CN107402267A

CN107402267A - 一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法

Info

Publication number: CN107402267A
Application number: CN201710611641.4A
Authority: CN
Inventors: 严宾; 冯成亮
Original assignee: Nantong Textile Vocational Technology College
Current assignee: Nantong Textile Vocational Technology College
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2017-11-28

Abstract

本发明涉及一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法，包括样品配制、样品测定和含量计算，其中，样品测定选用岛津LC‑20AT高效液相色谱仪且配二极管阵列检测器，CHIRALCEL AD‑H 250mm×4.6mm，5μm正相色谱柱，20℃柱温，20µl进样量，260nm检测波长，1.0ml/min流速，流动相：A相为正己烷，B相为乙醇，梯度洗脱程序：0～35min，B相从15%升至25%，A相从85%降至75%；35～36min，B相从25%降至15%，A相从75%升至85%；柱后平衡9min。本发明的优点在于：本发明检测方法中溶剂不干扰非对映异构体检测，样品中无干扰非对映异构体测定的峰，方法专属性良好，且该检测方法简便、快速、准确、灵敏度高、准确度好、重复性好。

Description

一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法

技术领域

本发明属于化学检测领域，特别涉及一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法。

背景技术

索氟布韦是治疗丙肝的全口服新药，是丙型肝炎病毒（HCV）核苷酸NS5B聚合酶抑制剂，作为联合抗病毒治疗的一部分用于治疗慢性丙型肝炎（CHC）感染，治疗持续周期短，临床效果非常好。

但是索氟布韦的非对映异构体及杂质的含量对索氟布韦的质量及用药安全有很大的影响，SF-Z1、SF-Z2、SF-Z3为索氟布韦的非对映异构体，各结构式参见式（I）～式（III），

、、

（I）（II）

，

（III）

SF-正丙酯为索氟布韦的工艺杂质，结构式参见式（IIII），

（IIII），

在有关物质色谱条件下分离不佳，为控制质量，急需建立一种正相高效液相色谱法同时测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法，该检测方法中溶剂不干扰非对映异构体检测，样品中无干扰非对映异构体测定的峰，方法专属性良好，且该检测方法简便、快速、准确、灵敏度高、准确度好、重复性好。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法，其创新点在于：包括样品配制、样品测定和含量计算，具体包括以下步骤：

（1）空白溶剂：选用HPLC级乙醇作为空白溶剂；

（2）非对映异构体SF-Z1定位溶液配制：取非对映异构体SF-Z1约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；

（3）非对映异构体SF-Z2定位溶液配制：取非对映异构体SF-Z2约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；

（4）非对映异构体SF-Z3定位溶液配制：取非对映异构体SF-Z3约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；

（5）杂质SF-正丙酯定位溶液配制：取杂质SF-正丙酯约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；

（6）系统适用性溶液配制：取索氟布韦对照品、非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3和杂质SF-正丙酯适量，精密称定，用乙醇溶解并稀释制成含1mg/ml的索氟布韦、含1μg/ml的非对映异构体SF-Z1、含1μg/ml的非对映异构体SF-Z2、含1μg/ml的非对映异构体SF-Z3和含1μg/ml的杂质SF-正丙酯的溶液，作为系统适用性溶液；

（7）对照溶液配制：取索氟布韦对照品、非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3和杂质SF-正丙酯适量，精密称定，用乙醇溶解并稀释制成含1μg/ml索氟布韦、含1μg/ml的非对映异构体SF-Z1、含1μg/ml的非对映异构体SF-Z2、含1μg/ml的非对映异构体SF-Z3和含1μg/ml的杂质SF-正丙酯的溶液，作为对照溶液；

（8）样品测定：选用岛津LC-20AT高效液相色谱仪且配二极管阵列检测器，CHIRALCELAD-H 250mm×4.6mm，5μm正相色谱柱，20℃柱温，20µl进样量，260nm检测波长，1.0ml/min流速，流动相：A相为正己烷，B相为乙醇，梯度洗脱程序：0～35min，B相从15%升至25%，A相从85%降至75%；35～36min，B相从25%降至15%，A相从75%升至85%；柱后平衡9min，分别吸取空白溶剂、非对映异构体SF-Z1定位溶液、非对映异构体SF-Z2定位溶液、非对映异构体SF-Z3定位溶液、杂质SF-正丙酯定位溶液、系统适用性溶液、对照溶液、样品溶液各20µl，注入高效液相色谱仪，记录各色谱图；；

（9）含量计算：根据各色谱图，通过外标法计算样品中各非对映异构体及杂质的含量：

，A_异构体表示供试品溶

液色谱图中异构体的峰面积；A_对照表示对照溶液色谱图中异构体的峰面积；C_供试表示供试品溶液的浓度；C_对照表示对照溶液中异构体的浓度；且供试品溶液的色谱图如有异构体的峰，按外标法计算不得大于0.1%。

本发明的优点在于：本发明由于采用了上述的技术方案，建立了同时测定索氟布韦原料药中SF-Z1非对映异构体、SF-Z2非对映异构体、SF-Z3非对映异构体及SF-正丙酯杂质的正相高效液相色谱分析方法，试样采用岛津LC-20AT高效液相色谱仪，CHIRALCEL AD-H250mm×4.6mm，5μm正相色谱柱进行测定，并考察和优化了仪器测定条件，结果表明，SF-Z1非对映异构体在0.20μg/ml～2.01μg/ml范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.998，SF-Z2非对映异构体在0.24μg/ml～2.39μg/ml范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.998，SF-Z3非对映异构体在0.19μg/ml～1.91μg/ml范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.998，及SF-正丙酯杂质在0.19μg/ml～1.94μg/ml范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.998；非对映异构体和杂质的回收率在90%～108%之间，该检测方法的回收率良好；此外，本发明检测方法中溶剂不干扰非对映异构体检测，样品中无干扰非对映异构体测定的峰，方法专属性良好，且该检测方法简便、快速、准确、灵敏度高、准确度好、重复性好。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明中空白溶剂的色谱图。

图2为本发明中非对映异构体SF-Z1定位溶液的色谱图。

图3为本发明中非对映异构体SF-Z2定位溶液的色谱图。

图4为本发明中非对映异构体SF-Z3定位溶液的色谱图。

图5为本发明中非SF-正丙酯定位溶液的色谱图。

图6为本发明中系统适用性溶液的色谱图。

图7为本发明中对照溶液的色谱图。

图8为本发明中样品溶液的色谱图。

图9为本发明中检测限溶液的色谱图。

图10为本发明中定量限溶液的色谱图。

图11～图15为非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3、杂质SF-正丙酯及索氟布韦线性溶液的标准曲线图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

本发明正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法，具体在于：包括样品配制、样品测定和含量计算，所述样品配制步骤如下：

实施例1

本发明方法的专属性试验：

取空白溶剂（HPLC级乙醇），精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图1。

精密量取非对映异构体SF-Z1定位溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图2。

精密量取非对映异构体SF-Z2定位溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图3。

精密量取非对映异构体SF-Z3定位溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图4。

精密量取SF-正丙酯定位溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图5。

精密量取系统适用性溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图6。

精密量取对照溶液20µl注入液相色谱仪对照溶液，记录色谱图7。

精密量取样品溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图8。

由图1～图8可知，空白溶剂不干扰本品测定，样品中无干扰非对映异构体测定的峰。索氟布韦、索氟布韦中各非对映异构体及杂质间分离度均大于1.2。

实施例2

本发明方法的检测限试验：

取索氟布韦、SF-Z1、SF-Z2、SF-Z3及SF-正丙酯适量，加乙醇逐级稀释，按信噪比约3为检测限溶液，然后精密量取各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图9，并记录结果，见表1。

表1 索氟布韦、SF-Z1、SF-Z2、SF-Z3及SF-正丙酯检测限结果

实施例3

本发明方法的定量限试验：

取索氟布韦、SF-Z1、SF-Z2、SF-Z3及SF-正丙酯适量，加乙醇逐级稀释，按信噪比约10为定量限溶液，然后精密量取各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图10，并记录结果，见表2。

表2 索氟布韦、SF-Z1、SF-Z2、SF-Z3及SF-正丙酯定量限结果

实施例4

本发明方法的线性和范围：

取非对映异构体SF-Z1适量分别配置浓度为0.20μg/ml、0.50μg/ml、0.80μg/ml、1.00μg/ml、1.51μg/ml、2.01μg/ml的对映异构体对照品线性溶液。

取非对映异构体SF-Z2适量分别配置浓度为0.24μg/ml、0.60μg/ml、0.76μg/ml、1.19μg/ml、1.79μg/ml、2.39μg/ml的对映异构体对照品线性溶液。

取非对映异构体SF-Z3适量分别配置浓度为0.19μg/ml、0.48μg/ml、0.76μg/ml、0.95μg/ml、1.43μg/ml、1.91μg/ml的对映异构体对照品线性溶液。

取非对映异构体SF-正丙酯适量分别配置浓度为0.19μg/ml、0.49μg/ml、0.78μg/ml、0.97μg/ml、1.45μg/ml、1.94μg/ml的对映异构体对照品线性溶液。

取索氟布韦适量分别配置浓度为0.20μg/ml、0.50μg/ml、0.81μg/ml、1.01μg/ml、1.51μg/ml、2.02μg/ml的对映异构体对照品线性溶液。

分别精密量取各浓度的线性溶液20μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图；以浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3、杂质SF-正丙酯及索氟布韦线性溶液的标准曲线，各标准曲线图见图11～15，结果见表4～表8。

表4 非对映异构体SF-Z1线性试验结果

由表4可知，非对映异构体SF-Z1在浓度为0.20μg/ml～2.01μg/ml范围内相关系数大于0.998，截距比小于25%，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。

表5 非对映异构体SF-Z2线性试验结果

由表5可知，非对映异构体SF-Z2在浓度为0.24μg/ml～2.39μg/ml范围内相关系数大于0.998，截距比小于25%，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。

表6 非对映异构体SF-Z3线性试验结果

由表6可知，非对映异构体SF-Z3在浓度为0.19μg/ml～1.91μg/ml范围内相关系数大于0.998，截距比小于25%，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。

表7 杂质SF-正丙酯线性试验结果

由表7可知，杂质SF-正丙酯在浓度为0.19μg/ml～1.94μg/ml范围内相关系数大于0.998，截距比小于25%，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。

表8 索氟布韦线性试验结果

由表8可知，索氟布韦在浓度为0.20μg/ml～2.02μg/ml范围内相关系数大于0.9997，截距比小于25%，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。

实施例5

本发明方法的准确度试验：

取索氟布韦对照品、非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3和杂质SF-正丙酯适量，用乙醇溶解并稀释制成含索氟布韦（1mg/ml）、非对映异构体SF-Z1（1μg/ml）、非对映异构体SF-Z2（1μg/ml）和非对映异构体SF-Z3（1μg/ml）、杂质SF-正丙酯（1μg/ml）的溶液，作为系统适用性溶液；取索氟布韦对照品、非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3和杂质SF-正丙酯适量，用乙醇溶解并稀释制成含索氟布韦（1μg/ml）、非对映异构体SF-Z1（1μg/ml）、非对映异构体SF-Z2（1μg/ml）和非对映异构体SF-Z3（1μg/ml）、杂质SF-正丙酯（1μg/ml）的溶液，作为对照溶液。

取非对映异构体SF-Z1、非对映异构体SF-Z2、非对映异构体SF-Z3、正丙酯适量，精密称定，加乙醇适量溶解并稀释成每1ml约含10μg的异构体溶液，作为异构体储备液。

取索氟布韦原料药约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加异构体储备液0.5ml，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，平行配制3份。

取索氟布韦原料药约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加异构体储备液1ml，加乙醇相溶解并稀释至刻度，混匀，平行配制3份。

取索氟布韦原料药约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加异构体储备液1.5ml，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，平行配制3份。

精密量取供试品溶液各20µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算回收率，结果见表9～表12。

表9 非对映异构体SF-Z1准确度试验结果

由表9可知，回收率在90%～108%之间，该检测方法的回收率良好；平均回收率为100.6%，该方法的准确度良好。

表10 非对映异构体SF-Z2准确度试验结果

由表10可知，回收率在90%～108%之间，该检测方法的回收率良好；平均回收率为97.8%，该方法的准确度良好。

表11 非对映异构体SF-Z3准确度试验结果

由表11可知，回收率在90%～108%之间，该检测方法的回收率良好；平均回收率为101.5%，该方法的准确度良好。

表12 杂质SF-正丙酯准确度试验结果

由表12可知，回收率在90%～108%之间，该检测方法的回收率良好；平均回收率为102.2%，该方法的准确度良好。

实施例6

本发明方法的重复性试验：

取索氟布韦原料药约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为供试品溶液，平行配制6份；精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定结果，考察重复性，结果见表13。

表13 重复性试验结果

由上表可以看出，该测定法重复性较好。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法，其特征在于：包括样品配制、样品测定和含量计算，具体包括以下步骤：

（1）空白溶剂：选用HPLC级乙醇作为空白溶剂；

（8）样品溶液配制：取索氟布韦原料药适量，精密称定，加乙醇溶解并稀释成每1ml中含索氟布韦1mg的溶液，作为样品溶液；

（9）样品测定：选用岛津LC-20AT高效液相色谱仪且配二极管阵列检测器，CHIRALCELAD-H 250mm×4.6mm，5μm正相色谱柱，20℃柱温，20µl进样量，260nm检测波长，1.0ml/min流速，流动相：A相为正己烷，B相为乙醇，梯度洗脱程序：0～35min，B相从15%升至25%，A相从85%降至75%；35～36min，B相从25%降至15%，A相从75%升至85%；柱后平衡9min，分别吸取空白溶剂、非对映异构体SF-Z1定位溶液、非对映异构体SF-Z2定位溶液、非对映异构体SF-Z3定位溶液、杂质SF-正丙酯定位溶液、系统适用性溶液、对照溶液、样品溶液各20µl，注入高效液相色谱仪，记录各色谱图；

（10）含量计算：根据各色谱图，通过外标法计算样品中各非对映异构体及杂质的含量：

，A_异构体表示供试品溶液色谱图中异构体的峰面积；A_对照表示对照溶液色谱图中异构体的峰面积；C_供试表示供试品溶液的浓度；C_对照表示对照溶液中异构体的浓度；供试品溶液的色谱图如有异构体的峰，按外标法计算不得大于0.1%。