BR122013007556A2 - compostos de fosforamidatos de nucleosídeo e processos para preparação destes compostos - Google Patents

Description

COMPOSTOS DE FOSFORAMIDATOS DE NÚCLEOS IDEO E PROCESSOS PARA PREPARAÇÃO DESTES COMPOSTOS

Pedido de divisão do PI 1012781-0 depositado em 20/05/2010.

Este pedido foi depositado em 20 de maio de 2010, como um Pedido de Patente Internacional PCT em nome de Pharmasset, Inc., uma corporação nacional dos EUA, requerente para a designação de todos os países exceto os EUA, e Michael Joseph Sofia e Bruce S. Ross, ambos cidadãos dos EUA, Ganapati Reddy Pamulapati e Suguna Rachakonda, ambos cidadãos da índia, Hai-Ren Zhang, um cidadão dos EUA, Byoung-Kwon Chun, um cidadão da República da Coréia, e Peiyuan Wanq, um cidadão da China, requerentes para a designação dos EUA apenas, e reivindica a prioridade do pedido de patente provisório US 61/179. 923, depositado em 20 de maio de 2009, e 61/319. 513, depositado em 31 de marco de 2010, as matérias objeto dos quais sendo incorporadas por referência na sua totalidade.

Campo da Invenção São divulgados neste documento fosforamidatos de nucleosídeo e seu uso como agentes para o tratamento de doenças virais. Estes compostos são inibidores da replicação do RNA viral dependente de RNA e são úteis corno inibidores da polimerase MCV NS5R, corno inibidores da replicação de IiCV e para o tratamento de infecção por hepatite C em mamíferos.

Fundamentos A infecção por vírus da hepatite C (HCV) é um importante problema de saúde que leva a doença hepática crônica, tal como cirrose e carcinoma hepatocelu 1 ar, em urn número substancial de pessoas infectadas, estimado como sendo de 2 a 15% da população do mundo. Há uma estimativa de 4,5 milhões de pessoas infectadas nos Estados Unidos, segundo o Centro para Controle de Doenças dos EUA. Segundo a Organização Mundial de Saúde, existem mais de 200 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo, com pelo menos 3 a 4 milhões de pessoas sendo infectadas a cada ano. Uma vez infectadas, cerca de 20% das pessoas eliminam o vírus, mas o resto pode abrigar HCV pelo resto de suas vidas. Dez a vinte por cento dos indivíduos cronicamente infectados, eventualmente, desenvolvem cirrose ou câncer destruidora do fígado o. A doença viral é transmitida por via parenteral produtos de sangue e sangue contaminado, agulhas contaminadas, ou sexualmente e verticalmente a partir de mães infectadas ou mães portadoras aos seus descendentes. Os tratamentos atuais para a infecção por HCV, que são restritos à imunoterapia com interferon-α recombinante individualmente ou ern combinação com o .ríbavírina análoga de nucleosídeo, são de benefício clínico limitado. Além disso, não existe vacina estabelecida para HCV. Consequentemente, há uma necessidade urgente de agentes terapêuticos melhorados que efetivamente combatem a infecção crônica por HCV. 0 virion HCV é um vírus de RN A de filamento positivo envolví.do com uma sequência genôm.i ca de oligoribonucleot ideo única de cerca de 9.600 bases que codificam uma poiiproteína de cerca de 3.010 aminoácidos. Os produtos de proteína do gene de HCV consistem cm proteínas estruturais C, El, E2 e em prote.í nas não estruturais NS2, NS3, NS4A e NS4B e NS5A e NS5B. Acredita-se que as proteínas não estruturais (NS) são para fornecer o maquinár.io catalítico para a replicação vira 1 . A proteasc NS3 libera NS5B, a Polimerase de RNA dependente de RNA da cadeia de poliprotcína. A HCV NS5B polimerase é necessária para a síntese de um RNA de filamento duplo a partir de um RNA viral de filamento único que serve como um modelo do ciclo de replicação do HCV. Portanto, a NS5B polimerase é considerada como sendo um componente essencial no complexo de replicação do HCV (K. Ishi, et al, Heptology, 1999, 29: 12 27-1235; V. Lohmann, et al. , Virology, 1998, 249: 108- 118) . A inibição de HCV NS5B polimerase impede a formação do RNA HCV de filamento duplo e, portanto, constitui uma abordagem atraente para o desenvolvimento de terapias antíviraís específicas para HCV. 0 HCV pertence a uma família muito grande de vírus que compartilham muitas características comuns. Vírus Flaviví rl dae A família de vírus Flaviviridae compreende pelo menos três gêneros distintos: pestivírus, que causam doenças em gados e suínos; flavovirus, que são a principal causa de doenças como a dengue e a febre amarela; e hepacivírus, cujo único membro é HCV. 0 gênero flavivírus inclui mais de 68 membros separados em grupos com base no relacionamento sorológ.i co (Cal i sher et al., J. Gen. Virol, 19 93,70, 37-43). Os sintomas clínicos variam e incluem febre, encefalite, cs febre hemorrágica (F.ields Virology, Editors: Ftields, B. N., Knipe, D. M. , and Howley, P. M., L.i ppi ncot. L-Ravcn Publishers, Philadelphia, PA, 1996, Chapter 31, 931-959).

Os Flavivírus de interesse global que estão associados com doenças humanas incluem o vírus da febre hemorrágica da dengue (DHF), vírus da febre amarela, a síndrome de choque e vírus da encefalite japonesa (Halstead, S. B., Rcv. Infect. Dis., 1984, 6, 251-264; Halstead, S. B., Science, 239:476-481, 1988; Mona th, T. P., New Eng. J. Med, 1988, 319, 64 1-643) . O gênero pestivírus inclui vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da peste suína clássica (CSFV, também chamado de vírus da cólera de porco) e vírus da doença de fronteira (BDV) de ovinos (Moennig, V. et al. Adv. Vir.

Res. 1992, 41, 53-98). As infecções por Pestivírus de animais de fazenda domesticados (gados, porcos e ovinos) causam perdas econômicas significativas em todo o mundo. A BVDV causa a doença das mucos as em gados e é do significativa importância econômica para a indústria pecuária (Meyers, G. and Thíel, H.Jd, Advances in Vírus Research, 1996, 47, 53-118; Moennig V., et al, Adv. Vir.

Res. 1992, 41, 53-98) . Os pestivírus humanos não têm sido tão amplamente caracterizados como os pestivírus animais. No entanto, as avaliações sorológicas indicam a exposição de pestivírus considerável em seres humanos.

Os pestivírus e hepacivírus são grupos de vírus estreitamente relacionados no seio da família Flaviviridae. Outros vírus estreitamente relacionados nesta família incluem os vírus GB tipo A, agentes de vírus GB tipo A, vírus GB tipo B e vírus GB tipo C (também chamado vírus da hepatite G, 1-IGV) . 0 grupo hepacivírus (vírus da hepatite C; HCV) consiste em uma série de vírus gonot ipi carnen tc distinguíveis, mas intimamente .relacionados que infectam seres humanos. Há pelo menos 6 genótipos HCV e mais de 50 subtipos. Devido às semelhanças entre pestivírus e hepacivírus, combinada com a capacidade pobre de hepacivírus para crescer de forma eficiente em cultura de células, vírus da diarréia viral bovina (BVDV) é frequentemente usado corno um substituto para estudar o ví rus HCV. A organização genética de pestivírus e hepacivírus é muito semelhante. Esses vírus de RNA de cadeia positiva possuem uma grande estrutura de leitura única aberta (ORF) codificando todas as proteínas virais necessárias para a replicação do vírus. Estas proteínas são expressas como uma poliproteína que é co- e pós- transducionalmente processadas por proteinases codificadas por vírus e celulares para produzir as proteínas virais maduras. As proteínas virais responsáveis pela replicação do RNA de genoma viral estão localizadas dentro de aproximadamente o carbóxi-terminal. Dols terços da ORF são denominados proteínas não estruturais (NS) . 0 processamento dc poliproteína e organização genética da porção de proteína não estrutural da ORF para pestivírus e hepacivírus é muito semelhante. Para ambos os pestivírus e hepacivírus, as proteínas não estruturais (NS) maduras, em ordem sequencial a partir do terminal-amino da região de codificação de proteína não estrutural de para carbóxi-terminal da ORF, consistem em p7, NS2, NS3, NSÍA, NSÍB, NS5A e NS5B.

As proteínas NS de pestivírus e hepacivírus compartilham domínios de sequência que são característicos das funções das proteínas específicas. Por exemplo, as proteínas NS3 de vírus cm ambos os grupos possuem motivos de sequências de aminoácidos característicos de serina proteinases e de he.licases (Gorbalenya et a l . , Nal.urc, 1988, 333, 22; Bazan and Fletterick Virology, 1989, 1 71 , 637-639; Gorbalenya et al. , Nucleic Acid Res., 1989, 17, 3889-3897) . Da mesma forma, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm os motivos característicos de polimerases RNA dirigida a RNA (Koonin, E.V. and Doilja, V. V. , Crir. Rev. Biochem. Molec. fíiol. 1993, 28, 373-330).

Os papéis e funções reais das proteínas NS de pestivírus e hepacivírus no ciclo de vida do vírus são diretamente análogos. Em ambos os casos, a proteinase serina NS3 é responsável por todo o processamento proteolítico dos precursores da poliproteína a jusante da sua posição no ORF (Wískerchen and Collett, Virology, 1991, 184 , 341-350; Bartenschlager et al., J. Vi rol. 1993, 67, 3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993,192, 399-406; Grakou.i. et al. , J. Virol. 1993, 67, 2832-2843; Grakoui et al., Proc. Natl. Acad Sei. (JSA 1993, 90, 10583-10587; Hijikata et al., J. Virol. 1993, 67, 4665- 4675; Tome et al., J. Virol., 1993, 67, 4017-4026). A proteína NS4A, em ambos os casos, atua como um cofator com a serina protease NS3 (Bartenschlager et al. , J. Virol. 1994, 68, 5045-5055; Failla et al., J. Virol. 1994, 68, 3753-3760; Xu et al., J. Virol., 1997, 71:53 12-5322). A proteína NS3 de ambos os vírus também funciona como uma helicase (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, 215, 160-166; Jin and Peterson, Arch. Biochem. Biophys., 1995, 323, 47-53; Warrener and Collett, J. Virol. 1995, 69,1720-1726). Finalmente, as proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus têm as atividades do RNA polimerases dirigidas a RNA previsto (Behrens et al., KMBO, 1996, 13, 12-22; Lechmann et al., J. Virol., 1991, 71, 8416-8428;

Yuan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 232, 231- 235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al, J. Virol., 1998, 72, 9365-9369).

Atualmente, existem opções de tratamento limitadas para os indivíduos infectados com o vírus da hepatite C. A opção terapêutica atual aprovada é o uso de imunoterapia com interferon-oí recombinan te individualmente ou em combinação com a ribavirina análoga de nucleosídeo. Ksta terapia é limitada em sua eficácia clinica e apenas 50% dos pacientes tratados respondem à terapia. Portanto, não há necessidade significativa para terapias mais eficazes e novas para abordar a necessidade médica não atendida devido à infecção por HCV.

Uma série de alvos moleculares potenciais para o desenvolvimento de fármacos de antivirais de ação direta como terapêuticas antí-HCV foram agora identificados incluindo, mas não limitados a, autoprotease NS2-NS3, a protease N3, a hei icase N3 e a polimerase NS5B. A Polimerase de RNA dependente de RNA é absolutamente essencial para a replicação de genoma de RNA de filamento único, sentido positivo, e esta enzima tem suscitado grande interesse entre os químicos medicinais.

Os inibidores da HCV NS5B como terapias potenciais para a infecção por HCV foram revistos: Tan, S. -I.. , et al., Nature Rev. Drug Díscov. , 2002, 1 , 867-881; WaiLker, M.P. et al., Exp. Opín. tnves l.iga t ional Drugs, 2003, 12, 1269-1280;

Ni, Z-J., et al., Current Opinion in Drug Discovery and Development:, 2004, 7, 44 6-459; Beaulieu, P. L., et al., Current Opinion in Investigational Drugs, 2004, 5, 838-850;

Wu, J., et al . , Current Drug Targets-lnfectious Disorders, 2003, 3, 207-219; Griffith, R.C., et al, Annuai Reports in Medicinal Chemistry, 2004, 39, 223-237; Carro.I, S., et a "1 . , Infectious Disorders-Drug Targets, 2006, 6, 17-29. 0 potencial para o surgimento de cepas resistentes a HCV e a necessidade de identificar os agentes com ampla cobertura ) de genótipo suporta a necessidade de esforços contínuos para identificar nucleosídeos novos e mais eficazes como inibidores de HCV NS5B.

Os inibidores nucleosídeos da polimerase NS5B podem atuar tanto como um substrato não natural, que resulta no ) término da cadeia, ou como um inibidor competitivo que compete com a ligação de nucleotídeos para a polimerase. Para funcionar como um terminador de cadeia o análogo de nucleosídeos deve ser retomado pela célula e convertido in vivo em um trifosfato para competir pelo sítio de ligação > de nucleotídeo de polimerase. Esta conversão para o trifosfato é comumente mediada por quinases celulares que transmitem requisitos estruturais adicionais em um inibidor da polimerase de nucíeosídeo potencial. Intelizmente, isto limita a avaliação direta de nucleosídeos como inibidores ) da replicação do HCV para ensaios à base de células capazes de fosforilação in si tu.

Em alguns casos, a atividade biológica de um nucíeosídeo é dificultada pe.las suas pobres características de substrato para urna ou mais das quinases necessárias para ) converter o mesmo para a forma de tri fosfato ativa. Λ formação do monofosfato por uma quinase de nucleosídeos é geralmente vista como a etapa de limitação da taxa dos três eventos de fosforilação. Para contornar a necessidade da etapa de fosforilação inicial no metabolismo de um ) nucíeosídeo para o análogo de trifosfato ativo, a preparação de pró-fármacos de fosfato estáveis tem sido relatada. Pró-fármacos de fosforamidato de nucleosídeos mostraram ser precursores do trifosfato de nucleosídeo ativo e inibir a replicação viral quando administrados a células inteiras infectadas por vírus (McGuígan, C., et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1748-1753; Valette, G., et al. , J. Med. Chem., 1996, 39, 1981-1990; Balzaríni, J., et al., Proc. National Acad Scí USA, 1996, 93, 7295-7299; Siddiqui, A. Q., et. al., J. Med. Chem., 1999, 42, 4122-4128; Eisenberq, E. J. , et al. , Nucleosides, Nucleotides and. Nucleic Acids, 2001, 20, 1 091-1098; Lee, W.A., et al., Antímicrohia] Agents and Chemotherapy, 2005, 49, 1898);. US2006/0241064, e WO 2007/095269.

Também límitante da utilidade de nucleosídeos como agentes terapêuticos viáveis são as suas, por vezes, pobres propriedades físico-químícas e farmacocinéticas. Estas propriedades pobres podem limitar a absorção intestinal de um agente e captação limite no tecido ou célula alvo. Para melhorar suas propriedades os pró-fármacos de nucleosídeos têm sido empregados. Tem sido demonstrado que a preparação de fosforamidatos de nucleosídeo melhora a absorção sistêmica de um nucleosídeo e, além disso, o grupamento fosforarnidato destes "pronucleotídeos" é mascarado com grupos lipofílicos neutros para obter um coeficiente de partição adequado para otimizar a absorção e transporte para a célula intensificando dramaticamente a concentração intracelular de análogo de monofosfato de nucleosídeo em relação à administração dos nucleosídeos de origem individualmente. A hidrólise mediada por enzima do grupamento éster de fosfato produz um monofosfato de nucleosídeo em que a limitação de taxa de fosforilação inicial é desnecessária. Para este fim, o Pedido de Patente US 12/053.015, que corresponde a WO 2008/121634 e US 2010/0016251, revela uma série de pró-fármacos de fosforamidato de nucleosideos, muitos dos quais mostram atividade em um ensaio de HCV. Vários compostos divulgados no US 2010/0016251 foram testados como um candidato potencial clinico para aprovação pelo FDA.

Sumário da Invenção É divulgado neste documento um composto representado pela fórmula 4 e seus diastereoisômeros à base de fósforo respectivos SP-4 e Rv-4, 4 .S’p-4 /í,,-4 Breve Descrição dos Desenhos Figura 1. Difractograma de DRX de alta resolução de 4.

Figura 2. Difractograma de DRX de alta resolução de llp-4 .

Figura 3. Difractograma de DRX dc alta resolução de Sp-4 (Forma 1) .

Figura 4. Difractograma de DRX de alta resolução de Sp-4 (Forma 1) .

Figura 5. Difractograma de DRX de alta resolução de Sp-4 -CHpClp (Forma 2) .

Figura 6. Dif ractograma de DRX de alta resolução de Sp-4 -CHClj (Forma 3).

Figura 7. Dif ractograma de DRX de alta resolução de Sp-4 ( Forma 4 ) .

Figura 8. Dif ractograma de DRX de alta resolução dc Sp-4 ( Forma 5 ) .

Figura 9. Dif ractograma de DRX de alta resolução de Sp-4 (amorfo) .

Figura 10. Estrutura de Cristal de Raios-X para Sp-4 (Forma 1) Figura 11. Estrutura de Cristal de Raios-X (Isotrópica) para SP-4 -CHbC^ (Forma 2) Figura 12. Estrutura de Cristal de Raios-X (Anisotrópica) para Sp-4 -CERCl,? (Forma 2) Figura 13. Estrutura de Cristal de Raios-X para Sp-4 'CUCla (Forma 3) Figura 14. Espectro FT-IR de 4.

Figura 15. Espectro FT-IR de Rí?-4.

Figura 16. Espectro FT-IR de SP-4 Figura 17. Análise de TGA e DSC de 4, Figura 18. Análise de TGA e DSC de R,>-4.

Figura 19. Análise de TGA e DSC de SP-4.] Figura 20A. Estrutura de cristal de Ra.i.os-X para 8 (Sp-ísômero) (molécula no. 1 da unidade assimétrica).

Figura 20B. Estrutura de cristal de Raios-X para 8 (Sp-isômero) (molécula no. 2 da unidade assimétrica).

Descrição Detalhada da Invenção Definições A frase "um, uma" ou "uns, umas" entidade (s) como usado neste documento se refere a uma ou mais dessas entidades, por exemplo, um composto se refere a um ou mais compostos ou pelo menos um composto. Como tal, os termos "um, uma" (ou "uns, umas"), "um ou mais", e "pelo menos um" podem ser usados de forma intercambiável neste documento.

Os termos "opcional" ou "opcionalmente" como usado neste documento significa que um evento ou circunstância descrita posteriormente pode, mas não precisa ocorrer, e que a descrição inclui casos onde o evento ou circunstância ocorre e casos em que isso não acontece. Por exemp l.o, " 1 i g a ç ã o o p c 1 o n a 1 " si g n i. f i c a que a 1 i g a ç ã o p o d e o u n ã o estar presente, e que a descrição inclui ligações simples, duplas ou triplas. 0 termo "P *" significa que o átomo de fósforo é quiral e que o mesmo tem uma designação Cahn-Ingold-Prelog correspondente do "R" ou "S", que têm. seus significados s imp1e s aceitos. 0 termo "purificado", como descrito neste documento, se refere a pureza de um determinado composto. Por exemplo, um composto é "purificado", quando o determinado composto é um componente importante da composição, isto é, pelo menos 50% p/p puro. Assim, "purificado" abrange pcio menos 50¾ p/p de pureza, pelo menos 60% p/p de pureza, pelo menos 70% de pureza, pelo menos 80% de pureza, pelo menos 85% dc pureza, pelo menos 90% de pureza, pelo menos 92% de pureza, pelo menos 94% de pureza, pelo menos 96% de pureza, pelo menos 97% de pureza, pelo menos 98% de pureza, pelo menos 99% de pureza, pelo menos 99,5% de pureza, e pelo menos 99, 9% de pureza, em que "substancialmente puro" abrange pelo menos 97% de pureza, pelo menos 98% de pureza, pelo menos 99% de pureza, pelo menos 99,5% de pureza, e pelo menos 99,9% de pureza. 0 termo "metabólito", como descrito neste documento se refere a um composto produzido in vivo após a administração a um sujeito que necessita do mesmo. 0 termo "cerca de" (também representado por ~) significa que o valor numérico recitado é parte de uma faixa que varia dentro de erro experimental padrão. A expressão "substancialmente, como mostrado em ..." um padrão de XRPD especificado significa que as posições de pico mostradas no padrão de XRPD são substancialmente as mesmas, dentro da inspeção ou recurso visual para a listagem de pico selecionada (1 0,2 ° 20) . Uma pessoa versada na técnica entende que a intensidade pode variar dependendo da amostra. 0 termo "substancialmente anidro" significa que uma substância contém no máximo 10% em peso de água, preferencialmente, no máximo, 1% em peso de água, mais preferencialmente, no máximo, 0,5% em peso de água, e mais preferivelmente, no máximo 0,1% em peso da água.

Um solvente ou antissolvcnte (como o usado em reações, cristalização, etc. ou solventes adsorvidos e/ou de rede) inclui pelo menos um de um álcool Cl a Cg, um éter C:> a CH, uma cetona C:i a C7, um éster C3 a C7, um clorocarbono C; a C;>, uma nitri.la C2 a C7, um solvente variado, um hi drocarboneto saturado C5 a C12, e um hidrocarboneto aromático C6 a Ci2. O álcool Ci a Cg se refere a um álcool linear / ramificado e/ou cíclico / acíclico tendo tal número de carbonos. Os álcoois Cú a C8 incluem, mas não estão limitados a, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, isobutanol, hexano'1 e c:i clohexanol. 0 éter C? a Cg se refere a um éter linear / ramificado e/ou cíclico / acíclico tendo tal número de carbonos. 0 éter C?_ a C8 incluí, mas não está limitado a, éter dimetílico, éter dietílico, éter di-isopropí 1 .i co, éter di-n-butílico, éter metíl-t-butílico (MTBE) , tetraidrofurano, e dioxano. A cetona C3 a C7 se refere a uma cetona linear / ramificada e/ou cíclica / acíclica tendo tal número de carbonos. A cetona C3 a C7 inclui, mas não está limitada a, acetona, metil etíl cetona, propanona, butanona, metil iscbutil cetona, metil butil cetona e cicloexanona. 0 éster C8 a C7 se refere a um és ter linear / ramificado e/ou cíclico / acíclico tendo tal número de carbonos. 0 éster C8 a C7 inclui., mas não está limitado a, acetato de efíla, acetato de propila, acetato de n-butila, etc. . 0 clorocarbono Cá a C2 se refere a um clorocarbono tendo tal número de carbonos. 0 clorocarbono C7 a C2 inclui, mas não está limitado a, clorofórmio, cloreto de metileno (DCM), tetraclorcto de carbono, 1,2-dicloroctano e Letracloroetano.

Uma nitrila C2 a C7 se refere a uma nitrila tendo tal número de carbonos. A nitrila C;> a C7 inclui, mas não está limitada a, aceton1trila, propionitrila, etc..

Um solvente variado se refere a um solvente comumcntc empregado em química orgânica, que inclui, mas não está limitado a, dietileno glicol, diglima (dimetil éter dietileno glicol), 1,2-dimetoxi-etano, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, et.ileno glicol, glicerina, hexamet i Ifosforamida, hexametil fósforo triame, N-met.il-2-pirrol.i d.i nona, n.i tromctano, piridina , triet.il a mi na e ácido acético. 0 termo hidrocarboneto saturado C5 a Ci? se refere a um hidrocarboneto linear / ramificado e/ou cíclico / acíclico. 0 hidrocarboneto saturado C5 a C12 inclui, mas não está limitado a, n-pentano, éter de petróleo (ligroína), n-hexano, n-heptano, ciclohexano e cicloheptano. 0 termo aromático Cn a Cl2 se refere a hidrocarbonetos substituídos e não substituídos tendo um grupo fenil como seu esqueleto. Os hidrocarbonetos preferidos incluem benzeno, xileno, tolueno, clorobenzeno, o-xileno, m-xileno, p-xilenb, xilenos, com tolueno sendo mais preferido. 0 termo "halo" ou "halogênio", conforme usado neste documento, inclui cloro, bromo, iodo e flúor. 0 termo "grupo de bloqueio" se refere a um grupo químico que apresenta as seguintes características. 0 "grupo" é derivado de um "composto de proteção." Os grupos que são seletivos para hidroxilas primárias sobre hidroxiias secundárias que podem ser colocados em condições consistentes com a estabilidade do fosforamidato (pi 1 2-8) e transmitem sobre o produto resultante propriedades físicas substancialmente diferentes permitindo uma fácil separação do produto do grupo novo 3'- fosforamidato-b' do composto desejado não reagido. 0 grupo deve reagir sele t :i vaineri t.e com bom rendimento para gerar um substrato protegido que é estável para as reações projetadas (ver E^rolect ivc Groups in Organic Synthesis, 3 ed. T. W. Greene and P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1999). Exemplos de grupos incluem, mas não estão limitados a: benzoil, acetil, benzoil substituído com fenil, tetraidropirani1, tritila, D Μ T (4,4 ' - d i m e t ó x 1 t r :i t i ] ) , Μ Μ T ( 4 - m ο η o rn e t ó x i t r i t i 1) , trimetóxitr i. t.i.l, grupo pixil (9-fenilxanten-9 -il), tiopixil (9-fenilt::i.oxanten-9-il) ou 9 - (p-metoxif erri 1 ) xantina-9-iI (MOX), etc; C(0)-alquil, C(0) Ph, C (0) aril, CH;>0-a.lquil, CH2O-ar.il, SO^-alquil, SO2- aril, terc- butildimetilsilil, terc-butildif enilsil.il. Acetaís, tais como MOM ου THP e semelhantes são considerados grupos possíveis. Compostos fluorados também são contemplados na medida em que eles podem ser fixos ao composto e podem ser removidos seletivamente pela passagem através de um meio dc extração em fase sólida fluorsa (FluorFlash©). Um exemplo específico inclui um análogo tritil fluorado, análogo de tritil 1-[ 4-(1H, 1 li, 2H, 2.H-pe:rf luordecil) fenil)-1,1 difeniImetanol. Outros análogos f.luorados da tr.i.tíl, BOC, Fmoc, CBz, etc., são também contemplados. Cloretos de sulfonila como cloreto de p-toluenosulfonil podem reagir seletivamente na posição 5'. Esteres podem ser formados seletivamente tais como acetatos e benzoatos . Anidridos dicarboxí1 icos tais como anidrido succínico e seus derivados podem ser usados para gerar uma ligação éster com um ácido carboxílico li.vre, tais exemplos incluem, mas não estão limitados a, oxal.il, malonil, succinil., glutaril, adipil, pimelil, superil, azelaí.l, sebacil, ftal i 1, isoftalil, tereftal.il, etc.. 0 ácido carboxílico l.i.vre aumenta drasticamente a polaridade e também pode ser usado como um identificador para extrair o produto de reação em fases aquosas levemente básica, tais como soluções de bicarbonato de sódio. 0 grupo fosforamidato é relativamente estável em meio ácido, então os grupos que exigem condições de reação ácidas, tais como, tetraidropiranil, também poderíam ser usados. O termo "grupo de proteção", que é derivado de um "composto de proteção", tem seu significado simples e comum, ou seja, pelo menos um grupo de proteção ou bloqueio é iigado a pelo menos um grupo funcional (por exemplo,-OH,-N H 2, etc.) que permite a modificação química de pelo menos um outro grupo funcional. Exemplos de grupos de proteção, incluem, mas não estão limitados a, benzil, acetil, benzil substituído com fenil, tetraidropiranil, tritil, DMT (4,4'-dímetóxitritil) , MMT (4-monometóxitritil) , trimetóxitritil, grupo píxil (9-fenilxanten -9-il), tiopixil (9-feniltioxanten-9-i1) ou 9 - (p-metoxifenil) xantina-9-il (MOX), etc.; C(0)-alquil, C(0) Ph, C(O) aril, C(0) O (alquil inferior), C(0) 0 (alquileno inferior) aril (por exemplo,-C(0) 0CH2Ph), C(0) 0 aril, CH20-alquil, CH20-aril , S02-alquil, S02~aril, um grupo de proteção compreendendo pelo menos um átomo de silício, tais como, terc-butildimetnsilil, terc-butildifenilsilil, Si (alquil inferior) ->0S i (alquil. inferior) :<0H (como, -S:i ('Pr) ?0Si ('Pr) 20H. 0 termo "composto de proteção" como usado neste documento e salvo definição em contrário, se refere a um composto que contém um "grupo de proteção" e que é capaz de reagir com um composto que contém grupos funcionais que são capazes de ser protegidos. 0 termo "grupo de saída", como usado neste documento, tem o mesmo significado para o versado na técnica (Advanced Organic Chemistry: reactions, mechanisms and structure- Fourth Edition by Jerry March, John Wiley and Sons Ed.; 1992 pages 351-357) e representa um grupo que faz parte de, e é fixo a uma molécula de substrato, em uma reação onde a molécula de substrato sofre uma reação de deslocamento (por exemplo, com um nucleófilo), o grupo de saida é, então, deslocado. Exemplos de grupos de saida incluem, mas não estão limitados a: halogênio (F, Cl, Br e I), preferencialmente, Cl, Br ou I; tosilato, mesilato, triflato, acetato, canforsulfonato, arilóxido e arilóxido substituído com pelo menos um grupo retirador de elétrons (por exemplo, p-nitrofenóxido, 2-clorofenóxido, 4-clorofenóxido, 2,4-dinítrofenóxido, pentafluorfenóxido, etc.), etc:.. 0 termo "grupo retirador de elétrons" é de acordo com o seu significado normal aqui. Os exemplos de grupo retíradores de elétrons incluem, mas não estão limitados a, um halogênio,-N02, -C (0) (alquil inferior),-C(0) (aril),-C(0)0(alquil inferior), -C(0)0 (aril), etc.. 0 termo "reagente básico", como usado neste documento, significa um composto que é capaz de dcsprotonar um grupo hidroxil. Exemplos de reagentes básicos incluem, mas não estão Limitados a, um óxido de (alquil inferior) ((alquil inferior) OM) em combinação com um solvente alcoó'1 ico, onde óxidos de (alquil inferior) incluem, mas não estão limitados a, MeCT, EtO ", "PrO~, ‘PRO", tBuO", ÍAmO" (iso-amilóxido) , etc., e onde M é um cátion de metal alcalino, tal como Li+, Na+, K+, etc.. Os solventes alcoólicos incluem (alquil inferior) 011, tal como, por exemplo, MeOll, EtOH, nPrOH, 1PrOH, LBuOH, 'AmOH, etc.. As bases de não- alcóxi também podem ser usadas, tais como hidreto de sódio, hexametildissilazano de sódio, hexametildissilazano de iitio, di.i.sopropilamida de litio, hidreto de cálcio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, DBU, DBN, reagentes de Grignard, tais como (alquil inferior) Mg (halogênio), que incluem mas não estão limitados a, MeMgCl, MeMgBr, LBuMgCl, tBuMgBr, etc.. 0 termo "base" abrange o termo "reagente básico" e é destinado a ser um composto que é capaz de desprotonar um composto contendo próton, ou seja, uma base de Bronsted. Além dos exemplos acima recitados, outros exemplos de uma base incluem, mas não estão limitados a, piridina, colidína, 2,6-(alquil inferior)-piri dina, dimetil-anilina, imidazol, N-metil-irnidazol, pirazol, N- metil-pirazol, trietilamína, d i-isopropileti1amine, etc. 0 termo "grupo retirador de elétrons" é de acordo como seu significado normal. Exemplos de grupo retiradores de elétrons incluem, mas não estão limitados a, um hal.ogênio (F, Cl, Br ou I) , -NCp, -C (0) (alquil i nferior) , -C (0) (aril),-C(0) 0 (alquil inferior),-C(0) 0 (aril), etc.. 0 termo "co-cristalatos" incluem co-cristalatos de 4, Rp-4, ou Sp-4 em combinação com sais, que abrange sais farmaceut.ioamente aceitáve i s . A expressão "sais", corno descrita neste documento sc refere a um composto compreendendo um cátion e urn âni.on, o que pode scr produz ido pela protonaçâo de um grupamento cio aceitaqrão de próton e/ou desprotonação de urn grupamento doador de próton. Deve ser notado que a protonaçâo do grupamento de aceitação de próton resulta na formação do uma espécie catiônica em que a carga é equilibrada pela presença de um ân.i.on fisiológico, enquanto a desprotonação do grupamento doador de próton resulta na formação de uma espéc.i e aniônica em que a carga é equilibrada pela presença de um cátion fisiológico. A frase "sal farmaceuticamente aceitável/' significa um sal que é farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e semelhantes; ou formados com ácidos orgânicos, tais como ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láti co, ácido malônico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido 3 —(4 — hidroxibenzoil) benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanosulfôníco, etanossulfônico , 1,2 etano-dissulfônico, ácido 2-hidróxietanosulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 4-clorobenzenosulfônico, ácido 2-naf talenosulf ônico, ácido 4~tolucnosulfôníco, ácido canforsulfônico, ácido lauril sulfúrico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido salicíl.ico, ácido mucônico, e semelhantes ou (2) sais de adição de base formados com as bases conjugadas de qualquer um dos ácidos inorgânicos listados acima, em que as bases conjugadas compreendem um componente cal. tônico selecionado entre Na+, K", Mg'-1, Ca'1, NHgR"'4-.g ', em que R"' é um C1-.3 alquil e g é um número selecionado deentre 0, 1, 2, 3 ou 4. Deve ser entendido que todas as referências aos sais farmaceuticamente aceitáveis incluem formas de adição de solvente (solvatos) ou formas de cristal (polimorfos) como definido neste documento, do mesmo sal de adição de ácido. 0 termo "alquil" se refere a um resíduo de hidrocarboneto monovalente de cadeia ramificada ou não ramificada, saturada, contendo de 1 a 30 átomos de carbono. 0 termo "C:-m alquil" se refere a um composto do alquil de 1 a M átomos de carbono, onde M é um inteiro tendo os seguintes valores: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, O termo "C1-4 alquil" se refere a um alquil contendo de 1 a 4 átomos de carbono. O termo "alquil inferior" denota um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono. "Ci-aoalquil", conforme usado neste documento se refere a uma alquil compreendendo 1 a 20 átomos de carbono. "Ci-ioalquil" corno usado neste documento se refere a um alquil compreendendo ] a 10 átomos de carbonos. Exemplos de grupos alquil incluem, mas não estão limitados a, grupos de alquil inferior incluindo metil, etil, propil, i-propil, n-butil, i-butil, t-butil ou pentil, isopent.il, neopentil, hexil, heptil, e oct.il. 0 termo (ar) alquil ou (heteroaril) alquil indica que o grupo alquil é opcionalmente substituído por um grupo ar.il ou um heteroaril, respectivamente . O termo "alqueni.1 " se refere a um radical de cadeia de hidrocarbonetos não substituído tendo de 2 a 10 átomos de carbono tendo uma ou duas ligações duplas olcfínicas, preferencialmente, uma ligação dupla olefínica. 0 termo "Cz-n alquenil" se refere a um composto alqueni 1 de 2 a N átomos de carbono, onde N é um número inteiro Lendo os seguintes valores: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. O termo "C;>- ioalquenil" se refere a um alquenil compreendendo de 2 a 10 átomos de carbono. O termo "C2--ialquenil" se refere a um alquenil contendo de 2 a 4 átomos de carbono. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, vinil, 1-propenil, 2-propcnil (al:il) ou 2-butenil (crot.il). 0 termo "aril", como usado neste documento, e salvo indicação em contrário, se refere a fenil (Ph), bifenil, ou naftil, substituído ou não substituído, preferencialmente, o termo aril se refere a fenil substituído ou não substituído. 0 grupo aril pode ser substituído com um ou mais grupamentos selecionados dentre hidroxil, F, Cl, Br, I, amino, alquilmino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nit.ro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ác.ido fosfônico, fosfato e fosfonato , ou desprotegidos ou protegidos, conforme necessário, como é conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, como ensinado na T.W. Greene and P.G. M. Wuts, "Protectíve Groups in Organic Synthesis," 3o ed. , John Wiley & Sons, 1999. 0 termo "arilóxido" como usado neste documento, e salvo indicação em contrário, se refere a fenóxido substituído ou não substituído (Pho-), p-fenil-fenóxido (p-Ph-Pho), ou naftóxido, preferencialmente, o termo arilóxido se refere a fenóxido substituído ou não substituído. 0 grupo arilóxido pode ser substituído com um ou mais grupamentos selecionados dentre hidroxi. .1, F, Cl, Br, I,-C(0) (alquil inferior),-C(0)0 (alquil inferior), amino, alquilmino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato e fosfonato, ou desprotegido ou protegido, conforme necessário, como é conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, como ensinado em T.W. Greene and P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Syrrthesis," 3o ed., John Wiley & Sons, 19 9 9. 0 termo "preparação" ou "forma de dosagem" é destinado a inc.luir ambas as formulações sólidas e líquidas do composto ativo e um versado na técnica irá apreciar que um ingrediente ativo pode existir em diferentes preparações, dependendo dos parâmetros farmacocinéticos e dose desejada. 0 termo "excipiente", como usado neste documento se refere a um composto que é usado para preparar uma composição farmacêutica, e é geralmente seguro, não tóxico e nem biologicamente nem de outra forma indesejável, e inclui os excipientes que são aceitáveis para uso veterinário, bem como para uso farmacêutico humano. 0 termo "cristalino" se refere a uma situação onde uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4 tem características cristalinas quando determinada por d.ifração em pó de raios X ou uma técnica de raios-X de cristal único. 0 termo "tipo cristal" se refere a urna situação em que uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4 tem características cristalinas quando determinada por um meio, por exemplo, visualmente ou por microscopia ótica ou de polarização, mas não t e m c a rac t e r í s t i c a s c r i s t. a 1 i n as quando d e t e r m i n a da p o r outros meios, por exemplo, difração de raios X de pó. Os métodos para determinar visualmente a cristalinidade de uma amostra sólida, por microscopia visual ou ótica ou polarização estão divulgados na USP <695> e <776>, ambos os quais sendo incorporados por referência. Uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4, que é "tipo cristal" pode ser cristal iria sob certas condições, mas pode se tornar não cristalina quando submetida a outras condições. 0 termo "amorfo" se refere a uma situação em que uma amostra sólida de Sp-4 ou Rp-4 não é cristalina, nem tipo cristal.

Moda 1ida des Uma primeira modalidade é direcionada a um composto representado pela fórmu.la 4: 4 em que P* representa um átomo dc fósforo quiral. Devido ao átomo de fósforo quiral, o composto representado pela fórmula 4 compreende dois diastereoisômeros designados como Rp-4 e Sp-4. 0 composto representado pela fórmula 4 também pode ser parte de um solvato, um hidrato, ou um solvato/hidrato misturado. 0 solvato é designado como 4 -nS, enquanto o hidrato é designado como 4 τηΙΙρΟ, onde S é um solvente de rede, n varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 5, Finalmente, o composto representado pela fórmula 4 pode não existir como um solvato ou hidrato, mas tem uma certa quan t i d ade v a n t a j o s a d e s o .1.. v e n t e a d s o r v ido ( S) o u á g u a . Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0 % em peso a cerca de 10 % em peso com base no peso do composto representado pela fórmula 4. O composto representado pela fórmula 4 e os solvatos e hidratos do mesmo sendo cristalinos, tipo cristal, ou amorfos.

Uma segunda modalidade é direcionada a um composto representado pela fórmula RP-4: Λ,,-4 0 composto representado pela fórmula RP-4 também pode ser parte de um solvato, um hidrato, ou um solvato/hidrato misturado. 0 solvato é designado como RP-4 -nS, enquanto o hidrato é designado como SP-4 -mh^O, onde S é um solvente de rede, n varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia por uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 5, Finalmente, o composto representado pela fórmula RP-4 pode não existir como um solvato, hidrato, ou solvato/hidrato misturado, mas tem uma certa quantidade vantajosa de solvente adsorvido (S), água, ou tanto S quanto água. F,m cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0 % em peso a cerca de 10 % em peso com base no peso do composto representado pela fórmula RP-4. O composto representado pela fórmula RP-4 e os solvatos e hidratos do mesmo sendo cristalinos, tipo cristal, ou amorfo.

Um primeiro aspecto da segunda modalidade é direcionado a um Cristalino R;>-4.

Um segundo aspecto da segunda modalidade é direcionado a um cristalino RP-4 tendo reflexões-XRPD 2Θ (°) em cerca de: 6,6, 7, 1, 9,0, 11,6, 17, 9, 20,7, 24,1, 24,4, e 26,2.

Um terceiro aspecto da segunda modalidade é direcionada a um cristalino RP-4 tendo reflexões XRPD 20 (°) era cerca de: 6,6, 7,1, 9,0, 11,0, 11,6, 12,0, 16,0, 17,9, 19,6, 20,7, 21,0, 21,7, 21,9, 22,2, 23,1, 24,1, 24,4, 26,1, 27,3, 27,7, e 28,2, Um quarto aspecto da segunda modalidade é direcionado a um cristalino RP-4 tendo um padrão de difração XRPD substancialmente como aquele mostrado na Fig. 2.

Um quinto aspecto da segunda modalidade é direcionado a Rp-4 tendo os seguintes picos FT-IR (cm'1) : 1742, 1713, 1679, 1460, 1377, 1259, 1157, e 1079, Um sexto aspecto da segunda modalidade é direcionado a .Rp-4 tendo um espectro FT-IR substancialmente como o mostrado na Fig. 15.

Um sétimo aspecto da segunda modalidade é direcionado a Rp-4 sustanciaJmente puro.

Um oitavo aspecto da segunda modalidade ó direcionado a .Rp-4 sustancialmente puro cristalino.

Um nono aspecto da segunda modalidade é direcionado a sustancialmente a RP-4 amorfo puro.

Uma terceira modalidade é direcionada a um composto representado pela fórmula SP-4: 7>4 O composto representado pela fórmula SP-4 também pode ser parte de um solvato, um hidrato, ou um solvaLo/hidrato misturado. O solvato é designado como SP-4-nS, enquanto o hidrato é designado como SP-4 ·ΓηΗ20, onde S é um solvente de rede, n varia em uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 3 e m varia em uma quantidade inteira ou não inteira de cerca de 0 a cerca de 5. Finalmente, o composto representado pela fórmula SP-4 pode não existir como um solvato ou hidrato, mas tem uma certa quantidade vantajosa de solvente adsorvído (S) ou água. Em cujo caso, a quantidade de S ou água pode variar de cerca de 0 % em peso a cerca de 10 % em peso com base no peso do composto representado pela fórmula SP-4. 0 composto representado pela fórmula SP-4 e os solvatos e hidratos do mesmo sendo cristalinos, tipo cristal, ou amorfos.

Um primeiro aspecto da terceira modalidade é direcionado a SP-4 Cristalino.

Um segundo aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino monoclínico SP-4, preferencialmente tendo os seguintes parâmetros de célula unitária de ~ 12,88 Â, b ~ 6,17 Á, c ~ 17,73 Ã, e β ~ 92,05°.

Um terceiro aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino monoclínico SP-4, preferencialmente, tendo os seguintes parâmetros de célula unitária de ~ 20,09 Â, b ~ 6,10 A, c ~ 23,01 Â, e β ~ 112,29°.

Um quarto aspect.o da terceira modalidade 6 direcionado a um cristalino monoclínico SP-4, preferencia lment.e, tendo os seguintes parâmetros de célula unitária de ~ 12,83 Ã, b ~ 6,15 Ã, c ~ 17,63 A, e β ~ 91,75°.

Um quinto aspecto da terceira modalidade 6 direcionado a um cristalino monoclínico SP-4, pref erenci alrnente tendo os seguintes parâmetros de célula unitária de ~ 12,93 A, b - 6,18 Â, c ~ 18,01 Â, e β ~ 96,40°.

Um sexto aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino SP-4 tendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 5,2, 7,5, 9,6, 16,7, 18,3, 22,2, Um sétimo aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino SP-4 tendo reflexões XRPD 20 (°) em cerca de: 5,0, 7,3, 9,4, e 18,1.

Um oitavo aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino SP-4 tendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 4,9, 6,9, 9,8, 19,8, 20,6, 24,7, e 26,1.

Um nono aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino SP-4 tendo reflexões XRPD 2Θ (°) em cerca de: 6, 9, 9,8, 19,7, 20,6, e 24,6.

Um nono aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino SP~4 tendo reflexões XRPD 20 (°) em cerca de: 5,0, 6, 8, 19, 9, 20, 6, 20,9, e 24,9.

Um décimo aspecto da terceira modalidade é direcionado a um cristalino SP-4 tendo reflexões XRPD 20 (°) em cerca de: 5,2, 6,6, 7,1, 15,7, 19,1, e 25,0.

Um décimo primeiro aspecto da terceira modalidade é direcionado ao Cristalino SP-4 tendo um padrão de difração XRPD substancialmente como o mostrado em qualquer um dentre a Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7, e Fig. 8.

Um décimo segundo aspecto da terceira modalidade é direcionado a SP-4 tendo os seguintes picos !·'Τ — I R (crrd:) em cerca de: 1743, 1713, 1688, 1454, 1378, 1208, e 1082.

Um décimo tercej.ro aspecto da terceira modalidades é direcionado a SP-4 tendo um espectro FT-IR substanciaimente como o mostrado na Fig. 7.

Um décimo quarto aspecto da terceira modalidade é direcionado a SP-4 sustancialmente puro.

Um décimo quinto aspecto da terceira modalidade é direcionado a SP-4 sustancialmente puro cristalino.

Um décimo sexto aspecto da terceira modalidade é direcionado a SP-4 sustancialmente puro amorfo.

Dosagem, Administração, e Uso A quarta modalidade é direcionada para uma composição para o tratamento e/ou profilaxia de qualquer um dos agentes virais usando qualquer um dos compostos 4, Rp-4, ou Sp-4. Possíveis agentes virais incluem, mas não estão limitados a: virus da hepatite C, vírus da hepatite B, vírus da Hepatite A, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da dengue, rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da diarréia v.i ral bovina, vírus da encefalite japonesa, ou aqueles vírus pertencentes aos grupos de pestivírus, hepacívírus, ou flavaví rus.

Um aspecto dessa modalidade é direcionado a uma composição para o tratamento de qualquer um dos agentes virais divulgados neste documento dita composição compreendendo um meio f armaceuticamerrte aceitável selecionado entre um excipiente, transportador, diluente, e meio equivalente e qualquer um dos compostos 4, Rp-4 , ou Sp-4, que é destinada a incluir seus hidratos, solvatos, e quaisquer formas cristalinas de qualquer um dos compostos 4, Ri:)-4 , ou S„-4 ou seus hidratos e solvatos cios mesmos.

Os compostos 4, R.,-4 , ou Sp-4 podem ser formulados de forma independente ern uma ampla variedades do transportadores e formas de dosagem de administração oral. A administração oral pode ser na forma de comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina duras e moles, soluções, emulsões, xaropes, ou suspensões. Os compostos 4, Rp-4 , ou Sp-4 são eficazes quando administrados por administração de supositório, entre outras rotas de administração. A maneira mais conveniente de administração é geralmente oral, usando um regime de dosagem conveniente diário que pode ser ajustado de acordo com a gravidade da doença e a resposta do paciente à medicação antiviral.

Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 juntamente com um ou mais excipientes, transportadores, ou diluentes convencionais, pode ser colocado na forma de composições farmacêuticas e dosagens unidade. As composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária podem ser compostas de ingredientes convencionais em proporções convencionais, com ou sem compostos ativos adicionais e as formas de dosagem unitária podem conter qualquer quantidade eficaz adequada do ingrediente ativo compatível com a faixa de dosagem diária destinada a ser empregada. As composições farmacêuticas podem ser empregadas como sólidos, tais como comprimidos ou cápsulas preenchidas, semissólidas, pós, formulações de liberação sustentada, ou líquidos, tais como suspensões, emulsões, ou cápsulas cheias para uso oral, ou na forma de supositórios para administração retal ou vaginal. A preparação típica irá conter de cerca de 5% para cerca de 95% de composto ativo ou compostos (p/p).

Os compostos 4, Rp-4, ou Sp-4 podem ser administrados individualmente, mas geralmente vão ser administrados, em mistura com um ou mais excipientes, diluentes ou transportadores farmacêuticos adequados selecionados orn relação à rota de administração pretendida e prática farmacêutica padrão.

As preparações de forma sólida incluem, por exemplo, pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, supositórios, e grânulos dispersíveis. Um transportador sólido pode ser uma ou mais substâncias que podem também atuar como diluentes, agentes aromat i zantes, solubilizant.es, lubrificantes, agentes de suspensão, I. igantes, conservantes, agentes desintegrant.es de comprimidos, ou um material encapsuiant.e. Em pós, o transportador, geralmente é um sólido finament.e dividido que é uma mistura com o componente ativo finamente dividido. Em comprimidos, o componente ativo geralmente é misturado com o transportador tendo a capacidade de ligação necessária em proporções adequadas e é compactado no formato e tamanho desejado. Os transportadores adequados incluem, mas não estão limitados a, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera de baixa fusão, manteiga de cacau, e semelhantes. As preparações de forma sólida podem conter, além do componente ativo, corantes, aromatizantes, estabilizantes, tampões, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, espessantes, agentes de solubilização, e semelhantes. Exemplos de formulações sólidas são exemplificados em EP 0524579; US 2002/0142050; US 2004/0224917; US 2005/0048116; US 2005/0058710; US 2006/0034937; US 2006/0057196; US 2006/0188570; US 2007/0026073; US 2007/0059360; US 2007/0077295; US 2007/0099902; US 2008/0014228; US 6.267.985; US 6.294.192; US 6.383.471; US 6.395.300; US 6.569.463; US 6.635.278; US 6.645.528; US 6.923.988; US 6.932.983; US 7.060.294; e US 7.4 62.608, cada um dos quais sendo incorporado po r referência.

As formulações liquidas que também são adequadas para administração oral incluem formulação liquida incluindo emulsões, xaropes, elixires e suspensões aquosas. Estas incluem as preparações de forma sólida que são destinadas a serem convertidas para as preparações de forma líquida pouco antes de usar. Exemplos de formulação líquida são exemplificados nas Patentes US 3.994.974; 5.695.784, e 6.977.257. As emulsões podem ser preparadas em soluções, por exemplo, em soluções aquosas de propileno glicol ou podem, conter agentes emulsificantes, tais como lecitina, monooleato de sorbitano, ou acácia. As suspensões aquosas podem ser preparadas pela dispersão do componente ativo finamente dividido em água com materiais viscosos, tais como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metiIcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e outros agentes dc suspensão bem conhecidos.

Os compostos 4, Rr-4, ou SP-4 podem ser independentemente formulados para a administração como supositórios. A cera de baixa fusão, tal como uma mistura de ácidos graxos de glicerídeos ou manteiga de cacau é primeiramente fundida e o componente ativo c disperso de forma homogênea, por exemplo, por agitação. A mistura homogênea derretida é então vertida em moldes de tamanho conveniente, deixar resfriar e solidificar.

Os compostos 4, RP-4, ou SP-4 pode ser independentemente formulados para administração vaginal. Pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou sprays contendo além do ingrediente ativo tais transportadores, são como conhecidos na técnica como sendo apropriado.

Algumas destas formulações também podem ser usadas em conjunto com um preservativo com ou sem um agente espermicida.

As formulações adequadas, juntamente com os transportadores, diluentes e excip.ientes farmacêuticos, são descritos em in Remington: The Science and Pcactice of Pharmacy 1995, edited by 11. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pennsylvania, que é aqui incorporado por referência. Um cientista de formulação capacitado pode modificar as formulações dentro dos ensinamentos do relatório descritivo para fornecer formulações diversas para um determinado modo de administração sem tornar as composições contendo os compostos contemplados neste documento previstos instáveis ou comprometendo sua atividade terapêutica.

Além disso, os compostos purificados 4, RP-4, ou SP-4 podem ser formulados de forma independente em conjunto com lipossomas ou micelas. Quanto aos lipossomas, é contemplado que os compostos purificados podem ser formulados de uma forma conforme divulgado nas Patentes US 4.797.285; 5.013.556; 5.077.056; 5.077.057; 5.154.930; 5.192.549; 5.213.804; 5.225.212; 5.277.914; 5.316.771; 5.376.380; 5.549.910; 5.567.434; 5.736.155; 5,827,533; 5.882.679; 5.891.468; 6.060.080; 6.132.763; 6.143.321; 6.180.134; 6.200.598; 6.214.375; 6.224.903; 6.296.870; 6.653.455; 6.680.068; 6.726.925; 7.060.689 e 7.070.801, cada um dos quais sendo incorporado por referência. Quanto às micelas, é contemplado que os compostos purificados podem ser formulados de uma forma conforme divulgado na Patente US 5.145.684 e 5.091.188, os quais são incorporados por referência. A quinto modalidades é direcionada para um uso de qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou SP-4 na fabricação de um medicamento para o tratamento de qualquer condição do resultado de uma infecção por qualquer um dos seguintes agentes virais: vírus da hepatite C, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela, vírus da Degue, rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da hepatite Δ, vírus da diarréia viral bovina e vírus da encefalite j aponesa. 0 "medicamento" significa uma substância usada em um método de tratamento e/ou profilaxia de um sujeito em necessidade do mesmo, onde a substância inclui, mas não está limitada a, uma composição, uma formulação, uma forma de dosagem, e semelhantes, compreendendo qualquer um. dos compostos 4, RP~4, ou SP-4. É contemplado que o uso de qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou SP-4 na fabricação de um medicamento para o tratamento de qualquer uma das condições antivirais divulgadas neste documento, individualmente ou em combinação com outro composto divulgado neste documento. Um medicamento inclui, mas não está limitado a, qualquer uma das composições contempladas pela quarta modalidade divulgada neste documento. A sexta modalidade c direcionada para um método de tratamento e/ou profilaxia em um sujeito que necessita do mesmo dito método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou SP-4 para o sujeito. É pretendido que um sujeito que necessita do mesmo seja aquele que tem qualquer condição do resultado de uma infecção por qualquer um dos agentes virais divulgados neste documento, que inclui, mas não está limitado a, vírus da hepatite C, vírus do Nilo Ocidental, o vírus da febre amarela, vírus da Degue, rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A, vírus da diarréia viral bovina ou vírus da encefalite japonesa, vírus Flaviviridae ou pestivírus ou hepacivírus ou um agente viral causando sintomas equivalentes ou comparáveis a qualquer um dos vírus listados acima. 0 "sujeito" designa um mamífero, que inclui, mas não está limitado a, gado, porcos, ovelhas, frango, peru, búfalos, lhamas, avestruzes, cães, gatos e humanos, preferencialmente, o assunto é um ser humano. É contemplado que, no método para tratamento de sujeito em necessidade do mesmo da nona modalidade pode ser qualquer um dos compostos contemplados neste documento, seja individualmente ou em combinação com outro composto divulgado neste documento. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como usado neste documento significa uma quantidade necessária, para reduzir os sintomas da doença em um indivíduo. A dose será ajustada às exigências do indivíduo em cada caso particular. A dosagem pode variar dentro de limites amplos, dependendo de inúmeros fatores como a gravidade da doença a ser tratada, a idade e a condição de saúde geral do paciente, outros medicamentos com os quais o paciente está sendo tratado, da rota e da forma de administração e as preferências e experiências do profissional médico envolvido. Para administração oral, uma dose diária de entre cerca de 0,001 e cerca de 10 g, incluindo todos os valores entre estes, tais como 0,001, 0,002b, 0,005, 0,0075, 0,01, 0,025, 0,050, 0,075, 0,1, 0,125, 0,150, 0,17 5, 0,2, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, Ί, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9 e 9,5, por dia devem ser apropriados em monoterapia e/ou em terapia de combinação. Δ dosagem diária especial é de entre cerca de 0,01 e cerca de 1 g por dia, incluindo todos os valores incrementais de 0,01 g (ou seja, 10 mg) entre estes, uma dosagem diária preferida cerca de 0,01 e cerca de 0,8 g por dia, mais preferencialmente, cerca de 0,01 e cerca de 0,6 g por dia, e mais preferivelmente de cerca de 0,01 e cerca de 0,25 g por dia, cada um dos quais incluindo todos os valores incrementais de 0,01 g entre estes. Geralmente, o tratamento é iniciado com uma grande "dose de carga" inicial para rapidamente reduzir ou eliminar o vírus seguido por uma diminuição da dose para um nível suficiente para prevenir o ressurgimento da infecção. Uma pessoa versada na técnica do tratamento de doenças descritas neste documento será capaz, sem experimentação indevida e com base nos conhecimentos, experiência e as divulgações do presente pedido, de determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto divulgado neste documento, para uma determinada doença e do paciente.

Eficácia terapêutica pode ser determinada com base em testes de função hepática, incluindo mas não limitados a, níveis de proteína, tais como proteínas do soro (por exemplo, albumina, fatores de coagulaçulo, fosfatase alcalina, aminotransferases (por exemplo, a alanina transam!nase, aspartato transaminase), 5'-núcleosida se, γ -glutaminiltranspeptidase, etc.), síntese de bilirrubina, síntese de colesterol., e síntese de ácidos biliares, uma função metabólica do fígado, incluindo, mas não limitada a, metabolismo de oarboidratos, metabolismo de aminoácidos e amônia. Alternativamente a eficácia terapêutica pode ser monitorada pela medição de HCV-RNA. Os resultados desses testes permitirão que a dose a seja otimizada.

Um primeiro aspecto da sexta modalidade é dirigido a um método de tratamento e/ou profilaxia em um sujeito que necessita do mesmo dito método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto representado por qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou Sp-4 e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente antiviral; em que a administração é concorrente ou alternativa. Entende-se que o tempo entre a administração alternativa pode variar entre 1-24 horas, o que inclui qualquer subfaixa entre estes incluindo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23 horas.

Exemplos de "agente de outro antiviral" incluem, mas não estão limitados a: inibidores da HCV NS3 protease (ver EP 1881001, US 2003187018, US 2005267018, WO 2003006490, WO 200364456, WO 2004094452, WO 2005028502, WO 2005037214, WO 2005095403, WO 2007014920, WO 2007014921, WO 2007014922, WO 2007014925, WO 2007014926, WO 2007015824, WO 2008010921, e WO 2008010921); Inibidores de HCV NS5B (veja US 2004229840, US 2005154056, US 2005-98125, US 20060194749, US 20060241064, US 20060293306, US 2006040890, US 2006040927, US 2006166964, US 20072/5947, US 6784166, US20072759300, WO 2002057287, WO 2002057425, WO 2003010141, WO 2003037895, WO 2003105770, WO 2004000858, WO 2004002940, WO 2004002944, WO 2004002977, WO 2004003138, WO 2004041201, WO 2004065367, WO 2004096210, WO 2005021568, WO 2005103045, WO 2005123087, WO 2006012078, WO 2006020082, WO 2006065335, WO 2006065590, WO 2006093801, WO 200702602, WO 2007039142, WO 2007039145, WO 2007076034, WO 2007088148, WO 2007092000, e W02007095269); Inibidores de HCV NS4 (ver WO 2005067900 e WO 2007070556); Inibidores de HCV NS5a (veja US 2006276511, WO 2006035061, WO 2006100310, WO 2006120251, e WO 2006120252); agonistas dos receptores tipos Toll (veja WO 2007093901), e outros inibidores (ver WO 2000006529, WO 2003101993, WO 2004009020, WO 2004014313, WO 2004014852, e WO 2004035571), e compostos divulgados no pedido de patente US 12/053.015, depositado em 21 de marco de 2008 (US 2010/0016251) (cujos conteúdos são incorporados por referência), α-interferon, β-interferon, α-interferon peguilado, ribavirina, levovirína, viramid.i.na, outro inibidor de HCV polimerase de nucleosidco, um .inibidor da HCV polimerase de não núcleosi deo, um inibidor de protease do HCV, um inibidor de helicase do HCV ou um inibidor de fusão de HCV.

Quando qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou SP-4 é administrado em combinação com outro agente antiviral a atividade pode ser aumentado ao longo do composto de origem. Quando o tratamento é a terapia de combinação, a administração poderá ser concorrente ou sequencial em relação a dos derivados de nuc 1 eos.í deos. "A administração concorrente", usada neste documento, portanto, inclui a administração dos agentes, ao mesmo tempo ou em tempos diferentes. Δ administração de dois ou mais agentes, ao mesmo tempo pode ser alcançada por uma formulação única contendo dois ou mais ingredientes ativos ou por administração substancialmente simultânea de duas ou mai s formas de dosagem com um único agente ativo.

Será entendido que as referências deste documento ao tratamento se estendem à profilaxia, bem como para o tratamento de condições existentes. Além disso, o termo "tratamento" de uma infecção por HCV, conforme usado neste documento, também inclui o tratamento ou profilaxia de uma doença ou uma condição associada ou mediada por: infecção por HCV, ou os sintomas clínicos do mesma.

Preparação Uma sétima modalidade é dirigida a um processo para preparar qualquer um dos compostos 4, RP-4, ou SP-4, que compreende: a) reagir uma isopropil-alanato, A, uma di-LG fenilfosfato, B, 2 ' -desóxí-2 '-f luo.r-2 ' -C-metílurídina, 3, e uma base para obter uma primeira mistura que compreende pelo menos uma de SP-4 e RP-4 Λ B 3 em que X é uma base conjugada de um ácido, n é 0 ou 1, e LG é um grupo de saída; b) reagir a primeira mistura com um composto de proteção para obter uma segunda mistura compreendendo pelo menos um de SP-4 protegidos e RP-4 protegido; e c) opc.i ona 1 mento, submeter a segunda mistura à cristalização, cromatografia ou extração, a fim de obter 4, SP-4, ou Rp-4.

Em um primeiro aspecto da sétima modalidade, o alanato isopropílico está presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferencialmente, substancial mente: anidro.

Em um segundo aspecto da sétima modalidade, a base é N-metilimidazol.

Em um terceiro aspecto da sétima modalidade, a razão molar de A-para-B-para-3 é de cerca de 1,6 para-1,3-para-l.

Em um quarto aspecto da sétima modalidade, o composto de proteção é cloreto de t-butil- dimetil-silil.

Uma oitava modalidade é direcionada para um processo de preparação de SP-4 ou RP-4, que compreende: a) reagir um isopropil-alanato, A, um d.i-LG fenilfosfato, B, 2'-desóxi-2 '-f luor-2 ' -C-metiluridina, 3, e uma base para obter uma primeira mistura que compreende pelo menos um de SP-4 e Rp-4 . A B 3 em que X é uma base conjugada de um ácido, n é 0 ου 1, e LG 6 um grupo de salda, e b) opcionalmente, submeter a segunda mistura à cristalização, cromatografia ou extração, a fim de obter SP-4 ou Rp-4purifiçado.

Um primeiro aspecto da oitava modalidade para preparar Rp-4, adicional.mente, inclui ainda purificar a segunda mistura ou o RP-4 purificado pela dissolução ou suspensão da segunda mistura ou a mistura de RP-4 purificado em um solvente; opcionalmente seguido de semeadura com Rp-4 cristalino; e adicionar uma quantidade suficiente de antissolvente para obter RP-4 cristalino.

Um segundo aspecto da oitava modalidade para a preparação de SP-4, adicionalmente, inclui ainda purificar a segunda mistura ou o Sp-4 purificado por d) dissolver ou suspender a segunda mistura ou Sp-4 purificado em um solvente seguido de semeadura com Sp-4 cristalina em cerca da temperatura ambiente; coletar um primeiro sólido da maioria que compreende Sp-4; dissolver o primeiro sólido em um solvente à temperatura de refluxo, e refrigerar ou adicionar um antissolvente para obter um segundo sólido.

Um terceiro aspecto da oitava modalidade para a preparação de Sp~4, além disso, inclui ainda purificar Sp-4 por d) dissolver ou suspender a segunda mistura ou mistura de Sp-4 purificado em um primeiro solvente, seguido pela adição de um antissolvente a fim de obter uma primeira composição em que o solvente residual / antissolvente é removido por decantação para obter um resíduo; tratar o resíduo com uma solução contendo o primeiro solvente e antissolvente para produzir uma segunda composição em que a redução da pressão produz um primeiro sólido; dissolver ou suspender o primeiro sólido usando um segundo solvente de modo a obter uma terceira composição; adicionar cristais de semente de Sp-4 para a terceira composição; coletar um segundo sólido; dissolver ou suspender o segundo sólido com um terceiro solvente, opcionalmente aquecer à temperatura dc refluxo do terceiro solvente para obter uma quarto composição, e, se necessário, refrigerar a quarta composição para obter um terceiro sólido compreendendo Sp-4, que é coletado por filtração.

Em um quarto aspecto da oitava modalidade para a preparação de Sp-4, Sp-4 é purificado ainda pela segunds mistura ou Sp-4 purificado por d) adicionar sílica gel para a segunda mistura ou Sp-4 purificado seguido por evaporação do solvente para produzir uma lama seca; agitar a lama seca em uma primeira combinação de solvente/antissolvente para obter uma primeira lama úmida; decantar a primeira combinação de solvente/antissolvente a partir da primeira lama úmida para obter uma segunda lama úmida e um primeira composição; adicionar à segunda lama úmida uma segunda combinação de solvente/antissolvente seguido por agitação; decantar a segunda combinação solvente/antissolvente da segunda lama úmida para obter uma terceira lama úmida e uma segunda composição, opcionalmente, repetir as etapas g)-h) na terceira lama úmida ou lama úmida adicional; evaporar o solvente a partir da segunda composição e, opcionalmente, qualquer composição adicional obtida a parti, r da etapa i) opcional para obter um primeiro sólido; dissolver ou suspender o primeiro sólido em uma solução contendo um terceiro solvente e, opcionalmente, um quarto solvente para obter uma terceira composição; opcionalmente adicionando cristais de semente de Sp-4 para a terceira composição; obter a partir da terceira composição um segundo sói ido compreendendo Sp-4 e, opcionalmente, recristalizar o segundo sói i.do usando um terceiro solvente para obter um terceiro sólido compreendendo Sp-4.

Um versado na técnica irá apreciar que os compostos podem ser separados por extração tradicional, cristalização tradicional ou técnicas cromatográficas tradicionais. Técnicas cromatográficas tradicionais incluem, mas não estão limitadas a, cromatografia em gel do sílica (usando, por exemplo, metanol 3 a 5% em DCM ou isopropanol 4 a 6¾ em DCM) para produzir níveis elevados de um isômero (50 a 100%) e então, cristalização dos mesmos. Alternativamente, pode-se usar a cromatografia de fase reversa (usando, por exemplo, fase móvel aquosa- acetonitrila 1 a 30%). Além disso, os compostos podem ser isolados por cromatografia com fluido supercrítico SFC com dióxido de carbono como solvente principal e álcoo.is como o metanol como um modificador, preferencialmente, usando o meio quiral apropriado, tal como, Daicel Chiralpack IA.

Alternativamente, a cromatografia de SMB pode ser empregada usando o meio quiral apropriado, tais como, Daicel ChiralPack IA, usando uma mistura de solventes, como hexano / isopropanol ou solventes únicos, tal como acetato de e t r 1 a . A nona modalidade é dirigida a um processo de preparação Sp-4, que compreende: a) reagir uma isopropil-alaníl-fosforamídato corrí um 3 ' -0-protegído ou não protegido 3, e um reagente básico para obter uma composição que compreende Sp-4 protegido ou desprotegido Mistura de d 1 a s t er e υ i s ôrne r os em que o isoprop i 1 -a ian.i 1 -:f os to roamidato é composto de urna mistura de dί a s to reoisômeros representada pelas seguintes eslru t. uras : c: c em que a razão de C:C' é cerca de 1:1.

Em um primeiro aspecto, o reagente básico é cloreto de t-butil magnésio e a razão de C:C' é maior que ou igual a cerca de 1:1.

Em um segundo aspecto, o reagente básico é cloreto de t-butil magnésio e a razão de C:C'; é maior que cerca de 1:1.

Em um terceiro aspecto, o reagente básico é cloreto de t-butil magnésio e a razão de C:C' é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1, Um quarto aspecto o LG' é p-nitrofenóxido, o reagente básico é cloreto de t-butil magnésio, e a razão de C:C' é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 4 9:].,, ou cerca de 99:1.

Um quinto aspecto para preparar Sp-4, compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato (C) com um 3'-0-protegido ou desprotegido, 3, e um reagente básico para obter uma composição que compreende Sp-4 protegido ou não protegido j o em que Z é um grupo de proteção ou de hidrogênio; LG 'c um grupo de saída, e b) opcionalmente, submeter o Sp-4 protegido ou não protegido obtido para cromatografia, extração ou a cristalização para obter Sp-4 purificado protegido ou não protegido. Em uma submodalidade, o LG é tosilato, canforsulfonato, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo reiirador de elétrons, mais preferencialmente, LG' é selecionado dentre p-nitrofenóxido, 2 , 4-dinitrofenóxido e pentaf1uorfenóxido . Em uma submodalidade adicional, quando Sp-4 está protegido, ou seja, Z não é hidrogênio, o processo da nona modalidade é direcionado ainda para desproteger Sp-4 protegido. Em uma submodalidade adicional, a reag;ão é conduzida em um solvente aprótico polar, tal como, tetraidrofurano ou outro solvente éteral seja um estando individualmente ou em combinação com outro ou com uma nitrila C2 a C7, como acetonitrila. 0 processo da nona modalidade compreende a mais 1) reagir (LG') P(0) (LG)>>, cm que LG, independente de LG' , é um grupo de salda, com (_i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (LG’)P(0) (LG) (.Ala-1Pr) , seguido pela reação de (LG1) P(0) (LG) (Ala-1Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura de C e C', (ii) fenol e uma primeira base para obter (LG') P(0) (LG) (OPh) seguido pela reação de (LG')P(0)(LG)(OPh), com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura de C e C', ou (iii) combinar isopropil-alanato, fenol e pelo menos uma base para obter uma mistura de C e C', ou 2) reagir (PhO) P (0) (LG) 2, cm que LG1 , independente de LG, c um grupo de sai.da, com (1) isopropil-alanato e uma primeira base para a obtenção de (PhO)!3 (0) (LG) (Ala-^Pr), seguido pela reação (PhO)P(O) (LG) (Ala-’'Pr) com um precursor de grupo de salda e uma segunda base para obter uma mistura de C e C', c c e submeter a mistura para cromatografia ou cristalizar a mistura para obter C. Em um aspecto da nona modalidade, o isopropil-alanato está presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferencialmente, substancialmente anidro.

Uma décima modalidade é direcionada a um processo para preparar RP-4, que compreende: a) reagir um isopropil- alani.l-fosforamidato com um .3' -Ο-protegido ou não protegido, 3, e um reagente fundamental para obter uma composição que compreende Rp-4 protegido ou não protegido Mistura de diastereoi sômeros em que o isopropi l-alanil-fosforoamidato é composto de uma mistura de diastereoisômeros representada pelas seguintes estruturas: c c em que a razão de C':C é cerca de 1:1.

Km um primeiro aspecto, o reagente básico é cloreto de t-butil magnés i.o e a razão de C':C é mai or que ou i gua l a cerca de 1:1.

Em um segundo aspecto, o reagente básico é cloreto dc t-butil magnésio e a razão de C':C; é maior que cerca de 1:1.

Fm um terceiro aspecto, o reagente básico é cloreto de t-butil magnésio e a razão de C' :C é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, ce r:ca de 4:1, ccrca de 5,7:1 , cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1, Um quarto aspecto o LG' é p-nitrofenóxido, o reagente básico é cloreto de t-butil magnésio, e a razão de C':C é pelo menos cerca de 1,5:1, cerca de 2,3:1, cerca de 4:1, cerca de 5,7:1, cerca de 9:1, cerca de 19:1, cerca de 32,3:1, cerca de 49:1, ou cerca de 99:1.

Um quinto aspecto para preparar Re-4, compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato (C') com um 3'-0-protegido ou não protegido 3, e um reagente básico para obter uma composição compreendendo _RP-4 protegido ou não protegido 3 C em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio; LG' é um grupo de saída, c b) opcionalmente, submeter o Rp-4 protegido ou não protegido obtido para cromatografia, extração ou a cristalização para obter Rp-4 purificado protegido ou não protegido. Em uma submodalidadc, a LG' c tosilato, canforsulfonato, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo retirador de elétrons, mais preferencialmente, LG' é selecionado dentre p~ nitrofenóxido, 2,4 dinitrofenóxido, e pentafluorfenóxido. Em uma submodalidade adicional, quando Rp-4 está protegido, ou seja, Z não é o hidrogênio, o processo da nona modalidade é mais direcionado para desproteger Rp-4 protegido. Em uma submodalidade adicional, a reação é conduzida em um solvente aprótico polar, tal como, tetraidrofurano ou outro solvente eteral seja um estando individualmente ou em combinação com outro ou com uma nitrila C2 a C7, tal como acetonitrila. 0 processo da décima modalidade compreende ainda 1) reagir (LG')P(0) (LG)?., em que LG, independente de LG', é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (LG1) P(0)(LG) (Ala-'Pr), seguido pela reação de (LG')P(0) (LG) (Ala-1Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura de C e C', (ii) fenol e uma primeira base para obter (LG')P(0) (LG)(OPh), seguido pela reação de (LG')P(0)(LG) (OPh), com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura de C e C', ou (iii) combinar isopropil-alanato, fenol e pelo menos uma base para obter uma mistura de C e C' , ou 2) reagir (PhO) (O) (LG) 2, em que LG, independente de LG', é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para a obtenção de (PhO)P(O)(LG) (Ala-'Pr), seguido pela reação de (PhO)P(O) (LG) (Ala-1 Pr) com um precursor dc grupo de saída e uma segunda base para obter uma mistura de C e C', C C' e submeter a mistura à cromatografia ou cristalizar a mistura para obter C'. Em um aspecto da nona modalidade, o isopropi1-alanato está presente como seu sal de ácido clorídrico, que é preferencialmente, substancialmente anidro.

Uma décima primeira modalidade é direcionada a uma composição obtida pelos processos recitados na sétima modalidade, oitava modalidade, nona modalidade ou décima modalidade bem como os seus respectivos aspectos. IJm aspecto da décima primeira modalidade é direcionado a uma composição obtida por qualquer uma das modalidades exemplificadas divulgadas abaixo. A composição assim obtida pode ser cristalina, tipo cristal, amorfa, ou uma combinação dos mesmos. A décima segunda modalidade é dirigida a um composto 3 3 em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio; que é útil para a preparação de Rp-4 ou Sp-4.

Um primeiro aspecto da décima segunda modalidade é selecionado dentre um composto tendo a seguinte estrutura Uma décima terceira modalidade é direcionada a um composto, seu sal, hidrato, solvato, ou combi.nação do mesmo, representado pelas seguintes estruturas C C em que LG' é um grupo de salda, que é útil para a preparação de Rp-4 ou Sp-4.

Em um primeiro aspecto da décima terceira modalidade, LG' é tosilato, canforsulfonato, um arilóxido, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo retirador de elétrons.

Em um segundo aspecto da décima terceira modalidade, LG 'é selecionado dentre p-nitrofenóxido, 2,1 dinitrofenóxido, e pentafluorfenóxido.

Uma décima quarta modalidade é direcionada para um análogo marcado isotopícamente de Rp-4 ou Sp-4. 0 termo análogo "marcado isotopícamente" se refere a um análogo de Rp-4 ou Sp-4 que é um "análogo deuterado", um " análogo marcado com 13C", ou um "análogo marcado com uC/deuterado". 0 termo "análogo deuterado" significa ura composto descrito neste documento, em que um isótopo-1!!, ou seja, hidrogênio (H) , é substituído por um isótopo-2H, ou seja, deutério (D) . A substituição de deutério pode ser parcial ou completa. A substituição parcial de deutério significa que pelo menos um hidrogênio é substituído por pelo menos um deutério. Por exemplo, para Rp-4 ou Sp-4, uma pessoa versada na técnica pode contemplar pelo menos os seguintes análogos deuterados parciais (em que "d,," representa número-n de átomos de deutério, como, por um grupo isopropil n = 1-7 , enquanto que para um grupo fenil, n = 1-5), bem como aqueles descritos abaixo.

Embora os grupos metil descritos acima sejam mostrados como sendo completamente deuterados, será reconhecido que variações deuteradas parciais também são possíveis, tais como, -CDH2 e -CD2H. As marcações isotópicas na furanose e base também são contempladas. Da mesma forma, os termos "análogo marcado com 13C" e "análogo marcado com 13C/deuterado " se referem a um composto descrito neste documento, em que o átomo de carbono é enriquecido com um isótopo-uC significado que o grau de enriquecimento excede a abundância natural usual cerca de 1,1%.

Exemplos Não se limitando por modo de exemplo, os seguintes exemplos servem para facilitar uma melhor compreensão da divulgação.

Aspectos sintéticos Δ fim de preparar o nucleosideo de ur.idina, pode-se tirar proveito de um intermediário de c.itid.ina tribenzoilada avançada na síntese de certos análogos diacilados de 3', 5'- de 3 (veja abaixo) já produzidos de forma eficiente em uma escala de planta piloto (ver WO 2006/031725 ou US 2006/0122146, ambos as quais sendo incorporados por referência em sua totalidade). 0 método a seguir foi verificado como sendo escalável e de custo-eficiente. 1 2 3 3' , 5' -0-dibenozil-2 ' -desóxí-2.' -f luor-2 ' -C-metil-N11 benzoilcitidi na (D 6 obtido por um método divulgado em WO 2006/031725 e WO 2008/045419 ambos os quais sendo incorporados por referência em sua totalidade. 1 é tratado com 70% de ácido acético aquoso para formar 3',5'-0-dibenozil-2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metil-uridina (2). Os ésteres de benzoíla podem ser hidrolisados por uma série de métodos, bem como, por exemplo, alcóxidos em solventes alcoólicos, tais como metóxido de sódio em metanol, carbonato de potássio em metanol, ou análogos de etanol, alqui lminas, corno a meti lamina em metanol, butilamina etc.. A arriônia metanól.ica foi escolhida para o trabalho em grande escala. 0 produto de uridina (3) pode ser pu r i Γ i cario por cristalização para produzir um rendimento de 70% cia citidina tribenzoilada (1).

Numerosos procedimentos da literatura detalham diferentes rotas e condições para preparar fosforamidatos usando equivalentes de reagentes de várias vezes. Veja, por exemplo, McGuigan et a].. J. Med. Chem. 2005, 4 8, 3504-3515 and McGuigan et al. J. Med. Chem. 2006, 49, 7215. Para o trabalho em escala de processo, há apenas um exemplo atualmente conhecido, que é divulgado em Lehsten et al., Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 819-822 ("Lehsten") . Nesta referência, os autores introduzem o conceito de um "procedimento rápido (one-pot)", no qual. um sal de cloridrato de aminoácido e diclorofosfato de fenila reagem em conjunto com N-meti1imidazol em diclorometano. Mais tarde, o nucleosideo é adicionado para formar o produto desejado 5'-O-fosforamidato, que no presente caso, produziría um composto representado pela fórmula 4, Infelizmente, o procedimento de Lehsten sofria de desvantagens. Por exemplo, o procedimento de Lehsten utilizava um excesso muito maior de reagentes do que era necessário que era somado ao custo e a dificuldade de purificação cromatográfica. Além disso, Lehsten sugeriu que se podería controlar a seletividade da reação de 5'-hid.rox.il sobre o 3'-hidroxil em comparação com uma referência da literatura através do uso de temperaturas mais baixas e adição lenta do nucleosideo. 4 5 6 ... .. r .,, 3' -0- fos forami dato 3',5'-bis-0- V -O-íosioramidato , „ , , •2 (2 diastereoisomeros) losroramidato ,. , . „ (4 diastereoisomeros) diastereoisomeros Usando o procedimento de Lehsten para os compostos aqui divulgados neste documento fornecido para diastereoisomeros de 31-0-fosforamidato 1-5% mono-substituídos (5) e cerca de 10-30% do produto bis-substituído (6). Como a polaridade dos 3'-diastereoisomeros era muito parecida com a dos 5'-diastereoisomeros desejados (4), a separação cromatográfica foi muito desafiadora. A ampliação do processo era quase impossível, sem descartar uma porção substancial dos 5'-diastereoisomeros menos polares (4) ou aceitar um maior nível de contaminação de 3'-diastereoisomeros (5). Em uma ampliação inicial de 50 g, o produto resultante continha uma contaminação de 3'-diastereoisômero (5) de cerca de 3%, que coeluíu com o monos polar do 5'-diastereromer (4). São divulgadas aqui condições de reação que usam menores quantidades de reagentes e um método para remover seletivamente a impureza de 3'-O-fosforamidato diastereoisomeros (5) com uma separação cromatográfica mais fácil, assim, proporcionando os diastereoisomeros de 5'-O-fosforamidato desejados com pureza muito maior (4).

Para a estequiometria do reagente, foi feito um estudo em que a estequiometria dos reagentes foi sistema11 carnenLe mudada e os resultados foram monitorados por RMN de f:ósforo da reação bruta como Lehsten havia relatado. Na mais bem-sucedida execução, o rendimento isolado e a pureza do produto desejado foram comparados. Observou-se que o 5'-hidroxil principal reage em uma taxa mais rápida do que o 3'-hidroxil secundário. Isso cria uma situação de competição entre o progresso da reação de consumo de todos os nucleosídeos de partida e conversão de produtos 5'- e 3'-monossubstituídos (4 e 5) para os produtos 5', 3'-bis substituídos (6). 0 produto 3'-monossubstituído se converte ao produto bis em uma taxa mais rápida do que o produto 5'-monossubstituído, então é possível reduzir o nível de contaminação de 3'-diastereoisômero empurrando a reação mais para os produtos bis-substituídos. No entanto, com uma forma eficaz para remover os 3'-diastereoisómeros, a reação pode ser otimizada para produzir mais do 5'-diastereoisômero desejado sem ter que sacrificar outro tanto de 5'-diastereoisômero sendo convertido para o bis-substituído (6) . Também foi observado que o cloridrato de aminoácido é muito higroscópico. Como qualquer água presente iria consumir uma quantidade equivalente do roagente diclorofosfato de fenila, cuidados devem ser tomados para manter o aminoácido substancialmente anidro ou o mesmo deve ser feito substancialmente anidro antes de usar. Em suma, Lehsten relatou que a razão ideal de aminoácidos para diclorofosfato de fenila para nucleosídeos foi 3,ò:2,5:l respectivamente. Verificou-se que a razão ideal de aminoácido para diclorofosfato de fenila para nucleosídeo de cerca de 1,6 a cerca de 1,3 a cerca de 1 é ideal sob condições nas quais o 3'-diastereoisômero pode ser eficientemente removido e quando o cloridrato de aminoácido é substancialmente anidro. Usando uma quantidade menor de reagent.es, uma economia de custos é realizada juntamente com uma simplificação da separação cromatográfica do produto desejado a partir de subprodutos reagentes e do nível reduzido de bis diastereoisómeros.

Em um procedimento alternativo, um derivado bloqueado 3'-hidróxi de 3 foi preparado usando um grupo de bloqueio de t-butildimetilsilil em duas etapas. Este foi então convertido para seu derivado 5'-fosforamidato. 0 desejo sendo que o grupo s.ilil possa então ser removido e não haja nenhum dos isômeros 3' (5) ou 3', 5'-bis fosforamidatos (6) . Uma abordagem semelhante foi demonstrada por Borch e Fries (Patente US 5.233.031) em um baixo rendimento global sobre um alquil fosforamidato.

Outra abordagem alternativa foi usar a síntese direta e, em seguida, usar a química para ajudar a diferenciar as impurezas de 3'-diastereoisômero 5 dos 5'-diastereoisómeros desejados 4 para ajudar a separação. Um grupo foi desejado o qual seletivamente reage com o hidroxil primário livre da impureza de 3'-0-fosforamidato 5 sobre o hidroxil secundário livre do 5'-0-fosforamidato desejado 4. Também era desejado que o grupo de bloqueio mudasse significativamente a polaridade do produto de 3 ' -0-fosforamidato bloqueado por 5'-0- resultante do 5'-O-fosforamidato desejado 4, Não havería nenhuma etapa extra necessária para remover o grupo de bloqueio na medida em que os 5'-diastereoisómeros desejados 4 não seriam mudados. Os 3'-diastereoisómeros quimicamente alterados permitiríam, então, a separação cromatográfica mais fácil ou separação por suportes sequestrantes especiais ou por extrações.

Especificamente, o grupo de bloqueio terc-butildimetilsilil (tBDMS) atendeu a esses critérios e foi o primeiro a ser demonstrado e posteriormente usado em uma escala de multiquilograma. Sob certas condições, tal como em piridina como solvente e base, o grupo tBDMS reage com alta seletividade na posição do hidroxil primário ao longo da posição de hidroxil secundário 3 ' . A reação de fosforamidato usa N-metilimidazol (NMI) como uma base. Na presença de NMI, a sililação é menos seletiva. Preferencialmente, a quantidade de NMI deve ser reduzida. Isso pode ser feito facilmente após ■ a reação de fosforamidato pela lavagem da reação com solução de ácido clorídrico IN. 0 NMI e o nucleosídeo de partida restante são removidos, deixando uma mistura bruta de produtos mono e bis substituídos e subprodutos reagentes. Este é então dissolvido em piridina e tratado com cloreto de terc-butiIdimetilsilil. 0 produto 3'-monossubstituído 5 é convertido em poucas horas ou menos para o 5'-O-tBDMS-3'-0-fosforamidato 7. 0 progresso de reação pode ser monitorado por HPLC. A polaridade deste produto sililado 7 é menor do que a do bis- fosforamidato 6 e é facilmente removido por crortiatografia. Usando este método, foi possível reduzir o nível de 3'-monofos foramidato 5 para menos que 0,1% do produto 5' 4 em comparação com 1-3% sem o tratamento com silil. Da mesma forma, o tratamento com cloreto de dimetóxitrifenilmetil (DMT-C1) nas mesmas condições funcionou bem. Também foi mais fácil identificar o produto de reação por de DMT por TLC como moléculas contendo DMT coradas com laranja brilhante sobre aquecimento ou exposição ao ácido. Pode-se também visualizar muitos outros grupos de bloqueio, como descrito acima.

Tanto as condições de reação quanto a limpeza da impureza 3'- são métodos gerais e poderíam ser aplicados a mais fosforamídatos de nucleosídeo com um 3' hidroxil livre. 0 grupamento de fosforamídato podería ser qualquer combinação de éster de aminoácido aromático e álcool. 0 grupamento de nucleosídeos podería ser qualquer nucleosídeos em que o fosforamidato a 5' levaria a uma 5'-monofosfato e podería ser ainda metabolizado para a forma d e 5 ' -1 r i f o s f a t o . 0 seguinte esquema é o esquema de reação principal ilustrado para fazer isopropil L-alanato fenil fosforamidato de 2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina com o produto maior como o 5'-0-fosforamídato desejado (4, dois diastereoisómeros) e o produto menor como o 3'-tifos f oramídato (5, dois diastereoisómeros) e 3',5'-bis-0-fosforamídato (6, quatro diastereoisómeros). Os reagentcs são adicionados nas razões estequiométrícas, conforme descrito no método da seção de preparação. A reação é deixada prosseguir até cerca de 5% do material de partida que permanece como julgado por visua 1 ização de UV em c rorna togra Γ i a de camada fina (TLC) . Além disso, UPLC/MS mostrou que aproximadamente 10% de 3',5' bis-fosforamídato 6 se formou em comparação com o produto-5'dcscjado. Após a extinção (quenching) e uma sequência de procedimentos do trabalho ácida aquosa, o resíduo bruto da camada orgânica foi preparado para a sililação. Nas condições de reaq:ão descrita, o grupo silil preferencialmente reagiu com o 5'- hidroxil livre de 3'-O-fosforamidato para formar 7, A reação foi mantida até que o 3'-O-fosforamidato já não era detectável por UPLC/MS. 4 7 6 3' -O-í'oslOroamidato-5' -O-IBDMS (2-diastereoisôme coa) Depois de trabalhar até a reação de siiiiação, o produto desejado é submetido a cromatografia em sílica gel e é eluido com um gradiente de metanol em diclorometano (1- 4%). Ο 5'-monofosforamidato desejado 4 elui mais tarde. Método de Preparação Exemplo 1 . Preparação de 2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina (3) Em um frasco de 10 L, foi adicionado 3',5'-0-dibenozil-2 ' -desóxi-2 ' -fluor-2 ' -C-metil-N'1 benzoilcitidina (500 g, 0, 874 mol) e ácido acético aquoso 70% (7,5 L) . A

solução foi aquecida sob refluxo (110°C) por 20 h. 0 TLC indicou uma reação completa (Rf 0,6 em metanol 5% em diclorometano (DCM)). A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e diluída com água (2 L). Após agitação por 2 h, o precipitado resultante foi coletado por filtração eo sólido foi lavado com água (5 L) e seco na atmosfera a temperatura ambiente por 12 h para produzir 360 g (88%) . Este intermediário díbenzoiluridína foi. usado diretamente na próxima etapa, adicionando-o todo à amônia metanólica preparada na hora (5,4 L, ca 25%) a 0 0 C. Esta temperatura foi mantida por 3 h e, em seguida, deixando aquecer a 15°C por 24 h. 0 TLC indicou uma reação completa (Rf 0,4 em metanol 10% em DCM) . A mistura foi filtrada através de um leito Celite e concentrada sob pressão reduzida para gerar o produto bruto (216 g) . 0 produto bruto foi agitado com acetato de etila (325 mt) por 3 h à temperatura ambiente. O sólido resultante foi. coletado por f:il. tração e lavado com acetato de etila (216 mL) . O sólido fo:i seco sob vácuo à temperatura ambiente por 4h para produzir 160 g (78%) do produto desejado em 98,7% de pureza por HPLC. JH-RMN (DMSO-d6) δ 11,44 (br s, 1H, NH) , 7,95 (d, 1H, C-6H) , 5,97 (d, 1H, C-1'Η), 5,64 (d, 1H, C-5H) , 3,84-3,77 (m, 3H, C-5'-Ha, C- 3' H. C-4'Η), 3,63-3,60 (m, 1H, C5'-Hb), 1,23 (d, 311, C-2 ' - CH3) . ES-MS M-l 25 9.

Exemplo 2. Preparação de éster isopropilico de ácido (S)-2-{[(IR,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l-yl)-4-(R)-fluor-3-hidroxi-4-metil-tetraidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propiônico (4).

Sinônimo: mistura diastereoisomérica de 5'-0- (Isopropil-L-alanato, fenil fosforamidil)-2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metil-uridina Um frasco de 3 pescoços de 5 L foi equipado com um agitador mecânico, banho de gelo em salmoura, termômetro interno, e uma atmosfera de nitrogênio. 0 frasco foi carregado com hidrocloreto de éster de L-alanina isopropilico (82,0 g, 0,490 moles) e diclorometano anidro (0,80 L). Enquanto isso estava sob agitação, diclorofosfato de fenila (85,0 g, 0,40 moles) foi adicionado em um lote e agitado. Mantendo a temperatura interna entre -5 a 5°C, uma solução de N-metilim.idazol (NMI, 250 g, 3,07 moles) em diclorometano (250 mL) íoi adicionada por um período de meia hora. A solução foi deixada agitar por 1 h nesta faixa de temperatura. 2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metil-uridina (3, 80,0 g, 0,307 moles) foi adicionado a 0°C em uma porção e, em seguida, o frasco de reação foi deixado aquecer lentamente em banho de salmoura. Em 1 h, a temperatura .interna era de até -2°C. O Ti.C (metanol 5% em DCM) cm 1 h mostrou que mais de 50% dos nucleos.í deos foi consumido. 0 banho foi removido e o frasco de reação atingiu a temperatura ambiente durante 1 h mais. O TLC após 3 h o em 5 h Lotais mostrou que 95% dos nucleosídeos de partida foram consumidos. A mistura reacional foi extinta po.l.a adição de metanol (100 mL) e agitação da reação por: 5 minutos . A mistura reacional foi lavada com HC1 IN (2 X 500 mL) , seguido por solução saturada de bicarbonato de sódio (2 X 500 mL) . A camada orgânica separada foi seca sobre sulfato de sódio anidro (50 g) e filtrada. A solução foi evaporada sob pressão reduzida e então em alto vácuo à secura para gerar o produto bruto como um óleo viscoso (170 g) . As RNMs do produto bruto (3JP e 1H) foram tomadas. O 31P-RMN indicou cerca de 1% da integração do fósforo total foi devido à presença do isômero 3' 5.

Para o produto bruto foi adicionado piridina anidra (1700 mL) . 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida e então em alto vácuo, a fim de reduzir o teor de água da mistura bruta através de coevaporação. O óleo resultante foi redissolvido em piridina anidra (500 ml) e, em seguida, foi adicionado cloreto de t-butil dimetilsilil em excesso (9,0 g, 60 mM). A reação foi agitada à temperatura ambiente. 0 progresso da reação foi monitorado por UPLC/MS. Após 3 horas, impureza 3' 5 já não podia ser detectada e a reação foi extinta pela adição de metanol (50 mL). A reação foi evaporada sob pressão reduzida a um óleo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila (1,5 L) e lavado com 1-1 Cl IN (2X 500 mL) , seguido por solução saturada de bicarbonato de sódio (2 X 500 mL) . A camada orgânica fo.i. seca sobre sulfato de sódio anidro (50 g), filtrada e evaporada sob pressão reduzida para gerar: o produto bruto como um óleo amarelo pálido. O óleo bruto foi diluído com o mesmo volume do diclorometano e carregado em um cartucho de 2,5 kg do sílica gel em um módulo de compressão radial a 1 00 psi de pressão de ar. Usando uma bomba de gradiente a 60 psi e uma vazão de 4 00 mL/min, o cartucho foi lavado com cloreto de metileno (4L), seguido por um gradiente de 1-4% de metanol em cloreto de metileno (48 L) . Maior parte das impurezas maiores (di- (isopropilai! arri .1 ) fenil fosfato, 3 ' , 5 ' -bis fosforamidato (6), aduto de 3'-5'-fosforamidato TBDMS (7)) foi eluída com gradiente de ~ 3%. 0 produto desejado foi eluído entre 3 e 4% de metanol. As frações contendo o produto foram classificadas em dois lotes. A primeira continha quantidades pequenas de impurezas superiores e o último foi o produto puro. O primeiro conjunto de frações continha pequenas quantidades de impurezas menos polares (impurezas superiores) como o 3', 5'-bis fosforamidato e o di-alanilfenil fosfato e principalmente o diastereoisômero Rp e exigiu uma segunda coluna de purificação. (Δ terminologia relativa, superior versus inferior se refere à eluição em cromatografia de sílica gel de fase normal, em que o "isôrnero superior", significa o primeiro isômero de eluição.) . 0 segundo conjunto de 1 rações não teve uma quantidade significativa de impurezas, apenas o RP restante e principalmente os diasterereomers SP. 0 mesmo foi depois recombinado duas vezes com as frações de colunas. O solvente foi evaporado sob pressão reduz i.da e a espuma branca resultante foi ainda mais seca (0,20 rnmllg) por 1 h para gerar 42 g do lote impuro (isômero superior versus inferior 4:1 com base em i]P-RMN) e 38 g dc lote puro (isômero superior versus inferior 1:3) . O lote impuro foi recolocado na coluna de forma semelhante para gerar 3,8 q de 97% de isômero puro superior (fração desprezadas) e 36 g do produto puro em uma razão de 4:1. Os dois principais lotes foram dissolvidos em DCM, combinados, evaporados sob pressão reduzida e secos (50°C, 0,2 mmHg, 24 h) para obter 74 g (45,7%) do produto puro 4 com uma razão diastereomérica de 48:51, como uma espuma branca, pf (ponto de fusão) de cerca de 75-85°C. A fim de produzir um sólido amorfo da mistura diastereomérica, 74 g da espuma branca foram agitados com t-butil éter metilico (750 mL) , resultando em uma solução parcial e um resíduo sólido de goma. Enquanto agitando, os heptanos (750 mL) foram adicionados lentamente e a suspensão foi mecanicamente agitada por 1 hora até que a maioria da goma foi convertida em um sólido branco. 0 sólido foi raspado com urna espátula e a lama resultante foi filtrada. O sólido foi lavado com heptanos (4 X 50 mL) e seco sob vácuo (50°C, 0,2 mmHg, 24 h) para gerar um pó branco, amorfo (64 g) com uma ampla faixa de fusão de cerca de 7 0-8 0 °C . lH e 31P RMN conformados com a estrutura e HPLC mostraram uma pureza de 99,8% com uma razão diastereomérica de 46:54 (também confirmado por ^P RMN). Método alternativo para fazer mistura sólida de 4. Depois da cromatografia, o residuo foi coevaporado duas vezes com diclorometano (5 ml,/g) e seco por 2 4 horas a 35-40°C em 35-45 mTorr. O resíduo de espuma foi peneirado através de uma tela de 250 mícrons e adicionalmente seco nas mesmas condições até que o diclorometano residual ficou aba ixo de 4 00 ppm como medido pelo headspace GC. O pó amorfo branco para esbranquiçado resultante tem uma faixa de temperatura de transição vítrea de 53,7-63,5°C.

Caracterização da mistura de isômeros (4) : Ll-NMR (CDC13) δ 10,05 (br s, 1H, NH, S?) , 10,00 (br s, 1H, Níl, Rv) , 7,49 (d, 1H, C6-H, SP), 7,36 (m, 5H, C6-H, RPr aromatic ), 7,23-7,14 (m, 6H, RP/SPr aromatic), 6,18 (br d, 2H, Cl ' - H, RB/Sp) , 5,63 (d, 1H, C5-H, SP) , 5,58 (d, 1H, C5-H, RP) , 5,01 (m, 2H, CJ7- (CH3) ;>, RP/SP), 4,46-4,33 (m, 8H, C-5'-H2, ala-NH, C3'-OH, RP/SP) , 4,12 (m, 2 H, ala-C/l-CH3, RP/SP), 4,01-3,85 (m, 4H, C3'-H, C4 '-H, RP/SP), 1,39-1,22 (m, 12H, all CH3, Rp/Sp) . J1P-RMN (CDC13) δ 3,60 (RP), 3,20 de Sp em relação ao t:rí fenilfosf ato em -17,80 ppm. ES-MS M+l 530,2. Análise elementar: % calculada (incluindo 0,29% de água como encontrado por análise de Karl Fisher) C, 4 9,75; H, 5,54; N, 7,90, F, 3,58, P, 5,84, Found %: C, 49,50; H, 5,44; N, 7,85; F, 3,62; P, 6,05.

Discussão sobre a separação de isómeros O Composto 4 devido à quira11 dade em fósforo é composto de dois diastereoisômeros, que são designados como Sp-4 e Rp-4. A atribuição estereoquímica foi feita com base na análise de raios-X de cristal único de Sp-4. Ambos os Sp-4 e Rp-4 geraram produto cristalino.

Os procedimentos para a cristalização são descritos abaixo.

Sp-4 Rp-4 Exemplo 3. Cristalização do isômero Rp-4. A fração de cromatografia contendo a primeira eluição, isômero Rp-4 menos polar (3,8 g, 97% de pureza) foi dissolvida em isopropanol (36 g) e diluída com até heptanos até turvaçáo (72 g) . A solução foi semeada e agitada à temperatura ambiente por 5 h. 0 sólido resultante foi coletado por filtração a vácuo, lavado com heptanos (2x20 mL) e seco (50°C, 0,2 mm, 24 h) para gerar 2,3 g de agulhas brancas muito pequenas de pf 136, 2-137,8 °C. A pureza por HPLC do material resultante foi encontrada como sendo de 99,02%. RP-4: ]H-NMR (C0C13) δ 9,10 (br s, III, NII) , 7,36 (m, 2H, o-aromático) , 7,26-7,16 (m, 4 H, C6-H, m,p-aromático) , 6,16 (br d, 1H, Cl'-H), 5,58 (d, 1H, C5-H) , 5,01 (sept, 1H, CH- (CH3 )2), 4,52-4,47 (m, 2H, C-5'-H:,), 4,10 (d, 1H, C 3'-H) , 4,02-3,76 (m, 4H, ala-NH, C3'-OH, C4'-H, ala-CH- CH3) , 1,37-1,20 (m, 12H, todos os CH3) .

Exemplo 4. Preparação e cristalização de Sp-4. Método 1 : precipitação direta a partir de bruto 4 : para uma solução agitada de hidrocloreto de éster de L-alanina isopropílico (10,5 g, 61,5mmol, azeotropicamente seca, duas vezes, com 50 mL de tolueno de cada vez) em diclorometano (100 ml,) foi adicionado f enydiclorof osf a to (7,5 mL, 50 mmol) à temperatura ambiente. A mistura foi resfriada a -10°C e, em seguida, foi adicionada uma solução de NMI (30,5 mL, 384,3mmol) em 30 mL de diclorometano durante um período de 30 min. Após o término da adição, a mistura foi agitada entre -10 e -15°C e por lh. Para a mistura acima foi adicionado 2 ' -desóx.i-2 ' - Π uo:r-2 ' -C-metiluridina (3) (lOg, 38,4 mmol) em um lote e a mistura foi agitada abaixo de -10 °C por 3h e, em seguida, lentamente deixada aquecer a 2 0 °C (6h) . 7\ mistura foi agitada a essa temperatura durante a noite (15h) e depois extinta com 10 mL de metanol. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi redissolvido em AcOEt (200 mL) . A camada de AcOEt foi lavada com água (100 mL) , HC1 IN (3x75 ml.), solução aquosa de NaHC03 2% (50 mL) e salmoura (50 mL) . A camada orgânica foi seca sobre Na2SÜ4, f.i 1 f rada e concentrada. O resíduo foi seco sob alto vácuo por 2h para gerar espuma branca (22 g). A espuma acima foi dissolvida em 33 mL de DCM e, em seguida, foram adicionados 65 mL de IPE (éter isopropilico) para gerar uma solução saturada. A solução foi filtrada através de uma pequena almofada de celite e o filtrado foi agitado com sementes de Sp-4 por 72h à temperatura ambiente (cerca de 22°C - nota que o resfriamento da suspensão a 0°C tornou oleoso o produto bruto) . 0 sólido branco fo.i filtrado, lavado com IPE (20 mL) e seco para gerar 4,S8g (-mistura 85:15 de Sp-4: Rp-4, respectivamente, como determinado por J1P RMN) de um pó branco. 0 sólido acima foi suspenso em 23 mL de DCM e depois refluído por 3h. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e agitada por 15h. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com 4,5 mL de DCM frio e seco sob alto vácuo a 45 °C para gerar Sp-4 puro, de pf 93, 9-104,7 °C, pureza por 1-IPLC de 99,74% (3,llg, 15,2% do nucleosídeo de uridina). SP-4 1H-NMR (CDCla) δ 8,63 (br s, 1H, NH) , 7,47 (d, 1H, C6-H) , 7,30 (m, 211, o-aromático ), 7,26-7,18 (m, 3H, ffl,p-aromáti co) , 6,18 (br d, 111, Cl'-H), 5,70 (d, 111, C5- H) , 5,02 (sept, CW-(CHj)x), 4,53 (m, 2H, C-5'-Hz), 4,11 (d, 1H, C3' -H) , 3,97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-ll, ala-CH-CH3) , 3,77 (br s, 1H, ala-NH) , 1,39 (d, 3H,C2'-CH3), 1,37 (d, 3H, ala-CH3), 1,24 (d, 6H, CH-(CH3)2). Método 2: oleosldade do bruto 4: uma solução agitada de hidrocloreto de éster de L-alanina isopropilico (20,6 g, 123mmol, azeotropicamente sec, duas vezes, com 75 rnh do tolueno de cada vez) em diclorometano (200 mL) fo.i adicionado fenildiclo.ro fosfato (14,9 mL, lOOmmol) em temperatura ambiente. Δ mistura foi resfriada a -10°C e, em seguida, foi adicionada uma solução de NMI (61,3 mL, 769mmol) em 60 mL de diclorometano durante um período de 30 min. Após o término da adição, a mistura foi agitada entre — 10°C e -15°C por lh. Para a mistura acima foi adicionado 2’-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina (3) (20g, 76,9 mmol) em um lote e a mistura foi agitada abaixo de -10 ° C por 3h e em seguida, lentamente deixada aquecer a 20°C (6h) . Δ mistura foi agitada a essa temperatura durante a noite (15h) e, em seguida, extinta com 10 mL de metanol. 0 solvente foi evaporado e o resíduo foi redissolvido em AcOEt (400 mL) . Δ camada de AcOEt; fo.i lavada com água (200ml), HC1 IN (3x100 mL) , solução aquosa NaHCCq 2% (100 mL) e salmoura (50 mL) . A camada orgânica foi seca sobre NazSCb, filtrada e concentrada. 0 resíduo foi seco sob alto vácuo por 2h para gerar espuma branca (43 g) . A espuma acima foi dissolvida em 8 6 mL de AcOEt em dois frascos de fundo de 2 pescoços equipado com um agitador mecânico.

Enquanto agitando, 100 mL de heptano foram adicionados lentamente e a suspensão foi agitada por lh. A camada superior foi decantada o o resíduo foi novamente agitado com 50 mL de soluções de AeOEt./heptano 2:3 por 10 min e depois decantada. O resíduo foi seco sob alto vácuo para gerar espuma branca (31q). A espuma acima foi dissolvida em 4 6 ml, de D CM e, em seguida, foram adicionados 95 mL de IPE para gerar uma solução saturada. A solução foi filtrada através de uma pequena almofada de celite e o filtrado foi agitado corrí sementes de Sp-4 por 72h à temperatura ambiente. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com IPE (30ml) e seco para gerar 7,33g (~ mistura de Sp-4: Rp-4 85:15, respectivamente, como determinado por 3LP RMN) de pó branco. 0 sólido acima foi suspenso em 3 6 rnL de DCM e, em seguida, refluído por 3h. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e agitada por 15h. 0 sólido branco foi filtrado, lavado com 7,5 ml, de DCM frio e seco sob alto vácuo a 45°C para gerar > 99% de Sp-4 puro, (4,78g, 11,6% do nucleosideo de uridina). Método 3: carga de sílica gel de bruto 4: 5,0 g do bruto 4 foi produzido da mesma maneira que a mistura de diastereoisómeros logo antes da etapa de cromatografia de coluna que começa com cerca de 2,5 g de 2'-desóxi-2'-fluor-2' -C-metiluridina (3). O bruto foi dissolvido em 10 mL de DCM e 10 g de sílica gel foram adicionados à solução. O solvente foi evaporado para gerar lama seca. A lama foi agitada com 40 mL de AcOElt / hexano 50% por 15 min e depois filtrada. A sílica gel foi então lavada com 10 mL adicionais de AcOEt / hexano 50%. A sílica gel foi lavada com MeOH /DCM 15% (100 mL) e colhida separadamente. O solvente foi evaporado e seco sob alto vácuo para gerar 4,0 g de resíduo (de espuma) . O resíduo foi dissolvido em DCM (6ml) e, em seguida, foi adicionado ~ 9ml de IPE para fazer uma solução saturada. A mistura foi. então agitada suavemente durante a noite com sementes do Sp-4 à temperatura ambiente. O sólido branco foi filtrado e lavado com IPE (5 ml) para gerar 1,28 g de produto. 31P RMN revelou que o produto acima contém mistura de Sp-4: Rp-4 77:23, respectivamente. Este foi recristalizado de 20 mL de DCM para obter 0,75 g de > 99% de Sp-4 puro (cerca de 12% do nucleosideo de uridina) . Esta preparação de Sp-4 não exige a etapa de sililação tal como feito para a mistura, de modo que o procedimento inteiro de reação é mostrado acima. Aspectos das formas poJ.imórficas e cristalina única de Sp-4 são apresentados abaixo. Método 4: 40,0 g da mistura 1:1 de 4 foram dissolvidos em 90 mL de diclorometano. Diisopropiléter (70 mL) foi adicionado à solução acima para gerar uma solução saturada. (A quantidade de éter diisopropilico pode variar de acordo com a pureza do produto.) A solução foi semeada com Sp-4 puro (> 99%) e a mistura foi agitada suavemente com uma barra de agitação em temperatura ambiente por 20h (a formação de sólidos foi observado após 2h) . 0 sólido foi. filtrado, lavado com 40 mL da mistura de diisopropiléter / diclorometano (1:1) e seco para gerar sólido branco (16,6 g, 89,35% de Sp-4 puro por RMN) . Este sólido foi suspenso em 83 mL de diclorometano e refluxado por 3h. A suspensão foi resfriada à temperatura ambiente e agitada durante a noite. 0 sólido fo:i filtrado e lavado com lOml de DCM frio. 0 sólido foi seco sob vácuo para gerar Sp-4 (13,1 g, 99,48% puro por IIPLC) . llg deste sólido foram red i ssolvidas em 330 mL de DCM em condições quentes. A solução foi resfriada à temperatura ambiente e mantida a esta temperatura durante a noite. 0 produto cristalino foi filtrado e seco para gerar 10,5 g de Sp-4 (99,74% por HPLC).

Os compostos Sp-4 e Rp-4 podem, alterna L i varnen fc, ser preparados de acordo com a nona ou décima modalidade, pola reação de núcleos ideos (protegida ou não) 3 com um isopropil-alanil-fosforamídato (mistura de C e C', C ou C'), como mostrado na seguinte equação. 3 P.D. Howes et ai. Núcleos ides, Nucleotides & Nuclelc Acíds 2003, Vol. 22, Nos. 5-8, pp. 687-689 ("Howes") divulga 2'- e 5'-fosforamidatos obtido por uma reação com cloreto de t-butil magnésio. Lá, Howes revela que quando um nucleosídeo 3'-desóxi-citidina é reagido com metil éster de ácido (S)-2-[cloro-fenóxi-fosforilamino] propiônico na presença de 1,2 equivalentes de cloreto de t-butil magnésio, a fosforilação seletiva sobre a pos.ição-2' ocorreu, mas com que um equivalente adicional de fosforilação seletiva de cloreto de t-butil magnésio na posição-5'ocorreu. Esta divulgação deve ser contrastada com a que está divulgada no Esquema 1.

Exemplo 5-1. Preparação de éster isopropilico de ácido (S)-2-[(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico Δ uma solução de 4-nitrofenil fosforodiclor.i dato 12,8g, 50 mmol) em diclorometano (100 mL) foi adicionada uma solução de fenol e trietilamina (7,7 mL, 55 mmol) cm diclorometano (100 mL) a -78°C durante um perido de 20min. A mistura foi agitada a esta temperatura por 30 min. e, em seguida, transferida para outro frasco de fundo redondo contendo hidrocloreto de éster de L-alanina isopropílico (8,38g, 50mmol) em diclorometano (100 mL) a 0°C. À mistura foi adicionada a segunda porção de trietilamina (14,6 mL, 105 mmol) durante um período de 15min. A mistura foi agitada a 0°C por lh e, em seguida, o solvente foi evaporado. 0 resíduo foi triturado com acetato de etila (150 mL) e o sólido branco foi filtrado para fora. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar óleo amarelo pálido. 0 composto bruto foi cromatografado usando gradiente de acetato de etila/hexanos 0/20% para gerar o produto (17g, 83% de rendimento) corno uma mistura de diastereoisômeros na razão de cerca de 1:1. 31P NMR (162 MHz, DMSO~d6): δ -0,31, -0,47; 'H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,31-8,27 (m, 2H) , 7,51-7,37(m, 4H) , 7,27-7,19 (m, 3H), 6,70-6,63(m, 1H), 4 , 85-4,78(m, 1H), 3,97-3,86(m, 1H) , 1,21- 1.19 (m, 3H) , 1.11-1.09 (m, 6H) ; MS (ESI) m/z 407 (M-l) + . 31P NMR (162 MHz, CDC13) : δ -2,05, -2,10; ΧΗ NMR (400 MHz, CDC13) : δ 8,22 (d, J - 9,2Hz, 2H) , 7,41 -7,33 (m, 4H), 7,26- 7,18(m, 3H), 5,05-4,96(m, 1H), 4,14-4,05(m, 1H), 3,93- 3,88 (m, 1H) , 1,38 (d, J = 6,8Hz, 3H) , 1,22 (dd, J = 6,2 & 3,0Ηz, 6H) ; MS (ESI) m/z 4 07 (M-l)-t-.

Exemplo 5-2. Preparação de SP-4/RP-4. A uma solução agitada de l-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidróxi-5-hidróximetii-3-metil-tetraidro-f uran-2-.i. 1) -1H-pirimidina-2, 4-diona (130mg, 0,5mmol) em THF seco (l,5ml,) foi adicionada uma solução 1 M de tercloreto de t-buti I. magnésio (l,05mL, l,05mmol, 2,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 5min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico de ácido ( S)-2-[ ( 4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforílamino] propiônico (mistura de isômeros 1:1, 408mg, Immol) em THF’ (l,5mL) foi adicionada gota a gota durante um período de 5min. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 48h e, em seguida, extinta com NH4CI aquoso saturado (20mL). A mistura foi dividida entre acetato de etila (50mL) e água (20mL). 0 extrato orgânico combinado foi seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido. A cromatografia de coluna do resíduo usando gradiente de MeOH/diclorometano 0-2% gerou um sólido espumoso branco (125mg, 47% de rendimento, mistura de Sp-4/Rp-4 em cerca de razão de 3,05: 1,0) .

Exemplo 6. Preparação e isolamento não cromatográfico de éster isopropílico de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico Hidrocloreto de éster de L-alanina isopropílico (330 g, 1,97 mol) foi pré-seco por coevaporação com tolueno (2 x 400 ml) sob pressão reduzida o, em seguida, seco em um forno a vácuo (50°C, 0,2 mmHg, 17 h). A uma solução agitada de 4-nitrof eni.l fosforodiclorida to (500,0 g, 1,953 mol) em diclorometano anidro (3,0 L) foi adicionada uma solução de fenol (183,8 g, 1., 953 mol) e trieti lamina (300 mt, 2,15 mol) em diclorometano (900 mL) a -60°C de temperatura interna durante um período de 3 horas. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30 min adicionais o, cm seguida, deixada aquecer até -5°C durante 2,5 horas. The éster de aminoácido pré-seco foi adicionado a -5~0°C sob uma atmosfera de nitrogênio durante 10 mins. O resíduo de sal de aminocster no frasco de adição foi transferido para a mistura reacional via rinsagem com diclorometano (2 x 100 mL). A mistura foi agitada a 0°C por 40 mins e uma segunda porção de trietilamina (571 mL, 4,10 mol) foi adicionada durante um período de 4 0 mins a 0°C. A mistura foi agitada a 0~10°C por 3 h e então o sólido branco (hidrocloreto de trietilamina) foi filtrado e rinsando com diclorometano (3 x 300 mL) . 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com metil t-butil éter (MTBE, 4 L) . 0 sal de sólido adicional assim formado foi filtrado e rinsado com MTBE (3 x 150 mL) . 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar óleo de cor marrom luminoso claro. 0 resíduo foi. coevaporado com hexanos (2 x 140 mL) para remover qualquer MTBE residual e ainda seco sob vácuo 40°C por 2 horas. 0 resíduo seco foi misturado com éter diisopropílico (IPE, 1,1 L) e agitado a 5 °C em um banho de gelo-água. Pequenas quantidades de sementes de cristal do Sp-isômero desejado do produto foram adicionadas à solução e a mistura foi agitada a 5°C por 22 h para formar um meio de lama espessa. Esta foi deixada agitar em um refrigerador (— 10 ° C) por 44 h. O produto precipitado foi coletado via filtração e rinsado com solventes misturados pré-resf r.iados dc IPE e hexanos (1:1, 3 x 190 mL) . O sólido foi seco sobre vácuo (0,5 mm Hg) a temperatura ambiente até que um peso constante foi obtido para gerar 227,23 g (rendimento: 28,5%) como um sólido em pó branco. A razão dos dois diastereoisômeros SP:RP foi 9,65/1 com base em 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6, δ -0,31 (SP), -0,47). Ο produto foi rescritalizado por dissolução em IPE (840 mL) enquanto aquecendo em um banho de 60°C. A solução acima foi agitada a temperatura ambiente porl h e, em seguida, uma pequena quantidade de sementes de cristal de Sp isômero foi adicionada. Sólido em pó branco foi formado dentro de 2 horas e o frasco foi armazenado em um refrigerador (~10°C) por 16 horas. Um sólido cristalino fino e branco obtido foi filtrado, lavado com IPE (3x 50 mL) pré-resf riado e seco sobre vácuo (ambiente, 0,5 mm Hg) para um peso constante para gerar um sólido leve branco (177,7 g, 22% de rendimento global ou 44% de rendimento global com base no rendimento teórico do isômero SP) com razão diastereoisomérica de 48/1 com base em P-RMN. Mp 62-66°C. 31P KMN (162 MHz, DMSO-d6) : δ -0,31; ΧΗ RMN (400 MHz, DMSO~d6) : δ 8,30-8,27 (m, 2H) , 7,49 (d, J=8,8Hz, 2H), 7,41- 7,37 (m, 2H) , 7,23-7,19 (m, 3H) , 6,66 (dd, 0==13,6, 10,0Hz, 1H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,97-3,86 (m, 1H), 1,19 (d, J=7,2Hz, 311) , 1,10 (d, J=6,4Hz, 6H) ; 31P KMN (162 MHz, CDC13) : δ -2,05; (162 MHz, DMSO-d6): δ -0,31; XH RMN (400 MHz, CDC13) : δ 8,22 (d', J=9,2Hz, 2H), 7,41-7,33(m, 4H), 7,26-7,18(m, 3H), 5,05-4,96(m, 1H), 4,14- 4,05 (m, 111), 3, 93-3,88 (rn, III), 1,38 (d, J = 6,8Hz, 3H) , 1,22 (dd, J-6,2 & 3,0 H z, 6H); Ul RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,30-8,27 (m, 2H) , 7,49 (d, J 8,8:lz, 2H) , 7,41-7,37 (m, 2H), 7,23-7,19 (m, 311), 6,66 (dd, J==13, 6, 10,0Hz, 1H) , 4,86-4,78 (m, 1H) , 3,97-3,86 (m, 1H) , 1,19 (d, J=7,2Hz, 3H) , 1,10 (d, J= 6, 4 Η z , 6Ή) . MS (ESI) m/z 407 (M-l)1. A estequiometria de 8 (Sp-.isômero) foi confirmada por cristalografia de raios-X de cristal único, ver detalhes fornecidos abaixo.

Exemplo 7. Separação de mistura distereoisomêrica de éster isopropilico de ácido (S)-2-[(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico por SFC

Uma amostra de mistura de diastereoisômeros (4,8 g) enriquecida com o 2RP-isômero foi. submetida a SFC usando uma coluna ChiralPak AD-H (2x15 cm) e eluida com isopropanol 35% em dióxido de carbono a 100 bar. Um carregamento de injeção de 4 mL de amostra a uma concentração de 17 mg/mL de metanol foi usado. O isômero- RP de éster isopropilico de ácido [(S)-2-[(R)-(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico] foi eluído primeiro. As frações apropriadas de corridas múltiplas foram combinadas e concentradas sob pressão reduz, ida para gerar 2,9 g do /!P-i sôrnero de éster isopropilico de ácido [(S)-2-[(R)-(4-nitro-fcnóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico] como um óleo viscoso amarelo luminoso e 1,9 g do Sp-isômero de éster isopropilico de ácido [(S)-2-[(S)-(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico] como um sólido branco. Os dados analíticos do Rp-ísômero são semelhantes ao produto isolado pelo método de cristalização acima.

Dados analíticos para éster isopropilico de ácido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (8, i\j>-isômero) : ;ílP RMN (162 MHz, DMS0-d6): ò -0,47; ]H RMN (400 MHz, DMS0-d6) : δ 8,30-8,27 (m, 2H) , 7,4 6-7,38 (m, 4H), 7,27-7,20 (m, 3H), 6,68 (dd, J=13,8, 10,2Hz, 1H), 4,86-4 , 77 (m, 1H), 3, 97-3,86 (m, 1H) , 1,20 (d, 0-7,2Hz, 3H), 1,10(dd, 0-6,2, 2,2Hz, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-ü) ' .

Exemplo 8-1. Preparação de racêmico de éster isopropílico de ácido 2-[(4-cloro-fenóxi)-fenóxi- fosforilamino] propiônico (±): A uma solução agitada de 4-cloro-fenil fosforodicloridato (2,45g, 10,0 mmol) em diclorometano (20 mL) foi adicionada uma solução de fenol (0,94 g, 10 mmol) e trietilamina (1,56 mL, 11 mmol) em diclorometano (20mL) a -78 °C durante um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30min o, em seguida, transferida para um outro frasco redondo contendo Hidrocloreto de éster de L-alanina isopropílico (1,67 g, 10 mmol) em diclorometano (50 mL) a 0°C. Para a mistura foi adicionado o segundo lote de trietilamina (2,92 mL, 21 mmol) durante um período dc 15min. A mistura foi agitada a 0°C por Ih e, em seguida, o solvente foi evaporado. O resíduo foi triturado com acetato de etiia (30rnL) e o sólido branco foi filtrado para fora. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar óleo amarelo pálido. 0 composto bruto foi. cromatografado usando 10-20% de gradiente de acetato de etila/hexanos para gerar produto (2,0 g, 50% de rendimento) como uma mistura de dias tereoisômeros em cerca de 1:1 de razão. 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -1,58, -1,62; ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) : δ 7,06-7,51 (m, 811), 7,15-7,28 (rn, 2H) , 7,29- 7, 4 7 (m, 2H) , 4,0-4, 10 (rn, 1H), 3, 82-3,88 (m, 311), 1,35-1,36 (dd, 6H) ; 1,19-1,22 (m, 3H). MS (ESI) m/z 398 (M-1 ) ' . O produto resultante foi purificado por extração, cristalização, ou cromatografia, como observado acima.

Exemplo 8-2. Preparação de (S)-Isopropil 2- ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-il)- 4-fluor-3-hidróxi-4-metiltetraidrofuran-2 il)metóxi)(fenóxi)-fosforilamino)propanoato (4). A uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidróxi-5-hidróximetil-3-metil-tetraidro-furan-2-i 1) - .1 H-p.i rimidina-2,4-d lona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THE seco (50 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t- butil magnésio (12,4 mL, 21 mmol, 2,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de racêmico de éster isopropilico de ácido (2 —· [(4 — cloro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (4,08g, lOmmol) em THE (15mL) foi adicionada gota a gota durante um período de lOmin. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 72h. Co-corante de TLC com o produto autêntico mostrou cerca de 5% do produto desejado tinha formado em comparação com o nucleosídeo de partida.

Exemplo 9-1. Preparação de racêmico de éster isopropilico de ácido 2-[(2-cloro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (±). A uma solução agitada de 2-cloro-fenil fosforodicloridato (9,8 g, 40 mmol) em diclorometano (80 mL) foi adicionada uma solução de fenol (3,76 g, 40 mmol) e trietilamina (6,16 mL, 44 mmol) em diclorometano (80 mL) a -78 °C durante um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30 min e, em seguida, transferida para um outro frasco redondo contendo Hidrocloreto de éster de L-alanina isopropilico (6,7 g, 40 mmol) em diclorometano (150 mL) a 0°C. Para a mistura foi adicionada a segunda porção de trietilamina (11,6 mL, 84 mmol) durante um período de 15 min. A mistura foi agitada a 0°C por lh e, em seguida, o solvente foi evaporado. O resíduo foi triturado com acetato de etila (lOOmL) e o sólido branco foi filtrado para fora. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar óleo amarelo pálido. O composto bruto foi cromatografado usando 10-20% de gradiente de acetato de etila/hexanos para gerar produto (11,3g, 72 % dc rendimento) como uma mistura de díastereoisômeros em cerca de 1:1 de razão. 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -1,58, -1,61; XH RMN (400 MHz,CDC13) : δ 7,06-7,51 (m, 8H) , 5, 02-5, 94 (m, 1H) , 4,10-4,16(m, 1H), 3,31-3,94(m, 1H), 1,18-1,35(m, 3H), 1,38- 1,40 (dd, 6I-I) ; MS (ESI) m/z 398 (Μ—1) ' . 0 produto resultante foi purificado por extração, cristalização, ou cromatografia, como observado acima.

Exemplo 9-2. Preparação de (S)-isopropil 2- ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-il)-4-fluor-3-hidróxi-4-metiltetraidrofuran-2 il)metóxi)(fenóxi)- fosforilamino)propanoato. Δ uma solução agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-h idróxi-5-hidróxi.metil -3-metil-tetraidro-furan-2- il) -1H-pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (12,4 mL,, 21 mmol, 2,1 equ.i.v) ) a temperatura ambiente durante um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico de ácido (2-[(2-cloro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (raccmico 4,08 q, 10 mmol) em THF (15mL) foi adicionada gota a gota durante um período de lOmin. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 72h. Co-corante de TLC com o produto autêntico mostrou cerca de 5% do produto desejado tinha formado em comparação com o nucleosídeo de partida.

Exemplo 10-1. Preparação de racêmico de éster isopropilico de ácido 2-[(2,3,4,5,6-pentafluor-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (±). A uma solução agitada de fosforodicloridato de pentafluorfenila (6,0 g, 20 mmol) em diclorometano (40 mL) foi adicionada uma solução de feno.1 e trieti lamina (3,08 mL, 22 mmol) em diclorometano (40 mL) a -78 °C durante um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 30 min e, em seguida, transferida para um outro frasco redondo contendo hidrocloreto de éster de L-alanina isopropilico (3,35 g, 20 mmol) em diclorometano (100 mL) at 0 °C. Para a mistura foi adicionado o segundo lote de trietilamína (5,84 mL, 42 mmol) durante um período de 15 min. A mistura foi agitada a 0°C por lh e, em seguida, o solvente foi evaporado. 0 resíduo foi triturado com acetato de etila (60mL) e o sólido branco foi filtrado para fora. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar óleo amarelo pálido como uma mistura de diastereoisômeros em cerca de 1:1 de razão. 31P RMN (162 MHz, CDC13) : δ -0,49, -0,58, O produto resultante foi purificado por extração, cristalização, ou cromatografia, como observado acima.

Exemplo 10-2. Preparação de (S)-isopropil 2- ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-il)-4-fluor-3-hidróxi-4-metiltetraidrofuran-2 il)metóxi)(fenóxi)- fosforilamino)propanoato. A uma solução agitada de 1-( (2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4- h i dróxi-5-hidróxi meti1-3-met i1-1 e t r a i dr o-f u r a n-2-i1)-1H-pirimidina-2, 4-diona (3, 2,6g, lOmmol) em THE' seco (50mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (12,4mL, 21mmol, 2,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 15min. Após 3 0 min, uma solução de racêmico bruto de éster isopropílico de ácido (2-[(2,3,4,5,6-pentafluor fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (4,08g, lOmmol) em THF (15mL) foi adicionada gota a gota durante um período de lOmin. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 72h. Co-corante de TLC com o produto autêntico mostrou que cerca de 40-50% do produto desejado fo:i, formado em comparação com o nucleosídeo de partida. A preparação e purificação de C or C1 fornece acesso direto a Sp-4 ou Rp- 4, como ilustrado nos exemplos seguintes.

Exemplo 11. Preparação de Sp-4 (32 mg-escala) : A uma solução agi tada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidróxi-b-hidróximctil-3-rnef i.l-tet raidro-furan-2-.i 1) -IH-pirimidi na- 2,4-diona 3 (32 mg, 0,12 mmol) em THE seco (lmL) foi adicionada uma solução 1 M de cloreto de LButil magnésio (0,26 mL, 0,26 mmol, 2,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 3 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (8, Sp-isômero) em THE (0,5mL) foi adicionada gota a gota durante um período do 3min. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 42h e, em seguida, extinta com NH4CI aquoso saturado (lOmL). A mistura foi dividida entre acetato de etila e água. 0 extrato orgânico combinado foi seco sobre sulfato de sódio anidro e concentrado. 0 resíduo foi cromatografado usando gradiente de metanol/diclorometano 0-4% para gerar Sp-4 como um sólido espumoso (29mg, 44,5% de rendimento). 1H e 31P RMN são de acordo com o que é divulgado neste documento.

Exemplo 12. Preparação de Sp-4 (2,6 g-escala, sem cromtografia) : A uma solução agitada de l-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluor-4-hidróxi-5-hidróximeti1-3-metil-tetraidro-furan-2-il)-lH-pirimidina-2,4-diona (2,6 g, 10 mmol) em THF seco (50 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (12,4 mL, 21 mmol, 2,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropí11co de ácido (S)-2-[(S)-( 4-nit.ro-f enóxi)-f enóxi-f osf orilamino] propiônico (8, Sy>-isômero, 4,08g, lOmmo.l) em THF (15 mL) foi adicionada gota a gota durante um período de lOmin. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 6 Oh e, em seguida, extinta com NiRCl aquoso saturado (20mL). A mistura foi dividi.da entro acetato de etila (150 mL) e sequencialmente, NdvC03 aquoso 10% (3 x 20 ml,) e água (20 rn!,) . O extrato orgânico combinado foi seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido (3,8 g) . 0 resíduo foi dissolvido cm diclorometano (7,6 m.L) e, em seguida, agitado por 20h a temperatura ambiente. O sólido branco foi filtrado, lavado com IPE/diclorometano 1:1 (5 mL) e seco sobre vácuo para gerar produto puro como um sólido branco (1,85 g, 35% de rendimento).

Exemplo 13. Preparação de Sp-4 usando NaHMDS: A uma solução agitada de l-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluo.r-4-hidróxi-5-hidróximetil-3-me til-tetrai.dro-f uran-2-il) -111-pirimidina- 2,4-diona (71 mg, 0,27 mmol) em THF seco (2,0 mL) foi adicionada uma solução 2 M de sódio bis(trimetilsilil) amida (NaHMDS) em THF (270 pL, 0,54 mmol) a -78 °C durante um período de 2 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico de ácido (S )-2-[ (S) - ( 4-N.i. tro-f enóxi)-f enóxi-fosforilamino]-propiônico (8, SP-isômero, 111 mg, 0,27 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada à mistura. A mistura reacional foi deixada agitar nesta temperatura por 2h e, em seguida, aquecida a -20°C temperatura na qual a mesma foi agitada por 20h adicionais. TLC indicou -30% de material de partida de nucleosídeo não reagido. Assim, 0,5 equivalentes adicionais do reagente (55 mg, 0,14 mmol) em THF (0,5 mL) foram adicionados à mistura reacional e e agitados por mais 6h. A mistura reacional foi extinta com solução aquosa saturada de cloreto de amônio e, em seguida, dividida entre acetato de etila e água. 0 extrato orgânico combinado foi seco sobre sulfato de sódio anidro e concentrado para gerar um resíduo marrom branco. A cromatogra f .1 a de coluna de produto bruto usando gradiente de metanol/di.clorometano 0-5% gerou Sp-4 (22 mg, 15% de rendimento), 3'-fosforamidafo (5, Sy-isômero, 11,5 mg, 16% de rendimento) e bis fosf oramidato (6, SP, Sp-isômero, 12,6mg).

Exemplo 14. Preparação de Rp-4 (260 mg-balança) : ΛΛ urna solução agitada de 1-( (2R, 3R, 4R, 5R)-3-Fluor-4-h.i.dróx i.-5-hidróximeti1-3-metil-tetraidro-furan-2-il)-lH-pirimidina- 2,4-diona (260 mg, 1 mmol) em THF seco (6 mL) fo:i adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (1,23 mL, 2,1 mmol, 2,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 5 min. Após 30 min, uma solução de éster i.sopropí li co de ácido (S)-2-[ (R) - (4-ni.tro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (8, RP-isômcro) em THF (3 mL) foi adicionada gota a gota durante um período de 3 min. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 96 h e, em seguida, extinta com NH4C.I aquoso saturado (10 mL) . A mistura foi dividida entre acetato de etila (50 mL) e água (2 x 20 mL) . 0 extrato orgânico combinado foi seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pá]..ido (490 mg). 0 resíduo foi cromatografado usando gradiente de metanol/díclorometano 0-5% para gerar produto como um sólido branco (160 mg, 30% de rendimento). A preparação de Sp-4 or Rp-4 também pode ser alcançada pela reação de 3'-protegido 3 com o reagente apropriado C ou C' ou uma mistura contendo C e C', como ilustrado nos exemplos seguintes.

Exemplo 15. Preparação de Sp~4 com 3a como um intermediário sintético Exemplo 15-1. Síntese de 5'-O-terc-Butildimetilsilil-2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina (9): AA uma solução agitada de 2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina (3, 81,1 g, 312 mmol) em piridina seca (750 mL) foi adicionada gota a gota uma solução de TBDMSC.l (103,19 g, 685,6 mmol) em piridina seca (500 mL) durante um período de 45 min a temperatura ambiente. A reação foi deixada agitar a temperatura ambiente por 24 h. Metanol (85 mL) foi adicionado à mistura reacional e o mesmo íoí deixado agitar por 10 min e, em seguida, os solvent.es foram destilados sob pressão reduzida. Água quente (45°C) (1 .!.·) foi adicionada à massa reacional e a mistura foi extraída com acetato de etila (2 x 500 mL), lavada com água (1 x 500 mL) . A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro. Acetato de etila foi destilado e o resíduo obtido foi coevaporado com tolueno (2 x 500 mL) para gerar o bruto 9 como uma espuma branca. Rendimento ^ 116,9 q (quantitativo). JH RMN (CDC13, 300 MHz): ó 0,1 (s,6II), 0,91 (s, 9H), 1,22 (d, 3H, J - 21 Hz), 2,50 (s, 2H), 3,75-4,05 (m,4H), 5,54 (d, 1H, J = 9 Hz), 5,73 (s, 1H), 6,0 (d, IH, J = 18 Hz), 7,81 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,57 (br, s, 1H) , II, 1 (s, 1H).

Exemplo 15-2. Síntese de 5'-O -( terc— Butildimetilsilil)-3'-O-levulinil-2'-desóxi-2'-fluor 2'-C-metil-uridina (10): A uma solução agitada de nucleosídeo 9 (116,9 g, 312,1 mmol) em DCM (1 L) foi adicionado DMAP (30,5 g, 249,7 mmol) e este foi deixado agitar a RT por 2 0 min. Uma solução de anídrído levulínico (133,6 g, 642,3 mmol) em DCM (200 mL) foi adicionada à mistura e deixado agitar por 24 h. TLC da mistura indicou a conclusão da reação. Água fria (500 mL) foi adicionada e a mistura foi agitada por 20 min. As camadas foram separadas e a camada foi lavada com solução sat. de bicarbonato de sódio (2 x 250 mL) , seca sobre sulfato de sódio anidro e, em seguida, o solvente foi. destilado sob pressão reduzida para gerar óleo amarelo. Rendimento bruto: 197,6 g (135 %) . 0 material foi usado como estava na próxima etapa. 1H RMN (CDC13, 300 MHz) õ 0,11 (s, 6H) , 0,94 (s, 9H), 1,34 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,22 (s, 3H) , 2,6-2,89 (m, 4H), 3,72 (m, 111), 4,01 (d, 1H, J 12 Hz), 4,23 (d, 1H, J - 9 Hz), 5,33 (dd, 1H, J = 1.5 Hz), 5,73 (d, 1H, J = 6 Hz), 6,26 (d, 1H, J = 15 Hz), 8,12 (d, 1Η, J = 12 Hz), 8,72 (br, s, 1H).

Exemplo 15-3. Síntese de 3'-0-levulinil-2'-desóxi-2'-fluor 2'-C-metil-uridina (3a): O bruto 10 (197,6 g, -312,1 itunol) foi dissolvido em DCM (1 L) ao qual foi adicionado TEA.3HF (50,3 g, 312,1 mmol) e deixado agitar durante a noite a temperatura ambiente. TLC da mistura indicou cerca de 50 % de conclusão da reação. Um outro equivalente de TEA.3HF (50,3 g, 31.2,1 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi deixada agitar por 6 h. TLC neste ponto indicou cerca de 10 % de material de partida não reagido. Outro 0,25 eq de TEA.3HF (12,5 g, 78,0 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi deixada agitar durante a noite. Mistura reacional foi concentrada até secura para gerar óleo amarelo. 0 bruto dos lotes foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (MeOH em DCM 0-2%) para gerar 124,1 g de 3'-levulinato como um sólido espumoso branco (90% de rendimento de purificado ao longo de três etapas de 2'-desóxi-2'-fluor-2 '-C-metiluridina) . ]H RMN: (CDCI3, 400 MHz) δ 1,55 (d, 3H, CH3, J = 20 Hz), 2,36 (s, 3H, CH3) , 2,8-3,03 (m, 5H, CH2CH3) , 3,91-3,96 (dd, 1H, CH' '), 4,2-4,25 (m, 1H, CH' ) , 4,34 (dd, 1H, CH, J - 8 Hz), 5,25 (dd, 1H, J - 16 Hz), 5,93 (d, 111, J - 8 Hz), 8,2 0 (d, 1H, J - 8 Hz), 9,18 (s, 1H).

Exemplo 15-4. Síntese de estereoseletividade de (S)-éster isopropílico de ácido (S)-2-{[(IR,4R,5R)-5-(2,4- Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l-il)-4-(R)-fluor-3-(4-oxopentanoil)-4-metil-tetraidro-furan-2-ilmetóxi]-fenóxi-fosforilamino}-propiônico (11): A uma solução de nucleosideo (3a, 1,00 mmol, 358 rr.q) em 5 ml de THF anidro que foi resfriado a 0°C foi adicionado tBuMgCl (1,7 M em THF, 2 eq) e o mesmo foi deixado aquecer a temperatura ambiente e agitado por meio hora. Para esta mistura foi adicionado o reagente (ca. 97% de pureza quiral) éster isopropílico de ácido (S)—2— [ (S) — (4-nitro-fenóxi)-fenóxi-fosforilamino] propiônico (8, SP-isômero) (408 mg, 1,00 mrnol, 1,00 eq.) em um lote e o mesmo foi deixado agitar a rt. Após 16 h, havia -30% de material, de partida deixado. A mistura reacional foi extinta com 10 ml de solução saturada de NH^Cl, e a fase aquosa foi extraída com. acetato de eti.la (3 x25 ml.) . A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura e seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada até secura para gerar uma espuma amarela pál...ida (500 mg) . Esta foi purificada por cromatografia de sílica gel usando metanol 2-5% em cloreto de metileno para gerar o produto como uma espuma branca (275 mg) de cerca de 97% de P de pureza quiral e material de partida não reagido (162 mg) . Com base no material de partida consumido, o rendimento foi 76%. 31P RMN (CDCl;!, 162 MHz) : 3,7 pprn; Ί1 RMN (CDC1 ,, 400 ΜII /.) : δ 1,22 (dd, 6H, J = 6,4 Hz), 1,37 (s, 3H) , 1,58 (s, 3H) , 2,18 (s, 311), 2,63-2,9 (m, 4H), 4,0 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,2-4,33 (m, 1H), 4,57 (d, 1H, J = 8Hz), 4,96-5,00 (sept, 1H) , 5,2 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5,42 (d, 1H, J = 8Hz), 6,19 (d, 1H, J = 18Hz), 7,15-7,35 (m, 5H), 7,5 (d, 111, J - 5, 6 llx), 8,2 (br, s, 1H) .

Exemplo 15-5. Sintese de (S)-2-{[(IR,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-l-il)-4-(R)-fluor-3-hidróxi-4-metil-tetraidro-furan-2-ilmetóxi]-fenóxi-fosforilamino}-propiônico ácido (S)-éster isopropílico (Sp-4) Uma solução de sulfito de sódio foi preparada pela adição de Na2S203 (1,51 g) e Na2S205 (0,57 g) em água (25 mL) . A uma solução de levulinato (11, 250 mg, 0,40 mmol) em THF anidro (2,5 mL) foi adicionada 1,0 ml de solução de sulfito de sódio. Esta foi deixada agitar a temperatura ambiente por 4 h. A mistura reacional foi vertida em água (15 mL) e extraída com acetato de etila (3x25 mL) seca e evaporada para gerar quantitativamente um produto de sólido branco com cerca de 97% de P de pureza quiral que correspondeu as propriedades físicas e espectrais de Sp-4 produzido diretamente do nucleosídeo não protegido.

Exemplo 16. Procedimento alternativo para preparar Sp-4 de 3a. A uma solução agitada de éster de ácido de 4-oxo-pentanóico (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidro-2H- pirimidín-l-il)-4-fluor-2-hidróximet il-4-metil-tetraidro-furan-3-il (3a, 210 mg, 0,59 mmol) em THF seco (1,5 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (1,07 mL, 1,82 mmol) a temperatura ambiente durante um período de 2 mi n. Inicialmente, um precipitado branco foi observado e após 10 min a mistura reacional sc tornou urna solução amarela escura. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico de ácido (S)-2-[(S)-(4-nitrofenóxi)-fenóxi-fosfori lamino]-propiônico (8 (S^-isômero) , 382mg, 0,94mrnol) em THE (l,5mL) foi adicionada gota a gota durante um período de 3min. A mistura foi aquecida a 40°C por 5h em cujo tempo TLC e 1H RMN indicaram menos que 2% de material de partida não reagido. A reação foi. extinta com cloreto de amônio aquoso saturado e, em seguida, dividida entro acetato de etila e água. A camada orgânica combinada foi lavada com solução aquosa de Na2CO3l.0% (3 x 10 mL) , seguido po.r água. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, e concentrada para gerar resíduo de cor marrom (410 mg). O produto bruto foi dissolvido em tetraidrofurano (1,0 ml,) e, em seguida, foi adicionada uma solução aquosa da mistura de sulfito de sódio (37 mg, 0,295 mmol) e metabisulfito de sódio (224 mg, 1,18 mmol) em lmL de água. A mistura foi aquecida a 45°C por 20 h em cujo estágio apenas cerca de 10% de conversão foi observado por TLC, assim o sulfito de sódio adicional (74 mg) e metabisulfito de sódio (448 mg) foram adicionados e o aquecimento foi continuado por 52 h adicionais. Neste momento, cerca de 40% de conversão observada por TLC. A mistura reactonal foi dividida entre água e acetato de etila. A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar um resíduo marrom (210 mg) . A cromatografia de coluna do resíduo usando gradiente de MeOH/DCM 0-5% gerou material de partida não reagido (8 9mg) e Sp-4 (5 7 rng, 18% de rendimento, 24% com base no material de partida recuperado).

Exemplo 17. Preparação de Sp-4 com 3c como um intermediário sintético Exemplo 17-1. Preparação de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc- butildimetilsilaniloxi)-3-fluor-5-hidróximetil-3-metil-tetraidro-furan-2-il]-lH-pirimidina-2,4-diona, 12. A uma solução de 3 (10,Og, 38,43 mmol) em piridina (50 mL) foram adicionados diclorometano (50 mL) . A solução foi resfriada a 0°C. Para a solução foi adicionado cloreto de 4, 4 ' -diinetóxitntil (14,32 g, 42,27 mmol) e a solução foi agitada a 0°C por 5 h. Metanol (5 mL) foi adicionado para extínguir a reação. A solução foi concentrada até secura sob pressão reduzida e o resíduo foi dividido entre acetato de etíla (500 mL) e água (50 mL) . A solução orgânica foi lavada com salmoura (50 mL) e seca (sulfato de sódio, 4 g). 0 solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em diclorometano (100 mL) . Para a solução foram adicionados imidazol (7,83 g, 115 mmol) e cloreto de t-butildímetilsilil (8,68 g, 57,6 mmol). A solução foi agitada a temperatura ambiente por 16 h. Metanol foi adicionado para extinguir a reação (5 mL) e o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dividido entre acetato de etila (500 mL) e água (50 mL). A solução orgânica foi seca (sulfato de sódio, 4 g) e evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (EtOAc em Hexanol0-40%) para gerar produto intermediário 5'-O-DMT-3'-O-tBDMS. Este por sua vez foi tratado com ácido trif1uoracctico 1% em dic]orometano (200 mL) . A solução foi agitada a temperatura ambiente por lh. Água (20 mL) foi adicionada e a solução foi agitada no ambiente por mais lh. Metanol (5 mL) foi lentamente adicionado e a solução foi agitada no ambiente por mais lh. Hidróxido de amôni.o foi adicionado para ajustar o pH da solução para 7. A solução orgânica foi. separada, seca (sulfato de sódio, 4 g) e evaporada até secura sob pressão reduzida. 0 resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (metanol em diclorometano 1-5%) para gerar 12 como um sólido branco 7,5g em 50% de rendimento ao longo de três etapas. 1H RMN (DMSO-d6) δ (ppm) 11,48 (br s, 1H, NII), 7,94 (d, 1H, H-6), 6,00 (d, 1H, H -1' ) , 5,69 (d, 1H, H-5), 4,06 (dd, 1H, 3'-H), 3,85 (m, 2H, H-5'a, H-4'), 3,58 ( br d, 1H, Η-5'b), 1,27 (d, 3 H, 2-CH3), 0,89 (s, 9H, C(CJi3) 3), 0,12 (s, 6H, S i ( CH3) 2) .

Exemplo 17-2. Preparação de Sp-4 usando 1- [(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)-3-fluor-5- hidróximetil-3-metil-tetraidro-furan-2-il]-lH-pirimidina-2,4-diona (3c). Ά uma solução agitada de 1-[ (2R,3R,4R,5R)-4 -(terc-buti Idimetilsilaniloxi ) -3-f luor-5-hidróximetil--3-met il-tetraidro-furan-2-il]-lH-pirimidina-2,4-díona (12, 374 mg, 1 mmol) em THE seco (3 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (1,8 mL, 3,1 mmol)) a temperatura ambiente durante um período de 2 min. Inicialmente, um precipitado branco foi observado e após lOmin a mistura reacional. se tornou uma solução amarela escura pura. Após 30 min, uma solução de éster isopropllico de ácido ( S) -2 - [ ( S ) - ( 4 -n.í t rof enóxi ) -f enóx i - f os f orilami no 1 -propiôni.00 (8, SP-:i sômero, 653 mg, 1,6 mmol) em THF (2,5 mL) foi adicionada gota a gota durante um período de 3 min. A mistura foi aquecida a 40°C por 20 h em cujo tempo TLC e ■'li RMN indicaram menos que 5% de material de partida não reagido. A mistura reacional foi extinta com cloreto de amônio aquoso saturado e, em seguida, dividida entre acetato de etila e água. A camada foi lavada com solução aquosa de Na^-CCó 10% (3 x 10 mL) , seguido por água (20 mL) . A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar resíduo marrom contendo 3c (850 mg) . O produto bruto foi dissolvido em tetraidrofurano (2 mL) e foi lavado com 0,8 mL de ácido fórmico aquoso 80% a temperatura ambiente. A mistura reacional foi aquecida a 50°C por 96h. Cerca de 70% de conversão foi observado por TLC. A mistura reacional foi vertida em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio e, em seguida, dividida entre acetato de etila e água. A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para gerar resíduo marrom (220 mg) . A cromatografia de coluna do resíduo usando gradiente de MeOH/DCM 0-5% gerou material de partida não reagido (21 mg) e Sp--4 (77 mg, 35% dc rendimento, 39% de rendimento com base no material de partida recuperado).

Exemplo 18. Preparação de Sp-4 com 3d como um intermediário sintético Exemplo 18-1. Preparação de 3d A uma solução agitada de 3 em piridina (20 mL) a 0°C foi adicionado TIPDS-Cl gota a gota durante um período de 15 min. A mistura foi lentamente deixada aquecer a temperatura ambiente, temperatura na qual a mesma foi agitada por 16 h. 0 piridino foi evaporado e o resíduo foi coevaporado com tolueno (50 mL). O resíduo foi então triturado com hexanos e o precipitado branco foi filtrado para fora usando uma almofada de Celite. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um sólido espumoso (12,97 g) . 0 produto bruto (13) foi redissolvido em tetraidrof urano (75ml.) e foi adicionada uma solução aquosa de TFA (75mL, 1:1 TEA/água) a 0°C durante um período de 20 min. A mistura foi agitada nesta temperatura por 6 h. TLC indicou ~5% de material de partida. A mistura reacíonal foi extinta com NaHCC>3 aquoso saturado até pH 8 e, em seguida, extraída com acetato de etila. 0 extrato orgânico combinado foi lavado com água, seco e concentrado para gerar sólido cristalino branco. A tr_i turação adicional do sólido com hexanos (30 rnL) gerou sólido branco que foi filtrado e seco sob alto vácuo para gerar 3d (10,1 g, 84 l de rendimento ao longo de 2 etapas) . 1H' RMN (400 MHz, CDC13) : δ 8,83 (bs, 1H) , 7,94 (bd, J=6,0Hz, 1H) , 6,10(bd, J-"l 8, 4 Hz, 1H) , 5,71 (d, J=8,2Hz, 1H), 4,43 (bs, 1H) , 4,3b (dd, J=22,6, 9, 0Hz, 1H) , 4,27 (bs, 1H) , 4, 10 (d, J=13,2Hz, 1Η), 4,03 (d, J=9,2Hz, 1H) , 3,92 (d, J=13,2Hz, 1H) , 1,39 (d, J=22,0Hz, 3H) , 1,11-0,92 (m, 28H) .

Exemplo 18-2. Preparação de Sp-4 A uma solução agitada de 3d (520 mg, 1 mmol) em THF seco (5 mL) foi adicionada uma solução 1,7 M de tercloreto de t-butil magnésio (1,8 mL, 3,1 mmol, 3,1 equiv)) a temperatura ambiente durante um período de 15 min. Após 30 min, uma solução de éster isopropílico de ácido (S)—2— [ (S) — (4-nitro-fenóxi)-fenóxifosforilamino] propiônico (8, SP- isômero, 653 mg, 1,6 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada gota a gota durante um período de 3 min. A mistura foi deixada agitar a temperatura ambiente por 60 h. ’h e ~nP RMN da amostra bruta indicou mistura de diastereoisômeros em cerca de 1:0,76. A mistura reaciona.1. foi extinta com NH4C1 aquoso saturado (20 mL) . A mistura foi dividida entre acetato de etíla (150 mL) e sequencialmente, Na?;C03 aquoso 10% (3 x 20mL) e água (20 mL). 0 extrato orgânico combinado foi seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo amarelo pálido (14, 878 mg). 0 composto acima, 14, foi redissolvido em tetraidrofurano (3 mL) e, em seguida, foi adicionado ácido fórmico aquoso 80%. A mistura foi aquecida a 55 °C por 20h. A mistura reacional foi. resfriada a 0°C, e, em seguida, extinta com bicarbonato de sódio aquoso saturado (pH 7,0) . A mistura reacional foi, em seguida, dividida entre acetato de etila e água. A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada para gerar 560mg do resíduo. 0 resíduo foi cromatografado usando gradiente de metanoi/diclorometano 0-5% para gerar material de parti cia não reagido (14, 242mg) e Sp-4 (80ing, 15% de rendimento) como um sólido branco.

Exemplo 19. Preparação de Sp-4 Isotopicamente marcado IS 16 17 17 18 19 19 20 21 Exemplo 19-1. Preparação de 1-((6ãR,8R, 9R, 9aS)-9-hidróxi-2,2,4,4-·tetralsopropiltetraidro-6H-furo[3,2- f][1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il) pirim±dina-2,4(1H,3H)-diona, 16 Uridina (15, 100,0 g, 409,5 mmol) foi coevaporada até secura com piridino anidro (6Ό0 mL) e ressuspendida em piridino anidro (700 mL) . Para esta suspensão fina agitada foi adicionado 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano (135,7 g, 482,5 mmol) durante 60 min a temperatura ambiente. Após agitação da suspensão fina por 17 h a temperatura ambiente, a reação foi extinta pela adição de metanol (20 mL) e, em seguida, concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dividido entre acetato de etila (1,5 L) e água (2 L) . A camada orgânica foi ainda lava com ácido clorídrico 5% (2 x 1 L) , salmoura (500 mL), seca sobre sulfato de sódio sólido (50 g) , filtrada e concentrada sob pressão reduzida para o produto bruto, ca 250 g. O resíduo foi submetido à filtração usando coluna de sil.i.ca gel (1,75 kg) e a gradiente de acetato de etila em Hexanos 20-65%. As frações do produto puro como julgadas por um TLC homogêneo (Rf 0,55 em hexanos-acetato de etila 1:1) foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida e secas (40°C, 0,2 mm Hg, 24 h) para produzir 145,5 g (76%) de 16 como uma espuma branca sólida. Uma fração adicional (35 g) de 16 levemente impuro foi também coletada. lH RMN (DMSO-cfc) δ (ppm) 11,35 (s, 1H, NH) , 7,66 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-6) , 5,57 (d, 1H, J == 4,8 Hz, 2'-0H) , 5,50-5,49 (m, 2H, 1 '-He H-5) , 4,14-4,18 (m, 3H, 2', 3’, 4 ’ -II) , 3,97-3,87 (m, 2H, 5'-Iia e Ho), 1,02-0, 95 (m, 28H, CH(CH3)2).

Exenplo 19-2. Preparação de 1-((6aR, 8R, 9aR)-2,2,4,4- tetxaiscpropil-9-oxotetxaidro-6H-furo[3,2- f][l,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidina-2,4(lH,3H)-diona, 17.

Para um frasco Redondo de três pescoços seco foram adicionados DCM anidro (600 mL) e DMSO (30,82 g, 394,5 mmol) . A solução foi resfriada a -78°C em um banho de gelo seco/acetiona sob uma atmosfera de nitrogênio. Anidrido trifluoracético (límpido, 77,7 g, 369,8 mmol) foi. adicionado via uma seri.nga durante 40 mins e produziu uma mistura tirva. Para a mistura uma solução de derivado de uridina 16 em DCM (600 mL) foi adicionada gota a gota durante 75 mins a -78°C via um funil de adição. A mistura heterogênea foi agitada por 2 h a -78—65°C e, em seguida, trietilamina anidra (92 mL) foi adicionada via uma seringa rapidamente para formar uma solução amarela luminosa clara. Após 1 h em baixa temperatura, a reação foi concluída corno mostrado por TLC (LtOAc em Mexanos 30%). 0 banho de resfriamento foi removido e a mistura reacional foi aquecida lentamente para a temperatura ambiente durante 1 h. A reação foi extinta por adição de NH/jCl sat. (180 mL) . Água (200 mL) foi adicionada e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída novamente com DCM (300 mL) . A camada orgânica combinada foi lavada com água (3x 400 mL) , salmoura (150 mL), e seca sobre Na^SCh. A remoção de solvente produziu um resíduo marrom pegajoso. O resíduo de óleo bruto (continha traços de DCM) foi armazenado durante a noite no refrigerador. Após isso, durante a noite, alguns sólidos de cristal foram, observados no óleo. 0 óleo foi dissolvido em 500 ml de hexanos a temperatura ambiente. A solução foi armazenada no refrigerador por 24 horas e mais sólido foi formado. 0 sólido foi coletado via fíltração e rinsado com DCM em Hexanos 10% frio (1 L) para remover a maior parte da cor laranja. O sólido (17) foi seco sobre vácuo por 2 h e, em seguida, seco ao ar por 24 h. 0 sólido pesou 21 g após seco a 50 °C sob vácuo. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado via cromatografia de coluna (acetato de etíla em Hexanos 10-70%) para produzir um adicional de 37 g (rendimento combinado de 97%) de 17 como um sólido laranja luminoso.

Exemplo 19-3. Preparação de 1-((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihidróxi-5-(hidróximetil) -3-13C-per deutericrnetiltetraidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 18.

Magnósio (3,53 g, 147 mmol), lavado com ácido clorídrico aquoso 5% e seco (50°C, 0,2rnrn Hg, 24 h) , foi colocado em um frasco dc fundo redondo de dois pescoços equipado com um agitador magnético e um condensador. 0 frasco foi preenchido com gás argônio e, em seguida, éter anidro (80 mL) foi adicionado. Para o magnésio em éter foi adicionado lentamente iodeto de metil perdeuterio-uC (15,06 g, 110,3 rnmol) , que gerou uma reação exotérmica. Depois que a mistura reacional foi resfriada, o sobrenadante foi transferido para uma solução do composto 17 seco (50°C, 0,2mm Hg, 15 h) (10,0 g, 20,63 rnmol) em THF anidro (1 L) a -50°C durante 20 min. A temperatura foi deixada se elevar para -40°C e a mistura foi agitada entre -40 a -25°C por 4h. Mediante a conclusão da reação, a mistura foi diluída com EtOAc (1L) a -50 °C e então salmoura (300 mL) foi adicionada lentamente. A camada orgânica foi separada e, em seguida, lavada com solução sat. de cloreto de amônio (300 mL x 2) e seca com sulfato de sódio. Após filtração e concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em MeOH (250 mL). Fluoreto de sódio (12 g) e TBAF' (400 mg) foram adicionados. A mistura resultante foi agitada a 90°C por 7h e, em seguida, concentrada com silica gel (20 g) sob pressão reduzida. Após a secagem a vácuo completa, o resíduo obtido foi purificado por cromatografia flash de coluna em silica gel (MeOH:CH^C.la = 1:20 to 1:10) gerando o composto 18 (5 g, 46%) como um sólido branco. 1H RMN (DMSO-cfe) δ (ppm) 11,26 (s, 1H, NH) , 7,65 (d, 1H, J- 8,4 Hz, H-6) , 5,77 (d, 1H, J= 2,4 Hz, H-l'), 5,57 (d, III, J= 8,0 Hz, H-5) , 5,46 (d, 1H, J= 5,2 Hz, HO-3') , 5,24 (d, 1H, J= 2,4 Hz, HO-2'), 5,14 (t, 1H, J= 5,6 Hz, HO-5') , 3,74-3,56 (m, 4H, H-3', 4', 5', 5").

Exemplo 19-4. Preparação de ((2R,3R,4S,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-il)-4-hidróxi-4-13C-perdeutericaxietiltetra±drofiirano-2-il) mace tato de etila, 19. A uma solução do composto 18 (5,00 g, 19,1 rnmol) em piridino anidro (100 mL) foi adicionado acético anidrido (3 mL) a temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 15h, diluída com EtOAc (250 mL), lavada com água (50 mL x 3) , e seca com sulfato de sódio. Após a filtração e concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia flash de coluna (MeOH 0 a 5% em CH2CI2) para gerar o composto 19 (4,0 g, 68%) como um sólido cinza.

Exemplo 19-5. Preparação de ((2R,3R,4R,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dlhidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluor-4-13C-perdeutericmetiltetraidrofurano-2-il)macetato de etila, 20 A uma solução do composto 19 (2,33 g, 6,73 rnmol) em CH2CI2 anidro (60 mL) foi adicionado DAST (1,33 mL, 10,1 mmol) a -78°C lentamente. A mistura resultante foi agitada por 30 min após exposição a temperatura ambiente. Duas reações de escala de 2,33 g e uma reação de escala de 1,00 g adicionais foram conduzidas exatamente do mesmo modo. Todas as quatro misturas reacionais foram combinadas, diluídas com CH2CI2 (300 mL) , e lavadas com gelo-áqua (100 mL x 2) e, em seguida, com solução aquosa de NaHC03 (100 ml, x 2). Após secagem, filtração, e concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia flash de coluna em sílica gel (EtOAc 0% a 50% em Hexanos, composto se formou em cerca de 48%) para gerar composto 20 (2,0 g, 24% do total 7,99 g do composto 19) como um sólido branco. ]Η RMN (CDCI3) δ (pprn) 8,27 (s, 1H, NH), 7,55 (d, 1H, J - 8,4 Hz, H—6) , 6,17 (d, 1H, J - 18,8 Hz, H-l' ) , 5,78 (dd, 1H, J - 1,2, 8,4 Hz, H-5), 5,12 (dd, 1H, J= 9,6, 21,6 Hz, H-3'), 4,40-4,31 (m, 3H, H-4', 5', 5"), 2,19 (s, 3H, CH3) , 2,15 (s, 3H, CH3) .

Exemplo 19-6. Preparação de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluor-4- hidróxi-5- (hidróximetil) -3-13C-perdeuteriometiltetraidrofurano-2-il)pirimid±na-2,4(1H,3H)-diona, 21. A uma solução do composto 20 (2 g, 5,74 mmol) em metanol (20 ml..,) .foi adicionado n-butilamina (6 mL) . A mistura resultante foi agitada a rt por 15h e concentrada com silica gel em vacuo. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia flash de coluna em sílica gel (MeOH 0 a 10% em CH2CI2) para gerar composto 21 (1,3 q, 85%) como um sólido branco. 1H RMN (CD3OD) δ (ppm) 8,08 (d, 1H, J - 8.0 Ηζ, Η—6), 6,13 (d, 1Η, J = 18,4 Ηζ, Η-1') , 5,70 (d, 1Η, J - 8,0 Ηζ, Η—5), 3,99 (d, 1Η, J= 13,6 Ηζ, Η-5'), 3,97-3,91 (m, 2Η, Η-3', 4'), 3,80 (dd, 1Η, J= 2,0, 12,8 Ηζ, Η-5''), ESMS (Μ+1) estimado 265, observado 265. 21 22 23 Exemplo 19-7. Preparação de (S) -Isopropil 2- ((((2R, 3R, 4R,5R) -5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluor-3-hidróxi-4-:3C-perdeutericmetil tetraidrofurano-2 -il)metóx±)(fenóxi)fosforilamino)propanoato, 22. A uma solução de nucleosídeo não protegido 21 (207 mg, 0,783 mmol) e W-metilimidazol (0,4 ml, 5 mmol) em THF (4 ml,) foi adicionado o fosforocloridato em THF pré-preparado (1,0 M, 2,35 ml, 2,35 mmol) a 0°C gota a goca. A reação foi aquecida lentamente a temperatura ambiente durante 1 h e, em seguida, água (1 mL) e EtOAc (5 mL) foram adicionados. A solução orgânica foi lavada com citrato de sódio sat. aq. mono básico (2x2 ml), NaHCOa sat. aq. (1x2 ml), seca (MgSO/j) e concentrada sob pressão reduzida. O bruto foi purificado por cromatografia de coluna de sílica gel usando 0 a 5% lPrOH em CH2CI2 como eluentes para gerar o fosforamidato, 22 (216 mg, 52%, 1:1 mistura de P-diastereoi sômer.os) como um sólido branco: 1 li RMN (400 MHz, DMSO-cfe) δ 11,54 (s, 111), 7,56 (d, J - 6,8 Ηζ, lil), 7,40-7,35 (m, 2H), 7,23-7,18 (m, 3 H), 6,14-5,96 (m, 2H) , 5,89 (dd, J= 5,6, 25,6 Hz, 11-1), 5,55 (t, J= 8,4 Ηζ, 1H) , 4,85 (dq, J = 1,6, 6.0 Ηζ, 1H), 4,44-4,32 (m, 111), 4,25 (m, 1H) , 4,06-3,98 (m, 111), 3,86-3,70 (m, 2H) , 1,30-1,08 (m, 911); 3:IP RMN (162 MHz, DMSO-cfe) 6 4,90, 4,77; LRMS (ESI) [Μ + H] ' calculado para C2i1'iCH27D3FN309P 534,5, encontrado 534,4.

Exemplo 19-8. Preparação de (2S)-2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-l(2H)-il)-4-fluor-3-hidróxi - 4-13C-perdeu ter iometiltetraidrof urano-2-il)metóxi)(hidróxi)fosforil)amino)propanóico ácido, 23 Fosforamidato 22 (147 mg, 0,276 ramo] ) foi suspenso em trietilamina (2 mL) e água (0,5 mL) , e aquecido a 60°C por 30 h. Então os componentes voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. 0 bruto foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel pela eluição com 50-70% iPrOH em CH2C12 e, em seguida, 0 a 20% NH40H em iPrOH para gerar 23 como um sólido branco (95 mg, 83%) : J‘H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 5,98 (d, J = 19,2 Hz, 1H) , 5,52 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,02-3,81 (m, 4H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H) ; 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6) δ 8,12; LRMS (ESI) [Μ -ι H] + calculado para C21'1'^CHjv/DuFN.-jOtjP 416,3, encontrado 416,4.

Propriedades das amostras de Rp-4, 4, e Sp-4 As amostras de Rp-4, 4, e Sp-4 foram analisadas por Difração de raios -X de pó (XRPD), espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FT-IR), Calorimetria de varredura diferencial (DSC), Análise térmica gravimétrica (TGA), Sorção de Vapor por gravimetria (GVS), Soiubílidade em água termodinâmica, e Crornatogra fia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).

Exemplo 20. Difração de Raios-X de pó As amostras de Rp-4, 4, e Sp-4 foram analisados por difração de raios-X de pó (XRPD), sob o seguinte esquema. a. Bruker AXS/Siemens D5000 Os padrões de difração de Raiso-X de pó foram coletados em um difratômetro Siemens D5000 usando radiação Cu Κα (40kV, 40mA), goniômetro Θ-Θ, divergência de V20 e recebendo fendas, um monocromador secundário de grafite e um contador de cintilação. 0 instrumento tem o desempenho verificado usando um padrão Corundum certificado (NIST 1976) . 0 software usado para a coleta de dados foi D.iffrac Plus XRPD Commander v2,3,l e os dados foram analisados e apresentados usando Diffrac Plus EVA v 11.0.0.2 ou v 13.0.0.2.

Condições ambientais As amostras executadas sob condições ambientais foram preparadas como espécimees de placa plana usando pó tal como recebido. Aproximadamente 35 mg da amostra foi brandamente embalada em um corte da cavidade no wafer de silicone polido, de fundo-zero (510) . A amostra foi girada em seu próprio plano durante a análise. Os detalhes da coleta dos dados Scão: faixa angular: 2 a 42°20, tamanho do passo: 0,05 °20, e tempo de coleta: 4 s.passo-1.

b. Bruker AXS C2 GADDS

Os padrões de difração de raios-X de pó foram recolhidos em um difratômetro Bruker AXS C2 GADDS usando radiação Cu Κα (40 kV, 40 mA) , microscópio de video a laser, estágio XYZ automatizado, do para posicionamento de autoamostra e um detector área bidimensional Ilistar. A ótica de .raios-X consiste em um espelho mui ticamadas de Góbel único acoplado cora um colimador pinho]e de 0,3 mm. A divergência do feixe, ou seja, o tamanho eficaz do feixe de raios X da amostra, foi de aproximadamente 4 mm. Um modo de varredura contínuo Θ-Θ foi empregado com uma distância de detector de amostras de 20 cm, que dá uma faixa 20 eficaz de 3,2° - 29,7°. Normalmente, a amostra seria exposta ao feixe de raios- X por 120 segundos. 0 software usado para a coleta de dados foi GADDS para WNT 4.1.16 e os dados foram analisados e apresentados usando Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2 ou v 13.0.0.2.

Condições ambientais As amostras executadas sob condições ambientais foram preparadas como espécimes de placa plana usando pó tal como recebido sem. moagern. Aproximadamente 1-2 mg da amostra foram, levemente pressionado sobre uma lâmina de vidro para obter uma superfície plana.

Difração de Raios-X de Pó (XRPD) 4 foi verificado por XRPD como sendo arnorfo (ver Fig. 1.) . A análise de XRPD de alta resolução de Rp-4 preparada de acordo com Exemplo 3 confirmou um sólido Cristalino exibindo um padrão de pó diferente ao de Sp-4 (preparado de acordo com Exemplo 4, método 4), que também foi confirmado como sendo um sólido Cristalino. Os resultados de XRPD para Rp-4 e Sp-4 scão apresentados na Tabela 1 com todos os picos exibindo uma intensidade de ^ 5% (Rp-4) e ^ 3% (Sp-4) excluídos.

Tabela 1. Dados de XRPD para Rp-4 e Sp-4, Uma amostra de Sp-4 foi moída corrí um almofariz e pilão e, em seguida, sucessivamente passada através de peneiras de 500 e 250 pm para produzir a amostra como um pó fino. Esta amostra foi novamente analisada por XRPD de alta resolução, confirmando que nenhuma mudança ocorreu.

Exemplo 21. Estudos de Cristalização para a Sp-4. O Cristalino Sp-4 exibe polimorfismo. Assim, um aspecto é direcionado ao Cristalino Sp-4 e suas formas polimórficas individuais. Sp-4 pode existir em polo menos cinco formas po l irnór í icas, designadas como formas 1-5. Além disso, Sp-4 amor í: o também pode ser preparado. Λ cristalização típica fornece dissolução de cerca de 100 rng de Sp-4, em um volume adequado de solvente de cristalização (acetonitrila (5 vol), clorofórmio (5 vol), acetato n-butila (7 vol), diclorortietano (50 vol), anisol (7 vol), e MTBE/heptano 1:1 (50 vol)) e, em seguida, deixando a evaporar da solução a 5°C. Várias formas de Cristalino foram obtidas, mas cada forma, mediante filtração e/ou secagem, produziu a Forma 1.

As Formas 1, 2 e 3 são uma forma não solvatada, solvato de DCM 1:1 e solvato clorofórmio 1:1, respectivamente, como foi confirmado por análise de XRPD e raios-X de cristal. As formas 4 e 5 foram obtidas de cristalização de Sp-4 a partir de soluções de acetonitrila e anisol, respectivamente. Dados suficientes não puderam ser colhidos para determinar se as Formas 4 e 5 são não solvatadas, hidratadas ou solvatadas uma vez que cristais únicos de qualidade suficiente não foram obtidos. As formas 4 e 5 transformam para a forma 1 sobre filtração. Duas formas de Cristalino adicionais são obtidas após a cristalização de Sp-4 a partir de solução de acetato de n-butila (nBuAc) contendo metil Lbutil-éter (MTBE) e heptano; mediante filtraçao ambas as formas de Cristalino se convertem para a Forma 1 . As Formas 2 e 3 também se transformam para a Forma 1 em isolamento. A Forma 1 é uma forma não-solvatada que apresenta uma ampla fusão endotérmica com uma temperatura de inicio de 94,3°C e AHrufi de 24,0 kJ mol-1. Um padrão adicional de XRPD da Forma Ide Sp-4 está representado na Figura 4.

Exemplo 21-1. Forma 1 de Sp-4 Uma .listagem de pico de Forma 1 de Sp-4 é apresentada na Tabela 2.

Exemplo 21-2. Forma 2 de Sp-4 Um padrão de; XRPD da Forma 2 de Sp-4 é representado na Figura 5.

Uma listagem de pico da Forma 2 de Sp-4 é apresentada na Table 3.

Exemplo 21-3. Forma 3 de Sp-4 Um padrão de XRPD da Forma 3de Sp-4 é representado na Figura 6.

Uma listagem de pico da Forma 3 de Sp....4 é apresentada na Tabela 4.

Exemplo 21-4. Forma 4 de SP-5 Um padrão de XRPD da Forma 4 de Sp-4 é representado na Figura 7.

Uma listagem de pico da Forma 4 de Sp-4 é apresentada na Tabela 5 .

Exemplo 21-5. Forma 5 de Sp-4 Um padrão de XRPD da Forma 5 de Sp-4 é representado na Figura 8.

Uma ] :i stagem de pico da Forma 5 de Sp-4 ó apresentada na Tabela 6.

Exemplo 21-6, Sp~4 (Amorfo) Um padrão para XRPD de Sp-4 amorfo es Lá representado na Figura 9.

Exemplo 22. Cristalografia de raios-X de Cristal Único de Sp-4 e seus Solvatos Exemplo 22-1. Cristalografia de Raios-X de Cristal Único de Sp-4 (Forma 1) A Figura 10 mostra uma Estrutura de cristal de Raios-X para a Forma 1 de Sp-4. Lá, a Figura mostra uma vista de moléculas da Forma 1 a partir da estrutura de cristal que mostra o esquema de numeração empregado. Os elípsóides de deslocamento atômico anisotrópico para os átomos do não hidrogênio são mostrados ao nível de probabilidade de 00". .

Os átomos de hidrogênio são exibidos com um raio arbitrariamente pequeno.

Uma solução de estrutura foi obtida por métodos diretos, refinamento por mínimos quadrados de matriz completa em F2 com ponderação w~l = g' (F„a) + (0,0592P) 2 + (0, 6950P), onde P - (F0?' + 2FC2)/3, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmônicos esféricos, implementados no algoritmo de SCALE3 ABSPACK . wR2 final = { Σ [ w ( F02-Fcz) 2 ] /Σ [ w (F„2) 2] 1/2} = 0,0871 para todos os dados, R\ convencional = 0,0329 em valores de F de 7090 refexões com F0 > 4σ( F0) , S = 1,016 para todos os dados e 870 parâmetros. A/a(rnax) final 0,001, Δ/σ (media), 0,000. Mapa cie diferença final entre +0,534 e -0,36 e Ã"~3.

Tabela 7. Parâmetros de Cristais Únicos da Forma 1 Exemplo 22-2. Cristalografia de Raios-X de Cristal Único de Sp-4 (Forma 2) A Figura 11 mostra uma Estrutura de cristal de Raios-X para a Forma 2 de Sp-4. I,á, esta Figura mostra uma vista de moléculas de Forma 2 da estrutura de cristal que mostra o esquema de numeração empregado. Os heteroátomos foram resolvidos isotrópicamente devido a dados muito fracos. Os átomos de hidrogênio não são exibidos.

Uma solução de estrutura foi obtida por métodos diretos, refinamento por mínimos quadrados de matriz completa em F2 com ponderação w'1 = L!2(F0Z) + (0,0975P)2 + (10, 6969P), onde P = (F02+2FC2)/3, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmônicos esféricos, implementados no algoritmo de escala SC ALE 3 ABSPACK. wlf final == Cd. F(.2)2] /i d iv(FcC) 2]1/2} = 0,18 83 para todos os dados, P, convencional = 0,0741 em valores de F de 2525 refexões com F0 > 411 ( F0) , S == 1,05 para todos os dados e 158 parâmetros. Li/!.J(max) final 0,000, d/d (média), 0,000. Mapa de diferença final entre +1,388 e -0, 967 e .

Tabela 8. Parâmetros de Cristais Únicos da Forma 2 Exemplo 22-3. Cristalografia de Raios-X de Cristal Único de Sp-4 (Forma 2) A Figura 12 representa uma estrutura de CristaI de raios-X (ORTEP - anisotrópico) Sp-4 (Forma 2) . Uma estrutura de cristal do solvato de cloreto de metileno do Sp-4 (Forma 2), C23H31N3PO9FC12, produz um grupo espacial monoclinico Ρ2χ (ausências sistemáticas OkO: k = impar) com a =12, 8822 (14) Ã, b = 6, 1690 (7) Á, c = 17,733 (2) À, β ---= 92, 045 (3) °, V = 1408,4 (3) A3, Z = 2 e dcai(; = 1,449 g/cm3.

Dados de intensidade raios-X foram coletados em um detector de área Rigaku Mercury CCD empregando radiação Mo-Koí monocromada- grafite (λ = 0,71073 Á) a uma temperatura de 143K. A indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de doze imagens de rotação de 0,5° com exposições de 30 segundos. Um total de 648 imagens de rotação foram coletadas de com um cristal à distância de detector de 35 mm, um ângulo de balanço 2Θ de -12°, larguras de rotação de 0,5° e exposições de 30 segundos: varredura n°. 1 foi um varredura-φ de 315 ° a 525 ° em ω = 10 ° e χ = 20 ° ; varredura n° . 2 .foi um varredura-ω de -20° a 5 ° em χ= -90 ° e $ = 315 °; varredura n°. 3 foi uma varredura -ω de -20° a 4o a χ -90 ° e φ 135 °; varredura n°. 4 foi uma varredura-ω de -20° a 5o em χ = -90 ° e φ = 225 °; varredura n°. 5 foi uma varredura- ω de -20° a 20° em χ = -90 ° e φ = 45 °. As imagens de rotação foram processadas usando Crista.lC3.ear (Crista IClear: Rigaku Corporation, 1999), produzindo uma lista de valores de F2 e o(F2) não calculados que foram passados para o pacote de programas de CristalStructure (CristalStructure: Cristal Structure Analysis Package, Rigaku Cotrp. Rigaku/MSC (2002)) para processamento adicional e solução de estrutura e em um computador Pentium TTI da Dell. Um total de 7707 Reflexões foram medidas ao longo dos intervalos de 5,48 E 2Θ < 50,04°, -14 < h < 15, -7 < k < 6, -19 < 1 < 21 rendendo 4253 reflexões únicas (Rj.nt i;: 0,0180). Os dados de Intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização e para absorção usando REQAB (transmissão máxima e mínima 0,824, 1,000). A estrutura foi resolvida por métodos diretos (SIR97, SIR97 : Altomare, A., M. Burla, M. Cama 1.1 i, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Guagliardi, A. Moliterni, G. Polidori & R. Spagna (1999) . J. Appl. Cryst., 32, 115-119) . O refinamento foi de e mínimos quadrados de matriz completa com base em F2 usando SHELXL-97 (SHFLXL-97: Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst., A64, 112-122). Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. O esquema de ponderação usado foi w=1/[o2(Fd,2 )+ 0,0472P2 + 0, 4960P] Onde P = (Fc,2 + 2FC,2 )/3. Os átomos de não hidrogênio foram refinados anisotropicamente e foram refinados usando um modelo "ridíng". 0 refinamento convergiu para Ri = 0,0328 e wR;> = 0,0817 para 4046 Reflexões para o qual F> 4o (F) e Ri -0,0348, wR2 = 0,0838 e GOF = 1,056 para todas as 4253 Reflexões diferentes de zero, únicas, e 358 variáveis Ri = Σ I I fo | - |FCM / Σ ÍF0I; wR2 = { Σ w (fu,2 - fc,2 )2 / Σ w (F0,2 )2}1/2; GOF = { w (F0,2 - Fc,2 )2 / (n - p)}1/2 Onde n = número de Reflexões e p = número de parâmetros refinados). 0 Δ/σ máximo no ciclo final dos mínimos quadrados foi 0,000 e os dois picos mais proeminentes na diferença final de Fourier foram + 0,312 e -0,389 e/Á3. O parâmetro de estrutura absoluta de Flack to.i refinado para -0,06 (6), assim, corroborando com a cstcreoquímica do composto do título. A Tabela 1 lista informações de célula, os parâmetros de coleta de dados, dados de refinamento. Os parâmetros térmicos isotrópicos equivalentes e posicionais finais e são apresentados na Tabela 2. Os parâmetros térmicos anisotrópicos estão na Tabela 3. ("ORTEP-II: A Fortran Thermal Ellipsoid Plot Program for Cristal Structure Illustrations". C.K. Johnson (1976) ORNL-5138), Representação da Molécula com 30% de probabilidade de elipsóides térmicos é exibida.

Tabela 9. Resumo da Determinação da Estrutura do Composto Sp-4 -CH^Cl^. Fó rmuJ a : C::JH , i N ,P0,,FC.l ;.

Peso da fórmula: 614,38 Classe do cristal: monoc.ld.nico Grupo espacial: '??,·. (#4) Constantes de célula: a :.3,8 88.3 (14) A

b 6,1690(7) A

c 17,733(8) A β 98,046(3)° V 1408,4(3) A ' μ 3, 4 8 cm ! tamanho do cristal, mm 0,42 x 0,18 x 0,10 D,r,h: 1,44 9 g/om' F(000) 640 Radiação: Μο-Κ„(λ~0, 71073Λ) faixa 80 5,48 - 50,04 0 hkl coletado: -14 < h < 15; -7 < k < 6; -19 <1 <21 No. reflexões mcd.idas: 7707 No. reflexões únicas: 4853 (Rin,-0 , 0 1 8 0 ) No. reflexões observadas 4046 (F>4a) No. rei. luxo es usa cia.s no 4 85 3 refinamenLu No. parâmetro s 3 58 R Índices (F>4o) R, =0,0388 wRp O, 081 7 R índices (todos os dados R;=0,0348 wR,-- 0, 0838 GOF: 1,056 Diferença final dos picos, +0,318, -0,389 c/A' Exemplo 22-4. Cristalografia de Raios-X de Cristais Únicos de Sp-4 (Forma 3) A Figura 13 mostra uma Estrutura de cristal de Raios-X para a Forma 3 de Sp-4. Lá, esta Figura mostra uma vista de moléculas de Forma 3 da estrutura de cristal, que mostra o esquema de numeração empregado. Os elipsóides de deslocamento atômico anisotrópico para os átomos de não hidrogênio são mostrados ao nível de probabilidade de 50%. Átomos de hidrogênio são exibidos com um raio arbitrariamente pequeno. A solução de estrutura foi. obtida por métodos diretos, refinamento por mínimos quadrados de matriz completa em F2 com ponderação w...1 = a2(F02) + (0 , 05 1 2P)2 + (Q,6810P), onde P = (F02+2FC2)/3, parâmetros de deslocamento anisotrópico, correção de absorção empírica usando harmônicos esféricos, implementados no algoritmo de escala S CALEI 3 ABSPACK. wR2 final = {E[w(F'02-Fc2) 2] /Z[w(F02) 2] 1/2} = 0,07 96 para todos os dados, Ri convencional == 0,0294 em valores de F de 2486 refexões com F0 > 4σ( Fc) , S = 1,068 para todos os dados e 377 parâmetros. A/a(max) final 0,001, Δ/σ(média), 0,000. Mapa de diferença final entre +0,211 e -0,334 e Á“3.

Tabela 10. Parâmetros de Cristais Únicos da Forma 3.

Exemplo 23. Estabilidade em umidade relativa e temperaturas elevadas Uma amostra de Rp-4 foi armazenada em uma câmara de umidade a 40°C e umidade relativa de 75% por uma semana, e a amostra fo.i. novamente analisada por XRPD. O padrão de pó obtido por Rp-4 não mostrou nenhuma mudança significativa durante o curso do experimento, o que significa que nenhuma mudança na forma sólida foi observada. Isto deve ser contrastado com uma amostra de 4, que deliqueseeu dentro de cerca de 16 horas após armazenagem a 40°C e umidade relativa de 75%. De fato, uma ilustração da natureza deliquescente de 4 é ilustrada pelo seguinte. Uma amostra de 4 foi passada por uma peneira de 250pm, então as amostras foram armazenadas a 40°C / 75% de UR e 25°C / 53% de umidade relativa e as observações visuais foram tomadas em intervalos regulares. Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Tabela 11. Estabilidade de 4 para umidade relativa elevada.

Durante o armazenamento a 40 “C e umidade relativa de 75% de urna amostra de Sp-4 deliquescida dentro de 16 horas. Por exemplo, uma amostra de Sp-4 foi rrtoída um almofariz e pilão, e depois sucessivamente passou por peneiras de 500 e 250 pm para produzir a amostra como um pó fino. As amostras deste material foram armazenadas a 40°C e 75% de umidade relativa e 25°C e 53% de UR e as observações visuais foram tomadas em intervalos regulares. Os resultados são apresentados na Tabela 5.

Table 12. Estabilidade de Sp-4 para umidade relativa elevada. A análise de XRPD da amostra após o armazenamento a 25°C e umidade relativa de 53% por 104 horas não apresentou nenhuma mudança signi ficativa nos difratogramas produzidos indicando gue nenhuma mudança de forma ocorreu.

Exemplo 24. Espectrometria no Infravermelho por Transformada de Fourier - (FT-IR) Os dados foram coletados em um Spectrum One Per/kin-Elmer equipado com um acessório de amostragem de Reflectância total atenuada universal (ATR). Os dados foram coletados e analisados usando o software Spectrum v5.0.1.

Os espectros de IR obtidos para 4, Rp-4, e Sp-4 são mostrados na Figs. 5-7, respectivamente. Os picos selecionados, em números de onda (cm-1) são recitados abaixo: 4: -1680, -1454, -1376, -1205, -1092, -1023 (Fig. 14) ;

Rp-4: -1742, -1713, -1679, -1460, -1377, -1259, -1157, -1079 (Fig. 15); e Sp-4 (Forma 1): -1743, -1713, -1688, -1454, -1378, -1208, -1082 (Fig. 16).

Exemplo 25. Análise Termo-Gravimétrica (TGA) por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) Os dados de DSC foram coletados em um TA Instruments Q2000 equipado com um autoamostrador de 50 posições. A calibração para a capacidade térmica foi realizada usando safira e a calibração de energia e de temperatura foi realizada usando índio certificado. A temperatura de; DSC modulada foi realizada cm tipicamente 0,8-1,2 mg de cada amostra, em um cadinho do alumínio com pequenos furos (pinholod), usando uma taxa de aquecimento subjacente de 2°C.min-i e parâmetros de modulação de temperatura de ± 0,2°C.mln"1 o 40 segundos.

Uma purga de nitrogênio seco a 50 ml. .min-1 foi mantida ao longo da amostra. O software de controle de instrumento foi Advantage para Q Series v2 .8.0.392 e Thermal Advantage v4.8.3 e os dados foram analisados usando Universal Analyses v4.3A.

Os dados de DSC foram coletados em um Mettler DSC 823e equipado com um autoamostrador de 34 posições. 0 instrumento foi cal i brado para a energ.i a e temperatura usando índio certificado. Tipicamente 0,8-1,2 mg de cada amostra, em um cadinho de alumínio com pequenos furos, foram aquecidos a 10°C.min-1 de 25°C a 250°C. Uma purga de nitrogênio a 50 ml.min-1 foi mantida ao longo da amostra. O software de análise de dados e o Instrumento de controle foi STAR v9.20.

Os dados de TGA foram coletados em um Mettler TGA/SDTA 851e equipado com autoamostrador de 34 posições. 0 instrumento teve a temperatura calibrada usando índio certificado. Tipicamente 8 a 12 mg de cada amostra foram colocados em um cadinho de alumínio pré-pesado e foram aquecidos a 10°C.min~L a partir da temperatura ambiente até 350°C. Uma purga de nitrogênio a 50 ml.min-1 foi mantida ao longo da amostra. O software de análise de dados e o Instrumento de controle foi STAR v9.20. A análise de DSC de 4 mostrou uma única endoterma ampla com um início de 58,7°C (ΔΗ 14 Jig-1) confirmou a ser devido ao relaxamento molecular durante a transição vítrea por análise de DSC modulada adicional (Fig. 17). A análise de TGA de 4 não mostrou nenhuma perda de peso antes da decomposição acima de 240°C, confirmando que o material não c soivatado. Como a análise de XRPD de 4 confirmou que o material é amorfo, a análise de DSC modulado foi rea.1 i zada em uma tentativa de calcular a temperatura de transição vítrea, que foi encontrada como sendo de 57°C. A análise de DSC que mostrou uma única endoterrna afiada com um inicio de 136,2 “C (ΔΗ 76 J.g"1) confirmou ser uma fusão por microscopia em estágio quente. Ver Fig. 18. A análise de TGA de Rp-4 não apresentou nenhuma perda de peso antes da decomposição acima de 240°C, confirmando que o material não é solvatado. A análise de DSC de Sp-4 que mostrou uma ampla endoterrna única com um inicio de 93,9°C (ΔΗ 43 J.g”1) confirmou uma fusão por microscopia em estágio quente. Ver Fig. 19. A análise de TGA de Sp-4 não apresentou nenhuma perda de peso antes da decomposição acima de 240°C, confirmando que o material não é solvatado.

Exemplo 26. Vapor de Sorção por Gravimetria (GVS) SMS DVS Intrínseca As isoterrnas de sorção foram obtidas usando um analisador de sorção de umidade intrínseca SMS DVS, controlado pelo software SMS Analysis Suite. A temperatura da amostra foi manti da a 25 °C pelos controles do instrumento. A umidade foi controlada por correntes de mistura de nitrogênio e seco úmido, com uma vazão total de 200 ml.min"1. A umidade relativa do ar foi medida por uma sonda Rotronic calibrado (faixa dinâmica de 1,0-100% de UR) , localizada perto cia amostra. A mudança de peso, (relaxamento massa) da amostra em função da % de umidade relativa foi constantemente acompanhada pela microbalança (precisão ± 0,005 mg).

Tipicamente 5-20 mg de amostra foram colocados em uma cesta de malha de aço inoxidável tarada sob condições ambientais. A amostra foi carregada e descarregada em 40% cie umidade relativa e 25°C (condições típicas cio ambiente) . A isoterma de sorção de umidade foi realizada conforme descrito abaixo (2 varreduras dando um ciclo completo). A isoterma padrão foi realizada a 25 °C em intervalos de 10% de UR em uma faixa de 0,5-90% de UR.

Tabela 13. Parâmetros de Métodos para Experimentos Intrinsicos de SMS DVS A amostra foi recuperada após da a conclusão isoterma e reana.li.sada por XRPD. A análise de CVS mostrou que Rp-4 não é higroscópico exibindo adsorção reversível de aproximadamente 0,2% em peso de água de 0 a 90% de umidade relativa. A reanálíse da amostra por XRPD após o experimento de GVS não mostrou nenhuma mudança na forma.

Uma amostra de Sp-4 foi molda com um almofariz e pilão, e depois sucessivamente passou por peneiras de 500 e 250 ym para produzir a amostra como um pó fino que foi. então analisado por um método de ciclo ún.ico modificado. A amostra foi tomada de 40% de UR (aproximadamente ambiente) a 60% de UR, em vez de 90% para o método padrão e, em seguida, um ciclada para 0% e de volta a 4 0% de UR. lista análise mostrou que Sp-4 não é higroscópico até 60% de UR, com absorção reversível de ~ 0,2% em peso de água de 0 a 60% de UR.

Exemplo 27. Solubilidade Aquosa Termodinâmica A solubilidade aquosa foi determinada pola suspensão de uma quantidade suficiente de composto em água para gerar uma concentração máxima final de 2 10 mg.ml-1 da forma livre de origem do composto. A suspensão foi equilibrada a 25°C por 24 horas, em seguida, o pH foi medido. A suspensão foi então filtrada através de um filtro de fibra de vidro C em uma placa de 96 poços. O filtrado foi então diluído por um fator de 101. A quantificação foi por HPLC com referência a uma solução padrão de aproximadamente 0,1 mg.ml-1 em DMSO. Diferentes volumes das soluções da amostra diluídas e não diluídas, padrão, foram injetados. A solubilidade foi calculada usando as áreas de picos determinadas por integração do pico encontrado no mesmo tempo de retenção que o do pico principal na injeção padrão.

Tabela 14. Parâmetros do Método de HPLC para Medições de Solubilidade A análise foi realizada sob as condições observadas acima em um sistema de Agilent série HP1100 equipado com um detector de arranjo de dlodo e usando software ChemStation vB.02.01-SR1.

Tabela 15. Resultado de solubilidade Aquosa para Rp-4, 4, e Sp-4.

Exemplo 28. Determinação da Pureza Química por HPLC

Diversas condições de HPLC podem ser usadas para determinar a pureza química dos compostos divulgados neste documento. Um desses exemplos é divulgado acima em relação aos estudos termodinâmicos de solubilidade em água. Outro exemplo é divulgado a seguir.

Condições de HPLC: LC: Waters Alliance 2695 Separations Module, detector Waters 2 996 PDA e Software Waters Empower 2 (Versão 6.00) Coluna: Fenomenex Luna C18(2); 4,6 x 50mm; 3μιη Vazão: 1,2 niL/min Volume de injeção: 10yL

Fase Móvel: Solvente A: Água 95% com Metanol 5% e Acetato de amônio lOmM; pH~5,3 Solvente B: MeOH com Acetato de amônio lOmM

Gradiente: mantido a 0%B 3 min 0-47% de B 3a4min mantido a 47 %B 4 a 10 min 4 7 %-7 4 % de B 10 a 1Imin mantido a 74% de B lia 13,5min retorno para 0% de B 13,5 a 13,6 min mantido a 0% deB 13,6 a 15,5 min Nestas condições, a pureza de 4, Rp-4, e Sp-4 foi determinada como sendo de -99,6, - 99%, e ~ 99,5%, respectivamente. Note-se que purezas mais elevadas podem ser realizadas por meio da otimização dos métodos divulgados acima. A inspeção de dif ratogramas de XRPD mostra que os dois dia stereo i sômeros Cristalinos únicos gerou claramente diferentes padrões de XRPD. Além disso, houve uma clara diferença entre o ponto de fusão dos dois diastereoisômeros Cristalinos, com Rp-4 tendo um inicio consideravelmente maior do que Sp-4 (136°C vs 94°C).

Exemplo 29. Métodos de Separação Adicionais A seguinte separação por SFC (condições listadas abaixo) produziu separação adequada de uma mistura de diastereoisómeros, Rp-4 e Sp-4. A seguinte separação por SFC (condições listadas abaixo) produziu separação adequada de uma mistura de diastereoisómeros, Rp~4 e Sp-4 .

TaJble 16. Resumo dos resultados da caracterização dos Lotes de Rp-4, 4, e Sp-4.

Exemplo 30. Cistalografia de Raios-X de 8 (isômero-Sp) 0 Composto 8 (isômero-Sp) , Ci8H2iN2P07, cristaliza no grupo espacial monoclínico P2i (ausências sistemáticas OkO: k = impar) com 5,3312 =- (4) Â, b = 15,3388 (8) Ã, c 23,7807 (13) Ã, β = 92,891 (3)°, V = 1942,2 (2) Á\ Z = 4, e dcai.c = 1, 397 g/cmJ. Dados de intensidade de raios-X foram coletados em um detector de área Bruker APEXII CCD empregando radiação Mo-Κα monocromado- grafite (λ = 0,71073 Â) a uma temperatura de 100 (1)K. As Figuras 20A e 2013 mostram moléculas numeradas de 1 e 2, respectivamente, da unidade assimétrica. A indexação preliminar foi realizada a partir de uma série de 36 estruturas de rotação de 0,5° com exposições de 30 segundos. Um total de estruturas de 3608 foi coletado com um cristal para distância de detector' de 70,00 mm, larguras do rotação cie 0,5° e exposições de 20 segundos: As estruturas de rotação foram integradas usando SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc,, Madison, Wisconsin, US.) produzindo uma listagem de valores de F2 e o'(F2) não calculados que foram então passadas para o pacote de programas de SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, US.) para processamento adicional e solução de estrutura em um computador Pentium 4 da Dell. Um total de 6909 Reflexões foi medido ao longo dos intervalos de 1,58 ^ Θ í 25,09°, -6 ^ h ^ 6, -18 < k ^ 18, -28 E 1 < 28 rendendo 6909 reflexões únicas (Rint = 0,0581) . Os dados de intensidade foram corrigidos para Lorentz e efeitos de polarização para a absorção usando SADABS (Sheldrick, GM (2007) SADABS. Universidade de Gottingen, Alemanha.) (Transmissão máxima e mínima 0,6093, 0,7452).

A estrutura foi resolvida por métodos diretos (SHELXS-97 (Sheldrick, GM (2008) Acta Cryst. A64, ]12-122.)) . O refinamento foi por mínimos quadrados de matriz completa com base em F2 usando SHELXL-97 (Sheldrick, GM (2008) Acta Cryst. A64, 112-122,). Todas as reflexões foram usadas durante o refinamento. 0 esquema de ponderação usado w=1 / [ o2 (F02 ) -t- (Ο,ΟΟΟΟΡ)2 + 14, 0 7 3 8 P ] onde P = (F0 2 + 2Fc2)/3. Os átomos de não hidrogênio foram refinados anisotropioamente e os átomos de hidrogênio foram refinados usando um modelo de "riding". 0 refinamento convergiu para Rl = 0,0847 e wR2 = 0,1899 para 6173 reflexões observadas para que F > 4o(F) e Rl-0, 0963 e wR2=0,1963 e GOF =1,1] 9 para todas as 6909 reflexões diferentes de zero, únicas o 512 variáveis (RI = Σ | | F„ I - I Fc I I / Σ | F01 ; wR2 = [Sw(F(f -F<2) 2/iw (F0;:)GOF = [Sw(F02 - Fc2)2/(n - p)]'"; onde n = o número de reflexões e p = o número de parâmetros redefinidos). 0 Δ/σ máximo no final do cilco dos quadrados mínimos foi 0, 000 e os picos mais prominent.es na diferença o final de Fourier foram +0,402 e -0,559 e/Ã · Tabela 17. Resumo da Determinação de Estrutura do Composto 8 (isômero-Sp) Exemplo 31. Atividade Biológica As células contendo Replicon foram semeadas em cada 3.000 células / poço (50 pL) em placas brancas / opacas de 96 poços, ou 1.500 células / poço (25 mlO em placas brancas / opacas de 384 poços. 50 pL do composto 2X foram adicionados na placa de 96 poços ou 25 pL do composto 2X foram adicionados na placa de 384 poços. As placas foram incubadas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO:,> umidif içada por 4 dias. Após a incubação, o reagcnte Bright-Glo (50 pL por placa de 96 poços, ou 25 pL por placa de 384 poços) foi adicionado para medir a luciferase de vagalume repórter para a replicação do HCV. O percentual de inibição foi calculado contra o controle sem fármacos.

Rp-4 e Sp-4 demonstraram ter uma ampla cobertura de genótipos. Por exemplo, ambos mostraram ser ativos contra o vírus da hepatite C, genótipos 1-4. Δ matéria objeto do Pedido de Patente US 12/053.015 e dos Pedidos de Patente Provisórios US 61/179.923, depositado em 20 de maio de 2009, e 61/319.513, depositado em 31 de março de 2010, é incorporada por referência em suas totalidades. Δ matéria objeto de todas as referências citadas é incorporada por referência. No caso em que o significado de um termo incorporado entre em conflito com o significado de um termo definido neste documento, o significado dos termos contidos na presente divulgação prevalecem sobre o significado dos termos incorporados.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1 . Processo para preparar um composto representado pela fórmula 4, ou um diastercoisômero a base de fosfóro do mesmo: 4em que P* representa um átomo de fósforo quiral, caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagir um isopropil-alanato A, um di-X'- fenilfosfato B, 2 1-desóx i.-2 '-f lúo.r-2 '-C-met iluridina 3, c uma base para obter uma primeira mistura compreendendo 4, ou um diastereoisômero a base de fosfóro do mesmo: A B 3 em que X é uma base conjugada de um ácido, n é 0 ou 1, e X' é um halogênio; b) reagir a primeira mistura com um composto de proteção para obter uma segunda mistura compreendendo 4, ou um diastercoisômero a base de fosfóro do mesmo; e o) opcionalmente submeter a segunda mistura à cristalização, cromatografia, ou extração para obter 4, ou um diastereoisômero a base de fosfóro do mesmo.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é cristalino ί?ρ-4 : V4 r caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: d) dissolver ou suspender a segunda mistura ou a terceira mistura em um solvente; e) opcionalmente seguido pela semeadura com cristalino Rp-4; e f) adicionar antissolvcntc suficiente para obter cristalino .Rp-4 .

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é cristalino Sp-4: -V4 caracterizado pelo fato de que compreende adi ciona.Imente: d) dissolver ou suspender a segunda mistura ou o Sp-4 purificado em um solvente seguido pela semeadura com cristalino Sp-4 em temperatura ambiente; e) coletar um primeiro sólido, a maior.i..a do qual compreende Sp-4; f) dissolver ou suspender o primeiro sólido em um solvente em sua temperatura de refluxo; e g) resfriar ou adicionar um antissolvelte para obter um segundo sólido.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, em que o composto é cristalino Sp-4: V -4 l’p * caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: d) dissolver ou suspender a segunda mistura ou o SP-4 purificado em um primeiro solvente, seguido pela adição de um antissolvente, de modo a obter uma primeira composição em que o solvente/antissolvente residual é removido por decantação para obter um resíduo; e) tratar o resíduo com uma solução contendo o primeiro solvente e o antissolvente para produzir uma segunda composição em que a redução da pressão produz um primeiro sólido; £) dissolver ou suspender o primeiro sói ido usando um segundo solvente de modo a obter uma terceira composição; g) adicionar cristais de semente do Sp-4 para a terceira composição; h) coletar um segundo sólido; i) dissolver ou suspender o segundo sólido em um terceiro solvente, opcionalmente aquecido à temperatura do refluxo do terceiro solvente para obter uma quarta composição e, se necessário, j) resfriar a quarta composição para obter um terceiro sólido compreendendo Sv-4, que é coletado por filtração.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, em que o c ornp osto é c r i s t a 1 i η o Sp - 4 : V4 caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: d) adicionar sílica gel à segunda mistura ou à terceira mistura seguido por evaporação dó solvente para produzir uma lama seca; e) agitar a lama seca em uma primeira combinação de solvente/antissoivente para obter uma primeira lama úmida; f) decantar a primeira combinação de solvente/antissoivente da primeira lama úmida para obter uma segunda lama úmida e uma primeira composição; g) adicionar à segunda lama úmida uma segunda comb.i.nação de solvente/antissoivente seguido por agitação; h) decantar a segunda combinação de solvente/antissoivente da segunda lama úmida para obter uma terceira lama úmida e uma segunda composição; i) opcionalmente, repetir as etapas g)-h) sobre a terceira lama úmida ou lamas úmidas adicionais; j) evaporar o solvente da segunda composição e, opcionalmente, qualquer composição adicional obtida a partir da etapa i) opcional para obter um primeiro sólido; k) dissolver ou suspender o primeiro sólido em uma solução contendo um terceiro solvente e, opcionalmente, um quarto solvente para obter uma terceira composição; l) opcionalmente, adicionar cristais de semente de S»-4 para a terceira composição; m) obter a partir da terceira composição um segundo sólido compreendendo SP-4; e n) opcionalmente, recristalizar o segundo sólido usando um terceiro solvente para obter um terceiro sólido compreendendo SP-4.

6. Processo para preparar o composto JRp-4 : R ,,-4 ' caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato C', com 2'-desóxi-2'~fluor-2'-C-metiluridina 3'-O-protegido ou não protegido 3, e um reaqente básico para obter Rp-4 protegido ou não protegido: 3 C" em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio e I,G' ó um grupo de saida.

7. Processo para preparar o composto Sp-4 : Λ>4 caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato C, com 2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina 3'-O-protegido ou não protegido 3, e um reagente básico para obter Sp-4 protegido ou não protegido 3 C em que Z é um grupo de proteção ou hidrogênio e LG' é um grupo de saída.

8. Processo, de acordo com a reinvidicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que LG' é tosilato, canforsu.lfonato ou um arilóxído substituído com pelo menos um grupo retirador de elétrons.

9. Processo, de acordo com a reinvidicação 8, caracterizado pelo fato de que LG' é p-nitrofenóxido, 2,4-d.i.ni trof enóxido ou pentafluorf enóxido .

10. Processo para preparar o composto Pp-4: Rp-4 caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagir um isopropil-alanil-f osf orarnidato com 2'-desóxi-2'-flúor-2'-C-metiluridina 3'-O-protegido ou não protegido 3, e um reagente básico para obter uma composição compreendendo 7?p-4 protegido ou não protegido: em que LG' é um grupo de saída, em que o isopropil-alanil-fosforarnidato é compreendido de uma mistura de diastereoisômeros Ce C' representado pelas seguintes estruturas: c c r em que o reagente básico é cloreto de t-butilmagnésio, e em que a razão de C:C' é maior que cerca de 1:1.

11. Processo para preparar o composto Sp-4: ■V4 caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagir um isopropil-alanil-fosforamidato com 2'-desóxi-2'-fluor-2'-C-metiluridina 3'-O-protegido ou não protegido 3, e um reaqente básico para obter uma composição compreendendo Sp-4 protegido ou não protegido: em que LG' é um grupo de saída, em que o isopropil-alanil-fosforamidato é compreendido de uma mistura de diastereoisômeros C e C' representado pelas seguintes estruturas: C C' em que o reagente básico é cloreto de t-butilmagnésio, e em que a razão de C:C' é maior que cerca de 1:1.

12. Composto caracterizado pelo fato de ser representado pela estrutura: em que LG' é tos 1 Lato, canforsul fonato, um arilóxido, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo retirador de elétrons.

13. Composto caracLerizado pelo fato de ser representado pela estrutura: C C· em que LG ' é um grupo de saída.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que LG' é tosilato, canforsulfonato, um arilóxido, ou um arilóxido substituído com pelo menos um grupo retirador de elétrons.

15. Processo para preparar o composto, como definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender: 1) reagir (LG')P(0) (LG)?. com (i) isopropi 1 -a lanado e uma primeira base para obter (LG ' ) P (0) (LG) (Ala-''Pr) , seguido pela reação de (LG')P(0) (LG) (Ala-^Pr) com fenol e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C', (íi) fenol e uma primeira base para obter (LG’)P(0)(LG)(OPh) seguido pela reação de (LG’)P(0)(LG)(OPh) com isopropil-alanato e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C', ou (iii) combinar .isopropil-alanato, fenol e pelo menos uma base para obter uma mistura compreendendo C e C', ou 3) .reagir (PhO)P(O) (.LG)?, em que LG ’ , independente de LG, é um grupo de saída, com (i) isopropil-alanato e uma primeira base para obter (PhO)P(O)(LG)(Ala-lPr), seguido pela reação de (PhO)P(O) (LG) (Ala-JPr) com um precursor de grupo de saída e uma segunda base para obter uma mistura compreendendo C e C1 , c c e submeter a mistura à extração, cromatografia, ou critalização para obter C ou C' .