CN116381079A - 一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半夏泻心颗粒中β‑谷甾醇的含量检测方法，包括取样品超声处理取续滤液、取β‑谷甾醇对照品适量加甲醇、液相色谱条件与系统适用性试验与分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定。本发明采用超高效液相色谱法检测半夏泻心颗粒中的β‑谷甾醇含量的方法，本方法流程合理，时间短、成本低、简单可行，专属性强、准确度高，其通过取样品超声处理取续滤液、取β‑谷甾醇对照品适量加甲醇、液相色谱条件与系统适用性试验与分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定的步骤实现半夏泻心颗粒中β‑谷甾醇的含量检测。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，具体为一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法。
背景技术
半夏泻心颗粒是一款胃肠科经典名方创新药，本中成药由清半夏、黄芩、干姜、人参、甘草、黄连、大枣等六味名贵道地中药组成，具有寒热平调、散结除痞之功效，主治寒热互结之痞证，症见心下痞，但满而不痛，或呕吐，肠鸣下利，舌苔腻而微黄。本产品用于慢性结肠炎、急慢性胃肠炎、慢性肝炎、早期肝硬化等属中气虚弱，寒热互结者；规格每袋15g。
为了有效控制产品质量，保证产品疗效，按照《药品注册管理办法》及《中药药典》相关要求，制定了本药品质量标准，主要内容包括处方、制法、性状、鉴别、检查、含量测定(β-谷甾醇、黄芩苷)、功能与主治、用法与用量、规格、贮藏等。
经查阅文献和资料，有多种药材和食品中β-谷甾醇的含量测定方法，但没有一种专门针对半夏泻心颗粒中β-谷甾醇含量的专用检测方法，现有的方法用在半夏泻心颗粒中，专属性和准确性都较差，不能满足本产品的检测要求，为此，我们提出了一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法，包括取样品超声处理取续滤液、取β-谷甾醇对照品适量加甲醇、液相色谱条件与系统适用性试验与分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定；
该一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法包括以下步骤：
步骤一，取样品超声处理取续滤液：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水50ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用纯化水补足减失的重量，分三次分别加入25ml饱和正丁醇进行萃取，合并三次萃取后所得的正丁醇，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤二，取β-谷甾醇对照品适量加甲醇：取β-谷甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液，即得；
步骤三，液相色谱条件与系统适用性试验：液相色谱条件与系统适用性试验，照高效液相色谱法(通则0512)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为37℃；检测波长为205nm。理论板数按β-谷甾醇峰计算应不低于10000；
步骤四，分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定：测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每袋含β-谷甾醇(C29H50O)计，含量应为8.97-16.48mg；超声处理的功率为200W，频率为40kHz；β-谷甾醇色谱峰分离度应符合要求。
优选的，所述步骤一与步骤四中的超声处理功率均为200W，频率为40kHz。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明依据《药品注册管理办法》及《中药药典》相关要求，建立了一种采用超高效液相色谱法检测半夏泻心颗粒中的β-谷甾醇含量的方法，本方法流程合理，时间短、成本低、简单可行，专属性强、准确度高，其通过取样品超声处理取续滤液、取β-谷甾醇对照品适量加甲醇、液相色谱条件与系统适用性试验与分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定的步骤实现半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测。
附图说明
图1为本发明一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法的流程图；
图2为本发明中β-谷甾醇对照品线性考察结果示意图；
图3为本发明中重复性试验结果示意图；
图4为本发明中样品的回收率试验结果示意图；
图5为本发明中检测限与定量限试验结果示意图；
图6为本发明中β-谷甾醇对照品线性考察结果示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法，包括取样品超声处理取续滤液、取β-谷甾醇对照品适量加甲醇、液相色谱条件与系统适用性试验与分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定；
该一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法包括以下步骤：
步骤一，取样品超声处理取续滤液：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水50ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用纯化水补足减失的重量，分三次分别加入25ml饱和正丁醇进行萃取，合并三次萃取后所得的正丁醇，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤二，取β-谷甾醇对照品适量加甲醇：取β-谷甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液，即得；
步骤三，液相色谱条件与系统适用性试验：液相色谱条件与系统适用性试验，照高效液相色谱法(通则0512)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为37℃；检测波长为205nm。理论板数按β-谷甾醇峰计算应不低于10000；
步骤四，分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定：测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每袋含β-谷甾醇(C29H50O)计，含量应为8.97-16.48mg；超声处理的功率为200W，频率为40kHz；β-谷甾醇色谱峰分离度应符合要求。
本申请中
1、所使用的仪器
ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(TUV检测器，Empower 3色谱工作站),美国沃特世公司生产；
EVOLUTION 201紫外-可见分光光度计，美国赛默飞公司生产；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
SQP型1mg分析天平，赛多利斯公司生产；QUINTIX213-1CN；
SQP型0.1mg分析天平，赛多利斯公司生产；SECURA224-1CN；
SQP型0.01mg分析天平，赛多利斯公司生产；SECURA125-1CN；
超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；
β-谷甾醇对照品，批号：110851-201909，HPLC法纯度98.8％，产于中国药品生物制品检定研究院；
正丁醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司生产；
甲醇，色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司生产；
甲醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司公司生产；
水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。
2、对照品溶液的制备
取β-谷甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml约含40ug的溶液，即得。
3、最大吸收波长的确定
精密称取β-谷甾醇对照品9.23mg，加甲醇溶解并稀释制成浓度为36.48μg/ml对照品溶液，在190nm～1100nm的波长范围内用紫外-可见分光光度计扫描，结果显示β-谷甾醇在205nm波长处有最大吸收，故以205nm作为β-谷甾醇含量测定的测定波长。
4、色谱条件与系统适用性试验
β-谷甾醇：照高效液相色谱法(通则0512)测定。
液相色谱条件与系统适用性试验，照高效液相色谱法(通则0512)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为37℃；检测波长为205nm。理论板数按β-谷甾醇峰计算应不低于10000。
5、供试品溶液的制备
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水50ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用纯化水补足减失的重量，分三次分别加入25ml饱和正丁醇进行萃取，合并三次萃取后所得的正丁醇，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6、专属性试验
按照半夏泻心颗粒质量标准【制法】项下的工艺方法制备缺清半夏的阴性样品，照供试品溶液的制备方法同法制成清半夏阴性品溶液，在拟定的色谱条件下进样1μl测定，结果β-谷甾醇色谱峰相应的位置上，阴性样品无色谱峰被检出，由此说明在上述色谱条件下处方中其它药材的成分对清半夏的测定无干扰，专属性良好。
7、精密度试验
仪器重复性按上述拟定的液相色谱方法，配制对照品溶液，分别取对照品溶液连续进样5次，在上述色谱条件下进行检测，以β-谷甾醇峰面积(Ax)进行考察，结果5次进样测定后的相对标准偏差RSD为0.34％，说明仪器的精密度良好，见附图3。
8、重复性
按上述拟定的液相色谱方法，配制批号为20220501半夏清心颗粒β-谷甾醇含量测定样品溶液6份，由同一测定人员在同一实验室按上述色谱条件进行检测，计算每份样品中的β-谷甾醇的含量结果进行考察。结果6份样品测定结果的平均值为13.43mg/袋，相对标准偏差RSD为1.05％，小于标准规定的2.0％，说明方法的重复性良好，见附图4。
9、准确度
供试品溶液的制备：取半夏清心颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水50ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用纯化水补足减失的重量，分三次分别加入25ml饱和正丁醇进行萃取，合并三次萃取后所得的正丁醇，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取β-谷甾醇对照品9.23mg(纯度为98.8％)，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为β-谷甾醇对照品储备液。取β-谷甾醇对照品储备液2.5ml，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得，作为对照品溶液。
待测液的制备(10ml体系)：精密量取供试品溶液1ml，共9份，精密加入对照品溶液1.0、2.0、3.0ml各3份，分别为低、中、高三个不同水平，分别加入甲醇至10ml，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
按上述色谱条件进行检测，并根据下列公式计算回收率，计算RSD，见附图5，
回收率试验表明，加入β-谷甾醇对照品设计的高、中、低三个不同水平的回收率在100.50％～108.28％之间，在标准规定的80～115％范围内，试验结果符合规定，说明该方法准确可靠，误差在允许的范围内。
10、检测限与定量限
取β-谷甾醇对照品9.23mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为β-谷甾醇对照品储备液。取β-谷甾醇对照品储备液2.5ml，置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得，作为对照品溶液。
定量限溶液：将上述对照品溶液稀释进样至峰高约为噪音值10倍，即为定量限溶液。
检测限溶液：将上述对照品溶液稀释进样至峰高约为噪音值3倍，即为检测限溶液。
测定：分别精密吸取上述定量限溶液和检测限溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
11、线性
取β-谷甾醇对照品，制成浓度为154.26μg/ml的对照品溶液，分别稀释成浓度为77.13μg/ml、38.57μg/ml、19.28μg/ml、9.64μg/ml、4.82μg/ml的对照品溶液，分别进样1μl，记录色谱图及峰面积积分值，平行进样三次。以β-谷甾醇的进样量(μg)作为横坐标(X)，以β-谷甾醇峰面积积分值作为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并对所测得的数据进行回归分析，得回归方程为y＝5696.831x+3416.324，相关系数r＝0.9999。说明β-谷甾醇的进样量在4.82ng～154.26ng之间时，进样量与峰面积积分值之间呈现良好的线性关系。
12、范围
根据分析方法的线性、精密度、准确度的试验结果，确定分析方法的浓度范围为4.82μg/ml～154.26μg/ml，对应的量的范围为4.82μg～154.26μg。
13、稳定性试验
按拟定的检测方法，制备对照品溶液；取半夏清心颗粒批号20220501样品0.5g，按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各1μl，在上述色谱条件下每隔一定时间测定一次，考察对照品溶液和供试品溶液的稳定性情况。
结论：稳定性试验结果表明，对照品溶液在48小时内峰面积相对标准偏差为0.88％，说明β-谷甾醇在溶液状态下放置48小时内是稳定的；供试品溶液在24小时内峰面积相对标准偏差为0.27％，说明供试品溶液在24小时内是稳定的14、耐用性
在上述确定的色谱条件下，取同一份对照品和供试品溶液，分别对流动相的配比、缓冲盐的浓度进行微调，考察对照品与供试品在不同条件下的变化情况。
在方法耐用性实验中，进样量在拟定的基础上上下浮动10％进样；检测波长在拟定的205nm基础上，上下浮动3nm检测；柱温在拟定的37℃的基础上，上下浮动2℃检测；流动相流速在拟定的0.3ml/min基础上上下浮动10％检测；使用同型号不同厂家的色谱柱检测，最终结果的的RSD为1.09％，符合小于2％的规定。
综上，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为37℃；检测波长为205nm。理论板数按β-谷甾醇峰计算应不低于10000的色谱条件是合适的，并且有一定的耐用性。
15、按上述方法对本品多批次样品测定的含量数据
用本次拟定的方法对上述15批半夏清心颗粒样品中的β-谷甾醇含量测定，测定结果每袋在9.79mg～14.98mg之间。根据15批半夏清心颗粒中β-谷甾醇含量测定结果，β-谷甾醇含量暂定按最低值下浮10％计，高值上浮10％计；本品每袋含β-谷甾醇含量以β-谷甾醇(C33H36N4O6)计，应为8.97-16.48mg。
通过上述的方法学试验结果表明，采用高效液相色谱法测定本样品中的β-谷甾醇限量测定方法合理可行。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法，包括取样品超声处理取续滤液、取β-谷甾醇对照品适量加甲醇、液相色谱条件与系统适用性试验与分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定，其特征在于：
该一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法包括以下步骤：
步骤一，取样品超声处理取续滤液：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水50ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用纯化水补足减失的重量，分三次分别加入25ml饱和正丁醇进行萃取，合并三次萃取后所得的正丁醇，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤二，取β-谷甾醇对照品适量加甲醇：取β-谷甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液，即得；
步骤三，液相色谱条件与系统适用性试验：液相色谱条件与系统适用性试验，照高效液相色谱法(通则0512)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.9μm)；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为37℃；检测波长为205nm。理论板数按β-谷甾醇峰计算应不低于10000；
步骤四，分别对精密吸取对照品溶液与供试品溶液测定：测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每袋含β-谷甾醇(C29H50O)计，含量应为8.97-16.48mg；超声处理的功率为200W，频率为40kHz；β-谷甾醇色谱峰分离度应符合要求。
2.根据权利要求1所述的一种半夏泻心颗粒中β-谷甾醇的含量检测方法，其特征在于,所述步骤一与步骤四中的超声处理功率均为200W，频率为40kHz。
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