TW518341B

TW518341B - Peptide or peptide mimetic compound that binds to thrombopoietin receptor and pharmaceutical composition for treatment of hematological disorders and thrombocytopenia

Info

Publication number: TW518341B
Application number: TW085109336A
Authority: TW
Inventors: Ronald W Barrett; Nicholas C Wrighton; William J Dower; David J Duffin; Steven E Cwirla
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2003-01-21
Also published as: DE69637473D1; ZA964814B; KR19990022576A; EP0885242A1; CZ291749B6; HK1015380A1; IL122102A; EP1961760A3; EP0885242B1; PE7898A1; PL323917A1; EP2338897A1; CA2223449A1; CN1966520B; ES2303338T3; CN1315870C; HUP9900921A2; NO20041296L; NO975705D0; CN1966520A

Description

518341 A7 B7 五、發明説明（1 ) 相顬案芊的交>叉_^_考資籾本申請案傺為在1995年6月7日提申美國專利申請案第 08/4j4,090號、在1995年6月7日提申美國專利申請案第 08/485,301號、在1995年6月7日提申美國專利申請案第 08/473,604號、在1995年6月7日提申美國專利申請案第 08/472,371號、在1995年6月7日提申美國專利申請案第 08/478,128號與在1995年6月7日提申美國專利申請案第 08/476,168號之部分連續案，該每一分申請案的整體内容列為本案的參考資料。發明背暑本發明偽提供一種胜肽或化合物，其可結合至並活血栓形成素受體（c-mpl或TP0-R)，或者可作為ΤΡ0同效劑。在生化及醫藥化學領域上具有應用性，待別是，其可提供一種供用於治療人類疾病之ΤΡ0同效劑。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 — ♦ I .-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 巨紅核細胞（m e g a k a r y 〇 c y t e s)像為骨髓衍生細胞，其傺負責産生血液循璟中的血小板。雖然在大部分的物種中其在骨髓中傺包含〈〇. 25¾ *但卻具有為典型骨髓細胞的體積之 > 10倍的體積。參見 Kuter et. a 1 Prj〇c_,_NaiL·__Ac_ajjk Sni. USA 91:11104-11108 (1994)。巨紅核細胞會遭遇一已知為内有絲分裂的步驟，藉此該細胞會複製其核，但不會經過細胞分裂，並藉由造成其為多倍體細胞。為反應血小板的數目降低，内分絲分裂速率會上升’進而高倍體的巨紅核細胞會形成，該巨紅核細胞數目可增加直至3倍一 4 一本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） 83. 3.10,000 518341 A7 _B7_ 五、發明説明（2 ) 。參見 Harker J> Clin> Invest. 47： 458-465 (1968) ° 相較於此，為反應血小板的數目上升，該内分絲分裂速率會降低，進而低倍體的巨紅核細胞會形成，該巨紅核細胞數目可降低50%。循環血小板物質調節内有絲分裂與骨髓巨紅核細胞數目之真正的生理回饋作用並不清楚。涉及調節該回饋環之循環血栓形成因子現今被認為是血栓形成素（ΤΡ0)。更特別的是，ΤΡ0在渉及血小板減少症的情況下顯示傺為主要的體液調節子。參見，例如M e t c a 1 f Nature 369:519 -520 (1994)。在一些的研究中已顯示TPO可增加血小板的數目、增加血小板大小及以增加接受動物之同位素加入血小板中的情況。特別是，ΤΡ0被認為傺在下述幾方面影響巨紅核細胞：⑴其可造成巨紅核細胞之大小與數目上的增加；⑵其可造成在巨紅核細胞中呈多倍體形式之DNA含量上增加；（3)其可增加巨紅核細胞之内有絲分裂；⑷其可造成巨紅核細胞成熟上的增加；以及⑸其可造成在骨髓中呈乙醯膽鹼-陽性反應細胞形式的前驅細胞之百分比上的增加。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因為血小板傺為血液凝集上必要的，且當其數目十分低時，一病人因可能會死於猝變的出血症而十分危險，ΤΡ0 在診斷與治療各種血液學上的疾病（例如，基本上因血小板缺陷所造成的疾病）二方面具有潛在之可應用性。ΤΡ0 的初期臨床測試顯示ΤΡ0可以安全地投藥給病人。此外，近來的研究更提供了一基礎，以投射出在治療血小板減少一 5 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 _B7_ 五、發明説明（3 ) 症上TPO治療效力，特別是治療癌症或是血癌上由化學治療、放射性治療或骨髓移植所造成的血小板減少上的治療效力。参見，例如，McDοna 1 d (1992) Am J > Ped H^fflato-i o^y/Onco1 ory 14*8-21 (1992) 編碼TPO的基因己被選殖出並定出待徵。參見Kuter et,al Proc. Hat 1 , Acad, Sci. USA 91:11104-11108 (1994) ； Barley et aK Cel 1 77 :1117-1 124 (1994); Kaushansky et al. Nature 369:568-571 (1994) ; Wend-ling et a 1 . Nature, 369:571-574 (1994);以及Sauvage et al. 369:533-538 (1994)。血栓形成素傷一具有至少二種形式的醣蛋白，其具二種25kDa與31kDa之明顯分子量，二者具有相同的端胺基酸序列◦參見Bariey et ai· Ceil 77：1117-1124 (1994)。血栓形成素顯然具有二個可區分的區域，其為潛在的Arg-Arg裂割址所分開。該胺端區域在人類與小鼠上是被高度保留的，且與促紅細胞生成素、’干擾素a與干擾素b具有同質性。而羧端域則顯示出物種廣泛的分歧。人類TP0-R (亦為已知的c—之f)NA序列與編碼胜肽序列皆已被掲不。参見V 1 g0n et a 1 , ?roc , Natl » Acad > SUSA 89:5640-5644 (1992)。TPO-R傺為紅細胞生成素生長因子受體族的一員，該族的待徵傜在其細胞外區域上的共同結構設計’其包含在}^端部份有4個保留C殘基以及一接近於穿膜區域之WSXWS動要素。參見Bazan 匕[脸』-NaU^Acad^lc i s USA 87 : 6634-6638 (1990)。該 - 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格f 2i〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7__ 五、發明説明（4 ) 受體在紅細胞生成上扮演著功能性的角色之證據包含有下述觀察：其表現受限制至小鼠中之脾臓、骨髓或是胎兒的肝臟（參見 Souyri et ah Ceil 63:1137-1147 ( 1990))，以人體的巨紅核細胞、血小板與CD34 +的細胞（參見 Methia Blood 82 :1395-1401 (1993))。再者，將 CD34 +細胞暴露至為fflPl RNA反訊息之合成寡核苷酸中，可顯著地抑制巨紅核細胞之細胞群落的出現，而不會影響紅色的細胞群落或骨髓細胞群落的形成。一些工作者推測該受體係為呈同二聚體來作用，是相似於G-CSF與促紅細胞生成素的受體情況。 TP0~R之選殖細胞的取得傜有助於該重要受體的同效劑的找尋。重組型受體蛋白的取得，則可以在各種隨機與半隨機胜肽變化生成条統中，研究受體-配位子之相互反應。此等条統包含有在美國專利第5270170與5338665號所掲示之“在質體上的胜肽”条統；1991年6月20日在美國提申之專利申請案第07/718577號、1990年6月20日在美國提申之專利申請案第07/541108號以及Cwirla et al. Proc, Nat K Acad. Sci . USA 87 : 6378-6382 (1990)所掲示之“在噬菌體上的胜肽”条統；1994年9月2日在美國提申之專利申請案第08/300262號所掲示之“聚小體（polysome )，此申請案傺以1993年10月29日在美國提申之專利申請案第08/144775號與PCT W095/11992為基礎的部份連續案 ;在1993年Π月12日在美國提申之專利申請案第08/1468862 號、在1992年9月16日在美國提申之專利申請案第07/946234 - Ί - 1紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7_ 五、發明説明（5 ) 號、在1991年9月18日在美國提申之專利申請案第07/762533 號中所揭示之“編碼合成基因庫”；掲示於美國專利第 51+3方时號中-之」大量价籍调支化贵合粉合请卫一；1990 年12月13日在公開之PCT專利申請案第90/15070號；1990 年12月6日在美國提申之專利申請案第07/624120號。 S i cen ce 251:767-773 (2/1991) ; Dower 與Fodor A η η .

Rep, Med. Chem , 26：271 -180 (1991) ; 1991 年 12月 6日在美國提申之專利申請案第07/8057272號；前述每一個專利申請案或公開案此皆被列為參考資料。在患有血小板減少症之病人上病人位準的緩慢回復是一嚴重的問題，而有找尋出能夠加速血小板再生之血液生長因子同效劑之急迫需要。而本發明正是提供此一同效劑〇發明摘要本發明部分是有關於一新穎且無法預期到的發現，即所界定的低分子量胜肽及胜肽仿效物對TP0-R具有能的結合特性，且可活化該TP0-R。因此，該等胜肽及胜肤仿效物在治療由ΤΡ0調節之病況上（例如由於化學治療、放射性治療或輸骨髓所造成的血小板減少症）可使用供治療目的上，同時可使用供研究造血機制上診斷目的與巨紅核細胞及所涉及的袓先細胞在活體外的擴大（expans ίοη)。適合於治療和/或診斷目的之胜肽與胜肽仿效物具有約2mM或更低的1C 5 8，此是以陳述於實施例3的結合親合力分析法所測定的，其中愈低的ICs e就愈與對ΤΡ0_的具有 ______- 8 _____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公^ ) 83. 3.10,000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（6 ) 強結合親和力相互闋連。就藥學目的而言，該胜肽與胜肽仿效物具有不高於約l〇〇mM的IC5fl *較佳是不高於500nM的 I〇5D 〇在較佳的實施例中，胜肽與胜肽仿效物之分子量傜自約250至約800道爾呑。當胜肽與胜肽仿效物傺使用於診斷目的時，其較佳傺以可偵測的標記物來標記，因此不具有該標記物之胜肽與胜肽仿效物可作為在經標記之胜肽與胜肽仿效物製備中的中間産物。符合上述分子量與TP0-R結合親和力的要點的胜肽包含9或更多個胺基酸，其中該胺基酸可為天然生成或者合成（非天然生成）之胺基酸。胜肽仿效物包含具有一種或多種下述修飾之胜肽：

一胜肽，其中一或多個胜肽醯基[-C(0)-NR-]鏈結（鍵結）可為非胜肽基之鏈結所取代，例如，-CH 2 -甲胺酸酯鏈[-CH2-0(C)-NR_]結所取代；一膦酸化；-CH2-磺醯胺[-CH2-S(0)2-NR_]鏈結；一脲卜 NHC(0)-NR-]鏈結；-CH 2-二级胺鏈結；或烷基化之胜肽醯基鏈結卜COMs -，其中 R e傺為低級烷基]; 一胜肽，其中N-端被衍生成NRR1基團；-NRC(0)R基團 ;-NRC(0)0R基團；-HRS(0)2R基團；-NHC(0)NHR基團，其中R與R1傺為氫或低級烷基，但規定R與Ri不可皆為氫；琥珀醯亞胺基團；苯甲氧羰-HH-(CBZ-NH-)基團；苯甲氧羰 -NH-(CBZ-NH-)基圑，在其苯環上有選自於低級烷基、低級烷氧基、氯與溴之1至3個取代基；或 -9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ^ϋ. - - - - " ϋ— -- J -- - - II I > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 _B7____ 五、發明説明（8 ) 的胺基基團，以形成一環形胜肽，以及其在生理上可接受的鹽類。在相闘的實施例中，本發明傺有Μ —經標記的胜肽或胜肽仿效物，其包含一具有如上所述之可共價接合至一能被偵測之標記物上的胜肽或胜肽仿效物。在本發明之一些實施例中，使用的較佳胜肽包含有一具有一核心結構的胜肽，該核心結構包含有下述胺基酸序列：

XiXsXsXdXsXeX? )(3為(：，？，1,^，1?，3,\/或丨，；；乂4為20種遣傳上所編碼之1^-胺基酸之任一者；¥5為&^，0,^,0,1?，3,11^或¥;趴為(：， 1^，0几，}4,3，^¥或¥;以及，¥7為(：50,1，1(几^，1?或\/。在一較佳的實施例中，該核心胜肽包含有下述胺基酸序列：

XeGXiXsXaXdXsWXz 其中 Χί 為 L，M,P，Q或 V ; X2為 F，R，S,T或 V ; X3為 F，L,V 或 W; X4為 4，{(，[，1^}?，3^或了；乂5為六，£,(],}(^,0,1?，3或丁 ;%7為(：，1，1(几，1^或？；每個¥8殘基各自擇自於20種遣傳上所編碼之L-胺基酸、其光學異構物D-胺基酸，以及非天然胺基酸之任一者。較佳的是，每個Xs殘基各自擇自於20種遣傳上所編碼之L-胺基酸之及其光學異構物D-胺基酸之任一者。在較佳的實施例中，Xi為Ρ ; 乂2為了； Χ3為L ; Χ4為R ;為Ε或Q ;且：<7為I或L。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ϋϋ- —.^1· ^l_l- JIBiil I —4— ϋ··— ·ϋϋ n (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 _ Bijr 518341 A7 B7 五、發明説明（9 ) 更佳的是，該核心胜肽包含有下述胺基酸序列： Χ9Χ8αΧΐΧ2Χ3Χ4Χ5ΪΧ7 其中）(3為々，(：，£,0，1,1^!^?,1?,0,3,1[或\/;且)(8為/\,(：， D , Ε，K , L，Q，R，S , Τ或 V。更佳的是，X 3 為 Α或 I ;且 X 8 為 D，Ε 或K。特佳的胜呔包含有下述者：GGCADGPTLRE WrSFCGG；GNADGPTLRQWLEGRRPK N；GGCADGPTLRE¥ISFCGGK；TIKGP TLRQWLKSREHTS；SiEGPTLREWLT SRTPHS；LAIEGPTLRQWLHGNGRDT； CADGPTLREWISFC;以及 IEGPTLRQW L A A R A 〇在本發明之另一値較佳實施例中，本發明使用之較佳實施例包含一具有一核心結構的胜肽，該核心結構包含有下述胺基酸序列： CX2X3X4X5XgX7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

其中12為1(，1^丨，0,1?,8，11或¥;¥3為(：，？，1几，}^1?，3或\? ;X4為20種遣傳上所編碼之L-胺基酸之任一者，♦爿5為A,D, £，0,3，¥或¥;乂6為(：3,0,1^,5，¥,«或¥;以及，¥7為[：，0, I，K，L , M，N，R或 V。在一較佳實施例中，％4為 a, E , G, H，K，L， 1^，？，0，{?，5，1或¥。在另一實施例中，乂2為3或了；¥3為1或1? ;X4 為 R; X5為 D，E或 G; Xs為 F，L或 W;且 X7為I，κ,L,lϊ或V

。尤佳的胜呔包含有：G G C T LR E W L H G G F C G G 〇 - 12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ΐ〇χ297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（10 ) 在本發明之另一個較佳實施例中’本發明使用之較佳實施例包含一具有一結構的胜狀’該結構包含有下述胺基酸序二 _______________________________ X8CX2X3X4X5X6X7 其中父2為「，}(，[，料，£1,!?，3，1'或？；）(3為(：3,1，1^1^，1?，5, V，或W ; X 4為2 0種遣傳上所編碼之L -胺基酸之任一者；X5 為1,0，£，0，}(^，(3,1?,3^或¥;“為(：，？，0，1^14,3,\?，!，;或¥; 以及，父7為(：，0，1，}(几，1^«，1?或？；且，¥8為20種遣傳上所編碼之L-胺基酸之任一者。在一些實施例中，X8為G，S，T 或R。在此所掲示的化合物傺可使用於預防與治療由ΤΡ0所調節的疾病，特別是可用於治療血液學上的疾病，包含有但不限於，由化學治療、放射性治療或骨髓移植所造成的血小板減少症。因此，本發明亦提供一種治療方法，其中該患有易為ΤΡ0同效劑所治療疾病之病人接受或投藥以一治療上有效劑量或量之本發明化合物。本發明亦提供一種藥學組成物，其包含有一或多種上述的化合物與一生理上可接受的載劑。此等藥學組成物可呈各種形式，包含口服劑量形式以及吸入粉末與溶液以及可注射與可輸注之溶液。圖式簡要説明第1A-B圖係顯示在各種胜肽存在功能下分析所獲得的結；該分析掲示於實施例2。第1A圖偽對本發明之經選 - 13 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂

Lr. 518341 A7 B7 五、發明说明（11 擇的胜肽，TP0-R穿染Ba/F3細胞增殖分析的結果的圖式說明：

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ▲為 L A I E G P T L R Q W L 的結果； O為G N A D G P T L R Q W L的結果；以及 + 為 T I K G P T L R Q W L K S R E H 丁 S 的結果 ο 第IB圖傺圖示說明以相同的胜肽及該母株細胞株所獲的絡果。 . 第2A-C圖顯示使用經ΊΤΟ-R穿染之Ba/F3細胞增殖分析上胜肽的寡聚合化的結果。第2A圖偽顯示經複合之生物素化胜肽（具有抗生蛋白鏈菌素（SA)之AF 12285)對經穿染細胞與親代細胞之分析結果。第2B圖示未經生物素化之胜肽 (之AF 12285)對經穿染細胞與親代細胞之分析結果。第2C 圖顯示僅有抗生蛋白鏈菌素下對經穿染細胞與母株細胞之分析結果。第3A-G圖顯示一連串用以顯示TP0、本發明之胜肽、E P0與EP0-R結合胜肽之活性的對照實驗結果，其在細胞增殖分析中傺使用經TP0-R穿染之Ba/F3細胞及其對應的母株細胞或E P 0 -依賴細胞株。第3 圖圖示說明在使用經T P 0 - R 穿染之Ba/F3細胞及其對應的母株細胞的增殖分析下對TP0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂

Kr 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7__ 五、發明説明（l2 ) 之結果。第3B圖圖示說明在使用經TP01穿染之Ba/F3細胞及其對應的母株細胞的增殖分析下對EPO之結果。第3C圔傺圖示說明經複合之生物素化胜呔（具有抗生蛋白鏈菌素（ SA)之AF12285)與一呈複合形式之經生物素化之EPO-R結合胜肽（具有SA之AF 1 1505)，對經TPO-R穿染細胞與親代細胞之分析結果。對應之母株細胞株的結果顯示於第3D圔。第3E圔圖示說明在使用ΕΡ0-依賴細胞株之細胞增殖分析中 ΤΡ0的結果。第3F圖圔示說明在使用ΕΡ0-依賴細胞株之細胞增殖分析中ΕΡ0的結果。第3G圖#圖示説明經複合之生物素化胜肽（具有抗生蛋白鏈菌素（SA)之AF 12285)與一呈複合形式之經生物素化之EP0-R結合胜肽（具有SA之AF 115 05)，ΕΡ0…依賴細胞株之分析結果。第4A-C圖圖示說明在載體f>JSl42中在質體基因庫中之胜肽（P e p t i d e - ο η - p 1 a s m i d 1 i b r a r y)的建構。第 4 A 圖像顯示基因上的限制圖譜與位置。該基因庫質體包含有rrnB轉錄終止子，可供安匹西靈篩選用之bla基因，可供救援單股DNA之M13噬菌體内基因區（M13 IG)，一質體之複製起始子（ori)，二個lac〇s序列，以及可對一驅動lac融合基因表現用之araB啓動子作正調節與負調節的araC。第4B圖顯示在1 ac I基因之3 ’端之選殖區的序列，其包含在基因庫建構上被使用之Sfil與EagI址。第4C圖顯示黏接的基因庫寡核苷酸，0N-829與0N-830，之接合至PJS142之Sfil址上，以生成一基因庫。單一空白處顯示接合址。第5A-B圖例示說明選殖進人PELM3與PELM15 MBP載體 -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T « mi ilYi · 518341 A7 B7 五、發明説明（13 ) 。第5A圖顯示在ina 1 E融合基因之3 τ端之序列，其包含有 ΜΒΡ編碼序列、聚精胺酸連接子、因子xa蛋白酶裂割址以及可獲得的選殖址。該載體之其餘部分傜衍生自可購自於 New England Biolabs之pMALc2(pELM3)與pMALp2(pEM15) 。第5B圖傺顯示在將BspE II-Sea I基因片斷轉移至Age I-Sc 3 1消化的“[10/?^1^15中後該載體之序列。該被轉移的序列包含有編碼有一源自於pJS 142基因庫之GCG胜肽連接子的序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第6A圖圖巫說明在載體pCMG14中供建構頭片（headpiece )二聚體基因庫之基因限制圖譜與位置。該基因庫質體包含：rrnB轉錄終止子，可供安匹西靈篩選用之bla基因，可供救援單股DNA之M13噬菌體内基因區（M13 IG)，一質體之複製起始子（ori)，一値lac〇s序列，以及可對一驅動一頭片二聚體的融合基因之表現用的araB啓動子作正調節與負調節的araC。第6B圖顯示在頭片二聚體基因之；Τ端之選殖區的序列，其包含在基因庫建構上被使用之Sf i I與Eag I 址。第6C圔顯示黏接的基因庫ON-1679、0N-829與0N-830 ，之接合至i>JS 142之Sfil址上，以生成一基因庫。單一空白處顯示接合址。第7至9圔顯示評估本發明胜肽之與胜肽mimETICS之進一步的分析結果。在該分析中，小鼠傍ί以卡伯布來定（ car b〇P 1 at in)來使其血小板減少。第7圔顯示當Balb/C在第0天傺以卡伯布來定（125mg/kg，腹空注射）處理所得之典型結果。虛線代表源自三個實驗之未經處理的動物。實本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7_____ 五、發明説明（l4 ) 線代表源自三個實驗之經卡伯布來定（在第〇天’腹腔内注射（i p)，m g / k g)處理的動物。第9圖顯不經由胜I太A F12 513 (513)在第10天對卡伯布來定所誘發的血小板減少的改善情況。卡伯布來定（08?;50-1251^/1^，腹腔内注射）傺在第 0天投予。AF12513(lmg/kg,ip)在第1-9天投藥。下面所陳述的定義是説明與界定在本發明所使用的各種名詞的意義與範圍。 “同效劑”傺指一生物活性配位子，其可結合至其互補的生物活性受體上並活化受體，以造成受體上的生物反應或者增進先前所存在之受體生物活性。 “藥學上可接受的鹽類”傺指一般使用於藥學工業上之不具毒性的鹼金族、鹼土族與銨鹽，其包含鈉、鉀、鋰、鈣、_、銷、銨或是魚精蛋白鋅鹽類，其等的製備方法傺為此技所熟知的。該詞亦包含不具毒性的酸加成鹽類，其一般係經由將本發明之化合物與一適合的有機或無機酸反應所製得的。代表性的鹽類包含有氯化氫、溴化氫、硫酸氫鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、檸檬酸鹽、順式丁烯二酸鹽、反式丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘磺酸鹽及其等類似物。 “藥學上可接受的酸加成鹽類”像指一般該等鹽類，其在自由鹼基下可維持其特性與效力，且其並無生物上或其它方面不欲的待性，該鹽類可以輿無機酸來形成，例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸與其等類似物，亦可一 17 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I JV ~.--J----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tr 518341 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（l5 ) 與有機酸來形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙烯酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、順式丁烯二酸、反式丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲基磺酸、乙基磺酸、P -甲苯磺酸、水揚酸與其等類似物。一有關藥學上可接受的酸加成鹽類可為先驅藥之說明可參見 Bundgaard, Η,, supra* ° “藥學上可接受酯類”傜指一般該等酯類，其基於酯鍵結之水解可維持羧酸類或醇類之生物效力與特性，且其並無生物上或其它方面不欲的恃性有關藥學上可接受的酯類可為先驅藥之說明可參見Bundgaard, H. , ed,，Design 〇ί Ρ r—ο d r u r , Ε 1 s e ν ί r e Science Publishers, Amsterdam (1985)。這些酯類一般傺自其對應的羧酸與醇所形成的。一般而言，酯的形成傜可經傳統的合成技術來完成。（參見，例如，March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed ，John Wiley & Sons，New York (1985) p* 1157及其中所掲示之參考文獻，與M a r k e t a 1 · E n c y c 1 o p e d i a o f Chemical Technology, John Wiley & Sons, Hew York ( 1980))。酯類的醇成份一般包含有（i )C2-C12脂族醇，其可包含有或不包含有一或多個雙鍵，且可包含或不包含有支鏈磺，或（ii ) C 7 - C ί 2芳香族或雜芳香族醇類。本發明亦預期在此所掲示之二種皆為酯類的組成物以及其藥學上可接受之酸加成鹽類之使用。 “藥學上可接受醯胺類”傷指一般該等醯胺類，其基於醯胺鍵結之水解可維持羧酸類或胺類之生物效力與特性 — -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -4ϋ ϋϋ 111 _ 訂 ^ϋϋ . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210Χ297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（16 ) ，且其並無生物上或其它方面不欲的特性有關藥學上可接受的酯類可為先驅藥之説明可參見Bundgaard，H.，ed·， D e s i r η ο f ProdrtiR, E 1 s e v i r e Science Publishers, Amsterdam (1985)。這些酯類一般傺自其對應的羧酸與胺所形成的。一般而言，醯胺類的形成傜可經傳統的合成技術來完成。（參見，例如，March Advanced Organic Che_-m i s t r y· 3rd Ed*? John Wiley & Sons, New York (1985 > P . 1152。本發明亦預期在此所掲示之二種皆為醯胺類的組成物以及其藥學上可接受之酸加成鹽類之使用。 “藥學上或治療上可接受的載劑”傜指一載劑介質，其不會干擾活性成份之有效性及生物活性，且其對宿主或病人是不具有毒性。 “光學異構物”傷指一化學物質與另一者具有相同的分子量、化學組成及構成，但原子排列不同。也就是，在空間上，一些相同化學部分傺在不同的方向，因此當其純化時，具有旋轉極化光之平面的能力。但是有些光學異構物具有十分輕微的光學旋轉待性，以使其以目前的儀器尚偵測不出。本發明之化合物可能具有一或多個不對稱硕，且因此包含有多種光學異搆物。所有的光學異構物皆包含在本發明之範圍中。用於本發明組成物投藥上之“治療上或藥學上有效量 ”傜指組成物的量足夠誘發出一所欲的生物結果。該結果可為對病癥、病症、疾病成因之減經或對一生物条統之其它所欲的變化。在本發明中，該結果一般偽涉及對感染或 -19 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） ml· Βϋϋ Hi-—·' —4ϋ ϋϋ Bull I .1 ϋϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 A7 B7 五、發明説明（17 ) 組織受傷之免疫反應與/或發炎反應上的降低。胺基酸殘基傷簡寫如下所示：苯丙胺酸為Phe或F ;白胺酸為Leu或L ;異白胺酸為lie或I ;甲硫胺酸為Met或Μ ; 纈胺酸為Val或V ;絲胺酸為Ser或S ;脯胺酸為Pro或Ρ ;蘇胺酸Thr或T ;丙胺酸為Ala或A ;酪胺酸為Tyr或Y ;組胺酸為His或Η ;榖醯胺為Gin或Q ;天冬醯胺為Asn或N ;離胺酸為Lys或K ;天冬胺酸AsP或D ;榖胺酸為G1U或E ;半胱胺酸為Cys或C ;色胺酸為Trp或W ;精胺酸為Arg或R ;與甘胺酸為Gly或G。此外，Bu為丁氧基，Bzy為苯甲基，CHA為環己胺，Ac為乙醯基，Me為甲基，Pen為青黴胺，Aib為胺基異丁酸，Nva為正總胺酸，Abu胺基丁酸，Thi為噻嗎基丙胺酸，OBn為0-苯甲基，且hyp為羥基脯胺酸。除了由天然生成的胺基酸所構成的胜肽外，本發明亦提供胜肽仿效物或胜肽類似物。胜肽類似物為一般使用於藥學工業上之具有相似於該等模版胜肽恃徵的非-胜肽藥劑。該型之非胜肽化合物被稱為“胜肽仿效物”（Fauchere, ___Adv Dru^ Res. 15: 29 (1986);Veber 與 Freidinger 11 N_S ρ·392 (1985)與 Evans et al* J , Med . Chem . 3 0 : 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1229 (1987)，其等在此皆被列為參考資料。在結構上具有相似於治療上有用的胜肽之胜肽仿效物亦可被使用，以生成目相當或一增強的治療或預防功效。一般而言，胜肽仿效物結構上像相似於典型的多肽（即具有生物或藥學活性之多肽），例如，天然生成之受體結合多肽，但該胜肽仿效物具有一或多個胜肽鏈結傺任擇地為下列群中之基團 _ 20 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A 7 B7 五、發明説明（18 ) 所取代：-CH2-NH-、-CHa-S-…CH2-CH2-、~CH:CH-(順式與反式）、-〇〇-(^2-、~〇}'1(〇}])(^丨2~與-〇1]2-5〇-*此取代傺藉由此技術中的已知的方法且進一步地被掲示於下列參考資料中：Spatola，A*F· in Chemistry and Biochem ί stry of Amino Acids，Peptides and Protein, B, tf e in-st e i n , eds. Marcel Dekker, New York，p. 267 (1983) ;Spetola, A.F., Vera Date (March 1983), Vo 1 . 1 ,

Issue 3，Pep elide Backbone Modifications (general review)； Mor ley, Trends Pharm Sci* (1980) pp. 483 -588 (general review) ； Hudson, D· et a 1 , Int, J > Pppt, Prot. Rn 14： 177-185 (197 9) (>CH 2 N H - ^ CH 2 CH 2) ；Spatola et aK Life Sci. 38： 1243-1249 (1986)( -CH2-S)； Hann J. Chem. Perkin Trans, I 307-314 ( • 1982)(-CH-CH-，順式與反式）；Almquist et al· J· Med·

Chein.23：1392-1398 (1980) (-C0CH2-)； Jenn i ngs - tf h i t e 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ___________ 乙_ ^ιϋ· ϋϋ ϋι_— i^m ϋϋ —J*— ϋϋ 111 ϋϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) eta 1 . Tetrahedron Lett 23: 2533 (1982,) (-COCH2-) ;Szelke et al·歐洲專利申請案EP45665CA (1982): 97: 39405 (1982) (>CH (OH)CHs~) ； Holladay et al. Tetr^-hedron Lfitt24 ： 4401 -4404 (1 983) (-C (OH)CH2~);及

Hruby Life_ScK_ 31：189-i99 (1982) (-CH 2-S-);其每一者在此皆列為本案的參考資料。一尤佳之非胜肽鏈結為 -CH2NH-。此一胜肽仿效物可具有顯著地優於多肽實施例之特性，其包含，例如，更經濟地生成，較高的化學安定性，增強的藥學特性（半生期，吸收性，效力與功效等等 ~ 21 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 _B7_____ 五、發明説明（19 ) )，經改變的專一性（例如，一廣範圍之生物活性）’經降低的抗原性及其它特性。胜肽模效物之標記一般涉及直接或經由一間隔子（例如，一醯胺基團），將一或多値標記物接價接合至以定量結構活性資料以及/分子模型分析所預期出該胜肽仿效物不受干擾的位置上。該不受干擾的位置一般是不會直接與一若與胜肽仿效物接合會産生治療效用之巨分子（例如，免疫球蛋白一族的分子）相接觸。胜肽仿效物之衍生化並不會實質上干擾該胜肽仿效物之所欲生物活性或藥理活性。一般而言，受體-結合胜肽之胜、肽仿效物傺以高親和力結合至受體上，且具有可偵測出的生物活性（g卩對一或多個受體-調節之表型改變傺呈同效性或拮抗性的）。對守恆序列（c ο n s e n s e s e q u e n c e)上的一或多値胺基酸以相同D-型之胺基酸作条統性的取代（例如，以D-離胺酸取代L-離胺酸）可能可用以生成更安定的胜肽。包含有守恆序列或一實質上相同於守恆序列之變化物之結構受限的（contrain)胜肽可利用此技藝中已知的方法生成（Rizo 與 Gierasch Am Rev* Bioehem. 61 :387 (1992)，其在此列為參考資料）；例如，藉由加入可能夠形成分子内鍵橋之分子内半胱胺酸，以環化該胜肽。合成或非天然生成的胜肽傺指該等非在活體内天然生成，但無論如何，是可被加入至在此所掲示之胜肽結構内。較佳的合成胺基酸傺為天然生成之L-a-胺基酸的D-a-胺基酸以及具有通式H2NCHR5C00H之非天然生成之D-與L-a _ 22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（20 ) -胺基酸，其中R5為1)低級烷基，2)具有3至7個磺原子的環烷基基團，3)具有3至7個碳原子且具有1至2個的擇自於氧、硫與氮所構成群中之雜原子的雜環基，4)具有6至10 個碳原子的芳香族殘基，在其芳香核上任擇地具有1至3個擇自於羥基、低級烷氧基、胺基與羧基所構成群之取代基，5卜烷烯基-Y，其中烷烯基傺為具有1至7個碩的烷烯基，且Y為擇自於下列群中者：（a)羥基，（b)胺基，U)具有 3至7個碩原子的環烷基與環烯基，（d)具有6至10個磺原子 •的芳基，在其芳香核上任擇地具有1至3値擇自於羥基、低級烷氧基、胺基與羧基所構成群之取代基，（e)具有3至7 個碳原子且具有1至2個的擇自於氧、硫與氮所構成群中之雜原子的雜環基* (f)-C(0)R2，其中R2傺擇自於氫、羥基、低級烷基、低級烷氧基與-NR3R4，其中R3與R4各自選自於氫與低級烷基所搆成的群中，（g)-S(0)nRs，其中η為1 至2的整數，且Ρ為低級烷基，但規定R5不被界定為一天然生成胺基酸之側鏈。其它較佳的合成胺基酸包含該等胺基酸，其中胺基像為多於一個碳原子而與羧基分隔開*例如b-丙胺酸、g-胺基丁酸及其等類似物。尤佳的合成胺基酸包含有，例如，天然生成之L -胺基酸的.胺基酸、L-1-萘基-丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、L-2-胺基異丁酸、甲硫胺酸之亞颯與颯衍生物，即 HCC〇-(H2NCH)CH2CH2-S(0)nRe)* 其中 RB 傺為如上所界定者以及甲硫胺酸之低級烷氧基衍生物（gp 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 訂· 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（21 ) HCC0-(H2NCH)CH2CH2-0Rs，偽如上所界定者），-」 “可偵測的標記物”傺指該等物質，當其被共價接合至本發明之胜肽或胜肽仿效物時，其可容許該等被投以該胜肽或胜肽仿效物之病人偵測出該胜肽或胜肽仿效物。適的可偵測檫記物傺為此技術所熟知的，其包含，例如放射性同位素，螢光標記物（例如，螢光素）及其等類似物。所用之可偵測的特定標記物並不是十分重要的，其傷有關於所欲應用的量以及在標記物應用量下該標記物之毒性而加以選定的。相對於上述因子而加以選出標記物為熟習此技藝人士所知曉的。可偵測出的標記共價接合至胜肽或胜肽仿效物傜可利用此技術中已知的傳統方法來完成。例如，應用11 2 5放射性同位素被應用可偵測的標記物時，將p 25共價接合至胜肽或胜肽仿效物就可藉由將胺基酸酪胺酸加入該胜肽或胜肽仿效物，而後碘滴定該胜肽，來達成之。若酪胺並不存在於該胜肽或胜肽仿效物中時，將酪胺酸加入該胜肽或胜肽仿效物之N或C端是可已知之化學技術所達成的。同樣地 ’ 3 2 P可被加入胜肽或胜肽仿效物中以作一磷酸部份，其傺使用傳統化學方法經由在胜肽或胜肽仿效物上的羥基來達成^ I概要本發明像提供一化合物，其可結合至TPO-R並活化之，且另一方面其可作PTO同效劑。該等化合物包含有出之一 24 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公釐） 1^1. ...... n.i f j ml ί n I - I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 A7 B7 五、發明説明（22 ) “前導（1 ead) ”胜肽化合物以及的“衍生”化合物，其傺被建構出而具有與前導胜肽化合物相同或相似之分子結構或形狀，但無論是在易於水解或蛋白分解方面以及有闋其經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 ____B7_ 五、發明説明（23 ) ，該母案又為在1991年9月18日在美國提申之專利申請案第07/762533號案之部份連續案）所掲示之“編碼合成基因庫”；掲示於美國專利第5143854號中之“非常大量的經固定化聚合物合成〃；1990年12月13日在公開之PCT專利公開案第90/15070號；1990年12月6日在美國提申之專利申請案第〇7/62412〇號〇{?〇(^「01：31· Shnw 251 ： 767-773 (2/1991) ; Dower 與Fodor Ann ., Mftd. rh^m. 26:271 -180 (1991) ; 1991年12月6日在美國提申之專利申請案第07/8057272號。使用上述步驟，隨機胜肽可被設計出，以使其在長度上具有所定的胺基酸殘基數目（例如，12値）。為了生成編碼該隨機胜肽之寡核苷酸的收集庫，編碼要素（NM) X ( 其中，N為核苷酸A、C、G或T (等莫耳當量；依其所應用的方法，其它的核苷酸亦可應用），【為G或了（等莫耳當量），且X為一等於該胜肽中胺基酸數目之整體（例如，1 2))傺使用於載明由該NHK要素可獲得的32種可能編碼之任一種：每12個胺基酸一種，每5個胺基酸二種，每3個胺基酸3種以及三種停止碼中之一種。因此，該NNK要素編碼所有的胺基酸，僅編碼一種停止碼並可降低編碼的偏好傾向（bias)性。在所應用的条統中，該隨機胜肽偽存在於噬_體粒子的表面，而成為一包含有噬菌體fd衍生物之PHI或PVIII 外套蛋白之融合蛋白的一部分，或者作為一與結合至質體上之Lac I胜呔融合蛋白融合的融合蛋白（在質體上的胜肽本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） __________乙_ n· 11 1^1 —Βιϋ ιϋ_— 111 ^ϋ·· In -i_i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 A 7 B7 五、發明説明（24 ) )。包含有編碼該胜肽之噬菌體或質體傺利用經固定化 TPO-R進行親和力富增方法來加以鑑定與分離出。該親和力富增方法有時又稱“淘選（Panning)” ·涉及將進行多回的以經固定化受體培育噬鐘體、質體與聚小體’收集該等可結合至該受體之噬菌體、質體或聚小體（伴隨著有 DNA或mRNA，以及生成更多所收集之噬鐘體或質體（並伴隨著有L a c I -胜肽融合蛋白）。在淘選過程中’一般是使用TPO-R的細胞外區域（ECD)。在幾回的親和富增後，該噬館體或質體以及其伴隨的胜肽傜以ELISA加以撿測，以決定該胜肽是否可專一地結合至TPO-R。此分析，除了在去除未經合的噬_體後外，其傷以相似於親和富增方法之步驟來進行，該孔洞一般像以免子抗-噬顏體抗體來處理，而後再以鹼性磷酸酶（AP) ~ 綴合的山羊抗-免抗體子來處理。在每一個孔洞中之鹼性磷酸酶的量偽以標準方法加以決定的。供在質體条統中胜肽之使用的相似EL ISA步驟傺詳細地掲示於下。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 藉由比與對照組孔洞（無受體）相比較，可以決定出是否融合蛋白可專一地結合至受體上。所發現之可結合至 TPO-R上之噬顏體匯集池使用經放射性標記的單價受體而以一單菌落取出之探針形成（cο 1 οny 1 i f t p r 〇b ί ng f 〇r ma t) 方式加以篩選。該探針偽可使用蛋白激酶A磷酸化融合至該可溶性受體C_端之Kemptide序列而生成。該TPO受體之經“基因工程”之形式而後可在宿主細胞（一般為CHO細本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

五、發明説明（25 胞）内表現。在受體之PI-PLC回收後’該受體傺供對TPO 或TPO-R專一之噬菌體選殖株測試用。該受體再以P3 2來標記成具有高的專一活性’以使用作為單價探針’進而可利用菌落取出方式鑑定出具高親和的配位子。發現可專一地結合至受體的胜肽，傺以自由的胜狀形式（例如，不具有噬菌體）合成之，且在阻礙分析中進行測試。該阻礙分析偽以相似於EL ISA的方式進行，但是除了 TPO或一參考用胜肽傺在融合蛋白前加入孔洞内（對照孔洞有二型：〇)無受體；以及⑵無TPO或參考用胜肽））。該等對受體之結合性可為ΤΡ0或該參考胜肽所阻礙的融合蛋白，包含在隨機胜肽部分中之胜肽，此等胜呔為本發明之化合物。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -ϋϋ> ιϋ-1 ϋ_1ϋ «1— ϋ^— —JB.1 ϋϋ ϋϋ ϋϋ ·ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 TPO-R以及其胞外區域像在重組型宿主細胞中生成。一可使用的TP0-R形式傺為使用標準方法，在經桿狀病毒轉形之宿主細胞中以呈可溶性蛋白質方式來表現該蛋白質，而被建構出的；另一種可使用的形式像以一供蛋白質分泌與醣礎脂膜固定接合用之單一胜肽而被建構出。該固定接合形式傺稱作“ PIG-尾端化（PIG-tai 1 ing) ” 。參見Cars與Weendel1 Science 243： 1196-1198 (1989)與 Lin et al . Science 249： 677-679 (1990) 〇使用P IG~尾端化，可利用磷酯酶C而自該表現受體的細胞表面（例如，以一細胞排列器來選出高程度表現該受體之經轉形細胞）裂割出該受體。該經裂割的受體依然包含有源自於一供膜接合之信號蛋白之|安_酸羧端序列， -28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______ B7 五、發明説明（26 ) 稱為“ HPAP-尾部”，且可不用進一步純化即可被固定化。該重組型蛋白可藉由以一抗HPAP尾部抗體（Abl79或MAb ------------塗覆該微盤的孔洞來白( BSA)阻礙非專一性的結合，而後將經裂割重組型受體結合至抗體上，將其固定化。使用此一步驟，一個人必須進行各種受體濃度的固定化反應，以決定出對一給定製劑的最佳量，不同之重組型蛋白製劑通常含有不同量之所欲蛋白。此外，其須確定在親和富增方法中，該經固定化的抗體是完全地被（TPO或其它阻礙化合物）阻礙的。否則，在親和富增步驟中，未阻礙會結合至不欲的噬菌體。其可使該等可結至固定化抗體上的胜肽，以阻礙該等在受體固定化後依然未結合之位置，進而避免此一問題，或者其可僅直接固定化該受體至該微量滴定盤的孔洞，而不用固定抗體用的輔助。參見1992年9月18日提申之美國專利申請案號07/947339，其在此列為本案的參考資料。當使用可容許多價配子體-受體反應之隨機胜肽産生条統時，其必須認知到經固定化之受體的濃度，在決定可結合至該經固定化受體之配位子的親和力上，為十分重要的因子。在較高的受體密度下（例如，以0 · 25 -0 · 5mg受體來處理每一個抗-受體抗體_塗覆的孔洞），多價結合是比在低受體密度下（例如，以0.5-lng受體來處理每一個抗-受體抗體-塗覆的孔洞）更容易發生。若發生多價結合，其就可能分離出相當低親和力的配位子，除非其使用高密度之經固定化的受體以鑑定出前導化合物並使用低受體密 ___- 29 -____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —I♦1-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 518341 A7 B7____ 五、發明説明（27 ) 度去分離出較親和力之衍生化合物。為對較高親和力胜肽加以區分’ 一般是常使用單價受體探針、該探針可使用蛋白激酶A來磷酸化一融合至該可溶性受體之C-端的kempt ide序列而予以生成。該了po受體之經“基因工程”之形式而後可在宿主細胞（一般為⑶0細胞）内表現。在受體之PI-PLC回收後，該受體偽供對TPO 或TPO_R專一之噬鐘體選殖株測試用。該受體再以P3 2來標記成具有高的專一活性，以使用作為單價探針’進而可利用鐘落取出方式鑑定出具高親和的配位子c 有助於該等可結合至TPO-R之胜肽鑑定之較佳篩選方法首先涉及鑑定出可結合至受體之胞外區域的前導胜肽，而後製造出與該前導胜肽相似的其它胜肽。詳言之，使用噬麵體条統中之Pill與pV III-為基的胜肽，可管選一隨機基因庫，以發現存在有可結合至了PO-R之胜肽的噬菌體。該噬菌體DMAs被定出序列，以決定出在該噬菌體表面所表現之胜肽序列。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ϋ· II ϋϋ JH ϋ-ϋ aij— in-— ϋϋ —^ϋ I V (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 能夠專一地結合至TPO-R的殖株像自一隨機線性之1〇聚體（10-ffler)pVIII基因庫與隨機環形之10聚體及12聚體（ 12III基因庫中鑑定出。此等胜肽的序列傺作為建構其它胜肽基因庫的基礎，該等其它胜肽基因庫被設計& 以包含有高頻率的最初被鑑定出之胜肽的衍生物。此等基因可被合成，以有肋於該等只有在幾個殘基上不同於結# 胜肽之胜肽的生成。此方法涉及一具有結合胜肽編碼序列的寡核苷酸之合成，除了在合成中其不用該四鐘核替三碟 -30 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） " — 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2S ) 酸之每一種的純製劑，其可使用該四種核苷三磷酸的混合物（即，為此目地，較佳的混合物為“ 55¾”的正確核苷酸以及151之其它三種核苷酸每一種，而“ 70¾”的正確核苷酸以及10%之其它三種核苷酸每一種則為另一種較佳的混合物），以生成結合胜肽編碼序列的衍生物。各種技術傺皆可使用以藉由製造“基因突變為主題 (m u t a g e n e s i s ο n a t h e m e) ”基因庫，來衍生出該等前導胜肽。此包含了以突變頻率在70 :10 :10 :10下之守恆序列為主的pV 11噬小體基因突變基因，並可在端部以隨機殘基延伸以生成編碼序列XXXX (C，S , P或R) TLREWLXXXXXX (C或S) 的殖株。一個額外經延伸/經突變的基因，XXXX ( (C , S , P 或R) TLREWLXXXXXX (C或S)傺可使用聚小體顯示条統來加以建構。上述三種基因庫可利用胜肽溶析方式加以篩選並以放射性標記單價受體來探測。 “在質體内的胜肽”技術亦可使用於胜肽篩選及突變的研究中，其已詳細掲示於美國專利第5338665號（其基於所有的目的而在此列為本案的參考資料）。依據此方法，隨機胜肽傺可經由一帶有融合基因之質體載體的表現而在Ucl的C-端相融合。Lacl_胜肽融合體對其編碼DNA之相闋連性偽經由在質體上lacO序列而發生的，其可形成一穩定的胜呔-Lac卜質體複合物，該複合物可藉由在一經固定化的受體上，以親和純化方式（淘選）來加以篩選。因此，所分離的質體偽可藉由電穿孔方式再被引入大腸捍菌中以擴增其群落，以可供多回篩選用或者供各別菌落之撿驗用本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -H·—' -ί ·1! - Βϋ— g—Ίβ —ϋ m am ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ 5Τδ34Ι Α7 _Β7___ 五、發明説明（29 ) 0 此外，隨機胜肽篩選與突變亦可使用一修飾C-端的La e - I条統來進行，該Lac-I条統中顯示的價數傺可被降低（ “頭片二聚體”顯示条統）。篩選該基因庫且所得到的DN A插入子以一匯集池而被選殖入一容許其以一 C-端融合蛋白形式表現的麥芽糖結合蛋白（MBP)載體中。自隨機會挑選出之個別MBP融合殖株粗細胞溶胞物而後在EL ISA形式下進行如上所討論的ΤΡΟ-i?結合分析。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ---,!------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 胜肽的突變研究亦可使用聚小體顯示条統來進行，其傜掲示在1994年9月2日提申之共審查美國專利申請案號08 /300262 *此共審查案為1993年10月29日提申之美國專利申請案號08/144775與PCT95/11992之部分連續案，該二案在此皆列為本案參考資料。突變庫傺基於X X X X (C , S , P 或R)t IreflXXXXX X(C或S)所建構的，其中X為一隨機NNK密碼子，小寫字母為胺基酸密碼子，其在密碼子之位置1與2包含有70 :10 :10 :10的突變性且在位置3為K ( G或了）。該基因庫對經固定於磁性上之ΤΡ0受體來淘選五回。在五回後，該經PCR擴增的匯集池被選殖入PAFF6，且對 ELISA呈正反應的殖株定出序列。將該序列次選殖入MBP載體内，且其結合親和力傺以MBP EL ISA來加以決定。為固定化供聚小體篩選之TP0-R，Ab-179首先依製造者的指示化學綴合至經甲苯磺醯基-活化之磁性珠粒上（得自於Dynal公司）。該珠粒與抗原在0.5M的硼酸緩衝液（ pH 9.5)中在室溫下一起培育過夜。再將該珠粒清洗並結本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（30 ) 合有含有”HPAP”尾部的TT0-R。該抗體塗覆珠粒與受體在 4 υ下培育1小時，而後在其加入聚小體基因庫前再次清洗。各種基因庫的篩選偽如上所述*其産生的ΤΡ0受體結合胜肽傷顯示於第1與2表，以及該等未列於此中者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 3 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表__1 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） I.— ------^^衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 518341 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

I.I -------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 518341 A7 B7 五、發明説明（33 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

C T L R E W L R 3 F c C T L R A W L M S E T c C T L R A W L M E S C c C T F Q V W K L A R N c C L L R E w L D X R T c C V L R E w L L X X S c rL L S E F L A G Q Q c ! s L R Q Y L D F G L G S c C τ L Q E L K Q S S L Y E c ! C D L S E L K T H G Y A Y c C Κ L S D W L M N G V A A c C S L Q E F L S H G G Y V c C S L Κ E F L H S G L M Q c C Τ F R Q L L E Y G V S S c C τ Μ R E F L V A S G V A c C τ L A E F L A S G V E Q c C τ L A E F L A S G V E Q c C τ L Κ E W L V S H E V W c C τ L R E F L S L G M N A c C τ L R E F L D P T T A V c C S L L E F L A L G V A L c G G G R G C T L K Q w K Q G D C G R S C Ν R S Q L L A A C C Τ L Q Q W L S G C C Τ L R E F K A G C C Τ R A Q F L K G C C Τ L R E F N R G C C ：Τ L S D F K .R .G ；C C ：Τ 丨F R .Q W ，Κ E ；A C C Ί • L .S E :F 1 R G G C C T L c > E ；F ，L E G C CTLQQWKDGC -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---6----------(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341

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518341 A7 B7 五、發明説明（ 35

Ν Y R G c T L s Q W V S E Q I _ V ' G C G R S G c T L R E Y L G G M c Y L S A S W Y c T V P E L M E M Q L P E C G S T- c T L R E X L H ML G4 D C — A C E G c T L R Q W L E Y V 'R V G C A Q R G c T L Q Y F V S Y G 丨X D M C f V C G c T L R E F L A I F > H T S C % E G G c T L R E W V A S S ；L A N C S N S R c T L R E W I I Q G C D F S S N S R c T L R E W I I Q G C D F S c L G C T L S Q W R K R T R C D T H Y R G C s R A Q L L G G E C R K K G R G C T L K Q W K Q G D C G R S V R G G c A L R D w V A G E C F D W T L W R G c T L N G F K S R H C G S P E C T L R s w K H R G C A P G R G C T R A Q W L A G C C T G H R A G C T L R E F R K G C ： L A L K R G C T L A E M 工 R G C : NR S N G R G C T L K Q W K Q G D C G R S R W R G c S L A K L K K G A A C G R G R G G C T L R E W R R V R VI N G R G C T 1 L ,K .Q W K _ Q G r D C G r R .S R .Y G C ：T 'R H :Q 丨V3 r L ,V ，G T C V R H - ....... I 1- - ..... Hr 81- m — - - - I(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -ΙΓ · -38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7__ 五、發明説明（36 ) 一些其它代表性的胜肽之IC5i3係顯示於下表中。可使用各種方法來評估c5 之值。例如利用MBP-TPO或lac I-胜呔追縱子之平衡結合EL IS A分析，來決定出該胜肽是否可抑制TPO結合至TPO受體之胞外區域的結合性。一般而言， ICso是使用自由的胜肽來加以決定出的。1C5D可使用自由一任擇地被Ο端醒胺化或者被製備成酯類或其它羧醯胺之胜肽來加以決定出的。為再産生顯示在噬菌體上的真正序列，合成胜肽之N-端與C -端的胺基酸之前常存在有一或二個甘胺酸殘基。這些甘胺酸被認為並非結合或活性上所必要的。相同地，為模仿顯示於聚小上的胜肽之真正序列，合成胜肽之C-端的胺基酸之前常存在為MAS序列。再次，這序列被認為並非結合或活性上所必要的。 IC5D^以符號、” + ”與” + + ”來加以表示。例如， ICSD值高於20〇μΜ之胜肽像以來表示之。低於或等於200hM之胜肽偽以” + ”來表示之，而IC5D值為500nM或比其更低之胜肽傺以” + + ”來表示之。具有接近於切分點或為切分點之等1C 5 0值的胜肽，其表示的特殊符號為混合的標記，例即。該等未測定出其值的胜肽傺以”N.D. ”表示之。具有下述結構的胜肽具有500nm或更低的1C 5〇值 :G G C T L R E W L H G G F C G G。（注意 Ν»端與 Ο 端的胺基酸之前為二個甘胺酸，以再産生顯示於噬菌體之真正序列，這些甘胺酸被認為並非結合或活性上所必要的 )° -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I;------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

Lr. 518341 A7 B7 五、發明説明（37 ) 表3

—1 I- I - i. r 1 - j* I ......... ί ϋ (清先閲漬背面之注意事項再填寫本頁) 上表，特別是表3，乃例示說明一較佳的核心蛋白包含有下列的胺基酸序列： ΧΐΧ2Χ3Χ4Χ5Χ6Χ7 其中[為(：，1，1^?,0，\/;父2為？，1(,1，料，0，!?，3，下或^ 父3為(：，？，1几，》，1?，3，〗/或》;父4為20種遣傳上所編碼之卜胺基酸之任一者；）(5為^\,0,£,0,1(,14,0,1?，8，1^^或¥;?6為(：， ?，0几，}4,3，¥，《或¥;以及，父7為(：，0，1，1(，1，1^^,1?或乂。在一較佳的實施例中，該核心胜肽包含有下述胺基酸序列： Χ8〇ΧιΧ2Χ3Χ4Χ5WX7 其中 Χί 為 L，M,P，Q或 V ; Χ2 為 F,R,S, 了或 V ; Χ3為 F，L,V 或《;。為11(，1^14，1?,3，\?或1';¥5為/\1,0，1(,14,0，1^3或丁 ;父7為[：，1，1(几，1^或\/;每個乂8殘基各自擇自於20種遣傳上所編碼之L -胺基酸、其光學異搆物D -胺基酸，以及非天然胺基酸中之任一者。較佳的是，每個X 8殘基各自擇自於20 _ 40 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 LT. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 -^ϋ__ 五、發明説明（38 ) 種遣傳上所編碼之L-胺基酸之及其光學異構物D-胺基酸之任一者。在較佳的實施例中，Xi為P ; X2為了； X3為L ; X4. 為R ; X5gE或Q ;且Χ7為I或L。，更佳的是，該核心胜肽包含有下述胺基酸序列： XaXeGXiX^XsXdXsWXz 其中 χ3 為 A，C , E，G , I，L，Μ，P , R，Q , S，T.或 V ;且 x8 為 A，C， 01，}(，1^0,1?,33或¥。更佳的是，）(9為/\或1;且){8為0，£ 或K。待佳的胜肽包含有下述者：G G C A D G P T L R E WISFCGG；GNADGPTLRQWLEGRRPK N； GGCADGPTLREWISFCGGK；TIKGP TLRQWLKSREHTS；SIEGPTLRE¥LT SRTPHS；LAIEGPTLRQWLHGNGRDT； CADGPTLREWISFC;以及 IEGPTLRQW L A A R A - 在另一實施例中，本發明所使用的較佳胜肽為包含有一核心結構之胜肽，該核心結構包含有下述胺基酸序列： CXsXaXdXsWXz 其中。為11^^0,1?，3,1^或¥;父3為(：，17，1,1，1^!?，3或\?

;L為20種遣傳上所編碼之L-胺基酸之任一者；χ5為A,D, E，G,S,V_Y;Xs.C，F,G，L，M，S,V,W_YUlS，Xr.C，G, ^[[^^«^-▽。在較佳實施例中，％4為&^，0,11，}(,1，}^ ?，〇，1?，3,〗/或丨彳。在另一較佳的實施例中，12為3或了；乂3為 L或 R ; )U為 R ; Xs 為 D,E或 Q ; X^.F，L或 W ;以及，X?為 I，K - 41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -----------會丨— (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 -UI. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 Α7 Β7 五、發明説明（39 )

,L，R或V。待別佳的胜舦包含有：G G C T L R E ¥ L H G G F C G G 在另一實施例中，本發明所使用的較佳胜肽為包含有一核心結構之胜肽，該核心結構包含有下述胺基酸序列： X8CX2X3X4X5WX7 其中X2為F，K,L，N，Q，R,S,T或V;)(3為C，F,I，UM，R，S, V或為20種遣傳上所編碼之L-胺基酸之任一者；乂5為 A，D,E,G，K，M,Q，R，S，TJ_Y;X6gC，F,G,L,M,S,V3mY; 以及，¥7為(：，0，1，【几，(^1^1?或\/;7^為20種遣傳上所編碼之L-胺基酸之任一者。在一些實施例中，χ8較佳為G，S，Y, 或R 〇具有大於約lOOmM之1C 5 ί)值的胜肽或胜肽仿效物傺缺少足夠使用於本發明之診斷或治療方面用途之結合性。較佳的是，針對診斷目的，該胜肽與胜呔仿效物具有約為2 mM或更低的1C 5 〇值，而針對藥物目的，則該胜肽與胜肽仿效物具有約為ΙΟΟμΜ或更低的ICs d值。該結合胜肽序列亦提供一種決定出本發明之TP0R結合化合物之最小尺寸。使用“編碼合成基因庫（ELS) ”条統或“十分大D之經固定化聚合物合成”条統，其不僅可決定出具有該活性之最小的胜肽尺寸，同時亦可使所有形成該胜肽群的胜肽在一、二或多殘基上不同於較佳的要素（ mot i f)(或該要素的最小尺寸）。而後此一胜肽的收集庫偽可被篩選有能力結合至ΤΡΟ-受體者。這些經固定化之聚合物合成条統或其它胜肽合成条統的方法亦可使用於合成 ~ 42 - $紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） —I· _11 ·«11 —Ln I etmmmmLr —^ϋ ϋϋ 111 ϋ_ι (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT • Γ— n Li · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7____ 五、發明説明（40 ) 本發明胜肽化合物之截頭（t r u n e a t i ο η)類似物，刪失類似物，取代類似物及其等組合。本發明之胜肽與胜肽仿效物亦可在血栓形成素-依賴之細胞增殖分析中評估，其詳細地掲露於實施例2。細胞的增殖傺可用此技藝中已知的技術來測定，例如，ΜΤΤ分析，其傺與3H-胸腺嘧啶加入量相關連而作為細胞增殖的 .指標（參見 Μ 〇 s s in a η n J. immunol» Methods 65:55 (1983) )。在如第ΙΑ所示者，該胜肽偽以劑量依賴的方式作TPO-R 穿染Ba/F3細胞之經剌激的增殖作用。如第1B圖所示，該胜肽對母株細胞株並不具有效用。第7至9圖像顯示本發明之胜肽與胜肽仿效物進一步分析以評估其活性的結果。在該分析中，小鼠傺以卡伯布來定使其血小板減少。第7偽說明當Ba 1 b/C小鼠傜以卡伯布來定（12 5 m g / k g，腹腔注射）在第〇天處理時所得的典型結果。該虛線表示由三個實驗所得之未處理動物。該實線代表在三個實驗中經卡伯布來定-處理群：該粗實線代表過去之資料。第8圔説明卡伯布來定滴定量對以該卡伯布來定 (mg/kg在第0天腹腔注射之指示量所處理小鼠中之血小板數目上效用。第9圖說明在第1〇天’胜肽AF 12513( 513)對卡伯布來定-誘發之血小板減少症之症狀上的減輕。該卡伯布來定（016?;20-1251118/1^腹腔注射（19))在第0 天投藥之。AF12513 ( ling/kg，ip)在第1-9天投藥之。其結果顯示本發明之胜肽可減輕在小鼠模式中之血小板減少症。 _ 43 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ---------------ΦΙ — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7_____ 五、發明説明（41 ) 此外，本發明之胜肽亦可二聚化或寡聚化，藉此增加該化合物之親和力以及/或活性。為了調查胜呔二聚化/ 寡聚化在細胞增殖分析中其所具有之TPO仿效效功效，合成一胜呔 G G C A D G P T L R E W I S F C G G 之Ο端生物素化類似物（G G C A D G P T L R E W I S F C G G K(生物素））。該胜肽在無血清之HEPES-緩衝之R ΡΜΓ中以4 :1莫耳比例與一抗生蛋白鏈菌素預培育之。該合物進行，如上所述，對經TPO-R穿染之Ba/F3細胞增殖分析的刺激作用的測試，以比較經生物素化胜肽與未經生物素化的胜肽。第2A圖顯示複合之經生物素化的胜肽UF12885 , )對經穿染與母株細胞株二者的分析結果。第2B圖顯示自由之經生物素化的胜肽（AF12885)對經穿染與母株細胞株二者的分析結果。第2C圖顯示僅有抗生蛋白鏈菌素下對經穿染與母株細胞株二者的分析結果。這些圔式説明預形成複合物具有約為自由胜肽10倍的效力。

本發明胜肽之結合專一性與活性亦可利用研究胜肽對促紅細胞生成素受體（EP0-R)之交叉反應來加以撿測。該 EP0-R如同ΊΤΟ-R為紅細胞生成素生長因子之受體一族的一員。本發明之胜肽，ΤΡ0與ΕΡ0以及已知的ΕΡ0-結合胜肽傺使用ΕΡ0-依賴型細胞株而在細胞增殖分析中加以撿測。此分析傺利用FDCP-1，一生長因子依賴型鼠類多潛能之原始紅細胞生成的袓先細胞株（參見，例如，Deexter et al. J. Exp > —Med·」152: 103β -1047 (1981)，作為母株細胞株。當提供WEHI-3-條件培養基（一含有IL-3之培養基，ATCC - 44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —I- n —τϋ ϋϋ eilt ϋ^ϋ amp ϋϋ ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 518341 A7 B7 五、發明説明（42 ) 編號T1B68)時，該細胞株會增殖，但不會分化。該母株細胞株傜以人類或鼠類的EPO_R所穿染，以生成一FDCP-1-E P 0 - R細胞株。該絰穿染的細胞株在人類或鼠類的E P 0存在下可增殖，但不會分化。在必要生成因子存在下，使細胞生長至一半的靜止密度，而後該細胞在PBS中清洗並在無有生長因子的全培養基中饑餓16-24小時。在決定出細胞之存活性後，製作出一儲液（無有生長因子的全培養基），以使其每50徼升具有10 5細胞。在90孔的組織培養盤上作出待測試的化合物連續稀釋（一般而言，為相對於噬菌體-結合或其它結或經固定化胜肽之自由溶液相的胜肽），以使每一孔洞的最終體積為50徽升。細胞（50徼升）傺加入每一孔中，且培育細胞24-48小時，在該點負對照組應死亡或者靜止的。細胞的增殖而後以已知的技術來測量之。第3A-G圖顯示一連串用以顯示ΤΡ0、本發明之胜呔、 ΕΡ0與EP0-R結合胜肽之活性的對照實驗結果，其在細胞增殖分析中傜使用經TP0-R穿染之Ba/F3細胞及其對應的母株細胞或ΕΡ0-依賴細胞株與其對應母株細胞株。第3A圖圖示說明在使用經ΤΡ0-R穿染之Ba/F3細胞及其對應的母株細胞的增殖分析下，對TT0之結果。第3B圖圖示說明在使用經 TP0-R穿染之Ba/F3細胞及其對應的母株細胞在增殖分析下對ΕΡ0之結果。第3C圔傺圖示說明經複合之生物素化胜肽（具有抗生蛋白鏈菌素（SA)之AF12285)與一呈複合形式之經生物素化之EP0-R結合胜肽（具有SA之AF 1 1505)，對經ΤΡ0 一 45 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 A7 B7 五、發明説明（43 ) - R穿染B a - F 3細胞株之分析結果。對應之母株細胞株的結果顯示於第3D圖。第3E圖圖示説明在使用EPO-依賴細胞株之細胞增殖分析中對ΤΡΟ的結果。第3F圔圖示說明在使用 ΕΡ0-依賴細胞株之細胞增殖分析中對ΕΡ0的結果。第3G圖像圖示説明經複合之生物素化胜肽（具有抗生蛋白鏈菌素（ SA)之i\F 12285)與一呈複合形式之經生物素化之EP0-R結合胜肽（具有SA之AF 1 1505)，在EP0-依賴細胞株之分析結果。這些結果顯示本發明之胜肽可以高專一性之程度來結合並活化TP0-R。 IV胖肽及胖肽ffi效物的製備 A ·因相合成經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之胜肽傜可利用此技術中已知的傳統方法來加以製備，例如使用標準的固相技術來製備。該標準方法包含有單獨的固相合成，部分固相合成方法，片斷縮合，傳統溶液合成方式，即使是重組DM技術亦包含其中。參見S Merr i f ί e 1 d J » Am , Chem > Soc > 85*2149 (1963)，在此列為參考資料。在固相上，利用一 a -胺基被保護之樹脂，而一般自胜肽的C-端開始合成。可製備出適合的起始物質，例如，藉由將所需的σ -胺基酸連接至氯甲基化樹脂上，一羥基甲基樹脂上或二苯甲基胺樹脂上。該氯甲基化樹脂傺為 Bio Rad Laboratories，Richman，Ca，以商標名-BIO BEADSSX-1販售，且該羥基甲基樹脂的製備方式像掲示於Bodonszky et al, Chem. Ind. (London) 38:1597 ~ 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐）五、發明説明（44 A7 B7 (1966)。該二苯甲基樹脂亦掲示於Pietta與Marshal 1 Chfim. Commn. 650 (1970)，且可自貝克曼儀器司，Pa l· A 11 ο，C A以氯化氯的形式自商業上購得。經濟部中央標準局員工消費合作社印製因此，本發明之化合物可依據Gis in Helv* Chii ftota. 56:1467 (1973)所掲示的方法*經由碳酸氫鉋催化劑並藉由將σ -胺基酸經保護的胺基偶合至氯甲基化樹脂，來加以製備之。在最初的偶合後，藉由試劑的選用而在有機溶液且在室溫下，去除該α-胺基保護基團，該試劑包含有三氟乙酸（TFA)或氯化氫（HC1)溶液。該σ -胺基保護基圍傺為該在胜肽一步步合成中此技已知使用者。其包含有醯基型保護基團（例如甲醯基、三氟乙醯基、乙醯基）芳香族胺基甲酸酯保護基團（例如，苯甲氧基羰基（Cbz)及經取代之Cbz)，脂族胺基甲酸酯保護基團（卜丁氧基羰基（Boe)，異丙氧基羰基，璟己氧基羰基）*以及烷基型保護基團（例如，苯甲基，三苯甲基 )。Boc與Fjnoc為較佳的保護基團。在偶合期間，該側鏈保護基團傷保持完整，且不會在胺端保護基團去保護期間或偶合期間被分開。該側鏈的保護基團必需在最終胜肽合成完成時且在不會改變標的胜肽之反應條件下可被去除。對Tyr的側鏈保護基團包含有四氫吡喃基，t-丁基，三苯甲基，苯甲基，（：1)2,21广-(^2以及2,5-二氯苯甲基。保護Asp的側鏈保護基團包含有苯申甲基，2,6-二氯苯甲基，甲基，乙基與環己基。Thr與Ser的側鏈保護基團包含有乙醯基，苯甲醯基，三苯甲基，四氫吡喃基，苯甲基 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ϋϋ> —ϋ 1··— 1-1 —4>ϋ n n.^— m Hi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T i· 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（45 ) 2,6-二氯苯甲基與Cbz。Thr與Ser的側鍵保護基團為苯甲基。Arg的側鏈保護基團包含有硝基，甲苯磺基（Tos)， Cbz，金剛烷氧基羰基，菜醯磺醯基（Mts)或Boc。Lys的側鏈保護基團包含Cbz，2-氯苯甲氧基基（2-C卜Cbz)，2-溴苯甲氯基基（2 - B r，C b z)，了〇 s，B 〇 c。在去除α _胺基保護基團後，所餘的經保護胺基酸以所欲的次序一步步地偶合。一般使用過量的每一種經保護的胺基酸，並使用一適合的羧基化劑，例如在溶液（例如在二氯甲烷（CH2C12)，二甲基甲醯胺（DMF)之混合物）中二環己基磺化二亞胺（DCC)。在所欲的胺基酸序列完成後，藉由一諸如三氟乙酸或氟化氫（HF)之試劑的處理，而自樹脂支撑物上去偶合出該所欲的胜肽，該試劑不僅可自樹脂上裂割出該胜肽，同時亦可保護側鏈保護基團。當使用氯甲基化樹脂，氟化氫的處理可造成自由的胜肽之形成。當使用二苯甲基胺樹脂時，氟化氫的處理可直接造成自由的胜肽之形成。或者，當使用氯甲基化樹脂，該側鏈經保護之胜肽可經由氨氣處理該胜肽而被去偶合，以生成所欲的側鏈經保護的醯胺或，或經由烷基胺虎理，以生成測鏈經的烷基醯胺或二烷基醯胺。而後，側鏈的保護傺以一般方式利用氟化氫的處理來去除，以産生自由的醯胺，烷醯胺或二烷醯胺。該固相合成步驟傺為此技術所已知的，且進一步掲示於Stewart Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co·， San Francisco，（1969))。 ~ 48 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ϋ^—' mi ϋϋ 1§t i MmJmM— ϋ·^ ϋ·— ϋϋ I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（46 ) 使用1990年3月7日在美國提申之專利申請案第07/ 492462號、1990年12月6日在美國提申之專利申請案第07/ 624120號、在1990年12月6曰在美國提申之專利申請案第 07/805727號中所掲示之“編碼合成基因庫”或“十分大量的經固定化聚合物合成”条統，其不僅可製出一具有該活性之胜肽的最小尺寸，同時亦可製出所有胜肽，其可形成一在一、二或多個殘基上為不同於較佳要素（或該要素之最小尺寸）之胜肽群。而後此一胜肽的收集庫傺可被篩選有能力結合至ΤΡ0-受體者。這些經固定化之聚合物合成条統或其它胜肽合成条統的方法亦可使用於合成本發明胜肽化合物之截頭（truncat i on)類似物與刪失類似物以及截頭類似物與刪失類似物之組合。 B ·合成胺某_ 該等步驟亦可使用於去合成胜肽，其中該等非為20種天然生成之基因編碼胺基酸的胺基酸取代於在本發明之胜肽化合物上的一個或二個位置。例如萘丙胺酸可取代色胺酸’以肋於合成。其它可使用取代入本發明胜肽之合成性 I女基酸包含L ~經基丙路基，L - 3，4 二翔基苯基丙胺釀基胺基酸（例如L-d-羥基離胺醯基與D-d-甲基丙胺醯基 )，L-a-甲基丙胺醯基，卜胺基酸與異喹啉基Z。D_胺基酸與非天然生成之合成胺基酸偽可被併入本發明之胜肽中〇可以利用其它的側鏈，例如以諸如烷基，低級烷基， ____ - 49 - I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公襲） |_1- -ϋϋ —Lrl ϋϋ —Lr «ϋϋ ·ϋϋ I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 _B7__ 五、發明説明（47 ) 璟4一、5-、6-至7-員烷基，醯胺，醯胺低級烷基，醯胺二 (低級烷基），低級烷氧基，羥基，羧基與其低級酯衍生物之基團以及以4…5-、6-至7-員雜環來取代基因編碼之胺基酸（或D-胺基酸）的天然發生側鏈。更特別的是，其是可應用該等脯脯胺酸殘基上的環大小被改變成4、5或7 員之脯胺酸類似物。環基圑可為鉋和或不飽和者，且若為不飽和，則可為芳香族或非芳香族者。環基團亦可飽和或不飽和，且若不飽和，則可為芳香族或非芳香族者。雜環基團較佳為包含一或多個氮、氧以及/或硫雜原子。此等基團的例子包含有呋咱基、呋喃基、眯唑烷基、眯唑基、眯唑啉基、異_唑基、異噁唑基、嗎啉基（例如，嗎啉並）、噁唑基、峨嗪基（例如，1 -哌 _基）、峨啶基（例如，1 -峨啶基，哌啶並）、吡喃基、吡_基、吡唑烷基吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基（例如，1 -吡咯烷基）、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、_唑基、噻嗯基、硫代嗎啉基（例如，硫代嗎啉並）與三唑基。此等雜環可經取代或未經取代。其中當一基團傜被取代時，該取代基可為烷基、烷氧基、鹵素、氧基或經取代或未經取代的苯基。一般可藉由磷酸化而很容易地修飾本發明之胜肽。用以製造出本發明化合物之胜肽衍生物的方法掲示於Hruby et a 1 · 4 2中。因此，本發明的胜肽化合物亦可為作製備具有相似生物活性之胜肽仿效物的基礎。本發明之胜肽，包含胜肽仿效物，可以如美國專利第 ~ 50 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ι_ϋ«· am— ϋϋ Jin HI —4— ϋϋ ϋϋ m.i I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 A7 __B7 五、發明説明（48 ) 4640835 、 4496686 、 4301144 、 4670417 > 4791182 、 4179337 號所掲示方式，而共價修飾至一或多個各種非蛋白質性的 _____________聚合物，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧烷烯上，該等文_ 獻之整體内容在此列為參考文獻。 C ·端部的修飾熟習此技藝人士認知各種對次建構胜肽仿效物的各種技術是可得知的，該等胜肽仿效物是具有相同或相似物對應胜肽化合物所欲的生物活性，但在溶解性、穩定性與易水解性與蛋白分解性是比該等胜肽更有利的。參見，例如，Morgan與Gainor Ann > Rep . M^d, Chem > 24 ： 243-252 ( 1989)。下面傺掲示在端胺基、在O端羧基與/或將在胜肽中之一或二値81胺鏈緒改變成非醯胺鏈結之胜肽仿效物的製備方法。可了解到二或多個該等修飾傺可偶合在一胜肽仿效物結構中（例如，在Ο端羧基上的修飾與在胜呔上二個胺基酸之間的-CH 2 -甲胺酸酯鏈結的包含）。 1 N-端的絛飾經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 該胜肽如上所示，一般是以自由胺基酸所合成，但可易於製得呈醯胺或酯形式。故可以修飾本發明之胜肽的胺基以及或羧基，以生成本發明之其它化合物。胺端的修飾包含甲基化（卽_NHCH3或-NH(CH3)2)、乙醯基化，加入一苯甲氧基羰基基團或以一含有一為RC00-的羧酸化官能基之阻礙基團來阻礙該胺端，其中R傺選自於萘基、吖啶基、甾基與相似基團。羧基修包含以碳醯胺基團取代自由 ______~ 51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（49 ) 酸或在羧端形成一環内醯胺，以引入結構的限制。胺端的修飾傺如上所示，包含有烷基化，乙醯基化，加入苯甲氧基羰基，形成一琥珀醯亞胺基基團等。待別而言，該N -端胺基基團而後如下所示反應： (a) 形成一具有通式RC(0)NH-的醯胺基，其藉由與一酸氯化物（例如，RC (0) C 1)或酸酐起反應而形成，其中R 傜如上所界定者。一般而言，該反應可藉由將等莫耳或過量的酸鹵化物接觸至在惰性稀釋劑（例如，二氯甲烷）中的胜肽，該稀釋劑較佳傺包含有過量（例如，約10當量）之三級胺，例如二異丙基乙胺，以清除在反應期間所産生的酸。反應條件搡為習知的（例如，室溫下30分鐘）。在如上述與一酸鹵化物反應後進行可提供低級烷基N-取代的端部胺烷化作用，而可提供一具有通式RC(0)NR-的N-烷醯胺基基團； (b) 形成一琥珀醯亞胺，其傺藉由其與一琥珀酸酐反應。如上所述，應用等莫耳或過量的琥珀酸酐，且該胺基基團可藉由此技已知的方法變轉變成琥珀醯亞胺，該方法每含使用過量（例如10倍當量）的三級胺，例如在懷性稀釋劑（例如，二氯甲烷）的二異丙基乙胺。參見，例如， Wollenberg美國專利第4612132號，其整體内容列為本案的參考資料。可了解的是，該琥珀酸基團傺可以利用傳統的方式來製備出，例如，C2-Ce烷基或-SR取代基所取代者，進而提供在胜肽N -端為經取代之琥珀醯亞胺該烷基取代基可藉由令一低烯經類（C 2 - C e)與馬來酸酐，以W 〇 1 1 e n b e r g -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I ·^ -------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 ----- - --------- - ——-丨-丨· 五、發明説明（50 ) et alqsupra所掲示的方式來製備，且-SR取代基可以RSH 與馬來酸酐反應而製得，其中R傺如上所界定者； (e)形成一苯甲氧基羰基-NH-或經取代之苯甲氧基羰基-NH-，其偽藉由在適合的惰性稀釋劑（例如，二氯甲烷 )，令其與約等量或過量的[：旧-(：1(即苯甲氧基羰基氯或一經取代之CBZ-C1起反應所形成，該稀釋劑較佳傺包含有三級胺（例如*二異丙基乙胺），以清除在反應期間所産生的酸； - (d) 形成一磺醯胺基團，其藉由在適合的惰性稀釋劑 (例如，二氯甲烷），令其與約等量或過量（例如5當量 )R-S(0)2C1起反應，以將端部的胺基轉變成磺醯胺基，其中R傺如上所界定者。該稀釋劑較佳傺包含有過量（例如，約10當量）之三級胺，例如二異丙基乙胺，以清除在反應期間所産生的酸。反應條件偽為習知的（例如，室溫下30分鐘）； (e) 形成一甲胺酸酯基，其藉由在適合的惰性稀釋劑 (例如，二氯甲烷），令其與約等量或過量（例如5當量 )R™0C1(0)C1 或 R-0C(0)0CeH4-p»N02 起反應，以將端部的胺基轉變成甲胺酸酯基，其中R傺如上所界定者。該稀釋劑較佳傺包含有過量（例如，約10當量）之三級胺，例如二異丙基乙胺，以清除在反應期間所産生的酸。反應條件傺為習知的（例如*室溫下30分鐘）；以及 (f) 形成一脲基基團，其藉由在適合的惰性稀釋劑（例如，二氯甲烷），令其與約等量或過量（例如5當量） _ 53 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ι^ϋ' —ϋ ϋ·ϋ iLH —>ϋ mLr —^ϋ ·ϋ^— m I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（51) R_N = C = 0起反應，以將端部的胺基轉變成脲基（即NHC (0) NH-)，其中R傺如上所界定者。該稀釋劑較佳係包含有過量（例如，約10當量）之三級胺，例如二異丙基乙胺，以清除在反應期間所産生的酸。反應條件偽為習知的（例如*室溫下30分鐘）。 2 · C-端的修飾在製備一其Ο端羧基基團偽為醯胺基-C (0) NR3R4所取代的胜肽仿效物上，一二苯甲基胺樹脂偽使用作為胜肽合成的支撑體。在合成完成時，以氟化氫處理以自該支撑體上釋出胜肽，而可直接造成呈自由形式的胜肽醯胺（即〇端為-C (0) N Η 2)。或者，在胜肽合成期間使用氯甲基化樹脂，並偶合有與氨反應以自該支撑體上裂割出側鏈經保護的胜肽，進而産生自由胜肽醯胺，以及並偶合有與烷胺或二烷胺反應以産生側鏈經保護的烷胺或二烷胺（即C端為 -C(0)NMi，其中R與R1傺如上所界定者）。而後使用一般的方式藉由氟化氫的處理而去除側鏈的保護，進而産生自由醯胺，烷胺或二烷胺。在另一個實施例中，C-端的羧基或C-端的酯基傺可藉由將羧基或酯基之-0H或酯（-0R)為N-端胺基基團作内部取代，而被誘發形成環，進而形成一環形胜肽。例如，在合成與裂割以生成胜呔酸後，該自由酸在溶液中’例如二氯甲烷（CHsCM、二甲.醯胺（DMF)混合物，藉由一適合的的羧基活化劑，例如二環己基狼化二亞胺（DCC)，來活化。而後該環形胜肽可藉由該經活化酯為端胺作進内部取一 54 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --- la—· .Hi nil 111 IJ1 βϋ ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（52 ) 代來形成。相對於聚合化之内環化偽可藉由使用十分稀的溶液來增強。該等方法傺為技術所已知的。 __其亦可璟化本^明之胜肽或者在胜肽的端部加入脱胺或脫辍殘基，以使其不具有胺端或羧端，進而降低其對蛋白酶的敏感性，或者可制限該胜肽的構型。本發明化合物之C-端官迮基包含有醯胺，IS胺低級烷基，醯胺二（低級烷基），低級烷氧基，羥基及其等低级酯衍生物與其等藥學上可接受的鹽類。 D »晋架的修飾用於製造本發明化合物之胜肽衍生物的其它方法像掲 TKHruby et aK B i o e h e m , J . 268(2):249-262 (1990)中，其列為參考資料。因此，本發明的胜肽亦可作為對具有相似生物活性之非胜肽型化合物的結構模型。熟習此技藝人士了解各種技術係可用於建構一化合物，該化合物與所欲的前導胜肽具有相同或類似所欲生物活性但在溶解性，穩定性與水解與蛋白分解的敏感性上具有比前導胜肽更佳活性〇參見 Μ 〇 r g a η 與 G a i η 〇 r Ann . Rep. Med . Ch . 24 * 243-252 (1989)，其在此列為參考資料。該等技術包含以瞵酸酯、薩胺、甲胺酸酯、磺醯胺、二級醯胺與甲基胺酸所構成的骨架來取胜肽代骨架。一胜肽仿效物傺可以在傳統的胜肽合成期間製得，在該仿效物中，一多個胜肽醯基鏈結（-C (0) NH-)像為諸如 -CH2-甲胺酸酯-鏈結，鱗酸鏈結，-CH 磺醯胺鏈結，脲 -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ;---^------會丨| (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Lf . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7_ 五、發明説明（53 ) 鏈結，二級胺（-CH2NH-)鏈結與烷化胜肽醯基鏈結（ -C (0) NRS -，其中R6為低級烷基），此製備是藉由在合成期間，查適^的點上，以一 ϋ合地保護的胺f酸取代該胺基酸試劑來進行。適合的試劑包含有，例如胺基酸類似物，其中胺基酸之羧基己一適合成形一或多上述鏈結之部分所取代。例如，一個人若欲以-CH2 _甲胺酸酯鐽結（_CH2〇C (0) NR-)取代在胜肽上之-C (0) NR_，則該經適合地保護之胺基酸的羧基 (-C00H)首先被還原成-CH2〇H基團，而後再利用傳統方法將其轉變成-0C(0)C1官能基或對-硝基碳酸-0C(0)0-CeH4-p-N〇2官能基。該官能基之任一者與位置支撑體上之部分製造街胜肽中的自由胺基.或烷化胺基反應，可造成 -CH2〇C(0)NR-鏈結。該等~CH2-甲胺酸酯鏈結的形成詳細内容可參見 Choet al Science, 261 :1303-1305 (1993)。相同地，以麟酸酯鏈結取代在胜肽中之醯胺鏈結亦可以在美國專利申請案第07/943805、08/081577與08/1 19700 號掲露的方式來達成，該等申請案整體列為本案參考資料〇在胜肽中醯胺鏈結偽以-CH 2 -磺醯胺基取代傺可藉由下述方式來達成，將經適合保護的胺基酸之羧基（-C00H) 還原成-CH2〇H，而後再利用傳統方法將羥基基團變成一適合的離去基團，例如甲苯磺醯基。甲苯磺醯化衍生物與，例如，硫代乙酸的反應，且其後並經水解與氧化性之氯化反應，可提供出-CH(0)2C1官能基（其取代其它適合過 -56 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7___ 五、發明説明（54 ) 保護之胺基酸的羧基）。在胜肽合成中使用該等經適合保護之胺基酸類似物可提供一包含有用以取代_胺鏈結之 -CH2-S αηρ鏈結者，並藉此而提供一胜肽仿效物° 將胺基酸上之羧基轉變成-CH 2 -S (0) 2 C 1基團的更詳細的說明，可參見，例如，Weinstein, boris Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Protein vo 1 7， pp· 267-357， Marcel Deker， Inc·, New York (1983 )，其在此被列為參考資料。以脲鏈結取代在胜肽中之醯胺鏈結亦可以在美國專利申請案第08/147805號掲露的方式來達成，該等申請案整體列為本案參考資料。二級胺鏈結（其中-CH2NH鏈結取代在胜肽中之醯胺）傷可藉由應用一經適合保護的二肽類似物來製備出，在該二肽中，該醯胺基的羰基鍵結已藉由傳統方式而被還原成 CH2基團。例如，在二甘胺酸的情況下，在去保護 H2NCH2CH2NHCH2C00H後，還原醯胺成胺的反應會發生，而後在下値偶合步驟中，就使用N-保護形式者。在二肽中藉由還原胺鏈結上的羰基以製備出類似物偽為此技所已知的〇經適合保護的胺基酸類似物偽可相同於對應的胺基酸，可應用於傳統胜肽合成中。例如，一般約3當量的經保護胺基酸類似物傜可應用於該反應中。一惰性有機稀釋劑，例如二氯甲烷或DMF，傷可應用，且當一酸傺以反應副産物生成時，該反應溶劑可包含有過量之三級胺，以清除 -57 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —；------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 _B7 __ 五、發明説明（55 ) 在反應期間所産生的酸。一特別佳的三級胺傺應用約高於 20倍量的二異丙基乙胺。該反應傺與一為具有非胜肽醯基鏈結之胺基酸類似物的胜肽仿效物相合併。此一取代可依所需而重覆進行，而使得在胜肽中之零個至所有的_胺鍵結皆可為非醯胺鏈結所取代。其亦可環化本發明之胜肽或在該胜肽端部加入有一脱胺或脫羧的殘基，而使得在端部的胺或羧基基團不存在，進而可降低其對蛋白酶的敏感性或限制該胜肽的構型。本發明化合物之Ο端官能基包含有醯胺，醯胺低級烷基，醯胺二（低級烷基），低級烷氧基，羥基與羧基及其低級酯衍生物，以及其等藥學上可接受的鹽類等。璟化化合物之例子傜提供在表4、、5、6、8與9。 £_ ·二硫鍵結的形式本發明的化合物可以璟化形式存在，其像位在半胱胺酸上硫基基團之間的分子内二硫鍵結所形成環化形式。或者’位在半胱胺酸上硫基基團之間的分子間二硫鍵結亦可生成，以生成一二聚體（或更局的寡聚體）化合物。一或多個半胱胺酸亦可為高半胱胺酸所取代。此等分;^内^ & 子間的二硫衍生物傺可以下圖表示之：

其中m與η各自為1或2。 -58 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

MmMMBmme ImMMf ιϋ> ULT ϋ^— .1·— ϋϋ ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

518341 A7 _B7 __ 五、發明説明（56 ) 本發明之其它實施例乃用以提供該等二硫衍生物之類似物，在該類似物中，一個硫原子偽一 C Η 2基團所取代或者以等排物取代硫。該等類似物亦可利用如下所示之已知的方法，經由分子内或分子間的取代來製得：

其中Ρ為1或2。熟習此技藝人士係可了解到此等取代，係可使用如上所示α -胺基g-丁酸衍生物與高半胱胺酸之類似物而發生之。或者，胜肽之胺端以一 α -取代的乙酸來罩蓋之，其中該d -取代基傺為一離去基團，諸如cc -鹵乙酸*例如、 σ -氯乙酸、σ -溴乙酸與α -碘乙酸。本發明之化合物亦可因離去基圍為半胱胺酸或高半胱胺酸上的硫取代而被環化或二聚化。參見，B a k e r e t a 1 · J , M e d . C h e m . 5:2040 -2048 (1992)，其在此被列為參考資料。二聚化化合物之實施例傺提供於表7、9與10中。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） — I!-I----豐------1T------H (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（57 ) V ·窨用件本發明的化合物是在活體外使用作為了解TPO在生物角色上獨一工具，其包含了對被認為是響的許多因子來加以評估，且可被TPO的生成與受體結合步驟所影響。本發明的化合物可用於發展出其它可結合並活化TPO-R的化合物，因為本發明化合物可對結構與活性之間的相關性提供重要的訊息，而有助於此項的發展。該化合物亦可在分析中使用作競爭性結合子，以篩選出新TPO受體同效劑。在此分析之實施例中，本發明的化合物像可使用而不用修飾，或者以各種方式來加以修飾；例如，藉由標記諸如可共價或非共價結合一可直接或間接提供一可偵測訊號的部分。直接標記的可能物包含有標記基團，諸如放射標記，例如1 2 51，酵素（美國專利第36450 90號，例如過氧化酶與鹼性磷酸酶以及能夠監測在螢光強度、波長或螢光極性上變化的螢光標記。間接標記的可能物包含一組分之生物素化而後再結合至一被偶合至一上述檫記物上的抗生物素蛋白。在該化合物被接合至一固體支撑體上的情況，該化合物亦可包含有間隔子或連結子。再者，基於其有結合至ΤΡ0受體上的能力，本發明的化合物亦可供作為一用於偵測在活細胞、經固定之細胞、生物體液、組織均質液、呈純化、天然的生物材料等中之 ΤΡ0受體的試劑。例如，藉由標記該胜肽，一個人可鑑定出具有TP0-R在其表面的細胞。此外，基於其有能力結合至ΤΡ0受體，本發明的胜肽亦可使用於原位染色、FASC ( 一 60 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（58 ) 螢光活化之細胞排序）、西方點墨、EL IS A等等中。此外，基於其有能力結合至TPO受體，本發明的胜肽亦可使用於受體的純化或者純化在細胞表面上實驗TTO-受體的細胞 (或者内側可被通透之細胞）。本發明的化合物亦可供各種醫學研究或診斷使用上的商業試劑。該等用途包含有，但不限於0)在沐種官能性分析中，使用作為一供定量可能ΤΡ0同效劑活性之校正曲線 ;②使用於維持ΤΡ0-依賴細胞株之增殖與生長；（3)經由共結晶，而使用於ΤΡ0-受體的結構分析；⑷使用於調查ΤΤ0 -訊號傳導受體活/化之機制；以及⑸其它研究或診斷應用，其中該ΤΡ0-受體較佳是被活化的或者該活化傜被可對一已知量之ΤΡ0同效劑或其類似物而被容易地校正。本發明的化合物亦可使用於活體外巨紅核細胞及其袓先的擴大，二者傜可與其它的細胞激素結合或者只有其自身的擴大。參見，例如，DiGiusto et al. PCT公開案\第 95/05743，其在此列為參考資料◦化學治療與放射性治療因其會殺死巨紅核細胞中之快速分裂且較為成熟的族群而造成血小板減少症。但是，此等治療處理亦可降低不成熟且較不會有絲分裂活性之巨紅核細胞先驅細胞的數目與存活性。因此，以ΤΡ0或本發明化合物來減輕血小板減少症的情況，可利用對化學治療舆放射性治療後病人輸注一在活體外經富增其巨紅核細胞與不成熟前驅細胞之族群而被加速。本發明的化合物亦可投藥給溫血動物，包含人類，以 ~ 61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^18341 A7 _ ----B7 五、發明説明（59 ) 活化在活體内的TPO-R。因此，本發明亦涵蓋TPO相關疾病的治療方法，其包含投予一足夠量的本發明化合物，以仿效ΤΡ0在活體内對TP0-R的效用。例如，本發明的胜肽與化合物傺可投藥，以治療各種血液疾病，包含但不限於血小板疾病與血小板減少症，特別是當其與骨髓移植，放射性治療與化學治療相闋時。在本發明一些實施例中，TP0D的拮抗劑較佳像首先投藥給遭遇到化學或放射性治療的病人，而後再投藥以本發明之ΤΡ0同效劑。本發明化合物之活性可在許多的模式中任一種作活體外或活體内的評估*該等模式掲示於MeDοna 1 d Am > J , of Pediatric H e m a t o ] 〇 r v / 0 n c ο ] o g. y 14:8 - 21 (1992)，其在此列為參考文獻。依據一實施例，本發明的組成物亦可使用於治療與骨髓移植，放射性治療與化學治療相關的血小板減少症。該等化合物一般像可在化學治療、放射性治療或骨髓移植前或者該等暴露後預防性地投藥。因此，本發明亦提供一種藥學組成物，其包含作為活性成份之至少一種本發明的胜肽或胜肽仿效物，其傜與一藥學上的載體或稀釋劑相結合。本發明的化合物亦可口服、肺部、非胃腸道（肌肉内注射、腹腔注射、靜脈注射（ m或皮下注射）、吸入（經由微細的粉末）、透皮、鼻内、子宫内、直腸、舌下等路徑投藥，且可配成適合每一種投藥路徑的劑量形式。參見，例如，Bernstein et a 1. -62 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（60 ) PCT專利公開案第¥094/17784號；與Pitt et ah歐洲專利申請案613683，其每一者皆在此列為本案參考資料。口服投藥的固體劑量形式包含有膠囊、錠劑、藥九、粉末與顆粒。在該等固體劑量形式中，該活性化合物偽與少至少一種懷性藥學上可接受的載體（例如，蔗糖，乳糖或澱粉）相摻合。該等劑量^彡式亦可包含，如一般正常方式，其它不同於惰性稀釋劑的物質，例如諸如硬脂酸_的潤滑劑。在膠囊、錠劑與藥九的情.況下，該劑量形式包含緩衝劑。錠劑與藥丸可額外以腸塗層來製備。口服投藥的液態劑量形式包含有藥學上可接受的乳化液，溶液，懸浮液，糖漿，與一般使用於此技中之酏劑含有惰性稀釋劑。除了此等惰性稀釋劑，組成物亦可包含有佐劑，例如潮溼劑，乳化劑與懸浮劑，以及甜化，芳香劑與香料劑。本發明之非胃腸道投藥的製劑包含無0水溶液或非水溶液，懸浮液或乳化液。非水性溶劑或載劑的實施例傺為丙二醇，聚乙二醇，蔬菜油，例如橄欖油與玉米油，凝膠與可注射的有機酯，例如油酸乙酯。此等劑量形式亦包含佐劑，例如防腐劑，保溼劑，乳化劑與分散劑。^其可藉由，例如，經由一細菌保留濾紙過濾之，藉由將殺菌劑加入 · 組成物，藉由放射性中照射組成物或加熱組成物來殺顏。該~製劑在使用之前，可使用無菌水或一些其它可無菌可注射介質馬上使用來加以製備。直腸或子投藥的組成物較佳傺為栓劑，其除了包含有 -63 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） —ϋ- ϋϋ HI >»—^1 ϋ— —Li —ϋ —ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341

i、發明説明（61 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製活性物質5還包含有賦形劑，例如可可奶油或栓劑用蠟。用於鼻内或舌下投藥的組成物亦可以此技中已的標準賦形〜式來加以製備。包含有該等化合物的組成物傺可為預防性處理或治療性理處而被投藥。在治療性應用上，該組成物偽以一足夠治療或者至少部分停希該疾病與其併發併症狀的量，投藥給一患有一如上所述疾病之病人。一可達成上述功效之量被定義為“治療有效劑量”。在此使用上有效的量，像依疾病的嚴重程度與該病人體重與其一般狀態而定。本發明的化合物亦可微膠囊化，例如，藉由Tiee與 Bibi之方法（in Treatise on Control led Drug Deliver y ed. A* Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y. (1992) pp. 315-339)。在預防性的應用中，包含有本發明化合物之組成物偽可投藥給一易於患一特定疾病或者有患一持定疾病的危機的病人。該量被定義為“預防有效劑量”。在此使用上，該精確的劑量傺依病人健康與體重的狀態而定。需要達成有效治療的TP0同效劑之量傺依許多因子而不同，該因子包含有投藥的方式，目標址，病人的生理狀態以及其它藥物投與。因此，治療劑量偽可被滴定，以定出最佳的安全性與效率。在活體外使用的劑量傺在可提供可對該等在原位投藥使用上的量提供一有用的引導。疾病之有效劑量的動物測試亦可提供人體劑量上保護性的指標 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 11·—*-------#裝------1T------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（62) 。各種考量像掲示於，例如s G i 1 m a n e t a 1 * (e d s )， Goodman and Gilman^* The Pharmacol oiReal Basis of Therapeutics^ 8th et * Pergamon Press (1990);及 Remington Ts P h a r m a e e u t i c a 1 Sciences· 7th ed, , Mack Publishing Co*，Easton Penn· (1985)，其每一者在此皆列為參考文獻。本發明的胜肽與胜肽彷效物當其投藥劑量偽在約0.001 mg約10mg/kg體重每天時，其在治療ΤΡ0調節之病況上是有效量的。所應用的特定劑量，傺依所治療的特定病況，投藥的路徑舆醫師基於諸如病況嚴重程度，年齡與病人的一般情況及其等類似因子所作的判斷而加以調節。雖然本發明的較佳實施例傜特別地說明如上，但一般可了解到在不偏離本發明之精神舆其範疇下，本發明之修飾與變化偽可能的窨施例1 固相胜肽合成本發明的各種胜肽傺可使用馬利費爾德（Merr i f i e 1 d) 固相合成技術（參見Steward 與 Young，SolidPhase Pep-tide Synthesis, 2d，edition,Pierce Chemical , Rock -ford，IL (1984)與 Merrifieid JNAnu Chem, Soc· 85: 2149 (1963))在 Milligen/Biosearch 9600 自動儀器或 Applied Biosystems Inc. Model 431A胜肽合成器上來予以合成。該等胜肽可使用Applied Biosystems Inc，Sys- -85 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I- ·ϋϋ IB— in. - In «ϋ— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明説明（64 ) 法來進行之。該均相的胜肽若適用的話’可利用快速原子撞撃質譜儀或電子噴射質譜議與胺基酸分析定出其特徵。窨施例2 牛物分析胜肽的生物活性傺可用一血栓形成素依賴細胞增殖分析來加以測定。鼠類IL4依賴型Ba/F3細胞像號人全長的人類TPO_R穿染。在缺少IL-3下（WEHI-條件培養基下），該等細胞傺依賴於TPO而增殖。其母代未經穿染細胞株則不會對人類TPO反應，依然保持IL-2依賴性。使用衍生自基因篩選之合成胜肽來對上述二種細胞株作分物分析。該細胞傺生長於含有1MWEH 1-3條件培養基之完全RPMI-10培養基，而後再以PBS清洗二次，並再懸浮於缺少WEHI-3條件培養基之培養基，再將該細胞以2X104 細胞/孔量加入含有胜肽稀釋液或者TPO之孔洞中。該細胞在37 °C且潮溼化之5%C〇2氣壓下培育48小時，再利用將 MTT被還原成甲潛，同時藉由在ELISA平盤閲讀器上測量在 5 7 Ο η Μ上的吸光量，來分析其代謝活性ϋ該胜肽係對經T P 0 -R穿染之Ba/F3細胞，利用如第1圖示的劑量依賴形式，來測定出其剌激之增殖作用。奮旆例3 結合親和力對TPO-R之化學合成的結合親和力係可以競爭性結合 -67 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（65 ) 分析來加以測定。微量滴定的孔洞像塗覆以Img的抗生蛋白鏈菌素，並以PBS/UBSA加以阻礙之，而後再以50ng的經生物素化的抗-受體來固定化的抗體（Ab 179)。該孔洞再以可溶性之TPO-R的1 :10稀釋液處理之。各種濃度的胜肽或胜肽仿效物傺與一固定量之經截頭形式的ΤΡ0相混合。該經截頭形式的ΤΡ0偽由被融合至麥芽糖結合蛋白（MBP-TPO^S)之1-156殘基所構成。該胜肽MBP-TP〇15e混合物偽加入ΊΤΟ-R塗覆的孔洞中，在41下培育2小時並以PBS清洗。在平衡狀態下所結合的ΜΒΡ-ΤΡ0 ^ s e傷藉由下述方式測量，即加入一免子對MBP之抗血清，而後加入鹼性磷酸酶綴合之山羊抗免子IgG。每一孔洞中之鹼性磷酸酶使用標g i 來測定出。 < 該分析傷對一廣範圍的胜肽濃度來進行，且其結果傺繪出圔形，以使得y軸代表結合MBP-TP〇15s之量而X軸表代胜肽或胜肽仿效物之濃度。其可測定出在嘟個濃度該胜肽 • 或胜肽仿效物傺可降低5MMBP-TP0i 5 s結合至經固定化之 TP0-R的量（ICu)。在使用上述的分析條件，該胜肽之解離常數（Kd)傺相似於所測量的1C 5 d。嘗施例4 “在質體中的胖肽” PJS142載體傺使用於基因庫的建構，且其偽如第4圖所示的。基因庫的建構是需要三個寡核苷酸序列：0N-829 (5’ACC ACC KC AG); 0Ν-δ30 (5TTTA CTT AGT ΤΑ)與一 -68 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ϋ- ^ϋ— HI &m i_i— eLrt mi ι_ϋ1 Hi·— in (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 〜__ B7 ^---------—_ i、發明説明（66 ) 有意義之基因庫專一的寡核苷酸（5fGA GGT GGT (NNlOn TM CTA AGT AAA GC)，其中（NNK) n代表所欲長度與序列之隨機區域°於合成中或純化後’該寡核苷酸像可利用聚核苷酸激在其5 ’上進行化學磷酸化。而後其在莫耳比例為 1 :1 :1下黏合（a η n e a 1 e d)並接合至載體上。在淘選上較佳使用的大腸桿菌株傺為基因型：△ (sr 1 -recA) enAl nupG Ion-" 11 sulAl hsdR17 Δ (opniT--fepC)226 A c 1 p 319 : : k a n A 1 a c 1 a c Z U118，其傺自源自於在耶魯大學之大腸捍麵儲存中心之具有基因型l〇n-ll SU1A1的大腸桿菌株來製得([並丄丄b/r，儲存中心編號CGSC :6573) 。上述的大腸桿菌株係被製出以將其使用於如Dower et a 1 . Nucleic Acids Res· 16:6127 (1988)所述的電穿孔方式中，但除了在是在所有的清洗步驟中皆使用10%甘油。使用1P g B 1 u e s c r i p t質體（S t r a t a g e n e)對細胞的效率加以測試。此細胞偽供原始基因庫的生長用與在每一輪淘選後經富增之族群的擴增用。在質體上的胜肽傷可使用溶顏酶之溫合地消化細胞壁而自細胞中釋出以供淘選◦在使細胞殘渣形成小九塊後，該粗溶菌液可直接使用於大多的受體上。若有需要質體複合物之額負純化，則可使用凝膠過濾，以去除任何在該粗溶鐘液中之低分子量污染物。淘選偽在比具有比大多生理緩衝液更低的鹽濃度下之緩衝液（HEKL)中進行。該淘選#可在一徼量滴定孔洞中進行*該孔洞具有一被固定在未被阻礙的單株抗體上的受體 -89 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） ---^--------^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 518341 A7 B7 五、發明説明（67 ) ，或者該淘選自在珠粒或者管柱上進行。更待別的是，在第一輪的淘選中，傺使用每一者皆被塗覆有受體的24孔。在第二輪中，則一般是使用六値經受薩塗覆的孔洞（p A N樣品）與六個未經受體塗覆的孔洞（NC樣品）。比較在此二組樣品中質體的數目，可對是否對受體專一的殖株經由淘選而被富增作一指標。“富增” 一詞被定義為PAN轉形體對 NC樣品中所回收者之比例。10倍的富增一般是對受體專一的殖株傺存在的指標。在其後一輪的淘選中，可利用降低溶_液加入孔洞的量，以降低質體複合物之非專一的背景結合性。在第二輪中，則使用每孔洞1〇〇μ 1溶菌液。在第三輪中，每孔洞1〇〇 Μ溶顏液傺以1/10的稀釋度在HEKL/BSA來加以稀釋。再一輪的淘選，偽使用至少1000倍之經估計殘餘多樣性的質體轉形單位作為加入量。

為各個殖株所編碼的胜肽結合特性一般可在3、4或5 輪的淘選後加以檢視，此傺依所觀察到的富增數目而變。一般而言，係使用該等可利用Lac 1~胜肽融合蛋白之受體專一結合性的ELISA。Lac I—般傺為四聚體，且其最小具 DNA結合功能之物種為二聚體。因此，該胜肽在融合蛋白上顯示出多價性。設若有足夠密度的受體可被固定在孔洞上，融合至Lac I的胜肽傜可結合以合作且多價的方式結合至表面。該合作結合性容許該等本身為低親和性之結合情況下被撿測出。此分析的敏感性係具有一優點，即低親和性的最初命中可容易地鑑定出，但有一缺點，即在EL IS A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） !:--------豐------1T------# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )18341 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 A7

五、發明説明（68 ) 中的訊號並不相關於該胜肽本身所具有的親和。如下所述之胜肽對麥芽糖結合蛋白（MBP)之融合可容許其在ELIS A形〜式上加以測試，其中訊號的強度是較親和與呈相關性的。參見第5A-B圖。由有意義的殖株中所獲得的DNA是使用檫準的徼製備步驟來製備出雙股形式。有意義的單一殖株或是群的編碼序列傷被轉移到一可與該基因編碼MBP融合而形成一呈閲讀架構形式（i n f r a m e)且其蛋白質一傺以溶液中單體的形式發生之載體中。一基因庫選殖入PJS142中，以産生一接近於基因庫之隨機編碼區起始處的BsPE I限制酶址。以 BspEI與SacI消化可純化出900bp的DNA片斷，其可被次選殖入二個載體pELM3(細胞質内）或PELM15 (胞質間）之一者*該二者偽分別為將載體pMAU-2與pMALp-2作簡單的修飾，且可購得自New England Bio labs。參見第5A-圖。以 “0 1與3〇8 11消化之1^1^3與&£1^15可使得自9以142基因庫中之BspEI-Scall片斷可有效地選殖。BspEI與Agel在接合上是可相容的。此外Sea 1 I的正確接合對再造成一具功能的b la (Amp抗性）是必要的，因而可降低因不欲的接合反應所造成的背景之情況。而後啓動子-驅動MBP-胜肽融合體之表現可以IPTG所誘發出。對1^〇1或1^?£113&3的溶_液像使用瀋_酶溶解細胞並利用離心去除不可溶的細胞碎片而自各個殖殊中製得。而後將溶謹液加入含有經固定受體的孔洞與無有受體之對照孔洞中。藉由其與一直接對抗Ucl或MBP之免子多株抗 _ 71 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ϋ_ϋ- ·ϋϋ I 4IH ϋϋ 1— —.1 —ϋ an— ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tT. 518341 A7 B7 i、發明説明（69 ) 血清相培育，而後再與鹼性磷酸酶標記的山羊抗免子二級抗體相掊育，來撿測Lac I或MBP胜肽融合體之結合性。經結合的鹼性磷酸酶像可以P-硝基苯基㈣酸呈色基質來撿測經濟部中央標準局員工消費合作社印製實施例5 “頭H (h e a d p i e c e )二聚體条統” LaC I胜肽在質體技術上的一變化方式是應用一被稱為 “頭片二聚體”之DNA結合蛋白。大腸捍鐘lac抑制子（SUP ressor)之DNA結合性偽被約60個胺基酸的“頭片”區域所調節。該可結合至lac操縱子之頭片區域的二聚體一般是藉由較大且約300個胺基酸Ο端區域結合所形成的。“頭 Η二聚體”条統則是利用包含有經由一短胜肽鏈結子之二個頭片的頭部片斷分子，此等蛋白質以足夠的安定性結合至DNΑ上，以使胜肽抗原決定基相結合，該抗原決定基像顯示在一具有編碼該胜肽之質體内的頭片二聚體C-端上。隨機的胜肽傷被融合至頭片二聚體之Ο端，該二聚體可結合至編碼其之質體，而製造出可用淘選來加以篩選的胜肽-頭片二元聚體複合物。頭片二聚體胜肽在質體上的条統可對親和配位子則比Lac I条統容許有更大的選擇性。因此，頭片二聚體可使用基於最初的低親和力的命中而製作突變基因庫，並篩選出該等最初序列中之較高親和力的變種。該基因使用頭片二聚體載體PCMG14 (參見第6A-C圖） -72 - ϋϋ· ·ϋϋ ^—Βϋ €ϋ ϋϋ· gMKff ι_ϋ m-i ϋϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 __ B7_ . 五、發明説明（7〇 ) 而如胜肽在質體上的方式來建構。1 ae操縱子的存在對藉由頭片二聚體蛋白來進行質體結合而言並不是需要的。該 _ 基因庫係被引入編大腸捍_ (1〇11_11株sulAl hsdR17 (opmT-fepC)A clp319：：kan AlacI lac ZU118 (srl-rec A) 306 :: TnlO)的細麵中，且在基本的啓動子誘導條件下擴增。頭片二聚體基因的淘選傺可以相似於Uc I基因庫所使用的方式來進行，只除了其是使用HEf(緩衝液取代HELK 緩衝液，且自孔洞將質體溶析出是以酚來取代該IPTG來進行。由頭片二聚體淘選出的序列常常可在其被轉移至MBP 載體後定出特徵，以使得其可在親和力敏感之MBP EL ISAs 中作測試，同時裳可使得殖的族群利用具有標記的受體而以細胞群落取出（c ο 1 ο n y i i f t)的方式加以篩選。 - 實施例6 在此實施例中，環化的化合物傷經由三種分析。第一 IC5 〇偽以如上所述的方式得之。此外，亦進行如上所述之 ΜΤΤ細胞增殖分析，以計算>出〖(：3〇值。最後，進行一微生理測量器（Μ ο 1 e c u 1 a r D e ν i e e s C 〇 r ρ * )分析。基本來說，在此分析中，可決定出細胞外培養基酸化的比率，此傺對該本發明化合物對ΤΡ0受體剌激作用的反應。EC s D的範圍如上述的IC 5Q係以符號顯示。其結果摘述於表4。 -73 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -i n ϋϋ - > ϋϋ I ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 518341 A7 B7 五、發明説明（71 ) 表4 EC50(nM^ EC5Q(nN-n IC30(nMl 增殖微生理 [Η] - ·； Pen) ADGPTLP^ISF {Cys ) - (NH 2i %

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[0 *C -MH} - ADGPTLP^IIS? (Cys) {NH 2 j 十+ 4-4· 十♦· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) GH2 [Η] - ·；Homocys) ADGrTLREWISF (Cys) - {NH21

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++ ++ MD — 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 [H] - {D-Cys) ADGPTLHEWIS? {D-Cys) - {NH2]

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[HI - icys) ADGPTLREWISF {D-Cys) [NH 2 J I I S------ +♦ 74 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（72 結構 EC50(nM) E*Z50fnM) ICSufnM) 增殖微生理 CH] - {D-Pen) ADG?T1?^：-7ISF {D-Cys) - {NH2 ] + 十 I S·

(HI - (Homocys) ADG?TL?3n：Sr fHomocv^s) - {NH 2i v I ί 十十十肀· ch2

-ADGFTLP,ZiiX£F{Pen) - {NH 9 J 十 CH2 [O-C-NH] -ADGPTLREWISF {Cys) - {NH 2] 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Ph-CH·

.S ^[H] -KADGPTLREWISFE- [NH 2 J ^-— NH-C-0 K)0 一 75 _ (請一先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 / A7 B7 五、發明説明（73 結構 ECSO(nM) E^OfnM^ IC30fnM) 增殖微生理 [H卜師2·】I I 0=C - NH-!

(0*C-MH1 -ADGrTL?^：IS?iCys) - [NH ?J

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[OsC-HH] -ADGPTLP^IIS? {Cys) - {NH 2 J ---S

[HN] -ADGPTLRH^ISFE--{NH2J I--CK) [HI - {Pen) ADGrTLHEWIS? {Pen) - {NH 21

+ 十 +- ND — 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

S -76 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（74 ) 實施例7 在此實施例中，如上所述，傺分析在環化化合物中之 D、E、I、S或F位置上胺基酸取代下的EC 5 e與1C 5 〇。

微生理測量器之結果顯示於括號内。其結果摘述於表5。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（75 表 5

CADG? 丁 LHliWISFC

EC5Q (nM) 細胞增殖 IC50 (nM)

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 S-A 一十 c—) 七十 S-D-Ala 十 -h- S - Sar t寸 S-Aib Ο) ++ S · D-Ser ++ 如十 S-Nva S· Abu — S - (N-Me-Ala) +- 十. S - (N-Me-Val) Ή S - (N-Me-Ala) ^ —· 十· S - (Nor-Leu) Η· 十+ 十十 S · (t-Bu-Gly) S - (N-Me-SertBzl)! 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 78 518341 A7 B7 五、發明説明（76 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 518341 A7 B7 五、發明説明（77 )

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Ava = ’X/Xy COOH - 8 Ο - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（78 ) 實施例8 在此實施例中，傺如表6所示評估在化合物中之D、S 或F位置上胺基酸取代。

CH2 _ ...................................................................... —'S EC 5 e與IC s 〇傜如上所示的來計算之。徼生理測量器之結果顯示於括號内。 ---.--*---1---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（79 ) 表6 [〇=C -NH 卜ADGPTLHEWISF (Cys }I ICH2---c 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製

---,I-*---.---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（ 80

實施例9 在此實施例中，對二聚體化合物之【5(]與IC5 “直係如上所述來計算，其列於表7。該環化單體 GPTLREWI SFC 傺包含於其中以作比較。表8的化合物在測定最高濃度1〇μιη下是不具有活性的〇在表9中，由環化且二聚體化之I E G p T L R Q W L A A R Α的變種如上所述來計算得的“5(3與1(：50來比較

在表10中，二聚體的截頭 (H) -IEGPTLRQWLAARA ---.--------i---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

)-IEGPTLRQWLAARA (jSala) K - (NH2) 是相比較的。EC 5 與IC 5 d值偽如上所述來計算。微生理測量器之結果顯不於括號内。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -83 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（ 81 表7

EC50 (nM) 1CS0 (nM) 徼生理增殖

0 II

[Br-fC-rnn -ADGPTL?^7I£FC* Ο ιι [Br-HZ-rTH] -ADGrTL?Z；-JIS?·：两】两】 [H] -ZEGPIXRQWLAAKA 【H卜 IZGPIUIQWLRAEA (p-Ala) ll- {NH2 ] 【HI -aZGPTLHQWLAAEA- {NH21 [H] -CZZGETLRQWLAARA- {NH2i -h-f -h+

TT —.1 — L---.——ΦI — (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 (H] -CADGFTLEnilSr · [NH2 i 【H 卜CADGPTISEWISF- (NH2 】 ++ 七十 T-r 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 [H卜 SVQCGPrLRQWLAASNKLS- (NK21， [H卜 SVQCGPTLIIQWLAAHNHLS-】 [H 卜 HyGPILRSGC- [ NH2 ] I [ίΠ-HVGPTLRSGCMNH21 一 8 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -Μ*

i\rD 4- 518341 A7 B7 五、發明説明（ 82 %: CADG?IIJSJI£Fr

tIX3PTIPSJISrC [AC] -ADGPTIPSJISFC ADGPTLESJISFC I ADGPTLRIHISFC 【Ac 卜:GPHIiEHISFC [Ac] -EGPTII&JISFC

[Ac]-G： (Ac) -G： :PIIEE5iI； ;PTLRHiI· ：SFC .5ru

GPILREWISFC I GPTLEHiISFC [Acl-PTLEH-JISTC I (Ac)-PTLmilSFC

PILEH/JISFC I PTIjEEWISFC EC50 微生理， (ηΜ) ，增殖 ICSO (ηΜ) --------r+ ND Τ + +十如十十— 十十 14〇 -h+ -W· 十· M D ++ ++ -Η· 十- ---,--.---1---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

【Ac 卜 TLSHIISFC 【Ac 卜 TIIJEWISFC

TEEEWISFC I TTIiEWISrC +-+ 85 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7

518341 A7 B7 五、發明説明（ 84 表 9

EC50 (nM) !C50 (ηΜ) 徼生理增殖 [H] -IZGPTLRQVTLAAFA- {1¾ ] N.D. + 十 +τ .【Η卜CIZGPTLHQWLAASAO ] N.D· 十十七十 [H] -IZGPTLRQWLAARA 十十爷+ 十+ \ [H 卜 lEGPTLRQWLAARA(B-Ala) K- (NH2 1._Ί[ιII鲁— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標率局員工消費合作社印f [Η 卜 CIEGPTLHQWLAARA- (NH2 ] [HI -CZEGPTLRQH:;·:·- im2) 87 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 518341

A B 五、發明説明（ 85 表10 (H) -IZG?TL^*iIAARA I (HJ •lEGPTLRQWLAAKA(β-Ala) 1C-{%】經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列 EC5D(nMl IC50 (ιιΜ) 1 細胞增殖 1 (AC) -lEGrTLRQVJLAARA 1 《Ac 卜 IEGTTLIl〇WLAAKA-(iA_K 叫 J 十十 MD ψ (H) -IEGTtLIlQliLAAR I (HWEGPTLRQWLAAR-PA-K (11¾ 1 补 mD (H) -lEGFXLHQWIAA 1 (H) -IEGTTIJlOVJIAA-βΑ-Κ (NH.) md (Aci -EGPTLIiaWLAARA 1 (Ac) -£GPTIJlQWIAA^A-(iA-K{NH2) MO {H 卜EGTTL^QVIL^AKA 1 (H)-EGFTIJlQV^J^-(iA-K{m) NO (H)-EGPTLRQWLAAR 1 (m-EGPTLRQWLAAR-PA-K (叫）肀十 Nt> (AC 卜 EGFTLRQWLAA i {Ac 卜 EGFTLRQWIAA-βΑ-Κ (NH； J Wb (H)-EGFTLHQWIAA 1 (HJ-EGFTLIlQWLAA-fiA-KlNH,) Mb 88 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） ---.--*---1---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 518341 A7 B7 五、發明説明（ 88 實施例10 在此實施例中，各種取代偽被引入環化化合物之G 與W位置上。請先閱表11列出顯示出ΤΡ0同效組合物之經取代化合物實施例縮寫於表中之取代基偽如下所示。之注意事項再 t 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製表11

% 一’ 一 -......... - ' [m-CADGPTLREWISFC· [NH，] ---- G P W —— --__ Sar Hyp(OBn) Nal Sar Hyp(OBn) Nal Gly Pro Trp Y Gly Pro Trp Sar Hyp(OBn) Nal Gaba Pro Trp Cpr-GIy Pro Trp Sar Hyp(OBn) Nal Gly Pro Trp Gly Pro Nal Sar Pro Trp Cpr-Gly L-Tic Nal Gly D-Tic D-Trp Cpr-Gly D-Tic Trp _ Gaba Hyp(OBn) TrD 訂 89 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（ 87 脯胺酸的取代

^Y^COOH ΒωΟ L-Pro D-Pro

八·

COOH (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΗΝ· ί56οη L-呢可啉酸 D-哌可啉酸 L-鈐蘭胺酸

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 518341 A7 B7 五、發明説明（88 ) 色胺酸的取代 • ▲ 丄

COOH

DL-1-Mc-Trp (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) DL-5-Mc-Trp l-(苯 1έ_嗯基卜丙胺酸經濟部中央標準局員工消費合作社印製

DL*6-P-X rp

F

Br

DL-5-Br-Trp

89 518341 Α7 Β7 五、發明説明（甘胺酸的取代

甘胺酸

XOOH 甲基甘胺酸 ϋϋ· m_i 11^1 imm—f —.^ϋ —bi mi —ϋ ·ϋ^ I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、COOH 丙胺酸 H〆 v 、C〇〇H7 -胺基丁酸

、1T

、COOH

、COOH 經濟部中央標準局員工消費合作社印f N-苯基甘胺酸璟丙基甘胺酸一 μ / — 92 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 518341 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（90 ) 實施例11 評估對傳統測試物種小鼠的可實施性，則進行一些設計用於測量該測試化合物對小鼠受體活性之活體外實驗。第一，回收自8-9週大的Balb/c小鼠之大腿骨的骨髓細胞，在具有rhuTPO或各種濃度之測試胜肽的培養基中培養7 天。在培養的最後，該培養物以Cytospin濃縮之，並以七醯膽鹼酯化酶UchE，一種小鼠巨紅核細胞的撿測劑）染色，再以顯徼鏡分析。InM的rhuTPO細胞可産生非常巨大（ >4〇μήι)之可為AchE所染色的非附箸性細胞。此細胞顯然是成熟的巨紅核細胞。由最初l〇s總骨髓細胞/ml (在50ml 培養液中）之種子培養物（seeding)，發成約1至2X106的巨紅核細胞。此對ΤΡ0的反應被稱為“最大”。不含有外加生長因子的對照培養基則産生十分少的AchE-陽性反應的細胞。一些胜肽化合物在該分析以高濃度測試，且其結果摘述於表12。在ΙΟμιη下的胜肽A對小鼠骨髓産生最大的反應。此事實是個顯示該胜肽族群傺對鼠類的受體係具活性之第一痼證據。在第二個實驗中，骨髓細胞在不含有因子或含有InMrhulTO或1〇μΜ胜肽A的固態培養基（甲基纖維素）中回收並培養之。在培養7天後，大細胞的細胞群落 (被推定為巨紅核細胞）係被計數且分類成小的群落（3-5個細胞）或大的群落（多於6個細胞）。其結果顯示於表 13。ΤΡ0與測試的胜肽皆實質上對二種大小的細胞群落皆生成比負對照組培養物更多之群落。此顯示胜肽可仿效 ΤΡ0，而在能力上可以剌激MK前驅細胞族群的擴大。 _ - 93 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ϋ- ϋϋ ^ϋ_ι ?ri ml I ml In in if (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 518341

7 7 A B 五、發明説明（91 ) 為了得到測試化合物對鼠類與人類受體活性上的定量比較’ m u T P 0受體傷被選殖並被轉入g a p 3細胞内。一 T P 0依賴族群細胞是被單離出。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

胜肽t 測試濃度（nM) f^m D 100,000 無 C 40,000 最大ί1 C + S.A.2 1000 、最大★★ S.A. alone 1000 無 B 100,000 最小k A 10,000 最大.2★ TPO (R 5c D) 1 最大〃 -94 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1

^相較於重組人體TPO * 2 在 c y t 〇 s p i η 上 2 0 - 3 0 % A C Ε 染色細胞無因子的培養物-ca. 5%AChE染色細胞（低細胞性） 2 複合至生物素化之抗生蛋白鏈謹素-推定為1 : 4複合體之濃度 518341 A7 B7 五、發明説明（92 ) 表13 化含物 3-5大型」細胞： 6-12 大型細胞 — No因子 1 2 1 _____ _ ^^因子 2 1 1 1 nM ΤΡΟ #1-1 15 6 1 nM ΤΡΟ #1-2 12 1 1 ηΜ ΤΡΟ #2-1 16 8 1 ηΜ ΤΡΟ #2-2 13 3 10 uM 胜呔 #1-1 25 10 10 uM 胜肽 #1-2 22 8 1〇 uM 胜肽 #2-1 22 7 10 uM #2-2 21 10 #衣- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本案中之所有文章，參考資料，包含專利文獻之掲示内容其整體因所有的目的而皆在此被列為本案的參考資訂料經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X297公釐）

Claims

518341

ΐ請專刹範_~--— 第85109336號專利再審查案申請專利範圍修正本 , 修正日期：90年03月 1· 一種可結合至並活化血栓形成素受體的胜肽或胜肽仿效化合物，其具有 —— - (1) 一低於約8000道爾吞的分子量； (2) 當以IC5〇來表示時，具有一不高於約loo^m之血栓形成素受體結合親和力； (3) 包含有一如下所示的胺基酸序列，該序列係位於該胜肽或胜肽仿效化合物的受體結合址： Xi x2 x3 X4 x5 Xe X7 其中乂1為0!^、]^、？、（5、乂；乂2為？、：&、1^、！<[、 (5、11、8、丁或¥;乂3為(：、卩、1、1^、]^、11、8、¥或 W ; X4為20種遺傳上所編碼之L-胺基酸中之任一者； X5 為 A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V 或 Y ; X6 為(：、卩、0、1^、？^、8、¥、\^或丫；以及乂7為(：、0、 I、K、L、Μ、N、R或 V。 2· 如申請專利範圍第1項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胺基酸的序列被環化。 3. 如申請專利範圍第1項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胺基酸的序列被二聚體化。 4. 如申請專利範圍第1項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胜版或胜狀仿效化合物在其受體結合址包含有一如下所示的胺基酸序列： C Χ2 Χ3 Χ4 Χ5 乂6 Χ7 其中乂2為尺、1^、>1、（5、11、8、丁或¥;乂3為0卩、 -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（C:NS ) Α4規格（210X297公釐）：：續 II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財4局诗工消費合作社印製申請專利範圍 1、[、]^、11、8或¥;乂4為20種遺傳上所編碼之1^胺基酸中之任一者；χ5為A、D、E、G、S、V或Y; X6 為<^、卩、〇、1^、厘、8、¥、冒或丫；以及乂7為（：、〇、卜 K、L、Μ、N、R或 V。 5. 如申請專利範圍第3項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中乂4為A、E、G、H、K、L、M、P、Q、R、S、T*W。 6·如申請專利範圍第5項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中 X2為S或T ; X3為L或R ; X4為R ; X5為D、E或G ; X6為 F、L 或 W ;且 X7 為 I、K、L、R或 V。 7· 如申請專利範圍第4項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胜肽或胜肽仿效化合物在其受體結合址包含有一如下所示的胺基酸序列： Χδ C Χ2 Χ3 Χ4 Χδ Χδ Χ7 其中 Χ2 為 F、反、1^、：^、（5、11、8、丁或¥;乂3為(：、 ?、1、1^、1^、11、8、¥、或\^;/4為20種遺傳上所編碼之L-胺基酸之任一者；χ5為a、D、E、G、K、Μ、 Q、R、S、V 或 Υ ; Χ6 為 C、F、G、L、M、S、V、W 或Y;以及，X7為C、G、I、K、L、M、N、R或V;且， X8為20種遺傳上所編碼之l·胺基酸中之任一者。 8· 如申請專利範圍第7項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中 X8為G、S、T或R。 9. 如申請專利範圍第7項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胜肽或胜肽仿效化合物在其受體結合址包含有下述胺基酸序列·· GGCTLREWLHGGFCGG。 10·如申請專利範圍第1項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中 518341 A8 B8 C8 —________ _ D8 六、申請專利範圍該胜版或胜狀仿效化合物在其受體結合址包含有一如下所示的胺基酸序列： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Χδ G X1 x2 x3 Χ4 X5 W Χ7 其中乂1為[、]^、？、（5或¥;乂2為卩、11、8、丁或¥;— Χ3為F、L、V或 W;X4為 A、K、L、M、R、S、V*T; X5為 A、E、G、K、M、Q、R、S或 T; X7為C、I、K、 L、M或V ;每個X8殘基各自為擇自於20種遺傳上所編碼之L -胺基酸中之任一者。 11 ·如申請專利範圍第1 〇項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中乂彳為卩；X2為T ; χ3為L ; X4為R ; X5為E或Q ;且χ7 為I或L。 12·如申請專利範圍第11項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胜肽或胜肽仿效化合物在其受體結合址私含有一如下所示的胺基酸序列： Χ9 Χδ G Χι X2 X3 X5 VV X7 其中 X8為a、c、d、e、k、l、q、r、s、t*v，且 X9為A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T或 V。經濟部智慧財4局員工消費合作社印製 13·如申請專利範圍第12項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中Χ8為D、Ε或Κ，且乂9為八或I。 14·如申請專利範圍第13項之胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胜肷或胜肽仿效化合物係選自於下列群中： GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN; GGCADGPTLREWISFCGGK; TIKGPTLRQWLKSREHTS; •98- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 518341 A8 B8 C8 D8 六、甲請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) SIEGPTLREWLTSRTPHS; LAIEGPTLRQWLHGNGRDT; CADGPTLREWISFC;以及 IEGPTLRQWLAARA。 15· —種可結合至血栓形成素受體上的胜肽或胜肽仿效化合物，其中該胜肷或胜肽仿效化合物係選自於下列群中： CADGPTLREWISFC ; [Ac] - CADGPTLREWISFC -[醯胺] ; I______________ o = cadgptlrewisfc-nh2 .以及 I I 1 C Η ------------3 IEGPTLRQWLAARA I IEGPTLRQWLAARA(/3 ala) -Κ [ΝΗ2]。經濟部智慧財4局員工消費合作社印製 16 一種用於治療一罹患一對血栓形成素拮抗劑敏感的疾病之病人的藥學組成物，其包含有一如申請專利範圍第1項之胜肽或胜肷仿效化合物以及一與之組合的藥學上可接受的載體。 17. —種用於治療血液疾病與血小板減少症的藥學組成物，其包含有一如申請專利範圍第丨項之胜肽或胜肽仿效化合物以及一與之組合的藥學上可接受的載體。 -99- 本紙關家縣（〇siS ) Α4規格（21GX297公釐) ----