BR122013004621A2 - fosforamidatos de nucleosídeo, seus processos de preparação, sua composição e seu uso - Google Patents

Abstract

fosforamidatos de nucleosídeo, seus processos de preparação, sua composição e seu uso. são revelados aqui fosforamidatos de nucleosídeos e seus usos como agentes para trataemento de doenças virais. estes compostos são inibidores de replicação viral de rna dependente de rna e são úteis como inibidores de polimerase hcv ns5b, como inibidores de replicação de hcv e para tratamento de infecção de hapatite c em mamíferos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FOSFORA-MIDATOS DE NUCLEOSÍDEO, SEUS PROCESSOS DE PREPARAÇÃO, SUA COMPOSIÇÃO E SEU USO".

Pedido dividido do BR112012024923-1, depositado em 31.03.2011.

Prioridade Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente US 61/319.513, depositado em 31 de março de 2010, pedido de patente US 61/319.548, depositado em 31 de março de 2010 e pedido de patente US 12/783.680, depositado em 20 de maio de 2010, o assunto objeto do qual é incorporado por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção Aqui são revelados fosforamidatos de nucleosídeo e sua utilização como agentes para o tratamento de doenças virais. Estes compostos são inibidores de replicação de vírus RNA dependente de RNA e são úteis como inibidores de polimerase HCV NS5B, como inibidores da replicação de HCV e para o tratamento de infecção de hepatite C em mamíferos.

Fundamentos O vírus da hepatite C (HCV) é um problema de saúde importante que leva â doença hepática crônica, como a cirrose e carcinoma hepatocelu-lar, em um número substancial de indivíduos infectados, estima-se que 2-15% da população do mundo. Há uma estimativa de 4,5 milhões de pessoas infectadas somente Estados Unidos, de acordo com os Centro de Controle de Doenças dos EUA. Segundo a Organização Mundial de Saúde, existem mais de 200 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo, com pelo menos 3 a 4 milhões de pessoas sendo infectadas a cada ano. Uma vez infectado, cerca de 20% das pessoas eliminam o vírus, mas o resto pode abrigar HCV pelo resto de suas vidas. Dez a vinte por cento dos indivíduos cronicamente infectados, eventualmente desenvolvem cirrose hepática destrutiva do fígado ou câncer. A doença viral é transmitida por via parenteral por sangue contaminado e produtos de sangue, agulhas contaminadas, ou sexualmente e verticalmente a partir de mães infectadas ou mães portadoras para sua prole. Os tratamentos atuais para a infecção por HCV, que são restritos a imunoterapia com interferon-α recombinante ou em combinação com o análogo de nucleosídeo ribavirina, são de benefício clínico limitado. Além disso, não existe nenhuma vacina estabelecido para o HCV. Consequentemente, existe uma necessidade urgente de agentes terapêuticos melhorados que combatem efetivamente a infecção crônica pelo HCV. O vírion HCV é um vírus RNA de fita positiva envelopado com uma sequência genômica única de oligoribonucleotídeo de cerca de 9600 bases que codificam uma poliproteína de cerca de 3010 aminoácidos. Os produtos proteicos do gene HCV consistem em proteínas estruturais C, E1 e E2, e as proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A e NS4B, e NS5A e NS5B. Acredita-se que as proteínas não estruturais (NS) fornecem o maquinaria catalítico para a replicação viral. A protease NS3 libera NS5B, a RNA polimerase dependente de RNA da cadeia de poliproteína. A polimerase HCV NS5B é necessária para a síntese de um RNA de fita dupla a partir de um RNA de fita simples viral que serve como um modelo no ciclo de replicação de HCV. Portanto, a polimerase NS5B é considerada um componente essencial no complexo de replicação do HCV (K. Ishi, et al, Hepatology, 1999, 29: 1227-1235; V. Lohmann, et al., Virology, 1998, 249: 108-1 18). A inibição da polimerase NS5B do HCV evita a formação de RNA de fita dupla de HCV e, por conseguinte, constitui uma abordagem atrativa para o desenvolvimento de terapias antivirais específicas de HCV. HCV pertence a uma família muito maior de vírus que compartilham muitas características comuns. Vírus Flaviviridae A família Flaviviridae de vírus compreende pelo menos três gêneros distintos: pestivírus, que causam doença em bovinos e suínos; flaviví-rus, que são a principal causa de doenças como a dengue e febre amarela, e hepacivírus, cujo único membro é HCV. O gênero flavivírus inclui mais de 68 membros separados em grupos com base na afinidade sorológica (Cali-sher et al., J. Gen. Virol, 1993,70,37-43). Os sintomas clínicos variam e incluem encefalite, febre e febre hemorrágica (Fields Virology, Editors: Fields, Β. Ν., Knipe, D. Μ., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Phila-delphia, PA, 1996, Chapter 31, 931-959). Os flavivírus de interesse global que estão associados com doenças humanas incluem os vírus Dengue Hemorrágica (FHD), vírus da febre amarela, síndrome de choque e vírus da encefalite japonesa (Halstead, S.B., Rev. Infect. Dis.,1984, 6, 251 -264; Halstead, S. B., Science, 239:476-481, 1988; Monath, T. P., New Eng.476-481,1988; Monath, T. P., New Eng.J. Med, 1988, 319, 64 1-643). O gênero pestivírus inclui vírus da diarréia bovina viral (BVDV), vírus da febre suína clássica (CSFV, também chamado peste suína clássica) e o vírus da doença de fronteira (BDV) de ovelhas (Moennig, V. et al. Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Infecções por pestivírus de animais domésticos (bovinos, suínos e ovinos) causam perdas econômicas significativas em todo o mundo. BVDV causa a doença das mucosas em bovinos e é de importância econômica significativa para a indústria pecuária (Meyers, G. e Thiel, H.J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-1 18; Moennig V., et al, Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Pestivírus humanos não foram tão amplamente caracterizados como os pestivírus animais. No entanto, pesquisas sorológi-cas indicam a exposição considerável a pestivírus em seres humanos.

Pestivírus e hepacivírus são grupos de vírus intimamente relacionados dentro da família Flaviviridae. Outros vírus estreitamente relacionados nesta família incluem o vírus A GB, agentes tipo vírus A GB, vírus B GB e vírus C GB (também chamado vírus da hepatite G, HGV). O grupo hepacivírus (vírus da hepatite C; HCV) é constituído por um número de vírus estreitamente relacionados, mas genotipicamente distinguíveis que infectam seres humanos. Existem pelo menos 6 genótipos de HCV e mais de 50 sub-tipos. Devido às semelhanças entre pestivírus e hepacivírus, combinados com a capacidade fraca de hepacivírus de crescer de forma eficiente em cultura de células, o vírus da diarréia bovina viral (BVDV) é frequentemente utilizado como um substituto para estudar o vírus HCV. A organização genética de pestivírus e hepacivírus é muito semelhante. Estes vírus RNA de cadeia positiva possuem uma estrutura de leitura aberta única grande (ORF) que codifica todas as proteínas virais ne- cessárias para a replicação do vírus. Estas proteínas são expressas como uma poliproteína que é co- e pós-traducionalmente processada por ambas as proteinases celulares e codificadas por vírus para produzir as proteínas maduras virais. As proteínas virais responsáveis para a replicação do RNA do genoma viral estão localizadas dentro aproximadamente do carboxi-terminal. Dois terços da ORF são designadas por proteínas não estruturais (NS). A organização genética e de processamento da poliproteína da porção de proteína não estrutural do ORF para pestivírus e hepacivírus é muito semelhante. Para ambos os pestivírus e hepacivírus, as proteínas maduras não estruturais (NS), em ordem sequencial a partir do amino-terminal da região de codificação da proteína não estrutural para o terminal carboxi do ORF, consistem em p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B.

As proteínas NS de pestivírus e hepacivírus compartilham sequências de domínios que são característicos das funções das proteínas específicas. Por exemplo, as proteínas NS3 de vírus em ambos os grupos possuem motivos de sequência de aminoácidos característicos de proteinases e de helicases (Gorbalenya et al., Nature, 1988, 333, 22; Bazan and Fletterick Virology, 1989, 171, 637-639; Gorbalenya et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 3889-3897). De modo semelhante, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm motivos característicos de RNA polimerases direcionadas para RNA (Koonin, E.V. and Dolja, V.V., Crir. Rev. Biochem. Molec. Bíol. 1993, 28, 375-430).

Os papéis e funções reais das proteínas NS de pestivírus e hepacivírus no ciclo de vida dos vírus são diretamente análogos. Em ambos os casos, a proteinase serina NS3 é responsável por todo o processamento proteolítico de precursores de poliproteína a jusante da sua posição na ORF (Wiskerchen and Collett, Virology, 1991, 184, 341-350; Bartenschlager et al., J Virol. 1993, 67, 3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993,192, 399-406; Grakoui et al., J. Virol. 1993, 67, 2832-2843; Grakoui et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 1993, 90, 10583-10587; Hijikata et al., J. Virol. 1993, 67, 4665-4675; Tome et al., J. Virol, 1993, 67, 4017-4026). A proteína NS4A, em ambos os casos, atua como um cofator com a protease de serina NS3 (Bartenschlager et al., J Virol. 1994, 68, 5045-5055; Failla et al., J. Virol. 1994, 68, 3753-3760; Xu et al., J. Virol., 1997, 71 :53 12-5322). A proteína NS3 de ambos os vírus também funciona como uma helicase (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, 215, 160-166; Jin and Peterson, Ar-ch. Biochem. Biophys., 1995, 323, 47-53; Warrener and Collett, J. Virol. 1995, 69,1720-1726). Finalmente, as proteínas NS5B do pestivírus e hepaci-vírus têm a atividade prevista de RNA polimerases direcionada para RNA (Behrens et al., EMBO, 1996,15,12-22; Lechmann et al., J. Virol., 1997, 71 , 8416-8428; Yuan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 232, 231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al, J. Virol., 1998, 72, 9365-9369).

Atualmente, há opções limitadas de tratamento para os indivíduos infectados com o vírus da hepatite C. A opção terapêutica atual aprovada é a utilização de imunoterapia com interferon-α recombinante isolado ou em combinação com o análogo de nucleosídeo ribavirina. Esta terapia é limitada na sua eficácia clínica e apenas 50% dos pacientes tratados respondem à terapia. Portanto, há necessidade significativa para terapias mais efetivas e inovadoras para direcionar à necessidade médica não atendida representada pela infecção pelo HCV.

Certo número de alvos moleculares potenciais para o desenvolvimento de drogas antivirais de atuação direta e que atuam como anti-HCV terapêutica foram agora identificados, incluindo, entre outros, o autoprotease NS2-NS3, a protease N3, a helicase N3 e a polimerase NS5B. A RNA poli-merase dependente de RNA é absolutamente essencial para a replicação do genoma de RNA senso positiva de fita simples, e esta enzima suscitou interesse significativo entre os químicos medicinais.

Os inibidores da HCV NS5B como terapias potenciais para infecção por HCV foram revisados: Tan, S.-L., et al., Nature Rev. Drug Dis-cov., 2002, 1, 867-881 ; Walker, M.P. et al., Exp. Opin. Investigational Drugs, 2003, 12, 1269-1280; Ni, Z-J., et al., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2004, 7, 446-459; Beaulieu, P. L., et al., Current Opinion in Investigational Drugs, 2004, 5, 838-850; Wu, J., et al., Current Drug Targets-Infectious Disorders, 2003, 3, 207-219; Griffith, R.C., et al, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 2004, 39, 223-237; Carrol, S., et al., Infectious Disor-ders-Drug Targets, 2006, 6, 17-29. O potencial para o surgimento de cepas resistentes de HCV e da necessidade de identificar agentes com ampla cobertura de genótipo apoia a necessidade de esforços contínuos para identificar nucleosídeos novos e mais efetivos como inibidores da HCV NS5B.

Inibidores nucleosídeos de polimerase NS5B pode atuar como um substrato não natural que resulta em terminação da cadeia, ou como um inibidor competitivo que compete com á ligação de nucleotídeo para a polimerase. Para funcionar como um terminador de cadeia o análogo de nucleo-sídeo deve ser levado pela célula e convertido in vivo para um trifosfato para competir para o sítio de ligação do nucleotídeo polimerase. Esta conversão para trifosfato é comumente mediada por quinases celulares que transmitem requisitos estruturais adicionais em um inibidor potencial de polimerase nu-cleosídeo. Infelizmente, isto limita a avaliação direta de nucleosídeos como inibidores da replicação do HCV para ensaios baseados em células capazes de fosforilação em situ.

Em alguns casos, a atividade biológica de um nucleosídeo é dificultada pelas suas características fracas de substrato para uma ou mais das quinases necessárias para convertê-lo à forma ativa trifosfato. A formação do monofosfato por uma quinase nucleosídeo é geralmente visualizada como a etapa limitante de velocidade dos três eventos de fosforilação. Para contornar a necessidade para a etapa de fosforilação inicial no metabolismo de um nucleosídeo para o análogo de trifosfato ativo, a preparação de pró-fármacos de fosfato estáveis foi relatada. Pró-drogas de nucleosídeos fosfo-ramidato demonstraram ser precursoras do trifosfato de nucleosídeo ativo e para inibir a replicação viral quando administradas às células infectadas por vírus inteiros (McGuigan, C, et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1748-1753; Va-lette, G., et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1981-1990; Balzarini, J., et al., Proc. National Acad Sei USA, 1996, 93, 7295-7299; Siddiqui, A. Q., et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 4122-4128; Eisenberg, E. J., et al., Nucleosides, Nu-cleotides and Nucleic Acids, 2001, 20, 1091-1098; Lee, W.A., et al., Antimi-crobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49, 1898); US 2006/0241064; and WO 2007/095269.

Ainda limitando a utilidade de nucleosídeos como agentes terapêuticos viáveis é, por vezes, suas fracas propriedades físico-químicas e farmacocinéticas. Estas propriedades fracas podem limitar a absorção intestinal de um agente de absorção e limitar o tecido alvo ou célula. Para melhorar as suas propriedades pró-fármacos de nucleosídeos foram empregadas. Foi demonstrar que a preparação de fosforamidatos de nucleosídeos melhora a absorção sistêmica de um nucleosídeo e, ainda, a fração fosforamidato destes "pró-nucleotídeos" é mascarada com grupos lipofílicos neutros para obter um coeficiente para otimizar absorção e transporte na célula drasticamente aumentando a concentração intracelular do análogo monofosfato de nucleosídeo em relação à administração do nucleosídeo parente isolado. Hidrólise mediada por enzima do radical éster de fosfato produz um monofosfato de nucleosídeo em que a fosforilação limitante de velocidade inicial é desnecessária. Para este fim, o pedido de patente US 12/053.015, que corresponde à WO 2008/121634 e US 2010/0016251, revela um número de pró-drogas nucleosídeo de fosforamidato, muitos dos quais apresentam atividade em um ensaio HCV. Vários compostos revelados em US 2010/0016251 foram testados como um candidato potencial clínico para a-provação pela FDA.

Sumário da Invenção É revelado aqui um composto representado pela fórmula 4 e seus respectivos diastereoisômeros com base em fósforo representado por fórmulas Sp-4 e Rp-4 4 Sp-4 Λρ-4 Breve Descrição dos Desenhos Figura 1. Difratograma de alta resolução XRPD de 4.

Figura 2. Difratograma de alta resolução XRPD de Rp-4.

Figura 3. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4 (Forma 1).

Figura 4. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4 (Forma 1)· Figura 5. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4-CH2Cl2 (Forma 2).

Figura 6. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4-CHCI3 (Forma 3).

Figura 7. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4 (Forma 4) .

Figura 8. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4 (Forma 5) .

Figura 9. Difratograma de alta resolução XRPD de Sp-4 (amorfo). Figura 10. Estruturas de Cristal de Raios-X para Sp-4 (Forma 1) Figura 11. Estrutura de Cristal de Raios X (Isotrópico) para SV-4-CH2CI2 (Forma 2) Figura 12. Estrutura de Cristal de Raios X (Anisotrópico) para SV-4-CH2CI2 (Forma 2) Figura 13. Estrutura de Cristal de Raios X para Sp-4-CHCI3 (Forma 3) Figura 14. Espectro FT-IR de 4.

Figura 15. Espectro FT-IR de Rp-4.

Figura 16. Espectro de FT-IR de Sp-4 Figura 17. Análise TGA e DSC de 4.

Figura 18. Análise TGA e DSC de Rp-4.

Figura 19. Análise TGA e DSC de Sp-4.

Figura 20A. Estrutura de Cristal de Raios X para 8 (isômero Sp) (molécula n.° 1 da unidade assimétrica).

Figura 20B. Estrutura de Cristal de Raios X para 8 (isômero Sp) (molécula n.° 2 da unidade assimétrica).

Figura 21._ Difratograma de Alta Resolução XRPD de Sp-4 (Forma 6).

Figura 22A. Estrutura de Cristal de Raios X para (S)-isopropil2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (molécula n.° 1 da unidade assimétrica).

Figura 22B. Estrutura de Cristal de Raios X para (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (molécula n.° 2 da u-nidade assimétrica).

Descrição detalhada da invenção Definições A frase "um" ou "uma" entidade conforme usado aqui se refere a um ou mais daquela entidade; por exemplo, um composto se refere a um ou mais compostos ou pelo menos um composto. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", e "pelo menos um" pode. ser usado de modo inter-cambiável aqui.

Os termos "opcional" ou "opcionalmente" conforme usado aqui significa que um evento ou circunstância subsequentemente descrito, mas não precisa ocorrer, e que a descrição inclui casos onde o evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, "ligação opcional" significa que a ligação pode ou não estar presente, e que a descrição inclui ligações simples, duplas ou triplas. O termo "P*" significa que o átomo de fósforo é quiral e que tem uma designação correspondente Cahn-Ingold-Prelog de "R" ou "S" que têm seus significados claros aceitos. O termo "purificado," conforme descrito aqui, se refere à pureza de certo composto. Por exemplo, um composto é "purificado" quando certo composto é um componente principal da composição, ou seja, pelo menos 50% p/p puro. Assim, "purificado" inclui pelo menos 50% p/p pureza, pelo menos 60% p/p pureza, pelo menos 70% pureza, pelo menos 80% pureza, pelo menos 85% pureza, pelo menos 90% pureza, pelo menos 92% pureza, pelo menos 94% pureza, pelo menos 96% pureza, pelo menos 97% pureza, pelo menos 98% pureza, pelo menos 99% pureza, pelo menos 99,5% pureza, e pelo menos 99,9% pureza, em que "substancialmente puro" inclui pelo menos 97% pureza, pelo menos 98% pureza, pelo menos 99% pureza, pelo menos 99,5% pureza, and pelo menos 99,9%) pureza; O termo "metabólito," conforme descrito aqui, se refere a um composto produzido in vivo após a administração a um sujeito em necessidade do mesmo. O termo "cerca de" (ainda representado por ~) significa que o valor numérico recitado é parte de uma faixa que varia dentro de um erro experimental padrão. A expressão "substancialmente conforme mostrado em ..." um padrão XRPD especificado significa que as posições de pico mostradas no padrão XRPD são substancialmente os mesmos, dentro da inspeção visual ou recorrem a uma listagem de picos selecionada (± 0,2 °20). Um especialista na técnica entende que as intensidades podem variar dependendo da amostra. O termo "substancialmente anidro" significa que uma substância contém no máximo 10%) em peso de água, preferencialmente no máximo 1% em peso de água, mais preferencialmente no máximo 0,5% em peso de água, e mais preferencialmente no máximo 0,1% em peso de água.

Um solvente ou antissolvente (conforme usado nas reações, cristalização, etc. ou grade e/ou solventes adsorvidos) inclui pelo menos um de um Ci a Ce álcool, um C2 a Ce éter, um C3 a C7 cetona, um C3 a C7 éster, um C1 a C2 clorocarbono, um C2 a C7 nitrila, um solvente miscelânea, um C5 a C12 hidrocarboneto saturado, e um C6 a C12 hidrocarboneto aromático. O C1 a Ce álcool se refere a um álcool linear/ramificado e/ou cí- clico/alicíclico contendo duto número de carbonos. O Ci a C8 álcool inclui, ente outros, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, isobutanol, hexanol, e ciclohexanol. O C2 a C8 éter se refere a um éter linear/ramificado e/ou cícli-co/alicíclico contendo dito número de carbonos. O C2 a Ce éter inclui, entre outros, dimetil éter, dietil éter, di-isopropil éter, di-n-butil éter, metil-t-butil éter (MTBE), tetrahidrofurano, e dioxano. A C3 a C7 cetona se refere a uma cetona linear/ramificado e/ou cíclico/alicíclico contendo dito número de carbonos. A C3 a C7 cetona inclui, entre outras, acetona, metil etil cetona, propanona, butanona, metil isobutil cetona, metil butil cetona, e ciclohexanona. O C3 a C7 éster se refere a um éster linear/ramificado e/ou cíclico/alicíclico contendo dito número de carbonos. O C3 a C7 éster inclui, entre outros, acetato de etil, acetato de propil, acetato de n-butil, etc. O C1 a C2 clorocarbono se refere a um clorocarbono contendo dito número de carbonos. O C1 a C2 clorocarbono inclui, entre outros, clor-fórmio, cloreto de metileno (DCM), tetracloreto de metileno, 1,2-dicloroetano, e tetracloroetano.

Uma C2 a C7 nitrila se refere a uma nitrila tem dito número de carbonos. A C2 a C7 nitrila inclui, entre outros, acetonitrila, propionitrila, etc.

Um solvente miscelâneo se refere a um solvente comumente empregado em química orgânica, que inclui, entre outros, dietileno glícol, diglima (dietileno glicol dimetil éter), 1,2-dimetoxi-etano, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, etileno glicol, glicerina, hexametilfosforamida, hexametilfós-foro triamida, N-metil-2-pirrolidinona, nitrometano, piridina, trietil amina, e ácido acético. O termo C5 a C12 hidrocarboneto saturado se refere a um hidro-carboneto linear/ramificado e/ou cíclico/alicíclico. O C5 a C12 hidrocarboneto saturado inclui, entre outros, n-pentano, éter de petróleo (ligroína), n-hexano, n-heptano, ciclohexano, e cicloheptano. O termo C6 a C12 aromático se refere à hidrocarbonetos substituídos ou não substituídos contendo um grupo fenil como suas estruturas. Hi- drocarbonetos preferenciais incluem benzeno, xileno, tolueno, clorobenzeno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, xilenos, com tolueno sendo mais preferencial. O termo "halo" ou "halogênio" conforme usado aqui, inclui cloro, bromo, iodo e flúor. O termo "grupo de bloqueio" se refere a um grupo químico que apresenta às seguintes características. O "grupo" é derivado de um "composto de proteção." Grupos que são seletivos para hidroxis primários sobre hidroxis secundários que podem ser colocados em condições consistentes com a estabilidade do fosforamidato (pH 2-8) e conferem no produto resultante propriedades físicas substancialmente diferentes permitindo uma preparação mais fácil do produto 3'-fosforamidato-5'-novo grupo de um composto desejado não reagido. O grupo deve reagir seletivamente para gerar um substrato protegido que é estável às reações projetadas (vide Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed. T. W. Greene and P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1999). Exemplos de grupos incluem, entre outros: benzoil, acetil, benzoil fenil-substituído, tetrahidropiranil, tritil, DMT (4 4«_dimetoxitritiI), MMT (4-monometoxitritil), trimetoxitritil, grupo pixil (9-fenilxanten-9-il), tiopixil (9-feniltioxanten-9-il) ou 9-(p-metoxifenil)xantina-9-il (MOX), etc.; C(0)-alquil, C(0)Ph, C(0)aril, CH20-alquil, CH20-aril, S02-alquil, S02-aril, tert-butildimetilsilil, tert-butildifenilsilil. Acetais, como MOM ou THP e semelhantes são considerados possíveis grupos. Compostos fluori-nados são ainda contemplados na medida em que podem ser ligados ao composto e pode ser removido seletivamente passando através de um meio de extração em fase sólida de flúor (FluoroFIash®). Um exemplo específico inclui um análogo tritil fluorinado, análogo tritil 1-[4-(1H,1H,2H,2H-perfluordecil)fenil)-1,1-difenilmetanol. Outros análogos fluorinados de tritil, BOC, FMOC, CBz, etc. são ainda contemplados. Cloretos Sulfonil tipo cloreto de p-toluenosulfonil podem reagir seletivamente na posição 5'. Os ésteres poderíam ser formados como acetatos e benzoatos. Anidridos dicarboxílicos como anidrido succínico e seus derivados podem ser usados para gerar uma ligação éster com um ácido carboxílico livre, como exemplos incluem, entre outros, oxalil, malonil, succinil, glutaril, adipil, pimelil, superil, azelail, sebacil, ftalil, isoftalil, tereftalil, etc. O ácido carboxílico livre aumenta a polaridade drasticamente e pode ainda ser usado como um identificador para extrair o produto de reação em fases aquosas básicas brandas como soluções de bicarbonato de sódio. O grupo fosforamidato é relativamente estável em meio ácido, assim os grupos que requerem condições de reação ácidas, como, tetrahidropiranil, poderiam ainda ser usados. O termo "grupo de proteção" que é derivado de um "composto de proteção," tem seu significado normal e claro, ou seja, pelo menos um grupo de proteção ou bloqueio está ligado a pelo menos um grupo funcional (por exemplo,-OH, -NH2, etc.) que permite modificação química de pelo menos outro grupo funcional. Exemplos de grupo de proteção, incluem, entre outros, benzoil, acetil, fenil-substituído benzoil, tetrahidropiranil, tritil, DMT (4,4'-dimetoxitritil), MMT (4-monometoxitritil), trimetoxitritil, grupo pixil (9-fenilxanten-9-il), tiopixil (9-feniltioxanten-9-il) ou 9-(p-metoxifenil)xantine-9-il (MOX), etc.; C(0)-alquil, C(0)Ph, C(0)aril, C(0)0(alquil inferior), C(0)0(alquileno inferior)aril (por exemplo,- C(0)0CH2Ph), C(0)0-aril, CH20-alquil, CH20-aril, S02-alquil, S02-aril, um grupo de proteção compreendendo pelo menos um átomo de silício, cp,p, tert-butildimetilsilil, tert-butíldifenilsilil, Si(alquil inferior)2OSi(alquil inferior)2OH (como, -SiCPrkOSiOPrfeOH. O termo "composto de proteção," conforme usado aqui e salvo se definido de outra forma, se refere a um composto que contém um "grupo de proteção" e que é capaz de reagir com um composto que contém grupos funcionais que são capazes de serem protegidos. O termo "grupo de saída", conforme usado aqui, tem o mesmo significado aos especialistas na técnica (Advanced Organic Chemistry: reac-tions, mechanisms and structure-Fourth Edition by Jerry March, John Wiley and Sons Ed.; 1992 páginas 351-357) e representa um grupo que é parte de e unido a uma molécula de substrato; em uma reação onde a molécula de substrato passa por uma reação de deslocamento (com, por exemplo, um nucleófilo), o grupo de saída é então deslocado. Exemplos de grupos de saída incluem, entre outros: halogênio (F, Cl, Br, e I), preferencialmente Cl, Br, ou I; tosilato, mesilato, triflato, acetato, canforsulfonato, arilóxido, e arilóxido substituído por pelo menos um grupo de retirada de elétron (por exemplo, p-nitrofenóxido, 2-clorofenóxido, 4-clorofenóxido, 2,4-dinitrofenóxido, pentaflu-orfenóxido, etc.), etc. O termo "grupo de retirada de elétron" é de acordo com seu significado claro aqui. Exemplos de grupo de retirada de elétrons incluem, entre outros, um halogênio, -N02, -C(0)(alquil inferior), -C(0)(aril), -C(0)0(alquil inferior), ~C(0)0(aril), etc. O termo "reagente básico", conforme usado aqui, significa um composto que é capaz de desprotonar um grupo hidroxil. Exemplos de rea-gentes básicos incluem, entre outros, um (alquil inferior)óxido ((alquil inferi-or)OM) em combinação com um solvente alcoólico, onde (alquil inferi-or)óxidos incluem, entre outros, MeO‘, EtO-, nPrO', 'PrCT, fBuO~, 'ÁmO- (iso-amilóxido), etc., e onde M é um cátion de metal alcalino, como Li+, Na+, K+, etc. Solventes alcoólicos incluem (alquil inferior)OH, como, por exemplo, MeOH, EtOH, nPrOH, ‘PrOH, ‘BuOH, 'AmOH, etc. Bases não alcoxi podem ser usadas como hidreto de sódio, hexametildisilazano de sódio, hexametil-disilazano de lítio, diisopropilamida de lítio, hidreto de cálcio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, DBU, DBN, reagentes de Grignard, como (alquil inferior)Mg(halogênio), que inclui, entre outros, a MeMgCI, MeMgBr, 'BuMgCI, 'BuMgBr, etc. O termo "base" inclui o termo "reagente básico" e pretende ser um composto que é capaz de desprotonar um composto contendo próton, ou seja, uma base de Bronsted. Além disso, os exemplos mencionados acima, outros exemplos de uma base incluem, entre outros piridina, colidina, 2,6-(alquil inferior)-piridina, dimetil-anilina, imidazol, N-metil-imidazol, pirazol, N-metil-pirazol, trietilamina, di-isopropiletilamina, etc. O termo "base não nucleofílica" significa um composto que é capaz de atuar como uma base de Br0nsted, mas tem nucleofilicidade baixa. Exemplos de bases não nucleofílica incluem, entre outros, carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropiletilamina, trietilamina, quinuclidina, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-Ci_6-alquil-piridina, uma 2,4,6-tri-CI -6-alquil-piridina, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5- eno, e 1,4-diazabiciclo [2.2.2]octano. O termo "grupo de retirada de elétron" está de acordo com seu significado claro. Exemplos de grupo de retirada de elétrons incluem, entre outros, um halogênio (F, Cl, Br, ou I), -NO2, -C(0)(alquil inferior), -C(0)(aril), -C(0)0(alquil inferior), -C(0)0(aril), etc. O termo "co-cristalatos" incluem co-cristalatos de 4, Rp-4, ou Sp-4 em combinação com sais, que incluem sais farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais," conforme descrito aqui, se refere a um composto compreendendo um cátion e um ânion, que podem ser produzidos pela pro-tonação de uma fração que aceita próton e/ou desprotonação de uma fração que doa próton. Deve ser notado que a protonação da fração que aceita próton resulta na formação de espécies catiônicas em que a carga é equilibrada pela presença de um ânion fisiológico, enquanto que a desprotonação da fração doadora de próton resulta na formação de uma espécie aniônica em que a carga é equilibrada pela presença de um cátion fisiológico. A frase "sal farmaceuticamente aceitável" significa um sal que é farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e semelhantes; ou formados com ácidos orgânicos como ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malônico, ácido má-lico, ácido maleico, ácido fumáríco, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinâmíco, ácido mandélico, ácido metanossul-fônico, ácido etanossulfônico, ácido 1,2-etano-dissulfônico, ácido 2-hidroxi-etanossulfônico, ácido benzenosulfônico, ácido 4-clorobenzenossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 4-toluenosulfônico, ácido canforsulfônico, ácido lauril sulfúrico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido salicílico, ácido mucônico, e semelhantes ou (2) sais de adição básicas formados com as bases conjugados de qualquer um dos ácidos inorgânicos listados acima, e que as bases conjugadas compreendem um componente catiônico selecionado dentre Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NHgR'Yg+, em que R" é um C^alquil e g é um número selecionado dentre 0, 1,2, 3, ou 4. Deve ser entendido que to- das as referências aos sais farmaceuticamente aceitáveis incluem formas de adição de solvente (solvatos) ou formas de cristal (polimorfos) conforme definido aqui, do mesmo sal de adição ácida. O termo "alquil" se refere a uma cadeia não ramificada ou ramificada, saturada, monovalente resíduo de hidrocarboneto contendo 1 a 30 átomos de carbono. O termo "Ci-m alquil" se refere a um alquil compreendendo 1 a M átomos de carbono, onde M é um inteiro contendo os seguintes valores: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30. O termo "Ci_4 alquil" se refere a um alquil contendo 1 a 4 átomos de carbono. O termo "alquil inferior" denota um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo 1 a 6 átomos de carbono. "Ci_20 alquil" conforme usado aqui se refere a um alquil compreendendo 1 a 20 átomos de carbono. "C-mo alquil" conforme usado aqui se refere a um alquil compreendendo 1 a 10 átomos de carbono. E-xemplos de grupos alquil incluem, entre outros, grupos alquil inferiores incluem metil, etil, propil, i-propil, n-butil, i-butil, t-butil ou pentil, isopentil, neopen-til, hexil, heptil, e octil. O termo (ar)alquil ou (heteroaril)alquil indicam o grupo alquil é opcionalmente substituído por um aril ou um grupo heteroaril respec-tivamente. O termo "alquenil" se refere a um radical de cadeia de hidrocarboneto não substituído contendo de 2 a 10 átomos de carbono contendo um ou mais duas ligações duplas olefínicas, preferencialmente uma ligação dupla olefínica. O termo "C2-n alquenil" se refere a um alquenil compreendendo 2 a N átomos de carbono, onde N é um inteiro contendo os valores seguintes: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. O termo "C2-10 alquenil" se refere a um alquenil compreendendo 2 a 10 átomos de carbono. O termo "C2.4 alquenil" se refere a um alquenil compreendendo 2 a 4 átomos de carbono. Exemplos incluem, entre outros, vinil, 1-propenil, 2-propenil (alil) ou 2-butenil (crotil). O termo "aril," conforme usado aqui, e salvo se especificado de outra forma, se refere a um substituído ou não substituído fenil (Ph), bifenil, ou naftil, preferencialmente o termo aril se refere a substituído ou não substituído fenil. O grupo aril pode ser substituído por uma ou mais frações sele- cionados dentre hidroxil, F, Cl, Br, I, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, e fosfo-nato, seja protegido ou não protegido conforme necessário, como conhecido aos especialistas na técnica, por exemplo, conforme ensinado em T.W. Gre-ene and P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd ed., John Wiley & Sons, 1999. O termo "arilóxido," conforme usado aqui, e salvo se especificado de outra forma, se refere a um substituído ou não substituído fenóxido (PhO-), p-fenil-fenóxido (p-Ph-PhO-), ou naftóxido, preferencialmente o termo arilóxido se refere a um fenóxido substituído ou não substituído. O grupo arilóxido pode ser substituído por uma ou mais frações entre hidroxil, F, Cl, Br, I, -C(0)(alquil inferior), -C(0)0(alquil inferior), amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, e fosfonato, seja protegido ou não protegido conforme necessário, como conhecido aos especialistas na técnica, por exemplo, com ensinado em T.W. Greene and P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3a ed., John Wiley & Sons, 1999. O termo "preparação" ou "forma de dosagem " é pretendido para incluir ambas formulações sólidas e líquidas do composto ativo e um especialista na técnica apreciará que um and ingrediente ativo pode existir em diferentes preparações dependendo da dose desejada e parâmetros farmacoci-néticos. O termo "excipiente" conforme usado aqui se refere a um composto que é usado para preparar uma composição farmacêutica, e é geralmente seguro, não tóxico e nem biologicamente nem de alguma forma indesejável, e inclui excipientes que são aceitáveis para uso veterinário conforme uso humano farmacêutico. O termo "cristalino" se refere a uma situação onde uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4 tem características cristalinas quando determinadas por difração de pó em raios-X ou uma técnica de raios X de cristais simples. O termo "tipo cristal" se refere a uma situação onde uma amostras sólida de Sp-4 ou Rp-4 tem características cristalinas quando determina- das por um meio, por exemplo, visualmente ou por microscopia óptica ou polarizante, mas não tem características cristalinas quando determinado por outros meios, por exemplo, difração em pó de raio-X. Métodos de determinar visualmente a cristalinidade de uma a-mostra sólido por visual ou óptica ou por microscopia polarizante são revelados em USP<695> e <776>, ambos dos quais são incorporados por referência. Uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4 que é "tipo cristal" pode ser cristalino sob certas condições mas pode se tornar não cristalino quando submetido a outras condições. O termo "amorfo" se refere a uma situação onde uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4 não é cristalina nem tipo cristal.

Modalidades Uma primeira modalidade é direcionada um composto representado pela fórmula 4: 4 Em que P* representa um átomo de fósforo quiral. Devido ao á-tomo de fósforo quiral, o composto representado pela fórmula 4 compreende dois diastereoisômeros designados como Rp-4 e Sp-4. O composto representado pela fórmula 4 pode ainda ser parte de um solvato, um hidrato, ou uma mistura de solvato/hidrato. O solvato é designado como 4-nS, enquanto que o hidrato é designado como 4-mH20, onde S é um solvente lattice, n varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula 4 pode não existir como um solvato ou hidrato, mas tem certa quantidade vantajosa de solvente ad-sorvido (S) ou água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0% em peso a cerca de 10% em peso baseado no peso do composto representado pela fórmula 4. O composto representado pela fór- mula 4 e seus solvatos e hidratos dos mesmos é cristalino, tipo cristal, ou amorfo.

Uma segunda modalidade é direcionada a um composto representado pela fórmula Rp- 4.

Rp-4 O composto representado pela fórmula Rp-4 pode ainda ser parte de um solvato, um hidrato, ou uma mistura de solvato/hidrato. O solvato é designado como Rp-4-nS, enquanto o hidrato é designado como Sp-4mH20, onde S é um solvente lattice, n varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula Rp-4 pode não existir como um solvato, hidrato, ou mistura de solvato/hidrato, mas tem certas quantidades vantajosas de solvente adsorvi-do (5), água, ou ambos S e água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0% em peso a cerca de 10% em peso baseado no peso do composto representado pela fórmula Rp-4. O composto representado pela fórmula Rp-4 e seus solvatos e hidratos dos mesmos é cristalino, tipo cristal, ou amorfo.

Um primeiro aspecto da segunda modalidade é direcionado a cristalino Rp-4.

Um segundo aspecto da segunda modalidade é direcionado ao cristalino Rp-4 contendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 6,6, 7,1, 9,0, 11,6, 17,9, 20,7, 24,1, 24,4, e 26,2.

Um terceiro aspecto da segunda modalidade é direcionado ao cristalino Rp-4 contendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 6,6, 7,1 , 9,0, 1 1,0, 1 1,6, 12,0, 16,0, 17,9, 19,6, 20,7, 21,0, 21,7, 21,9, 22,2, 23,1 , 24,1 , 24,4, 26,1,27,3, 27,7, e 28,2.

Um quarto aspecto da segunda modalidade é direcionado ao cristalino Rp-4 contendo um padrão de difração de XRPD substancialmente conforme aquele mostrado na Fig. 2.

Um quinto aspecto da segunda modalidade é direcionado a RP-4 contendo os seguintes picos de FT-IR (cm-1): 1742, 1713, 1679, 1460, 1377, 1259, 1 157, e 1079.

Um sexto aspecto da segunda modalidade é direcionado a RP-4 contendo um espectro de FT-IR substancialmente como aquele mostrado na Fig. 15.

Um sétimo aspecto da segunda modalidade é direcionado a substancialmente puro RP-4.

Um oitavo aspecto da segunda modalidade é direcionado a substancialmente puro RP-4.

Um nono aspecto da segunda modalidade é direcionado a substancialmente amorfo RP-4.

Uma terceira modalidade é direcionada a um composto representado pela fórmula Sp-4: Sp-4 O composto representado pela fórmula Sp-4 pode ainda ser parte de um soivato, um hidrato, ou uma mistura de solvato/hidrato. O solvato é designado como Sp-4-nS, enquanto o hidrato é designado como Sp-4-mH20, onde S é um solvente lattice, n varia em uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia em uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula Sp-4 pode não existir como um solvato ou hidrato, mas tem certa quantidade vantajosa de solvente adsorvido (S) ou água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0% em peso % a cerca de 10% em peso baseado no peso do composto representado pela fórmula Sp-4. O composto representado pela fórmula Sp-4 e seus solvatos e hidratos do mesmo é cristalino, tipo cristal, ou amorfo.

Um primeiro aspecto da terceira modalidade é direcionado a cristalino Sp-4.

Um segundo aspecto da terceira modalidade é direcionado para um cristalino monoclínico Sp-4, preferencialmente contendo os seguintes parâmetros de célula unitária em ~ 12,88 A, b ~ 6,17 A, c ~ 17,73 A, e β ~ 92,05°.

Um terceiro aspecto da terceira modalidade é direcionado para um cristalino monocíclico Sp-4, preferencialmente contendo os seguintes parâmetros de célula unitários a - 20,09 A, b ~ 6,10 A, c ~ 23,01 A, e β ~ 112,29°.

Um quarto aspecto da terceira modalidade é direcionado para um cristalino monocíclico Sp-4, preferencialmente contendo os seguintes parâmetros de célula unitários a ~ 12.83 A, b ~ 6,15 A, c ~ 17,63 A, e β ~ 91,75°.

Um quinto aspecto da terceira modalidade é direcionado para um cristalino monocíclico Sp-4, preferencialmente contendo os seguintes parâmetros de célula unitários a ~ 12,93 A, b ~ 6,18 A, c ~ 18,01 A, e β ~ 96,40°.

Um sexto aspecto da terceira modalidade é direcionado para a cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 5,2, 7,5, 9,6, 16.7, 18,3,22,2.

Um sétimo aspecto da terceira modalidade é direcionado para a cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 20- (°) em cerca de: 5,0, 7.3, 9,4, e 18,1.

Um oitavo aspecto da terceira modalidade é direcionado para a cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 20 (°) em cerca de: 4,9, 6,9, 9.8, 19.8, 20,6, 24,7, e 26,1.

Um nono aspecto da terceira modalidade é direcionado para a cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 20 (°) em cerca de: 6,9, 9.8, 19,7, 20,6, e 24,6.

Um nono aspecto da terceira modalidade é direcionado para a cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 5,0, 6.8, 19,9, 20.6, 20,9, e 24,9.

Um décimo aspecto da terceira modalidade é direcionado para um cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 5,2, 6,6, 7,1, 15.7, 19,1, e 25,0.

Um décimo primeiro aspecto da terceira modalidade é direcionado para cristalino Sp-4 contendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 6,1, 8.2.10.4.12.7, 17,2, 17,7, 18,0,18.8, 19,4,19.8,20,1,20.8, 21.8, e 23,3.

Um décimo segundo aspecto da terceira modalidade é direcionado para cristalino Sp-4 contendo um padrão de difração de XRPD substancialmente conforme aquele em qualquer um de Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7, Fig. 8, e Fig 21.

Um décimo terceiro aspecto da terceira modalidade é direcionado para Sp-4 contendo os seguintes picos FT-IR (cm'1) em cerca de: 1743, 1713, 1688, 1454, 1378,1208, e 1082.

Um décimo quarto aspecto da terceira modalidade é direcionado para Sp-4 contendo um espectro FT-IR substancialmente como aquele mostrado na Fig. 7.

Um décimo quinto aspecto da terceira modalidade é direcionado para substancialmente puro Sp-4.

Um décimo sexto aspecto da terceira modalidade é direcionado para substancialmente puro cristalino Sp-4.

Um décimo sétimo aspecto da terceira modalidade é direcionado para substancialmente puro amorfo Sp-4.

Dosagem, Administração e Uso Uma quarta modalidade é direcionada para uma composição para o tratamento e/ou profilaxia de qualquer um dos agentes virais de qualquer composto 4, Rp-4, ou Sp-4. possíveis agentes virais incluem, entre outros: vírus da hepatite C, vírus da hepatite B, vírus da Hepatite A, vírus da Febre do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da dengue, rinovírus, poliovírus, vírus da diarréia bovina viral, vírus da encefalite japonesa, ou a-queles vírus que pertencem aos grupos de pestivírus, hepacivlrus, ou flaviví- rus.

Um aspecto desta modalidade é direcionado para uma composição para o tratamento de qualquer um dosa gentes virais revelados aqui dita composição compreendendo um meio farmaceuticamente aceitável de qualquer excipiente, carreador, diluente, e meio equivalente e qualquer um dos compostos 4, Rp-4, òu Sp-4, que é pretendido para incluir seus hidratos, sol-vatos, e qualquer forma cristalina de qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou Sp-4 ou seus hidratos e solvatos dos mesmos.

Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados em uma ampla variedade de formas de dosagem de administração oral e carreadores. A administração oral pode estar na forma de comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas gelatinosas duras e moles, soluções, emulsões, xaropes ou suspensões. Os compostos 4, RP-4, ou Sp-4 são eficazes quando administrados por administração em supositório, entre outras vias de administração. O modo mais conveniente de administração é geralmente oral usando um regime de dosagem diária conveniente que pode ser ajustado de acordo com a gravidade da doença e a resposta do paciente à medicação antiviral.

Os compostos 4, RP-4, ou Sp-4 juntos com um ou mais convencionais excipientes, carreadores, ou diluentes, podem ser colocados na forma de composições farmacêuticas e dosagens unitárias. As composições farmacêuticas e formas de dosagem unitárias podem ser compreendidas de ingredientes convencionais nas proporções convencionais, com ou sem compostos aditivos adicionais e as formas de dosagem unitárias podem conter qualquer quantidade eficaz do ingrediente ativo proporcionado com a faixa de dosagem diária pretendida a ser empregada. As composições farmacêuticas podem ser empregadas como sólidos, como comprimidos ou cápsulas preenchidas, semissólidos, pós, formulações de liberação sustentada, ou líquidos como suspensões, emulsões, ou cápsulas preenchidas para uso oral; ou na forma de supositórios para administração retal ou vaginal. Uma preparação típica irá conter de cerca de 5% a cerca de 95% de composto ativo ou compostos (p/p).

Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser administrados isolados mas irão geralmente ser administrados na mistura com um ou mais ex-cipientes farmacêuticos apropriados, diluentes ou carreadores selecionados com relação à via de administração pretendida e prática farmacêutica padrão.

As preparações de forma sólida incluem, por exemplo, pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, supositóríos, e grânulos dispersíveis. Um carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias que pode ainda atuar como diluentes, agentes flavorizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes, preservativos, agentes desintegradores de comprimidos, ou um material de encapsulamento. Nos pós, o carreador geralmente é um sólido finamente dividido que é uma mistura com o componente ativo finamente dividido. Em comprimidos, o componente ativo geralmente é misturado com o carreador contendo a necessária capacidade de ligação em proporções apropriadas e compactados na forma e tamanho desejados. Carreadores apropriados incluem, entre outros, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacante, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera de baixa fusão, manteiga de cacau, e semelhantes. As preparações em forma sólida podem conter, além do composto ativo, corantes, flavorizantes, estabilizadores, tampões, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, es-pessantes, agentes solubilizantes, e semelhantes. Exemplos de formulações sólidas são exemplificadas em EP 0524579; US 2002/0142050; US 2004/0224917; US 2005/0048116; US 2005/0058710; US 2006/0034937; US 2006/0057196; US 2006/0188570; US 2007/0026073; US 2007/0059360; US 2007/0077295; US 2007/0099902; US 2008/0014228; US 6.267.985; US 6.294.192; US 6.383.471; US 6.395.300; US 6.569.463; US 6.635.278; US 6.645.528; US 6.923.988; US 6.932.983; US 7.060.294; e US 7.462.608, cada um dos quais é incorporado por referência.

Formulações líquidas são ainda apropriadas para administração oral incluem formulação líquida incluindo emulsões, xaropes, elixires e suspensões aquosas. Estes incluem preparações de formas sólidas que são pretendidos para ser convertidos às preparações de forma líquida logo antes do uso. Exemplos de formulação líquida são exemplificados nas patentes US Nos. 3.994.974; 5.695.784; e 6.977.257. As emulsões podem ser preparadas em soluções, por exemplo, em soluções aquosas de propileno glicol ou podem conter agentes emulsificantes como lecitina, sorbitano monooleato, ou acácia. Suspensões aquosas podem ser preparadas por dispersão do composto ativo finamente dispersa em água com material viscoso, como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e outros agentes de suspensão bem conhecidos.

Os compostos 4, RP-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados para administração como supositórios. Uma cera de baixa fusão, como uma mistura de glicerídeos de ácidos graxos ou manteiga de cacau é primeiro fundida e o componente ativo é homogeneamente disperso, por exemplo, por agitação. A mistura homogênea fundida é então vertida nos moldes de tamanho convenientes, deixados resfriar e solidificar.

Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados para administração vaginal. Pessários, tampões, cremes, géis, pastas ou sprays contendo além do ingrediente ativo como carreadores como são conhecidos na técnica a ser apropriados. Algumas destas formulações podem ainda ser usadas em conjunto com um preservativo com ou sem um agente espermicida.

As formulações apropriadas junto com carreadores farmacêuticos, diluentes e excipientes são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Com-pany, 19th edition, Easton, Pennsylvania, que é aqui incorporado por referência. Um cientista especialista em formulação pode modificar as formulações com os ensinamentos da especificação para fornecer várias formulações para uma via de administração particular sem gerar composições contendo os compostos contemplados aqui instáveis ou comprometendo suas atividades terapêuticas.

Além disso, os compostos purificados 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser independentemente formulados em conjunto com lipossomas ou micelas.

Como para lipossomas, é contemplado que os compostos purificados podem ser formulados de modo conforme revelados nas patentes US 4.797.285; 5.013.556; 5.077.056; 5.077.057; 5.154.930; 5.192.549; 5.213.804; 5.225.212; 5.277.914; 5,316.771; 5,376,380; 5.549.910; 5.567.434; 5.736.155; 5.827.533; 5.882.679; 5.891.468; 6.060.080; 6.132.763; 6.143.321; 6.180.134; 6.200.598; 6.214.375; 6.224.903; 6.296.870; 6.653.455; 6.680.068; 6.726.925; 7.060.689; e 7.070.801, cada um dos quais está aqui incorporado por referência. Como para micelas, é contemplado que os compostos purificados podem ser formulados de modo conforme revelado nas patentes US 5.145.684 e 5.091.188, ambos dos quais são incorporados por referência. A quinta modalidade é direcionada para um uso de qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 na fabricação de um medicamento para o tratamento de qualquer condição o resultado de uma infecção por qualquer um dos seguintes agentes virais:vírus da hepatite C, vírus da febre do Nilo ocidental, vírus da febre amarela, vírus da dengue, rinovírus, poliovírus, vírus da hepatite A, vírus da diarréia bovina viral e vírus de encefalite japonesa. O termo "medicamento" significa uma substância usada em um método de tratamento e/ou profilaxia de um sujeito em necessidade do mesmo, em que a substância inclui, entre outros, uma composição, uma formulação, uma forma de dosagem, e semelhantes, compreendendo qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4. É contemplado que o uso de qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 na produção de um medicamento, para o tratamento de qualquer uma das condições antivirais reveladas aqui, isolado ou em combinação com outro composto revelado aqui. Um medicamento inclui, entre outros, qualquer uma das composições contemplados pela quarta modalidade revelada aqui.

Uma sexta modalidade é direcionada para um método de tratamento e/ou profilaxia em um sujeito em necessidade do mesmo dito método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou Sp-4 ao sujeito. É pretendido que um sujeito em necessidade do mesmo é aque- le que tem qualquer condição que resulta de uma infecção por qualquer um dos agentes virais revelados aqui, que inclui, entre outros, vírus da hepatite C, Vírus da febre do Nilo ocidental, vírus da febre amarela, vírus da dengue, rinovírus, poliovírus, vírus da hepatite A, vírus da diarréia bovina viral ou Vírus da encefalite japonesa, vírus flavivírus ou pestivírus ou hepacivírus ou um agente viral causando sintomas equivalentes ou comparáveis a qualquer um dos vírus acima listados. O termo "sujeito" significa um mamífero que inclui, entre outros, gado, porcos, ovelha, galinha, peru, búfalo, lhama, avestruz, cães, gatos, e humanos, preferencialmente o sujeito é um humano. É contemplado que no método de tratar um sujeito do mesmo da nona modalidade pode ser qualquer um dos compostos contemplados aqui, isolados ou em combinação com outro composto revelado aqui. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" conforme usado aqui significa uma quantidade requerida para reduzir sintomas da doença em um indivíduo. A dose será ajustadas aos requisitos individuais em cada caso particular. Aquela dosagem pode variar dentro de limites dependendo de vários fatores como a gravidade da doença a ser tratada, a idade, e condições de saúde geral do paciente, outros medicamentos com os quais o paciente está sendo tratado, a via e forma de administração e as preferências e experiência do médico envolvido. Para administração oral, uma dosagem diária dentre cerca de 0,001 e cerca de 10 g, incluindo todos os valores entre, como 0,001, 0,0025, 0,005, 0,0075, 0,01, 0,025, 0,050, 0,075, 0,1, 0,125, 0,150, 0,175, 0,2, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, e 9,5, por dia deve ser apropriado em monoterapia e/ou em terapia de combinação. Uma dosagem diária particular está entre cerca de 0,01 e cerca de 1 g por dia, incluindo todos os valores incrementais de 0,01 g (ou seja, 10 mg) entre, uma dosagem diária preferencial cerca de 0,01 e cerca de 0,8 g por dia, mais preferencialmente cerca de 0,01 e cerca de 0,6 g por dia, e mais preferencialmente cerca de 0,01 e cerca de 0,25 g por dia, cada um dos quais incluindo todos os valores incrementais de 0,01 g entre. Geralmente, o tratamento é iniciado com uma grande "dose de ataque" inici- al para rapidamente reduzir ou eliminar o vírus seguido por uma redução a um nível suficiente para prevenir o ressurgimento da infecção. Um especialista na técnica de tratamento de doenças descritas aqui será capaz, sem experimentação indevida e em dependência e as revelações desta aplicação, para verificar uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto revelado para certa doença e paciente. A eficácia terapêutica pode ser verificada de testes de função hepática incluindo, entre outros a níveis de proteína como proteínas séricas (por exemplo, albumina, fatores de coagulação, fosfatase alcalina, amino-transferases (por exemplo, alanina transaminase, aspartato transaminase), 5'-nucleosidase, γ-glutaminiltranepeptidase, etc.), síntese de bilirubina, síntese de colesterol, e síntese de ácidos biliares; uma função metabólica hepática, incluindo, entre outros, metabolismo de carboidrato, metabolismo de aminoácido e amônia. Alternativamente a efetividade terapêutica pode ser monitorada medindo HCV-RNA. Os resultados destes testes permitirão que a dose seja otimizada.

Um primeiro aspecto da sexta modalidade é direcionado para um método de tratamento e/ou profilaxia em um sujeito em necessidade do mesmo dito método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto representado por qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 e uma quantidade terapeuticamente efetiva de outro agente antiviral; em que a administração é concorrente ou alternativa. É entendido que o tempo entre a administração alternativa pode variar entre 1-24 horas, que inclui qualquer sub-faixa entre incluindo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, e 23 horas.

Exemplos de "outros agentes antivirais" incluem, entre outros: I-nibidores de protease NS3 de HCV (vide EP 1881001, US 2003187018, US 2005267018, WO 2003006490, WO 200364456, WO 2004094452, WO 2005028502, WO 2005037214, WO 2005095403, WO 2007014920, WO 2007014921, WO 2007014922, WO 2007014925, WO 2007014926, WO 2007015824, WO 2008010921, e WO 2008010921; Inibidores NS5B de HCV (vide US 2004229840, US 2005154056, US 2005-98125, US 20060194749, US 20060241064, US 20060293306, US 2006040890, US 2006040927, US 2006166964, US 2007275947, US 6784166, US20072759300, WO 2002057287, WO 2002057425, WO 2003010141, WO 2003037895, WO

2003105770, WO 2004000858, WO 2004002940, WO 2004002944, WO

2004002977, WO 2004003138, WO 2004041201, WO 2004065367, WO

2004096210, WO 2005021568, WO 2005103045, WO 2005123087, WO

2006012078, WO 2006020082, WO 2006065335, WO 2006065590, WO 2006093801, WO 200702602, WO 2007039142, WO 2007039145, WO 2007076034, WO 2007088148, WO 2007092000, e W02007095269); Inibidores NS4 de HCV (vide WO 2005067900 and WO 2007070556); Inibidores de NS5a HCV (vide US 200627651 1, WO 2006035061, WO 2006100310, WO 2006120251, e WO 2006120252); Agonistas de receptor tipo Toll (vide WO 2007093901); e outros inibidores (vide WO 2000006529, WO 2003101993, WO 2004009020, WO 2004014313, WO 2004014852, and WO 2004035571); e compostos revelados aqui no pedido de patente US No. 12/053.015, depositado em 21 de março de 2008 (US 2010/0016251) (os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência), interferon-α, in-terferon-β, interferon-a peguilado, ribavirina, levovirina, viramidina, outro inibidor de HCV polimerase nucleosídeo, um inibidore de HCV polimerase não nucleosídeo, um inibidor de HCV protease, um inibidor de HCV helicase ou um inibidor de fusão HCV.

Quando qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 são administrados com outros agentes antivirais a atividade pode ser aumentada durante o composto parente. Quando o tratamento é terapia de combinação, dita administração pode ser concorrente ou sequencial com relação àqueles dos derivados de nucleosídeo. "Administração concorrente" conforme usado aqui isto inclui administração de agentes ao mesmo tempo ou em diferentes tempos. A administração de dois ou mais agentes ao mesmo tempo pode ser obtido por uma formulação líquida contendo dois ou mais ingredientes ou por substancialmente administração simultânea de duas ou mais formas de dosagem com um único agente ativo.

Deve ser entendido que as referências aqui para o tratamento se estendem para profilaxia bem como ao tratamento de condições existentes. Além disso, o termo "tratamento" de uma infecção por HCV, conforme usado aqui, ainda inclui o tratamento ou profilaxia de uma doença ou uma condição associada com ou mediada por infecção HCV, ou os sintomas clínicos dos mesmos.

Preparação Uma sétima modalidade é direcionada para um processo para a preparação de qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4, que compreende: a) reagir um isopropil-alanato, A, um di-LG-fenilfosfato, B, 2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metiluridina, 3, e uma base para obter uma primeira mistura compreendendo pelo menos um de Sp-4 e Rp-4 Λ B 3 em que X é uma base conjugado de um ácido, n é 0 ou 1, e LG é um grupo de saída; b) reagir a primeira mistura com um composto de proteção para obter uma segunda mistura compreendendo pelo menos um de Sp-4 protegido e Rp-4 protegido; e c) opcionalmente submetendo a mistura a cristalização, cromatografia ou extração para obter 4, Sp-4, ou Rp-4.

Em um primeiro aspecto da sétima modalidade, o isopropil ala-nato está presente como seu ácido clorídrico, que é preferencialmente, substancialmente anidro.

Em um segundo aspecto da sétima modalidade, a base é N-metilimidazol.

Em um terceiro aspecto da sétima modalidade, a proporção em mole de A-para-B-para-3 é cerca de 1,6-para-1,3-a -I.

Em um quarto aspecto da sétima modalidade, o composto de proteção é t-butil-dimetil-silil-cloreto.

Uma oitava modalidade é direcionada para um processo de para a preparação Sp-4 ou Rp-4, que compreende: a) reagir um isopropil-alanato, A, um di-LG-fenilfosfato, B, 2’-deoxi-2'-flúor-2,-C-metiluridina, 3, e uma base para obter uma primeira mistura compreendendo pelo menos um de Sp-4 e Rp-4 A B 3 em que X é uma base conjugada de um ácido, n é 0 ou 1, e LG é um grupo de saída; e b) opcionalmente submetendo a segunda mistura à cristalização, cromatografia, ou extração para obter Sp-4 ou RP-4 purificado.

Um primeiro aspecto da oitava modalidade para preparar Rp-4 adicionalmente inclui ainda purificar a segunda mistura ou o RP-4 purificado pela dissolução ou suspensão da segunda mistura ou a mistura de RP-4 purificado em um solvente; opcionalmente seguido por semeadura com cristalino RP-4; e adicionando antissolvente suficiente para obter RP-4 cristalino.

Um segundo aspecto da oitava modalidade para preparar Sp-4 adicionalmente inclui ainda purificar a segunda mistura ou o Sp-4 purificado por d) dissolução ou suspensão da segunda mistura ou o Sp-4 purificado em um solvente seguido por semeadura com Sp-4 cristalino em cerca de temperatura ambiente; coletar um primeiro sólido a maior parte do qual compreende Sp-4; dissolver o primeiro sólido em um solvente como sua temperatura de refluxo; e resfriar ou adicionar um antissolvente para obter um segundo sólido.

Um terceiro aspecto da oitava modalidade para a preparação de Sp-4, adicionalmente inclui ainda purificar Sp-4 by d) dissolver ou suspender a segunda mistura ou a mistura de Sp-4 purificado em um primeiro solvente seguido pela adição de um antissolvente de modo a obter uma primeira composição em que o solvente residual/antissolvente é removido por decantação para obter um resíduo; tratar o resíduo com uma solução contendo o primeiro solvente e antissolvente para gerar uma segunda composição por meio da qual na redução a pressão gera um primeiro sólido; dissolver ou suspender o primeiro sólido usando um segundo solvente de modo a obter uma terceira composição; adicionar cristais sementes de Sp-4 à terceira composição; coletar um segundo sólido; dissolver ou suspender o segundo sólido em um terceiro solvente, opcionalmente aquecido em temperatura de refluxo do terceiro solvente para obter uma quarta composição, e, se necessário, resfriar a quarta composição para obter um terceiro sólido compreendendo Sp-4 que é coletado por filtração.

Em um quarto aspecto da oitava modalidade para a preparação de Sp-4, Sp-4 é ainda purificado pela segunda mistura ou o Sp-4 purificando por d) adição de gel à segunda mistura ou o Sp-4 purificado seguido por e-vaporação do solvente para obter uma pasta seca; agitar a pasta seca em um primeiro solvente/antissolvente combinação para obter uma primeira tímida; decantar o primeiro solvente/antissolvente combinação da primeira pasta úmida para obter uma segunda pasta úmida e uma primeira composição; adicionar à segunda pasta úmida uma segunda combinação de solvente/antissolvente seguido por agitação; decantar a segunda combinação de solvente/antissolvente da segunda pasta úmida para obter uma terceira pasta úmida e uma segunda composição; opcionalmente repetindo etapas g)-h) na terceira pasta úmida ou pastas úmidas adicionais; evaporar o solvente da segunda composição, e opcionalmente qualquer composição adicional obtida de outra etapa opcional i) para obter um primeiro sólido; dissolver ou suspender o primeiro sólido em uma solução contendo um terceiro solvente e opcionalmente um quarto solvente para obter uma terceira composição; opcionalmente adicionar cristais em sementes de Sp-4 à terceira composição; obtendo da terceira composição e um segundo sólido compreendendo Sp-4; e opcionalmente recristalizar o segundo sólido usando um terceiro solvente para obter um terceiro sólido compreendendo Sp-4.

Um especialista na técnica irá apreciar que os compostos podem ser separados por extração tradicional, cristalização tradicional ou técnicas cromatográficas tradicionais. As técnicas cromatográficas tradicionais incluem, entre outros, cromatografia em sílica gel (usando, por exemplo, 3-5% metanol em DCM ou 4-6% isopropanol em DCM) para produzir níveis melho- rados de um isômero (50-100%) e em seguida cristalizá-lo. Alternativamente, pode-se usar cromatografia de fase reversa (usando, por exemplo, 1-30% de fase móvel aquosa de acetonitrila). Além disso, os compostos podem ser isolados por cromatografia em fluido supercrítico SFC com dióxido de carbono como o principal solvente e álcoois como metanol como um modificador, preferencialmente usando o meio quiral apropriado, como, Daicel Chiralpack IA. Alternativamente, cromatografia SMB pode ser empregada usando o meio quiral apropriado, como, Daicel ChiralPack IA, usando uma mistura de solventes como hexanos/isopropanol ou solventes simples como acetato de etil.

Uma nona modalidade é direcionada para um processo para preparar Sp-4, que compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato com um 3'-0-protegido ou 3 desprotegido, e um reagente básico para obter uma composição compreendendo Sp-4 protegido ou desprotegido. em que o isopropil-alanil-fosforamidato é compreendido de uma mistura de diastereoisômeros representados pelas seguintes estruturas: em que a proporção de C:C' é cerca de 1: 1.

Em um primeiro aspecto, o reagente básico é cloreto t- butilmagnésio e a proporção de C:C' é maior do que ou igual a cerca de 1:1.

Em um segundo aspecto, o reagente básico é cloreto t- butilmagnésio e a proporção de C:C'; é maior do que cerca de 1:1.

Em um terceiro aspecto, o reagente básico é cloreto t- butilmagnésio e a proporção de C:C' é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4: 1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19: 1, cerca de 32,3: 1, cerca de 49:1, ou cerca de 99: 1.

Em um quarto aspecto o LG' é selecionado dentre, 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2-nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4-diclorofenóxido, e pentafluorfenóxido, o reagente básico é cloreto t-butilmagnésio, e a proporção de C:C' é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7: 1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1.

Um quinto aspecto para preparar Sp-4, compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato (C) com um 3'-0-protegido ou 3 desprotegido, e um reagente básico para obter uma composição compreendendo Sp-4 protegido ou desprotegido 3 C em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio; LG' é um grupo de saída; e b) opcionalmente submeter o Sp-4 protegido ou desprotegido obtido a cromatografia, extração, ou cristalização para obter Sp-4 protegido ou desprotegido purificado. Em uma sub-modalidade, LG' é tosilato, canfor-sulfonato, ou um arilóxido substituído por pelo menos um grupo de retirada de elétron; mais preferencialmente, LG' é selecionado dentre 2,4-dinitrofenóxído, 4-nitrofenóxido, 2-nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4-diciorofenóxido, ou pentafluorfenóxido. Em outra sub-modalidade, quando Sp-4 é protegido, ou seja, Z não é hidrogênio, o processo da nona modalidade é ainda direcionada para desproteger Sp-4 protegido. Em outra sub-modalidade, a reação é conduzida em um solvente polar aprótico, como, tetrahidrofurano ou outro solvente étero seja sendo isolado ou em combinação com cada outro ou com um C2 a C7 nitrila, como acetonitrila. O processo da nona modalidade ainda compreende 1) reagir (LG')P(0)(LG)2, em que LG, independente de LG', é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (LG')P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) seguido por reação de (LG')P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C, (ii) fenol e uma primeira base para obter (LG')P(0)(LG)(0Ph) seguido pela reação (LG')P(0)(LG)(0Ph) com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C', ou (iii) combinar isopropil-alanato, fenol, e pelo menos uma base para obter uma mistura compreendendo C e C'; ou 2) reagir (Ph0)P(0)(LG)2, em que LG é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (PhO)P(0)(LG)(NHAIa-Pr) seguido por reação (PhO)P(0)(LG)(NHAIa-Pr) com um precursor de grupo de saída (LG'H) e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C\ c c* e submeter a mistura à cromatografia ou cristalizar a mistura para obter C. Em um aspecto a nona modalidade, o isopropil alanato está presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferencialmente, substancialmente anidro.

Uma décima modalidade é direcionada para um processo para preparar Rp-4, que compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato com um 3'-0-protegido ou 3 desprotegido, e um reagente básico para obter uma composição compreendendo Rp-4 protegido ou desprotegido. mistura de diastereoisômeros em que o isopropil-alanil-fosforamidato é compreendido de uma mistura de diastereoisômeros representados pelas seguintes estruturas: c c em que a proporção de C':C é cerca de 1:1.

Em um primeiro aspecto, o reagente básico é cloreto t- butilmagnésio e a proporção de C':C é maior do que ou igual a cerca de 1:1.

Em um segundo aspecto, o reagente básico é cloreto t- butilmagnésio e a proporção de C':C; é maior do que cerca de 1:1.

Em um terceiro aspecto, o reagente básico é cloreto t- butilmagnésio e a proporção de C':C é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3 :1, cerca de 49:1, ou cerca de 99: 1.

Um quarto aspecto o LG' é p-nitrofenóxido, o reagente básico é cloreto t-butilmagnésio, e a proporção de C':C é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1.

Um quinto aspecto para preparar Rp-4, compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato (C) com um 3'-0-protegido ou 3 desprotegido, e um reagente básico para obter uma composição compreendendo Rp-4 protegido ou desprotegido. 3 C' em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio; LG' é um grupo de saída; e b) opcionalmente submeter o Rp-4 protegido ou desprotegido a cromatografia, extração, ou cristalização para obter Rp-4 protegido ou desprotegido purificado. Na sub-modalidade, LG' é tosilato, canforsulfonato, ou um arilóxido substituído por pelo menos um grupo de retirada de elétron; mais preferencialmente, LG' é selecionado dentre p-nitrofenóxido, 2,4-dinitrofenóxido, e pentafluorfenóxido. Em outra sub-modalidade, quando Rp-4 é protegido, ou seja, Z não é hidrogênio, o processo da nona modalidade é ainda direcionado para desproteger o RP-4 protegido. Em outra sub-modalidade, a reação é conduzida em um solvente polar aprótico, como, tetrahidrofurano ou outro solvente etéreo um sendo usado isolado ou em combinação com cada outro ou com a C2 a C7 nitrila, como acetonitrila. O processo da décima modalidade ainda compreende 1) reagir (LG')P(0)(LG)2, em que LG, independente de LG', é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (LG')P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) seguido pela reação (LG')P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C1, (ii) fenol e uma primeira base para obter (LG')P(0)(LG)(0Ph) seguido por reação (LG')P(0)(LG)(0Ph) com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C', ou (iii) combinando isopropil-alanato, fenol, e pelo menos uma base para obter uma mistura compreendendo C e C'; ou 2) reagir (Ph0)P(0)(LG)2, em que LG', independente de LG, é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (PhO)P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) seguido pela reação de (PhO)P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) com um precursor de grupo de saída e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C\ C C’ e submeter a mistura à cromatografia ou cristalização da mistura para obter C1. Em um aspecto da nona modalidade, o isopropil alanato está presente como seu ácido clorídrico, que é preferencialmente, substancialmente anidro.

Uma décima primeira modalidade é direcionada para uma composição obtida pelos processos recitados na sétima modalidade, a oitava modalidade, a nona modalidade ou a décima modalidade bem como seus aspectos respectivos. Um aspecto da décima primeira modalidade é direcionado para uma composição obtida por uma das modalidades exemplificadas reveladas abaixo. A composição assim obtida pode ser cristalina, tipo cristal, amorfo, ou uma combinação do mesmo.

Uma décima segunda modalidade é direcionada para um composto 3 3 em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio; que é útil para a preparação de - RP-4 ou Sp-4.

Um primeiro aspecto da décima segunda modalidade é selecionado dentre um composto contendo a seguinte estrutura 3a: Z = -C(0)CH2CH2C(0)CH3 3b: Z = -C(0)0CH2Ph 3c: Z = -Si(Me)2*Bu 3d: Z = -SiCPOzOSiCPrhOH.

Uma décima terceira modalidade é direcionada para um composto, seu sal, hidrato, solvato, ou combinação do mesmo, representado pelas seguintes estruturas C c onde LG' é um grupo de saída, que é útil para a preparação de Rp-4 ou Sp-4.

Em um primeiro aspecto da décima terceira modalidade, LG1 é tosilato, canforsulfonato, um arilóxido, ou um arilóxido substituído por pelo menos um grupo de retirada de elétron.

Em um segundo aspecto da décima terceira modalidade, L é selecionado dentre 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2-nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4-diclorofenóxido, ou pentafluorfenóxido.

Em um terceiro aspecto da décima terceira modalidade, LG é pentafluorfenóxido ou 4-nitro-fenóxido.

Um quarto aspecto da décima terceira modalidade é direcionado para composto C, em que LG' é 2,4-dinitrofenóxido, 4-nitrofenóxido, 2-nitrofenóxido, 2-cloro-4-nitrofenóxido, 2,4-diclorofenóxido, ou pentafluorfenóxido.

Um quinto aspecto da décima terceira modalidade é direcionado para composto C, em que LG é 4-nitrofenóxido ou pentafluorfenóxido.

Um sexto aspecto da décima terceira modalidade é direcionado para composto C, em que LG é 4-nitrofenóxido.

Um sétimo aspecto da décima terceira modalidade é direcionado para cristalino composto C, em que LG é 4-nitrofenóxido.

Um oitavo aspecto da décima terceira modalidade é direcionado para composto C, em que LG é pentafluorfenóxido.

Um nono aspecto da décima terceira modalidade é direcionado para composto cristalino C, em que LG é pentafluorfenóxido.

Uma décima quarta modalidade é direcionada para um processo para preparar um composto representado pela fórmula estrutural cristalizar o composto de uma composição, compreendendo a) uma primeira composição; b) um segundo precursor de grupo de saída; c) uma base não nucleofílica; e d) uma composição líquida;

Em que a primeira composição compreende o composto e seus correspondentes diastereoisômeros a base de P.

Em um primeiro aspecto da décima quarta modalidade, a quantidade de mole do composto e a quantidade de mol de seu diastereoisômero a base de P são os mesmos ou diferentes.

Em um segundo aspecto da décima quarta modalidade, a quantidade de mole do composto é maior do que a quantidade de mole de seu diastereoisômero a base de P correspondente ou vice versa.

Em um terceiro aspecto da décima quarta modalidade, o segundo precursor de grupo de saída é 2,4-dinitrofenol, 4-nitrofenol, 2-nitrofenol, 2-cloro-4-nitrofenol, 2,4-diclorofenol, ou pentafluorfenol.

Em um quarto aspecto da décima quarta modalidade, LG' é pentafluorfenóxido. Em um primeiro sub-aspecto, o segundo precursor de grupo de saída é pentafluorfenol. Em um segundo aspecto, a quantidade de pentafluorfenol varia de cerca de 0,01 equivalente de moles a cerca de 10 equivalentes de moles em relação à quantidade de mole do composto e seu diastereoisômero a base de P e todos os equivalentes de mole entre. Em um terceiro aspecto, a quantidade de pentafluorfenol varia de cerca de 0,1 equivalente de moles a cerca de 1 equivalente de moles em relação à quantidade de mole do composto e seu diastereoisômero a base de P e todos os moles equivalentes entre.

Em um quinto aspecto da décima quarta modalidade, a cristalização ocorre em uma temperatura que varia de cerca de -10°C a cerca de +40°C e todos os valores de temperatura entre. Em um primeiro aspecto, a cristalização ocorre em cerca de temperatura ambiente.

Em um sexto aspecto da décima quarta modalidade, a base não nucleofílico é selecionada dentre carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropiletilamina, trietilamina, quinuclidine, naftaleno- 1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, a 2,6-di-Ci^-alquil-piridina, um 2,4,6-tri-Ci_6-alquil-piridina, e misturas dos mesmos. Em um primeiro sub-aspecto, a base não riucleofílica é trietilamina ou 1,8-diazabicicloundec-7-eno. Em um segundo sub-aspecto, a base não nucleofílica é trietilamina.

Em um sétimo aspecto da décima quarta modalidade, a base não nucleofílica base está presente em uma quantidade que varia de cerca de 0,01 equivalente de mol a cerca de 10 equivalentes de moles, e todos os moles equivalentes entre, em relação à quantidade mole total dõ composto e seu diastereoisômero a base de P. Em um primeiro sub-aspecto, a base nucleofílica está presente em uma quantidade que varia de cerca de 0,1 equivalente de moles a cerca de 1 equivalente de moles, e todos os moles equivalentes entre, em relação à quantidade total de mole do composto e seu diastereoisômero a base de P .

Em um oitavo aspecto da décima quarta modalidade, a solubili-dade do composto é menos do que a solubiiidade de seu diastereoisômero correspondente baseado em P na composição líquida ou vice versa.

Em um nono aspecto da décima quarta modalidade, a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um antissolvente. Em um primeiro sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de um Ci a Ce álcool, um C2a Ce éter, um C3 a C7cetona, um Cea C7 éster, um Ò1 a C2 clorocarbono, um C2 a C7 nitrila, um C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado, e um Ce a Ci2 hidrocarboneto aromático. Em um segundo sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de C2 a Ce éter, um C3 a C7 éster, a C5 a C12 hidrocarboneto saturado, e um C6 a C12 hidrocarboneto aromático. Em um terceiro sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de um C2 a Ce éter, um C3 a C7 éster, e um C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado. Em um quarto sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de etil acetato, t-butil-metiléter, e hexano. Em um quinto sub-aspecto, a composição líquida compreende etil acetato e hexano. Em um sexto sub-aspecto, a composição líquida compreende t-butil-metiléter e hexano.

Em um décimo aspecto da décima quarta modalidade, a quantidade de composição líquida varia de cerca de 1 mL a cerca de 10 mL para cada grama da primeira composição e todos os valores mL/g entre.

Um décimo primeiro aspecto da décima quarta modalidade ainda compreende adicionar composto cristalino à composição. Um primeiro sub-aspecto ainda compreende adicionar cerca de 0,1 a cerca de 1% em peso e todos os valores % em peso entre estes, de composto cristalino à primeira composição.

Um décimo segundo aspecto da décima quarta modalidade ainda compreende a) reagir Ph0P(0)(LG)2 e 'Pr-Ala-NH2*HC1 na presença de uma primeira base para obter (PhO)P(0)(LG)(NHAIa-'Pr); b) reagir (PhO)P(0)(LG)(NHAIa-'Pr) com um primeiro precursor de grupo de saída (LG'H) na presença de uma segunda base para obter a composição compreendendo o composto e seu diastereoisômero a base de P; em que LG e LG', independente de cada outro, são grupos de saída; em que o primeiro precursor de grupo de saída e o segundo precursor de grupo de saída são os mesmos ou diferentes; e em que a primeira base e a segunda base são as mesmas ou diferentes.

Uma décima quinta modalidade é direcionada para um processo para preparar (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi) fosforil)amino)pro-panoato cristalino contendo a seguinte estrutura que compreende: cristalizar (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil) a- mino)propanoato de uma segunda composição compreendendo a) uma primeira composição; b) pentafluorfenoi; c) uma base não nucleofílica; e d) uma composição líquida; em que a primeira composição compreende (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato e (S)- isopropil 2-(((R)- (per-fluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

Em um primeiro aspecto da décima quinta modalidade, a quantidade de mole de (S)-isopropil 2-(((S)- )-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino) propanoato e a quantidade de mole de (S)-isopropil 2-(((R)- (perfluorfeno-xi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato são a mesma ou diferente.

Em um segundo aspecto da décima quinta modalidade, a quantidade de mole de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil) ami-no)propanoato é maior do que a quantidade de mole de (S)-isopropil 2-(((R)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

Em um terceiro aspecto da décima quinta modalidade, a quantidade de pentafluorfenoi varia de cerca de 0,01 moles equivalentes a cerca de 10 moles equivalentes (e todos os valores de moles equivalentes entre estes) em relação à quantidade de mole de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfe-noxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoàto e (S)-isopropil 2-(((R)- (perfluorfeno-xi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato. Em um primeiro sub-aspecto, a quantidade de pentafluorfenoi varia de cerca de 0,1 equivalente de moles a cerca de 1 equivalente de moles (e todos os moles equivalentes entre estes) em relação à quantidade de mole de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi) (feno-xi)fosforil)amino)propanoato e (S)-isopropil 2-(((R)-(perfluorfenoxi)(fenoxi) fosforil)amino)propanoato.

Em um quarto aspecto da décima quinta modalidade, a cristalização ocorre em uma temperatura que varia de cerca de -10°C a cerca de +40°C e todos os valores de temperatura entre estes. Em um primeiro aspecto, a cristalização ocorre em cerca de temperatura ambiente.

Em um quinto aspecto da décima quinta modalidade, a base não nucleofílica é selecionado dentre carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropiletilamina, trietilamina, quinuclidine, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, l,8-diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-Ci^-alquil-piridina, a 2,4,6-tri-Ci-6-alquil-piridína, e misturas dos mesmos. Em um primeiro sub-aspecto, a base não nucleofílica é trietilamina ou 1,8-diazabicicloundec-7-eno. Em um segundo sub-aspecto, a base não nucleofílica é trietilamina.

Em um sexto aspecto da décima quinta modalidade, a base não nucleofílica está presente em uma quantidade que varia de cerca de 0,1 a cerca de 1 equivalente de moles (e todos os moles equivalentes entre estes) em relação à quantidade de mol total de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi) (fenoxi)fosforil)amino)propanoato e (S)-isopropil 2-(((R)-(perfluorfenoxi)(feno-xi)fosforii)amino)propanoato.

Em um sétimo aspecto da décima quinta modalidade, a solubili-dade de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato é menos do que a solubilidade de (S)-isopropil 2-(((R)- (perfluorfenoxi) (feno-xi)fosforil)amino)propanoato na composição líquida.

Em um oitavo aspecto da décima quinta modalidade, a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um antissolvente. Em um primeiro sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de a Ci a Ce álcool, um C2 a C8 éter, um C3 a C7 cetona, um C3 a C7 éster, a C1 a Ç2 clorocarbono, um C2 a C7 nitrila, um C5 a C|2 hidrocarbo-neto saturado, e um C6 a C|2 hidrocarboneto aromático. Em um segundo sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, um C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado, e C6 a Ci2 hidrocarboneto aromático. Em um terceiro sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, e um C5 a Ci2 hidrocarboneto saturado. Em um quarto sub-aspecto, a composição líquida compreende pelo menos um de etil acetato, t-butil-metiléter, e hexano. Em um quinto sub-aspecto, a composição líquida compreende etil acetato e hexano. Em um sexto sub-aspecto, a composição líquida compreende t-butil-metiléter e hexano.

Em um nono aspecto da décima quinta modalidade, a quantidade de composição líquida varia de cerca de 1 a cerca de 10 mL para cada grama (e todos os valores em ml_/g entre estes) da primeira composição.

Um décimo aspecto da décima quinta modalidade ainda compreende adicionar (S)-isopropil 2-(((S)- (perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil) ami-no)propanoato cristalino à segunda composição.

Um décimo primeiro aspecto da décima quinta modalidade ainda compreende adicionar cerca de 0,1 a cerca de 1% em peso (e todos os valores % em peso entre estes) de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi) (fe-noxi)fosforil)amino)propanoato cristalino baseado em peso total de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato na primeira composição.

Uma décima sexta modalidade é direcionada para (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato cristalino obtido pelo processo da décima quinta modalidade.

Uma décima sétima modalidade é direcionada para um processo para preparar (S)-isopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2I4-dioxo-3,4-dihidro-pirimidin-1(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato, que compreende: cristalizar (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil) a-mino)propanoato de uma segunda composição compreendendo a) uma primeira composição; b) pentafluorfenol; c) uma base não nucleofílica; e d) uma composição líquida; em que a primeira composição compreende (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato e (S)- isopropil 2-(((R)- (per-fluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

Um primeiro aspecto da décima sétima modalidade é direcionado para um processo para preparar (S)-isopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fiuoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2-il) metoxi) (fenoxi)fosforil)amino)propanoato, que compreende: contatar (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil) ami-no)propanoato com um produto obtido pela reação de um haleto de t-butil-magnésio com l-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metilte-trahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona com um haleto de t-butil-magnésio.

Em um segundo aspecto da décima sétima modalidade, o contato ocorre em um meio contendo uma temperatura que varia de cerca de 0°C a cerca de 40°C e todos os valores de temperatura entre estes.

Em um terceiro aspecto da décima sétima modalidade, o contato ocorre em um meio contendo uma temperatura que varia de cerca de 0°C a cerca de 30°C e todos os valores de temperatura entre estes.

Em um quarto aspecto da décima sétima modalidade, a proporção em mole de haleto de t-butilmagnésio a l-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidroxÍ-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona varia de cerca de 2 a cerca de 2,2. Em um primeiro sub-aspecto, a proporção em mole de haleto de t-butilmagnésio a1-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor- 4- hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona é cerca de 2,1.

Em um quinto aspecto da décima sétima modalidade, o haleto de t-butilmagnésio é cloreto t-butilmagnésio.

Uma décima oitava modalidade é direcionado para um processo para preparar substancialmente (S)-isopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1 (2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato puro, que compreende: obter (S)-isopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihi-dropirimidin-1(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato de acordo com qualquer uma das relevantes modalidades reveladas aqui, e cristalizar o assim formado (S)-isopropil 2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)- 5- (2,4-dioxo-3 ,4-dihidropirimidin-1 (2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiltetrahidro-furano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

Uma décima nona modalidade é direcionada para um análogo marcado isotopicamente de RP-4 ou Sp-4. O termo análogo "isotopicamente marcado" se refere a um análogo de RP-4 ou Sp-4 que é um "análogo deute-rado", um análogo "13C-marcado," ou um "análogo deuterado/13C-marcado." O termo "análogo deuterado" significa um composto descrito aqui, por meio do qual um isótopo H, ou seja, hidrogênio (H), é substituído por um isótopo H, ou seja, deutério (D). A substituição por deutério pode ser parcial ou completo. A substituição de deutério parcial significa que pelo menos um hidrogênio é substituído por pelo menos um deutério. Por exemplo, para RP-4 ou Sp-4, um especialista pode contemplar pelo menos os seguintes análogos parciais deuterados (onde "dn" representa o número n de átomos deutério, como, por um grupo isopropil n = 1-7, enquanto para um grupo fenil, n = 1-5), bem como aqueles descritos abaixo.

Embora os grupos metil descritos acima são mostrados como sendo completamente deuterados, reconhece-se que as variações deutera-das parciais são ainda possíveis, como, -CDH2 e -CD2H. Marcadores isotó-picos em furanose e base são ainda contemplados. Da mesma forma, os termos "análogos 13C marcados" e "análogo deuterado/13C marcado" se refere a um composto descrito aqui, por meio do qual o átomo de carbono é enriquecido com um 13C-isótopo significando que a extensão do enriquecimen- to excede a abundância natural normal de cerca de 1,1%.

Exemplos Não sendo limitado por meio de exemplos, os seguintes exemplos servem para facilitar o melhor entendido da revelação.

Aspectos Sintéticos Para preparar o nucleosídeo uridina, pode-se ter vantagem de um intermediário avançado tribenzoilado citidina na síntese de certos análogos 3',5'-daicilado de 3 (ver abaixo) já produzido de forma eficiente em uma escala de planta piloto (ver WO 2006/031725 ou US 2006/0122146, ambos dos quais são incorporados por referência em sua totalidade). O seguinte método demonstrou ser escalonável e custo eficiente. 12 3 3',5'-0-dibenozil-2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metil-N4-benzoilcitidina (1) é obtido por um método revelado em WO 2006/031725 e WO 2008/045419 ambos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. 1 é tratado com 70% ácido acético aquoso para formar S^õ-O-dibenozil^-deoxi^-flúor-2’-C-metil-uridina (2). Os ésteres benzoil podem ser hidrolisados por um número de métodos como tal, por exemplo, alcóxidos em solvente alcoólico, como metóxido de sódio em metanol, carbonato de potássio em metanol, ou análogos de etanol, alquilaminas como metilamina em metanol, butilamina etc. Amônio metanólico foi escolhido para o trabalho de escala maior. O produto uridina (3) pode ser purificado por cristalização para gerar 70% d rendimento de tribenzoilado citidina (1). Vários procedimentos de literatura detalham diferentes vias e condições para gerar fosforamidatos usando equivalentes em vezes de rea-gentes. Ver, por exemplo, McGuigan et al. J. Med. Chem. 2005, 48, 3504-3515 and McGuigan et al. J. Med. Chem. 2006, 49, 7215. Para trabalho de escala de processo, há somente um exemplo atualmente conhecido, que é revelado em Lehsten et al., Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 819-822 ("Lehs-ten"). Nesta referência, os autores introduzem o conceito de um "procedimento de um recipiente" em que um sal cloridrato de aminoácido e fenil di-clorofosfato são reagidos juntos com N-metilimidazol em diclorometano. Depois, o nucleosídeo é adicionado para formar o produto desejado 5-0-fosforamidato, que no presente caso podería gerar um composto representado pela fórmula 4. Infelizmente, o procedimento Lehsten tem desvantagens. Por exemplo, o procedimento Lehsten utilizou um excesso maior de reagentes do que foi necessário que adicionou ao custo e dificuldade de purificação cromatográfica. Além disso, Lehsten sugeriu que pode-se controlar a seletividade de reação em 5'-hidroxil sobre o 3'-hidroxil comprado à uma referência de literatura através do uso de temperaturas mais baixas e adição lenta de nucleosídeo. 4 5 6 5'-0-fosforamidato 3'-0-fosforamidato 3',5'-bis-0-fosforamidato (2 diastereoisômeros) (2 diastereoisômeros) (4 diastereoisômeros) Usando o procedimento Lehsten para os compostos revelados aqui geraram cerca de 1-5% de mono-substituído 3'-0-fosforamidato diastereoisômeros (5) e cerca de 10-30% do produto bis-substituído (6). Como a polaridade de 3'-diastereoisômeros foi muito semelhante ao desejado 5-diastereoisômeros (4), separação cromatográfico foi muito desafiador. O escalonamento do processo foi quase impossível sem descartar uma porção substancial de menos polares 5'-diastereoisômeros (4) ou aceitando um nível maior de contaminação de 3'-diastereoisômeros (5). Em um aumento de escala inicial de 50 g, o produto resultante continha uma contaminação 3'-diastereoisômero (5) de cerca de 3%, que co-eluiu com o menos polar de 5'- diastereoisômero (4). São reveladas aqui condições de reação que usam quantidades menores de reagentes e um método para seletivamente remover a impureza 3'-0-fosforamidato diastereoisômeros (5) com uma separação cromatografia mais fácil assim gerando o desejado 5'-0-fosforamidato diastereoisômeros em muito maior pureza (4).

Para a estequiometria de reagente, um estudo foi feito em que a estequiometria dos reagentes foi sistematicamente alterada e os resultados foram monitorados por RMN de fósforo da reação bruta como Lehsten reportou. Nas corridas mais sucedidas, o rendimento isolado e pureza do produto desejado foi comparado. Foi observado que o 5'-hidroxil primário reage em uma velocidade mais rápida do que o 3'-hidroxil secundário. Isto cria uma situação de competição entre o progresso de reação de consumo de todos os nucleosídeos de partida e convertendo produtos 5'- e 3-monosubstituídos (4 e 5) aos produtos 5,,3'-bis substituídos (6). O produto 3'-monosubstituído converte ao produto bis em uma velocidade mais rápida do que o produto 5'-monosubstituído, conforme é possível reduzir o nível de contaminação 3'-diastereoisômero empurrando a reação mais para os produtos bis-subs-tituídos. No entanto, com uma forma efetiva de remover os 3'-diastereoisô-meros, a reação pode ser otimizada para produzir mais do desejado 5'-diastereoisômero sem tendo que sacrificar tanto quanto o 5'-diastereoisô-mero sendo convertido no bis-substituído (6). Foi ainda observado que o clo-ridrato aminoácido é muito higroscópico. Como qualquer água presente podería consumir quantidade equivalente de reagente fenil diclorofosfato, deve-se ter cuidado para manter o aminoácido substancialmente anidro ou deve ser preparado substancialmente anidro antes do uso. Em resumo, Lehsten relatou que a proporção ideal de aminoácido para fenil diclorofosfato ao nu-cleosídeo foi 3,5:2,5:1 respectivamente. Foi demonstrado que a proporção ideal de aminoácido para fenil diclorofosfato ao nucleosídeo de cerca de 1,6 a cerca de 1.3 a cerca de 1 é ideal em condições em que o 3'-diastereoisô-mero pode ser eficientemente removido e quando o cloridrato aminoácido é substancialmente anidro. Usando uma quantidade menor dos reagentes, economia de custo é realizado acoplado com uma simplificação da separação cromatográfica do produto desejado a partir de subprodutos reagentes e de nível reduzido de bis diastereoisômeros.

Em um procedimento alternativo, um derivado 3'-hidroxi-bloqueado de 3 foi preparado usando um grupo de bloqueio t-butildimetilsilil em duas etapas. Este foi então convertido ao seu derivado 5'-fosforamidato. O desejo sendo ainda o grupo silil podería ser então removido e não houve isômeros 3' (5) ou 3',5-bis fosforamidatos (6). Uma abordagem semelhante foi demonstrada por Borch e Fries (Patente US 5.233.031) em um rendimento geral em um alquil fosforamidato.

Outra abordagem alternativa foi usar a síntese direta e então o uso químico para ajudar a diferenciar as impurezas 3'-diastereoisômero 5 do desejado 5'-diastereoisômeros 4 para ajudar a separação. Um grupo foi desejado que poderia seletivamente reagir com o hidroxil primário livre de 3'-0-fosforamidato impureza 5 sobre o hidroxil secundário livre do desejado 5-0-fosforamidato 4. Foi ainda desejado que o grupo de bloqueio significativa-mente muda a polaridade do produto resultante 5-O-bloqueado 3'-0-fosfo-ramidato do desejado 5'-0-fosforamidato 4. Não houve etapa extra necessária para remover o grupo bloqueador conforme o desejado 5'-diastereoisô-meros 4 não poderia ser alterado. O quimicamente alterado 3'-diastereoisô-mero poderia então permitir separação cromatográfica mais fácil ou separação por suporte de limpeza especial ou por extrações.

Especificamente, o grupo bloqueador tert-butildimetilsilil (tBDMS) atinge estes critérios e foi o primeiro a ser demonstrado e subsequentemente usado em uma escala de multi-quilograma. Sob certas condições como em piridina como solvente e base, os grupos tBDMS reagem com alta seletividade na posição hidroxil primário sobre a posição 3' hidroxil secundário. A reação de fosforamidato usa N-metilimidazol (NMI) como uma base. Na presença de NMI, a sililação é menos seletivo. Preferencialmente, a quantidade de NMI deve ser reduzida. Isto pode ser conseguido facilmente após a reação fosforamidato lavando uma solução de reação com 1 N ácido clorídrico. O NMI e o nucleosídeo restante de partida são removidos, deixando uma mistura bruta de produtos mono e bis substituídos e subprodutos reagentes. Isto é então dissolvido na piridina e tratado com tert-butildimetilsilil cloreto. O produto 3-monosubstituído 5 é convertido em algumas horas ou menos ao 5'-0-tBDMS-3'-0-fosforamidato 7. O progresso da reação pode ser monitorado por HPLC. A polaridade deste produto sililado 7 é menos do que o bis-fosforamidato 6 e é prontamente removido por cromatografia. Usando este método, foi possível reduzir o nível 3'-monofosforamidato 5 a menos do que 0,1% do produto 5'- 4 comparado ao 1-3% sem o tratamento silil. De modo semelhante, o tratamento com dimetoxitrifenilmetil cloreto (DMT-CI) sob as mesmas condições trabalharam tão bem. Foi ainda mais fácil identificar o produto de reação DMT por TLC como DMT contendo moléculas de corante laranja brilhante em aquecimento ou exposição ao ácido. Pode-se visionar muitos outros grupos bloqueadores, conforme notado acima.

Ambas as condições de reação e a limpeza de 3 '-impureza são métodos gerais e poderíam ser aplicados à maior parte dos nucleosídeo fos-foramidatos com um livre 3' hidroxil. A fração fosforamidato poderia ser qualquer combinação de aminoácido éster e álcool, aromático. A fração nucleosídeo poderia ser qualquer nucleosídeo em que um 5' fosforamidato poderia levar a 5'-monofosfato e poderia ser ainda metabolizado à forma 5'-trifosfato. O seguinte esquema é o principal esquema de reação ilustrado para produzir isopropil L-alanato fenil fosforamidato de 2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metiluridina com o produto principal conforme desejado 5'-0-fosforamidato (4, dois diastereoisômeros) e o produto secundário como o 3'-0-fosfora-midato (5, dois diastereoisômeros) e o 3',5' -bis-O-fosforamidato (6, quatro diastereoisômeros). Os reagentes são adicionados nas proporções estequi-ométricas no método de seção de preparação. A reação é deixada proceder até cerca de 5% do material de partida permanece conforme julgado por visualização UV na cromatografia de camada fina (TLC). Ainda UPLC/MS mostrou aproximadamente 10% de 3',5' bis-fosforamidato 6 formado comparado ao produto desejado 5'. Após extinção de um retrabalho aquoso ácido, o resíduo bruto da camada orgânica foi preparada para a sililação. Sob as condições de reação descritas, o grupo silil preferencialmente reagiu com o livre 5'-hidroxil do 3-O-fosforamidato para formar 7. A reação foi continuada até que o 3'-0-fosforamidato não era mais detectável por UPLC/MS. 3’-0-fosforamidato-5’-0-tBDMS (2 diastereoisômeros) Após trabalhar a reação de sililação, o produto desejado é submetido a cromatografia em sílica gel e é eluído com um gradiente de metanol / em diclorometano (1-4%). O desejado 5'-monofosforamidato 4 elui por último.

Exemplo 1. Preparação de 2>-deoxi-2l-flúor-2,-C-metiluridina (3) Em um frasco de 10 L, foi adicionado 3', 5'-0-dibenozil-2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metil-N4-benzoilcitidina (500 g, 0,874 mol) e 70% ácido acético aquoso (7,5 L). A solução foi aquecida sob refluxo (110°C) por 20 h. TLC indicou uma reação completa (Rf 0,6 em 5% metanol em diclorometano (DCM)). A mistura foi resfriada em temperatura ambiente e diluído com água (2 L). Após agitação por 2 h, o precipitado resultante foi coletado por filtração e o sólido foi enxaguado com água (5 L) e seco na atmosfera em temperatura ambiente por 12 h para gerar 360 g (88%). Este intermediário díbenzoilu-ridina foi usado diretamente na etapa seguinte adicionado este à amônia metanolica recém preparada (5,4 L, ca 25%) a 0°C. Esta temperatura foi mantida por 3 h e em seguida mantida para aquecer a 15°C por 24 h. TLC indicou uma reação completa (Rf 0,4 em 10% metanol em DCM). A mistura de reação foi fitlrada por um leito de celite e concentrada sob pressão reduzida para gerar o produto bruto (216 g). O produto bruto foi agitado com acetato etil (325 mL) por 3 h em temperatura ambiente. O sólido resultante foi coletado por filtração e lavado com acetato de etil (216 mL). O sólido foi seco sob vácuo em temperatura ambiente por 4h para gerar 160 g (78%) do produto desejado em 98,7% HPLC pureza. 1H-RMN (DMSO-d6) δ 11,44 (br s, 1H, NH), 7,95 (d, 1H, C-6H), 5,97 (d, 1H, C-ΙΉ), 5,64 (d, 1H, C-5H), 3,84-3,77 (m, 3H, C-5’-Ha, C-3'Η. C-4’H), 3,63-3,60 (m, 1H, C5'-Hb), 1,23 (d, 3H, C-2’-CH3). ES-MS M-1259.

Exemplo 2. Preparação de isopropil éster de ácido (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3l4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-flúor-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiônico (4) Sinônimo: 5'-0-(lsopropil-1-alanato, fenil fosforamidil)-2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metil-uridina mistura diastereoisomérica.

Um frasco de 5 L de 3 gargalos foi ajustado com um agitador mecânico, banho de gelo salmoura, termômetro interno, e uma atmosfera de nitrogênio. O frasco foi carregado com L-alanina isopropil éster cloridrato (82,0 g, 0,490 moles) e diclorometano anidro (0,80 L). Enquanto esta estava agitando, diclorofosfato fenil (85,0 g, 0,40 moles) foi adicionado em um lote e agitado. Enquanto mantendo a temperatura interna entre -5 a 5°C, uma solução de N-metilimidazol (NMI, 250 g, 3,07 moles) em diclorometano (250 mL) foi adicionado por um período de meia hora. A solução foi deixada agitar por 1 h nesta faixa de temperatura. 2,-Deoxi-2'-flúor-2'-C-metil-uridina (3, 80,0 g, 0,307 moles) foi adicionado a 0°C em uma porção e então um frasco de reação foi deixado aquecer lentamente no banho de salmoura. Em 1 h, a temperatura interna foi até -2°C. TLC (5% Metanol em DCM) a 1 h mostrou que mais do que 50% de nucleosídeo foi consumido. O banho foi removido e um frasco de reação atingiu a temperatura ambiente por mais 1 h. TLC após 3 h e em 5 h total mostrou 95% do nucleosídeo de partida foi consumido. A mistura de reação foi extinta adicionando metanol (100 mL) e agitando a reação por 5 minutos. A mistura de reação foi lavada com 1N HCi (2 X 500 mL) seguido por solução de bicarbonato de sódio saturado (2 X 500 mL). A camada orgânica separada foi seca em sulfato de sódio anidro (50 g) e filtrada. A solução foi evaporada sob pressão reduzida e então sob alto vácuo até secagem para gerar o produto bruto como um óleo viscoso (170 g). RMNs do produto bruto (31P e 1H) foram tomados. O 31P-RMN indicou cerca de 1% da integração de fósforo total foi devido à presença de isômero 3' 5.

Ao produto bruto foi adicionado piridina anidra (1700 mL). O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e então sob alto vácuo para reduzir o teor de água da mistura bruta através de co-evaporação. O óleo resultante foi re-dissolvido em piridina anidra (500 ml) e, em seguida foi adicionado excesso de t-butildimetilsilil cloreto (9,0 g, 60mM). A reação foi agitada em temperatura ambiente. O progresso de reação foi monitorado por U-PLC/MS. Após 3 horas, a impureza 3' 5 podería não ser mais detectado e a reação foi temperatura pela adição de metanol (50 mL). A reação foi evaporada sob pressão reduzida a um óleo. O resí- duo foi dissolvido em acetato de etil (1,5 L) e lavado com 1N HCI (2X 500 mL), seguido por solução de bicarbonato de sódio saturado (2 X 500 mL). A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro (50 g), filtrado e evaporado sob pressão reduzida para gerar o produto bruto como um óleo amarelo pálido. O óleo bruto foi diluído com o mesmo volume de diclorometano e carregado em um cartucho de 2,5 kg de sílica gel em um módulo de compressão radial em 100 psi de pressão de ar. Usando uma bomba de gradiente a 60 psi e uma taxa de fluxo de 400 mL/min, o cartucho foi lavado com cloreto de metileno (4L) seguido pelo gradiente 1-4% metanol em cloreto de metileno (48 L). A maior parte das impurezas (di-(isopropilaianil)fenil fosfato, 3’,5'-bis fosforamidato (6), 3'-fosforamidato-5'-TBDMS aducto (7)) eluiu com ~3% gradiente. O produto desejado eluído entre 3 e 4% metanol. O produto contendo frações foram classificados em dois lotes. O primeiro continha quantidades pequenas de impurezas superiores e o último foi produto puro. O primeiro conjunto de frações continha quantidades pequenas de impurezas menos polares (impurezas superiores) como o 3',5'-bis fosforamidato e di-alanilfenil fosfato e a maioria de Rp diastereoisômero e requereu uma segunda coluna de purificação. (A terminologia relativa, superior vs. inferior se refere à eluição em cromatografia de sílica gel em fase normal, onde o "isô-mero superior" significa o primeiro isômeró eluindo.) O segundo conjunto de frações não teve uma quantidade significativa de impurezas - somente o restante de diastereoisômeros de Rp e a maior parte de Sp . Foi depois re-combinado com as frações de duas colunas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e a espuma branca resultante foi ainda seca (0,20 mmHg) por 1 h para gera 42 g do lote impuro (4:1 isômero superior vs inferior baseado em 31P-RMN) e 38 g de lote puro (1:3 isômero superior vs inferior). O lote impuro foi posto novamente em coluna em um modo semelhante para gerar 3,8 g de 97% isômero puro superior (fração deixada de lado) e 36 g do produto puro em uma proporção 4: 1. Os dois lotes restantes foram dissolvidos em DCM, combinados, evaporados sob pressão reduzida e secos (50°C, 0,2 mmHg, 24 h) para obter 74 g (45,7%) de produto puro 4 com uma pro- porção diastereoisomérica de 48: 51, com uma espuma branca, mp cerca de 75-85°C.

Para produzir um sólido amorfo da mistura diastereoisomérica, 74 g de espuma branca foi agitada em t-butil metil éter (750 mL) resultando em uma solução parcial e um resíduo sólido pegajoso. Enquanto sob agitação, heptanos (750 mL) foi adicionado lentamente e a suspensão foi mecanicamente agitada por 1 hora até a maior parte de a goma ser convertida em um sólido branco. O sólido foi raspado com uma espátula e a pasta resultante foi filtrada. O sólido foi lavado com heptanos (4 X 50 mL) e seco sob vácuo (50°C, 0,2 mmHg, 24 h) para gerar um pó branco amorfo (64 g) com uma ampla faixa de fusão de ca 70-80°C. 1H e 31P RMN conformou à estrutura e HPLC mostrou a pureza de 99,8% com uma proporção diastereoisomérica de 46:54 (ainda confirmado por31P RMN). Método alternativo para criar mistura sólida de 4. Após cromato-grafia, o resíduo foi co-evaporado com diclorometano duas vezes (5 mL/g) e seco por 24 h a 35-40°C a 35-45 mTorr. O resíduo de espuma foi peneirado por uma peneira de 250 micron e ainda seco sob as mesmas condições até o diclorometano residual estar abaixo de 400 ppm conforme medido por GC headspace. O pó resultante fino branco a quase branco tem uma faixa de temperatura de transição vítrea de 53,7 a 63,5°C.

Caracterização da mistura de isômeros (4):1 H-RMN (CDCI3) δ 10,05 (br s, 1H, NH, Sp), 10,00 (br s, 1H, NH, Rp), 7,49 (d, 1H, C6-H, Sp), 7,36 (m, 5H, G6-H, Rp, aromático), 7,23-7,14 (m, 6H, Rp/Sp, aromático), 6,18 (br d, 2H, Cf-H, Rp/Sp), 5,63 (d, 1H, C5-H, Sp), 5,58 (d, 1H, C5-H, Rp), 5,01 (m, 2H, CH-(CH3)2, Rp/Sp), 4,46-4,33 (m, 8H, 0-5'-Η2, ala-NH, C3'-OH, Rp/Sp), 4,12 (m, 2 H, ala-CH-CH3, Rp/Sp), 4,01-3,85 (m, 4H, C3’-H, C4’-H, Rp/Sp 1,39-1,22 (m, 12H, todos CH3, Rp/Sp). 31P-RMN (CDCI3) δ 3,60 (Rp), 3,20 (Sp) em relação ao trifenilfos-fato a -17,80 ppm. ES-MS M+l 530,2. Análise Elementar: % Calculado (incluindo 0,29% água conforme encontrado por análise de Karl Fisher) C, 49,75; H, 5,54; N, 7,90, F, 3,58, P, 5,84. % Encontrado: C, 49,50; H, 5,44; N, 7,85; F, 3,62; P, 6,05.

Discussão sobre separação de isômeros 0 composto 4 devido à quiralidade em fósforo é compreendido de dois diastereoisômeros, que são designados como Sp-4 e Rp-4. A designação estereoquímica foi feita baseada em análise de cristal de raios X de Sp-4. Ambos RP-4 e -4 geraram produto cristalino.

Os procedimentos para cristalização são delineados abaixo.

Sp-4 Rp-4 Exemplo 3. Cristalização do isômero Rp-4. A fração cromatografada de contendo o primeiro eluindo, isômero menos polar RP-4 (3,8 g, 97% puro) foi dissolvido em isopropanol (36 g) e diluído com heptanos até turvo (72 g). A solução foi semeada e agitada em temperatura ambiente por 5 h. O sólido resultante foi coletado por filtração a vácuo, lavado com heptanos (2x20 mL) e seco (50°C, 0,2 mm, 24 h) até 2,3 g de agulhas brancas muito pequenas mp 136,2-137,8°C. Pureza de HPLC do material resultante foi encontrado como sendo 99,02%. RP-4: 1H-RMN (CDC13) δ 9,10 (br s, 1H, NH), 7,36 (m, 2H, 0-aromático), 7,26-7,16 (m, 4 H, C6-H, w. -aromático), 6,16 (br d, 1H, Cl'-H), 5,58 (d, 1H, C5-H), 5,01 (sept, 1H, CH-(CH3)2), 4,52-4,47 (m, 2H, C-5*-H2), 4,10 (d, 1H, C3'-H), 4,02-3,76 (m, 4H, ala-NH, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 1,37-1,20 (m, 12H, todos CH3).

Exemplo 4. Preparação e cristalização de Sp-4 Método 1 : Precipitação direta do 4 bruto: A uma solução em agitação de L-alanina isopropil éster cloridrato (10,5g, 61,5mmol, azeotropica-mente seco, duas vezes, com 50 mL de tolueno cada vez) em diclorometano (100 mL) foi adicionado fenil diclorofosfato (7,5 mL, 50 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi resfriada em -10°C e, em seguida foi adicionada uma solução de NMI (30,5 mL, 384,3mmol) em 30 mL de diclorometano por um período de 30 min. Após conclusão da adição, a mistura foi agitada entre -10 e -15°C por 1h. À mistura acima foi adicionado 2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metiluridina (3) (10g, 38,4mmol) em um lote e a mistura foi agitada abaixo de -10°C por 3h e, em seguida lentamente adicionado para aquecer a 20°C (6h). A mistura foi agitada nesta temperatura durante a noite (15h) e, em seguida temperada com 10 mL de metanol. O solvente foi evaporado e o resíduo foi re-dissolvido em EtOAc (200 mL). A camada EtOAc foi lavada com água (100mL), HCI 1N (3x75 mL), 2 % solução NaHC03 aquosa (50 mL) e salmoura (50mL). A camada orgânica foi seca em Na2S04, filtrada e concentrada. O resíduo foi seco sob alto vácuo por 2h para gerar espuma branca (22 g). A espuma acima foi dissolvida em 33 mL de DCM e, em seguida foi adicionado 65 mL de IPE (isopropil éter) para gerar uma solução saturada. A solução foi filtrada através de um pequeno pad de Celite e o filtrado foi agitado com sementes de Sp-4 por 72h em temperatura ambiente (cerca de 22°C - notar que resfriar a suspensão a 0°C levou à lubrificação do produto bruto). O sólido branco foi filtrado, lavado com IPE (20mL) e secou para gerar 4,58g (-85:15 mistura de Sp-4:RP-4 respectivamente conforme determinado por31P RMN) de um pó branco. O sólido acima foi suspenso em 23 mL de DCM e, em seguida refluxou por 3h. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e agitado por 15h. O sólido branco foi filtrado, lavado com 4,5 mL de DCM frio e seco sob alto vácuo a 45°C para gerar Sp-4 puro, rrip 93,9-104,7°C, HPLC pureza 99,74% (3,11 g, 15,2 % a partir de uridina nucleosí-deo).

Sp-4 1H-RMN (CDCI3) δ 8,63 (br s, 1H, NH), 7,47 (d, 1H, C6-H), 7,30 (m, 2H, o-aromático ), 7,26-7,18 (m, 3H, w, -aromático), 6,18 (br d, 1H, Cl ’-H), 5,70 (d, 1H, C5-H), 5,02 (sept, CH-(CH3)2), 4,53 (m, 2H, C-5'-H2), 4,11 (d, 1H, C3'-H), 3,97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 3,77 (br s, 1H, ala-NH), 1,39 (d, 3H,C2'-CH3), 1,37 (d, 3H, ala-CH3), 1,24 (d, 6H, CH-(CH3)2). Método 2 : Lubrificação do 4 bruto: A uma solução agitada de L-alanina isopropil éster cloridrato (20,6g, 123mmol, azeotropicamente seco, duas vezes, com 75 mL de tolueno cada vez) em diclorometano (200 mL) foi adicionado fenil diclorofosfato (14,9 mL, lOOmmol) em temperatura ambiente. A mistura foi resfriada em -10°C e, em seguida foi adicionada uma solução de NMI (61,3 mL, 769 mmoi) em 60 mL de diclorometano por um período de 30 min. Após conclusão da adição, a mistura foi agitada entre -10°C e -15°C por 1h. À mistura acima foi adicionado 2,-deoxi-2,-flúor-2,-C-metiluri-dina (3) (20g, 76,9mmol) em um lote e a mistura foi agitada abaixo de - 10°C por 3h e, em seguida lentamente aquecer a 20°C (6h). A mistura foi agitada nesta temperatura durante a noite (15h) e, em seguida temperada com 10 mL de metanol. O solvente foi evaporado e o resíduo foi re-dissolvido em EtOAc (400 mL). A camada de EtOAc foi lavada com água (200mL), HCI1N (3x100 mL), 2 % solução de NaHCC>3 aquoso (100 mL) e salmoura (50mL). A camada orgânica foi seca em Na2S04, filtrada e concentrada. O resíduo foi seco sob alto vácuo por 2h para gerar espuma branca (43 g). A espuma a-cima foi dissolvida em 86 mL de EtOAc em um frasco de fundo redondo de Hoiet nomolAC λλιύι ιιιύι anitiarlr\r mor*ânÍpn I—ηηι ιοη+Α cnh anitaoSn ΛΠΠ ml vl w 1¾ yai yCtIUD wUI 11 LI111 l IClU L» I lIILSv/Ctl l IL/L/ · EZ·· l LJ UI CS 11 ILJ S)UU I j I v/ VJ III de heptano foi adicionado lentamente e a suspensão foi agitada por 1 h. A camada superior foi decantada e o resíduo foi novamente agitado com 50 mL de 2:3 Soluções EtOAc/heptano por 10 min e, em seguida decantadas. O resíduo foi seco sob alto vácuo para gerar espuma branca (31 g). A espuma acima foi dissolvida em 46 mL de DCM e, em seguida foi adicionado 95 mL de IPE para gerar uma solução saturada. A solução foi filtrada através de um pequeno pad de Celite e o filtrado foi agitado com sementes de Sp-4 por 72h em temperatura ambiente. O sólido branco foi filtrado, lavado com IPE (30mL) e secou para gerar7,33g (-85:15 mistura de Sp-4: Rp-4 respectivamente conforme determinado por 31P RMN) de um pó branco. O sólido acima foi suspenso em 36 mL de DCM e, em seguida reflu-xou por 3h. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e agitado por 15h. O sólido branco foi filtrado, lavado com 7,5 mL de DCM frio e seco sob alto vácuo a 45°C para gerar >99% Sp-4 puro, mp (4,78g, 11,6 % a partir de uri-dina nucleosídeo). Método 3 : Carregamento de Sílica gel de 4 bruto: 5,0 g de 4 bruto foi produzido na mesma maneira conforme a mistura de diastereoisô- meros imediatamente antes da etapa de coluna de cromatografia começando com aproximadamente 2,5 g de 2'-deoxi-2,-flúor-2'-C-metiluridina (3). O bruto foi dissolvido em 10 ml_ de DCM e 10 g de sílica gel foi adicionado à solução. O solvente foi evaporado para gerar uma pasta seca. A pasta foi agitada com 40 mL de 50% EtOAc/hexanos por 15 min e, em seguida filtrada. A sílica gel foi lavada com mais 10 mL de 50% EtOAc/hexanos. A sílica gel foi então lavada com 15% MeOH/DCM (100 mL) e coletada separadamente. O solvente foi evaporado e seco sob alto vácuo para gerar 4,0 g de resíduo (espuma). O resíduo foi dissolvido em DCM (6mL) e, em seguida foi adicionado ~9mL de IPE para produzir uma solução saturada. A mistura foi então suavemente agitado durante a noite com sementes Sp-4 em temperatura ambiente. O sólido branco foi filtrado e lavado com IPE (5 mL) para gera 1,28 g de produto. 31P RMN revelou que o produto acima contém 77:23 mistura de Sp-4: Rp-4 respectivamente. Este foi recristalizado de 20 mL de DCM para obter 0,75 g de >99% Sp-4 puro (cerca de 12% de uridina nucleosídeo). Esta preparação de Sp-4 não requer a etapa de sililação como feito para a mistura, de modo que o procedimento de reação total é mostrado acima. Aspectos de formas únicas cristalinas e polimórficas de Sp-4 são apresentados abaixo.

Método 4 : 40,0 g de 1: 1 mistura de 4 foi dissolvido em 90 mL de diclorometano. Diisopropilpéter (70 mL) foi adicionado à solução acima para gerar uma solução saturada. (A quantidade de diisopropil éter pode variar baseado ria pureza do produto.) A solução foi semeada com Sp-4 puro (> 99%) e a mistura foi suavemente agitada com uma barra de agitação em temperatura ambiente por 20h (formação de sólido foi observada após 2h). O sólido foi filtrado, lavado com 40 mL da mistura de diisopropilé-ter/diclorometano (1:1) e seco para gerar sólido branco (16,6 g, 89,35 % Sp-4 puro por RMN). Este sólido foi suspenso em 83 mL de diclorometano e reflu-xado por 3h. A suspensão foi resfriada até temperatura ambiente e agitada durante a noite. O sólido foi filtrado e lavado com 10mL de DCM frio. O sólido foi seco sob vácuo para gerar Sp-4 (13,1 g, 99,48 % puro por HPLC). 11g deste sólido foi redissolvido em 330 mL de DCM sob condições quentes. A solução foi resfriada até temperatura ambiente e deixada nesta temperatura durante a noite. O produto cristalino foi filtrado e seco para gerar 10,5 g de Sp-4 (99,74 % por HPLC).

Os compostos Sp-4 e Rp-4 podem alternativamente ser preparados, de acordo com a nona ou décima modalidade, reagindo nucleosídeo (protegido ou desprotegido) 3 com um isopropil-alanil-fosforamidato (mistura de C e C', C ou C'), como mostrado na equação seguinte. 3 P.D. Howes et al. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2003, Vol. 22, Nos. 5-8, pp. 687-689 ("Howes") revela 2’- e 5'-fosforamidatos obtidos ou uma reação com cloreto t-butiimagnésio. Nele, Howes revela que quando 3'-deoxi-citidina nucleosídeo é reagido com éster metil de ácido (S)-2-[cloro-fenoxi-fosforilamino] propiônico na presença de 1,2 equivalentes de cloreto t-butílmagnésio, fosforilação seletiva na posição 2' ocorreu, mas a-quele com um equivalente adicional de cloreto t-butilmagnésio em fosforila-çâo seletiva na posição 5' ocorreu. Esta revelação deve ser contrastada de modo que seja revelado no Esquema de Howes 1.

Exemplo 5-1. Preparação de éster isopropil de ácido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico A uma solução agitada de 4-nitrofenil fosforodicloridrato 12,8g, 50 mmol) em diclorometano (100 ml_) foi adicionada uma solução de fenol e trietilamina (7,7 ml_, 55 mmol) em diclorometano (100 ml_) a -78°C por um período de 20min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30min e, em seguida transferida a outro frasco de fundo redondo contendo L-alanina isopropil éster cloridrato (8,38g, 50mmol) em diclorometano (100 ml_) a 0°C. À mistura foi adicionada segunda porção de trietilamina (14,6 mL, 105 mmol) por um período de 15min. A mistura foi agitada em 0°C por 1h e, em seguida o solvente foi evaporado. O resíduo foi triturado com acetato de etil (150 mL) e o sólido branco foi filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar o óleo amarelo pálido. O composto bruto foi cromatografado u-sando gradiente 0-20% acetato etil /hexanos para gerar produto (17g, 83 % de rendimento) como uma mistura de diastereoisômeros em cerca de proporção 1:1. 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6): δ -0,31, -0,47; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,31-8,27 (m, 2H), 7,51-7,37(m, 4H), 7,27-7,19(m, 3H), 6,70-6,63(m, 1H), 4,85-4,78(m, 1H), 3,97-3,86(m, 1H), 1,21-1,19(m, 3H), 1,11-1,09 (m, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-l)+. 31P RMN (162 MHz, CDC13): δ -2,05, -2,10; 1H RMN (400 MHz, CDC13): δ 8,22 (d, J = 9,2Hz, 2H), 7,41-7,33(m, 4H), 7,26-7,18(m, 3H), 5,05- 4,96(m, 1H), 4,14-4,05(m, 1H), 3,93-3,88(m, 1H), 1,38(d, J = 6,8Hz, 3H), 1,22 (dd, J * 6,2 & 3,0Hz, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-l)+.

Exemplo 5-2. Preparação de Sp-4/RP-4. A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3 -metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona ( 130mg, 0,5mmol) em THF seco (1,5mL) foi adicionado a 1,0M solução de cloreto de tert-butilmagnésio (1,05mL, 1,05'mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 5min. Após 30min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (1:1 mistura de isômeros, 408mg, 1mmol) em THF (1,5mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 5min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 48h e, em seguida extinta com NH4C1 aquoso saturado (20mL). A mistura foi particionada entre acetato de etil (50mL) e água (20mL). O extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido. A croma- tografia em coluna do resíduo usando gradiente 0-2% MeOH/diclorometano gerou um sólido branco espumoso (125mg, 47% de rendimento, mistura de Sp-4/Rp-4 em cerca de proporção 3,05: 1,0).

Exemplo 6. Preparação e isolamento não cromatográfico de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenox)-fenoxi-fosforilamino] propiônico L-alanina isopropil éster cloridrato (330 g, 1,97 mol) foi pré-seco por co-evaporação com tolueno (2 x 400 mL) sob pressão reduzida e, em seguida seca em um forno a vácuo (50°C, 0,2 mmHg, 17 h). A uma solução agitada de 4-nitrofenil fosforodícloridrato (500,0 g, 1,953 mol) em diclorometano anidro (3,0 L) foi adicionada uma solução de fenol (183,8 g, 1,953 mol) e trieti-lamina (300 mL, 2,15 mol) em diclorometano (900 mL) a -60°C temperatura interna por um período de 3 horas. A mistura foi agitada nesta temperatura por mais 30 min e, em seguida deixada aquecer até -5°C durante 2,5 horas. O éster aminoácido pré seco foi adicionado a -5~0°sob uma atmosfera de nitrogênio durante 10 mins. O resíduo de sal aminoéster no frasco de adição foi transferido a uma mistura de reação através de rinsagem com diclorometano (2 x 100 mL). A mistura foi agitada em 0°C por 40 mins e uma segunda porção de trietilamina (571 mL, 4,10 mol) foi adicionado por um período de 40 mins a 0°C. A mistura foi agitada em 0~10°C por 3 h e, em seguida o sólido branco (trietilamina cloridrato) foi filtrado e enxaguado com diclorometano (3 x 300 mL). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com metil t-butil éter (MTBE, 4 L). O sal de sólido adicional assim formado foi filtrado e enxaguado com MTBE (3 x 150 mL). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar o óleo marrom claro. O resíduo foi co-evaporado com hexanos (2 x 140 mL) para remover qualquer MTBE residual e ainda seco sob vácuo a 40°C por 2 horas. O resíduo seco foi misturado com diisopropil éter (IPE, 1,1 L) e agitado a 5°C em um banho de gelo-água. Pequena quantidade de sementes de cristal do Sp-isômero do produto foi adicionado à solução e a mistura foi agitada em 5°C por 22 h para formar uma pasta espessa média. Isto foi deixado repousar em um freezer (-10°C) por 44 h. O produto precipitado foi coletado através de filtração e enxaguado com solventes misturados pré-resfriados de IPE e hexanos (1: 1,3 x 190 mL). O sólido foi seco sob vácuo (0,5 mm Hg) em temperatura ratura ambiente até um peso constante foi obtido para gerar 227,23 g (rendimento: 28,5%) como um sólido pó branco. A proporção de dois diastereoisômeros SP:RP foi 9,65/1 baseado em 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6, δ-0,31 (Sp), -0,47). O produto foi recristalizado dissolvendo em IPE (840 mL) enquanto reagindo em um banho a 60°C. A solução acima foi agitada em temperatura ambiente por 1 h e, em seguida uma pequena quantidade de cristal de sementes Sp isômero foi adicionado. O sólido em pó branco foi formado dentro de 2 horas e o frasco foi armazenado em um freezer (-10°C) por 16 horas. Um sólido branco e fino cristalino obtido foi filtrado, lavado com IPE pré-resfriado (3x 50 mL) e seco sob vácuo (ambiente, 0,5 mm Hg) em um peso constante para gerar sólido branco fofo (177,7 g, 22% rendimento geral ou 44% rendimento geral baseado em rendimento teórico de isômero Sp) com proporção diastereoisomérica de 48/1 baseado em 31P-RMN. Mp 62-66°C. 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6): δ -0,31; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,30-8,27 (m, 2H), 7,49(d, J=8,8Hz, 2H), 7,41-7,37(m, 2H), 7.23- 7,19 (m, 3H), 6,66 (dd, J=13,6, 10,0Hz, 1H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,97- 3.86 (m, 1H), 1,19 (d, J=7,2Hz, 3H), 1,10(d, J=6,4Hz, 6H); 31P RMN (162 MHz, CDCI3): δ -2,05; (162 MHz, DMSO-d6): δ - 0,31; 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,22 (d, J=9,2Hz, 2H), 7,41-7,33(m, 4H), 7,26-7,18(m, 3H), 5,05-4,96(m, 1H), 4,14-4,05(m, 1H), 3,93-3,88(m, 1H), 1,38(d, J=6,8Hz, 3H), 1,22 (dd, J=6,2 & 3,0Hz, 6H); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,30-8,27 (m, 2H), 7,49(d, J=8,8Hz, 2H), 7,41 -7,37(m, 2H), 7.23- 7,19 (m, 3H), 6,66 (dd, J=13,6, 10,0Hz, 1H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,97- 3.86 (m, 1H), 1,19 (d, J=7,2Hz, 3H), 1,10(d, J=6,4Hz, 6H) MS (ESI) w/z 407 (M-1)+. A estereoquímica de 8 (Sp-isômero) foi confirmado por cristalo- grafia de raios X de cristal simples, ver detalhes fornecidas abaixo.

Exemplo 7. Separação da mistura diastereoisomérica iso-propil éster de ácido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propi-ônico por SFC.

Uma amostra de uma mistura de diastereoisômeros (4,8 g) enriquecida com o Rp-isômero foi submetida a SFC usando uma coluna Chiral-Pak AD-H (2x15 cm) e eluída com 35% isopropanol em dióxido de carbono a 100 bar. Um carregamento de injeção de 4 mL da amostra em uma concentração de 17 mg/mL de metanol foi usado. O Rp-isômero isopropil éster de ácido [(S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico eluiu primeiro. As frações apropriadas das várias corridas foram combinada e concentradas sob pressão reduzida para gerar 2,9 g do Rp-isômero éster isopropil de ácido [(S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico como um óleo amarelo claro viscoso e 1,9 g do Sp-isômero éster isopropil de ácido [(S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxí-fosforilamino] propiônico] como um sólido branco. Dados analíticos de Rp-isômero é semelhante ao produto isolado pelo método de cristalização acima.

Dados analíticos para éster isopropil de ácido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (8, Rp-isômero): 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6): δ -0,47; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,30-8,27 (m, 2H), 7,46-7,38 (m, 4H), 7,27-7,20 (m, 3H), 6,68 (dd, J*13,8, 10,2Hz, 1H), 4,86-4,77 (m, 1H), 3,97-3,86 (m, 1H), 1,20 (d, J=7,2Hz, 3H), 1,10(dd, J=6,2, 2,2Hz, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-l)+.

Exemplo 8-1. Preparação de mistura racêmica éster isopropil de ácido 2-[(4-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (±): A uma solução agitada de 4-cloro-fenil fosforodicloridrato (2,45g, 10,0 mmol) em diclorometano (20 mL) foi adicionada uma solução de fenol (0,94 g, 10 mmol) e trietilamina (1,56 mL, 11 mmol) em diclorometano (20mL) a -78°C por um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30min e, em seguida transferida para outro frasco de fundo re- dondo contendo L-alanina isopropil éster cloridrato (1,67 g, 10 mmol) em diclorometano (50 mL) a 0°C. À mistura foi adicionada segundo lote de trieti-lamina (2,92 mL, 21 mmoi) por um período de 15min. A mistura foi agitada em 0°C por 1h e, em seguida o solvente foi evaporado. O resíduo foi triturado com acetato de etil (30mL) e o sólido branco foi filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um óleo amarelo pálido. O composto bruto foi cromatografado usando gradiente 10-20% etil aceta-to/hexanos para gerar produto (2,0 g, 50% de rendimento) como uma mistura de diastereoisômeros em cerca de proporção 1:1.31P RMN (162 MHz, CDCI3): δ -1,58, -1,62; 1H RMN (400 MHz, CDC13): δ 7,06-7,51 (m, 8H), 7,15-7,28 (m, 2H), 7,29-7,47(m, 2H), 4,0-4,10(m, 1H), 3,82-3,88 (m, 3H), 1,35-1,36 (dd, 6H); 1,19-1,22 (m, 3H). MS (ESI) m/z 398 (M-l)+. O produto resultante é purificado por extração, cristalização, ou cromatografia, como notado acima.

Exemplo 8-2. Preparação de (S)-lsopropil 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)(fenoxi)-fosforilamino)propanoato(4). A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 mL) foi adicionado uma solução 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio (12,4 mL, 21 mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 15 min. Depois de 30 min, uma solução racêmica de éster isopropil de ácido (2-[(4-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (4,08g, 10mmol) em THF (15mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 10min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 72. TLC co-spot com produto autêntico ao redor de 5% do produto desejado formou comparado ao nucleosídeo de partida.

Exemplo 9-1. Preparação de racêmico de éster isopropil de ácido 2-[(2-cloro-fenoxi)-fenoxi- fosforilamino] propiônico (±). A uma solução agitada de 2-cloro-fenil fosforodicloridrato (9,8 g, 40 mmol) em diclorometano (80 ml_) foi adicionada uma solução de fenol (3,76 g, 40 mmol) e trietilamina (6,16 ml_, 44 mmol) em diclorometano (80 ml_) a -78°C por um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30 min e, em seguida transferido para outro frasco de fundo redondo contendo L-alanina isopropil éster doridrato (6,7 g, 40 mmol) em diclorometano (150 mL) a 0°C. À mistura foi adicionado a segunda porção de trietilamina (11,6 mL, 84 mmol) por um período de 15 min. A mistura foi agitada em 0°C por 1h e, em seguida o solvente foi evaporado. O resíduo foi triturado com acetato de etil (100mL) e o sólido branco foi filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um óleo amarelo pálido. O composto bruto foi cromatografado usando gradiente 10-20% acetato etil /hexanos para gerar produto (1 1,3 g, 72 % de rendimento) como uma mistura de diastereoisômeros em cerca de proporção 1 :1.31P RMN (162 MHz, CDC13): δ -1,58, -1,61; 1H RMN (400 MHz,CDCI3): δ 7,06-7,51 (m, 8H), 5,02-5,94 (m, 1H), 4,10-4,16(m, 1H), 3,31-3,94(m, 1H), 1,18-1,35(m, 3H), 1,38-1,40 (dd, 6H); MS (ESI) m/z 398 (M-l)+. O produto resultante é purificado por extração, cristalização, ou cromatografia, como notado acima.

Exemplo 9-2. Preparação de (S)-isopropil 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4- dihidropirimidin-l(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4~metiltetrahi-drofurano-2-il) metoxi)(fenoxi)- fosforilamino)propanoato. A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3 -metil -tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 mL) foi adicionado uma solução de 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio (12,4 mL, 21 mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (2-[(2-cloro-fenoxi)-fenoxi- fosforilamino] propiônico (racêmica 4,08 g, 10 mmol) em THF (15mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 10min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 72h. TLC co-spot com produto autêntico ao redor de 5-10% do produto desejado formou comparado ao nucleosídeo de partida.

Exemplo 10-1. Preparação de éster isopropil de ácido 2- [(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico racêmico (±)· A uma solução agitada de pentafluorfenil fosforodicloridrato (6,0 g, 20 mmol) em diclorometano (40 mL) foi adicionada uma solução de fenol e trietilamina (3,08 mL, 22 mmol) em diclorometano (40 mL) a -78°C por um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30 min e, em seguida transferido a outro frasco de fundo redondo contendo L-alanina iso-propil éster cloridrato (3,35 g, 20 mmol) em diclorometano (100 mL) a 0 °C. À mistura foi adicionado segundo lote de trietilamina (5,84 mL, 42 mmol) por um período de 15 min. A mistura foi agitada em 0°C por 1h e, em seguida o solvente foi evaporado. O resíduo foi triturado com acetato de etil (60mL) e o sólido branco foi filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um óleo amarelo pálido como uma mistura de diastereoisômeros em cerca de proporção 1:1. 31P RMN (162 MHz, CDC13): δ -0,49, -0,58. O produto resultante é purificado por extração, cristalização, ou cromatografia, como notado acima.

Exemplo 10-2. Preparação de mistura diastereoisomérica éster isopropil de ácido (S)-2~[(2,3,4,5,6-pentafluor-fènoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico e isolamento de único diastereoisômero de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico através de resolução dinâmica induzida por cristalização com várias culturas. A um frasco de fundo redondo de 2 L de três gargalos ajustados com um agitador mecânico em termômetro de e baixa temperatura foram adicionados 60 g (284 mmol) de fenil diclorofosfato e 300 mL de diclorome-tano anidro. A solução foi resfriada a 0°C sob atmosfera de nitrogênio e sal cloridrato iso-propil alanato (seco em vácuo, 47,7 g, 284 mmol) foi adicionado rapidamente como um sólido. A mistura foi agitada e resfriada a -55°C em um banho de gelo-acetona seco. Uma solução de 60,32 g de trietilamina (596 mmol) em 300 mL de diclorometano foi adicionada através de um funil de adição durante 70 minutos. A mistura turva branca foi agitada em -55°C por meia hora e, em seguida a temperatura foi aumentada em -5°C lentamente durante 1,5 h. Uma mistura pré-resfriada (temperatura ambiente) de pentafluorfenol (52,42 g, 284 mmol) e trietilamina (32,11 g, 317 mmol) em 180 mL de diclorometano foi adicionado à mistura através de um funil de adição por 1 h a 0°C e a mistura resultante foi agitada em 0°C por 4 horas. O precipitado branco (TEA*HCI) foi filtrado e enxaguado com diclorometano (3x 50 mL). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo sólido branco foi triturado em 880 mL de t-butil metil éter (TBME) em temperatura ambiente por uma hora. A suspensão branca foi filtrada e o sólido foi enxaguado com TBME (3x 150 mL). O sólido foi distribuído em uma mistura de acetato de etil (600 mL) e água (150 mL). A camada orgânica foi separada e lavada com água (3 x 100 mL). A camada orgânica foi seca em MgS04 e concentrada para gerar 29,92 g (66 mmol) de produto (Sp-isômero, como confirmado por cristalografia de raios X, abaixo) como um sólido branco plumagem. O filtrado da trituração em TBME acima foi concentrado sob pressão reduzida a um resíduo sólido branco e o sólido foi triturado em 450 mL de mistura de acetato de etil e hexanos (20:80, v/v) em temperatura ambiente por 75 minutos. O sólido (sólido 1) foi coletado por filtração e enxaguado com 20% acetato de etil em hexanos (75 mL, 2x 30 mL). O líquor mãe foi concentrado para gerar um sólido quase branco que foi triturado em 20% acetato de etil em hexanos (185 mL) em temperatura ambiente por 17 horas. Um sólido branco (sólido 2) foi coletado por filtração e enxaguado com 20% acetato de etil em hexanos (210 mL). Sólido 1 e sólido 2 foram combinados e dissolvidos em 1,2 L de acetato etil. A solução foi lavada com água (3x 150 mL), salmoura (50 mL) e seca em MgSO* A solução foi concentrada sob pressão reduzida para gerar 72,8 g (161 mmol) de produto puro. A quantidade total de produto foi 102,72 g (226 mmol, 80%). 1H RMN (CDC13, 400 MHz) 6:. 7,38-7,33 (m, 2 H), 7,27-7,24 (m, 2 H), 7,23-7,19 (m, 1 H), 5,04 (hept, 1 H), 4,18-4,09 (m, 1 H), 4,01-3,96 (m, 1 H), 1,45 (d, 3 H), 1,25 (dd, 6 H). 31P RMN (CDCI3, 162 MHz) õj -0,50.

Exemplo 10-3. Preparação de mistura diastereoisomérica de éster isopropil de ácido (S)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico e isolamento de diastereoisômero único éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico via resolução dinâmica induzida por cristalização em uma única cultura. À um frasco de 1 L seco de três gargalos com um termômetro de baixa temperatura e um agitador mecânico foi carregado fenil fosforodiclori-drato (25 g, 118,5 mmol). Diclorometano anidro (125 mL) foi adicionado e a solução foi resfriada a 0°C. O sal alanina éster (seco em forno) (19,86 g, 1 eq) foi adicionado rapidamente sob N2 enquanto agitado. A solução foi resfriada a ca -50°C (temperatura interna (em um banho de acetona/gelo seco sob N2). Uma solução de trietilamina (25,2 g, 2,1 eq) em DCM (125 mL) foi adicionado sob gotejamento através de um funil de adição por 0,5 h a -50°C e a pasta branca resultante foi agitada em cerca de -50°C por 0,5 h. A mistura foi deixada aquecer até 0°C por 1,5 h e, em seguida uma solução pré- misturada de pentafluorfenol (21,82 g, 1 eq) e TEA (13,2 g, 1,1 eq) (precaução: calor liberado enquanto mistura pentafluorfenol e TEA) em 75 mL de DCM foi adicionado por 0,5 h a 0°C através de um funil de adição. A mistura foi agitada em 0°C por mais 4 h. A mistura foi filtrada por um funil de Buchner e o sólido coletado de trietila-mina cloridrato foi enxaguado com DCM (3 x 40 mL). O filtrado foi verificado por 31P-RMN (proporção ca 1,14: 1 favoreceu o Sp-diastereoisômero - pico downfield) e foi dividido em duas partes de pesos iguais. Um destes foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo de sólido branco (31 g) foi triturado em uma mistura de EtOAc e hexanos (150 mL, 20:80, v/v) em RT por 17 h deixando tempo para resolução dinâmica do menos solúvel Sp isômero. A pasta branca foi filtrada e o sólido foi enxaguado com 20% EtOAc em hexanos (2x 25 mL). O sólido (22,58 g) foi verificado por 1H-RMN e 31P-RMN e continha produto como um isômero contaminado com sal trietilamina cloridrato. O sólido foi dissolvido e particionado em 310 mL de EtOAc e 100 mL de água. Após a separação da camada orgânica, a camada aquosa foi extraída de volta com EtOAc (50 mL). A camada orgânica combinada foi lavada com água (3x 80 mL), salmoura (50 mL) e seca em MgS04. A solução foi concentrada sob pressão reduzida e, em seguida seca sob alto vácuo em RT em um peso constante para gerar 17,36 g do produto como um sólido branco a partir de metade da reação. O rendimento é 64%. O líquor mãe acima foi concentrado em um resíduo pegajoso (7,89 g) que continha os re-agentes com uma proporção de 1:1,2 (desejado/indesejado) baseado em 31P-RMN.

Exemplo 10-4. Preparação de éster isopropil de ácido (S)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico DCM (11,5 L) foi carregado no reator de vidro limpo e seco. Fe-nildiclorofosfato (2,3 kg, 10,9 mol) foi carregado ao reator sob nitrogênio. A solução foi então resfriado a 0°C. L- Alanina isopropiléster cloridrato (1,83 kg, 10,9 mol) foi então adicionado em uma porção e continua agitando por 30 min. A massa da reação foi resfriada a -50°C temperatura interna usando um banho de gelo seco/acetona. Uma mistura de TEA (2,1 eq, 3,17 L) em DCM (1 1,5 L) foi adicionado à solução de reação acima lentamente por um período de 8 h para manter a temperatura interna entre -40 a -50°C. Após conclusão de adição, a reação foi mantida na mesma faixa de temperatura por cerca de 1h. A mistura foi deixada aquecer a 0°C por cerca de 4h.

Ao mesmo tempo, em outro reator, DCM (6,9 L) foi carregado, e, em seguida pentafluorfenol (2,0 kg, 10,9 mol) foi adicionado sob nitrogênio. A solução foi resfriada a 0°C, então TEA (1,1 eq, 1,65 L) foi adicionado à solução de pentafluorfenol (exotérmica) por um período de cerca de 2 h. A solução resultante por sua vez foilentamente adicionado à primeira solução contendo o fenil diclorofosfato e éster aminoácido enquanto mantendo a temperatura entre 0 a 5°C por um período de cerca de 7 h. Após a conclusão da adição, agitação foi continuada na faixa de temperatura por cerca de 4 h. O progresso de reação foi monitorado por HPLC. Quando menos do que 5% de pentafluorfenol sobrou, a reação foi parada. Notar que o HPLC quiral indicou ainda uma mistura de diastereoisômeros do produto neste ponto. A suspensão de reação foi filtrada por um filtro Nutsche para remover a maior parte de sal trietilamina cloridrato suspenso. A torta de sal foi lavada com excesso de quantidade de DCM (9 L) e esta lavagem foi adicionada ao principal filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida a 35°C para gerar um resíduo sólido. O resíduo sólido foi co-evaporado com hexano (4 L) para aindâ reduzir os níveis de DCM residual. A este sólido residual foi adicionado 20% MTBE/Hexano 6 L e a suspensão foi agitada por cerca de 17 hr em temperatura ambiente e monitorado por HPLC. O pH da solução permaneceu básico devido ao TEA residual. Durante este tempo, uma resolução dinâmica ocorreu em que o sólido precipitado foi o desejado Sp-4 isômero e o sobrenadante restou em equilíbrio entre Sp-diasteômero e Rp-diasteômero. A suspensão passou por um filtro Nutsche e o produto sólido desejado, ainda contaminado com cloridrato de TEA, foi lavada com 5% de MTBE/Hexano (1 L). O sólido foi dissolvido em acetato de etil (35 L) e a solução foi lavada com água (3 x 35 L) e salmoura (10 L) e, em seguida a solução foi seca em sulfato de sódio sólido, filtrada e concentrada sob pressão reduzida mantendo a temperatura do reator abaixo de 44°C. O resíduo sólido foi co-evaporado com hexano (4 L). O reator foi trazido à temperatura ambiente e 5% de MTBE/Hexano (5 L) foram adicionados. A suspensão espessa foi agitada por 15 min e, em seguida o sólido foi coletado por filtração. O sólido coletado foi lavado com hexano (2,5 L) e seco sob alto vácuo em temperatura ambiente em peso constante para gerar o produto final (Sp-diasteômero) como um sólido branco, 2,6 kg (53%); 99,5% puro por HPLC, 0,4% de outro RP-diasteômero.

Exemplo 10-5. Preparação de (S)-isopropil 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2 il)metoxi)(fenoxi)-fosforilamino)propanoato. A uma solução agitada de l-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1 H-pirimidina-2,4-diona (3, 2,6g, 10mmol) em THF seco (50mL) foi adicionada uma solução 1,7M de cloreto de tert-butilmagnésio (12,4mL, 21mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 15min. Após 30min, uma solução de racêmico bruto de éster ísopropíl de ácido (2-[(2,3,4,5,6-pentafluor fenoxi)- fenoxi-fosforilamino] propiônico (4,08g, 10mmol) em THF (15mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 10min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 72h. O TLC co-spot com produto autêntico mostrou ao redor de 40-50% do produto desejado formado comparado ao nucle-osídeo de partida.

Exemplo 10-6. Preparação de (S)-lsopropil 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidln-1(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-metiitetrahidrofurano-2- il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Sp-4) usando éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi- fosforilamino] propiônico e purificação por cristalização somente.

A uma solução agitada de 3 (10g, 38,46mmol, seco sob vácuo a 50°C por 20h) em THF seco (165mL) foi adicionada uma solução 1,7M de cloreto de tert-butilmagnésio em THF (47,5 mL, 80,77 mmol) por um período de 20min enquanto mantido frasco em um banho de água fria (5°C) sob uma atmosfera de nitrogênio. Depois de conclusão da adição, o banho frio foi removido e a suspensão branca foi agitada em temperatura ambiente (20°C) por 30 min. Uma solução de éster isopropil de ácido (5)-2-[(5)-(2,3,4,5,6-pentafluorfenoxi)-fenoxifosforilamino] propiônico (20,9 g, 46,11 mmol) em THF anidro (165 mL) foi então adicionado à uma mistura de reação por um período de 30 min. A mistura foi agitada em temperatura ambiente (20°C) por 3,5 h. A agitação foi continuada por outra 1,5 h, em cujo estágio TLC indicou >95% de conversão e sem diferença significativa em 3',5'-fos-fosforamidato impureza intensidade de 2h. A mistura de reação foi extinta com NH4CI saturado aquoso (10 mL) e, em seguida o solvente foi evaporado a 25°C. O resíduo foi particionado entre acetato de etil (400 mL) e mistura de cloreto de amônio saturado (60 mL)/água (20 mL). A camada orgânica foi separada, lavada com cloreto de amônio saturado (80 mL) e água (3 x 60 mL). A camada aquosa superior a este ponto foi mantida separadamente. A camada orgânica foi lavada com 5% de carbonato de sódio aquoso (3 x 50 mL) e água (2 x 60 mL). A primeira camada aquosa foi extraída com mais acetato de etil (100 mL), lavada com água (2 x20 mL) e, em seguida a camada aquosa obtida a partir das lavagens de carbonato de sódio foi extraída com o mesmo extrato de acetato de etil. A camada orgânica foi lavada com água (2 x 20 mL) e combinada com o lote principal. As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio anidro, filtradas e concentra-. das para gerar um sólido espumoso (19,32 g). O resíduo foi dissolvido em 60 mL de diclorometano (um sólido branco foi precipitado e uma torta foi formada em cerca de cinco minutos) e, em seguida foi adicionado 25 mL de IPE. A suspensão foi agitada em temperatura ambiente por 2 h. O sólido branco foi filtrado, lavado com mistura de 1 :1 de (0°C) IPE/diclorometano frio (20 ml_) e seco para gerar 11,77 g (58% de rendimento) do produto como um sólido branco amorfo. O sólido acima foi re-dissolvido em diclorometano (350 ml_), filtrado e evaporado sob pressão atmosférica (45 °C temperatura do banho) para um volume de -120 mL. A solução foi deixada em repouso em temperatura ambiente (21 °C) por 20 h. O cristalino sólido branco (diclorometano sol-vato) foi coletado por filtração, lavado com diclorometano (0°C) frio (10 mL) e seco sob alto vácuo por 4 h em temperatura ambiente para gerar um produto puro não solvatado (10,62 g, 52% de rendimento) como agulhas brancas. HPLC pureza 99,8%. Propriedades espectrais combinam aqueles valores reportados aqui.

Exemplo 10-7. Preparação de (S)-lsopropil 2-((S)-(((2R,3R, 4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-meti!tetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Sp-4) usando éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-pentafluor-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico, condições de reação modificadas e retrabalho e purificação por cristalização somente. A uma suspensão em agitação de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4( 1 H,3H)- diona (3, 5,0 g, 19,1 mmol, seco sob vácuo a 50°C por 20 h) em THF seco (75 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio em THF (23,7 mL, 40,35 mmol) usando um funil de adição por um período de 30 min a -5°C. A suspensão branca foi agitada nesta temperatura por 30 min e, em seguida aquecida até temperatura ambiente (20°C) em cuja temperatura este foi agitado por mais 30 min. A mistura de reação foi resfriada a 5°C e, em seguida foi adicionada uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(5)-(2,3,4,5,6-pentafluorfenoxi)-fenoxifosforilamino] propiônico (10,45 g, 23,06 mmol) em THF (50 mL) por um período de 30 min. A mistura foi agitada em 5°C por 18 h, resfriado até -5°C e, em seguida extinto com 2N HC1 (25 mL). Tolueno (100 mL) foi adicionado à mistura e aquecida até temperatura ambiente. Após 20 min as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com HCI 1N (2 x 10mL), água (10 mL), 5% Na2C03 aquoso (4 x 10mL), água (2 x 10mL) e salmoura (10 mL). Todas as camadas aquosas foram extraídas novamente com tolueno (20 mL), lavado com 5% aquoso Na2C03 (2x5 mL), água (10 mL) e salmoura (5 mL). A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro, filtrada e e-vaporada em um volume aproximado de 20 mL. Diclorometano (20 mL) foi adicionado à solução e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 18 h. O sólido foi filtrado, lavado com mistura 1:1 MTBE/DCM (2 x 10mL) e seco sob alto vácuo para gerar sólido branco (7,7 g). HPLC do sólido neste indicou 98,21% Sp-4, 0,18% de não reagido 3 e 0,67% de 3',5-bis-fosforamidato impureza. O sólido acima de Sp-4 foi redissolvido em diclorometano (77 mL, aquecido em um vaso de pressão a 55°C) e deixado em repouso em temperatura ambiente por 20 h. O sólido cristalino foi filtrado com diclorometano frio (5 mL, 0°C) e seco sob alto vácuo para gerar produto puro como um sólido branco (6,9 g, 68% de rendimento, 99,79% puro por HPLC). A preparação e purificação de C ou C' gera acesso direto para Sp-4 ou Rp-4, conforme ilustrado nos seguintes exemplos.

Exemplo 11. Preparação de Sp-4 (32 mg em escala): A uma solução agitada de 1 -((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il) -1 H-pírimidina-2,4-diona 3 (32 mg, 0,12 mmol) em THF seco (1mL) foi adicionada uma solução 1M de cloreto t-butilmagnésio (0,26 mL, 0,26 mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 3 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro- fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (8, Sp-isômero) em THF (0,5mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 3min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 42h e, em seguida interrompida com NH4CI aquoso saturado (10mL). A mistura foi particionado entre acetato de etil e água. O extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro e concentrado. O resíduo foi cromatografado usando gradiente 0-4% rnetanol/diclorometano para gerar Sp-4 como sólido espumoso (29mg, 44,5% de rendimento). 1H e 31P RMN concordam com o que é aqui revelado.

Exemplo 12. Preparação de Sp-4 (2,6 g-escala, sem cromato-grafia): A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 ml_) foi adicionado uma solução 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio (12,4 mL, 21 mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (8, Sp-isômero, 4,08g, 10mmol) em THF (15 mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 10min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente for 60h e, em seguida extinta com aquoso saturado NH4C1 (20mL). A mistura foi particionada entre acetato de etil (150 mL) e sequencialmente, 10% aquoso Na2CC>3 (3 x 20 mL) e água (20 mL). O extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido (3,8 g). O resíduo foi dissolvido em diclorométano (7,6 mL) e, em seguida agitado por 20h em temperatura ambiente. The sólido branco foi filtrado, lavado com 1:1 I-PE/diclorometano (5 mL) e seco sob vácuo para gerar produto puro como sólido branco (1,85 g, 35% de rendimento).

Exemplo 13. Preparação de Sp-4 usando NaHMDS: A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il) -1H~pirimidina-2,4-diona (71 mg, 0,27 mmol) em THF seco (2,0 mL) foi adicionada uma solução 2,0 M de bis(trimetilsilil)amida de sódio (NaHMDS) em THF (270 pL, 0,54 mmol) a -78°C por um período de 2 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4- Nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] -propiônico (8, Sp-isômero, 111 mg, 0,27 mmol) em THF (1 mL) foi adicionado à mistura. A mistura de reação foi deixada agitar nesta temperatura por 2h e, em seguida aquecida a -20°C em cuja temperatura foi agitada por mais 20h. TLC indicou -30% de nucleosídeo de material de partida não reagido. Assim, mais 0,5 equivalentes do reagen-te (55 mg, 0,14 mmol) em THF (0,5 mL) foi adicionado à mistura de reação e agitado por mais 6 h. A mistura de reação foi extinta com solução de cloreto de amônio aquoso saturado e, em seguida particionado entre acetato de etil e água. O extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro e concentrado para gerar um resíduo marrom claro. Cromatografia em coluna do produto bruto usando gradiente 0-5% metanol/diclorometano gerou Sp-4 (22 mg, 15% de rendimento), 3’-fosforamidato (5, Sp-isômero, 11,5 mg, 16% de rendimento) e bis fosforamidato (6, Sp, Sp-isômero, 12,6mg).

Exemplo 14. Preparação de Rp-4 (260 mg em escala): A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (260 mg, 1 mmol) em THF seco (6 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio (1,23 mL, 2,1 mmol, 2,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 5 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (8, Rp-isômero) em THF (3 mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 3 min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 96 h e, em seguida extinta com NH4CI aquoso saturado (10 mL). A mistura foi particionada entre acetato de etil (50 mL) e água (2 x 20 mL). O extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido (490 mg). O resíduo foi cromatografado usando gradiente 0-5% metanol/diclorometano para gerar produto como um sólido branco (160 mg, 30% de rendimento). A preparação de Sp-4 ou Rp-4 pode ainda ser conseguido reagindo 3'-protegido 3 com o reagente apropriado C ou C' ou uma mistura contendo C e C', conforme ilustrado nos seguintes exemplos.

Exemplo 15. Preparação de Sp-4 com 3a como Intermediário Sintético Exemplo 15-1. Síntese de 5,-0-tert-Butildimetilsilil-2'-deoxi-Z^flúor-^-C-metiluridina (9): A uma solução agitada de 2,-deoxi-2'-flúor-2'-C-metiluridina (3, 81,1 g, 312 mmol) em piridina seca (750 mL) foi adicionado sob gotejamento uma solução de TBDMSC1 (103,19 g, 685,6 mmol) em piridina seca (500 mL) por um período de 45 min em temperatura ambiente. A reação foi deixada agitar em temperatura ambiente por 24 h.

Metanol (85 mL) foi adicionado à mistura de reação e esta foi deixada agitar for 10 min e, em seguida os solventes foram destilados sob pressão reduzida. Água quente (45°C) (1 L) foi adicionado à massa de reação e a mistura extraída com acetato de etil (2 x 500 mL), lavada com água (1 x 500 mL). A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro. Acetato de etil foi destilado e o resíduo obtido foi co-evaporado com tolueno (2 x 500 mL) para gerar 9 bruto como uma espuma branca. Rendimento = 116,9 g (quantitativo). 1H RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,1 (s,6H), 0,91 (s, 9H), 1,22 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,50 (s, 2H), 3,75-4,05 (m,4H), 5,54 (d, 1H, J = 9 Hz), 5,73 (s, 1H), 6,0 (d, 1H, J = 18 Hz), 7,81 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,57 (br, s, 1H), 11,1 (s, 1H).

Exemplo 15-2. Síntese de 5a-0 -( tert -Butildimetilsili))-3'-0-levulínil^-deoxi^-flúor 2'-C-metil-uridina (10): A uma solução agitada de nucleosídeo 9 (116,9 g, 312,1 mmol) em DCM (1 L) foi adicionado DMAP (30,5 g, 249,7 mmol) e esta foi deixada agitar em RT por 20 min. Uma solução de anidrido levulínico (133,6 g, 642,3 mmol) em DCM (200 mL) foi adicionado à mistura e deixado agitar por 24 h. TLC da mistura indicou conclusão de reação. Água fria (500 mL) foi adicionada e a mistura agitara por 20 min. As camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio aquoso (2 x 250 mL), seco em sulfato de sódio anidro e, em seguida o solvente foi destilado sob pressão reduzida para gerar óleo amarelo. Rendimento bruto: 197,6 g (135 %). O material foi usado como é para a etapa seguinte. 1H RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,11 (s, 6H), 0,94 (s, 9H), 1,34 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,22 (s, 3H), 2,6-2,89 (m, 4H), 3,72 (m, 1H), 4,01 (d, 1H, J = 12 Hz), 4,23 (d, 1H, J = 9 Hz), 5,33 (dd, 1H, J = 15 Hz), 5,73 (d, 1H, J = 6 Hz), 6,26 (d, 1H, J = 15 Hz), 8,12 (d, 1H, J = 12 Hz), 8,72 (br, s, 1H).

Exemplo 15-3. Síntese de 3,-0-levulinil-2'-deoxi-2'-flúor 2'-C-metil-uridina (3a): Bruto 10 (197,6 g, -312,1 mmol) foi dissolvido em DCM (1 L) ao qual foi adicionado TEA.3HF (50,3 g, 312,1 mmol) e deixado agitar durante a noite em temperatura ambiente. TLC da mistura indicou cerca de 50 % conclusão da reação. Outro equivalente de TEA.3HF (50,3 g, 312,1 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi deixada agitar por 6 h. TLC neste ponto indicou cerca de 10 % de material de partida não reagido. Outro 0,25 eq de TEA.3HF (12,5 g, 78,0 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi deixada agitar durante a noite. A mistura de reação foi concentrada até secagem para gerar óleo amarelo. O bruto de todos os lotes foi purificado por croma-tografia em coluna em sílica gel (0-2% MeOH em DCM) para gerar 124,1 g de 3'-levulinato com uma espuma branca sólida (90% rendimento purificado por três etapas de 2'-deoxi-2'-flúor-2'-C-metiluridina). 1H RMN: (CDC13, 400 MHz) δ 1,55 (d, 3H, CH3, J =20 Hz), 2,36 (s, 3H, CH3), 2,8-3,03 (m, 5H, CH2CH3), 3,91-3,96 (dd, 1H.CH3), 4,2-4,25 (m, 1H, CH'), 4,34 (dd, 1H, CH, J = 8 Hz), 5,25 (dd, 1H, J = 16 Hz), 5,93 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 8 Hz), 9,18 (s, 1H).

Exemplo 15-4. Síntese Estereoseletiva de éster (S)-isopropil de ácido (S)-2-{[(1 R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-flúor-3-(4-oxopentanoil)-4-metN-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiônico (11): A uma solução de nucleosídeo (3a, 1,00 mmol, 358 mg) em 5 ml THF anidro que foi resfriado a 0°C foi adicionado tBuMgCI (1,7 M em THF, 2 eq) e deixado aquecer até temperatura ambiente e agitar por meia hora. À esta mistura foi adicionado o reagente (ca. 97% pureza quiral) éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxí)-fenoxi-fosforilamino] propiônico (8, 5p-isômero) (408 mg, 1,00 mmol, 1,00 eq.) em um lote e deixado agitar em rt. Após 16 h, foi -30% de material de partida restante. A mistura de reação foi extinta com solução saturada de NH4C1 10 ml, e a fase aquosa foi extraída com acetato de etil (3 x25 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura e seca em sulfato de sódio anidro e evaporada até secagem para gerar uma espuma amarela pálida (500 mg). Este foi purificado por cromato-grafia sílica gel usando 2-5% metanol em cloreto de metileno para gerar o produto com uma espuma branca (275 mg) de cerca de 97% P pureza quiral e material de partida não reagido (162 mg). Baseado no material de partida consumido, o rendimento foi 76%. 31P RMN (CDC13, 162 MHz): 3,7 ppm; 1H RMN (CDC13, 400 MHz): 6 1,22 (dd, 6H, J = 6,4 Hz), 1,37 (s, 3H), 1,58 (s, 3Η), 2,18 (s, 3H), 2,63-2,9 (m, 4H), 4,0 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,2-4,33 (m, 1H), 4,57 (d, 1H, J = 8Hz), 4,96-5,00 (sept, 1H), 5,2 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5,42 (d, 1H, J = 8Hz), 6,19 (d, 1H, J = 18Hz), 7,15-7,35 (m, 5H), 7,5 (d, 1H, J = 5,6 Hz), 8,2 (br, s, 1H).

Exemplo 15-5. Síntese de éster (S)-isopropil de ácido (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-yl)-4-(R)-flúor-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiônico (Sp-4) Uma solução de sulfito de sódio foi preparado adicionando Na2S203 (1,51 g) e Na2S205 (0,57 g) em água (25 mL). A uma solução de levulinato (11, 250 mg, 0,40 mmol) em THF anidro (2,5 mL) foi adicionado 1,0 ml da solução de sulfito de sódio. Esta foi deixada agitar em temperatura ambiente por 4 h. A mistura de reação foi vertida em água (15 mL) e extraída com acetato de etil (3x25 mL) seca e evaporada para gerar quantitativamente um produto sólido branco com cerca de 97% P de pureza quiral em que combinado com as propriedades físicas e espectrais de Sp-4 produzido diretamente do nucleosídeo não protegido.

Exemplo 16. Procedimento alternativo para preparar Sp-4 de 3a. A uma solução agitada de éster de ácido 4-oxo-pentanoico (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-flúor-2-hidroximetil-4-metil-tetrahidro-furan-3-il (3a, 210 mg, 0,59 mmol) em THF seco (1,5 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio (1,07 mL, 1,82 mmol) em temperatura ambiente por um período de 2 min. Inicialmente, um precipitado branco foi observado e após 10 min a mistura de reação virou uma solução amarelo escuro. Após 30min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propiônico (8 (Sp-isômero), 382mg, 0,94mmol) em THF (1,5mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 3min. A mistura foi aquecida a 40°C por 5h em cujo tempo TLC e 1H RMN indicou menos do que 2% de material de partida não reagido. A reação foi extinta com cloreto de amônio aquoso saturado e, em seguida particionada entre acetato de etil e água. A camada orgânica combinada foi lavada com solução aquosa a 10% de Na2C03 (3x10 ml_), seguido por água. A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrado para gerar resíduo de cor marrom (410 mg). O produto bruto foi dissolvido em tetrahidrofurano (1,0 mL) e, em seguida foi adicionada uma solução aquosa de mistura de sulfito de sódio (37 mg, 0,295 mmol) e metabissulfito de sódio (224 mg, 1,18 mmol) em 1mL de água. A mistura foi aquecida a 45 °C por 20 h em cujo estágio somente cerca de 10% de conversão foi observado por TLC, por isso o sulfito de sódio adicional (74 mg) e metabissulfito de sódio (448 mg) foi adicionado e o aquecimento foi continuado por mais 52 h. Neste momento, cerca de 40% de conversão observada por TLC. A mistura de reação foi particionada entre água e acetato etil. A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar um resíduo marrom (210 mg). Croma-tografia de coluna do resíduo usando gradiente 0-5% MeOH/DCM gerou material de partida não reagido (89mg) e Sp-4 (57mg, 18% de rendimento, 24% baseado em material de partida recuperado).

Exemplo 17. Preparação de Sp-4 com 3c como um Intermediário sintético Exemplo 17-1. Preparação de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(tert-butildimetilsilaniloxi)-3-flúor-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-1H-pirimidina-2,4-diona, 12. A uma solução de 3 (10,Og, 38,43 mmol) em piridina (50 mL) foram adicionados diclorometano (50 mL). A solução foi resfriada a 0°C. À solução foi adicionado 4,4'-dimetoxitritil cloreto (14,32 g, 42,27 mmol) e a solução foi agitada em 0°C por 5 h. Metanol (5 mL) foi adicionado para extinguir a reação. A solução foi concentrada até secagem sob pressão reduzida e o resíduo foi particionado entre acetato de etil (500 mL) e água (50 mL). A solução orgânica foi lavada com salmoura (50 mL) e seca (sulfato de sódio, 4 g). O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em diclorometano (100 mL). À solução foram adicionados imidazol (7,83 g, 115 mmol) e t-butildimetilsilil cloreto (8,68 g, 57,6 mmol). A solução foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Metanol foi adicionado para extinguir a reação (5 mL) e o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi particionado entre acetato de etil (500 mL) e água (50 mL). A solução orgânica foi seca (sulfato de sódio , 4 g) e evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (10-40% EtOAc em He-xano) para gerar produto intermediário 5'-0-DMT-3'-0-tBDMS. Este, por sua vez, foi tratado com 1% de ácido trifluoracético em diclorometano (200 mL). A solução foi agitada em temperatura ambiente por 1h. Água (20 mL) foi adicionada e a solução foi agitada em ambiente por mais 1 h. Metanol (5 mL) foi lentamente adicionado e a solução foi agitada em ambiente por mais 1h. Hidróxido de amônio foi adicionado para ajustar pH de solução a 7. A solução orgânica foi separada, seca (sulfato de sódio , 4 g) e evaporada até secagem sob pressão reduzida. O resíduo foi pirufucado por cromatografia de coluna de sílida gel (1 -5% metanol em diclorometano) para gerar 12 como um sólido branco 7,5g em 50% de rendimento durante as três etapas. 1H RMN (DMSO-d6) δ (ppm) 11,48 (br s, 1H, NH), 7,94 (d, 1H, H-6), 6,00 (d, 1H, H-1'), 5,69 (d, 1H, H-5), 4,06 (dd, 1H, 3'-H), 3,85 (m, 2H, H-5’a, H-4'), 3,58 ( br d, 1H, Η-5'b), 1,27 (d, 3 H, 2-CH3), 0,89 (s, 9H, C(CH3)3), 0,12 (s, 6H, Si(CH3)2).

Exemplo 17-2. Preparação de Sp-4 usando 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(tert-butildimetilsilanyloxi)-3-flúor-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-1 H-pirimidina-2,4-diona (3c). A uma solução agitada de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(tert-butildimetil-silanyloxi)-3-flúor-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-1H-pirimidina-2,4-diona (12, 374 mg, 1 mmol) em THF seco (3 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de cloreto de tert-butilmagnésio (1,8 mL, 3,1 mmol)) em temperatura ambiente por um período de 2 min. Inicialmente, um precipitado branco foi observado e após 10min a mistura de reação passou para uma solução clara amarela escuro. Após 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propiônico (8, Sp-isômero, 653 mg, 1,6 mmol) em THF (2,5 mL) foi adicionado sob gotejamen-to por um período de 3 min. A mistura foi aquecida a 40°C por 20 h em cujo tempo TLC e *H RMN indicaram menos do que 5% de material de partida não reagido. A mistura de reação foi extinta com cloreto de amônio aquoso saturado e, em seguida particionada entre acetato de etil e água. A camada orgânica foi lavada 10% de solução aquosa de Na2C03(3 x 10 mL), seguido por água (20 mL). A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar resíduo marrom contendo 3c (850 mg). O produto bruto foi dissolvido em tetrahidrofurano (2 mL) e foi adicionado 0,8 mL de 80% de ácido fórmico aquoso em temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida a 50°C por 96h. cerca de 70% de conversão foi observada em TLC. A mistura de reação foi vertida em saturado bicarbonato de sódio aquoso frio e, em seguida particionado entre acetato de etil e água. A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar resíduo marrom (220 mg). Cromatografia de coluna do resíduo usando gradiente Ò-5% MeOH/DCM gerou o material de partida não reagido (21 mg) e Sp-4 (77 mg, 35% de rendimento, 39% de rendimento baseado em material de partida recuperado).

Exemplo 18. Preparação de Sp-4 com 3d como um Intermediário sintético Exemplo 18-1. Preparação de 3d A uma solução agitada de 3 em piridina (20 mL) a 0°C foi adicionado TIPDS-CI sob gotejamento por um período de 15 min. A mistura foi lentamente adicionada em temperatura ambiente em cuja temperatura este foi agitada por 16 h. A piridina foi evaporada e o resíduo foi co-evaporado com tolueno (50 mL). O resíduo foi então triturado com hexanos e o precipitado branco foi filtrado usando um pad de Celite. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um sólido espumoso (12,97 g). O produto bruto (13) foi redissolvido em tetrahidrofurano (75mL) e foi adicionada uma solução aquosa de TFA (75mL, 1:1 TFA/água) a 0°C por um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 6 h. TLC indicou -5% de material de partida. A mistura de reação foi extinta com NaHCOs aquoso saturado até pH 8 e, em seguida extraída com acetato etil. O extrato orgânico combinado foi lavado com água, seco e concentrado para gerar sólido cristalino branco. Outra trituração do sólido com hexanos (30 mL) gerou sólido branco que foi filtrado e seco sob alto vácuo para gerar 3d (10,1 g, 84 % de rendimento durante 2 etapas). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,83 (bs, 1H), 7,94 (bd, J=6,0Hz, 1H), 6,10(bd, J=18,4Hz, 1H), 5,71 (d, J=8,2Hz, 1H), 4,43 (bs, 1H), 4,36 (dd, J=22,6, 9,0Hz, 1H), 4,27 (bs, 1H), 4,10(d, J=13,2Hz, 1H), 4,03 (d, J=9,2Hz, 1H), 3,92 (d, J=13,2Hz, 1H), 1,39 (d, J=22,0Hz, 3H), 1,1 1-0,92 (m, 28H).

Exemplo 18-2. Preparação de Sp-4 A uma solução agitada de 3d (520 mg, 1 mmol) em THF seco (5 mL) foi adicionada uma solução 1,7M de cloreto de tert-butilmagnésio (1,8 mL, 3,1 mmol, 3,1 equiv)) em temperatura ambiente por um período de 15 min. Apôs 30 min, uma solução de éster isopropil de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxifosforilamino] propiônico (8, Sp-isômero, 653 mg, 1,6 mmol) em THF (1 mL) foi adicionado sob gotejamento por um período de 3 min. A mistura foi deixada agitar em temperatura ambiente por 60 h. 1H e 31P RMN da amostra bruta indicou a mistura de diastereoisômeros em cerca de 1:0,76. A mistura de reação foi extinta com NH4CI aquoso saturado (20 mL). A mistura foi particionada entre acetato de etil (150 mL) e sequencialmente, 10% NaaCOs aquoso (3 x 20mL) e água (20 mL). O extrato orgânico combinado foi seco em sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido (14, 878 mg). O composto acima, 14, foi redissolvido em tetrahidrofurano (3 mL) e, em seguida foi adicionado 80% ácido fórmico aquoso. A mistura foi aquecida a 55°C por 20h. A mistura de reação foi resfriada a 0°C, e, em seguida extinta com aquoso saturado bicarbonato de sódio (pH 7,0). A mistura de reação foi então particionada entre acetato de etil e água. A camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio e concentrada para gerar 560mg do resíduo. O resíduo foi cromatografado usando gradiente 0-5% metanol/diclorometano para gerar material de partida não reagido (14, 242mg) e Sp-4 (80mg, 15% de rendimento) como um sólido branco.

Exemplo 19. Preparação de Isotopicamente Marcado Sp-4 Exemplo 19-1. Preparação de 1-((6aR,8R,9R,9aS)-9-hídroxi-2,2,4,4-tetraisopropiltetrahidro-6H-furo[3,2-fI[1,3,5,2>4]trioxadisilocln-8-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 16 Uridina (15, 100,0 g, 409,5 mmol) foi co-evaporado até secagem com piridina anidra (600 mL) e ressuspenso em piridina anidra (700 mL). À esta suspensão agitada foi adicionado 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano (135,7 g, 482,5 mmol) por 60 min em temperatura ambiente. Após agitação a suspensão fina por 17 h em temperatura ambiente, a reação foi extinta adicionando metanol (20 mL) e, em seguida concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi particionado entre acetato de etil (1,5 L) e água (2 L). A camada orgânica foi ainda lavada com 5% ácido clorídrico (2 x 1L), salmoura (500 mL), seco em sulfato de sódio sólido (50 g), filtrada e concentrada sob pressão reduzida ao produto bruto, ca 250 g. O resíduo foi submetido a uma coluna de fíltração usando coluna de sílica gel (1,75 kg) e um gradiente de acetato de etil em hexanos 20-65%. As frações de produto puro conforme julgado pelo TLC homogêneo (Rf 0,55 em 1: 1 hexanos-acetato etil) foram combinados e concentrados sob pressão reduzida e secos (40°C, 0,2 mm Hg, 24 h) para gerar 145,5 g (76%) de 16 com um sólido em espuma branca. Uma fração adicional (35 g) de 16 ligeiramente impuro foi ainda coletada. 1H RMN (DMSO-d6) δ (ppm) 11,35 (s, 1H, NH), 7,66 (d, 1H, J= 7,6 Hz, H-6), 5,57 (d, 1H, J= 4,8 Hz, 2'-OH), 5,50-5,49 (m, 2H, Γ-Hand H-5), 4,14-4,18 (m, 3H, 2', 3', 4'~H), 3,97-3,87 (m, 2H, 5'-Ha and Hb), 1,02-0,95 (m, 28H, CH(CH3)2).

Exemplo 19-2. Preparação de 1-((6aR,8R>9aR)-2,2,4,4-tetraisopropil-9-oxotetrahidro-6H-furo[3,2-fJ[1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona, 17 A um frasco redondo seco de três gargalos foram adicionados DCM anidros (600 mL) e DMSO (30,82 g, 394,5 mmol). A solução foi resfriada a -78°C em um banho de gelo seco/acetona sob uma atmosfera de nitrogênio. Anídrido Trifluoracético (líquido, 77,7 g, 369,8 mmol) foi adicionado via seringa por 40 mins e obtida uma mistura turva. À mistura uma solução de derivado de uridina 16 em DCM (600 mL) foi adicionado sob gotejamento por 75 rriins a -78°C através de um funil de adição. A mistura heterogênea foi agitada por 2 h a -78~65°C e, em seguida trietilamina anidra (92 mL) foi adicionado via seringa rapidamente para formar uma solução clara amarela clara. Após 1 h em baixa temperatura, a reação foi completa como mostrado por TLC (30% EtOAc em hexanos). O banho de resfriamento foi removido e a mistura de reação foi aquecida lentamente até temperatura ambiente por 1 h. A reação foi extinta pela adição de NH4CI sat (180 mL). Água (200 mL) foi adicionado e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída novamente com DCM (300 mL). A camada orgânica combinada foi lavada com água (3x 400 mL), salmoura (150 mL), e seca em Na2S04. A remoção do solvente gerou um resíduo marrom pegajoso. O resíduo de óleo bruto (continha traço de DCM) foi armazenado durante a noite no freezer. Após durante a noite, algum cristal sólido foi observado no óleo. O óleo foi dissolvido em 500 ml hexanos em temperatura ambiente. A solução foi armazenada em freezer por 24 horas e mais sólido foi formado. Sólido foi coletado através de filtração e enxaguado com 10% de DCM frio em hexanos (1 L) para remover a maior parte da cor laranja. O sólido (17) foi seco sob vácuo por 2 h e, em seguida seco em ar por 24 h. O sólido pesou 21 g após seco em 50 °C em vácuo. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna (10-70% acetato de etil em hexanos) para gerar mais 37 g (rendimento combinado de 97%) de 17 como um sólido laranja claro.

Exemplo 19-3. Preparação de 1-((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona, 18 Magnésio (3,53 g, 147 mmol), lavado com 5% ácido clorídrico aquoso e seco (50°C, 0,2mm Hg, 24 h), foi colocado em um frasco de fundo redondo de dois gargalos com um agitador magnético e um condensador. O frasco foi preenchido com gás argônio e, em seguida éter anidro (80 mL) foi adicionado. Ao magnésio em éter foi adicionado lentamente iodeto de per-deuterio-13C metil (15,06 g, 110,3 mmol), que gerou uma reação exotérmica. Após a mistura de reação foi resfriada, o sobrenadante foi transferido a uma solução de composto 17 seco (50°C, 0,2mm Hg, 15 h) (10,0 g, 20,63 mmol) em THF anidro (1 L) a -50°C por 20 min. A temperatura foi deixada aumentar a -40°C e a mistura foi agitada entre -40 a -25 °C por 4h. Na conclusão da reação, a mistura foi diluída com EtOAc (1L) a -50 "C e, em seguida salmoura (300 mL) foi adicionada lentamente. A camada orgânica foi separada e, em seguida lavada com solução de cloreto de arnônio saturada (300 mL x 2) e seca com sulfato de sódio . Após filtração e concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em MeOH (250 mL). Fluoreto de arnônio (12 g) e TBAF (400 mg) foram adicionados. A mistura resultante foi agitada em 90°C por 7h e, em seguida concentrado com sílica gel (20 g) sob pressão reduzida. Após secagem completa em vácuo, o resíduo obtido foi purificado por cromatografia rápida em coluna de sílica gel (MeOH:CH2CI2 = 1 :20 a 1 :10) gerou o composto 18 (5 g, 46%) como um sólido branco. 1H RMN (DM-SO-d6) δ (ppm) 11,26 (s, IH, NH), 7,65 (d, 1H, J= 8,4 Hz, H-6), 5,77 (d, 1H, J= 2,4 Hz, Η-Γ), 5,57 (d, 1H, J= 8,0 Hz, H-5), 5,46 (d, 1H, J= 5,2 Hz, HO-3'), 5,24 (d, 1H, J= 2,4 Hz, HO-2'), 5,14 (t, 1H, J= 5,6 Hz, HO-5'), 3,74-3,56 (m, 4H, H-3\ 4', 5’, 5").

Exemplo 19-4. Preparação de ((2R,3R,4S,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-yl)-4-hidroxi-4-3C-perdeuteriometiltetrahídrofurano-2il()metil acetato, 19 A uma solução de composto 18 (5,00 g, 19,1 mmol) em piridina anidra (100 mL) foi adicionado acético anidro (3 mL) em temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 15h, diluído com EtOAc (250 mL), lavado com água (50 mL x 3), e seco com sulfato de sódio . Após filtração e concentração, o resíduo foi purificado por croma-tografia rápida de coluna (MeOH 0 a 5% em CH2C12) para gerar composto 19 (4,0 g, 68%) como um sólido cinza.

Exemplo 19-5. Preparação de ((2R,3R,4R,5R)-3-acetoxi-5-(2f4-dioxo-3,4-dihidropirimídm-1(2H)-il)-4-flúor-4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)metil acetato, 20 A uma solução de composto 19 (2,33 g, 6,73 mmol) em anidro CH2C12 (60 mL) foi adicionado DAST (1,33 mL, 10,1 mmol) a -78°C lentamente. A mistura resultante foi agitada por 30 min após exposto em temperatura ambiente. Duas reações em escala de 2,33 g e uma reação em escala 1,00 g foram conduzidas exatamente da mesma forma. Todas as quatro misturas de reação foram combinadas, diluídas com CH2C12 (300 mL), e lavado com gelo-água (100 mL x 2) e, em seguida solução aquosa fria de NaHC03 (100 mL x 2). Após secagem, filtração, e concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia rápida de sílica gel em coluna (EtOAc 0% a 50% ín hexanos, o composto ficou ao redor de 48%) para gerar composto 20 (2,0 g, 24% de total 7,99 g de composto 19) como um sólido branco. 1H RMN (CDC13) δ (ppm) 8,27 (s, 1H, NH), 7,55 (d, 1H, J= 8,4 Hz, H-6), 6,17 (d, 1H, J= 18,8 Hz, H-), 5,78 (dd, 1H, J = 1,2, 8,4 Hz, H-5), 5,12 (dd, 1H, J= 9,6, 21,6 Hz, H-3"), 4,40-4,31 (m, 3H, H-4\ 5', 5"), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,15 (s, 3H, CH3).

Exemplo 19-6. Preparação de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona, 21 A uma solução de composto 20 (2 g, 5,74 mmol) em metanol (20 mL) foi adicionado n-butilamina (6 mL). A mistura resultante foi agitada em rt por 15h e concentrada com sílica gel em vácuo. O resíduo obtido foi purificado cromatografia rápida de coluna de sílica gel (MeOH 0 a 10% em CH2C12) para gerar composto 21 (1,3 g, 85%) como um sólido branco. 1H RMN (CD3OD) δ (ppm) 8,08 (d, 1H, J= 8,0 Hz, H-6), 6,13 (d, 1H, J= 18,4 Hz, Η-Γ), 5,70 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5), 3,99 (d, 1H, J= 13,6 Hz, H-5'), 3,97-3,91 (m, 2H, H-3', 4'), 3,80 (dd, 1H, J= 2,0, 12,8 Hz, H-5"), ESMS (M+l) estimado 265, observado 265. 21 22 23 Exemplo 19-7. Preparação de (S)-lsopropil 2-((((2R,3R,4R, 5R)-5-(2>4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-flúor-3-hidroxi-4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino) pro-panoato, 22 A uma solução de nucleosídeo 21 desprotegido (207 mg, 0,783 mmol) e N-metilimidazol (0,4 ml, 5 mmol) em THF (4 mL) foi adicionado o pré-preparado fosforocloridrato em THF (1,0 M, 2,35 ml, 2,35 mmol) a 0°C sob gotejamento. A reação foi lentamente aquecido até temperatura ambiente por 1 h e, em seguida água (1 mL) e EtOAc (5 mL) foram adicionados. A solução orgânica foi lavada com citrato de sódio saturado aq. mono básico (2x2 ml), NaHC03 aq. Saturado (1x2 ml), seco (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. O bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica usando 0 a 5% 'PrOH em CH2C12 como eluentes para gerar o fosfo-ramidato, 22 (216 mg, 52%, 1 :1 mistura de P-diastereoisômeros) como um sólido branco: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,54 (s, 1H), 7,56 (d, J= 6,8 Ηζ, 1 Η), 7,40-7,35 (m, 2Η), 7,23-7,18 (m, 3 Η), 6,14-5,96 (m, 2Η), 5,89 (dd, J= 5,6, 25,6 Hz, 1H), 5,55 (t, J= 8,4 Ηζ, 1H), 4,85 (dq, J= 1,6, 6,0 Ηζ, 1H), 4,44-4,32 (m, 1H), 4,25 (m, 1H), 4,06-3,98 (m, 1H), 3,86-3,70 (m, 2H), 1,30-1,08 (m, 9H); 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6) δ 4,90, 4,77; LRMS (ESI) [M + H]+ calculado para C2i13CH27D3FN309P 534,5, encontrado 534,4.

Exemplo 19-8. Preparação de ácido (2S)-2~(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)‘4-flúor-3-hidroxi-4-13C-perdeuteriometiitetrahidrofurano-2-il)metoxi)(hidroxi)fosforil)amino)propanoico, 23 Fosforamidato 22 (147 mg, 0,276 mmol) foi suspenso em trieti-lamina (2 mL) e água (0,5 mL), e aquecido a 60°C por 30 h. Então, os componentes voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O bruto foi purificado por cromatografia de coluna sílica eluindo com 50-70% 'PrOH em CH2C12 e então, 0 a 20% NH4OH em 'PrOH para gerar 23 como um sólido branco (95 mg, 83%): 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 68,00 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 5,98 (d, J= 19,2 Hz, 1H), 5,52 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 4,02-3,81 (m, 4H), 1,10 (d, J= 6,8 Hz, 3H); 31P RMN (162 MHz, -OMSO-de) 5 8,12; LRMS (ESI) [M + Hf calculado por Ci213CH27D3FN309P 416,3, encontrado 416,4. Propriedades de Amostras de Rp-4, 4, e Sp-4 Amostras de Rp-4, 4, e Sp-4 foram analisadas por Difração em pó de raio-X (XRPD), espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infravermelho em transformata de Fourier (FT-IR), calorimetria de varredura diferencial (DSC), análise gravimétrica térmica (TGA), sorção de vapor gravimétrica (GVS), solubilidade aquosa termodinâmica, e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

Exemplo 20. Difração em pó de raio-X Amostras de Rp-4, 4, e Sp-4 foram analisadas por difração de pó em raios-X (XRPD) sob o seguinte regime. a. Bruker AXS/Siemens D5000 Padrões de difração em pó de raio-X foram coletados em um di-fratômetro Siemens D5000 usando radiação Cu Ka (40kV, 40mA), Θ-Θ goni- ômetro, diveregência de V20 e recebendo fendas, um monocromator secundário de grafite e um contador de cintilação. O instrumento é verificado em desempenho usando um padrão certificado Corundum (NIST 1976). O software usado para a coleta de dados foi Diffrac Plus XRPD Commander v2.3.1 e os dados foram analisados e apresentados usando Diffrac Pius EVA v 11.0.0.2 ou v 13.0.0.2.

Condições Ambientais As amostras correram em condições ambientes foram preparadas como espécimes em placa plana usando pó conforme recebido. Aproximadamente 35 mg da amostra foi suavemente empacotada em um corte de cavidade em bolacha de silício polida de zero-background (510). A amostra foi girada em seu próprio plano durante a análise. Os detalhes da coleta de dados são: Faixa angular: 2 a 42°2Θ; tamanho da etapa: 0,05°2Θ; e tempo de coleção: 4 s.etapa'1.

b. Bruker AXS C2 GADDS

Padrões de Difração em pó de raio-X foram coletados em um di-fratômetro Bruker AXS C2 GADDS usando radiação Cu Ka (40 kV, 40 mA), estado automatizado XYZ, microscópio de vídeo laser para auto-amostrador e um detector de área HiStar 2-dimensional. Óptica de raio X consiste de um espelho multicamada único Gobel acoplado com um colimador pinhole de 0,3 mm. A divergência de feixe, ou seja o tamanho efetivo do feixe de raio X na amostra, foi aproximadamente 4 mm. O modo de varredura Θ-Θ contínuo foi empregado com uma distância detector-amostra de 20 cm que gerou uma faixa efetiva 2Θ de 3,2o- 29,7°.

Tipicamente, a amostra poderia ser exposta ao feixe de raio X por 120 segundos. O software usado para a coleta de dados foi GADDA para WNT 4.1.16 e os dados foram analisados e apresentados usando Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2 ou v 13.0.0.2.

Condições Ambientais As amostras correram em condições ambientes foram preparadas como espécimes em placa plana usando pó conforme recebido sem moagem. Aproximadamente 1-2 mg da amostra foi levemente prensada em uma lâmina de vidro para obter uma superfície plana.

Difração em pó de raios-X (XRPD) 4 foi encontrado por XRPD como sendo amorfo (ver Fig. 1). Análise de XRPD de alta resolução de RP-4 preparado de acordo com o Exemplo 3 confirmou um cristalino sólido apresentando um padrão de pó diferente aquele de Sp-4 (preparado de acordo com o Exemplo 4, método 4), que foi ainda conformado como sendo um sólido cristalino. A tabela de resultados de XRPD para RP-4 e Sp-4 são mostrados na Tabela 1 com todos os picos apresentando uma intensidade de <5 % (RP-4) e <3% (Sp-4) excluído.

Tabela 1. Dados XRPD para RP-4 e Sp-4.

Uma amostra de Sp-4 foi moída com um almofariz e pilão, e, em seguida sucessivamente passado por peneiras de 500 e 250 pm para gerar a amostra como um pó fino. Esta amostra foi reanalisadao por XRPD de alta resolução, confirmando que nenhuma forma alterada ocorreu.

Exemplo 21. Estudos de Cristalização para Sp-4.

Cristalino Sp-4 apresenta polimorfismo. Assim, um aspecto é direcionado para cristalino Sp-4 e suas formas polimórficas individuais. Sp-4 pode existir em pelo menos cinco formas polimórficas, designadas como Formas 1 -5. Além disso, Sp-4 amorfo pode ainda ser preparado. Uma cristalização típica fornece para dissolução cerca de 100 mg de Sp-4 em um volume apropriado de solvente de cristalização (acetonitrila (5 vol), clorfórmio (5 vol), n-butil acetato (7 vol), diclorometano (50 vol), anisol (7 vol), e 1:1 MTBE/heptano (50 vol)) e, em seguida deixando para evaporação de uma solução a 5 °C. Várias formas cristalinas foram obtidas, mas cada forma, na filtração e/ou secagem, gerou Forma 1.

Formas 1, 2 e 3 são uma forma não solvatada, 1:1 DCM solvato e 1:1 clorfórmio solvato, respectivamente, como foi confirmado por análise de raios X de cristal simples e XRPD. Formas 4 e 5 foram obtidas de cristalização de Sp-4 das soluções de acetonitrila e anisol, respectivamente. Dados suficientes não puderam ser coletados para determinar se as Formas 4 e 5 são não solvatadas, hidratadas ou solvatadas, uma vez que os cristais simples de qualidade suficiente não foram obtidos. Formas 4 e 5 transformam à Forma 1 na filtração. Duas formas adicionais cristalinas sãò obtidas na cristalização de Sp-4 a partir de n-butil acetato (nBuAc) e uma solução contendo metil^butil éter (MTBE) e heptano; na filtração ambas destas formas cristalinas são convertidas à Forma 1. Formas 2 e 3 ainda se transformam à Forma 1 no isolamento. Forma 1 é uma forma não solvatada que apresenta uma ampla endotérmica de fusão com uma temperatura inicial de 94,3°C e AH-fus de 24,0 kJ mol'1. Um padrão adicional de XRPD de Sp-4 Forma 1 é descrito na Figura 4.

Conversão de Sp-4, Forma 1 a Sp-4, Forma 6 Forma 1 pode ser convertida à Forma 6 em pelo menos duas formas.

Primeiro, deixando que os cristais finos da Forma 1 sejam expostos a umidade atmosférica por vários dias, um monohidrato da Forma 1 é produzido com uma aparência de uma goma solidificada. Após moer o monohidrato sólido a um pó fino, o padrão XRPD permanece consistente com Forma 1. No repouso em um frasco aberto por 6-10 semanas, o material moldo lentamente muda para a Forma 6 como um sólido anidro. Forma 1 é estável por pelo menos 2 anos em um recipiente vedado.

Alternativamente, Forma 1 pode ser suspensa em água 5-50 mg/mL em temperatura ambiente e por algumas horas ser transformada em Forma 6. A eficiência do processo de transformação de água pode ser melhorado pelo aquecimento da água até um ponto para dissolver mais Forma 1 e para aumentar a fluidez da porção imiscível de Sp-4 de uma goma rígida a um óleo suspenso em cerca de ou acima. Durante o tempo, a Forma 6 pode começar a cristalizar em 50°C. Além disso, o resfriamento da suspensão a 0-10°C leva à recuperação maior do sólido. Cristalização de água ainda remove impurezas traços mais polares, levando à pureza geral melhorada.

Redissolver a Forma 6 em um solvente orgânico como dicloro-metano ou acetonifrila seguido por cristalização fornece Forma 1, mesmo quando semeando com Forma cristalina 6.

Em um frasco de 100 mL seco de fundo redondo e um gargalo equipado com um septo de borracha e barra de agitação magnética foi carregado com 1,04 gramas de Sp-4, Forma 1. HPLC pureza 99,7%. Carregado 40 mL de água Dl. Começou a agitação vigorosa da suspensão enquanto com aquecimento a 50°C. Uma vez que a temperatura atingiu 50°C, a solução mais homogênea foi mantida por 60 mins, durante cujo tempo os sólidos começaram a precipitar da solução, formando uma pasta fina. A pasta foi resfriada a 20°C por 90 mins e mantida por 16 horas a 20°C, seguido por resfriamento a 0~5°C pro 30 mins e mantido a 0-5°C por 2,5 horas. A pasta foi filtrada em um funil de vidro poroso de média porosidade e lavado com 10 mL de água gelada. A torta úmida foi seca por sucção por 2 horas antes da secagem em um forno a vácuo durante a noite por 23 horas a 50°C. Isolado 0,88 g (84,6% recuperação) de Sp-4, Forma 6.

Forma 6 tem um ponto de fusão observado de cerca de 124,5- 126°C.

Exemplo 21-1. Sp-4 Forma 1 Uma listagem de pico de Sp-4 Forma 1 é apresentada na Tabela 2.

Exemplo 21-2. Sp-4 Forma 2 Um padrão XRPD de Sp-4 Forma 2 é descrito na Figura 5.

Uma listagem de picos de Sp-4 Forma 2 é apresentada na Tabela 3.

Exemplo 21-3. Sp-4 Forma 3 Um padrão XRPD de Sp-4 Forma 3 é descrito na Figura 6.

Uma listagem de picos de Sp-4 Forma 3 é apresentada na Tabela 4.

Exemplo 21-4. Sp-5 Forma 4 Um padrão XRPD de Sp-4 Forma 4 é descrito na Figura 7.

Uma listagem de picos de Sp-4 Forma 4 é apresentada na Tabela 5.

Exemplo 21-5. Sp-4 Forma 5 Um padrão XRPD de Sp-4 Forma 5 é descrito na Figura 8.

Uma listagem de picos de Sp-4 Forma 5 é apresentada na Tabe- Ia 6.

Exemplo 21-5. Sp-4 Forma 6 Um padrão XRPD de Sp-4 Forma 6 é descrito na Figura 21.

Uma listagem de picos de Sp-4 Forma 2 é apresentada na Tabe- a seguinte.

Exemplo 21-7. Sp-4 (amorfo) Um padrão XRPD para amorfo Sp-4 é descrito na Figura 9. Exemplo 22. Cristalografia de raios X Cristal de Sp-4 e seus solvatos Exemplo 22-1. Cristalografia de Raios X de Cristal Simples de Sp-4 (Forma 1) Figura 10 mostra uma estrutura de cristais em raios X para Sp-4 Forma 1. Aqui, a figura mostra uma vista de moléculas de Forma 1 de estrutura de cristal mostrando o esquema de numeração empregado Deslocamento elipsoides Anisotrópico atômico para os átomos de não hidrogênio são mostrados no nível de 50% de probabilidade. Átomos de hidrogênio são deslocados com um raio pequeno arbitralmente. A solução da estrutura foi obtida por métodos diretos, refinamento de mínimos quadrados de matriz máxima em F 2 com ponderação w'1 = o2(Fo2) + (0.0592P)2 + (0,6950P), onde P = (F02+2Fc2)/3, parâmetros de deslocamento anisotrópicos, correção de absorção empírica usando harmônicas esféricas, implementado em algoritmo de escalamento SCALE3 ABSPACK. Final para todos os dados, con- vencional Ri = 0,0329 em valores de F de reflexões 7090 com F0 > 4o( F0), S = 1,016 para todos os dados em 870 parâmetros. Final Δ/σ(max) 0,001, Mj(média), 0,000. Mapa de Diferença final entre +0,534 and -0,36 e A3.

Tabela 7. Parâmetros de Cristal Simples da Forma 1 Exemplo 22-2. Cristalografia de Raios X de Cristal Simples de Sp-4 (Forma 2) Figura 11 mostra uma estrutura de cristais em raios X para Sp-4 Forma 2. Aqui, a figura mostra uma vista de moléculas de Forma 2 de estrutura de cristal mostrando o esquema de numeração empregado Os heteroá-tomos foram resolvidos isotropicamente devido à dados muito fracos. Os átomos de hidrogênio não são deslocados. A solução de estrutura foi obtido por métodos diretos, refinamento de mínimos quadrados, de matriz máxima em F2 com ponderação w'1= o^Fo2) + (0,0975P)2+ (10.6969P), onde P = (F02+2Fc2)/3, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmônicas esféricas, implementados em alaoritmo de escalonamento SCALE3 ABSPACK. Final para todos os dados, convencional Ri = 0,0741 em valores F de 2525 reflexões com F0 > 4o(F0), S = 1,05 para todos os dados e 158 parâmetros . Final A/o(max) 0,001, A/o(média), 0,000. Mapa de Diferença final entre +1,388 e -0,967 e Λ'3 Tabela 8. Parâmetros de Cristal Simples da Forma 2 Exemplo 22-3. Cristalografia de Raios X de Cristal Simples de Sp-4 (Forma 2) Figura 12 descreve Estrutura Cristal de Raio X (ORTEP - anisotrópico) Sp-4 (Forma 2). Uma estrutura em cristal do cloreto de metileno solvato de Sp-4 (Forma 2), C23H31N3PO9FCI2, gera um grupo P2i de espaço monoclínico (ausências sistêmicas OkO: k=odd) com um =12,8822(14) A, b=6,1690(7) A, c=17,733(2) A, β=92,045(3)°, V=1408,4(3)A3, Z=2 e dcaic=1,449 g/cm3. Os dados de intensidade de raios X foram coletados em um detector Rigaku Mercury CCD área empregando radiação monocromatado grafite de radiação Μο-Κα (λ=0,71073 A) em uma temperatura de 143K. Indexação preliminar foi realizada de uma série de doze imagens de rotação 0,5° com exposição de 30 segundos. Um total de 648 imagens de rotação foram coletados com um cristal para distância de detector de 35 mm, um ângulo de 2Θ oscilação de -12°, larguras de rotação de 0,5° e exposições de 30 segundos: scan no. 1 foi a φ-scan de 315° a 525° a ω= 10° e χ = 20°; scan no. 2 foi um co-scan de -20° a 5o a χ = -90° e <p= 315°; scan no. 3 foi um co-scan de -20° a 4o em χ = -90° e <p= 135°; scan no. 4 foi um co-scan de -20° a 5o em χ= -90° e φ= 225°; scan no. 5 foi um co-scan de -20° a 20° em χ = -90° e cp= 45°. Imagens de rotação foram processadas usando CrystalClear (CrystalClear: Rigaku Corporation, 1999), produzindo uma lista de valores não ponderados F2 e o(F2) que são então passados à CrystalStructure (Crystal Structure: Crystal Structure Pacote de Análise, Rigaku Corp. Rigaku/MSC (2002)) pacote de programa para outro processamento e solução de estrutura em um computador Dell Pentium III. Um total de 7707 reflexões foi medido sobre as faixas 5,48 < 2Θ < 50,04 °, -14 < h < 15, -7 < k < 6, -19 < 1 < 21 gerando 4253 reflexões únicas (Rint = 0,0180). Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção usando REQAB (transmissão mínima e máxima 0,824,1,000). A estrutura foi solvida por métodos diretos (SIR97, SIR97: Alto-mare, A., M. Burla, M. Camalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Guagliardi, A. Moliterni, G. Polidori & R. Spagna (1999). J Appl. Cryst., 32, 115-119). O refinamento foi por mínimos quadrados de matriz completa em baseado em F2 usando SHELXL-97 (SHELXL-97: Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst, A64, 112-122). Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. O esquema de ponderação usado foi w=l/[o2(F02)+ 0.0472P2 + 0.4960P] onde P = (F2 + 2Fc2)/3. Átomos de não hidrogênio foram refinados anisotropicamente e os átomos de hidrogênio foram refinados usando um modelo "riding". O refinamento convertido a Ri=0,0328 e wR2=0,0817 por 4046 reflexões para as quais F > 4o(F) e R=0,0348, wR2=0,0838 e GOF = 1,056 para todo os 4253 únicos, reflexões não zero e 358 variáveis ;onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros refinado). O máximo Δ/σ no ciclo final de mínimos quadrados foi 0,000 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram +0,312 e -0,389 e/Â3. O parâmetro de estrutura absoluto Flack refinado a -0,06(6) assim corroborando a estereoquímica do composto título. A tabela 1 lista informações de células, parâmetros de coleta de dados, e dados de refinamento. Os parâmetros de posição final e térmicos isotrópicos equivalentes são mostrados na Tabela 2. Parâmetros térmicos anisotrópicos estão na Tabela 3. ("ORTEP-II: A Fortran Thermal Ellipsoid Plot Program for Crystal Structure lllustrations". C.K. Johnson (1976) ORNL-5138.) representação da molécula com 30% elipsoides apresentadas por probabilidade térmica.

Tabela 9. Sumário de Determinação de Estrutura de Composto Sp~4 CH2CI2. Fórmula: C23H3,N3P09FCl2 Peso da fórmula: 614,38 Classe cristal: monoclínico Grupo espaço: P2i (#4) Z 2 Constantes de célula: a 12,8822(14)A

b 6,1690(7) A

c 17,733(2) A β 92,045(3)° V 1408,4(3) A 3 μ 3,48 cm'1 tamanho do cristal, mm 0,42 x 0,12 x 0,10 Dcaic 1,449 g/cm3 F(000) 640 Radiação: Μο-Κα(λ=0,71073Α) 2Θ faixa 5,48 - 50,04 ° hkl coletado: -14 < h 15; -7 < k < 6; -19 < 1 < 21 No. reflexões medidas: 7707 No. únicas reflexões: 4253 (Rint=0,0180) No. reflexões observadas 4046 (F>4a) No. reflexões usadas em refinamento 4253 No. parâmetros 358 índices R (F>4o) Ri=0,0328 wR2=0,0817 índices R (todos os dados) Ri=0,0348 wR2=0,0838 GOF: 1,056 Picos de diferença final, e/Â3 +0,312, -0,389 Exemplo 22-4. Cristalografia de Raios X de Cristal Simples de Sp-4 (Forma 3) Figura 13 mostra uma estrutura de cristais em raios X para Sp-4 Forma 3. Aqui, a figura mostra uma vista de moléculas de Forma 3 de estrutura de cristal mostrando o esquema de numeração empregado Deslocamento elipsoides Anisotrópico atômico para os átomos de não hidrogênio são mostrados no nível de 50% de probabilidade. Átomos de hidrogênio são deslocados com um raio pequeno arbitraimente. A solução da estrutura foi obtida por métodos diretos, refinamento de mínimos quadrados de matriz total em F2 com ponderação w"1= o2(Fo2) + (0.0512P)2 + (0,6810P),onde P = (F02+2Fc2)/3, parâmetros de deslocamento anisotrópicos, correção de absorção empírica usando harmônicas esféricas, implementado em algoritmo de escalamento SCALE3 ABSPACK. Final para todos os dados, R convencionais = 0,0294 em valores F de 2486 reflexões com F0 > 4o( F0), S = 1,068 para todos os dados e 377 parâmetros. Final A/o(max) 0,001, A/o(média), 0,000. Mapa de Diferença final entre +0,21 1 e -0,334 e A"3.

Tabela 10. Parâmetros de Cristal Simples da Forma 3 Exemplo 23. Estabilidade em temperaturas elevadas e umidade relativa Uma amostra de RP-4 foi armazenada em uma câmara de umidade a 40°C e 75% umidade relativa por uma semana, e a amostra foi rea-nalisada por XRPD. O padrão pó obtido por Rp-4 não mostrou alteração substancial durante o curso do experimento, significando que nenhuma alteração na forma sólida observada. Isto deve ser contrastado a uma amostra de 4, que se desfaz dentro de cerca de 16 horas no armazenamento a 40°C e 75 % de umidade relativa. De fato, uma ilustração da natureza deliques-cente de 4 é ilustrada pelo seguinte. Uma amostra de 4 foi passada por uma peneira de 250 pm do que as amostras que foram armazenadas a 40°C / 75 % RH e 25°C / 53 % umidade relativa e as observações visuais foram tomadas em intervalos regulares. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 11. Estabilidade de 4 Dara umidade relativa elevada No armazenamento a 40 °C e 75 % umidade relativa uma amostra de Sp-4 se desfaz dentro de 16 horas. Por exemplo, uma amostra de Sp-4 foi moída com um almofariz e pistão, e, em seguida sucessivamente passado por peneiras de 500 e 250 pm para gerar a amostra como um pó fino. Amostras deste material foram armazenadas a 40°C e 75% umidade relativa e 25°C e 53 % RH e as observações visuais foram tomadas em intervalos regulares. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 12. Estabilidade de Sd-4 Dara umidade relativa elevada.

Análise XRPD da amostra após armazenamento a 25°C e 53% RH por 104 horas não mostrou alterações significativas nos difratogramas produzidos indicando que nenhuma alteração de forma ocorreu.

Exemplo 24. Espectrometria de Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) Os dados foram coletados em um espectro Perkin-Elmer One ajustado com um acessório de amostragem de Reflectância Total Atenuada (ATR). Os dados foram coletados e analisados usando Espectro v5,0,1 software. O espectro IR obtido por 4, Rp-4, e Sp-4 são mostrados nas Figs. 5-7 respectivamente. Os picos selecionados, em comprimentos de onda (cm' 1) são mencionados abaixo: 4: -1680, -1454, -1376, -1205, -1092, -1023 (Fig. 14);

Rp-4: -1742, -1713, -1679, -1460, -1377, -1259, -1157, -1079 (Fig. 15); e Sp~4 (Forma 1): -1743, -1713, -1688, -1454, -1378, -1208, -1082 (Fig. 16).

Exemplo 25. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) Análise Termo-Gravimétrica (TGA) Os dados DSC foram coletados em um TA Instruments Q2000 equipado com uma posição 50 de autoamostrador. A calibração para a capacidade térmica foi conduzida usando safira e a calibração para energia e temperatura foi conduzida out usando índio certificado. O DSC de temperatura modulado foi conduzido em tipicamente 0,8-1,2 mg de cada amostra, em um cadinho de alumínio pin-holed, usando uma taxa de aquecimento subjacente de 20C.min‘1 e parâmetros de modulação de temperatura de ± 0,2 °C.min'1 e 40 segundos. Uma purga de nitrogênio seco 50 ml.min"1 foi mantido durante a amostra. O software de controle de instrumento foi Advantage para Q Series v2,8,0,392 e Thermal Advantage v4,8,3 e os dados foram analisados usando Universal Analysis v4,3A.

Os dados DSC foram coletados em um Mettler DSC 823 equipado com uma posição 34 de autoamostrador. O instrumento foi calibrado para energia e temperatura usando índio certificado. Tipicamente 0,8-1,2 mg de cada amostra, em um cadinho de alumínio pin-holed, foi aquecida a 10°C.min‘1 de 25°C a 250°C. Uma purga de nitrogênio seco 50 mi.min-1 foi mantido durante a amostra. O controle de instrumento e software de análise de dados foi STA e v9,20.

Dados de DSC para Sp-4 (Forma 6) foram coletados usando um instrumento DSC (TA Q2000), usando uma taxa de aquecimento de 10 °C/ min sob um fluxo contínuo de gás de nitrogênio seco (100 ml/min). Aproximadamente 2,2 mg de amostra foi precisamente pesado e aquecido em um cadinho não hermeticamente vedado 'Tzero' com uma tampa de ajuste frouxo. O instrumento foi calibrado (entalpia e temperatura) com um padrão de índio e (capacidade de calor) com um padrão de safira. As incertezas são estimadas sendo ±0,1 °C para temperaturas e ±5 % para entalpias medidas. Software TA Universal Analysis foi empregado para medir temperaturas de início.

Os dados TGA foram coletados em um Mettler TGA/SDTA 85 equipado com uma posição 34 de autoamostrador. O instrumento foi calibrado para temperatura usando índio certificado. Tipicamente 8-12 mg de cada amostra foi carregada em um cadinho de alumínio pré-pesado e foi aquecida a 10°C.min'1 a partir de temperatura ambiente a 350°C. Uma purga de nitrogênio seco 50 ml.min-1 foi mantido durante a amostra. O controle de instrumento e software de análise de dados foi STARe v9,20.

Análise DSC de 4 mostrou uma endoterma simples ampla com um início de 58,7°C (ΔΗ 14 J.g'1) confirmou ser devido à relaxamento molecular durante a transição vítrea por outra análise de DSC modulada (Fig. 17). Análise TGA de 4 não mostrou perda de peso antes da decomposição acima de 240°C, confirmando o material ser não solvatado. Como a análise XRPD de 4 confirmou que o material é amorfo, análise de DSC modulado foi submetido em uma tentativa de calcular a temperatura de transição vítrea, que foi demonstrado ser 57°C.

Análise DSC mostrou uma única endoterma simples com um início de 136,2 °C (ΔΗ 76 J.g'1) confirmou ser uma fusão por microscopia em estágio quente. Ver Fig. 18. Análise TGA de Rp-4 não mostrou perda de peso antes da decomposição acima de 240 °C, confirmando que o material é não solvatado.

Análise DSC de sp-4 mostrou uma única endoterma simples com um início de 93,9°C (ΔΗ 43 J.g'1) confirmou ser uma fusão por microscopia em estágio quente. Ver Fig. 19. Análise TGA de Sp-4 não mostrou perda de peso antes da decomposição acima de 240°C, confirmando que o material é não solvatado.

Análise DSC de Sp-4 (Forma 6) mostrou uma única endoterma simples com um início de 120,7°C (ΔΗ 79 J.g"1).

Exemplo 26. Sorção de Vapor Gravimétrico (GVS) SMS DVS Intrínseco Isotermas de sorção foram obtidas usando um analisador de sorção de umidade de SMS DVS intrínseco, controlado por software SMS Analysis Suite. A temperatura de amostra foi mantida a 25 °C pelos controles de instrumento. A umidade foi controlada misturando correntes de nitrogênio seco e úmido, com uma taxa de fluxo total de 200 ml.min'1. A umidade relativa foi medida por uma sonda calibrada Rotronic (faixa dinâmica de 1,0-100 %RH), localizado próximo à amostra. A alteração de peso, (relaxamento de massa) da amostra como uma função de %RH foi constantemente monitorado por microequilíbrio (precisão ±0,005 mg).

Tipicamente 5-20 mg de amostra foi colocado em uma cesta de aço inoxidável de malha tarada sob condições ambientes. A amostra foi carregada e descarregada em 40 %RH e 25°C (condições ambientes típicas). Uma isoterma de sorção de umidade foi realizada como delineado abaixo (2 varreduras gerando 1 ciclo completo). A isoterma padrão foi realizada a 25°C em 10 %RH intervalos sobre uma faixa de 0,5-90 %RH.

Tabela 13. Parâmetros Métodos para Experimentos de SMS DVS Intrínsecos A amostra foi recuperada após conclusão da isoterma e reanali-sada por XRPD.

Análise GVS mostrou RP-4 como não higroscópica apresentando captação reversível de aproximadamente 0,2% em peso de água de 0 a 90 % umidade relativa. Reanálise de amostra por XRPD após o experimento GVS não mostrou alteração na forma.

Uma amostra de Sp-4 foi moída com um almofariz e pistão, e, em seguida sucessivamente passou em peneiras 500 e 250 pm para gerar a amostra como um pó fino foi então analisado usando método de ciclo modificado. A amostra foi tomada de 40 % RH (aproximadamente ambiente) a 60 % RH, em vez de 90 % para o método padrão, e, em seguida ciclado a 0 % e de volta a 40 % RH. Esta análise mostrou Sp-4 sendo não higroscópica até 60 % RH, com captação reversível de -0,2 % em peso de água de 0 a 60 % RH.

Exemplo 27. Solubilidade Aquosa Termodinâmica Solubilidade aquosa foi determinada por suspensão de uma quantidade suficiente de composto em água para gerar uma concentração máxima final de >10 mg,ml'1 do composto parente de forma livre. A suspensão foi equilibrada a 25 °C por 24 horas em seguida o pH foi medido. A suspensão foi então filtrada por um filtro de fibra de vidro C em uma placa de 96 poços. O filtrado foi então diluído por um fator de 101. A quantificação foi por HPLC com referência à uma solução padrão de aproximadamente 0,1 mg.ml'1 em DMSO. Volumes diferentes do padrão, soluções de amostras diluídas e não diluídas foram injetadas. A solubilidade foi calculada usado as áreas de pico determinadas por integração do pico encontrado no mesmo tempo de retenção conforme o pico principal na injeção padrão.

Tabela 14. Parâmetros de Métodos de HPLC para Medições de Solubilidade______________________________ Análise foi realizada sob as condições acima notadas em um sistema Agilent HP1100 series equipado com um detector de arranjo de diodo e usando ChemStation software vB,02,01 -SRI.

Tabela 15. Resultado de Solubilidade Aquosa para RP-4, 4, e Sp- 4.______________.___________________________________________________ Exemplo 28. Determinação de Pureza Química por HPLC Várias condições de HPLC podem ser usadas para determinar a pureza química dos compostos revelados aqui. Um dito exemplo é revelado acima em relação aos estudos de solubilidade de termodinâmica aquosa. Outro exemplo é revelado abaixo.

Condições de HPLC: Sob estas condições, a pureza de 4, RP-4, e Sp-4 foi determinada como sendo -99,6, -99%, e -99,5%, respectivamente. Deve-se notar que purezas maiores podem ser realizadas otimizado os métodos revelados acima. A inspeção de difratogramas XRPD mostra que os dois cristalinos simples diastereoisômeros geraram claramente padrões diferentes de XRPD. Além disso, houve uma clara diferença no ponto de fusão de dois diastereoisômeros cristalinos, com Rp- 4 contendo consideravelmente maior no início do que Sp-4 (136°C vs. 94°C).

Exemplo 29. Modelos de Separação de Métodos Adicionais A seguinte separação SFC (condições listadas abaixo) gerou separação adequada de uma mistura de diastereoisômeros, Rp-4 e Sp-4. A seguinte separação SFC (condições listadas abaixo) gerou separação adequada de uma mistura de diastereoisômeros, Rp-4 e Sp-4.

Tabela 16. Sumário dos resultados de caracterização de lote de Rp~4, 4, e Sp-4.

Exemplo 30. Cristalografia de Raios X de 8 (Sp-isômero) Composto 8 (Sp-isômero), C18H21N2PO7, cristalia no grupo de espaço monoclínico P2, (ausências sistemáticas OkO: k=odd) com a=5,3312(4)Â, b=15,3388(8)A, c=23,7807(13)Â, β=92,891(3)°, V= 1942,2(2)Â3, Z=4, e dCaic=:1,397 g/cm3. Dados de intensidade raios X foram coletados em detector de área Bruker APEXII CCD empregando monocro-mado grafite radiação Μο-Κα (λ=0,71073 A) em uma temperatura de 100(1)K. Figuras 20 A e 20B mostra módulos numérico 1 e 2, respectivamente, da unidade assimétrica.

Indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de trinta e seis 0,5° rotação com exposições de 30 segundos. Um total de 3608 quadros foram coletados com um cristal para detectar distância de 70,00 mm, larguras de rotação de 0,5° e exposição de 20 segundos: Quadros de rotação foram integrados usando SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) produzindo uma listagem de valores não ponderados de F2 e o(F2) que foram então passados ao SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) pacote de programa para outro processamento e solução de estrutura em um computador Dell Pentium III. Um total de 6909 reflexões foi medido sobre as faixas 1,58 < θ< 25,09°, -6 < h < 6, -18 < k <_18, -28 < 1 < 28 gerando 6909 únicas reflexões (Rint = 0,0581). Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção u-sando SADABS (Sheldrick, G.M. (2007) S AD ABS. University of Gottingen, Alemanha.) (transmissão mínima e máxima 0,6093, 0,7452). A estrutura foi solvida pelos métodos diretos (SHELXS-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,l 12-122.)). O refinamento foi pelos mínimos quadrados de matriz total baseado em F2 usando SHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst A64, 112-122.). Todas as reflexões foram u-sadas durante o refinamento. O esquema de ponderação usado foi w=I/[o2(F02 )+ (Ο,ΟΟΟΟΡ)2 + 14.0738P] onde P = (F0 + 2Fc2)/3. Átomos não hidrogênio foram refinados anisotropicamente e os átomos de hidrogênio foram refinados usando um modelo riding. O refinamento convergiu para R1 - 0,0847 e wR2 = 0,1899 por 6173 reflexões observadas para as quais F > 4o(F) e Rl=0,0963 e wR2-0,1963 e GOF =1,119 para todos os 6909 únicas reflexões não zero e 512 variáveis onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros refinados). O máximo Δ/σ no ciclo final de mínimos quadrados foi 0,000 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram +0,402 e -0,559 e/Á3. Figs 20A e 20B são OR-TEP (30% elipsoides térmicas de probabilidade) de moléculas 1 e 2 da unidade assimétrica.

Tabela 17. Sumário de Determinação de Estrutura de Composto 8 (Sp-isômero).

Exemplo 32. Cristalografia de Raios X de (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)- amino)propanoato, C18H17NPO5F5, cristaliza no grupo PI de espaço triclínico com a = 5,2641(6) A, b = 12,0548(13) A, c = 16,4307(15) A, a = 74,960(4)°, β = 83,959(4)°, γ = 80,275(4)°, V = 990,40(18) A3, Z = 2, e dcaic=1,520 g/cm3. Dados de intensidade de raios-X foram calculados em um detector de área Bruker APEXII CCD empregando um monocromato de grafite e radiação Mo-Κα (λ = 0,71073 A) em uma temperatura de 143(1)K. Indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de trinta e seis 0,5° rotação com exposições de 20 segundos. Um total de 3593 quadros foram coletados com um cristal para detectar distância de 37,600 mm, larguras de rotação de 0,5° e exposição de 20 segundos: Quadros de rotação foram integrados usando SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.), produzindo uma lista de valores não ponderados de F2 e σ2 foram então passados ao SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, USA.) pacote de programa para outro processamento e solução de estrutura em um computador Dell Pentium III. Um total de 17880 reflexões foi medida sobre as faixas 1,77 < Θ > 25,12°, -6 < h < 6, -14 < k < 14, -19 < 1 < 19 gerando 6897 reflexões únicas (Rint = 0,0212). Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção usando SADABS (Sheldrick, G.M. (2007) SADABS. University of Gottingen, Alemanha.) (transmissão mínima e máxima 0,6887, 0,7452). A estrutura foi solvida pelos métodos diretos (SHELXS-97 (Sheldrick, G.M. (2008) (2008) Acta Cryst. A64,l 12-122.)). O refinamento foi pelos mínimos quadrados de matriz total baseado em F2 usando SHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,l, 12-122.). Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. O esquema de ponderação usado foi w=l/[o2(Fo2 )+ (0.0344P)2 + 0.1102P] on- de Ρ = (F02+ 2Fc2)/3. Átomos não hidrogênio foram refinados anisotropica-mente e os átomos de hidrogênio foram refinados usando um modelo riding. O refinamento convergiu para Ri =0,0259 e wR2=0,0609 por 6527 reflexões observadas para as quais F > 4o(F) e RI = 0,0284 e wR2 = 0,0621 e GOF = 1,040 para todos os 6897 únicas reflexões não zero e 548 variáveis. (RI

Fc2)2/(n - p)]/2; onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros refinados.) O máximo Δ/σ no ciclo final de mínimos quadrados foi 0,001 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram +0,254 e -0,236 e/Á3. As Figs. 22A e 22B são ORTEP (30% probabilidade de elipsoides térmicas) de moléculas 1 e 2 da unidade assimétrica.

Tabela 18. Sumário de Determinação de Estrutura de (S)-isopropil 2-(((S)- (perfluorfenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato Exemplo 33. Atividade Biológica O Replicon contendo células foram semeados em 3.000 célu-las/poço (50 pL) em placas opacas/brancas de 96 poços, ou 1.500 células/poço (25 μΙ_) em placas opacas/brancas de 384 poços. 50 μΙ_ de composto 2X foram adicionados em uma placa de 96 poços ou 25 pL de composto 2X foram a-dicionados na placa 384 poços. As placas foram incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2 por 4 dias. Após incubação, reagente Bright-GIo (50 pL, por placa de 96 poços, ou 25pL para placas de 384 poços) foi adicionado para medir o repórter firefly luciferase para replicação de HCV. Inibição percentual foi calculada contra 0 controle sem droga.

Rp-4 e Sp-4 demonstraram ter ampla cobertura de genótipo. Por exemplo, ambos demonstraram ser ativos contra o vírus da hepatite C, ge-notipos 1 -4.

Este pedido é uma continuação em parte de pedido de patente US 12/783.680 depositado em 20 de maio de 2010, que reivindica a prioridade para o pedido provisório de patente US 61/179.923, depositado em 20 de maio de 2009, e 61/319.513, depositado em 31 de março de 2010, o assunto objeto do qual é incorporado por referência em sua totalidade. O assunto objeto do pedido de patente US 12/783.680 e 12/053.015 e pedido provisório de patente US 61/179.923, depositado em 20 de maio de 2009, e 61/319.513, depositado em 31 de março de 2010, está aqui incorporado por referência em sua totalidade. O assunto objeto de todas as referências citadas está aqui incorporado por referência. Caso o significado de um termo incorporado conflite com o significado de um termo definido aqui, o significado dos termos contidos na presente revelação prevalecem sobre o significado dos termos incorporados.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está na forma cristalina.

3. Processo para preparação do composto como definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende cristalizar o composto, como definido na reivindicação 2, de uma segunda composição compreendendo: a) uma primeira composição; b) pentafluorofenol; c) uma base não nucleofílica; e d) uma composição liquida; em que a primeira composição compreende (S)-isopropil 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato e (S)-isopropil 2-(((R)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforil)amino)propanoato.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a cristalização ocorre a uma temperatura na faixa de cerca de -10°C a cerca de +40°C.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cristalização ocorre a temperatura ambiente.

6. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a base não nucleofílica é selecionada a partir do grupo consistindo em carbonato de potássio, carbonato de césio, di-isopropilamina, di-isopropiletilamina, trietilamina, quinuclidina, naftaleno-1,8-diamina, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina, 1,8-diazabicicloundec-7-eno, 4-dimetilamino-piridina, piridina, uma 2,6-di-Ci^-alquil-piridina, uma 2,4,6-tri-Ci-6-alquil-piridina, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano e misturas dos mesmos.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a base não nucleofílica é trietilamina.

8. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição líquida compreende pelo menos um de um solvente e um anti-solvente.

9. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição líquida compreende pelo menos um de um C2 a C8 éter, um C3 a C7 éster, e um C5 a C12 hidrocarboneto saturado.

10. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição líquida compreende pelo menos um de acetato de etila, t-butil-metiléter, e hexano.

11. Processo para preparar um composto apresentando a fórmula Sp-4: Sr 4 caracterizado pelo fato de que compreende contatar o composto, como definido na reivindicação 1, com um produto obtido através da reação de um haleto de t-butilmagnésio com 1-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetrahidrofuran-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o composto apresentando a fórmula Sp-4 preparado através do processo, como definido na reivindicação 11, e um meio farmaceuticamente aceitável.

13. Uso do composto apresentando a fórmula SP-4 preparado a-través do processo, como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma in- fecção por vírus da hepatite C.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda utilizar outro agente antiviral.

15. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto, ou de processo, ou uso, englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.