JPH10507776A - トロンボポエチン受容体に結合するペプチドおよび化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 受容体は、トロンボポエチン受容体に結合して、活性化するペプチドおよびペプチド擬態物である。このようなペプチドおよびペプチド擬態物は、血液学的疾患、とりわけ化学療法、放射線療法、または骨髄移植によって生じた血小板減少症の治療方法の他、標識されたペプチドおよびペプチド擬態物を用いた診断法法において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンボポエチン受容体に結合するペプチドおよび化合物本件に関わる相互参照 本出願は、1995年６月７日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第08/485,301号 および1995年６月７日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第08/478,128号の一部 継続出願であり、全ての目的で、参照文献として両者の全体を本明細書の一部と する。発明の背景 本発明は、トロンボポエチン受容体（c-mplまたはＴＰＯ-Ｒ）に結合して、活 性化するペプチドおよび化合物、あるいは、そうでなければＴＰＯアゴニストと して作用するペプチドおよび化合物を提供する。本発明は、生物化学および医化 学の分野に応用することができ、とりわけヒトの疾病を治療するために使用され るＴＰＯアゴニストを提供する。 巨核球は骨髄由来の細胞であり、循環血流中の血小板を産生するのに必要であ ろ。多くの種において、巨核球は骨髄細胞の0.25％未満を占めるにすぎないが、 容積は、典型的な骨髄細胞の10倍である。クーターら（Ｋuter et al.）の「Ｐr oc.Ｎatl.Ａcai.Ｓci.ＵＳＡ」91:11104-11108(1994)を参照されたい。巨核球は 、核内有糸分裂として知られる過程を経て核を複製するが、細胞分裂は行わず、 それによって倍数細胞が生じる。血小板の数が減少すると、核内有糸分裂速度が 増大し、倍数性がさらに増大した巨核球が形成され、巨核球の数が３倍にまで増 えるかもしれない。ハーカー（Ｈarker）の「Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.」47:458-465(1 968)を参照されたい、対照的に、血小板の数が上昇すると、核内有糸分裂速度が 減少し、倍数性が減少した巨核球が形成され、巨核球の数が、50％にまで減少す るかもしれない。 循環血小板の量が、骨髄巨核球の核内有糸分裂速度および数を制御する正確な 生理学的フィードバック機構は知られていない。現在では、このフィードバック ループの仲介に関与する循環血小板生産因子は、トロンボポエチン(ＴＰＯ)であ る と考えられている。 さらに具体的にいえば、ＴＰＯは、血小板減少症に含まれる症状において、主要 な液性調節因子であることが示されてきた。例えば、メトカルフ（Ｍetcalf）の 「Ｎature」369:519-520(1994)を参照されたい。いくつかの研究において、ＴＰ Ｏが血小板数、血小板サイズ、レシピエント動物の血小板中へのアイソトープの 取込みを増大させることが示されている。具体的には、ＴＰＯは、いくつかの方 法で、巨核球に影響を与える：すなわち、 (1)巨核球のサイズおよび数を増大させる； (2)ＤＮＡ含量の増加をもたらす； (3)巨核球の核内有糸分裂を増加させる； (4)巨核球の成熟を促進せしめる； (5)アセチルコリンエステラーゼ陽性小細胞の形をした、骨髄中の前駆体細胞 数を増加せしめる と考えられている。 血小板（トロンボサイト）は血液凝固に必要であり、血小板の数がきわめて少 ないと、患者は大出血のために死亡する危険がきわめて大きく、ＴＰＯは、例え ば、主として血小板欠損による疾患などの、様々な血液学的な疾患の診断および 治療の両者に、有用に応用できる可能性をもっている。現在進行中の、ＴＰＯの 臨床試験により、ＴＰＯを患者に対して、安全に投与し得ることが示されている 。さらに、近年の研究により、ＴＰＯ療法の効力を血小板減少症（特に化学療法 、放射線療法、または癌もしくはリンパ腫の治療としての骨髄移植の結果生じた 血小板減少症）の治療にまで拡張していくことに対する基礎が得られている。例 えば、マクドナルド（ＭcＤonald）Ａm.Ｊ.Ｐed.Ｈematology/Ｏncology 14:8-2 1(1992)を参照されたい。 ＴＰＯをコードする遺伝子は、既にクローニングされ、特性が明らかとなって いる、クーターらの「Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ」91:11104-11108(1994); バーレーら（Ｂarley et al.)の「Ｃell」77: 1117-1124(1994); カウシャンス キーら（Ｋaushansky et al.）の「Ｎature」369: 568-571(1994); ウェンドリ ングら（Ｗendling et al.）の「Ｎature」369:571-574(1994); サウベージら（ Ｓauvage et al.）の「Ｎature」369:533-538(1994)を参照されたい。トロンボポエチンは 、見かけの分子量が25〜31kＤaであり、共通のＮ末端アミノ酸配列を有する少な くとも２つの型が存在する糖タンパク質である。バートレーら（Ｂartley et al .）の「Ｃell」77: 1117-1124(1994)を参照されたい。トロンボポエチンは、Ａr g-Ａrg切断を受け得る部位によって分断される、二つの別個の領域を有するよう である。該アミノ末端領域は、ヒトとマウスの間で、高度に保存されており、エ リスロポエチン、インターフェロン-aおよびインターフェロン-bと幾分相同性が ある。カルボキシ末端領域は、種によって大きく相違が見られる。 ヒトＴＰＯ-Ｒ（c-mplとしても知られている）のＤＮＡ配列およびコードされ ているペプチド配列は既に文献に記載されている。ビゴンら(Ｖigon et al.)の「 Ｐroc.Ｎatl.Ａca.Ｓci.ＵＳＡ」89:5640-5644(1992)を参照されたい。ＴＰＯ-Ｒ はヘマトポエチン成長因子受容体ファミリーの一員であり、該ファミリーは、細 胞外ドメインが、Ｎ末端部位に存在する４つの保存されたシステイン残基、およ び膜貫通領域付近のＷＳＸＷＳモチーフを含むという共通の構造デザインをもつ ことによって特徴付けられる。バーザン（Ｂazan）のＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ 87:6934-6938(1990)を参照されたい。該受容体が、造血において機能的 な役割を果たしているという証拠には、受容体の発現が脾臓、骨髄、またはマウ ス胎児の肝臓（スーリら（Ｓouyri et al.）の「Ｃell」63:1137-1147(1990)を 参照されたい）およびヒトの巨核球、血小板およびＣＤ34⁺細胞(メチアら(Ｍeth ia et al.)「Ｂlood」82: 1395-1401(1993))に限局しているという観察が含まれる 。さらに、ＣＤ34⁺細胞をmplＲＮＡのアンチセンス合成オリゴヌクレオチドに晒 すと、赤芽球または骨髄球のコロニー形成には影響を与えずに、巨核球コロニー の出現を阻害する。研究者の中には、Ｇ-ＣＳＦおよびエリスロポエチン受容体 の場合と同様に、該受容体はホモ２量体として機能すると推量する者もいる。 クローニングされたＴＰＯ-Ｒ遺伝子が入手可能となったことにより、この重 要な受容体のアゴニストの探索が盛んになっている。組換え受容体タンパク質が 入手可能になったことにより、種々のランダムまたは準ランダムなペプチドを多 様に生成する系において、受容体-リガンド相互作用の研究を行うことが可能と なっている。 これらのシステムには、アメリカ合衆国特許第5,270,170号および第5,338,665 号に記載されている「プラスミド上のペプチド」システム；1991年６月20日出願 、アメリカ合衆国特許出願番号第07/718,577号、1990年６月20日出願、アメリカ 合衆国特許出願番号第07/541,108号、クウィーラら(Ｃwirla et al.)の「Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ」87: 6378-6382(1990)に記載されている「ファージ上 のペプチド」システム；1993年10月29日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第08 /144,775号およびＰＣＴ ＷＯ 95/11992に基づく、これらの一部継続出願である 1994年９月２日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第08/300,262号に記載されて いる「ポリソーム」システム；1993年11月12日出願、アメリカ合衆国特許出願番 号第08/146,886号、1992年９月16日出願、第07/946,239号、1991年９月18日出願 、第07/762,522号に記載されている「コードされた合成ライブラリー」システム ；アメリカ合衆国特許第5,143,854号に記載されている「きわめて大規模な固定 化されたポリマー合成」システム；1990年12月13日公開、ＰＣＴ国際公開番号第 90/15070：1990年12月６日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第07/624,120号； フォドールら(Ｆodor et al.)の「Ｓcience」251: 767-773(2/1991);ダウアーおよ びフォドール（Ｄower and Ｆodor)の「Ａnn.Ｒep.Ｍed.Ｃhem」26:271-180(199 1)；および1991年12月６日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第07/805,727号が 含まれ、前出の特許出願および刊行物は、参照文献として、それぞれ本明細書の 一部をなす。 血小板減少症を患っている患者の血小板レベルの回復が遅いことは、由々しい 問題であり、血小板の再生を加速することができる血液成長因子アゴニストの探 索を危急のものとしている。本発明は、そのようなアゴニストに関する。発明の概要 本発明は、少なくとも、ＴＰＯ-Ｒに強く結合するという特性、およびＴＰＯ- Ｒを活性化し得るという特性を有する特定の低分子量ペプチドおよびペプチド擬 態物（peptide mimetics）を決定するという、新規且つ予期されない発見を目指 したものである。従って、このようなペプチドおよびペプチド擬態物は、ＴＰＯ によって仲介される症状（例えば、化学療法、放射線療法または骨髄移植によっ て生じ た血小板減少症）を治療するという治療目的の他、造血機構の研究における診断 目的、および巨核球および関連始源細胞をインビトロで増殖するのに有用である 。 治療目的および／または診断目的に適する、ペプチドおよびペプチド擬態物は 、ＩＣ₅₀（以下の実施例３（実施例中では、ＩＣ₅₀が小さいほど、ＴＰＯ-Ｒへ の結合親和性が強くなる）で明示されている、結合親和性アッセイによって決定 される）が、約２ｍＭ以下である。薬学的な目的においては、ペプチドおよびペ プチド擬態物のＩＣ₅₀は、好ましくは、約100μＭ、より好ましくは、500nＭに すぎない。好適な実施態様においては、ペプチドまたはペプチド擬態物の分子量 は、約250〜8000ダルトンである。 診断目的に用いる場合には、ペプチドおよびペプチド擬態物は、好ましくは、 検出可能な標識でラベルされており、それ故このような標識をもたないペプチド およびペプチド擬態物は、標識されたペプチドおよびペプチド擬態物の調製にお ける中間体としての役割を果たす。 分子量およびＴＰＯ-Ｒへの結合親和性に関して、設定された基準に適合する ペプチドは、９個以上のアミノ酸を具備し、該アミノ酸は、天然に存在するアミ ノ酸または合成（天然には存在しない）アミノ酸である。ペプチド擬態物には、 以下の修飾： １以上のペプチド［-Ｃ(Ｏ)ＮＲ-］結合（ボンド）が、-ＣＨ₂-カルバメート ［-ＣＨ₂-Ｃ(Ｏ)ＮＲ-］結合；ホスホネート結合；-ＣＨ₂-スルホンアミド［-Ｃ Ｈ₂-Ｓ(Ｏ)₂ＮＲ-］結合；尿素［-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ-］結合；-ＣＨ₂-２級アミン 結合；またはアルキル化ペプチド結合［-Ｃ(Ｏ)ＮＲ⁶-ここでＲ⁶は低級アルキル ］のような非ペプチド結合に置換されたペプチド； Ｎ末端が、-ＮＲＲ¹基；-ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ基；ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ基；-ＮＲＳ(Ｏ)₂ Ｒ基；-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ基（ここで、ＲおよびＲ¹は水素または低級アルキル（ ただしＲおよびＲ¹の両者が水素であってはならない））；スクシンイミド基； ベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-(ＣＢＺ-ＮＨ-)基；またはフェニル環上に、低 級アルキル、低級アルコキシ、塩素、および臭素からなる群から選択される、１ 〜３個の置換基を有する」ベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-基に誘導化されてい るペプチド； または、Ｃ末端が、-Ｃ(Ｏ)Ｒ²（ここでＲ²は低級アルコキシおよび-ＮＲ³Ｒ⁴ （こ こで、Ｒ³およびＲ⁴は、水素および低級アルキルからなる群から独立に選択され る）からなる群から選択される）に誘導化されているペプチド を１以上有するペプチドが含まれる。 従って、好適なペプチドおよびペプチド擬態物には、 (1)分子量がおよそ5000ダルトン以下で、且つ (2)ＩＣ₅₀で表した、ＴＰＯ-Ｒへの結合親和性が、約100μＭにすぎない ような化合物が含まれる。 ここで、該ペプチドの-Ｃ(Ｏ)ＮＨ-結合のうちの０〜全部が、-ＣＨ₂-ＯＣ(Ｏ )ＮＲ-結合：ホスホネート結合：-ＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)₂ＮＲ-結合；-ＣＨ₂-ＮＲ結合； および-Ｃ(Ｏ)ＮＲ⁶-結合；および-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ-結合（ここでＲは水素また は低級アルキルであり、Ｒ⁶は低級アルキルである。）からなる群から選択され る結合に置換され； さらに、前記ペプチドまたはペプチド擬態物のＮ末端は、-ＮＲＲ¹基；-ＮＲ Ｃ(Ｏ)Ｒ基：ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ基；-ＮＲＳ(Ｏ)₂Ｒ基；-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ基；ス クシンイミド基；ベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-基；およびフェニル環上に、 低級アルキル、低級アルコキシ、塩素、および臭素（ここで、ＲおよびＲ¹は水 素または低級アルキルからなる群から独立に選択される）からなる群から選択さ れる、１〜３個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-基からなる群 から選択され； さらに前記ペプチドまたはペプチド擬態物のＣ末端は、式-Ｃ(Ｏ)Ｒ²（ここで Ｒ²は、ヒドロキシ、低級アルコキシおよびＮＲ³Ｒ⁴（ここでＲ³およびＲ⁴は、 水素および低級アルキルからなる群から独立に選択される、また環状ペプチドお よび生理学的に受容可能な、該環状ペプチドの塩を作るために、任意に、該ＮＲ³ Ｒ⁴の窒素原子をペプチドのＮ-末端のアミン基してもよい））を有する。 関連した実施態様においては、本発明は、共有結合によって結合された検出可 能な標識を有する、前述したようなペプチドまたはペプチド擬態物を具備する、 標識されたペプチドまたはペプチド擬態物に誘導される。 本発明の、いくつかの実施態様においては、使用するのに好適なペプチドには 、アミノ酸配列： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₁はＣ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｖ：Ｘ₂はＦ,Ｋ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ ；Ｘ₃は Ｃ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＷ：Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ 酸のうちのいずれでもよい：Ｘ₅はＡ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ,ＶまたはＹ ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；およびＸ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ, ＲまたはＶである。）を具備するコア構造を有するペプチドが含まれる。 好適な実施態様においては、該コアペプチドは、アミノ酸配列： Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₁はＬ,Ｍ,Ｐ,ＱまたはＶ；Ｘ₂はＦ,Ｒ,ＳまたはＴ；Ｘ₃はＦ,Ｌ, ＶまたはＷ；Ｘ₄はＡ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｒ.Ｓ,ＶまたはＴ；Ｘ₅はＡ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ ,ＳまたはＴ；Ｘ₇はＣ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,ＭまたはＶ；および各Ｘ₈残基は、遺伝的にコ ードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れか、それらの立体異性体であるＤ-アミ ノ酸；および非天然のアミノ酸から独立に選択される。）を具備する。好ましく は、各Ｘ₈残基は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れかから、お よびそれらの立体異性体であるＤ-アミノ酸のうちの何れかから独立に選ばれる 。好適な実施態様においては、Ｘ₁はＰ；Ｘ₂はＴ；Ｘ₃はＬ；Ｘ₄はＲ；Ｘ₅はＥ またはＱ；Ｘ₇はＩまたはＬである。 さらに好ましくは、コアペプチドは、アミノ酸配列： Ｘ₉Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₉はＡ,Ｃ,Ｅ,Ｇ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；およびＸ₈ はＡ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｋ,Ｌ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶである。）を具備する。より好まし くは、Ｘ₉はＡまたはＩ；およびＸ₈はＤ,ＥまたはＫである。 特に好適なペプチドには、：ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧ;ＧＮＡ ＤＧＰＴＬＲＱＷＬＥＧＲＲＰＫＮ;ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧＫ; ＴＩＫＧＰＴＬＲＱＷＬＫＳＲＥＨＴＳ;ＳＩＥＧＰＴＬＲＥＷＬＴＳＲＴＰＨ Ｓ;ＬＡＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＨＧＮＧＲＤＴ;ＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣ; およびＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡが含まれる。 さらに本発明の実施態様では、本発明において使用するのに好適なペプチドに は、アミノ酸配列： ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₂はＫ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ またはＶ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れか；Ｘ₅は Ａ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｓ,Ｖま たはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；およびＸ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ, Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶである。）を具備するコア構造を有するペプチドが含まれる。 さらに好適な実施態様においては、Ｘ₄はＡ,Ｅ,Ｇ,Ｈ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ またはＷである。別の実施態様では、Ｘ₂はＳまたはＴ；Ｘ₃はＬまたはＲ；Ｘ₄ はＲ；Ｘ₅はＤ,ＥまたはＧ；Ｘ₆はＦ,ＬまたはＷ：Ｘ₇はＩ,Ｋ,Ｌ,ＲまたはＶで ある。特に好適なペプチドには、：ＧＧＣＴＬＲＥＷＬＨＧＧＦＣＧＧが含まれ る。 さらなる実施態様においては、本発明において使用するのに好適なペプチドに は、アミノ酸配列： Ｘ₈ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで：Ｘ₂はＦ,Ｋ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ ,Ｓ,ＶまたはＷ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸の何れか；Ｘ₅は Ａ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ,ＶまたはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,Ｗま たはＹ；Ｘ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶ；Ｘ₈は遺伝的にコードされる2 0のＬ-アミノ酸のうちの何れかである。）を具備する構造を有するペプチドが含 まれる。いくつかの実施態様においては、Ｘ₈は、好ましくは、Ｇ,Ｓ,Ｙまたは Ｒである。 本明細書に記載されている化合物は、ＴＰＯによって実施される疾病の予防お よび治療において有用であり、特に、化学療法、放射線療法または骨髄移植によ って起こる血小板減少症を含む（ただしこれに限定はされない）血液学的疾病の 治療に有用である。このように、本発明は、ＴＰＯアゴニストによる治療が効果 的であるような疾患を患う患者を治療する方法をも提供し、患者は本発明の化合 物を治療的有効投与量もしくは有効量与えられるか、または投与される。 本発明は、本明細書に記載された化合物を１以上具備する薬学的組成物および 生理学的に受容可能な担体も提供する。これらの薬学的組成物は、吸入可能な粉 末および吸入可能な溶液、注射可能な溶液および注入可能な溶液の他、経口投与 形態を含む様々な形態であり得る。図面の簡単な説明 図１Ａ-Ｂは、種々のペプチド存在下における、機能に関するアッセイ（本ア ッセイは実施例２において記載されている）結果を示している。図１Ａは、本発 明 のペプチドの中から選択したペプチドに対して、ＴＰＯ-Ｒをトランスフェクト したＢa/Ｆ3細胞の増殖アッセイを行った結果をグラフとして図示したものであ り： ■は、ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧＫ（ビオチン）の結果を表し； ×は、ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧの結果を表し； ▲は、ＬＡＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＨＧＮＧＲＤＴの結果を表し； ○は、ＧＮＡＤＧＰＴＬＲＱＷＬＥＧＲＲＰＫＮの結果を表し、 ＋は、ＴＩＫＧＰＴＬＲＱＷＬＫＳＲＥＨＴＳに対する結果を表している。 図１Ｂは、同じペプチドおよび親細胞株を用いた結果をグラフとして図示した ものである。 図２Ａ-Ｃは、ＴＰＯ-ＲをトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞の増殖アッセイ を用いるペプチドのオリゴマー化の結果を示す。図２Ａは、複合体化した、ビオ チン化ペプチド（ストレプトアビジン(ＳＡ)を有するＡＦ 12285）を用いて、ト ランスフェクトした細胞株および親細胞株の両者に対して行っアッセイの結果を 示す。 図２Ｂは、遊離のビオチン化ペプチド（ＡＦ 12285）を用いて、トランスフェク トした細胞株および親細胞株の両者に対して行ったアッセイの結果を示す。図２ Ｃは、ストレプトアビジンのみを用いて、トランスフェクトした細胞株および親 細胞株の両者に対して行ったアッセイの結果を示す。 図３Ａ-Ｇは、一連の対照実験の結果を示し、ＴＰＯ-Ｒをトランスフェクトし たＢa/Ｆ3細胞株、該細胞株に対応する親株、またはＥＰＯ-依存性細胞株の何れ かを用いた細胞増殖アッセイにおけるＴＰＯ活性、本発明のペプチドの活性、Ｅ ＰＯ活性およびＥＰＯ-Ｒ結合ペプチド活性を示している。図３Ａは、ＴＰＯ-Ｒ をトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株および該細胞株に対応する親株を用いた 細胞増殖アッセイにおけるＴＰＯの結果を表している。図３Ｂは、ＴＰＯ-Ｒを トランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株および該細胞株に対応する親株を用いた細 胞増殖アッセイにおけるＥＰＯの結果を表している。図３Ｃは、ＴＰＯ-Ｒをト ランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株中での、複合体化した、ビオチン化ペプチド （ストレプトアビジン(ＳＡ)を有するＡＦ 12285）およびビオチン化されたＥＰ Ｏ-Ｒ結合ペプチド（ＳＡを有するＡＦ 11505）の複合体の結果を表している。 対応する親細胞株の結果は、図３Ｄに示されている。図３Ｅは、ＥＰＯ依存性細 胞株を用いた細胞増殖アッセイにおける ＴＰＯの結果を表していろ。図３Ｆは、ＥＰＯ依存性細胞株を用いた細胞増殖ア ッセイにおけるＥＰＯの結果を図示している。図３Ｇは、ＥＰＯ依存性細胞株に おける、複合体化した、ビオチン化ペプチド(ストレプトアビジン(ＳＡ)を有す るＡＦ 12285)およびビオチン化されたＥＰＯ-Ｒ結合ペプチド（ＳＡを有するＡ Ｆ 11505）の複合体の結果を表している。 図４Ａ-Ｃは、ベクターpＪＳ142中への、プラスミド上ペプチドライブラリー の構築を表している。図４Ａは、遺伝子の制限地図および制限部位を示している 。該ライブラリープラスミドは、rrnＢ転写終結因子、アンピシリンによる選択 を可能とするためのbla遺伝子、一本鎖ＤＮＡの救出を可能とするためのＭ13フ ァージ遺伝子内領域（Ｍ13 ＩＧ）、プラスミドの複製起点（ori）、二つのlac Ｏs配列、およびlac融合遺伝子の発現を誘導するaraＢプロモーターの正の調節 および負の調節を可能とするaraＣ遺伝子を含んでいる。図４Ｂは、ライブラリ ーの構築において用いられるＳfiＩ部位およびＥagＩ部位を含む、lacＩ遺伝子 の3'末端におけるクローニング領域の配列を示している。図４Ｃは、アニールさ れたライブラリーオリゴヌクレオチド、ＯＮ-829、およびＯＮ-830をpＪＳ142の ＳfiＩ部位へ連結してライブラリーを作成する様子を示している。配列中の一文 字分のスペースは、連結部位を示している。 図５Ａ-Ｂは、pＥＬＭ３およびpＥＬＭ15 ＭＢＰベクター中へのクローニング を表している。図５Ａは、ＭＢＰコーディング配列、ポリアスパラギンリンカー 、Ｘa因子プロテアーゼ切断部位、および利用可能なクローニング部位を含む、m alＥ融合遺伝子の3'末端の配列を示す。ベクターの残りの部分は、ニューイング ランドバイオラボ（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs）から入手可能な、pＭＡＬc2(pＥ ＬＭ3)およびpＭＡＬp2（pＥＬＭ15）から誘導される。図５Ｂは、ＢspＥII-Ｓc aＩライブラリー断片をＡgeＩ-ＳcaＩによって消化されたpＥＬＭ3/pＥＬＭ15中 へ転移せしめた後の、ベクターの配列を示している。該転移された配列には、p ＪＳ142ライブラリーからのＧＧＧペプチドリンカーをコードする配列が含まれ る。 図６Ａは、pＣＭＧ14ベクター中で、ヘッドピース二量体ライブラリーを構築 するための遺伝子の制限地図および制限部位を図示している。ライブラリープラ スミドは、:rrnＢ転写終結因子、アンピシリンに対する選択を可能にするための bla 遺伝子、一本鎖ＤＮＡの救出を可能にするためのＭ13ファージ遺伝子内領域(Ｍ1 3ＩＧ）、プラスミド複製起点（ori）、lacＯs配列１つ、およびヘッドピース二 量体融合遺伝子の発現を誘導するaraＢプロモーターの正の制御および負の制御 を可能とするaraＣ遺伝子を含む。図６Ｂは、ライブラリーの構築において用い られるＳfiＩ部位およびＥagＩ部位を含む、ヘッドピース二量体遺伝子の3'末端 におけるクローニング領域の配列を図示している。図６Ｃは、ライブラリーを作 成するために、pＣＭＧ14のＳfiＩ部位に、アニールされたＯＮ-1679、ＯＮ-829 およびＯＢ-830を連結する様子を示している。配列における、１文字分のスペー スは連結部位を意味している。 図７〜９までは、本発明のペプチドおよびペプチド擬態物の活性を、さらに評 価するためのアッセイ結果を示す。このアッセイでは、カルボプラチン（carbop latin）を用いて、マウスを血小板減少症にしている。図７は、第０日に、カル ボプラチン（125mg/kg腹腔内）でＢalb/Ｃマウスを処置したときの、典型的な結 果を図示している。破線は、３つの実験における未処置動物を表している。実線 は、３つの実験におけるカルボプラチン処置群を表している。太い実線は、従来 データを表している。図８は、示された量（mg/kg、第０日に腹腔内へ）のカル ボプラチンで処置したマウスにおいて、カルボプラチンの滴定が血小板の数に及 ぼす影響を図示している。図９には、カルボプラチンで誘導された血小板減少症 が、第10日目において、ＡＦ12513（513）ペプチドにより、改善されている様子 が図示されている。カルボプラチン（ＣＢＰ;50-125mg/kg、腹腔内）は、第０日 目に投与された。ＡＦ12513（1mg/kg、腹腔内）は、第1-9日に与えられた。特定の実施態様の記載 １.定義および一般的なパラメーター 以下の記述は、本明細書において、本発明を記述するために用いられる、様々 な用語の意味および範囲を説明し、定義するためのものである。 「アゴニスト」とは、生物学的に活性な相補的受容体に結合して、受容体を活 性化し、受容体の生物学的応答を引き起こすか、または元から存在している、受 容体の生物学的活性を増強する、生物学的に活性なリガンドを指している。 「薬学的に受容可能な塩」は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カル シウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩およびプロタミンの亜 鉛塩（本分野においてよく知られた方法で調製される）を含む、アルカリ金属塩 、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩などの製薬産業で一般的に使用さ れる、無毒性の塩を指している。本用語には、無毒性の酸を添加した塩も含まれ 、一般的には、適当な有機酸または無機酸と本発明の化合物を反応させることに よって調製される。代表的な塩には、塩化水素塩、臭化水素塩、硫酸塩、重硫酸 塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、ホウ酸塩、安息 香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸 塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩（napsylate）、およびそれらの類似 物が含まれる。 「酸を添加した、薬学的に受容可能な塩」は、遊離塩基の生物学的有効性およ び特性を保持し、且つ生物学的な不都合またはその他の不都合を示さないような 、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、および酢 酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸 、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、 マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サ リチル酸などのような有機酸からなる塩を指している。プロドラッグとして、酸 を添加した薬学的に受容可能な塩を用いるためには、バンドガード（Ｂundgaard ,Ｈ.,上記）の記述を見られたい。 「薬学的に受容可能なエステル」は、エステル結合を加水分解したときに、カ ルボン酸またはアルコールの生物学的有効性および特性が保持され、且つ生物学 的な不都合またはその他の不都合を示さないようなエステルを指している。プロ ドラッグとして、薬学的に受容可能なエステルを用いるためには、バンドガード 編集の「プロドラッグのデザイン」、エルゼビアサイエンス出版社（Ｅlsevier Ｓcience Ｐublishers）、アムステルダム（1985）の中の記述を見られたい。こ れらのエステルは、典型的には、対応するカルボン酸およびアルコールから形成 される。一般的には、エステルの形成は、従来の合成技術によってなし得る（例 えば、マーチ（Ｍarch）の「上級有機化学（Ａdvanced Ｏrganic Ｃhemistry） 」、第 ３版、ジョンワイリー アンド サンズ（Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons）、ニューヨ ーク（1985）、1157ページ、およびこの書籍で引用されている参照文献、並びに マークらの「化学技術事典（Ｅncyclopedia of Ｃhemical Ｔechnology）」、ジ ョンワイリー アンド サンズ、ニューヨーク（1980）を見られたい）。エステ ルのアルコール部分は、一般的には、(i)Ｃ₂-Ｃ₁₂の脂肪族アルコール（一以上 の二重結合を含有してもよく、また含有しなくてもよく、且つ分枝炭素を含有し てもよく、また含有しなくてもよい）または(ii)Ｃ₇-Ｃ₁₂の芳香族アルコールま たは複素芳香族アルコールを具備するであろう。本発明は、本明細書に記載され ているようなエステルであると同時に、酸を添加した薬学的に受容可能な、それ らの塩であるような組成物の使用も想定している。 「薬学的に受容可能なアミド」は、アミド結合の加水分解に際して、カルボン 酸またはアミンの生物学的有効性および特性が保持され、且つ生物学的な不都合 またはその他の不都合を示さないようなアミドを指している。プロドラッグとし て、薬学的に受容可能なアミドを用いるには、バンドガード編集の「プロドラッ グのデザイン」、エルゼビアサイエンス出版社、アムステルダム（1985）を見ら れたい。これらのアミドは、典型的には、対応するカルボン酸およびアミンから 形成される。一般的には、アミドの形成は、従来の合成技術によってなし得る（ 例えば、マーチの「上級有機化学」、第３版、ジョンワイリー アンド サンズ 、ニューヨーク（1985）、1152ページ、およびマークらの「化学技術事典」、ジ ョンワイリー アンド サンズ、ニューヨーク（1980）を見られたい）。本発明 は、本明細書に記載されているようなアミドであると同時に、酸を添加した薬学 的に受容可能な、それらの塩であるような組成物の使用も想定している。 「薬学的または治療的に受容可能な担体」は、活性成分の生物学的活性の有効 性を妨害せず、且つ宿主または患者に対して毒性を示さないような担体媒体を指 している。 「立体異性体」は、分子量が同一であり、化学組成が同一であり、且つ他の構 成が同一であるが、原子団が異なる集団を成しているような化学的化合物を指す 。すなわち、ある同一の原子または原子団が、空間的に異なって配置され、それ 故、純粋であれば、偏光面を回転することができる。しかし、純粋な立体異性体 の中 には、光の回転が、極めて微かなので、現在の装置では検出されないものがある かもしれない。本発明の化合物は、一以上の非対称的な炭素原子をもつことがで き、それ故、様々な立体異性体が含まれる。本発明の範囲の中には、全ての立体 異性体が含まれる。 「治療的有効量または薬学的有効量」とは、本発明の組成物に対して用いる場 合には、所望の生物学的結果を誘発するのに十分な量の組成物を指す。前記結果 は、疾病の兆候、症候、もしくは原因の緩和、またはその他の生物学的システム の望ましい変化であり得る。典型的には、本発明においては、該結果には、感染 もしくは組織の傷害に対する免疫学的応答および／または炎症的応答を減少する ことが含まれるであろう。 ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように省略される。 ：フェニルアラニンは、ＰheまたはＦ；ロイシンは、ＬeuまたはＬ；イソロイ シンは、ＩleまたはＩ；メチオニンは、ＭetまたはＭ；バリンは、ＶalまたはＶ ；セリンは、ＳerまたはＳ；プロリンは、ＰroまたはＰ；トレオニンは、Ｔhrま たはＴ；アラニンは、ＡlaまたはＡ；チロシンは、ＴyrまたはＹ；ヒスチジンは 、ＨisまたはＨ；グルタミンは、ＧlnまたはＱ；アスパラギンは、ＡsnまたはＮ ；リシンは、ＬysまたはＫ；アスパラギン酸は、ＡspまたはＤ；グルタミン酸は 、ＧluまたはＥ；システインは、ＣysまたはＣ；トリプトファンは、Ｔrpまたは Ｗ；アルギニンは、ＡrgまたはＲ；およびグリシンは、ＧlyまたはＧである。さ らに、Ｂuはブトキシ、Ｂzlはベンジル、ＣＨＡはシクロヘキシルアミン、Ａcは アセチル、Ｍeはメチル、Ｐenはペニシラミン、Ａibは、アミノイソ酪酸、Ｎva はノルバリン、Ａbuはアミノ酪酸、Ｔhiはチエニルアラニン、ＯＢnはＯ-ベンジ ル、およびhypはヒドロキシプロリンである。 天然に存在するアミノ酸のみからなるペプチドに加えて、ペプチド擬態物また はペプチド類縁体も提供される。ペプチド類縁体は、鋳型ペプチド特性と類似の 特性を有する非ペプチド薬として製薬業界において、一般的に用いられている。 この種の非ペプチド化合物は、「ペプチド擬態物（peptide mimeticsまたはpept idomimetics）」と称される（フォーシェール（Ｆauchere Ｊ.）の「Ａdv.Ｄrug Ｒes.」15:29(1986)；ベーバー（Ｖeber）およびフライディンジャー（Ｆreidi nger） の「ＴＩＮＳ」392ページ（1985）；およびエバンスら（Ｅvans et al.）の「Ｊ .Ｍed.Ｃhem.」30:1229(1987)は、参照文献として、本明細書の一部をなす）。 治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド擬態物は、同等の、または 増強された治療的効果若しくは予防的効果を生じせしめるために用いられるかも しれない。 一般的には、ペプチド擬態物は、天然に存在する受容体結合ポリペプチドなど の、基本となるポリペプチド（すなわち、生物学的活性または薬学的活性を有す るポリペプチド）と構造的に類似しているが、一以上のペプチド結合が、本分野 で公知の方法、さらに以下の参照文献に記載されている方法(スパトーラ（Ｓpat ola,Ａ.Ｆ,）「アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の化学および生物化学（Ｃ hemistry and Ｂiochemistry of Ａmino Ａcids,Ｐeptides,and Ｐroteins）」 、ヴァインシュタイン（Ｗeinstein）編集、マーセル・デッカー(Ｍarcel Ｄekk er）、ニューヨーク、267ページ（1983）；スパトーラの「Ｖega Ｄata」（1983 年３月）、第１巻、第３号、「ペプチド骨格の修飾（包括的書評）（Ｐeptide Ｂackbone Ｍodifications）；モーリー（Ｍorley）の「Ｔrends Ｐharm Ｓci」 （1980）、463-468ページ（包括的書評）；ハドソンら（Ｈudson Ｄ.et al.）の 「Ｉnt Ｊ Ｐept Ｐrot Ｒes」14:177-185（1979）（-ＣＨ₂ＮＨ-,-ＣＨ₂ＣＨ₂- ）；スパトーラらの「Ｌife Ｓci」38:1243-1249（1986）（-ＣＨ₂Ｓ-）；ハー ン（Ｈann）の「Ｊ.Ｃhem.Ｓoc.Ｐerkin Ｔrans.Ｉ」307-314（1982）（-ＣＨ- ＣＨ-）（シスおよびトランス）；アルムクィストら(Ａlmquist et al.)の「Ｊ. Ｍed.Ｃhem.」23:1392-1398(1980)(-ＣＯＣＨ₂-)；ジェニングス-ホワイトら(Ｊ enning-Ｗhite et al.)の「Ｔetrahedron Ｌett」23:2533（1982）（-ＣＯＣＨ₂ -）；スチェルケら（Ｓzelke et al.）の欧州特許出願ＥＰ 45665 ＣＡ(1982):9 7:39405(1982)（-Ｃ(ＯＨ)ＣＨ₂-）；ホラデーら(Ｈolladay et al.）の「Ｔetr ahedron Ｌett」24:4401-4404(1983)（-ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ₂-）；ルビー（Ｈruby） の「Ｌife Ｓci」31:189-199(1982)（-ＣＨ₂-Ｓ-）；これらは、各々参照文献と して、本明細書の一部をなすものである）を用いて、-ＣＨ₂ＮＨ-、-ＣＨ₂Ｓ-、 -ＣＨ₂-ＣＨ₂-、-ＣＨ=ＣＨ-（シスおよびトランス）、-ＣＯＣＨ₂-、-ＣＨ(Ｏ Ｈ)ＣＨ₂-、および-ＣＨ₂ＳＯ-からなる群から選択される結合によって、任意に 置換されているようなものである。特に、好適な非ペプチド結合は、-ＣＨ₂ＮＨ -である。このようなペプチド擬態 物は、ペプチドによる実施態様に比べて、例えば、生産が経済的であること、化 学的安定性が増すこと、薬学的特性（半減期、吸収、効力、効能など）が増強さ れること、特異性（例えば、生物学的活性のスペクトルが広範である）が変化す ること、抗原性が減少することなどを含めた、顕著な利点を有するかもしれない 。ペプチド擬態物の標識には、直接または介在物（例えば、アミド基）を介して 、定量的な構造−活性データおよび／または分子模型構築によって予想される、 ペプチド擬態物中の妨害を及ぼさない部位に、一以上の標識を共有結合で付着さ せることが、通常含まれる。このような妨害を及ぼさない部位とは、一般的には 、治療効果を生じせしめるために、ペプチド擬態物を結合させるべき高分子（例 えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子）と直接接触を行わない部位であ る。ペプチド擬態物の誘導体化（例えば、標識化）は、ペプチド擬態物の所望の 生物学的活性または薬学的活性を強度に妨害すべきではない。一般的には、受容 体結合ペプチドのペプチド擬態物は、受容体に高親和性結合するので、検出可能 な生物学的活性（すなわち受容体を介した、一以上の表現型変化に対する作動薬 作用または拮抗薬作用）を有する。 共通配列中の、一以上のアミノ酸を、同じ型のＤ-アミノ酸（例えば、Ｌ-リシ ンをＤ-リシンと置き換える）と体系的に置換することは、より安定なペプチド を作り出すために用いることができるかもしれない。さらに、共通配列または共 通配列と実質的に同一な変形配列を具備する拘束されたペプチドは、本分野で公 知の方法：（リゾおよびギーラッシュ（Ｒizo and Ｇierasch）の「Ａnn.Ｒev. Ｂiochem.」61：387(1992)、参照文献として、本明細書の一部をなす）例えば、 分子内ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を内部に付加し て、ペプチドを環状にすることによって作り出すことができるかもしれない。 合成アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸は、天然において、インビボで は見られないアミノ酸であるが、本明細書で記載されているペプチド構造物中に 取り込ませることができるようなアミノ酸を指す。好適な合成アミノ酸は、式Ｈ₂ ＮＣＨＲ⁵ＣＯＯＨで表される（ここでＲ⁵は、1）低級アルキル基、2)３〜７個 の炭素原子のシクロアルキル基、3)３〜７個の炭素原子、並びに酸素、硫黄、お よび窒素からなる群から選択される、１〜２個のヘテロ原子を有する複素環、4) 芳香核上 に、ヒドロキシル、低級アルコキシ、アミノおよびカルボキシルからなる群から 選択される、１〜３個の置換基を任意に有する、炭素原子６〜10の芳香族残基、 5)-アルキレン-Ｙ（ここでアルキレンは、１〜７の炭素原子からなるアルキレン 基であり、Ｙは、(a)ヒドロキシ、(b)アミノ、(c)炭素原子３〜７のシクロアル キルおよびシクロアルケニル、(d)芳香核上にヒドロキシル、低級アルコキシ、 アミノおよびカルボキシルからなる群から選択される、１〜３の置換基を任意に 有する、炭素原子６〜10のアリル、(e)炭素原子３〜７、並びに酸素、硫黄およ び窒素からなる群から選択される、１〜２のヘテロ原子を有する複素環、(f)-Ｃ (Ｏ)Ｒ²（Ｒ²は、水素、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、および- ＮＲ³Ｒ⁴（Ｒ³およびＲ⁴は、水素および低級アルキルからなる群から独立に選択 される））、(g)-Ｓ(Ｏ)_nＲ⁶（ここでｎは１〜２の整数であり、Ｒ⁶は低級アル キルであるが、ただしＲ⁵は天然に存在するアミノ酸の側鎖を表さないものとす る）からなる群から選択される））天然には存在しないＤ-アミノ酸およびＬ-α -アミノ酸の他、天然に存在するＬ-α-アミノ酸のＤ-α-アミノ酸である。 他の好適な合成アミノ酸には、β-アラニン、γ-アミノ酪酸等のように、１よ り多い炭素原子によって、アミノ基がカルボキシル基と分断されているようなア ミノ酸が含まれる。 特に好適な合成アミノ酸には、例として、天然に存在するＬ-アミノ酸のＤ-ア ミノ酸、Ｌ-1-ナフチル-アラニン、Ｌ-2-ナフチルアラニン、Ｌ-シクロヘキシル アラニン、Ｌ-2-アミノイソ酪酸、メチオニンのスルホキシド誘導体およびスル ホン誘導体（すなわち、ＨＯＯＣ-(Ｈ₂ＮＣＨ)ＣＨ₂ＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)_nＲ⁶（ここで 、ｎおよびＲ⁶は上記の定義通りである））の他、メチオニンの低級アルコキシ 誘導体（すなわち、ＨＯＯＣ-(Ｈ₂ＮＣＨ)ＣＨ₂ＣＨ₂-ＯＲ⁶（ここで、Ｒ⁶は上 記の定義通りである）が含まれる。 「検出可能な標識」は、共有結合によって、本発明のペプチドおよびペプチド 擬態物に結合されている物質であって、ペプチドおよびペプチド擬態物を投与さ れた患者の体内で、ペプチドおよびペプチド擬態物を検出することを可能にする 物質を指す。適切な、検出可能な標識には、本分野において周知であり、例とし て放射線同位体、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）などが含まれる。どのよ うな検出可能な標識を用いるかは、重要な問題ではなく、用いる標識の量におけ る標識の毒性の他、用いる標識の量を参考にして選択すればよい。このような要 素を参考にして標識を選択することは、本分野の技術の中に十分含まれるもので ある。共有結合によって、ペプチドまたはペプチド擬態物に、検出可能な標識を 結合させることは、本分野において周知の、従来技術によって達成される。例え ば、¹²⁵Ｉ放射線同位体を検出可能な標識として用いる場合には、アミノ酸-チロ シンをペプチドおよびペプチド擬態物の中に取り込ませた後、ペプチドをヨード 化することによって、¹²⁵Ｉをペプチドまたはペプチド擬態物に共有結合によっ て結合させることができる。もし、チロシンが、ペプチドまたはペプチド擬態物 中に存在しなければ、周知の化学によって、ペプチドまたはペプチド擬態物のＮ 末端またはＣ末端に、チロシンを取り込ませることが可能である。同様に、例え ば、従来の化学を用いて、ペプチドまたはペプチド擬態物上のヒドロキシを介す るリン酸原子団として、³²Ｐをペプチドまたはペプチド擬態物上に取り込ませる ことができる。II. 概要 本発明は、ＴＰＯ-Ｒに結合して、ＴＰＯ-Ｒを活性化する化合物、さもなけれ ばＴＰＯアゴニストとして働く化合物を提供する。これらの化合物には、「先導 （リード；lead）」ペプチド化合物、および「誘導体」化合物が含まれ、該「誘 導体」化合物は、先導ペプチドと同様の分子構造または形状を持つが、先導化合 物とは加水分解もしくはタンパク質分解の受けやすさおよび／または受容体に対 する親和性が増加しているというような、生物学的特性が異なっているように構 築されている。本発明は、ＴＰＯアゴニスト、とりわけ血液学的疾患（特に化学 療法、放射線療法、または骨髄移植にともなった血小板減少症）を治療するのに 有用な化合物を具備する組成物を提供する。III. ＴＰＯアゴニストの同定 ＴＰＯ-Ｒに対する結合親和性を有するペプチドは、アフィニティー濃縮過程 に、ランダムペプチド多様化生成システム（random peptide diversity generat ing system）を組み合わせることによって容易に同定され得る。 具体的には、ランダムペプチド多様化生成システムには、アメリカ合衆国特許 第5,270,170号および第5,338,665号に記載されている「プラスミド上のペプチド 」システム；1990年６月20日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第071541,108号 およびクウィーラらの「Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ」87:6378-6382（1980 ）の一部継続出願である、1991年６月20日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第 07/718.577号に記載されている「ファージ上のペプチド」システム；1993年10月 29日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第081144,775号およびＰＣＴ ＷＯ95/11 992の一部継続出願である、1994年９月２日出願、アメリカ合衆国特許出願番号 第08/300,262号に記載されている「ポリソーム」システム；1991年９月18日出願 、アメリカ合衆国特許出願第07/762,522号の一部継続出願である1992年９月16日 出願、アメリカ合衆国特許出願第07/946,239号の一部出願である1993年11月12日 出願、アメリカ合衆国特許出願番号第08/146,886号に記載されている「コードさ れた合成ライブラリー（ＥＳＬ）」システム；アメリカ合衆国特許第5,143,854 号；1990年12月13日公開、ＰＣＴ国際公開番号第90/15070；1990年12月６日出願 、アメリカ合衆国特許出願番号第07/624,120号；フォドールらの「Ｓcience」25 1:767-773(2/1991);ダウアーおよびフォドールの「Ａnn.Ｒep.Ｍed.Ｃhem」26: 271-180(1991)；および1991年12月６日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第805 ,727号に記載されている「きわめて大規模な固定化されたポリマー合成」システ ムが含まれる。 上述の操作を用いて、特定のアミノ酸残基数を有する長さの（例えば12）、ラ ンダムなペプチドを一般的にデザインした。ランダムなペプチドをコードするオ リゴヌクレオチドの集合物を作成するために、コドンのモチーフ（ＮＮＫ）ｘ（ ここで、ＮはヌクレオチドＡ,Ｃ,Ｇ,またはＴ（等モル；用いる方法によっては 、他のヌクレオチドを使用し得る）、ＫはＧまたはＴ（等モル）、およびｘはペ プチド中のアミノ酸の数（例えば12）に対応する整数）を用いて、ＮＮＫモチー フ（12種類の各アミノ酸にはコドンが１つずつ対応し、５種類の各アミノ酸に対 しては２つのコドンが対応し、３種類の各アミノ酸に対しては３つのコドンが対 応し、且つ３種類の停止コドンのうち、１つの停止コドンのみが生じる）から生 じ得る 32のコドンのうちの何れかを与えた。このように、ＮＮＫモチーフは、全てのア ミノ酸、単一の停止コドンをコードしているので、コドンの偏りが少ない。 用いたシステムにおいては、該ランダムペプチドは、ファージfd誘導体のpIII もしくはpＶIIIコートタンパク質の何れかを具備する融合タンパク質の一部とし てファージ粒子の表面上に付与されるか（ファージ上のペプチド）、またはプラ スミドに結合したＬacＩペプチド融合タンパク質との融合タンパク質として（プ ラスミド上のペプチド）付与された。 固定化したＴＰＯ-Ｒを用いたアフィニティー濃縮法によって、ペプチドをコ ードするＤＮＡを含むファージまたはプラスミドを同定および単離した。時には 「パンニング」とも称される、該アフィニティー濃縮法は、固定化した受容体と ともに、ファージ、プラスミドまたはポリソームを複数回インキュベートするこ とと、（付随するＤＮＡまたはｍＲＮＡとともに）受容体に結合しているファー ジ、プラスミドまたはポリソームを集めることと、および（ＬacＩ-ペプチド融 合ペプチドを伴った）集められたファージまたはプラスミドを増産することとを 含む。パンニングにおいては、典型的には、ＴＰＯ-Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣ Ｄ）を用いた。 アフィニティー濃縮を数ラウンド行った後、ペプチドがＴＰＯ-Ｒに特異的に 結合するかどうか、ファージまたはプラスミドおよび付随するペプチドをＥＬＩ ＳＡで調べた。該アッセイは、結合していないファージを除去した後、典型的に は、ウェルをウサギの抗ファージ抗体で処理し、続いてアルカリフォスファター ゼ（ＡＰ）を接合したヤギの抗ウサギ抗体で処理したことを除いては、アフィニ ティー濃縮法において用いた操作と同様に行った。各ウェル中のアルカリフォス ファターゼの量は、標準的な方法で決定した。以下に、プラスミド上のペプチド システムにおいて使用するための、同様のＥＬＩＳＡ操作を詳細に記述する。 対照ウェル（受容体なし）と試験用ウェルを比較することによって、融合タン パク質が、特異的に受容体と結合するかどうかを決定することができる。放射能 ラベル１価の受容体を用いる、コロニー選出プロービングフォーマット（colony lift porbing format）中で、ＴＰＯ-Ｒに結合することが明らかとなったファ ージをスクリーニングした。該プローブは、タンパク質キナーゼＡを用いて、可 溶性受容体のＣ-末端に融合されたケンプタイド配列をリン酸化することによっ て作成 することができる。次に、宿主細胞（典型的には、ＣＨＯ細胞）の中に該「工作 された（engineered）」型のＴＰＯ受容体を発現させる。受容体のＰＩ-ＰＬＣ 採集に続いて、ＴＰＯに対する受容体の結合、またはＴＰＯ-Ｒ特異的なファー ジクローンへの受容体の結合についての試験を行った。次に、該受容体を高比活 性³³Ｐで標識して、コロニー選出を用いて高親和性リガンドを同定するための１ 価のプローブとして使用するする。 次に、受容体に、特異的に結合することが明らかとなったペプチドを遊離のペ プチド（例えば、ファージなし）として合成し、ブロッキングアッセイ試験を行 った。該ブロッキングアッセイは、融合ペプチドに先立ってＴＰＯまたは参照用 ペプチドをウェル中に添加したということ以外は、ＥＬＩＳＡと同様の方式で行 った（対照用のウェルは、２種類：(1)受容体なし、および(2)ＴＰＯまたは参照 用ペプチドなし）。ＴＰＯまたは参照用ペプチドによって受容体への結合をブロ ックされた融合タンパク質は、ランダムペプチド部位中に、本発明の好適な化合 物を含有する。 ＴＰＯ-Ｒは、その細胞外ドメインと同じく、組換え宿主細胞内で作成された 。ある有用な型のＴＰＯ-Ｒは、バキュロウイルスで形質転換された宿主細胞中 に、標準的方法を用いて、可溶性タンパク質として発現させることによって構築 され；他の有用な型は、タンパク質分泌用シグナルペプチドおよび糖リン脂質膜 アンカー付着用シグナルペプチドを伴って構築される。該アンカー付着型は、「 ＰＩＧ-テーリング」と称される。カラスおよびウェンデル(Ｃaras and Ｗendel l)の「Ｓcience」243:1196-1198（1989）およびリンら（Ｌin et al.）の「Ｓcien ce」249:677-679（1990）を見られたい。 該ＰＩＧ-テーリングシステムを用いると、フォスフォリパーゼＣによって、 受容体を発現している細胞（例えば、細胞選別機を用いて、高レベルの受容体を 発現しているという選別がなされた、形質転換されたＣＨＯ細胞）の表面から受 容体を切断することが可能である。切断された受容体は、まだ「ＨＰＡＰテール 」と称される、膜付着用のシグナルタンパク質由来のＣ末端アミノ酸配列を具備 し、これ以上精製せずに、固定化することができる。組換え受容体タンパク質は 、抗-ＨＰＡＰテール抗体（Ａb 179またはＭab 179）で微量滴定プレートのウェ ルをコ ートし、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で非特異的結合をブロッキン グし、切断された組換え受容体を抗体に結合させることによって、固定化するこ とができる。この方法を用いる場合には、受容体の濃度を変化させながら固定化 反応を行って、ある調製物に対する至適量を決定しなければならない。何故なら 、組換えタンパク質の調製物が異なると、しばしば含有されている所望のタンパ ク質の量が異なるからである。さらに、アフィニティー濃縮過程の間、固定化用 抗体が、（ＴＰＯまたは他のブロッキング化合物で）完全にブロックされている ことが保証されていなければならない。そうしないと、アフィニティー濃縮操作 の間に、ブロックされていない抗体が、所望していないファージを結合するかも しれない。受容体の固定化後に残存する未結合部位をブロックするための固定化 用抗体に結合するペプチドを用いて、この問題を回避するか、または、固定化用 抗体の助けを借りずに、単に受容体を微量滴定プレートのウェルに直接固定化し てもよい。1992年９月18日出願、アメリカ特許出願第07/947,339号を見られたい （参照文献として、本明細書の一部とする）。 多価のリガンド-受容体相互作用を可能とする、ランダムペプチド生成システ ムを用いる場合には、固定化される受容体に結合し得るリガンドの親和性を決定 する上で、固定化される受容体の濃度が、重要な因子となることを認識しなけれ ばならない。受容体の濃度が高いほど(例えば、抗受容体抗体をコートし、0.25- 0.5mgの受容体で処理した各ウェル)、低濃度の受容体（例えば、抗受容体抗体を コートし、0.5-1ngの受容体で処理した各ウェル）におけるよりも、多価結合が 生じやすい。多価結合が生じる場合には、高濃度の固定化された受容体を用いて 、先導化合物を同定しなければ、あるいは低濃度の受容体を用いて、さらに高親 和性の誘導体化合物を単離しなければ、比較的低い親和性のリガンドが単離され 易くなる。 さらに高親和性のペプチド間で識別を行うためには、しばしば１価の受容体プ ローブが用いられる。該プローブは、タンパク質キナーゼＡを用いて、可溶性受 容体のＣ末端に融合されたケンプタイド配列をリン酸化することによって作成す ることができる。次に、該「工作された」型のＴＰＯ受容体を宿主細胞内（典型 的にはＣＨＯ細胞内）に発現させる。受容体のＰＩ-ＰＬＣ採集に続いて、ＴＰ Ｏに対す る受容体の結合、またはＴＰＯ-Ｒ特異的なファージクローンへの受容体の結合 についての試験を行った。次に、コロニー選出を用いて高親和性リガンドを同定 するための、１価のプローブとして使用するために、該受容体を高比活性³³Ｐで 標識する。 ＴＰＯ-Ｒを結合するペプチドの同定を促進するための、好適なスクリーニン グ方法には、まず、受容体の細胞外ドメインに結合する先導ペプチドを同定し、 次に先導ペプチドに類似した、他のペプチドを作成することが含まれる。具体的 には、pIIIベースのペプチドまたはpＶIIIベースのファージシステム上ペプチド を用いて、ランダムライブラリーをスクリーニングして、ＴＰＯ-Ｒと結合する ペプチドを与えるファージを発見する。ファージＤＮＡの配列を決定して、ファ ージ表面上に発現されたペプチドの配列を決定する。 ランダム直鎖10量体（10-mer）pＶIIIライブラリー並びにランダム環状10量体 および12量体pＶIIIライブラリーから、ＴＰＯ-Ｒと特異的に結合することがで きるクローンを同定した。これらのペプチドの配列は、初めに同定されたペプチ ドの誘導体を高頻度で含有するようにデザインされた、別のペプチドライブラリ ーを構築するための基礎として役立つ。これらのライブラリーは、結合している ペプチドと２乃至３残基のみが異なるペプチドを産生しやすいように合成するこ とができる。このアプローチには、結合しているペプチドのコーディング配列を 有するオリゴヌクレオチドの合成が含まれるが、該合成においては、結合してい るペプチドのコーディング配列の誘導体を生成するために、４種類のヌクレオシ ド３リン酸の純粋な調製物を用いるよりも、むしろこれら４種類のヌクレオシド ３リン酸の混合物を使用する（すなわち、この目的のためには、「正しい」ヌク レオチドが55％およびその他の３種類のヌクレオチドが各々15％という混合物が 好適な混合物であり、「正しい」ヌクレオチドが70％およびその他の３種類のヌ クレオチドが各々10％という混合物は別の好適な混合物である。 「目的に添った変異導入（mutagenesis on a theme）」ライブラリーを作成す ることによって先導ペプチドを誘導体化するために、様々な戦略を用いた。これ らには、70:10:10:10の頻度で変異導入された共通配列に基づき、および配列Ｘ ＸＸＸ（Ｃ,Ｓ,ＰまたはＲ）ＴＬＲＥＷＬ ＸＸＸＸＸＸ（ＣまたはＳ）をコー ドするクロ ーンを産生するためのランダムな残基により、各末端が伸長されたpＶIIIファジ ミド（phagemid）変異導入ライブラリーが含まれた。プラスミド上のペプチドシ ステムを用いて、同様の伸長された／変異導入されたライブラリーを構築し、配 列ＸＸＸＸＸ（Ｃ,Ｓ,ＰまたはＲ）ＴＬＲＥＷＬ ＸＸＸＸＸＸＸをコードする クローンを産生した。さらに、ポリソーム発現システムを用いて、伸長された／ 変異導入されたライブラリー、ＸＸＸＸ（Ｃ,Ｓ,ＰまたはＲ）ＴＬＲＥＷＬ Ｘ ＸＸＸＸＸ（ＣまたはＳ）を構築した。３つのライブラリーは全て、ペプチド溶 出を用いてスクリーニングされ、放射能ラベルされた、１価の受容体で探査した 。 ペプチドスクリーニングおよび変異導入研究において、「プラスミド上のペプ チド」も用いた。これは、アメリカ合衆国特許第5,338,665号中で、さらに詳細 に記載されており、全ての目的のために、参照文献として本明細書の一部とする 。このアプローチに従って、融合遺伝子を有するプラスミドベクターから発現す ることにより、ランダムペプチドは、ＬacＩのＣ末端と融合する。ＬacＩ-ペプ チド融合体をコードしているＤＮＡと該融合体との結合は、プラスミド上のlac Ｏ配列を介して起こり、固定化された受容体上のアフィニティー精製（パンニン グ）によってスクリーニングされ得る、安定なペプチド-ＬacＩ-プラスミド複合 体が形成される。このようにして単離されたプラスミドを、次に電気穿孔法によ って、大腸菌の中に再導入して、選択した集団を増幅し、さらなるスクリーニン グまたは個々のクローンの調査をすることが可能である。 さらに、発現の価数を減少させた（「ヘッドピース二量体」発現システム）、 被修飾Ｃ-末端Ｌac-Ｉ発現システムを用いて、ランダムなペプチドのスクリーニ ングおよび変異導入を行った。該ライブラリーをスクリーニングして、生じたＤ ＮＡ挿入物をプールして、Ｃ-末端融合タンパク質として発現させることが可能 な、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）ベクター中にクローニングした。次に 、上述のように、ＥＬＩＳＡフォーマット中で、個々のＭＢＰ融合クローンから 無作為に取り出した細胞粗溶解物のＴＰＯ-Ｒ結合アッセイを行った。 1993年10月29日出願、アメリカ合衆国特許出願第08/144,775号およびＰＣＴ ＷＯ 95/11992に基づく一部継続出願である1994年９月２日に出願された、同時 係属中のアメリカ合衆国特許出願第08/300,262号に記載されているように（各々 は、全ての目的のために、参照文献として本明細書の一部とする）、ポリソーム 発現システムを用いて、ペプチド変異導入研究も行った。配列ＸＸＸＸ（Ｃ,Ｐ, Ｒ,またはＳ）ＴＬＲＥＦＬＸＸＸＸＸＸ（ＣまたはＳ）（ここで、Ｘはランダ ムなＮＮＫコドンを表し、後の部分の文字は、該記号はコドンの１位、および２ 位、および３位におけるＫ（ＧまたはＴ）部位における70:10:10:10の変異導入 を含有するアミノ酸コドンを表している）に基づいて、変異導入ライブラリーを 構築した。磁石のビーズに固定化されたＴＰＯ受容体に対して、５回該ライブラ リーをパンニングした。５回目が終わった後、pＡＦＦ６中に、ＰＣＲで増幅し たプールをクローニングし、ＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列を決定した。ＭＢＰ ベクター中に該配列をサブクローニングして、ＭＢＰＥＬＩＳＡにより、それら の結合親和性を決定した。 ＴＰＯ-Ｒを固定化して、ポリソームスクリーニングを行うために、製造者の 記述に従って、まず、トシル活性化された磁石のビーズ（ダイナル社（Ｄynal Ｃorporation）から入手可能）に、Ａb179を化学的に接合させた。0.5Ｍホウ酸 緩衝液（pＨ9.5）中で、室温にて、該ビーズを抗体とともに、一晩インキュベー トした。該ビーズを洗浄し、「ＨＰＡＰ」テールを含むＴＰＯ-Ｒと結合させた 。４℃にて、１時間、抗体をコートされたビーズおよび受容体をインキュベート し、ポリソームライブラリーを添加する前に、再度該ビーズを洗浄した。 上述した、様々なライブラリーをスクリーニングすることによって、本明細書 にリストされていないものの他、下表１および下表２に示されたＴＰＯ受容体結 合ペプチドが得られた。 その他の代表的なペプチドのＩＣ₅₀値をいくつか以下の表に示す。ＩＣ₅₀値を 決定するためには、種々の方法を使用することができる。例えば、ＭＢＰ-ＴＰ ＯトレーサーまたはlacＩペプチドトレーサーを用いた平衡結合ＥＬＩＳＡアッ セイを使用して、ペプチドが、ＴＰＯ受容体の細胞外ドメインへのＴＰＯの結合 を阻害するかどうか決定した。典型的には、ＩＣ₅₀値は、遊離のペプチドを用い て決定した。ＩＣ₅₀値は、遊離のペプチドを用いて決定することができるが、該 ペプチドは、任意にＣ末端をアミド化してもよく、またはエステルもしくは他の カルボキシルアミドとして調製してもよい。 ファージ中で発現された配列を正確に再現するために、合成ペプチドのＮ末端 アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の前に、１または２個のグリシンを前置すること が多い。これらのグリシンは、結合または活性に必要であるとは考えられていな い。同じように、ポリソーム中で発現されたペプチドの配列を正確に模倣するた めに、合成ペプチドのＣ末端アミノ酸の前に、ＭＡＳという配列を前置すること が多い。該配列も、結合または活性に必要であるとは考えられていない。 ＩＣ₅₀値は、記号「-」、「+」、「++」で、記号的に示す。例えば、200μＭ を超えるＩＣ₅₀値を示したペプチドは、「-」で示されている。200μＭ以下のＩ Ｃ₅₀値には「+」の記号を与え、500ｎＭ以下のＩＣ₅₀値は「++」で示されている ペプチドのＩＣ₅₀値が、ある記号のカットオフ値上またはカットオフ値付近にあ る場合には、混合型の表記で示す（例えば、「+/-」）。ペプチドのＩＣ₅₀値が 決定されなかったものは、「Ｎ.Ｄ.」としてリストされている。構造：ＧＧＣＴ ＬＲＥＷＬＨＧＧＦＣＧＧを有するペプチドのＩＣ₅₀値は、500nＭ以下であった 。（Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の前に、２つのグリシンが前置され、 ファージによって発現された配列が正確に再現されていることに注意せよ。これ らのグリシンは、結合または活性には必要ではないと考えられている。） 上記の表、特に表３は、好適なコアペプチドがアミノ酸配列： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₁はＣ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｖ；Ｘ₂はＦ,Ｋ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＷ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ- アミノ酸の何れでもよい；Ｘ₅はＡ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ,ＶまたはＹ； Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；およびＸ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,Ｒ またはＶである。）を具備することを示している。 好適な実施態様においては、該コアペプチドは、アミノ酸配列： Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₁はＬ,Ｍ,Ｐ,ＱまたはＶ；Ｘ₂はＦ,Ｒ,ＳまたはＴ；Ｘ₃はＦ,Ｌ, ＶまたはＷ；Ｘ₄はＡ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＴ；Ｘ₅はＡ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ ,ＳまたはＴ；Ｘ₇はＣ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,ＭまたはＶ；および各Ｘ₈残基は、遺伝的にコ ードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れか、それらの立体異性体であるＤ-アミ ノ酸；および非天然のアミノ酸から独立に選択される。）を具備する。好ましく は、各Ｘ₈残基は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れかから、お よびそれらの立体異性体であるＤ-アミノ酸のうちの何れかから独立に選ばれる 。好適な実施態様においては、Ｘ₁はＰ；Ｘ₂はＴ；Ｘ₃はＬ；Ｘ₄はＲ；Ｘ₅はＥ またはＱ；Ｘ₇はＩまたはＬである。 さらに好ましくは、該コアペプチドは、アミノ酸配列： Ｘ₉Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₉はＡ,Ｃ,Ｅ,Ｇ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；およびＸ₈ はＡ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｋ,Ｌ, Ｑ,Ｒ.Ｓ,ＴまたはＶである。）を具備する。より好ましくは、Ｘ₉はＡまたはＩ ；およびＸ₈はＤ,ＥまたはＫである。 特に好適なペプチドには、：ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧ；ＧＮＡ ＤＧＰＴＬＲＱＷＬＥＧＲＲＰＫＮ；ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧＫ ；ＴＩＫＧＰＴＬＲＱＷＬＫＳＲＥＨＴＳ；ＳＩＥＧＰＴＲＥＷＬＴＳＲＴＰＨ Ｓ；ＬＡＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＨＧＮＧＲＤＴ；ＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣ ；およびＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡが含まれる。 さらに本発明の実施態様では、本発明において使用するのに好適なペプチドに は、アミノ酸配列： ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₂はＫ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ またはＶ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れか；Ｘ₅は Ａ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｓ,ＶまたはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；および Ｘ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶである。）を具備するコア構造を有する ペプチドが含まれる。さらに好適な実施態様においては、Ｘ₄はＡ,Ｅ,Ｇ,Ｈ,Ｋ, Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＷである。さらなる実施態様では、Ｘ₂はＳまたは Ｔ；Ｘ₃はＬまたはＲ；Ｘ₄はＲ；Ｘ₅はＤ,ＥまたはＧ；Ｘ₆はＦ,ＬまたはＷ；Ｘ₇ はＩ,Ｋ,Ｌ,ＲまたはＶである。特に好適なペプチドには、：ＧＧＣＴＬＲＥＷ ＬＨＧＧＦＣＧＧが含まれる。 さらなる実施態様においては、本発明において使用するのに好適なペプチドに は、アミノ酸配列： Ｘ₈ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで：Ｘ₂はＦ,Ｋ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ, Ｓ,ＶまたはＷ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸の何れか；Ｘ₅はＡ ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ,ＶまたはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,Ｗまた はＹ；Ｘ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶ；およびＸ₈は遺伝的にコードさ れる20のＬ-アミノ酸のうちの何れかである。）を具備する構造を有するペプチ ドが含まれる。いくつかの実施態様においては、Ｘ₈は、好ましくは、Ｇ,Ｓ,Ｙ またはＲである。 ＩＣ₅₀が約100ｍＭ以上のペプチドおよびペプチド擬態物は、本発明による、 診断面または治療面の何れかにおける使用を可能とするのに、十分な結合を行う こ とができない。好ましくは、診断目的においては、該ペプチドおよびペプチド擬 態物のＩＣ₅₀は約２ｍＭまたはそれ未満であり、薬学的目的においては、該ペプ チドおよびペプチド擬態物のＩＣ₅₀は約100μＭまたはそれ未満である。 結合するペプチド配列は、本発明によるＴＰＯＲ結合化合物の最小サイズを決 定する手段も提供する。「コードされた、合成ライブラリー（ＥＳＬ）」システ ムまたは「きわめて大規模な固定化されたポリマー合成」システムを用いて、こ のような活性を有するペプチドの最少サイズを決定することができるだけでなく 、好適なモチーフ（または該モチーフの最少サイズ）の１、２あるいはそれ以上 の残基が、異なっているようなペプチド群を形成するペプチドを全て作成するこ とができる。次に、これらのペプチド集合物を、ＴＰＯ-Ｒ受容体に対する結合 能に関するスクリーニングにかけることができる。該固定化されたポリマー合成 システム、または他のペプチド合成法を用いて、本発明による、全てのペプチド 化合物の末端切断された類縁体、欠失類縁体、置換類縁体、およびそれらを組み 合わせたものを合成することができる。 また、本発明のペプチドおよびペプチド擬態物に対して、下記の実施例２にお いて詳述されているような、トロンボポエチン依存性細胞増殖アッセイによる評 価も行った。細胞増殖の指標としての³Ｈチミジンの取込と相関するＭＴＴアッ セイ（モスマン（Ｍossmann）の「Ｊ.Ｉmmunol.Ｍethods」65:55（1983）を参照 されたい）のような、本分野で公知の技術によって、細胞増殖を測定する。テス トされたペプチドは、図１Ａに示すように、用量依存的に、ＴＰＯ-Ｒをトラン スフェクトしたＢa/Ｆ3細胞の増殖を刺激した。図１Ｂに示されているように、 これらのペプチドは、親細胞株に対しては、何も影響を与えなかった。 図７〜９は、本発明によるペプチドおよびペプチド擬態物の活性を評価するた めの、別のアッセイの結果を示している。本アッセイでは、カルボプラチンを用 いて、マウスを血小板減少症にしている。図７は、第０日目に、カルボプラチン （125mg/kg腹腔内投与）処置を施したＢalb/Ｃマウスの、典型的結果を図示して いる。破線は、３つの実験における未処置動物を表している。実線は、３つの実 験におけるカルボプラチン処置群を表している。太い実線は、従来データを表し ている、図８は、示された量（mg/kg、第０日に腹腔内へ）のカルボプラチンで 処置したマウスにおいて、カルボプラチンの滴定が血小板の数に及ぼす影響を図 示している。図９には、カルボプラチンで誘導された血小板減少症が、第10日目 において、ＡＦ12513（513）ペプチドにより、改善されている様子が図示されて いる。カルボプラチン（ＣＢＰ;50-125mg/kg、腹腔内）は、第０日目に投与され た。ＡＦ12513（1mg/kg、腹腔内）は、第1-9日目に与えられた。これらの結果は 、本発明のペプチドが、マウスモデルの血小板減少症を改善し得ることを示して いる。 さらに、本発明のペプチドは、２量体化またはオリゴマー化することが可能で あり、それよって該化合物の親和性および／または活性が増加するかもしれない 。細胞増殖アッセイでのＴＰＯ模倣活性に対する、ペプチドの２量体化／オリゴ マー化の影響を調べるために、Ｃ末端をビオチン化したＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥ ＷＩＳＦＣＧＧ（ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧＫ（ビオチン））を合 成した。無血清ＨＥＰＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ中で、該ペプチドとストレプトアビジ ンを4:1のモル比でプレインキュベートした。上述のように、該複合体が、ＴＰ Ｏ-ＲをトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞の細胞増殖を刺激するかどうかについ て、遊離ビオチン化ペプチドおよび非ビオチン化親ペプチドとともに調べた。 図２Ａは、複合体化した、ビオチン化ペプチド（ストレプトアビジン(ＳＡ)を 有するＡＦ 12885）を用いて、トランスフェクトした細胞株および親細胞株の両 者に対して行ったアッセイの結果を示す。図２Ｂは、遊離のビオチン化ペプチド (ＡＦ 12285)を用いて、トランスフェクトした細胞株および親細胞株の両者に対 して行ったアッセイの結果を示す。図２Ｃは、ストレプトアビジンのみを用いて 、トランスフェクトした細胞株および親細胞株の両者に対して行ったアッセイの 結果を示す。これらの結果は、予め形成させた複合体は、遊離のペプチドに比べ て、ほぼ10倍強力であることを示している。 エリスロポエチン受容体(ＥＰＯ-Ｒ)に対する、ペプチドの交叉反応性を研究 することによって、本発明によるペプチドの結合および活性の特異性も調べた。 ＴＰＯ-Ｒ同様、ＥＰＯ-Ｒもヘマトポエチン成長因子受容体ファミリーの一員で ある。本発明のペプチドの他、ＴＰＯ、ＥＰＯ、および既知のＥＰＯ結合ペプチ ドについて、ＥＰＯ依存性細胞株を用いた、細胞増殖アッセイ試験を行った。該 アッセイでは、 親細胞株として、ＦＤＣＰ-1（成長因子依存的マウス多分化能性未分化造血始源 細胞株（growth factor dependent murine multi-potential primitive haemato poietic progenitor cell line））を用いた（例えば、デクスターら（Ｄexter et al.）の「Ｊ.Ｅxp.Ｍed.」152:1036-1047（1981）を参照されたい）。該細胞 株は、ＷＥＨＩ-3で調節した培養液（ＩＬ-3を含有する、ＡＴＣＣ番号Ｔ1Ｂ68 の培養液）を補充すると、増殖し得るが、分化はしない。該親細胞株をヒトＥＰ Ｏ-ＲまたはマウスＥＰＯ-Ｒでトランスフェクトして、ＦＤＣＰ-1-ＥＰＯ-Ｒ細 胞株を作成する。該トランスフェクトされた細胞株は、ヒトＥＰＯまたはマウス ＥＰＯ存在下では、増殖し得るが、分化はしない。 必要な成長因子存在下で、半定常密度になるまで、該細胞を増殖させた。次に 、ＰＢＳ中で、該細胞を洗浄し、成長因子が含まれていない、完全な培養液中で 、16-24時間絶食する。細胞の生死判別決定を行った後、原液（成長因子が含ま れていない、完全な培養液）50μｌ当たりに、約10⁵の細胞が存在するようにす る。テストをするために、化合物（典型的には、ファージもしくは他のものに結 合したペプチド、または固定化されたペプチドではなく、液相に遊離したペプチ ド）を段階的に希釈して、細胞（50μl）を各ウェルに添加し、該細胞を24〜48 時間インキュベートする（この時点で、負の対照は、死滅または静止状態になっ ているはずである）。続いて、ＭＴＴアッセイのような、本分野で既知の技術を 用いて、細胞増殖の測定を行う。 図３Ａ-Ｇは、ＴＰＯ-ＲをトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株、および該細 胞株に対応する親株、またはＥＰＯ-依存性細胞株および対応する親株の何れか を用いた、細胞増殖アッセイにおけるＴＰＯ活性、本発明のペプチドの活性、Ｅ ＰＯ活性およびＥＰＯ-Ｒ結合ペプチド活性を示す一連の対照実験の結果を示し ている。図３Ａは、ＴＰＯ-ＲをトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株および該細 胞株に対応する親株を用いた細胞増殖アッセイにおけるＴＰＯの結果を表してい る。図３Ｂは、ＴＰＯ-ＲをトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株および該細胞株 に対応する親株を用いた細胞増殖アッセイにおけるＥＰＯの結果を表している。 図３Ｃは、ＴＰＯ-ＲをトランスフェクトしたＢa/Ｆ3細胞株中での、複合体化し た、ビオチン化ペプチド（ストレプトアビジン(ＳＡ)を有するＡＦ 12285）、お よびビオチン化されたＥＰＯ-Ｒ結合 ペプチド（ＳＡを有するＡＦ 11505）の複合体の結果を表している。対応する親 細胞株に対する結果は、図３Ｄに示されている。図３Ｅは、ＥＰＯ依存性細胞株 を用いた細胞増殖アッセイにおけるＴＰＯの結果を表している。図３Ｆは、ＥＰ Ｏ依存性細胞株を用いた細胞増殖アッセイにおけるＥＰＯの結果を表している。 図３Ｇは、ＥＰＯ依存性細胞株における、複合体化した、ビオチン化ペプチド（ ストレプトアビジン(ＳＡ)を有するＡＦ 12285）、およびビオチン化されたＥＰ Ｏ-Ｒ結合ペプチド（ＳＡを有するＡＦ 11505）の複合体の結果を表している。 これらの結果は、本発明のペプチドが、非常に特異的に、ＴＰＯ-Ｒに結合して 、ＴＰＯ-Ｒを活性化することを示している。 IV.ペプチドおよびペプチド擬態物の調製 Ａ.固相合成 本発明のペプチドは、（例えば、標準的固相技術を用いて）本分野において公 知の、古典的方法によって調製され得る。標準的方法には、完全固相合成法、一 部固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成、および組換えＤＮＡ技術さえも含ま れる。例えば、メリーフィールド（Ｍerrifield）の「Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.」85: 2149（1963）を参照されたい（参照文献として、本明細書の一部をなす）。アル ファアミノ保護された樹脂を用いると、固相上においては、典型的には、合成は ペプチドのＣ末端終結部位から始まる。例えば、適切な初発物質は、クロロメチ ル化樹脂、ヒドロキシメチル化樹脂、またはベンズヒドリルアミン樹脂に、必要 なアルファアミノ酸を付着せしめることによって調製され得る。このようなクロ ロメチル化樹脂のうちの１つは、バイオビーズ（ＢＩＯ-ＢＥＡＤＳ）ＳＸ-1の 商標で、バイオラッド ラボラトリーズ（Ｂio Ｒad Ｌaboratories）、リッチモ ンド、カリフォルニアによって販売されており、ヒドロキシメチル化樹脂の調製 法は、ボドンスキーら（Ｂodonszky et al.)の「Ｃhem.Ｉnd.」（ロンドン）38: 1597（1966）に記載されている。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂は、ピエ ッタおよびマーシャル（Ｐietta and Ｍarshall）の「Ｃhem.Ｃommn.」650（197 0）に記載されており、塩化水素型のものが、ベックマン インスツールメント社 （Ｂeckman Ｉnstruments Ｉnc.）、パロアルト（Ｐalo Ａlto）、カリフォルニ アから、市販され ており、入手することができる。 このように、本発明の化合物は、ギシン(Ｇisin)の「Ｈelv.Ｃhim.Ａcta.」56 :1467（1973）に記述されている方法に従って、例えば、セシウム重炭酸塩触媒 の補助を受けながら、クロロメチル化樹脂に、アルファアミノが保護されたアミ ノ酸を結合させることによって調製され得る。最初の結合を行った後、室温で、 有機溶媒中にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または塩酸（ＨＣl）が溶けている溶 液を含む試薬を選択することによって、アルファアミノ保護基を除去する。 アルファアミノ保護基とは、ペプチドの段階的合成の分野において有用である ことが知られている基である。これには、アシル型の保護基（例えば、ホルミル 、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタン型保護基（例えば、ベン ジルオキシカルボイル（Ｃbz）および置換されたＣbz）、脂肪族ウレタン保護基 （例えば、t-ブチルオキシカルボニル（Ｂoc）、イソプロピルオキシカルボニル 、シクロヘキシルオキシカルボニル）およびアルキル型保護基（例えば、ベンジ ル、トリフェニルメチル）が含まれる。ＢocおよびＦmocは、好適な保護基であ る。結合の間、側鎖保護基は、変化を受けず、アミノ末端保護基の脱保護の間、 または結合の間には外れない。最終ペプチドの合成が終了した時点で、側鎖保護 基は除去することができなければならず、反応条件下では、標的ペプチドを変容 せしめないであろう。Ｔyrの側鎖保護基には、テトラヒドロピラニル、tert-ブ チル、トリチル、ベンジル、Ｃbz，Ｚ-Ｂr-Ｃbz、および2,5-ジクロロベンジル が含まれる。Ａspの側鎖保護基には、ベンジル、2,6-ジクロロベンジル、メチル 、エチル、およびシクロヘキシルが含まれる。ＴhrおよびＳerの側鎖保護基には アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、2,6-ジク ロロベンジル、およびＣbzが含まれる。ＴhrおよびＳerの側鎖保護基はベンジル である。Ａrgの側鎖保護基には、ニトロ、トシル（Ｔos）、Ｃbz、アダマンチル オキシカルボニルメシトイルスルフォニル（Ｍts）、またはＢocが含まれる。Ｌ ysの側鎖保護基には、Ｃbz、2-クロロベンジルオキシカルボニル（2-Ｃl-Ｃbz） 、2-ブロモベンジルオキシカルボニル（2-ＢrＣbz）、Ｔos、またはＢocが含ま れる。 アルファアミノ保護基を除去した後、残りの、保護されたアミノ酸を、所望の 順序で、段階的に結合する。例えば塩化メチレン（ＣＨ₂Ｃl₂）、ジメチルホル ムア ミド（ＤＭＦ）混合物のような溶液中のジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣ Ｃ)のような、適切なカルボキシル基活性化因子とともに、通常、過剰量の保護 された各アミノ酸を用いる。所望のアミノ酸配列が完成した後、該所望のペプチ ドは、トリフルオロ酢酸またはフッ化水素（ＨＦ）のような試薬（該試薬は、樹 脂からペプチドを外すだけではなく、残存している側鎖保護基を全て切断する） で処理することによって、支持体樹脂から外される。クロロメチル化樹脂を用い る場合には、フッ化水素処理によって、遊離のペプチド酸が生じる。ベンズヒド リルアミン樹脂を用いる場合には、フッ化水素は、直接、遊離のペプチドアミド を生じせしめる。あるいは、クロロメチル化樹脂を用いる場合には、アンモニア で、ペプチド樹脂を処理することによって、側鎖を保護されたペプチドを外すこ とができ、側鎖が保護された、所望のアミドが生じ、アルキルアミンを用いると 、側鎖が保護されたアルキルアミドまたはジアルキルアミドが生じる。次に、通 常の方法を用いて、フッ化水素処理によって、側鎖保護基を除去し、遊離のアミ ド、遊離のアルキルアミド、または遊離のジアルキルアミドを得る。 これらの固相ペプチド合成操作は、本分野において周知であり、スチュアート （Ｓtewart）の「固相ペプチド合成（Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓyntheses）」 （フリーマンアンド社（Ｆreeman and Ｃo.）サンフランシスコ（1969））に詳 述されている。 1990年３月７日出願、アメリカ合衆国特許出願番号第07/492,462号；1990年12 月６日出願アメリカ合衆国特許出願番号第07/624,120号；1991年12月６日出願、 アメリカ合衆国特許出願番号第07/805,727号に記載されている、「コードされた 合成ライブラリー」システムまたは「極めて大規模な、固定化されたポリマー合 成」システムを用いて、このような活性を有する、最少サイズのペプチドを決定 することができるだけでなく、好適なモチーフ（または該モチーフの最少サイズ ）の１、２あるいはそれ以上の残基が、異なっているようなペプチド群を構成す る、ペプチドを全て作成することができる。次に、これらのペプチド集合物をＴ ＰＯ-Ｒに対する結合能に関するスクリーニングにかけることができる。該固定 化されたポリマー合成システム、または他のペプチド合成法を用いて、本発明に よる、全てのペプチド化合物の末端切断された類縁体、欠失類縁体、および 末端切断と欠失を組み合わせた類縁体を合成することができる。 Ｂ.合成アミノ酸 これらの操作を用いて、本発明による、任意の化合物の、１、２あるいはそれ 以上の部位が、天然に存在し、遺伝的にコードされる、20のアミノ酸以外のアミ ノ酸で置換されたペプチドを合成することができる。例えば、トリプトファンを ナフチルアラニンに置換して、合成を促進させることもできる。本発明のペプチ ド中に置換させ得る、他の合成アミノ酸には、Ｌ-ヒドロキシプロピル、Ｌ-3、 ４ジヒドロキシフェニルアラニル、Ｌ-δ-ヒドロキシリシルおよびＤ-d-メチル アラニルのようなｄアミノ酸、Ｌ-α-メチルアラニル、βアミノ酸、およびイソ キノリルが含まれる。本発明のペプチド中には、Ｄアミノ酸、および天然に存在 しない合成アミノ酸も取り込むことができる。 天然に存在し、遺伝的にコードされる20のアミノ酸（またはＤアミノ酸）の側 鎖を、他の側鎖（例えば、アルキル、低級アルキル、４員環、５員環、６員環、 または７員環アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル ）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびそれらの低級エステル誘 導体のような基、および４員環、５員環、６員環、または７員環の複素環）で置 き換えることができる。特に、プロリン残基の環のサイズを、５員環から４員環 、６員環、または７員環に換えた、プロリン類縁体を用いることができる。環状 の基は、飽和であってもよく、また不飽和でもよい（不飽和の場合には、芳香族 であってもよく、また芳香族でなくてもよい）。 環状の基は、飽和であってもよく、また不飽和でもよい（不飽和の場合には、 芳香族であってもよく、また芳香族でなくてもよい）。好ましくは、複素環には 、１以上の窒素、酸素、および／または硫黄ヘテロ原子が含まれる。このような 基の例には、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾ リニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルフォリニル（例えば、モルフ ォリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、1-ピペラジニル）、ピペリジ ル（例えば、1-ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジ ニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピ ロ リジニル（例えば、1-ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル 、チアゾリル、チエニル、チオモルフォリニル（例えば、チオモルフォリノ）、 およびトリアゾリルが含まれる。これらの複素環基は、置換を受けてもよく、あ るいは置換を受けなくてもよい。基が置換を受けている場合には、置換基は、ア ルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換された、もしくは置換されな いフェニルであり得る。 リン酸化によって、容易に、本発明のペプチドを修飾することも可能であり、 本発明による化合物のペプチド誘導体を作成するその他の方法は、ルビーら⁴²に 記載されている。このように、本発明のペプチド化合物は、類似の生物学的活性 を有するペプチド擬態物を調製するための基礎としての役割も果たす。 本発明のペプチド化合物は、ペプチド擬態物も含めて、アメリカ合衆国特許第 4,640,835号；アメリカ合衆国特許第4,496,689号；アメリカ合衆国特許第4,301, 144号；アメリカ合衆国特許第4,670,417号；アメリカ合衆国特許第4,791,192号 ；アメリカ合衆国特許第4,179,337号（参照文献として、これら全ての全体を本 明細書の一部とする）に述べられている方法によって、様々な非タンパク質性の ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、または ポリオキシアルケン）に、共有結合させて修飾することができる。 Ｃ.末端修飾 当業者は、種々の技術を用いることによって、対応するペプチド化合物と同一 または類似の、所望の生物学的活性を有するが、溶解性、安定性、並びに加水分 解およびタンパク質分解に対する感受性などの活性が、改善されたペプチド擬態 物を構築することができることを認めるであろう。例えば、モーガンおよびガイ ナー（Ｍorgan and Ｇainor）Ａnn.Ｒep.Ｍed.Ｃhem.24:24:3-252（1989）を参 照されたい。以下に、Ｎ-末端アミノ基が修飾されたペプチド擬態物、Ｃ-末端カ ルボキシル基が修飾されたペプチド擬態物を調製する方法、および／またはペプ チド中の１以上のアミド結合を、非アミド結合に変換する方法について述べる。 １つのペプチド擬態物の構造中に、このような修飾を２つ以上組み合わせること もできるということを理解すべきである（例えば、Ｃ末端のカルボキシル基を修 飾し、 且つペプチド中の２つのアミノ酸の間に、-ＣＨ2-カルバメート結合を挿入する ）。 1.Ｎ-末端修飾 典型的には、ペプチドは遊離の酸として合成されるが、上述のように、容易に 、アミドまたはエステルとして調製することができるであろう。本発明のペプチ ド化合物のアミノ末端および／またはカルボキシ末端を修飾して、本発明による その他の化合物を産生することもできる。アミノ末端の修飾には、メチル化（す なわち、-ＮＨＣＨ₃または-ＮＨ(ＣＨ₃)₂）アセチル化、カルボゼベンゾイル基 の付加、またはＲＣＯＯ-（ここでＲは、ナフチル、アクリジニル、ステロイデ ィル、および類似の基からなる群から選択される）-によって表されるカルボン 酸官能基を含む、任意のブロッキング基でアミノ末端をブロックすることが含ま れる。カルボキシル末端の修飾には、カルボキサミド基で遊離の酸を置換するこ と、カルボキシ末端において、環状ラクタムを形成して、構造的な制限を導入す ることが含まれる。 アミノ末端の修飾には、先に詳述したように、アルキル化、アセチル化、カル ボベンゾイル基の付加、スクシンイミド基の形成などが含まれる。具体的には、 Ｎ末端アミノ基は、以下のように反応させることが可能である。 (a)酸ハロゲン化物［例えば、ＲＣ(Ｏ)Ｃl」または酸無水物との反応によ って（ここでＲは、先に定義したとおりである）、式ＲＣ(Ｏ)ＮＨ-のアミド基 を形成する。典型的には、該反応は、好ましくは反応中に生成する酸を捕捉する ための、ジイソプロピルエチルアミンのような３級アミンを過剰量（例えば、約 10倍量）含有する不活性な希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中のペプチドに対 して、およそ等モルまたは過剰量（例えば、約５倍量）の酸ハロゲン化物をを接 触させることによって、行われ得る。その他の反応条件は、従来どおりである（ 例えば、室温で30分間）。末端アミノをアルキル化して、Ｎを低級アルキル置換 した後、上述のよに、酸ハロゲン化物と反応させれば、式ＲＣ(Ｏ)ＮＲ-で表さ れるＮ-アルキルアミド基が生じる； (b)コハク酸無水物との反応によって、スクシンイミド基を形成する。前 述 のように、ほぼ等量または過剰量（例えば、約５倍量）のコハク酸無水物を用い ることができ、適切な不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で、ジイソプロ ピルエチルアミンのような３級アミンを過剰量（例えば、10倍量）使用すること を含む、本分野で周知の方法によって、アミノ基はスクシンイミドに転換される 。例えば、ウォーレンベルグら（Ｗollenberg et al.）のアメリカ合衆国特許第 4,612,132号を参照されたい（参照文献として、その全体を本明細書の一部とす る）。例えば、コハク酸基をＣ₂-Ｃ₆アルキル置換または-ＳＲ置換基（従来の方 法で調製され、ペプチドのＮ末端に、置換されたスクシンイミドを与える）と置 換することができることは理解されるであろう。このようなアルキル置換基は、 前記のウォーレンバーグらによって記述された方法によって、マレイン酸無水物 と低級オレフィン（Ｃ₂-Ｃ₆）を反応させて調製され、-ＳＲ置換基は、ＲＳＨ（ ここでＲは、上記の定義どおり）とマレイン酸無水物を反応させて調製される； (c)好ましくは、反応中に生成する酸を捕捉するための３級アミンを含有 する、適切な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で、ほぼ等量もしくは 過剰量のＣＢＺ-Ｃl（すなわち、ベンジルオキシカルボニル塩化物）または置換 されたＣＢＺ-Ｃlを反応させることによって、ベンジルオキシカルボニル-ＮＨ- 、または置換されたベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-が生じる； (d)適切な不活性希釈剤（ジクロロメタン）中で、等量または過剰量（例 えば、５倍量）のＲ-Ｓ(Ｏ)₂Ｃlと反応させてスルホンアミド基を生じさせ、末 端のアミンをスルホンアミドに換えることができる（ここでＲは、上記の定義ど おり）。反応中に生じる酸を捕捉するために、該不活性希釈剤には、ジイソプロ ピルエチルアミンのような３級アミンを過剰量（例えば、10倍量）が含まれてい ることが好ましい。その他の反応条件は、従来どおりであり（例えば、室温で30 分間）； (e)適切な不活性希釈剤中（例えば、ジクロロメタン）で、等量もしくは 過剰量（例えば、５倍量）のＲ-ＯＣ(Ｏ)ＣlまたはＲ-ＯＣ(Ｏ)ＯＣ₆Ｈ₄-p-ＮＯ₂ と反応させることによって、カルバメート基を生じさせ、末端アミンをカルバメ ートに転換させる（ここでＲは、上記の定義どおり）。該不活性希釈剤（diluen t）は、反応中に生成される、全ての酸を捕捉するための、ジイソプロピルエチ ルアミンのような、３級アミンを過剰量（例えば、約10倍量）含有していること が、好ましい。その他の反応条件は、従来どおりである（例えば、室温で30分間 ）； (f)適切な不活性希釈剤（例えば、ジクロロメタン）中で、等量または過 剰量の（例えば、５倍量）のＲ-Ｎ=Ｃ=Ｏと反応させることによって、尿素基を 生じさせ、末端アミンを尿素（すなわち、ＲＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ-（ここでＲは、上 記の定義どおり））に転換させる。該不活性希釈剤は、ジイソプロピルエチルア ミンのような、３級アミンを過剰量（例えば、約10倍量）含有していることが好 ましい。 2.Ｃ-末端修飾 Ｃ末端のカルボキシル基が、エステルによって置換されているペプチド擬態物 （すなわち、-Ｃ(Ｏ)ＯＲ（ここで、Ｒは上記の定義どおり））を調製する場合 には、ペプチド酸を調製するために用いた樹脂を使用し、塩基および適切なアル コール（例えば、メタノール）によって、側鎖を保護したペプチドを切断する。 次に、所望のエステルを得るために、フッ化水素で処理するという通常の方式に よって、側鎖の保護基を除去する。 Ｃ末端のカルボキシル基が、アミド-Ｃ(Ｏ)ＮＲ³Ｒ⁴に置換されている、ペプ チド擬態物を調製する場合には、ペプチド合成用の固相支持体として、ベンズヒ ドリルアミン樹脂を用いる。合成が完了したら、フッ化水素処理で、ペプチドを 支持体から外せば、即座に、遊離のペプチドアミド（すなわち、Ｃ末端が-Ｃ(Ｏ )ＮＨ₂である）が得られる。あるいは、ペプチド合成において、アンモニアを用 いて、支持体から側鎖が保護されたペプチドを切断する反応と、クロロメチル化 された樹脂を組み合わせて使用すれば、遊離のペプチドアミドが産生され、アル キルアミンまたはジアルキルアミンを用いる反応と組み合わせれば、側鎖を保護 するアルキルアミドまたはアルキルジアミド（すなわち、Ｃ末端が、-Ｃ(Ｏ)Ｎ ＲＲ¹（ここ で、ＲおよびＲ¹は、上記の定義どおり））が産生される。次に、遊離のアミド 、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを得るために、フッ化水素処理という 通常の方式によって、側鎖の保護基を除去する。 その他の実施態様においては、カルボキシル基の-ＯＨまたはエステルの-ＯＲ を、Ｎ末端アミノ基で内部置換することによって、Ｃ末端カルボキシル基または Ｃ末端エステルを環状化せしめ、環状ペプチドを作ることができる。例えば、ペ プチド酸を得るための合成および切断を行った後、該遊離酸は、例えば、塩化メ チレン（ＣＨ₂Ｃl₂）、ジメチルホルムアミド混合物のような溶液中において、 ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような、適切なカルボキシル基活 性化因子によって、活性化されたエステルに転換される。続いて、該活性化され たエステルをＮ末端アミンで内部置換することによって、環状ペプチドが生じる 。重合化とは逆に、内部環状化は、極めて薄い溶液を使用することによって増強 され得る。このような方法は、本分野において周知である。 本発明のペプチドも環状化することが可能であり、また、末端アミノ基または 末端カルボキシル基が存在しないことによって、プロテアーゼに対する感受性が 減少させるように、あるいはペプチドの高次構造が限定されるように、ペプチド の末端にデスアミノ残基またはデスカルボキシ残基を取り込ませることも可能で ある。本発明による化合物の、Ｃ末端官能基には、アミド、アミド低級アルキル 、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およ びそれらの低級エステル、およびそれらの薬学的に受容可能な塩が含まれる。 Ｄ.骨格の修飾 本発明による化合物のペプチド誘導体を作成するための他の方法は、ルビーら の「Ｂiochem Ｊ.」、268(2)：249-262（1990）に記載されており、参照文献と して本明細書の一部をなす。このように、本発明のペプチド化合物は、同様の生 物学的活性を有する、非ペプチド化合物の構造モデルとしても役立つ。先導ペプ チド化合物と同一または類似の、所望の生物学的活性を有するが、溶解度、安定 性、並びに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性の面で、先導化合物に 比べて、さらに好ましい活性を有する化合物を構築するために、種々の技術が使 用で きることを、当業者は認めるであろう。モーガンおよびガイナーの「Ａnn.Ｒep. Ｍed.Ｃhem.」24：243-252（1989）を参照されたい（参照文献として本明細書の 一部をなす）。これらの技術には、ペプチド骨格をホスホネート、アミデート（ amidate）、カルバメート、スルホンアミド、２級アミン、およびＮ-メチルアミ ノ酸からなる骨格と置換することが含まれる。 -ＣＨ₂-カルバメート結合；ホスホネート結合；-ＣＨ₂-スルホンアミド結合； 尿素結合；２級アミン（-ＣＨ₂ＮＨ-）結合；およびアルキル化されたペプチド 結合［-Ｃ(Ｏ)ＮＲ⁶-、ここでＲ⁶は低級アルキル］などの結合で、一以上のペプ チド結合［-Ｃ(Ｏ)ＮＨ-］が、置換されているようなペプチド擬態物は、合成中 の適当な時点に、アミノ酸試薬を適切に保護されたアミノ酸類縁体と置き換える だけで、従来のペプチド合成の間に調製される。 適切な試薬には、例えば、アミノ酸のカルボキシル基が、上記の結合のうちの １つを形成するのに適した原子団と置き換えられたようなアミノ酸類縁体が含ま れる。例えば、ペプチド中の-Ｃ(Ｏ)ＮＲ-結合を-ＣＨ₂-カルバメート結合（-Ｃ Ｈ₂ＯＣ(Ｏ)ＮＲ-）と置換したい場合には、まず、適切に保護されたアミノ酸の カルボキシル（-ＣＯＯＨ）基を-ＣＨ₂ＯＨ基に還元し、次に、従来の方法で、- ＯＣ(Ｏ)Ｃl官能基またはパラ-ニトロ炭酸（-ＯＣ(Ｏ)Ｏ-Ｃ₆Ｈ₄-pＮＯ₂）官能 基に変換する。固体支持体上にある、部分的に作られたペプチドのＮ末端上の遊 離アミンまたはアルキル化されたアミンと、このような官能基のうちの何れかを 反応させれば、-ＣＨ₂ＯＣ(Ｏ)ＮＲ-結合が形成される。このような-ＣＨ₂-カル バメート結合の形成に関する、さらに詳細な記述については、チョーら（Ｃho e t al.）の「Ｓcience」、261：1303-1305（1993）を参照されたい。 同様に、アメリカ合衆国特許出願第07/943,805号、第08/081,577号、および第 08/119,700号において明らかにされている方法で（参照文献として、これらの開 示全体を本明細書の一部とする）、ペプチド中のアミド結合をホスホネート結合 と置換することもできる。 適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル（-ＣＯＯＨ）基を還元して、-ＣＨ₂ ＯＨ基とし、次に、従来の方法によって、該水酸基をトシル基のような適当な 脱離基に転換することによって、ペプチド中のアミド結合を-ＣＨ₂-スルホンア ミド結合 に置き換えることができる。トシル化誘導体を、例えば、チオ酢酸と反応させた 後に、加水分解および酸化的塩素化を行うと、ＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)₂Ｃl官能基が生成し 、他の部分が適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル基に置き換わる。ペプチ ド合成において、該適切に保護されたアミノ酸類縁体を用いると、ＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)₂ ＮＲ-結合が取り込まれて、ペプチド中のアミド結合に置き換わり、ペプチド擬 態物が得られる。アミノ酸のカルボキシル基をＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)₂Ｃl基に変換するこ とに関する、さらに完全なる記述については、例えばヴァインシュタイン、ボリ スの「アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学および生化学」、第７巻、 267-357ページ、マーセルデッカー社、ニューヨーク(1983)を参照されたい（参 照文献として本明細書の一部とする）。 アメリカ合衆国出願番号第08/147,805号（参照文献として、その全体を明細書 の一部とする）において明らかにされている方法によって、ペプチド中のアミド 結合を尿素結合に置換することができる。 例えば、従来の方法で、アミド結合のカルボニル結合をＣＨ₂基に還元した、 適切に保護されたジペプチド類縁体を利用することによって、ペプチド中のアミ ド結合が-ＣＨ₂ＮＨ-に置き換えられた、２級アミン結合を調製することができ る。例えば、ジグリシンの場合には、アミドをアミンに還元すると、脱保護の後 には、ＮＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣＨ₂ＣＯＯＨが生成し、これは、Ｎ-保護を受けた 形で、次の結合反応に用いられる。ジペプチド中のアミド結合のカルボニル基を 還元することによって、このような類縁体を調製することは、本分野において周 知である。 適切に保護されたアミノ酸類縁体は、対応するアミノ酸のように、従来のペプ チド合成において同様に用いられる。例えば、典型的には、該反応では、約３等 量の保護されたアミノ酸類縁体が用いられる。塩化メチレンまたはＤＭＦのよう な不活性有機希釈剤が用いられ、且つ反応副産物として酸が生成する場合には、 該反応溶液は、反応中に生成する酸を捕捉するために、典型的には、過剰量の３ 級アミンを含有するであろう。特に好適な３級アミンの１つには、ジイソプロピ ルエチルアミンがあり、典型的には、約10倍過剰量で用いられる。反応の結果、 非ペプチド結合を有するアミノ酸類縁体は、ペプチド擬態物に取り込まれる。ペ プチド中の任意のアミド結合のうちの０〜全部が、非アミド結合に置換されるよ うにこのような置換を繰り返すことができる。 また、本発明のペプチドは環状化することができ、あるいはペプチドの末端に デスアミノ残基もしくはデスカルボキシ残基を取り込ませることができ、プロテ アーゼに対する感受性を減少させるために、またはペプチドの高次構造を限定さ せるために、末端にアミノ基もしくはカルボキシル基が存在しないようにするこ とができる。本発明の化合物のＣ末端官能基には、アミド、アミド低級アルキル 、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およ びそれらの低級エステル誘導体、およびそれらの薬学的に受容可能な塩が含まれ る。環状化合物の例を表４、５、６、８、および９に示す。 Ｅ.ジスルフィド結合形成 本発明の化合物は、システインのチオール基間の分子内ジスルフィド結合を伴 った環状型で存在することができる。あるいは、２量体（または、さらに高次の オリゴマー）化合物を産生するために、システインのチオール基間の分子間ジス ルフィド結合を作成することができる。一以上のシステイン残基をホモシステイ ンと置換してもよい。これらの分子内ジスルフィド誘導体または分子間ジスルフ ィド誘導体は、以下のように図示できる： ここで、ｍおよびｎは、独立に、１または２である。 本発明の、他の実施態様では、これらのジスルフィド誘導体の類縁体であって 、硫黄の１つが、ＣＨ₂基または硫黄の均等物（isostere）に置換されているよ うな類縁体が提供される。これらの類縁体は、本分野において公知の、以下に示 す方法を用いて、分子内置換または分子間置換を行うことによって作成し得る。 ここで、ｐは１または２である。当業者の一部には、先に示されたα-アミノ- γ-酪酸誘導体の、他の相同体およびホモシステインを用いて、該置換を行うこ とも可能であるということが、容易に理解されるであろう。 あるいは、アルファ置換された酢酸で（ここで、アルファ置換基は、α-ハロ 酢酸（例えば、α-クロロ酢酸、α-ブロモ酢酸、またはα-ヨード酢酸）のよう な脱離基である）で、ペプチドのアミノ末端をキャッピングすることもできる。 システイン残基またはホモシステイン残基の硫黄で、脱離基を置換することによ って、本発明の化合物を環状化または２量体化することができる。例えば、バー カーら（Ｂarker et al.）の「Ｊ.Ｍed.Ｃhem.」35：2040-2048（1992）、およ びオーら（Ｏr et al.）の「Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.」56：3146-3149（1991）を参照さ れたい（参照文献として、各々を本明細書の一部とする）。２量体化合物の例は 、表７、９、および10に示されている。 Ｖ.有用性 本発明の化合物は、ＴＰＯの産生および受容体結合過程に影響を及ぼす、ある いは影響を及ぼされると考えられる多くの因子を評価することを含めた、ＴＰＯ の生物学的役割を理解するための、ユニークな道具として、インビトロにおいて 有用である。本化合物は、ＴＰＯ-Ｒに結合して、活性化する、他の化合物を開 発する上でも有用である。何故なら、本化合物は、構造と活性の相関に関する重 要な情報 を提供し、このような開発を促進するはずだからである。 本化合物は、新規ＴＰＯ受容体アゴニストをスクリーニングするためのアッセ イにおける、競合的結合物としても有用である。このようなアッセイでの実施態 様においては、本発明の化合物は、修飾せずに用いることができ、また種々の修 飾（例えば、直接的もしくは間接的に、検出可能な信号を付与する原子団を共有 結合もしくは非共有結合で結合しているような、標識によって）をすることもで きる。これらのアッセイでは全て、物質は直接的または間接的に標識され得る。 直接的標識の中で可能なものには：¹²⁵Ｉのような放射性標識、ペルオキシダ ーゼ、アルカリフォスファターゼのような酵素（アメリカ合衆国特許第3,645,09 0号）、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光偏光の変化をモニターし得る 蛍光標識（アメリカ合衆国特許第3,940,475号）のような標識団が含まれる。間 接的標識の中で可能なものには、ある構成物をビオチン化した後、上記の標識団 のうちの何れかを付着させたアビジンに結合させるものが含まれる。本化合物を 固体支持体に付着させなければならない場合には、本化合物は、スペーサーまた はリンカーを含んでもよい。 さらに、ＴＰＯ受容体に結合できるという特性に基づいて、生きた細胞上、固 定された細胞上、生物の体液中、組織ホモジネート中、精製された、天然の生物 学的物質中などのＴＰＯ受容体を検出するための試薬として、本発明のペプチド を用いることができる。例えば、このようなペプチドを標識することによって、 表面上にＴＰＯ-Ｒを有する細胞を同定することができる。さらに、ＴＰＯ-Ｒに 結合できるという特性に基づいて、本発明のペプチドをインシトゥ染色、ＦＡＣ Ｓ（蛍光活性化細胞選択；fluorescence-activated cell sorting）、ウェスタ ンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどに用いることができる。また、ＴＰＯ受容体 に結合できるという特性に基づき、本発明のペプチドを受容体の精製、または細 胞表面上(または内部への透過性を上昇せしめた細胞)にＴＰＯ受容体を発現して いる細胞の精製に用いることができる。本発明の化合物は、種々の医学的研究用 および診断用の市販試薬として用いることもできる。このような使用には、： (1)種々の機能的アッセイにおいて、ＴＰＯアゴニスト候補の活性を定量す るための校正用スタンダードとしての使用； (2)ＴＰＯ依存性細胞株の増殖および成長を維持するための使用； (3)共結晶化によるＴＰＯ受容体の構造解析における使用； (4)ＴＰＯシグナル伝達／受容体活性化機構を調べるための使用； (5)好ましくは、ＴＰＯ受容体が活性化され、またはこのような活性化が、 既知量のＴＰＯアゴニストおよびそれに類するものに対して、好適に校正されて いるような他の研究用途および診断用途 などが含まれるが、これらに限定されない。 本発明の化合物は、インビトロで巨核球およびそれらの始源細胞を増殖させる ために（両者とも、添加したサイトカインまたは自身のサイトカインとともに） 用いることができる。例えば、ジギウストら（ＤiＧiusto et al.）のＰＣＴ国 際公開第95/05843号を参照されたい（参照文献として、本明細書の一部をなす） 。化学療法および放射線療法は、急速に分裂している、さらに成熟した巨核球群 を殺すことによって、血小板減少症を引き起こす。しかし、これらの治療的処置 は、未成熟で、有糸分裂活性が小さい巨核球前駆細胞の数および生存率も減少さ せるかもしれない。このように、化学療法または放射線療法を受けた後の患者に 、インビトロ培養によって巨核球および未成熟な前駆体を増加させた、彼または 彼女自身の細胞群を注入することによって、ＴＰＯまたは本発明の化合物による 血小板減少症の改善を促進することができる。 本発明の化合物は、インビボでＴＰＯ-Ｒを活性化するために、ヒトを含めた 温血動物に投与することもできる。このように、本発明は、ＴＰＯ-Ｒに対する インビボでのＴＰＯの効果を模倣するのに十分な量の、本発明による化合物の投 与を含んでなる、ＴＰＯ関連疾患の治療的処置法を包括する。例えば、（特に、 骨髄移植、放射線療法、および化学療法に伴った）血小板の疾患および血小板減 少症を含む（ただし、これらに限定されない）種々の血液学的疾患を治療するた めに、本発明のペプチドおよび化合物を投与することができる。 いくつかの、本発明の実施態様においては、好ましくは、まず、化学療法また は放射線療法を行っている患者に、ＴＰＯアンタゴニストを投与し、次に本発明 のＴＰＯアゴニストを投与する。 本発明の化合物の活性は、マクドナルドの「Ａm．Ｊ．of Ｐediatric． Ｈematology/Ｏncology」14:8-21(1992)に記載されている多数のモデルの中の１ つによって、インビトロまたはインビボの何れかで評価することができる。 １つの実施態様によれば、本発明の組成物は、骨髄移植、放射線療法、または 化学療法に伴う血小板減少症を治療するのに有用である。典型的には、化学療法 、放射線療法、または骨髄移植の前に、またはこれらへの暴露の後に、予防的に 本化合物が投与されるであろう。 従って、本発明は、活性成分として、薬学的担体または希釈剤と共に、本発明 のペプチドまたはペプチド擬態物を一以上具備する薬学的組成物も提供する。本 発明の化合物は、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（IV）または皮下 投与）、（細粒処方による）吸入、経皮、鼻、膣、直腸、または舌下投与経路に よって投与することができ、各投与経路に適した投与形態で処方し得る。例えば 、ベルンシュタインら（Ｂernstein et al.）のＰＣＴ特許国際公開番号ＷＯ93/ 25221；ピットら（Ｐitt et al.）のＰＣＴ特許国際公開番号ＷＯ94/117784；お よびピットらの欧州特許出願第613,683号を参照されたい（参照文献として、各 々を本明細書の一部とする）。 経口投与用の固形投与形態には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が 含まれる。このような固形投与形態においては、有効化合物は、ショ糖、乳糖、 またはデンプンのような、一以上の薬学的に受容可能な不活性担体と混合される 。このような投与形態は、通常行われるように、例えば、ステアリン酸マグネシ ウムのような潤滑剤などの、不活性希釈剤以外の添加物質も具備し得る。カプセ ル、錠剤および丸薬の場合には、該投与形態は、緩衝剤を具備してもよい。錠剤 および丸薬は、さらに腸管コーティングを用いて調製することもできる。 経口投与用の液状投与形態は、水のような、本分野において一般的に用いられ る不活性希釈剤を含有するエリキシル剤とともに、薬学的に受容可能なエマルジ ョン、溶液、懸濁液、シロップを含む。このような不活性希釈剤の他に、組成物 は、保湿剤、乳化剤、および懸濁剤、並びに甘味剤、芳香剤、および香料のよう な佐剤も含み得る。 非経口投与用の本発明による調製物には、滅菌された水溶液もしくは非水溶液 、滅菌された水性懸濁液もしくは非水性懸濁液、または滅菌された水性エマルジ ョ ンもしくは非水性エマルジョンが含まれる。非水性溶液または非水性賦形剤には 、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロ コシ油のような植物油、ゼラチン、オレイン酸エチルのような注射可能な有機エ ステルが含まれる。このような投与形態には、保存料、保湿剤、乳化剤、および 分散剤のような佐剤を含有させてもよい。例えば、細菌を通さないフィルターに よる濾過、組成物中への滅菌剤の添加、組成物に対する放射線照射、または組成 物の加熱によって、それらを滅菌してもよい。また、使用直前に、滅菌された水 、または他の滅菌された、注射可能な溶媒を用いて製造することもできる。 直腸内または膣内投与用組成物は、好ましくは、座薬であり、活性物質の他に 、ココアバターまたは座薬用ワックスのような添加剤を含有してもよい。鼻また は舌下投与用組成物も、本分野において周知の、標準的添加物を用いて調製され る。 本化合物を含有する組成物は、予防用および／または治療用処置のために、投 与することができる。治療用の使用においては、組成物は、上述のように、既に 疾病を患っている患者に対して、治癒するのに十分な量、または少なくとも疾病 およびその併発症の症候を部分的に阻止するのに十分な量投与される。これを十 分達成し得る量を「治療的有効量」と定義する。このような使用における有効量 は、病気の程度、並びに患者の重量および一般的な状態に依存するであろう。 本発明の組成物は、例えば、タイスおよびビビ（Ｔice and Ｂibi）の方法「 薬物供給制御に関する論文（Ｔreatise on Ｃontrolled Ｄrug Ｄelivery）」、 キドニエウス（Ｋydonieus Ａ.）編集、マーセルデッカー、ニューヨーク、（19 92）、315-339ページ）によって、ミクロ封入化し得る。 予防用の使用においては、本発明の化合物を含有する組成物は、ある病気に罹 り易い患者、またはその他ある病気に罹るリスクを負っている患者に対して投与 される。このような量を「予防的有効量」と定義する。この使用においても、正 確な量は、患者の健康状態および体重に依存する。 有効な治療に必要なＴＰＯアゴニストの量は、投与手段、標的部位、患者の生 理的状態、および投与されている他の医薬を含む、多くの異なる因子に依存する であろう。したがって、治療的投与量を滴定して、安全性および有効性を至適化 しなければならない。典型的には、インビトロで用いられる投与量は、これらの 試 薬をインシトゥで投与する場合に有用な量に対して、有効な指針を与えるかもし れない。動物を用いて、ある疾患の治療的有効量をテストすれば、さらにヒトに 対する投与量の予測用指標も得られるであろう。例えば、ギルマンら（Ｇilman et al.）編集、グッドマンおよびギルマンの「治療の薬理学的基礎（Ｔhe Ｐhar macological Ｂasis of Ｔherapeutics）、第８版、パーガモン出版(Ｐergamon Ｐress)(1990)：レミントン(Ｒemington)の「薬剤科学(Ｐharmaceutical Ｓcien ces)、第７版、マック出版社（Ｍack Ｐublilshing Ｃo.,）、イーストン（Ｅas ton）、ペンシルバニア、（1985）（参照文献として、各々が本明細書の一部と される）中で、種々の考察が記述されている。 本発明のペプチドおよびペプチド擬態物は、１日あたり約0.001〜10mg/kg体重 の範囲の投与量で投与すると、ＴＰＯが仲介する症状を治療するのに有効である 。用いるべき具体的な用量は、治療される症状、投与経路の他、症状の程度、患 者の年齢および一般的な条件等のような要因を考慮して、治療に当たっている医 師が行った判断によって調整される。以上、本発明の好適な実施態様のみを具体 的に記述しているが、本発明の精神および意図する範囲から外れずに、本発明の 修飾および変形が可能であることが理解されるであろう。実施例１ 固相ペプチド合成 本発明による種々のペプチドは、メリーフィールドの固相合成技術（スチュワ ードおよびヤング（Ｓteward and Ｙoung）の「固相ペプチド合成」、第２版、 ピアース化学(Ｐierce Ｃhemical）、ロックフォード（Ｒockford）、イリノイ （1984）、およびメリーフィールドの「Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.」85：2149（1963） 参照）を用いて、ミリゲン／バイオサーチ（Ｍilligen/Ｂiosearch）9600自動装 置、またはアプライドバイオシステム社（Ａpplied Ｂiosystem Ｉnc.）モデル4 31Ａペプチド合成機上で合成した。ペプチドは、アプライドバイオシステム社の システムソフトウェアバージョン1.01の標準的プロトコールを用いて、ペプチド を組み合わせた。各々の結合は、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾリル Ｎ-オキシトリ スジメチルアミノフォスフォニウム ヘキサフルオロリン酸）およびＨＯＢt（1 -ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて、1-2時間行った。 用いた樹脂は、ＨＭＰ樹脂またはＰＡＬ（ミリゲン／バイオリサーチ）であり 、これはリンカーとして、5-（4'-Ｆmoc-アミノメチル-3,5'-ジメトキシフェノ キシ）吉草酸をリンカーとして架橋した、ポリスチレン樹脂である。ＰＡＬ樹脂 を用いて、ペプチドを樹脂から切断すると、カルボキシル末端にアミド官能基が 生じる。ＨＭＰ樹脂には、切断すると、最終産物のＣ末端にカルボン酸原子団が 生じる。殆どの試薬、樹脂、および保護されたアミノ酸（遊離または樹脂上）は 、ミリポアまたはアプライドバイオシステム社から購入した。 結合操作中における、アミノ保護には、Ｆmoc基を用いた。アミノ酸上の１級 アミンの保護は、Ｆmocで行い、側鎖の保護基は、セリン、チロシン、アスパラ ギン、グルタミン酸、およびトレオニンの場合にはt-ブチル；グルタミンの場合 には、トリチル；アルギニンの場合にはＰmc(2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマ スルホン酸）、トリプトファンの場合にはＮ-t-ブチロキシカルボニル；ヒスチ ジンおよびグルタミンの場合にはＮ-トリチル；システインの場合にはＳ-トリチ ルであった。試薬Ｋまたはそれを若干修正したもので処理することによって、樹 脂からペプチドを除去し、同時に側鎖官能基を脱保護せしめた。あるいは、アミ ド化されたカルボキシル末端を有する、それらのペプチド合成においては、４℃ から初めて、徐々に室温まで上昇させながら、90％トリフルオロ酢酸、５％エタ ンジチオール、および５％の水の混合物で、完全に組み立てられたペプチドを切 断した。該脱保護されたペプチドは、ジエチルエーテルで沈殿させた。全てのケ ースにおいて、Ｃ₁₈が結合したシリカゲルカラム上の調製用逆相高速液体クロマ トグラフィーを用いて、0.1％トリフルオロ酢酸中アセトニトリル／水の勾配で 、精製を行った。高速原子衝撃質量分析計または電子スプレー質量分析計、およ び利用できる場合には、アミノ酸分析によって、均一なペプチドを特定した。実施例２ バイオアッセイ ペプチドの生物活性は、トロンボポエチン依存性の細胞増殖アッセイを用いて 測定することができる。マウスのＩＬ-3依存性Ｂa/Ｆ3細胞を完全な長さのヒト ＴＰＯ-Ｒでトランスフェクトした。ＩＬ-3が存在しない場合には（調節された ＷＥＨＩ-3培養液）、これらのセルの増殖は、ＴＰＯに依存する。トランスフェ クト していない親細胞株は、ヒトＴＰＯには応答しないが、ＩＬ-3依存性は残存して いる。 ライブラリーのスクリーニングから得られた合成ペプチドを用いて、上記の両 細胞株に対して、バイオアッセイを行った。調節された10％ＷＥＨＩ-3培養液を 含有する完全ＲＰＭＩ-10培養液中で細胞を増殖させて、次に２度ＰＢＳで洗浄 し、調節されたＷＥＨＩ-3培養液を含まない培養液中に再懸濁して、ペプチド希 釈液またはＴＰＯ希釈液を含有するウェルに、２×10⁴細胞／ウェルになるよう に、細胞を添加した。水分を含んだ５％ＣＯ₂大気下で、細胞を37℃で48時間イ ンキュベートし、ＭＴＴがホルマザンに還元されることを用いて、ＥＬＩＳＡプ レート読み取り機で570nmの吸収を測定することにより、代謝活性をアッセイし た。図１に示されているように、テストしたペプチドは、ＴＰＯ-Ｒをトランス フェクトしたＢa/Ｆ3細胞の増殖を用量依存的に刺激した。これらのペプチドは 、親細胞株には、全く影響を与えない。実施例３ 結合親和性 化学的に合成されたペプチドのＴＰＯ-Ｒに対する結合親和性を競合的結合ア ッセイで測定した。微量滴定プレートのウェルを１mgのストレプトアビジンでコ ートし、ＰＢＳ/1％ ＢＳＡでブロックした後、50ngのビオチン化抗受容体固定 化抗体（Ａb179）をコートした。続いて、可溶性ＴＰＯ-Ｒ採集物を1:10で希釈 したものでウェルを処理した。種々の濃度のペプチドまたはペプチド擬態物を、 マルトース結合タンパク質のＣ末端に融合させた1-156残基からなる一定量の末 端切断型ＴＰＯ（ＭＢＰ-ＴＰＯ₁₅₆）と混合した。ペプチドとＭＢＰ-ＴＰＯ₁₅₆ の混合物をＴＰＯ-Ｒでコートされたウェルに添加し、４℃で２時間インキュベ ートした後、ＰＢＳで洗浄した。ＭＢＰに対して誘導されたウサギ抗血清を添加 し、続いてアルカリフォスファターゼを結合したヤギ抗ウサギＩgＧを添加する ことによって、平衡状態で結合していろＭＢＰ-ＴＰＯ₁₅₆の量を測定した。各ウ ェル中のアルカリフォスファターゼの量は、標準的方法を用いて定量した。 該アッセイは、広範囲のペプチド濃度にわたって行い、その結果を、ｙ軸が結 合したＭＢＰ-ＴＰＯ₁₅₆の量を表し、ｘ軸がペプチドまたはペプチド擬態物の濃 度を 表すようにグラフ化する。これによって、固定化されたＴＰＯ-Ｒに結合したＭ ＢＰ-ＴＰＯ₁₅₆の量を50％減少せしめるペプチドまたはペプチド擬態物の濃度（ ＩＣ₅₀）を決定することができる。ペプチドの解離定数（Ｋd）は、上述のアッ セイ条件を用いて測定されたＩＣ₅₀と同様のはずである。実施例４ 「プラスミド上のペプチド」 ライブラリーの構築には、pＪＳ142ベクターを使用し、該ベクターを図４に示 す。ライブラリーの構築には、ＯＮ-829（5'ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧ）；Ｏ Ｎ-830（5'ＴＴＡ ＣＴＴ ＡＧＴ ＴＡ）、および目的のライブラリー特異的な オリゴヌクレオチド（5'ＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ{ＮＮＫ}_nＴＡＡ ＣＴＡ ＡＧＴ Ａ ＡＡ ＧＣ）（ここで、{ＮＮＫ}_nは、所望の長さおよび配列のランダム領域を示 す）という３つのオリゴヌクレオチド配列が必要である。該オリゴヌクレオチド は、合成中または精製後、ポリヌクレオチドキナーゼによって、5'を化学的にリ ン酸化し得る。次に、それらを1:1:1のモル比でアニールさせ、ベクターに連結 する。 パンニングに用いられる、好適な大腸菌株は、△(srl-recＡ)endＡ1 nupＧ lo n-11sulＡ1 hsdＲ17△（ompＴ-fepＣ）266△clpＡ319::kan△lacＩ lac ＺＵ118 という遺伝子型を有し、エール大学の大腸菌ジェネティックストックセンター( Ｅ.Ｃolib/r,stock center designation ＣＧＳＣ:6573)から入手できる遺伝子 型lon-11 sulＡ1をもつ大腸菌株から調製される。ダウアーらの「Ｎucleic Ａci ds Ｒes.」16：6127（1988）に記載されている電気穿孔法（全ての洗浄ステップ で、10％グリセロールが用いられていることが異なる）に用いるために、上記大 腸菌株を調製する。1pgのブルースクリプトプラスミド（Ｓtratagene）を用いて 、細胞の有効性をテストする。オリジナルのライブラリを増殖させ、パンニング の各ラウンドによって濃縮された群を増幅するために、これらの細胞を用いる。 パンニングをするために、リゾチームを用いる、穏和な酵素的消化によって細 胞壁を消化して、細胞からプラスミド上のペプチドを放出させる。細胞破片を沈 殿させた後、殆どの受容体には、粗溶解物を直接用いることができる。プラスミ ド複合体をさらに精製することが必要ならば、粗溶解物中の低分子量混入物の多 くはゲル濾過カラムを用いて除去することができる。 パンニングは、多くの生理的緩衝液に比べて塩濃度が低い緩衝液（ＨＥＫＬ） 中で行う。パンニングは、ブロックされていないモノクローナル抗体（Ｍab）上 に固定化された受容体を有する微量滴定ウェルの中で行うことができ、またビー ズもしくはカラム上でパンニングすることもできる。さらに具体的には、パンニ ングの第１ラウンドでは、受容体でコートされた各24のウェルを用いることがで きる。第２ラウンドでは、典型的には、受容体でコートされた６つのウェル（Ｐ ＡＮサンプル）、および受容体がない６つのウェル（ＮＣサンプル）を用いる。 これらの２つのサンプル中のプラスミド数を比較すれば、パンニングによって、 受容体特異的なクローンが濃縮されているかどうかの指標を得ることができる。 「濃縮」は、ＮＣサンプルから回収された形質転換体に対するＰＡＮ形質転換体 の比として定義される。10倍の濃縮が、通常受容体特異的クローンが存在すると いう指標となる。 その後のパンニングのラウンドにおいては、プラスミド複合体の非特異的バッ クグラウンド結合を抑えるために、ウェルに入れる溶解物の量を少なくするのが 有用である。第２ラウンドでは、ウェル当たり100μｌの溶解物が通常使用され る。第３ラウンドでは、ウェル当たり100μｌの溶解物を、ＨＥＫＬ/ＢＳＡ中で 1/10に希釈したものが用いられる。それ以後のパンニングのラウンドでは、典型 的には、残存すると概算せれる多様性の、少なくとも1000倍プラスミド形質転換 ユニットを用いる。 各クローンにコードされているペプチドの結合特性は、観察された濃縮数に従 って、典型的には、３、４、または５ラウンド目のパンニングの後に調べている 。典型的には、ＬacＩ-ペプチド融合タンパク質による受容体特異的結合を検出 するＥＬＩＳＡを用いる。ＬacＩは、通常４量体であり、機能を有する最少のＤ ＮＡ結合分子種は２量体である。それ故、ペプチドは、融合タンパク質上に複数 個発現されている。十分な密度の受容体をウェル中に固定化できると仮定すれば 、ＬacＩに融合されたペプチドは、協同的、多価的様式にて、表面に結合するで あろう。このような協同的結合によって、固有親和性が低い結合状態を検出する ことができる。該アッセイの感度は、初めに、低親和性のものに遭遇したことを 容易に同定できることが利点であるが、ＥＬＩＳＡ中のシグナルがペプチドの固 有親和性と相関しな いということが欠点である。以下に記述するように、ペプチドをマルトース結合 タンパク質（ＭＢＰ）に融合させることによって、シグナル強度が、親和性とさ らによく相関するようなＥＬＩＳＡフォーマットでテストすることが可能になる 。図５Ａ-Ｂを見よ。 任意の標準的な少量調製操作（miniprep procedure）を用いて、目的のクロー ンから、ＤＮＡを２重鎖の形で調製することができる。目的の単一クローンまた はクローン群のコーディング配列をベクターへ移し、該ベクターによって、これ らの遺伝子は、ＭＢＰ（一般的には、溶液中で単量体として存在するタンパク質 ）をコードしている遺伝子と一体化して融合する。pＪＳ142中へライブラリーを クローニングすることにより、ライブラリーのランダムコーディング領域の先頭 付近にＢspＥＩ制限部位が生じる。ＢspＥＩおよびＳcaＩでの消化によって、２ つのベクターpＥＬＭ3（細胞質）またはpＥＬＭ15（周辺細胞質）（これらは、 各々pＭＡＬc2およびpＭＡＬp2ベクターの簡易な修飾物であり、ニューイングラ ンド バイオラブから市販されているものが利用可能である）のうちの何れかに 、サブクローニングされ得る約900bpのＤＮＡ断片を精製することが可能となる 。図５Ａ-Ｂを見よ。ＡgeＩおよびＳcaＩでpＥＬＭ3およびpＥＬＭ15を消化すれ ば、pＪＳ142ライブラリーからのＢspＥＩ-ＳcaＩ断片を効率的にクローニング することができる。ＢspＥＩおよびＡgeＩの末端は、連結に適合している。さら に、機能的なbla遺伝子（Ａmp耐性）を再現させるためには、ＳcaＩ部位を正し く連結することが必須であり、これによって、望ましくない連結がにより生じる バックグラウンドクローンのレベルが減少する。次にＩＰＴＧによって、tacプ ロモーター誘導性のＭＢＰ-ペプチド融合体の発現を生じさせることができる。 ＬacＩ ＥＬＩＳＡまたはＭＢＰ ＥＬＩＳＡ用の溶解物は、リゾチームを用い た細胞の溶解、および遠心による不溶性の細胞破片の除去によって、各クローン から調製される。続いて、固定化された受容体を含むウェル、および受容体を含 まない対照用のウェルに溶解物を添加する。ＬacＩペプチド融合体またはＭＢＰ ペプチド融合体の結合は、ＬacＩまたはＭＢＰの何れかに対して誘導された、ウ サギのポリクローナル抗血清とともにインキュベートし、次にアルカリフォスフ ァターゼを標識したヤギ抗ウサギ第２抗体でインキュベートすることによって検 出される。結合 したアルカリフォスファターゼは、p-ニトロフェニルリン酸発色性基質を用いて 検出する。実施例５ 「ヘッドピース２量体」システム プラスミド上のＬacＩペプチドの変形法では、「ヘッドピース２量体」と称さ れるＤＮＡ結合タンパク質を利用する。大腸菌lacリプレッサーによるＤＮＡの 結合は、約60アミノ酸の「ヘッドピース」ドメインを介して行われている。lac オペレーターに結合するヘッドピースドメインの２量体は、通常さらに大きい、 約300アミノ酸のＣ末端ドメインが会合することによって形成される。「ヘッド ピース２量体」システムは、短いペプチドリンカーを介して結合された、２つの ヘッドピースを含有するヘッドピース２量体分子を用いる。これらのタンパク質 は、ＤＮＡと十分安定な結合をするので、ヘッドピース２量体のＣ末端に位置す るペプチドのエピトープが、ペプチドをコードしているプラスミドと会合するこ とが可能となる。 ランダムペプチドをヘッドピース２量体のＣ末端に融合させると、該２量体は 、該２量体をコードしていたプラスミドに結合し、パンニングによるスクリーニ ングが可能なペプチド-ヘッドピース２量体-プラスミド複合体を形成する。該ペ プチド上のヘッドピース２量体システムは、ＬacＩシステムに比べて、高親和性 リガンドに対する選択性が勝っている。このように、ヘッドピース２量体システ ムは、最初の低親和性ヒットに基づいて変異導入ライブラリーを作成し、最初の 配列の高親和性変異体を選択するのに有用である。 ライブラリーは、ヘッドピース２量体ベクターpＣＭＧ14を用いたプラスミド 上のペプチドとともに構築されている（図６Ａ-Ｃを見よ）。ヘッドピース２量 体タンパク質がプラスミドに結合するためには、lacオペレーターの存在は、必 要ではない。ライブラリーは、大腸菌(lon-11 sulＡ1 hsdＲ17(ompＴ-fepＣ)Δc lpＡ319::kanΔlacＩ lac ＺＵ118Δ（srl-recＡ）306::Ｔn10を具備する細菌株 に導入し、基底(Ａ)プロモーター誘導状態下で増幅した。ヘッドピース２量体ラ イブラリーのパンニングは、ＬacＩライブラリーに用いたものと類似の操作によ って行うが、ＨＥＫＬ緩衝液に代えてＨＥＫ緩衝液を用いること、およびＩＰＴ Ｇに代えてフェノ ール水溶液で、ウェルからのプラスミド溶出を行うことが異なる。ヘッドピース ２量体パンニングからの配列をアフィニティー感受性ＭＢＰ ＥＬＩＳＡ中でテ ストすることができるように、また標識された受容体用いて、コロニーリフトす ることによって、クローン群をスクリーニングできるように、多くの場合、ＭＢ Ｐベクターへ転移させた後に、ヘッドピース２量体パンニングからの配列を特定 する。実施例６ 本実施例では、環状化合物に対して、３つのアッセイを行った。まず、上述の ようにＩＣ₅₀値を得た。さらに、上述したように、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを行 って、ＥＣ₅₀値を計算した。最後に、ミクロフィジオメーター（Ｍolecular Ｄe vices Ｃorp.）アッセイを行った。基本的には、該アッセイでは、本発明の化合 物によるＴＰＯ受容体刺激に応じた細胞外培養液の酸性化速度を求めた。ＥＣ₅₀ の範囲は、上記のＩＣ₅₀のように、記号で示してある。結果を表４にまとめる。 実施例７ 本実施例においては、環状化合物 中のＤ、Ｅ、Ｉ、ＳまたはＦ部位のアミノ酸置換体のＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀値を上 述のように、アッセイした。ミクロフィジオメーターの結果は、括弧内に示され ている。結果を下表５にまとめる。 実施例８ 本実施例においては、下表６に示されているように、化合物 中のアミノ酸置換をＤ、ＳまたはＦ部位において評価した。ＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀ 値は、上述のように計算した。括弧内は、ミクロフィジオメーターの結果である 。 実施例９ 本実施例では、下表７にリストされている２量体化合物のＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀ 値は、上述のように計算した。環状単量体 を比較のために含めてある。 表８の化合物は、テストされた最高濃度10μＭで不活性であった。 表９では、上述のように求めた、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡの環状変異体 および２量体変異体のＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀値を比較している。 表10では、２量体 の末端切断型が比較されている。ＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀値は、上述のように計算し た。括弧内にミクロフィジオメーターの結果を示す。 実施例10 本実施例では、環状化合物 中のＧ、Ｐ、およびＷ部位に種々の置換を導入した。 表11は、ＴＰＯアゴニスト活性を示す、置換された化合物の例の一覧表である 。表中で略記した置換は、次のとおりである： 実施例11 マウスを有用なテスト種として用いることができるかどうかを評価するために 、マウス受容体に対するテスト化合物の活性を測定するようにデザインされた、 いくつかのインビトロ実験を行った。まず、培養液中で、rhuＴＰＯまたは様々 な濃度のテストペプチドの何れかとともに、１匹のＢalb/cマウス（８〜９週齢 ）の大腿から採集した骨髄細胞を７日間インキュベートした。インキュベーショ ン期間の終了時に、培養液をサイトスピン（Ｃytospin）で濃縮し、アセチルコ リンエステラーゼ（ＡＣhＥ、マウス巨核球の目印）で染色して、顕微鏡分析で 計数した。ＡＣhＥで染色される、極めて巨大な（>40μｍ）非接着性細胞の増殖 が、1nＭのrhuＴＰＯによって生じた。これらの細胞は、成熟した巨核球である と思われる。合計10⁶個/mlの骨髄細胞（50ml培養液中）を最初に植え付けたこと から推測すると、1〜2×10⁶個の巨核球が生育したと推定される。ＴＰＯに対す るこのような応答を「最大」と称した。成長因子を全く添加しなかった、対照培 養は、ＡＣheＥ陽性細胞を殆ど生じなかった。このアッセイにおいて、いくつか のペプチド化合物は、高濃度でテストした。その結果を表12にまとめる。ペプチ ドＡは、10μＭで、マウス骨髄に最大の応答を生じせしめた。この発見が、該ペ プチドファミリーがマウス受容体に対して活性を有するという最初の証拠となっ た。別の実験では、骨髄細胞を採集し、1nＭ rhuＴＰＯまたは10μＭペプチドＡ を含む、あるいは因子を全く含まない、何れかの半固形培地（メチルセルロース ）中で培養した。培養７日後に、大きな細胞のコロニー（巨核球と推測される） を計数し、小コロニー（3-5個の細胞）または大コロニー（６個以上の細胞）に 分けた。結果を表13に示す。陰性対照培養に比べて、ＴＰＯおよびテストペプチ ドは、両者ともに、両サイズのコロニーを明らかに多く生じせしめた。このこと は、ペプチドが、ＭＫ前駆体細胞群の増殖を刺激することができるというＴＰＯ の性質を模倣していることを示すものである。 マウス受容体およびヒト受容体に対するテスト化合物の活性をさらに定量的に 比較するために、muＴＰＯ受容体をクローニングして、ＢaＦ3細胞にトランスフ ェクトした。ＴＰＯ依存性の細胞群を単離した。 本出願において開示された、全ての論文および参照文献は、特許文献も含めて 、全ての目的のために、参照文献として、その全体を本明細書の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バーレット、ロナルド・ダブリュ アメリカ合衆国、カリフォルニア州 95070、サラトガ、アロヨー・デ・アーク ェロ 12900 (72)発明者 クワーラ、スティーブン・イー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94025、メンロ・パーク、ヘッジ・ロード 111 (72)発明者 ダフィン、デイビッド・ジェイ アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94303、イースト・ポロ・アルト、ナンバ ー 13、ウッドランド・アベニュー 1735 (72)発明者 ゲーツ・クリスチャン・エム アメリカ合衆国、カリフォルニア州 95037、モーガン・ヒル、エー・クロイ・ ロード 5770 (72)発明者 ジョンソン、シェリル・エス アメリカ合衆国、カリフォルニア州 95060、サンタ・クルッツ、イーストリッ ジ・ドライブ 27 (72)発明者 マットヒーキス、ラリー・シー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 95014、カパーティノ、サンライズ・ドラ イブ 20612 (72)発明者 シャッツ、ピーター・ジェイ アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94040、マウンテン・ビュー、ナンバー 15、マリッチ・ウェイ 2080 (72)発明者 ワグストロム、クリストファー・アール アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94024、ロス・アルトス、ファーンドン・ アベニュー 1909 (72)発明者 ライトン、ニコラス・シー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94304、パロ・アルト、アムハースト・ス トリート 2030

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トロンボポエチン受容体に結合する化合物であって、該化合物が： (1)約8000ダルトン未満の分子量であり、 (2)ＩＣ₅₀で表したときの、トロンボポエチン受容体に対する結合親和性 が約100μｍにすぎない ような化合物。 ２．請求項１の化合物であって、該化合物がペプチドであり、且つ 該ペプチドの０〜全ての-Ｃ(Ｏ)ＮＨ-結合が、 -ＣＨ₂-ＯＣ(Ｏ)ＮＲ-結合；ホスホネート結合；-ＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)₂ＮＲ-結 合；-ＣＨ₂ＮＲ-結合：および-Ｃ(Ｏ)ＮＲ⁶-結合；および-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ-結合 （ここでＲは水素または低級アルキルであり、Ｒ⁶は低級アルキルである） からなる群から選択される結合によって置換されており、 さらに、前記ペプチドまたはペプチド擬態物のＮ末端が、 -ＮＲＲ¹基；-ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ基；ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ基；-ＮＲＳ(Ｏ)₂Ｒ基；- ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ基：スクシンイミド基；ベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-基； およびフェニル環上に、低級アルキル、低級アルコキシ、塩素、および臭素から なる群から選択される、１〜３個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル- ＮＨ-基（ここで、ＲおよびＲ¹は水素および低級アルキルからなる群から独立に 選択される） からなる群から選択され、 さらに、前記ペプチドまたはペプチド擬態物のＣ末端が、式-Ｃ(Ｏ)Ｒ²（ ここでＲ²はヒドロキシ、低級アルコキシおよび-ＮＲ³Ｒ⁴（ここで、Ｒ³および Ｒ⁴水素および低級アルキルからなる群から独立に選択され、且つ、-ＮＲ³Ｒ⁴の 窒素原子は、環状ペプチドを形成させるために、任意にペプチドのＮ末端のアミ ン基であり得る）からなる群から選択される）を有するような化合物および生理 学的に受容可能なそれらの塩。 ３．薬学的に受容できる担体とともに、請求項１の化合物を具備する薬学的組成 物。 ４．トロンボポエチンアゴニストによる治療に対して感受性を有する疾病を患つ ている患者の治療方法であって、患者に、請求項１の化合物を治療的有効用量ま たは有効量投与することを含んでなる方法。 ５．請求項４の方法であって、患者に投与される化合物がペプチドであり、 該ペプチドの０〜全ての-Ｃ(Ｏ)ＮＨ-結合が、 -ＣＨ₂ＯＣ(Ｏ)ＮＲ-結合；ホスホネート結合；-ＣＨ₂-Ｓ(Ｏ)₂ＮＲ-結 合；-ＣＨ₂ＮＲ-結合：-Ｃ(Ｏ)ＮＲ⁶-結合：および-ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨ-結合（ここ でＲは水素または低級アルキルであり、Ｒ⁶は低級アルキルである） からなる群から選択される結合によって置換され、 さらに、前記ペプチドまたはペプチド擬態物のＮ末端が、 -ＮＲＲ¹基：-ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ基；ＮＲＣ(Ｏ)ＯＲ基；-ＮＲＳ(Ｏ)₂Ｒ基；- ＮＨＣ(Ｏ)ＮＨＲ基；スクシンイミド基；ベンジルオキシカルボニル-ＮＨ-基； およびフェニル環上に、低級アルキル、低級アルコキシ、塩素、および臭素から なる群から選択される、１〜３個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル- ＮＨ-基（ここで、ＲおよびＲ¹は水素および低級アルキルからなる群から独立に 選択される） からなる群から選択され、 さらに、前記ペプチドまたはペプチド擬態物のＣ末端が、式-Ｃ(Ｏ)Ｒ²（ ここでＲ²はヒドロキシ、低級アルコキシおよび-ＮＲ³Ｒ⁴（ここで、Ｒ³および Ｒ⁴は、水素および低級アルキルからなる群から独立に選択され、環状ペプチド を形成させるために、-ＮＲ³Ｒ⁴基の窒素原子は、任意に、ペプチドのＮ末端の アミン基であり得る）からなる群から選択される）を有する ような化合物および生理学的に受容可能なそれらの塩である方法。 ６．請求項２の化合物であって、前記化合物がアミノ酸配列： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₁はＣ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｖ；Ｘ₂はＦ,Ｋ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔまたは Ｖ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＷ：Ｘ₄は遺伝的にコードされる20の Ｌ-アミノ酸のうちの何れか；Ｘ₅はＡ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ,ＶまたはＹ ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；およびＸ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ, ＲまたはＶである） を具備する化合物。 ７．請求項６の化合物であって、前記アミノ酸配列が環状である化合物。 ８．請求項６の化合物であって、前記アミノ酸配列が２量体化されている化合物 。 ９．請求項６の化合物であって、該化合物がアミノ酸配列： ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₂はＫ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｒ, ＳまたはＶ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れか；Ｘ₅ はＡ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｓ,ＶまたはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；およ びＸ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶである） を具備する化合物。 １０．請求項８の化合物であって、Ｘ₄がＡ,Ｅ,Ｇ,Ｈ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ またはＷである化合物。 １１．請求項１０の化合物であって、Ｘ₂がＳまたはＴ；Ｘ₃がＬまたはＲ；Ｘ₆ がＲ；Ｘ₅がＤ,ＥまたはＧ；Ｘ₆がＦ,ＬまたはＷ；Ｘ₇がＩ,Ｋ,Ｌ,ＲまたはＶで ある化合物。 １２．請求項９の化合物であって、前記化合物がアミノ酸配列： Ｘ₈ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで；Ｘ₂はＦ,Ｋ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｊ,Ｌ, Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＷ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸の何れか； Ｘ₅はＡ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ,Ｒ,Ｓ.Ｔ,ＶまたはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ ,ＷまたはＹ；Ｘ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶ；およびＸ₈は遺伝的にコ ードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れかである） を具備する化合物 １３．請求項１２の化合物であって、Ｘ₈がＧ,Ｓ,ＹまたはＲである化合物。 １４．請求項１２の化合物であって、前記化合物が、アミノ酸配列：ＧＧＣＴＬ ＲＥＷＬＨＧＧＦＣＧＧを具備する化合物。 １５．請求項６の化合物であって、前記化合物がアミノ酸配列： Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここでＸ₁はＬ,Ｍ,Ｐ,ＱまたはＶ；Ｘ₂はＦ,Ｒ,ＳまたはＴ；Ｘ₃はＦ, Ｌ,ＶまたはＷ；Ｘ₄はＡ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＴ；Ｘ₅はＡ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ,Ｑ ,Ｒ,ＳまたはＴ； Ｘ₇はＣ,Ｉ.Ｋ.Ｌ,ＭまたはＶ；およびＸ₈は、遺伝的にコードされる20のＬ-ア ミノ酸のうちの何れかである） を具備する化合物。 １６．請求項１５の化合物であって、Ｘ₁がＰ；Ｘ₂がＴ；Ｘ₃がＬ；Ｘ₄がＲ；Ｘ₅ がＥまたはＱ；Ｘ₇がＩまたはＬである化合物。 １７．請求項１６の化合物であって、前記化合物がアミノ酸配列： Ｘ₉Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₈はＡ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｋ,Ｌ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；およびＸ₉は Ａ,Ｃ,Ｅ,Ｇ,Ｉ.Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｒ,Ｑ,Ｓ,ＴまたはＶである） を具備する化合物。 １８．請求項１７の化合物であって、Ｘ₈がＤ,ＥまたはＫ；およびＸ₉がＡまた はＩである化合物 １９．請求項１８の化合物であって、前記化合物が、ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲＥＷ ＩＳＦＣＧＧ;ＧＮＡＤＧＰＴＬＲＱＷＬＥＧＲＲＰＫＮ;ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲ ＥＷＩＳＦＣＧＧＫ;ＴＩＫＧＰＴＬＲＱＷＬＫＳＲＥＨＴＳ;ＳＩＥＧＰＴＬＲ ＥＷＬＴＳＲＴＰＨＳ;ＬＡＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＨＧＮＧＲＤＴ;ＣＡＤＧＰＴ ＬＲＥＷＩＳＦＣ;およびＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡからなる群から選択さ れる化合物。 ２０．請求項４の方法であって、患者に投与される前記化合物がアミノ酸配列： ＣＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ （ここで、Ｘ₂はＫ,Ｌ,Ｎ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；Ｘ₃はＣ,Ｆ,Ｉ,Ｌ,Ｍ, Ｒ,ＳまたはＶ；Ｘ₄は遺伝的にコードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れか； Ｘ₅はＡ,Ｄ,Ｅ,Ｇ,Ｓ,ＶまたはＹ；Ｘ₆はＣ,Ｆ,Ｇ,Ｌ,Ｍ,Ｓ,Ｖ,ＷまたはＹ；お よびＸ₇はＣ,Ｇ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｎ,ＲまたはＶである） を具備する方法。 ２１．請求項２０の方法であって、Ｘ₄がＡ,Ｅ,Ｇ,Ｈ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,Ｔ またはＷである方法。 ２２．請求項２１の方法であって、Ｘ₂がＳまたはＴ；Ｘ₃がＬまたはＲ；Ｘ₄が Ｒ：Ｘ₅がＤ,ＥまたはＧ：Ｘ₆がＦ,ＬまたはＷ：Ｘ₇がＩ,Ｋ,Ｌ,ＲまたはＶで ある方法。 ２３．請求項２２の方法であって、患者に投与される前記化合物がアミノ酸配列 ：ＧＧＣＴＬＲＥＷＬＨＧＧＦＣＧＧを具備する方法。 ２４．請求項４の方法であって、トロンボポエチンアゴニストに感受性を有する 疾患が： 化学療法、放射線療法、または骨髄移植によって生じる血液学的疾患 および血小板減少症 からなる群から選択される方法。 ２５．請求項４の方法であって、患者に投与される前記化合物がアミノ酸配列： Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₁はＬ,Ｍ,Ｐ,ＱまたはＶ；Ｘ₂はＦ,Ｒ,ＳまたはＴ；Ｘ₃はＦ ,Ｌ,ＶまたはＷ；Ｘ₄はＡ,Ｋ,Ｌ,Ｍ,Ｒ,Ｓ,ＶまたはＴ；Ｘ₅はＡ,Ｅ,Ｇ,Ｋ,Ｍ, Ｑ,Ｒ,ＳまたはＴ：Ｘ₇はＣ,Ｉ,Ｋ,Ｌ,ＭまたはＶ；およびＸ₈残基は、遺伝的に コードされる20のＬ-アミノ酸のうちの何れかである） を具備する方法。 ２６．請求項２５の方法であって、Ｘ₁がＰ；Ｘ₂がＴ；Ｘ₃がＬ；Ｘ₄がＲ；Ｘ₅ がＥまたはＱ；Ｘ₇がＩまたはＬである方法。 ２７．請求項２６の方法であって、前記化合物がアミノ酸配列： Ｘ₉Ｘ₈ＧＸ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＷＸ₇ （ここで、Ｘ₈はＡ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｋ,Ｌ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶであり；Ｘ₉はＡ, Ｃ,Ｅ,Ｇ,Ｉ,Ｌ,Ｍ,Ｐ,Ｑ,Ｒ,Ｓ,ＴまたはＶ；および） を具備する方法。 ２８．請求項２７の方法で、Ｘ₈がＤ,ＥまたはＫであり；Ｘ₉がＡまたはＩであ る方法。 ２９．請求項２８の方法で、患者に投与される化合物が、ＧＧＣＡＤＧＰＴＬＲ ＥＷＩＳＦＣＧＧ;ＧＮＡＤＧＰＴＬＲＱＷＬＥＧＲＲＰＫＮ;ＧＧＣＡＤＧＰＴ ＬＲＥＷＩＳＦＣＧＧＫ;ＴＩＫＧＰＴＬＲＱＷＬＫＳＲＥＨＴＳ;ＳＩＥＧＰＴ ＬＲＥＷＬＴＳＲＴＰＨＳ;ＬＡＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＨＧＮＧＲＤＴ;ＣＡＤＧ ＰＴＬＲＥＷＩＳＦＣ;およびＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡから なる群から選択される方法。 ３０．トロンボポエチン受容体に結合する化合物であって、前記化合物が からなる群から選択される化合物。 ３１．トロンボポエチンアゴニストによる治療に対して感受性を有する疾病を患 っている患者の治療方法であって、患者に、 からなる群から選択される化合物を投与することを具備する方法。