CN112213418A - 索非布韦中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种索非布韦中有关物质的检测方法。本发明采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；检测波长258‑262nm，流动相A：磷酸二氢钾‑四丁基溴化铵‑水，流动相B为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱。本发明提供的检测方法能够实现主成分与已知杂质、以及多个未知杂质之间的有效分离，且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，能够用更为简便的方法实现对索非布韦原料中更多杂质的定性和定量，为提高和更好地控制索非布韦制剂产品的质量提供了可靠保障。

Description

索非布韦中有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其涉及一种索非布韦中有关物质的检测方法。
背景技术
索非布韦(又名索弗布韦，英文名Sofosbuvir，商品名Sovaldi)是吉利德公司开发的用于治疗慢性丙肝的药物，于2013年12月6日经美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国上市，2014年1月16日经欧洲药品管理局(EMEA)批准在欧盟各国上市。该药物是首个无需联合干扰素就能安全有效治疗某些类型丙肝的药物。临床试验证实针对1型和4型丙肝，该药物联合聚乙二醇干扰素和利巴韦林的总体持续病毒学应答率(SVR)高达90％；针对2型丙肝，该药物联合利巴韦林的SVR可达85-95％；针对3型丙肝，该药物联合利巴韦林的SVR可达61-63％。上述复方药物更安全，疗效更加，且可以彻底根除丙肝病毒，被医学界视为治疗丙肝的突破性药物。
有关物质是在药物合成生产过程中带入的起始物料、中间体、副反应产物和降解杂质等，其影响着药物的产品质量，甚至还会造成严重的不良反应。有关物质的检测方法的开发是药品质量研究中的重要部分，能够提高药物安全性、有效性与质量可控性。采用现有索非布韦有关物质的检测方法对原料破坏样品中的有关物质进行分析，发现一些风险杂质被包含在主峰中，有关物质并不能得到有效分离，现有检测方法并不能真实反映药品的质量。因此，研发一种能够检测索非布韦中有关物质的分析方法，尽可能多的检测出其含有的杂质，对于提高索非布韦制剂产品的质量以及提高患者用药安全性具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种索非布韦中有关物质的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种索非布韦中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
UV检测器，检测波长258-262nm；
流动相A：磷酸二氢钾-四丁基溴化铵-水，流动相B为乙腈；
洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：
0-4min，75％流动相A，25％流动相B；
4-20min，75％→40％流动相A，25％→60％流动相B；
20-28min，40％→30％流动相A，60％→70％流动相B。
相对于现有技术，本发明提供的索非布韦中有关物质的检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以磷酸二氢钾-四丁基溴化铵-水作为流动相A，以乙腈作为流动相B，通过高效液相色谱法以特定的梯度洗脱的方式，能够实现索非布韦中主成分与多个已知杂质、未知杂质的有效分离，准确定性及定量检测出索非布韦中多个已知杂质和未知杂质，且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏度、准确度、重现性较好，杂质的检测限和定量限低，能够实现对索非布韦中更多杂质的定性和定量检测，为提高和更好地控制索非布韦制剂产品的质量提供了可靠保障。
本发明中有关物质是指在索非布韦的合成工艺中引入的或降解生成的杂质，其中，已知杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G、杂质H和杂质I，各已知杂质的结构式下表所示。
Figure BDA0002687504960000031
Figure BDA0002687504960000041
优选的，流速为0.9-1.1mL/min，柱温30-40℃。
更优选的，检测波长为260nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
优选的，进样体积为10μL。
优选的检测条件可使索非布韦中的主成分、未知杂质以及已知杂质之间达到更高的分离度，可以保证多种杂质的有效检出，从而实现对索非布韦中有关物质的定量检测。
优选的，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为9-11mmol/L，四丁基溴化铵的浓度为0.9-1.1mmol/L。
更优选的，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为10mmol/L，四丁基溴化铵的浓度为1.0mmol/L。
优选的，所述梯度洗脱的程序为：
0-4min，75％流动相A，25％流动相B；
4-20min，75％→40％流动相A，25％→60％流动相B；
20-28min，40％→30％流动相A，60％→70％流动相B；
28-28.01min，30％→75％流动相A，70％→25％流动相B；
28.01-35min，75％流动相A，25％流动相B。
优选的流动相配合优选的梯度洗脱，在不产生基线干扰的前提下，能够更好地检测出索非布韦中的杂质，有利于有关物质的检出，并且有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。
优选的，所述色谱柱的规格为250*4.6mm，填料直径为5μm。
更优选的，所述色谱柱为Hypersil BDS C18，4.6*250mm，5μm。
优选的色谱柱规格可以使各组分峰形、分离度及检测的灵敏度俱佳，且基线干扰较小，从而有利于索非布韦与杂质有效分离，且结果准确可靠，重复性好。
优选的，所述供试品溶液的浓度为1.0mg/mL。
优选的供试品浓度有利于使主成分及杂质的峰形更好，柱效高，积分更准确，从而有利于对供试品中杂质的含量进行更准确的计算。
本发明提供的检测方法，能够实现索非布韦中的7种已知杂质、多个未知杂质和主成分之间的有效分离，准确定性及定量检测索非布韦中杂质情况，检出的杂质种类、数量均高于现有方法。
附图说明
图1为实施例2中2.1专属性项下系统适用性溶液的色谱图；
图2为实施例2中2.1专属性项下自身对照溶液的色谱图；
图3为实施例2中2.1专属性项下杂质A定位溶液的色谱图；
图4为实施例2中2.1专属性项下杂质B定位溶液的色谱图；
图5为实施例2中2.1专属性项下杂质C定位溶液的色谱图；
图6为实施例2中2.1专属性项下杂质D定位溶液的色谱图；
图7为实施例2中2.1专属性项下杂质G定位溶液的色谱图；
图8为实施例2中2.1专属性项下杂质H定位溶液的色谱图；
图9为为实施例2中2.1专属性项下杂质I定位溶液的色谱图；
图10为实施例2中2.2强制降解试验项下酸破坏的供试品溶液的色谱图；
图11为实施例2中2.2强制降解试验项下高温破坏的供试品溶液的色谱图；
图12为实施例2中2.2强制降解试验项下光照破坏的供试品溶液的色谱图；
图13为实施例2中2.2强制降解试验项下碱破坏的供试品溶液的色谱图；
图14为实施例2中2.2强制降解试验项下高湿破坏的供试品溶液的色谱图；
图15为实施例2中2.2强制降解试验项下氧化破坏的供试品溶液的色谱图；
图16为实施例2中2.2强制降解试验项下未破坏的供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
材料与方法：
仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器，量瓶，电子天平。
试剂：乙腈、磷酸二氢钾、四丁基溴化铵、索非布韦对照品(石家庄凯瑞德医药科技发展有限公司，含量99.82％)，杂质A(含量97.68％)，杂质B(含量98.13％)，杂质C(含量98.50％)，杂质D(含量99.12％)，杂质G(含量95.53％)，杂质H(含量99.90％)，杂质I(含量99.92％)。
本发明中所用乙腈为市售色谱纯，磷酸二氢钾为市售分析纯，四丁基溴化铵为色谱级。杂质A-杂质I均为市售产品。
空白溶剂/稀释剂：体积比为3:1的流动相A-乙腈。
1.1溶液的配制
供试品溶液：精密称取索非布韦原料10.08mg，置10mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL的供试品溶液。
自身对照溶液：精密量取上述供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液1mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得1μg/mL的自身对照溶液。
杂质定位溶液：
分别称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G、杂质H和杂质I各约10mg，精密称定，分别置于100mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备液；分别精密量取上述杂质对照品储备液各1mL，分别置于10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，分别得到10μg/mL的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G、杂质H和杂质I定位溶液。
混合杂质对照溶液：分别精密量取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G、杂质H对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得10μg/mL的混合杂质对照溶液。
系统适用性溶液：精密称取索非布韦标准品10.19mg，置10mL量瓶中，加少量稀释剂溶解，再精密量取上述混合杂质对照溶液1mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液，其中各杂质浓度为1μg/mL，索非布韦浓度为1mg/mL。
高效液相色谱的条件：
色谱柱：Hypersil BDS C18(4.6×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；柱温，35℃；供试品溶液浓度：1.0mg/ml；进样量：10μL；流动相A相：磷酸二氢钾1.36g与四丁基溴化铵0.322g溶于1000mL水中，抽滤，即得，流动相B相：乙腈。
按下列梯度程序进行洗脱：
Figure BDA0002687504960000071
Figure BDA0002687504960000081
计算方法：自身对照法计算杂质含量
计算公式：
Figure BDA0002687504960000082
A杂质：供试品溶液中杂质的峰面积；
A对照：索非布韦自身对照溶液的峰面积；
F：该杂质的校正因子。
校正因子测定：
由主成分与各杂质的线性回归方程计算各杂质的校正因子F，计算公式如下：杂质校正因子＝主成分斜率/杂质斜率。
实施例2
方法学验证：
2.1专属性试验
精密量取空白溶液、自身对照溶液、上述各杂质定位溶液、系统适用性溶液各10μL，分别按照上述高效液相色谱条件进样检测，记录色谱图，其中自身对照溶液和系统适用性溶液中，索非布韦的出峰时间分别为14.088min和14.080min，各杂质溶液的保留时间和系统适用性溶液中各杂质的保留时间，结果如表1所示，系统适用性溶液的色谱图如图1所示。
表1系统适用性试验结果
Figure BDA0002687504960000083
Figure BDA0002687504960000091
试验结果表明，基线平稳无干扰，空白溶剂对杂质及主成分检测无干扰；系统适用性符合要求，各峰间分离度均大于2.0，系统适用性溶液中各杂质的保留时间与单独杂质定位溶液的保留时间一致，表明本方法专属性良好，适合有关物质的检查。
2.2强制降解试验
对原料药进行酸、碱、氧化、高温、高湿、光照等降解试验，各降解试验方法如下。正常处理及降解后的供试品溶液用DAD检测器检测，检测波长为190-400nm，分别测试供试品溶液中索非布韦主峰的纯度角和纯度阈值，考察降解杂质是否干扰主峰的测定。
空白溶剂/稀释剂：流动相A(磷酸二氢钾1.36g与四丁基溴化铵0.322g溶于1000ml水中，抽滤)-乙腈(3:1)(V/V)
系统适用性溶液：同专属性项下系统适用性溶液。
未破坏溶液：精密称取索非布韦原料11.07mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
酸空白溶液：取稀释剂2mL，置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1mL，室温放置1h，加1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
酸破坏溶液：精密称取索非布韦原料10.58mg，置10mL量瓶中，加稀释剂2mL使溶解，加1mol/L盐酸溶液1mL，室温放置1h，加1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
碱空白溶液：取稀释剂2mL，置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL，室温放置2min，加0.1mol/L盐酸溶液1mL中和，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏溶液：精密称取索非布韦原料11.52mg，置10mL量瓶中，加稀释剂2mL使溶解，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL，室温放置2min，加0.1mol/l盐酸溶液1mL中和，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化空白溶液：取稀释剂2mL，置10ml量瓶中，加30％过氧化氢1mL，室温放置8h，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏溶液：精密称取索非布韦原料10.64mg，置10mL量瓶中，加稀释剂2mL使溶解，加30％过氧化氢1mL，室温放置8h，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏溶液：精密称取索非布韦原料10.21mg，置10mL量瓶中，放于150℃烘箱中7h后，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
高湿破坏溶液：取索非布韦原料药适量，置称量瓶中，敞口放置在室温、90％RH环境10天后，精密称取10.44mg，置10mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
光照破坏溶液：取索非布韦原料药适量，置称量瓶中，敞口放置光照培养箱(照度为4500lx)10天后，精密称取9.79mg，置10mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法：
取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图,计算各杂质的含量，试验结果见表2。
表2强制降解试验结果
Figure BDA0002687504960000111
Figure BDA0002687504960000121
结论：通过上述结果可知，索非布韦在氧化、高湿、光照条件下稳定，峰纯度检查表明，各破坏条件下主峰是纯的，说明本品降解杂质不干扰索非布韦的测定，本方法的专属性较强，满足检测的要求。
2.3检测限和定量限
根据专属性试验中各杂质的信噪比，将各杂质对照品储备液逐步稀释，分别测其定量限(S/N≥10)、检测限(S/N≥3)，将定量限溶液连续进样5次，计算峰面积的RSD值，将检测限溶液重复进样2次，记录色谱图，结果见表3-表7。
表3定量限重复进样峰面积结果
序号 1 2 3 4 5 均值 RSD(％)
杂质A 1.2 1.1 1.1 1.2 1.2 1.2 4.7
杂质B 1.2 1.2 1.1 1.0 1.1 1.1 7.5
杂质C 1.3 1.3 1.3 1.4 1.4 1.3 4.1
杂质D 1.8 1.8 1.6 1.7 2.0 1.8 8.3
杂质G 1.2 1.3 1.3 1.1 1.4 1.3 9.0
杂质H 1.2 1.4 1.3 1.3 1.2 1.3 6.5
索非布韦 2.2 2.1 1.9 1.9 2.0 2.0 6.5
表4定量限重复进样保留时间结果
Figure BDA0002687504960000131
表5定量限重复进样信噪比结果
序号 1 2 3 4 5 均值 RSD(％)
杂质A 13.3 12.6 12.0 12.1 10.5 12.1 8.5
杂质B 11.7 11.8 12.9 12.6 12.6 12.3 4.3
杂质C 13.2 10.7 11.6 14.7 14.4 12.9 13.5
杂质D 10.4 10.5 13.4 12.2 9.6 11.2 13.8
杂质G 11.6 10.8 11.8 11.2 9.8 11.0 7.2
杂质H 12.7 9.9 13.3 10.0 11.2 11.4 13.5
索非布韦 11.5 12.8 10.0 10.5 12.9 11.5 11.4
表6检测限重复进样信噪比结果
序号 1 2 均值
杂质A 3.2 2.6 2.9
杂质B 3.6 3.3 3.5
杂质C 4.1 3.1 3.6
杂质D 3.0 4.1 3.6
杂质G 3.3 4.6 4.0
杂质H 2.8 2.9 2.9
索非布韦 3.8 4.5 4.2
表7检测限与定量限试验结果
Figure BDA0002687504960000151
试验结果表明，索非布韦、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G和杂质H的检测限浓度分别是0.35ng、0.55ng、0.36ng、0.36ng、0.71ng、0.36ng、0.18ng；定量限浓度分别是1.01g、1.56ng、1.03g、1.02gL、2.02ng、0.50ng、0.36ng，各个杂质的检测限均小于样品浓度的0.007％，定量限小于样品浓度的0.02％，说明本方法灵敏度高。
2.4线性范围
按对照品溶液浓度的定量限到规定限度的150％，分别配制一系列不同水平浓度的溶液：
线性储备液：精密称取索非布韦对照品10.03mg，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G对照品储备液各1mL，精密量取杂质H对照品储备液5mL，置同一50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质H：10μg/mL，其他：2μg/mL)。
线性1：精密量取线性储备液1mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(20％)。
线性2：精密量取线性储备液2.5mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(50％)。
线性3：精密量取线性储备液3.5mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(70％)。
线性4：精密量取线性储备液5mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(100％)。
线性5：精密量取线性储备液6mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(120％)。
线性6：精密量取线性储备液7.5mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(150％)。
精密量取上述线性溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积y为纵坐标、浓度x(单位：μg/ml)为横坐标作线性回归，结果见表8。
表8
Figure BDA0002687504960000161
Figure BDA0002687504960000171
结论：各杂质在即定的浓度范围内线性关系良好，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G和杂质H的校正因子分别为1.00、0.59、0.77、1.00、0.74和0.39，均在0.2-5.0范围内，符合关于校正因子的要求。
2.5精密度
2.5.1重复性
空白溶剂和系统适用性溶液同专属性项下。
杂质对照品溶液1：分别精密量取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G对照品储备液各1mL、杂质H对照品储备液5mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(杂质H：5μg/mL，其他：1μg/mL)。
杂质对照品溶液2：分别精密量取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G对照品储备液各1mL、杂质H对照品储备液5mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(杂质H：5μg/mL，其他：1μg/mL)。
供试品溶液：精密称取索非布韦原料10.56mg、10.18mg、10.23mg、10.62mg、10.34mg、10.08mg，分别置10mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
自身对照溶液：精密量取各供试品溶液1mL，分别置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述各溶液1mL，分别置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(1μg/mL)。
测定方法：
精密量取上述各溶液10μL，分别进样，杂质对照品溶液1重复进样5针，杂质对照品溶液2重复进样2针，记录色谱图，结果如表9-表10所示。
表9重复性实验结果(杂质对照品外标法)
Figure BDA0002687504960000181
Figure BDA0002687504960000191
表10重复性实验结果(杂质自身对照法)
Figure BDA0002687504960000192
结论：同批样品配制6份溶液，各杂质含量通过用对照品外标法以及自身对照法计算结果，两种方法结果基本一致，其RSD均小于10.0％，表明本法重复性良好。
2.5.2中间精密度
两位分析人员，在不同日期，使用不同的液相色谱仪在不同日期检测同批索非布韦供试品，每人平行配制6份浓度1.0mg/mL的供试品溶液，考察其杂质含量，分别以对照品外标法及自身对照法峰面积计算杂质含量，结果如表11-表12所示。
表11中间精密度实验数据(杂质对照品外标法)
Figure BDA0002687504960000201
表12中间精密度试验结果(杂质自身对照法)
Figure BDA0002687504960000211
结论：两种方法的计算结果基本一致，12份供试品的测定中，各杂质含量的RSD均不大于15.0％，表明本法中间精密度良好。
2.6准确度
供试品储备液：精密称取索非布韦原料101.27mg，置10mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品储备液：精密量取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G对照品储备液各1mL，精密量取杂质H对照品储备液5mL，置同一50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密量取供试品储备液1mL，置10mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液1：精密称取索非布韦对照品10.47mg，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G对照品储备液各1mL、杂质H对照品储备液5mL，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(杂质H：5μg/mL，其他：1μg/mL)。
杂质对照品溶液2：精密称取索非布韦对照品10.35mg，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G对照品储备液各1mL、杂质H对照品储备液5mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(杂质H：5μg/mL，其他：1μg/mL)。
回收率溶液：
80％：精密量取对照品储备液4mL、供试品储备液1mL，置于10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
100％：精密量取对照品储备液5mL、供试品储备液1mL，置于10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
120％：精密量取对照品储备液6mL、供试品储备液1mL，置于10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
上述80％、100％、120％三个不同浓度样品分别平行配置制备3份，依法进样，记录色谱图中各杂质的峰面积，计算9个样品各浓度的平均回收率及回收率的RSD值，结果如表13所示。
Figure BDA0002687504960000231
表13回收率试验结果(方法1为对照品外标法，方法2自身对照法)
Figure BDA0002687504960000232
Figure BDA0002687504960000241
Figure BDA0002687504960000251
结论：各杂质回收率均在80％～120％范围内，且RSD小于10.0％，采用两种不同方法计算的回收率结果基本一致，表明本法准确度较好。
2.7溶液稳定性
供试品溶液：精密称取索非布韦对照品10.30mg，置10mL量瓶中，加少量稀释剂溶解，再精密量取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质G、杂质H对照品储备液各0.1mL，至同一量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。(杂质：1μg/mL，索非布韦：1mg/mL)。
取上述溶液分别在室温放置0、1、2、4、6、10、16、24h后进样，记录色谱图，结果如表14所示。
表14溶液稳定性考察结果
Figure BDA0002687504960000252
Figure BDA0002687504960000261
结果表明：样品溶液在室温放置24h内进样，各杂质峰面积及主峰面积的RSD均小于10.0％，且没有新的杂质产生，表明在样品溶液在室温条件24小时内稳定。
2.8耐用性
供试品溶液：精密称取索非布韦原料10.73mg，置10mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
自身对照溶液：精密量供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法：
考察测定条件发生微小波动情况下测定结果的稳定性，考察了本系统其他条件不变，改变如下条件对测定结果的影响。
改变流速±0.1mL/min(0.9mL/min、1.1mL/min)
改变柱温±5℃(30℃、40℃)
改变波长±2nm(258nm、262nm)
改变流动相磷酸盐浓度(9mM、11mM)
改变四丁基溴化铵浓度(0.9mM、1.1mM)
精密量取上述溶液各10μL，分别在上述条件下进样，记录色谱图，，试验结果见表15。
表15耐用性试验结果
Figure BDA0002687504960000262
Figure BDA0002687504960000271
结论：测定条件(波长、流速、柱温、磷酸盐浓度、四丁基溴化铵浓度)微小变化，样品检测结果基本一致，表明方法耐用性良好。
对比例1
将本发明实施例中的Hypersil BDS C18，4.6*250mm，5μm替换为Intersil ODS-3(4.6*250mm，5μm)色谱柱，其他色谱条件不变，对1mg/mL索非布韦供试品溶液进行检测，检测结果如表16所示。可以看出，替换的色谱柱中杂质G与索非布韦主成分未分开，未知杂质的检出量小于本发明中使用的色谱柱。
表16
色谱柱 杂质A 杂质C 杂质G 杂质H 未知杂质
Hypersil BDS C18 0.00333 0.00777 0.0105 0.00249 0.059
Intersil ODS-3 0.0029 0.0068 未检出 0.0021 0.042
对比例2
将本发明实施例中流动相A中的四丁基溴化铵替换为四丁基氢氧化铵，其他色谱条件不变，对1mg/mL索非布韦供试品溶液进行检测，检测结果如表17所示。可以看出，更换离子对试剂后杂质A出峰偏小，检出能力变弱。
表17
离子对试剂 杂质A 杂质C 杂质G 杂质H 未知杂质
四丁基溴化铵 0.00333 0.00777 0.0105 0.00249 0.059
四丁基氢氧化铵 0.0012 0.0072 0.013 0.0027 0.062
由对比例1和对比例2可以看出，采用其他C18色谱柱和流动相均无法达到本申请实施例中的检测效果，这说明本发明提供的检测方法能够实现对索非布韦中更多杂质的定性和定量，从而实现更有效地控制索非布韦原料及其制剂中的有关物质，提高产品安全性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
UV检测器，检测波长258-262nm；
流动相A：磷酸二氢钾-四丁基溴化铵-水，流动相B为乙腈；
洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：
0-4min，75％流动相A，25％流动相B；
4-20min，75％→40％流动相A，25％→60％流动相B；
20-28min，40％→30％流动相A，60％→70％流动相B。
2.如权利要求1所述索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，流速为0.9-1.1mL/min，柱温30-40℃。
3.如权利要求2所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，检测波长为260nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
4.如权利要求1所述索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，进样体积为10μL。
5.如权利要求1所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为9-11mmol/L，四丁基溴化铵的浓度为0.9-1.1mmol/L。
6.如权利要求5所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为10mmol/L，四丁基溴化铵的浓度为1.0mmol/L。
7.如权利要求1所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
0-4min，75％流动相A，25％流动相B；
4-20min，75％→40％流动相A，25％→60％流动相B；
20-28min，40％→30％流动相A，60％→70％流动相B；
28-28.01min，30％→75％流动相A，70％→25％流动相B；
28.01-35min，75％流动相A，25％流动相B。
8.如权利要求1所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为250*4.6mm，填料直径为5μm。
9.如权利要求1或8所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Hypersil BDS C18，4.6*250mm，5μm。
10.如权利要求1所述的索非布韦中有关物质的检测方法，其特征在于，供试品溶液的浓度为1.0mg/mL。
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