o esquema de numeração utilizado. Elipsoides de deslocamento atómico anisotrópico para os átomos de não hidrogénio são mostrados no nível de probabilidade de 50 %. Os átomos de hidrogénio são mostrados com um raio arbitrariamente pequeno. A solução de estrutura foi obtida por meio dos métodos diretos, refinamento de mínimos quadrados de matriz total em F2 com ponderação w"1 = g2(F02) À (0,Q592P)2 À (Q,6950P), onde P = (F02À2FC2) Ó3, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmónica esférica, implementada em algoritmo de escalamento SCALES ABSPACK. wR2 = {e[w(F02-
Fcó)2] 0Σ [w (F02) 2] 102} = 0,0871 final para todos os dados, Rj_ = 0,0329 convencional em valores de F de 7090 reflexões com F0 > 4o(F0), S = 1,016 para todos os dados e 870 parâmetros. AÓa(máx) final 0,001, ΔΟσ(média), 0,000. Mapa de diferença final entre Ã0,534 e -0,36 e Â"3.
Quadro 7. Parâmetros de
Cristal Único da Forma 1
Exemplo de Referência 22-2. Cristalografia de raios X de Cristal Único de Sp-4 (Forma 2) A Figura 11 mostra uma estrutura cristalina de raios X para a Forma 2 de SP-4. Neste documento, esta figura mostra uma vista de moléculas da Forma 2 da estrutura de cristal que mostra o esquema de numeração utilizado. Os heteroS tomos foram resolvidos isotropicamente devid a dados muito fracos. Os átomos de hidrogénio não são mostrados. A solução de estrutura foi obtida por meio dos métodos diretos, refinamento de mínimos quadrados de matriz total em F2 com ponderação w"1 = a2(F02) À (0,0975P)2 À (10,6969P), onde P = (F02À2Fc2) 03, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmónica esférica, implementada em algoritmo de escalamento SCALE 3 ABSPACK. wR2 = {E[w(F02-
Fc2)2] 0Σ [w (Fo"') 2] 102} = 0,1883 final para todos os dados, R-ι = 0,0741 convencional em valores de F de 2525 reflexões com F0 > 4a(FG), S = 1,05 para todos os dados e 158 parâmetros. LÓo(mãx) final 0,000, ΔΟσ(média), 0,000. Mapa de diferença final entre à 1,388 e -0,967 e ‘3.
Quadro 8. Parâmetros de Cristal Único da Forma 2
Exemplo de Referência 22-3. Cristalografia de raios X de Cristal Único de SP-4 (Forma 2) A Figura 12 representa uma Estrutura de Cristal de Raios X (ORTEP - anisotrõpico) SP-4 (Forma 2) . Uma estrutura de cristal do solvato cloreto de metileno de SP-4 (Forma 2), C23H31N3POgFCl2, produz um grupo de espaço monoclínico P2, (ausências sistemáticas OkO: k=ímpar) com a=12,8822 (14) À, b=6,1690 (7) Á, c = 17,733(2) Â, β-92,045 (3) 0 , V=1408,4 (3 ) Ã3 , Z = 2 e dcaic=l,449 g/cm3 . Os dados de intensidade de raios X foram colhidos num detetor de área Rigaku Mercury CC# que utiliza radiação de Mo-Kc monocromada com grafite (X=0,71073 Ã) numa temperatura de 143K. A indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de doze imagens de rotação de 0,5° com exposições de 30 segundos. Um total de 648 imagens de rotação foi colhido com uma distância do cristal em relação ao detetor de 35 mm, um ângulo de giro 2Θ de -12°, larguras de rotação de 0,5° e exposições de 30 segundos: varrimento N° 1 foi um varrimento φ de 315° a 525° em ω)= 10° e χ = 20°Á varrimento N° 2 foi um varrimento ode -20° a5° em χ = -90° e φ = 315°Ã varrimento N° 3 foi um varrimento ω de -20° a 4o em χ = -90° e φ = 135 °Ã varrimento N° 4 foi um varrimento ω de -20° a 5o em χ = -90° e φ = 225 °Ã varrimento N° 5 foi um varrimento ω de -20° a 20° em χ = -90° e φ = 45°. As imagens de rotação foram processadas usando CrystalClear (CrystalClear: Rigaku Corporation, 1999), produzindo uma lista de valores que não se fizeram a média de F2 e o(F2) que foram então passados ao pacote de programa CrystalStructure (CrystalStructure: Crystal Structure Analysis Package, Rigaku Corp. RigalcuÓMSC (2002)) para processamento posterior e solução de estrutura num computador #ell Pentium III. Urn total de 7707 reflexões foi medido ao longo dos intervalos 5,48 < 2Θ < 50,04°, -14 < h < 15, -7 < k < 6, -19 < 1 < 21 produzindo 4253 reflexões únicas (Rint = 0,0180). Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção usando REQAB (transmissão mínima e máxima 0,824, 1,000). A estrutura foi resolvida por meio dos métodos diretos (SIR97, SIR97: Altomare, A., M. Burla, M. Camalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Guagliardi, A. Moliterni, G. Polidori &amp; R. Spagna (1999). J. Appl. Cryst., 32, 115-119). 0 refinamento foi por meio de mínimos quadrados de matriz total com base em F2 usando 5HELXL-97 (SHELXL-97:
Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst., A64, 112-122). Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. O esquema de . - - . w=1/[cj2(Fo )+ 0,0472P2 + 0,4960P] . ponderação usado foi L v J onde P~:Cítt ^ SPcXK Os átomos de nâo hidrogénio foram refinados anisotropicamente e os átomos de hidrogénio foram refinados usando um modelo de "equitação". 0 refinamento convergiu a Ri = 0.0328 e wR2=0,0817 para 4046 reflexões para as quais F > 4o(F) e Ri=0,0348, wR2 = 0,0838 e GOF = 1,056 para todas as 4253 reflexões não zero únicas e 358 variáveis II!Fj-ÍFJ/IW^R2=“{£w(^ -F* Ã onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros refinado). 0 Δ0σ máximo no ciclo final de mínimos quadrados foi 0,000 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram À0,312 e -0,389 eÕS3. 0 parâmetro de estrutura absoluta de Flack refinado até -0,06(6) assim corroborando à estereoquímica do composto do título. 0 Quadro 1 lista informação de célula, parâmetros de colheita de dados, e dados de refinamento. Parâmetros térmicos isotrópicos equivalentes e posicionais finais são dados no Quadro 2. Parâmetros térmicos anisotrõpicos estão no Quadro 3. A representação ("ORTEP-II: A Fortran Thermal Ellipsoid Plot Program for Crystal Structure Illustrations". C.K. Johnson (1976) ORNL-5138.) da molécula com probabilidade de 30 % de elipsoides térmicos mostrada. Quadro 9. Sumário de Determinação da Estrutura do Composto SP-4CH2C12. Fórmula: C23H31N3PO9FCI2
Peso da fórmula: 614,38
Classe de cristal: monoclínico
Grupo de espaço: P21; (#4) Z 2
Constantes de célula:
a 12,8822( 14)S
b 6,1690 (7) A
c 17,733(2) A β 92,045(3)° V 1408,4(3) A3 μ 3,4 8 cm"1 tamanho de cristal, mm 0,42 x 0,12 x 0,10 #caic 1,44 9 gÓcm3 F (000) 640
Radiação: Μο-Κα (λ.= 0,71073Â) intervalo 2Θ 5,48 - 50,04° -14 < h < 150 -7< k < 60 hkl colhido: -19 < 1 < 21 N° de reflexões medidas: 7707 N° de reflexões únicas: 4253 (Rint=0,0180) N° de reflexões observadas 4046(F>4o) N° de reflexões usadas no4253 refinamento N° de parâmetros 358 índices de R (F>4cj) Ri=0,0328 wR2 = 0,0817 índices de R (todos os dados R,=0,0348 wR2 = 0,0838 GOF: 1,056
Picos de #iferença Final, eÓÃ3+0,312, -0,389
Exemplo de Referência 22-4. Cristalografia de raios X de Cristal Único de SP-4 (Forma 3) A Figura 13 mostra uma estrutura cristalina de raios X para a Forma 3 de SP-4. Neste documento, esta figura mostra uma vista de moléculas da Forma 3 da estrutura de cristal que mostra o esquema de numeração utilizado. Os elipsoides de deslocamento atómico anisotrópico para os átomos de não hidrogénio são mostrados no nível de probabilidade de 50 %. Os átomos de hidrogénio são mostrados com um raio arbitrariamente pequeno. A solução de estrutura foi obtida por meio dos métodos diretos, refinamento de mínimos quadrados de matriz total em F2 com ponderação w1 = σ2 (Fa2) À (0,0512P)2 Â (0,6 810P), onde P = (F02À2Fc2) 03, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmónica esférica, implementada em algoritmo de escalamento SCALE3 ABSPACK. wR2 = {E[w(F02-
Fc2)2] 0Σ [w (Fq"') 2] 102} = 0,07 96 final para todos os dados, Ri = 0,0294 convencional em valores de F de 2486 reflexões com Faá >á 4a(F0), S = 1,068 para todos os dados e 3 77 parâmetros. AÕa(mãx) final 0,001, ΔΟσ(média), 0,000. Mapa de diferença final entre Â0,211 e -0,334 e Â"3.
Quadro 10. Parâmetros de Cristal Único da Forma 3
Exemplo de Referência 23. Estabilidade a temperaturas elevadas e humidade relativa
Uma amostra de RP-4 foi armazenada numa câmara de humidade a 40 °Ce 75 áde humidade relativa durante uma semana, e a amostra foi reanalisada por meio de XRP#. 0 padrão de pó obtido para RP-4 não mostrou nenhuma alteração substancial durante o curso da experiência, o que significa que nenhuma alteração na forma sólida foi observada. Isto deveria ser contrastado com uma amostra de 4, que deliquesceu dentro de cerca de 16 horas após armazenamento a 40 °C e 75 ã de humidade relativa. #e facto, uma ilustração da natureza deliquescente de 4 é ilustrada por meio do seguinte. Uma amostra de 4 foi passada através de um crivo de 250 pm, em seguida, as amostras foram armazenadas a 40 °C Ó 75 ã de HR e 25 °C Ó 53 á de humidade relativa e observações visuais foram tomadas em intervalos regulares. Os resultados são dados no Quadro 4.
Quadro 11. Estabilidade de 4
a humidade relativa elevada.
Após armazenamento a 40 °C e 75 á de humidade relativa uma amostra de SP-4 deliquesceu dentro de 16 horas. Por exemplo, uma amostra de SP-4 foi moída com um pilão e almofariz, e, em seguida, sucessivamente passada através de crivos de 500 e 250 μηι para produzir a amostra como um põ fino. As amostras deste material foram armazenadas a 40 °C e 75 E de humidade relativa e 25 °C e 53 0 de HR e observações visuais foram tomadas em intervalos regulares.
Os resultados são dados no Quadro 5.
Quadro 12. Estabilidade de SP-4 a humidade relativa pl pvaiia .
A análise de XRP# da amostra após armazenamento a 2 5 °C e 53 H de HR durante 104 horas não mostrou nenhma alteração significativa nos difratogramas produzidos indicando que nenhuma alteração de forma tinha ocorrido. Exemplo de Referência 24. Trans formada de Fourier Espetrometria de Infravermelho (FT-IR)
Os dados foram colhidos num Perkin-Elmer Spectrum One equipado com um acessório de amostras de Refletância Total Atenuada (RTA) universal. Os dados foram colhidos e analisados usando o software Spectrum v5.0.1. 0 espetro IR obtido para 4, RP-4, e SP-4 são mostrados nas Figs. 5-7, respetivamente. Os picos selecionados, em números de onda (cm-1) são indicados a seguir: 4: -1680, -1454, -1376, -1205, -1092, -1023 (Fig. 14); RP-4: —1742, —1713, —1679, —1460, —1377, —1259, —1157, -1079 (Fig. 15); e
Sp-4 (Forma 1): -1743, -1713, -1688, -1454, -1378, -1208, -1082 (Fig. 16).
Exemplo 25. Calorimetria de varrimento diferencial (DSC) Análise Termogravimétrica (TGA)
Os dados de #SC foram colhidos num TA Instruments Q2000 equipado com um auto-amostrador de 50 posições. A calibração para capacidade térmica foi levada a cabo usando safira e a calibração para energia e temperatura foi levada a cabo usando índio certificado. A #5C de temperatura modulada foi levada a cabo em tipicamente 0,8-1,2 mg de cada amostra, num recipiente de alumínio com pequenos orifícios, usando uma taxa de aquecimento subjacente de 2 “C.min”1 e parâmetros de modulação de temperatura de ± 0,2 °C.min‘1 e 40 segundos. Uma purga de azoto seco a 50 ml.min”1 foi mantida na amostra. 0 software de controlo do instrumento foi Advantage for Q Series v2.8.0.392 e Thermal Advantage v4.8.3 e os dados foram analisados usando Universal Analysis v4.3A.
Os dados de #SC foram colhidos num Mettler #SC 823e equipado com um auto-amostrador de 34 posições. 0 instrumento foi calibrado para energia e temperatura usando índio certificado. Tipicamente 0,8-1,2 mg de cada amostra, num recipiente de alumínio com pequenos orifícios, foi aquecido a 10 “C.min”1 de 25 °C a 250 °C. Uma purga de azoto a 50 ml.min”1 foi mantida na amostra. 0 software de análise de dados e controlo do instrumento foi STARe v9.20.
Os dados de #SC para SP-4 (Forma 6) foram colhidos usando um instrumento de #SC (TA Q2000), usando uma taxa de aquecimento de 10 °CÕ min sob um fluxo contínuo de gás azoto seco (100 mlómin) . Aproximadamente 2,2 mg de amostra foram precisamente pesados e aquecidos num recipiente 'Tzero' não hermeticamente vedado com uma tampa de ajuste frouxo. 0 instrumento foi calibrado (entalpia e temperatura) com um padrão de índio e (capacidade de calor) com um padrão de safira. As incertezas são estimadas como sendo ±0,1 °C para temperaturas e ±5 % para entalpias medidas. 0 software TA Universal Analysis foi utilizado para medir temperaturas iniciais.
Os dados de TGA foram colhidos num Mettler TGAÓS#TA 851e equipado com um auto-amostrador de 34 posições. 0 instrumento teve a temperatura calibrada usando índio certificado. Tipicamente 8-12 mg de cada amostra foram carregados num cadinho de alumínio pré-pesado e foi aquecido a 10 “C.min”1 de temperatura ambiente a 350 °C.
Uma purga de azoto a 50 ml.min”~ foi mantida na amostra. 0 software de anH lise de dados e controlo do instrumeto foi STARe v9.20. A anS lise de #SC de 4 mostrou uma endoterma ampla única com um início de 58,7 °C (AH 14 J.g"1) confirmada como sendo devido a relaxamento molecular durante a transição de vidro por meio de análise de #SC modulada posterior (Fig. 17) . A análise de TGA de 4 não mostrou nenhuma perda de peso antes da decomposição acima de 240 °C, confirmando que o material era não solvatado. Como a análise de XRP# de 4 confirmou o material como sendo amorfo, a análise de #SC modulada foi tomada numa tentativa de calcular a temperatura de transição de vidro, que foi encontrada como sendo 57 °C. A análise de #SC mostrou uma endoterma aguda única com um início de 136,2 °C (AH 76 J.g”1) confirmada como sendo um material fundido por meio de microscopia de estágio quente. Veja-se a Fig. 18. A análise de TGA de RP-4 não mostrou nenhuma perda de peso antes da decomposição acima de 240 °C, confirmando que o material era não solvatado. A análise de #SC de SP-4 mostrou uma endoterma ampla única com um início de 93,9 °C (AH 43 J.g”1) confirmou um material fundido por meio de microscopia de estágio quente. Veja-se a Fig. 19. A análise de TGA de SP-4 não mostrou nenhuma perda de peso antes da decomposição acima de 240 °C, confirmando que o material era não solvatado. A análise de #SC de SP-4 (Forma 6) mostrou uma endoterma ampla com um início de 120,7 °C (AH 79 J.g-1). Exemplo de Referência 26. Sorção Gravimétrica de Vapor (GVS) SMSáGVSálntrínseca
Isotermas de sorção foram obtidas usando um analisador sorção de humidade SMS #VS Intrínseca, controlado por software de Suite de Análise de SMS. A temperatura da amostra foi mantida a 25 °C pelos controlos do instrumento. A humidade foi controlada por correntes de mistura de azoto seco e húmido, com uma taxa de fluxo total de 200 ml.min"1. A humidade relativa foi medida por uma sonda Rotrónica calibrada (intervalo dinâmico de 1,0-100 % de HR), localizada próxima à amostra. A alteração de peso, (relaxamento de massa) da amostra como uma função de % de HR foi constantemente monitorizada por meio da microbalança (precisão ±0,005 mg).
Tipicamente 5-20 mg de amostra foram colocados numa cesta de malha de aço inoxidável tarada sob condições ambientais. A amostra foi carregada e descarregada a 40 % de HR e 25 °C (condições ambientes típicas) . Uma isoterma de sorção de humidade foi realizada como delineado a seguir (2 varrimentos dando 1 ciclo completo). A isoterma padrão foi realizada a 25 °C a 10 % de intervalos de HR ao longo de um intervalo de 0,5-90 % de HR.
Quadro 13. Parâmetros de Método para Experiências de SMS DVS Intrínseca
A amostra foi recuperada após conclusão da isoterma e reanalisada por meio de XRP#. A análise de GVS mostrou RP-4 como sendo não higroscópico que exibe absorção reversível de aproximadamente 0,2 % em peso de água de 0 a 90 % de humidade relativa. A reanãlise da amostra por meio de XRP# após a experiência de GVS não mostrou nenhuma alteração em forma.
Uma amostra de SP-4 foi moída com um pilão e almofariz, e, em seguida, sucessivamente passada através de crivos de 500 e 250 pm para produzir a amostra como um pó fino que foi então analisado usando um método de ciclo único modificado. A amostra foi tomada de 4 0 % de HR (aproximadamente ambiente) a 60 % de HR, em vez de 90 % para o método padrão, e, em seguida, submetida a ciclo de 0 % e de volta a 40 % de HR. Esta análise mostrou SP-4 como sendo não higroscópico a 6 0 % de HR, com absorção reversível de ~0,2 % em peso de água de 0 a 60 % de HR. Exemplo de Referência 27. Solubilidade Aquosa Termodinâmica A solubilidade aquosa foi determinada por meio d e suspensão de uma quantidade suficiente de composto em água para dar uma concentração final máxima de >10 mg.ml"1 da forma livre parental do composto. A suspensão foi equilibrada a 25 °C durante 24 horas então o pH foi medido. A suspensão foi então filtrada através de um filtro de fibra de vidro C numa placa de 96 poços. 0 filtrado foi então diluído por um fator de 101. A quantização foi por meio de HPLC com referência a uma solução padrão de aproximadamente 0,1 mg.ml"1 em #MS0. Volumes diferentes do padrão, soluções de amostra diluídas e não diluídas foram injetadas. A solubilidade foi calculada usando as áreas de pico determinadas por integração do pico encontrado no mesmo tempo de retenção que o pico principal na injeção padrão.
Quadro 14. Parâmetros de Método de HPLC para Medições de
Solubilidade
A análise foi realizada sob as condições indicadas acima num sistema Agilent HP1100 series equipado com um detetor de arranjo de díodos e usando software ChemStation VB.02.01-SR1.
Quadro 15. Resultado de solubilidade aquosa para RP-4, 4, e
Exemplo de Referência 28. Determinação de Pureza Química por meio de HPLC Várias condições de HPLC podem ser usadas para determinar a pureza química dos compostos revelados no presente documento. Um tal exemplo é revelado acima em relação aos estudos de solubilidade aquosa termodinâmica. Outro exemplo é revelado a seguir.
Condições de HPLC LC: Módulo de Separações Waters Alliance 2695, #etetor de P#A Waters 2996 e Software Waters Empower 2 (Versão 6.00) Coluna: Fenomenex Luna C18 (2) à 4,6 x 50 rrtm 3 pm
Taxa de fluxo: 1,2 mlómin
Volume de Injeção: 10 μΐ
Fase móvel: Solvente A: 95 % de água com 5 % de
Acetato de Amónio; metanol e 10 mM pH~5,3
Solvente B: MeOH com 10 mM de Acetato de Amónio
Gradiente: manter a 0 % de B 3 min 0-47 % de B 3-4 min manter a 47 % de B 4-10 min 10-11 4 7 % - 74 % de B min 11-13,5 manter a 74 % de B min 13.5- retornar a 0 % de B 13,6 min 13.6- manter a 0 % de B 15,5 min
Sob estas condições, a pureza de 4, RP-4, e SP-4 foi determinada como sendo -99,6, ~99 ES , e -99,5 0, respetivamente. É indicado que purezas maiores podem ser conseguidas por meio da otimização dos métodos revelados acima. A inspeção dos #ifratogramas de XRP# mostra que os dois diastereoisõmeros de cristal único deram claramente padrões de XRP# diferentes. Adicionalmente, havia uma diferença clara no ponto de fusão dos dois diastereoisõmeros cristalinos, com RP-4 que tem um início consideravelmente mais alto que SP-4 (136 °C vs. 94 °C). Exemplo de Referência 29. Métodos de Separação Adicionais A seguinte separação de SFC (condições listadas a seguir) produziu uma separação adequada de uma mistura dos diastereõmeros, RP-4 e SP-4.
A seguinte separação de SFC (condições listadas a seguir) produziu uma separação adequada de uma mistura dos diastereõmeros, RP-4 e SP-4.
Quadro 16. Sumário dos resultados da caraterização de lote de Rp-4, 4, e SP-4.
Exemplo de Referência 30. Cristalografia de Raios X de 8 (Sp-isómero) O composto 8 (Sp-isómero) , 0ι8Η2ΐΝ2Ρ07, cristaliza no grupo de espaço monoclínico P2, (ausências sistemáticas OkO: k=ímpar) com a=5,3312(4)Ã, b=15,338S(8)Ã, c=23,7807(13)Ã, β = 92,891 (3) 0, V=1942,2(2)Ã3 , Z = 4, e άα3ιε=1;3 97 gócm3. Os dados de intensidade de raios X foram colhidos num detetor de área de CC# Bruker APEXII que utiliza radiação de Mo-Κα monocromada com grafite (λ=0,71073 Á) numa temperatura de 100(1)K. As Figuras 20A e 20B mostram moléculas numeradas 1 e 2, respetivamente, da unidade assimétrica. A indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de trinta e seis quadros de rotação de 0,5° com exposições de 30 segundos. Um total de 3608 quadros foi colhido com uma distância do cristal em relação ao detetor de 70,00 mm, larguras de rotação de 0,5° e exposições de 20 segundos:_
Os quadros de rotação foram integrados usando SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) produzindo uma lista de valores de F2 e a(F2) que não se fizeram a média que foram então passados ao pacote de programa SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc. , Madison, Wisconsin, USA.) para processamento posterior e solução de estrutura num computador #ell Pentium 4. Um total de 6909 reflexões foi medido ao longo dos intervalos 1,58 < Θ < 25,09°, -6 < h < 6, -18 < k < 18, -28 < 1 < 28 produzindo 6909 reflexões únicas (Rint = 0,0581). Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção usando SA#ABS (Sheldrick, G.M. (2007) SA#ABS. University of Gottingen, Alemanha.) (transmissão mínima e máxima 0,6093, 0,7452) . A estrutura foi resolvida por meio dos métodos diretos (SHELXS-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,112-122.)) . 0 refinamento foi por meio de mínimos quadrados de matriz total com base em F2 usando SHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64, 112-122.) . Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. 0 esquema de ponderação usado foi w=10 [σ2 (Fo"') À (Ο,ΟΟΟΟΡ)2 À 14,Q738P] onde P = (Fc2 À 2Fc2)Ó3. Os átomos de não hidrogénio foram refinados anisotropicamente e os átomos de hidrogénio foram refinados usando um modelo de equitação. 0 refinamento convergiu a RI = 0,0847 e wR2 = 0,1899 durante 6173 reflexões observadas para as quais F > 4o(F) e R1 = 0,Q963 e wR2 = 0,1963 e GOF = 1,119 para todas as 6909 reflexões não zero únicas e 512 variáveis (RI = Σ | | F01 - | Fc | j Ó E|F0|Ã wR2 = [Ew(F02 -
Fc2) 2ÓEw(Fo2) 2]1/ÍA GOF = [Ew(Fo2 - Fc2)2Ó(n - p)]1/á onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros refinados). Ο ΔΟσ máximo no ciclo final de mínimos quadrados foi 0,000 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram ÀQ,402 e -0,559 eÕÀ3. As Figs 20A e 20B são ORTEP (probabilidade de 30 % de elipsoides térmicos) de moléculas 1 e 2 da unidade assimétrica.
Quadro 17. Sumário de Determinação da Estrutura do Composto 8 (Sp-isómero)
Exemplo de Referência 32. Raios X Cristalografia de 2 -(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)-amino) propanoato de (S)-isopropilo, C18H17NPO5F5, cristaliza no grupo de espaço triclínico PI com a = 5,2641(6) Ã, b = 12,0548(13) Á, c = 16,4307(15) Ã, a; = 74,960(4)°, β = 83,959(4)°, y = 80,275(4)°, V = 990,40(18) Â3, Z = 2, e dcaic=l/520 gócm3. Os dados de intensidade de raios X foram colhidos num detetor de área de CC# Bruker APEXII que utiliza radiação Mo-Kcx monocromada com grafite (λ = 0,71073 Â) numa temperatura de 143(1)K. A indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de trinta e seis quadros de rotação de 0,5° com exposições de 20 segundos. Um total de 3593 quadros foi colhido com uma distância do cristal em relação ao detetor de 37,600 mm, larguras de rotação de 0,5° e exposições de 20 sequndos:
Os quadros de rotação foram integrados usando SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, EUA.), produzindo uma lista de valores de F2 e o{FA) que não se fizeram a média que foram então passados ao pacote de programa SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc. , Madison, Wisconsin, USA.) para processamento posterior e solução de estrutura num computador #ell Pentium 4. Um total de 17880 reflexões foi medido ao longo dos intervalos 1,77 < Θ > 25,12°, -6 < h < 6, -14 < k < 14, -19 < 1 < 19 produzindo 6897 reflexões únicas (Rint. = 0,0212) . Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção usando SA#ABS (Sheldrick, G.M. (2007) SA#ABS. University of Gottingen, Alemanha.) (transmissão mínima e máxima 0,6887, 0,7452). A estrutura foi resolvida por meio dos métodos diretos (SHELXS-97(Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,112-122.)) . 0 refinamento foi por meio de mínimos quadrados de matriz total com base em F2 usando SHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64, 112-122.). Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. O esquema de ponderação usado foi w=lÓ [σ2 (F02 )À (0,0344P)2À 0,11Q2P] onde P = (Fc2 À 2FC‘::)Ó3. Os átomos de não hidrogénio foram refinados anisotropicamente e os átomos de hidrogénio foram refinados usando um modelo de equitação. 0 refinamento convergiu a Rl=0,0259 e wR2=0,0609 durante 6527 reflexões observadas para as quais F > 4a(F) e RI = 0,0284 e wR2 = 0,0621 e GOF = 1,040 para todas as 6897 reflexões não zero únicas e 548 variáveis. (RI = Σ | | Fc | - | Fc | | Ó E|F0|Ã wR2 = Ew(F02-Fc2) 2Sw (Fo2)2] GOF = Ew(Fo2 - Fc2)2Õ(n - p) ] *Ã onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros refinados.) Ο ΔΟσ máximo no ciclo final de mínimos quadrados foi 0,001 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram Â0,254 e -0,236 eÕB3. As Figs. 22Ά e 22B são ORTEP (probabilidade de 30 % de elipsoides térmicos) de moléculas 1 e 2 da unidade assimétrica.
Quadro 18. Sumário de Determinação da Estrutura de 2-(((3)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)- isopropilo
Exemplo 33. Atividade Biológica
As células que contêm replicão foram semeadas em 3.000 célulasópoço (50 ml) em placas brancasóopacas de 96 poços, ou 1.500 célulasópoço (25 ml) em placas brancasóopacas de 384 poços. 50 μΐ de 2X composto foram adicionados na placa de 96 poços ou 25 μΐ de 2X composto foram adicionados na placa de 384 poços. As placas foram incubadas a 37 °C numa atmosfera de C02 a 5 % humidificada durante 4 dias. Após incubação, reagente Bright-Glo (50 μΐ para a placa de 96 poços, ou 25 μΐ para a placa de 384 poços) foi adicionado para medir o repórter de luciferase de pirilampo para replicação de VHC. A percentagem de inibição foi calculada contra o controlo não fãrmaco.
0 Rp-4 e Sp-4 demonstraram ter ampla cobertura de genótipo. Por exemplo, ambos mostraram ser ativos contra o vírus da hepatite C, genótipos 1-4.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Claims (2)

REIVINDICAÇÕES
1. Um processo para preparar 2-(((S)~ (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo cristalino representado pela fórmula
que compreende: cristalizar 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S)-isopropilo a partir de uma segunda composição que compreende a) uma primeira composição b) pentafluorofenolà c) uma base não nucleofílicaà e d) uma composição líquidaà em que a primeira composição compreende 2-(((S)~ (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de (S)-isopropilo e 2-(((R)- (perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil) amino)propanoato de (S) -isopropilo, e em que a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um anti-solvente.
2. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que a cristalização ocorre numa temperatura que varia de -10 °C a À40 °C, 3. 0 processo de acordo com a reivindicação 2, em que a cristalização ocorre à temperatura ambiente. 4. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que a base não nucleofílica é selecionado a partir de entre carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropiletilamina, trietilamina, quinuclidina, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-Ci-S-alquil-piridina, uma 2,4,6-tri-Ci-6-alquil-piridina, 1,5-diazabiciclo[4,3.0]non-5-eno, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, e misturas dos mesmos. 5. 0 processo de acordo com a reivindicação 4, em que a base não nucleofílica é trietilamina. 6. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que a composição líquida compreende pelo menos um de um éter C2 a C8, um éster C3 a C7, e um hidrocarboneto saturado C5 a Ci2. 7. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que a composição líquida compreende pelo menos um de acetato de etilo, t-butil-metiléter, e hexano.
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