NO317737B1 - Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. - Google Patents
Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. Download PDFInfo
- Publication number
- NO317737B1 NO317737B1 NO19975705A NO975705A NO317737B1 NO 317737 B1 NO317737 B1 NO 317737B1 NO 19975705 A NO19975705 A NO 19975705A NO 975705 A NO975705 A NO 975705A NO 317737 B1 NO317737 B1 NO 317737B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- peptide
- group
- peptides
- tpo
- receptor
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 319
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 113
- 108010070774 Thrombopoietin Receptors Proteins 0.000 title claims description 4
- 102000005763 Thrombopoietin Receptors Human genes 0.000 title claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 120
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 claims description 4
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 85
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 85
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 70
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 70
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 58
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 55
- 102100034196 Thrombopoietin receptor Human genes 0.000 description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 description 48
- 101710148535 Thrombopoietin receptor Proteins 0.000 description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 44
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 27
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 26
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 26
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- -1 sulfone derivatives of methionine Chemical class 0.000 description 22
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 21
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 21
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 20
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 18
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 18
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 18
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 17
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 17
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 16
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 15
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 14
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 14
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 13
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 10
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 10
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 9
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 9
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical group N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 5
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 5
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 5
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000946191 Galerina sp Laccase-1 Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000799466 Homo sapiens Thrombopoietin receptor Proteins 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 3
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101710139410 1-phosphatidylinositol phosphodiesterase Proteins 0.000 description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WIGDGIGALMYEBW-LLINQDLYSA-N 2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetic acid Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIGDGIGALMYEBW-LLINQDLYSA-N 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanoic acid Chemical compound CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037097 Protein disulfide-isomerase A3 Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N cyclohexylamine Chemical compound NC1CCCCC1 PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000034311 endomitotic cell cycle Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 2
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001361 thrombopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004214 1-pyrrolidinyl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXUAQHNMJWJLTG-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(C)CC(O)=O WXUAQHNMJWJLTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDGOIRWJWVZKAQ-UHFFFAOYSA-N 5-[2-(aminomethyl)-4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)-3,5-dimethoxyphenoxy]pentanoic acid Chemical compound COC1=CC(OCCCCC(O)=O)=C(CN)C(OC)=C1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZDGOIRWJWVZKAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010003384 Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004626 Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 239000004129 EU approved improving agent Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000620880 Homo sapiens Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000694103 Homo sapiens Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical class [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 210000002361 Megakaryocyte Progenitor Cell Anatomy 0.000 description 1
- SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N Monoamide-Oxalic acid Natural products NC(=O)C(O)=O SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000730535 Morganella morganii Major phosphate-irrepressible acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022919 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Human genes 0.000 description 1
- 229940123936 Thrombopoietin agonist Drugs 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 108700003859 araC Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical class [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- ZMCUDHNSHCRDBT-UHFFFAOYSA-M caesium bicarbonate Chemical compound [Cs+].OC([O-])=O ZMCUDHNSHCRDBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000005265 dialkylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- RDYMFSUJUZBWLH-UHFFFAOYSA-N endosulfan Chemical compound C12COS(=O)OCC2C2(Cl)C(Cl)=C(Cl)C1(Cl)C2(Cl)Cl RDYMFSUJUZBWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 125000003838 furazanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000053400 human TPO Human genes 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 125000002632 imidazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002636 imidazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005956 isoquinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000013541 low molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- OFYAYGJCPXRNBL-LBPRGKRZSA-N naphthalen-2-yl-3-alanine Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=CC2=C1 OFYAYGJCPXRNBL-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940039748 oxalate Drugs 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000587 piperidin-1-yl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005936 piperidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010052780 polyasparagine Proteins 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001850 polyploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Chemical class 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010000947 protamine zinc Chemical class 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 125000004309 pyranyl group Chemical group O1C(C=CC=C1)* 0.000 description 1
- KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N pyrazine-2,5-dicarboxylic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C1=CN=C(C(O)=O)C=N1 KOUKXHPPRFNWPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003072 pyrazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002755 pyrazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001422 pyrrolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YOEWQQVKRJEPAE-UHFFFAOYSA-L succinylcholine chloride (anhydrous) Chemical group [Cl-].[Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(=O)CCC(=O)OCC[N+](C)(C)C YOEWQQVKRJEPAE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005505 thiomorpholino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004568 thiomorpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000014754 thrombocytosis disease Diseases 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N β-(2-naphthyl)-alanine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C21 JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N β-cyclohexyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1CCCCC1 ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
KRYSSHENVISNING TIL RELATERTE SAKER
Denne søknad er en CIP av US-patentsøknad serie nr. 08/485.301, av 7. juni, 1995 og US-patentsøknad serie nr. 08/478.128, av 7. juni, 1995.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptider og forbindelser som binder til, og aktiverer, trombopoietinreseptoren (c-mpl eller TPO-R) eller på annen måte virker som TPO-agonist samt farmasøytisk blanding. Oppfinnelsen har anvendelse innen feltet biokjemi og medisinsk kjemi og gir særlig TPO-agonister for anvendelse innen humanmedisinsk sykdomsbehandling.
Megakaryocytter er benmarg-avledede celler som er ansvarlige for dannelsen av sirkulerende blodplater. Selv om de utgjør mindre enn 0,25% av benmargcellene i de fleste arter, har de mer enn ti ganger volumet av typiske margceller. Se Kuter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11104-11108 (1994). Megakaryocytter undergår en prosess som er kjent som endomitose, hvorved de replikerer deres kjerner, men ikke undergår celledeling og således fører til polyploide celler. Som respons på et nedsatt blodplatetall øker den endomitotiske hastighet, det dannes polyploide megakaryocytter, og antallet av megakaryocytter kan øke opptil tre ganger. Se Harker, J. Clin. Invest. 47:458-465 (1968). Derimot avtar den endomitotiske hastighet, dannelse av lavere-ploide megakaryocytter, og antallet av megakaryocytter kan avta med 50% som respons på et forhøyet blodplatetall.
Den nøyaktige fysiologiske tilbakekoblingsmekanisme som massen av sirkulerende blodplater regulerer den endomitotiske hastighet og antallet av benmargs-megakaryocytter med, er ikke kjent. Den sirkulerende trombopoietiske faktor som er involvert ved medieringen av denne tilbakekoblingssløyfe, antas nå å være trombopoietin (TPO). Nærmere bestemt har TPO vært vist å være den humorale hovedregulator i situasjoner hvor trombocytopeni er involvert. Se f.eks. Metcalf Nature, 369:519-520 (1994). TPO har i flere undersøkelser vist seg å øke blodplatetallet, øke blodplatestørrelsen og øke isotop inkorporering i blodplater hos mottagerdyr. TPO antas å påvirke megakaryocytopoiese på flere måter: (1) det frembringer økninger i megakaryocyttenes størrelse og antall; (2) det produserer en økning av DNA-innhold i form av polyploiditet, i megakaryocytter; (3) det øker megakaryocytt-endomitose; (4) det frembringer øket modning av megakaryocytter og (5) det frembringer en økning i prosentandelen av forstadie-celler, i form av små acetyl-kolinesterase-positive celler, i benmargen.
Siden blodplater (trombocytter) er nødvendige for blodkoagulering og siden en pasient er i alvorlig fare for å dø av katastrofal blødning når antallet av disse er meget lavt, har TPO en mulig anvendelse både ved diagnostiseringen og behandlingen av forskjellige hematolo-giske forstyrrelser, for eksempel sykdommer som primært skyldes blodplate-defekter. Pågående kliniske forsøk med TPO har tydet på at TPO trygt kan administreres til pasienter. Dessuten har nylige undersøkelser gitt grunnlag for å forutsi effektivitet av TPO-terapi ved behandling av trombocytopeni, og særlig av trombocytopeni som skriver seg fra kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransplantasjon, som behandling av cancer eller lymfom. Se f.eks. McDonald (1992) Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14:8-21 (1992).
Kato et al., J. Biochemistry, vol. 118,1995, s. 229-236, beskriver isolering og karakterisering av en trombopoietisk faktor (TPO) fra plasma til trombocytopeni-rotter. Det beskrives videre at rotteplasma TPO omfatter minst 163 aminosyrer og har en molekylvekt på omtrent 19 kDa. Peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som er mindre og som har molekylvekt som er mindre enn omtrent 8000 dalton, er derimot ikke beskrevet.
Genet som koder for TPO er blitt klonet og karakterisert. Se Kuter et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11104-11108 (1994); Barley et al, Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushansky et ai, Nature 369:568-571 (1994); Wendling et al, Nature 369:571-574
(1994); og Sauvage et al, Nature 369:533-538 (1994). Trombopoietin er et glykoprotein med minst to former med tilsynelatende molekylmasser på 25 kDa og 31 kDa og med en felles N-terminal aminosyresekvens. Se Bartley et al, Cell 77:1117-1124 (1994). Trombopoietin viser seg å ha to distinkte regioner adskilt av et eventuelt Arg-Arg-spaltningssete. Den amino-terminale region er sterkt konservert hos menneske og mus, og har en viss homologi med erytropoietin og interferon-a og interferon-b. Den karboksyterminale region oppviser stor artsdivergens.
DNA-sekvensene og kodede peptidsekvenser for human TPO-R (også betegnet c-mpl) er beskrevet. Se Vigon et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5640-5644 (1992). TPO-R er et ledd i den hematopoietiske vekstfaktor-reseptorfamilien, en familie som kjennetegnes ved en felles strukturutformning av det ekstracellulære domenet, inklusivt fire konserverte C-rester i den N-terminale del og et WSXWS-motiv tett ved den transmembrane region. Se Bazan, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:6934-6938 (1990). Indikasjoner på at denne reseptor spiller en funksjonell rolle for hematopoiese, er bl.a. observasjoner som at ekspresjonen er begrenset til milt, benmarg eller lever i musefostere (se Souyri et al, Cell 63:1137-1147 (1990)) og til megakaryocytter, blodplater og CD34<+->celler hos mennesker (se Methia et al, Blood 82:1395-1401 (1993)). Eksponering av CD34<+->celler for syntetiske oligonukleotider, antisense for mpl RNA, inhiberer signifikant utseendet av megakaryocytt-kolonier uten å påvirke erytroid eller myeloid kolonidannelse. Enkelte forskere har postulert at reseptoren funksjonerer som en homodimer tilsvarende situasjonen med reseptorene for G-CSF og erytropoietin.
Tilgjengeligheten av klonede gener for TPO-R forenkler letingen etter agonister for denne viktige reseptor. Tilgjengeligheten av det rekombinante reseptorprotein gjør det mulig å studere reseptor/ligand-interaksjon i en rekke randomiserte og semi-randomiserte systemer for utvikling av peptid-diversitet. Disse systemene innbefatter det «peptider på plasmider» system som er beskrevet i US-patentene 5.270.170 og 5.338.665; «peptider på fag» systemet beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/718.577, av 20. juni, 1991, US-patentsøknad serie nr. 07/541.108, av 20. juni, 1990 og i Cwirla et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1990); «polysome» systemet beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/300.262, av 2. september, 1994 som er en CIP-søknad basert på US-patentsøknad serie nr. 08/144.775, av 29. oktober, 1993 og PCT W095/11992; det «encoded synthetic library» system beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/146.886, av 12. november, 1993; 07/946.239, av 16. september, 1992 og 07/762.522, av 18. september, 1991 og det «very large scale immobilized polymer synthesis» system som er beskrevet i US-patent 5.143.854; PCT patentpublikasjon nr. 90/15070, publisert 13. desember, 1990; US-patentsøknad serie nr. 07/624.120, av6.desember, 1990; Fodor et al, Science 251:767-773 (2/1991); Dower & Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180 (1991); og US-patentsøknad serie nr. 07/805.727, av 6. desember, 1991.
US patent nr. 5.411.942 beskriver peptidderivater med opp til 5 eventuelle substituerte aminosyrer, fremgangsmåte for fremstilling av peptidene og anvendelse for behandling av glaukom. Peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som er nyttige for behandling av en forstyrrelse som er mottagelig for behandling med en trombopoietin-agonist er derimot ikke beskrevet heri.
Den langsomme gjenopprettelse av blodplatenivåer i pasienter som lider av trombocytopeni, er et alvorlig problem og har påskyndet letingen etter en vekstfaktor-agonist i blodet som kunne aksellerere blodplate-regenerering. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en slik agonist.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Denne oppfinnelse er tildels rettet mot den nye og uventede oppdagelse at bestemte lavmolekylære peptider og peptid-mimetika har sterke bindingsegenskaper for TPO-R og kan aktivere TPO-R. Slike peptider og peptid-mimetika er følgelig egnet for terapeutiske formål ved behandling av tilstander mediert av TPO (f.eks. trombocytopeni som resultat av kjemo-terapi, strålebehandling eller benmargs transfusjoner) så vel som for diagnostiske formål, ved studiet av mekanismen for hematopoiese, og for in vitro ekspansjon av megakaryocytter og forbundne progenitorceller.
Peptider og peptid-mimetika egnet for terapeutiske og/eller diagnostiske formål, har en IC50 på ca. 2 mM eller mindre, bestemt gjennom bindings-afifnitetstesten beskrevet nedenfor i Eksempel 3, hvor en lavere IC50 korrelerer med en sterkere bindingsaffinitet for TPO-R. For farmasøytiske formål har peptidene og peptid-mimetika en IC50 på maksimalt 100 um, mer foretrukket maksimalt 500 nM. Ifølge en foretrukket utførelsesform er molekylvekten av peptidet eller peptid-mimetikumet fra ca. 250 til ca. 8000 dalton.
Når de benyttes for diagnostiske formål merkes peptidene og peptid-mimetikaene fortrinnsvis med en påvisbar merking, og peptidene og peptid-mimetikaene uten slik merking tjener følgelig som mellomprodukter for fremstillingen av merkede peptider og peptid-mimetika.
Peptider som oppfyller de definerte kriterier med hensyn til molekylvekt og bindingsaffinitet for TPO-R omfatter 9 eller flere aminosyrer, hvor aminosyrene er naturlig fore-kommende eller syntetiske (ikke-naturlig forekommende) aminosyrer.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig forbindelse, kjennetegnet ved at forbindelsen omfatter en sekvens av aminosyrer:
Xi X2 X3 X4 X5 Xe X7
hvor Xi er C, eller P, X2 er T, X3 er L, X4 er R, X5 er E eller Q, X6 er W og X7 er L.
Forbindelsen angitt ovenfor er videre kjennetegnet ved at forbindelsen er et peptid og
hvor fra null til alle -C(0)NH-koblingene i peptidet er erstattet av en kobling valgt fra gruppen bestående av en -CH20C(0)NR-kobling; en fosfonatkobling; en
-CH2-S(0)2NR-kobling; en - CH2NR-kobling; en -C(0)NR<6->kobling og en -NHC(0)NH-kobling, hvor R er hydrogen eller lavere alkyl og R<6> er lavere alkyl: hvor dessuten N-enden i nevnte peptid eller peptid-mimetikum er valgt fra gruppen bestående av en -NRR^gruppe; en -NRC(0)R-gruppe; en -NRC(0)OR-gruppe; en -NRS(0)2R-gruppe; en -NHC(0)NHR-gruppe; en succinimidgruppe; en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe; og en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe som på fenylringen har fra 1 til 3 substituenter, valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, lavere alkoksy, klor og brom, hvor R og R<1> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl,
og hvor ytterligere C-enden av nevnte peptid eller peptid-mimetikum har formelen -C(0)R<2>, hvor R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydroksy, lavere alkoksy og -NR<3>R<4>, hvor R<3> og R<4> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor nitrogenatomet i NR<3>R<4->gruppen eventuelt kan være amingruppen i peptidets N-ende slik at det dannes et cyklisk peptid,
og fysiologisk akseptable salter derav.
I en utførelsesform av oppfinnelsen er forbindelsen kjennetegnet ved at aminosyresekvensen er dimerisert.
I en foretrukket utførelsesform er forbindelsen kjennetegnet ved at forbindelsen omfatter aminosyresekvensen
hvor X2 er T, X3 L, X4 er R, X5 er Q, X$er W og X7 er L. Mer foretrukket omfatter forbindelsen aminosyresekvensen
hvorX2 erT, X3 erL, X4 er R, X5 er E eller Q, Xe er W, X7 er L og Xg er en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene.
Særlig foretrukne forbindelser inkluderer:
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre forbindelse som binder til trombopoietinreseptorer, kjennetegnet ved at nevnte forbindelse er valgt fra gruppen bestående av
De her beskrevne forbindelsene er egnet til forebyggelse og behandling av sykdommer mediert av TPO, og særlig for behandling av hematologiske forstyrrelser, inklusivt, men ikke begrenset til, trombocytopeni som resultat av kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransfusjoner. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således også en farmasøy-tisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter forbindelsen ifølge krav 1, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer. En pasient med en lidelse som er følsom for behandling med en TPO-agonist kan følgelig administreres en farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse.
Disse farmasøytiske blandingene kan tilberedes i en rekke former, inklusivt perorale doseringsformer, så vel som inhalerbare pulvere og løsninger og injiserbare og infuserbare løsninger.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 A-B illustrerer resultatene av en funksjonstest i nærvær av forskjellige peptider. Testen er beskrevet i Eksempel 2. Figur IA er en grafisk fremstilling av resultatene av den TPO-R transfekterte Ba/F3-celleproliferasjonstest for utvalgte peptider ifølge oppfinnelsen:
Figur IB er en grafisk fremstilling av resultatene med de samme peptidene og den parentale cellelinje. Figur 2A-C viser resultatene av peptid-oligomerisering ved bruk av den TPO-R transfekterte Ba/F3-celleproliferasjonstest. Figur 2A viser resultatene av testen for det kompleksene biotinylerte peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) både for de transfekterte og parentale cellelinjer. Figur 2B viser resultatene av testen for det frie biotinylerte peptid (AF 12285) både for de transfekterte og parentale cellelinjer. Figur 2C viser resultatene av testen for kun streptavidin både for de transfekterte og parentale cellelinjer. Figur 3 A-G viser resultatene av en rekke kontrollforsøk som viser aktiviteten av TPO, peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, EPO, og EPO-R-bindende peptider i en celleproliferasjonstest, ved å benytte enten den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje, eller en EPO-avhengig cellelinje. Figur 3A viser resultatene for TPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3B viser resultatene for EPO i celleproliferasjons-testen ved å benytte den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3C viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) og en kompleksert form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF 11505 med SA) i den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje. Resultatene for de tilsvarende parentale cellelinjene er vist i Figur 3D. Figur 3E viser resultatene for TPO i celleproliferasjons-testen ved å benytte den EPO-avhengige cellelinje. Figur 3F viser resultatene for EPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den EPO-avhengige cellelinje. Figur 3G viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12885 med streptavidin (SA)) og den komplekserte form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF 11505 med SA) i den EPO-avhengige cellelinje. Figurene 4A-C illustrerer konstruksjonen av «peptider på plasmider» bibliotek i vektor pJS142. Figur 4A viser et restriksjonskart og genenes posisjon. Bibliotekplasmidet inkluderer mzZ?-trariskripsjonsterminatoren, Wa-genet som tillater seleksjon på ampicillin, M13-fag-intragen-regionen (Ml3 IG) som tillater opprettholdelse av enkeltkjedet DNA, et plasmid-replikasjonsorigo ( ori), to /acOj-sekvenser og arøC-genet som tillater positiv og negativ regulering av araS-promotoren som styrer ekspresjonen av /<2c-fusjonsgenet. Figur 4B viser sekvensen for kloningsregionen i 3'-enden av lac I genet, inklusivt Sfil- og Eagl-setene benyttet under bibliotek-konstruksjonen. Figur 4C viser ligeringen av de hybridiserte bibliotek-oligonukleotidene ON-829 og ON-830, til Sfil-seter av pJS142 for å frembringe et bibliotek. Enkeltstående åpninger i sekvensen antyder ligeringssteder. Figurene 5A-B illustrerer kloning i pELM3- og pELM15 MBP-vektorer. Figur 5A viser sekvensen i 3'-enden av ma/Æ-fusjonsgenet, inklusivt den MBP-kodende sekvens, polyasparagin-linkeren, faktor Xa-proteasespaltningssetet og de tilgjengelige kloningssetene. De øvrige deler av vektorene skriver seg fra pMALc2 (pELM3) og pMALp2 (pELM15) som er tilgjengelige fra New England Biolabs. Figur 5B viser sekvensen av vektorene etter overføring av BspEII-Scal bibliotek-fragmentet til Agel-Scal kuttet pELM3/pELM15. Den overførte sekvens innbefatter sekvensen som koder for GGG-peptid-linkeren fra pJS142 biblioteket. Figur 6A viser et restriksjonskart og posisjonen av genene for konstruksjon av «headpiece» dimer-bibliotek i vektor pCMG14. Bibliotekplasmidet inkluderer: rrnB-transkripsjonsterminatoren, 6/ogenet som tillater seleksjon på ampicillin, M13-fag-intragen-regionen (Ml 3 IG) for å opprettholde enkeltkjedet DNA, et plasmid-replikasjonsorigo ( ori), en /ac(9j-sekvens og araC- genet som muliggjør positiv og negativ regulering av den anjÆ-promotor som styrer ekspresjon av «headpiece» dimer-fusjonsgenet. Figur 6B viser sekvensen av den klonende region i 3'-enden av «headpiece» dimer-genet, inklusivt Sfil- og Eagl-setene benyttet under bibliotek-konstruksjonen. Figur 6C viser ligeringen av hybridiserte ON-1679, ON-829, og ON-830 til Sfil-seter av pCMG14 for fremstilling av et bibliotek. Enkeltstående åpninger i sekvensen indikerer ligeringssteder. Figurene 7 til 9 viser resultatene av ytterligere tester på aktiviteten av peptidene og peptid-mimetika ifølge oppfinnelsen. I denne test gjøres mus trombocytopene med karboplatin. Figur 7 viser typiske resultater når Balb/C-mus behandles med karboplatin (125 mg/kg intrapeirtonealt) på Dag 0. De stiplede linjene representerer ubehandlede dyr fra tre forsøk. Den opptrukne linje representerer karboplatin-behandlede grupper i tre forsøk. Den fete linjen representerer historiske data. Figur 8 viser effekten av karboplatin-titrering på blodplatetallet i mus behandlet med de angitte mengder karboplatin (i mg/kg, intraperitonealt (i.p.) på Dag 0). Figur 9 viser lindringen av karboplatin-indusert trombocytopeni på Dag 10 med peptidet AF12513 (513). Karboplatin (CBP; 50-125 mg/kg, intrapeirtonealt) ble administrert på Dag 0. AF12513 (1 mg/kg, i.p.) ble gitt på Dag 1-9.
BESKRIVELSE AV BESTEMTE UTFØRELSESFORMER
I. DEFINISJONER OG GENERELLE PARAMETERE
De etterfølgende definisjoner er angitt for å illustrere og definere meningen og rammen for forskjellige betegnelser benyttet for å beskrive foreliggende oppfinnelse.
«Agonist» refererer seg til en biologisk aktiv ligand som binder seg til dens komplementære biologisk aktive reseptor og aktiverer sistnevnte enten til å frembringe en biologisk respons i reseptoren eller til å forsterke allerede eksisterende biologisk aktivitet av reseptoren.
«Farmasøytisk akseptable salter» refererer seg til ugiftige alkalimetall-, jordalkali-metall- og ammoniumsalter som vanligvis benyttes innen den farmasøytiske industri, inklusivt natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, barium-, ammonium- og protamin sinksalter, som fremstilles etter velkjente fremgangsmåter. Betegnelsen innbefatter også ugiftige syreaddisjonssalter som generelt fremstilles ved å omsette forbindelsene ifølge oppfinnelsen med en egnet organisk eller uorganisk syre. Representative salter er bl.a. hydroklorid, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oksalat, valerat, oleat, laurat, borat, benzoat, laktat, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, napsylat og lignende.
«Farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt» refererer seg til salter som bibeholder den biologiske effektivitet og egenskapene til de frie basene og ikke er biologisk eller på annen måte uønskede, dannet med uorganiske syrer som saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende, samt organiske syrer som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyro-vinsyre, oksalsyre, eplesyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzoesyre, kanelsyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre og lignende. Angående en beskrivelse av farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter som prodrugs, se Bundgaard, H. supra.
«Farmasøytisk akseptabel ester» refererer seg til de estere som etter hydrolyse av esterbindingen, bibeholder den biologiske effektivitet og egenskapene til karboksylsyren eller alkoholen og ikke er uønsket biologisk eller på annen måte. Angående en beskrivelse av farmasøytisk akseptable estere som prodrugs, se Bundgaard, H., red. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse esterne dannes i alminnelighet av den tilsvarende karboksylsyre og en alkohol. Generelt kan esterdannelse oppnås gjennom konvensjonelle synteseteknikker. (Se f.eks. Maren, Advanced Organic Chemistry, 3. utg., John Wiley & Sons, New York (1985) s. 1157 og der angitte referanser, samt Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York
(1980)). Alkoholkomponenten av esteren vil i alminnelighet omfatte (i) en C2-C12 alifatisk alkohol som eventuelt kan inneholde én eller flere dobbeltbindinger og eventuelt kan inneholde forgrenede karboner eller (ii) en C7-C12 aromatisk eller heteroaromatisk alkohol. For denne oppfinnelse kan det også være aktuelt å benytte forbindelser som både er estere, slik som her beskrevet, og samtidig er de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav.
«Farmasøytisk akseptabelt amid» refererer seg til amider som etter hydrolyse av amidbindingen, bibeholder den biologiske effektivitet og egenskapene til karboksylsyren eller aminet, og som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket. Angående en beskrivelse av farmasøytisk akseptable amider som prodrugs, se Bundgaard, H., red. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse amidene dannes i alminnelighet fra den tilsvarende karboksylsyre og et amin. Generelt kan amid-dannelse skje ved hjelp av konvensjonell synteseteknikk. (Se f.eks. March, Advanced Organic Chemistry, 3. utg. John Wiley & Sons, New York (1985) s. 1152 og Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). For denne oppfinnelse kan det også være aktuelt å benytte forbindelser som både er amider, slik som her beskrevet, og samtidig utgjør farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav.
«Farmasøytisk eller terapeutisk akseptabel bærer» refererer seg til et bærermedium som ikke forstyrrer effektiviteten av den biologiske virkning av virkestoffet og som ikke er toksisk for verten eller pasienten.
«StereoisomeD> refererer seg til en kjemisk forbindelse som har den samme molekylvekt, kjemiske sammensetning og konstitusjon som en annen, men hvor atomene er annerledes gruppert. Det vil si at visse identiske kjemiske deler befinner seg i ulike orienteringer i rommet og derfor i ren tilstand har evnen til å dreie planet for polarisert lys. Enkelte rene stereoisomerer kan imidlertid ha en optisk dreining som er så svak at den ikke kan påvises med dagens instrumentering. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha ett eller flere asymmetriske karbonatomer og derfor innbefatte forskjellige stereoisomerer. Alle stereoisomerer faller inn under rammen for foreliggende oppfinnelse.
«Terapeutisk- eller farmasøytisk-effektiv mengde» anvendt på blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse, refererer seg til den mengde av blandingen som er tilstrekkelig til å indusere et ønsket biologisk resultat. Resultatet kan være å lette tegn, symptomer eller årsaker til en sykdom eller en hvilken som helst annen ønskelig endring av et biologisk system. For foreliggende oppfinnelse vil resultatet i alminnelighet innebære en nedsettelse av de immunologiske og/eller inflammatoriske responser på infeksjon eller vevsskade.
Aminosyrerester i peptider er forkortet som følger: fenylalanin er Phe eller F; Leucin er Leu eller L; Isoleucin er Ile eller I; Metionin er Met eller M; Valin er Val eller V; Serin er Ser eller S; Prolin er Pro eller P; Treonin er Thr eller T; Alanin er Ala eller A; Tyrosin er Tyr eller Y; Histidin er His eller H; Glutamin er Gin eller Q; Asparagin er Asn eller N; Lysin er Lys eller K; Asparaginsyre er Asp eller D; Glutaminsyre er Glu eller E; Cystein er Cys eller C; Tryptofan er Trp eller W; Arginin er Arg eller R; og Glycin er Gly eller G. Dessuten står Bu for butoksy, Bzl for benzyl, CHA for cykloheksylamin, Ac for acetyl, Me for metyl, Pen for penicillinamin, Aib for aminoisosmørsyre, Nva for norvalin, Abu for aminosmørsyre, Thi for tienylalanin, Obn for O-benzyl og hyp for hydroksyprolin.
I tillegg til peptider som kun består av naturlig forekommende aminosyrer, tilveie-bringes også peptid-mimetika eller peptidanaloger. Peptidanaloger er vanlig benyttet innen den farmasøytiske industri som ikke-peptid-medikamenter med egenskaper som er analoge med templat-peptidets. Disse typene av ikke-peptid-forbindelse betegnes «peptid-mimetika» eller «peptido-mimetika» (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber & Freidinger TINS s. 392 (1985); og Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Peptid-mimetika som har lignende struktur som terapeutisk anvendelige peptider, kan benyttes til å frembringe en tilsvarende eller forsterket terapeutisk eller profylaktisk effekt. I alminnelighet har peptid-mimetika en struktur som ligner et paradigme-polypeptid (dvs. et polypeptid som har en biologisk eller farmakologisk virkning), så som et naturlig forekommende reseptor-bindende polypeptid, men hvor én eller flere peptidkoblinger eventuelt er erstattet med en kobling valgt fra gruppen bestående av: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- ( cis og trans), -COCH2-,
-CH(OH)CH2-, og -CH2SO-, ved hjelp av kjente fremgangsmåter og som er ytterligere beskrevet i følgende referanser: Spatola, A.F. i Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, red. Marcel Dekker, New York, s. 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (mars, 1983) Bd. 1, utg. 3, Peptide Backbone Modifications (generell oversikt); Morley, Trends Pharm Sei. (1980), s. 463-468 (generell oversikt); Hudson D. et al., Int. J. Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al., Life Sei 38:1243-1249 (1986) (-CH2-S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314
(1982) (-CH=CH-, cis og trans) ; Almquist et al., J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)
(-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (-COCH2-); Szelke et al., Europeisk søknad EP 45665 CA (1982); 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (1983) (-C(OH)CH2-); og Hruby Life Sei 31:189-199
(1982) (-CH2-S-); som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. En særlig foretrukket ikke-peptidbinding er -CH2NH-. Slike peptid-mimetika kan ha vesentlige fordeler fremfor polypeptid-utførelsesformer, som for eksempel: mer økonomisk fremstilling, større kjemisk stabilitet, forbedrede farmakologiske egenskaper (halveringstid, absorpsjon, styrke, effektivitet, etc), endret spesifisitet (f.eks. et bredt spekter av biologiske virkninger), nedsatt antigenitet, m.m. Merking av peptid-mimetika involverer i alminnelighet kovalent tilkobling av én eller flere merkinger, direkte eller via en spacer (f.eks. en amidgruppe) til slike ikke-interfererende stillinger på peptid-mimetikumet som lar seg forutsi gjennom kvantitative struktur-akitvitetsdata og/eller molekyl-modellering. Slike ikke-interfererende stillinger er i alminnelighet stillinger som ikke danner direkte kontakter med makromolekylene (f.eks. molekyler av immunglobulin-superfamilien) som peptid-mimetikumet binder seg til for å frembringe den terapeutiske effekt. Derivatisering (f.eks. merking) av peptid-mimetika bør ikke interferere nevneverdig med peptid-mimetikumets farmakologiske aktivitet. I alminnelighet binder peptid-mimetika av reseptor-bindende peptider, seg med høy affinitet til reseptoren og har påvisbar biologisk virkning (dvs. er agonistisk eller antagonistisk til én eller flere reseptor-medierte fenotypiske endringer).
Systematisk erstatning av én eller flere aminosyrer i en konsensus-sekvens med en D-aminosyre av samme type (f.eks. D-lysin i stedet for L-lysin) kan benyttes for å frembringe mer stabile peptider. Dessuten kan det frembringes spente peptider som omfatter en konsensus-sekvens eller en i det vesentlige identisk konsensus-sekvensvariasjon ved hjelp av kjente fremgangsmåter (Rizo & Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992) som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse); for eksempel ved å addere interne cysteinrester som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som cykliserer peptidet.
Syntetiske eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer refererer seg til aminosyrer som ikke naturlig forekommer in vivo, men som ikke desto mindre kan inkorporeres i de her beskrevne peptidstrukturer. Foretrukne syntetiske aminosyrer er D-a-aminosyrer av naturlig forekommende L-ct-aminosyrer så vel som ikke-naturlig forekommende D- og L-a-aminosyrer representert ved formelen H2NCHR<5>COOH, hvor R<5> er 1) en lavere alkylgruppe, 2) en cykloalkylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, 3) en heterocyklus med fra 3 til 7 karbon-atomer og 1 til 2 heteroatomer valgt fra gruppen bestående av oksygen, svovel og nitrogen, 4) en aromatisk rest med fra 6 til 10 karbonatomer som på den aromatiske kjerne eventuelt har fra 1 til 3 substituenter valgt fra gruppen bestående av hydroksyl, lavere alkoksy, amino og karboksyl, 5) alkylen-Y hvor alkylen er en alkylengruppe med fra 1 til 7 karbon-atomer og Y er valgt fra gruppen bestående av (a) hydroksy, (b) amino, (c) cykloalkyl og cyklo-alkenyl med fra 3 til 7 karbonatomer, (d) aryl med fra 6 til 10 karbonatomer som på den aromatiske kjerne eventuelt har fra 1 til 3 substituenter valgt fra gruppen bestående av hydroksyl, lavere alkoksy, amino og karboksyl, (e) heterocyklus med fra 3 til 7 karbon-atomer og 1 til 2 heteroatomer valgt fra gruppen bestående av oksygen, svovel og nitrogen, (f) -C(0)R<2>, hvor R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, lavere alkyl, lavere alkoksy og -NR<3>R<4>, hvor R<3> og R<4> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, (g) -S(0)nR<6>, hvor n er et heltall fra 1 til 2 og R<6> er lavere alkyl, og med det forbehold at R<5> ikke utgjør en sidekjede av en naturlig forekommende aminosyre.
Andre foretrukne syntetiske aminosyrer er aminosyrer hvor aminogruppen er adskilt fra karboksylgruppen med mer enn ett karbonatom, så som p-alanin, y-aminosmørsyre og lignende.
Særlig foretrukne syntetiske aminosyrer innbefatter eksempelvis D-aminosyrene av naturlig forekommende L-aminosyrer, L-l-naftylalanin, L-2-naftylalanin, L-cykloheksyl-alanin, L-2-aminoisosmørsyre, sulfoksyd- og sulfon-derivatene av metionin (dvs. HOOC-(H2NCH)CH2CH2-S(0)„R<6>), hvor n og R<6> er som ovenfor definert, så vel som de lavere alkoksyderivatene av metionin (dvs. HOOC-(H2NCH)CH2CH2-OR<6>, hvor R<6> er som definert ovenfor).
«Påvisbar merking» refererer seg til materialer som når de kovalent kobles til peptidene og peptid-mimetikaene ifølge oppfinnelsen, muliggjør påvisning av peptidet og peptid-mimetikaene in vivo i vedkommende pasient som peptidet eller peptid-mimetikumet er administrert til. Slike påvisbare merkinger er velkjent på området og inkluderer for eksempel radioisotoper, fluorescerende merkinger (f.eks. fluorescein) og lignende. Den bestemte påvisbare merking som benyttes, er ikke av avgjørende betydning og velges ut fra den mengde av merking som kan benyttes, så vel som av merkingens toksisitet i de merkingsmengder som anvendes. Valget av merking i forhold til slike faktorer er velkjent på området.
Kovalent tilkobling av den påvisbare merking til peptidet eller peptid-mimetikumet oppnås ved hjelp av velkjente konvensjonelle metoder. Når for eksempel ,25I-radioisotopen benyttes som den påvisbare merking, kan kovalent tilkobling av <12>SI til peptidet eller peptid-mimetikumet, oppnås ved å inkorporere aminosyren tyrosin i peptidet eller peptid-mimetikumet, og deretter jodere peptidet. Dersom tyrosin ikke forekommer i peptidet eller peptid-mimetikumet, kan inkorporering av tyrosin i N- eller C-enden av peptidet eller peptid-mimetikumet oppnås ved hjelp av velkjent kjemi. Likeledes kan <32>P inkorporeres i peptidet eller peptid-mimetikumet som en fosfatdel, for eksempel gjennom en hydroksyl-gruppe på peptidet eller peptid-mimetikumet, ved å benytte konvensjonell kjemisk teknikk.
II. OVERSIKT
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som binder seg til og aktiverer TPO-R eller som på annen måte oppfører seg som en TPO-agonist. Disse forbindelsene innbefatter «leder»-peptidforbindelser og «derivat»-forbindelser som er slik konstruert at de har den samme eller lignende molekylstruktur eller form som lederforbindelsene, men som adskiller seg fra lederforbindelsene enten med hensyn til følsomhet for hydrolyse eller proteolyse og/eller med hensyn til andre biologiske egenskaper, som f.eks. øket affinitet for reseptoren. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også blandinger som omfatter en effektiv mengde av en TPO-agonist, og særlig en forbindelse som er egnet for behandling av hematologiske forstyrrelser, og spesielt trombocytopeni assosiert med kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransfusjoner.
III. IDENTIFISERING AV TPO-AGONISTER
Peptider som har bindingsaffinitet for TPO-R kan lett identifiseres ved hjelp av systemer som utvikler tilfeldig peptid-diversitet koblet med en affinitets-anrikningsprosess.
Nærmere bestemt innbefatter systemene som frembringer tilfeldig peptid-diversitet det «peptider på plasmider» system som er beskrevet i US-patent 5.270.170 og 5.338.665; systemet «peptider på fag» beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/718.577, av 20. juni, 1991 som er en CIP av US-patentsøknad serie nr. 07/541.108, av 20. juni, 1990 og i Cwirla et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1980); det «polysome system» som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/300.262, av 2. september, 1994 som er en CIP-søknad basert på US-patentsøknad serie nr. 08/144.775, av 29. oktober, 1993 og
PCT W095/11992; det «encoded synthetic library (ESL)» system som er beskrevet i US-patentsøkand serie nr. 08/146.886, av 12. november, 1993 som er en CIP-søknad av US-patentsøknad serie nr. 07/946.239, av 16. september, 1992 som er en CIP-søknad av US-patentsøknad serie nr. 07/762.522, av 18. september, 1991 og det« very large scale immobilized polymer synthesis» system som er beskrevet i US-patent 5.143.854;
PCT patentpublikasjon nr. 90/15070 av 13. desember, 1990; US-patentsøknad serie
nr. 07/624.120, av 6. desember, 1990; Fodor et al., Science 251:767-773 (2/1991),
Dower & Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180 (1991); og US-patentsøknad serie
nr. 805.727, av 6. desember, 1991.
Ved å benytte de her beskrevne fremgangsmåter ble det konstruert tilfeldige peptider med et definert antall aminosyrerester (f.eks. 12). For å frembringe samlingen av oligonukleotider som koder for de tilfeldige peptidene, ble kodonmotivet (NNK)x, hvor N er nukleotid A, C, G eller T (ekvimolar; avhengig av den valgte metodikk kan det benyttes andre nukleotider), K er G eller T (ekvimolart) og x er et heltall tilsvarende antall aminosyrer i peptidet (f.eks. 12) for å angi en hvilken som helst av de 32 kodoner som er mulig ut fra NNK-motivet: 1 for hver av 12 aminosyrer, 2 for hver av 5 aminosyrer, 3 for hver av 3 aminosyrer og kun én av de tre stoppkodonene. NNK-motivet koder således for alle aminosyrene, koder bare for ett stoppkodon og reduserer kodon-skjevhet.
I de anvendte systemene ble de tilfeldige peptidene presentert enten på fag-partikkelens overflate, som del av et fusjonsprotein som omfattet enten pEQ- eller pVIII-kappeproteinet til et fag fd-derivat (peptider på fag) eller som et fusjonsprotein med Lacl-peptid-fusjonsproteinet bundet til et plasmid (peptider på plasmider).
De fag eller plasmider, inklusivt DNA som koder for peptidene, ble identifisert og isolert ved hjelp av en affinitets-anrikningsprosess ved å benytte immobilisert TPO-R. Affinitets-anrikningsprosessen, enkelte ganger betegnet «panning» involverer flere runder med inkubering av fagen, plasmidene eller polysomene, med den immobiliserte reseptor, oppsamling av fagen, plasmidene eller polysomene som binder seg til reseptoren (sammen med den tilhørende DNA eller mRNA) og danner mer av den oppsamlede fag eller plasmidene (sammen med det ledsagende Lacl-peptid-fusjonsprotein). Det ekstracellulære domenet (ECD) av TPO-R ble i alminnelighet benyttet under utvaskingen.
Etter flere runder affinitets-anrikning ble fagen eller plasmidene og de ledsagende peptider undersøkt ved ELISA for å bestemme hvorvidt peptidene bandt seg spesifikt til TPO-R. Denne testen ble foretatt på lignende måte som de fremgangsmåter som ble benyttet i affinitets-anrikningsprosessen, bortsett fra at brønnene, etter fjerning av ubundet fag, i alminnelighet ble behandlet med kanin-anti-fag-antistoff, deretter med alkalisk fosfatase-(AP)-konjugert geit-anti-kanin-antistoff. Mengden av alkalisk fosfatase i hver brønn ble bestemt ved hjelp av standardmetoder. En tilsvarende ELISA for bruk for peptider på plasmider systemet er detaljert beskrevet nedenfor.
Ved å sammenligne testbrønner med kontrollbrønner (ingen reseptor) kan man bestemme hvorvidt fusjonsproteinet binder seg spesifikt til reseptoren. De fag-ansamlinger som viste seg å binde til TPO-R, ble underkastet screening etter et format for koloni-avtrykk («colony lift») probing ved å benytte radioaktivt merket monovalent reseptor. Denne probe kan fremstilles ved å benytte proteinkinase A til å fosforylere en kemptide-sekvens fusjonert til C-enden av den løselig reseptor. Den «manipulerte» form av TPO-reseptoren uttrykkes deretter i vertsceller, i alminnelighet CHO-celler. Etter PI-PLC-høsting av reseptorene ble reseptoren testet på binding til TPO eller TPO-R-spesifikke fag-kloner. Reseptoren ble deretter merket for høy spesifikk aktivitet med <33>P for bruk som en monovalent probe for identifisering av høy-affinitets ligander ved å benytte koloni-avtrykk.
Peptider som viste seg å binde spesifikt til reseptoren, ble deretter syntetisert som det frie peptid (f.eks. ingen fag) og testet i en blokkeringstest. Blokkerings-testen ble foretatt på lignende måte som ELISA, bortsett fra at brønnene ble tilsatt TPO eller et referanse-peptid før fusjonsproteinet (kontrollbrønnene var av to typer: (1) ingen reseptor og (2) intet TPO eller referansepeptid). Fusjonsproteiner hvis bindingen til reseptoren var blokkert av TPO eller referansepeptidet, inneholder peptider i den tilfeldige peptiddel som er foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen.
TPO-R, så vel som dets ekstracellulære domene, ble produsert i rekombinante vertsceller. En anvendelig form av TPO-R konstrueres ved å uttrykke proteinet som et løselig protein i baculovirus-transformerte vertsceller ved å benytte standardmetoder. En annen anvendelig form konstrueres med et signalpeptid for proteinsekresjon og for glykofosfo-lipidmembran-forankring. Denne form for forankring kalles «PIG tailing». Se Caras & Wendell Science 243:1196-1198 (1989) og Lin et al. Science 249:677-679 (1990).
Ved å benytte PIG-tailing systemet kan man spalte reseptoren fra overflaten av cellene som uttrykker reseptoren (f.eks. transformerte CHO-celler selektert med henblikk på høynivå-ekspresjon av reseptor med en celle-sorterer) med fosfolipase C. Den avspaltede reseptor omfatter fremdeles en karboksyterminal sekvens av aminosyrer, betegnet «HPAP-tail», fra signalproteinet for membran-tilkobling og kan immobiliseres uten ytterligere rensing. Det rekombinante reseptorprotein kan immobiliseres ved å belegge veggene av mikrotiterplatene med et anti-HPAP-hale-antistoff (Ab 179 eller MAb 179), blokkere uspesifikk binding med bovint serumalbumin (BSA) i PBS og deretter binde avspaltet rekombinant reseptor til antistoffet. Ved bruk av denne fremgangsmåte bør man foreta immobiliserings-reaksjonen i varierende reseptorkonsentrasjoner for å bestemme den optimale mengde for et gitt preparat, siden ulike preparater av rekombinante proteiner ofte inneholder forskjellige mengder av det ønskede protein. Dessuten bør man forsikre seg om at det immobiliserende antistoff er fullstendig blokkert (med TPO eller annen blokkerende forbindelse) under affinitets-anrikningsprosessen. Om ikke, kan ublokkert antistoff binde uønskede fag under affinitets-anrikningsprosessen. Man kan benytte peptider som binder seg til det immobliiserende antistoff for å blokkere ubundne steder som er igjen etter reseptor-immobilisering for å unngå dette problem, eller man kan simpelthen immobilisere reseptoren direkte til veggene av mikrotiterplatene uten hjelp av noe immobiliserende antistoff. Se US-patentsøknad serie nr. 07/947.339, av 18. september, 1992, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Når det benyttes systemer for tilfeldig peptid-generering som muliggjør multivalent ligand/reseptor-interaksjon, skal det bemerkes at tettheten av den immobiliserte reseptor er en viktig faktor ved bestemmelse av affiniteten av de ligander som kan binde seg til den immobiliserte reseptor. Ved høyere reseptor-tettheter (f.eks. hver anti-reseptor-antistoff-dekkede brønn behandlet med 0,25 til 0,5 mg reseptor) er det mer sannsynlig at det inntrer multivalent binding enn ved lavere reseptor-tettheter (f.eks. hver anti-reseptor-antistoff-dekkede brønn behandlet med 0,5 til 1 ng av reseptoren). Dersom multivalent binding inntrer, vil man mer sannsynlig isolere ligander med relativt lav affinitet, med mindre man benytter høye tettheter av immobilisert reseptor for å identifisere lederforbindelser og benytte lavere reseptor-tettheter for å isolere derivat-forbindelser med høyere affinitet.
For å skjelne mellom peptider med høyere affinitet benyttes ofte en monovalent reseptor-probe. Denne probe kan fremstilles ved å benytte proteinkinase A for å fosforylere en kemptide-sekvens fusjonert til C-enden av den løselige reseptor. Den «manipulerte» form av TPO-reseptoren uttrykkes deretter i vertsceller, i alminnelighet CHO-celler. Etter PI-PLC-høsting av reseptorene testes reseptoren for binding til TPO eller TPO-R spesifikke fag-kloner. Reseptoren merkes deretter for å gi høy spesifikk aktivitet med <33>P for bruk som en monovalent probe for å identifisere høy-affinitetsligander under bruk av koloni-avtrykk.
Foretrukne screeningmetoder for å lette identifiseringen av peptider som binder TPO-R involverer identifisering av lederpeptider som binder seg til reseptorens ekstracellulære domene, hvoretter andre peptider som ligner lederpeptidene, fremstilles. Nærmere bestemt kan et tilfeldig bibliotek ved å benytte pill- eller pVIII-baserte peptider på et fag-system, underkastes screening for å oppdage en fag som presenterer et peptid som binder seg til TPO-R. Fag-DNA sekvenseres for å bestemme sekvensene av de peptidene som opptrer på fagens overflate.
Kloner som er i stand til spesifikt å binde seg til TPO-R, ble identifisert fra et tilfeldig lineært 10-mer pVIII-bibliotek og tilfeldige cykliske 10-mer og 12-mer pVIII-bibliotek. Disse peptidenes sekvenser tjener som basis for konstruksjonen av andre peptid-biblioteker beregnet på å inneholde en høy frekvens av derivater av de først identifiserte peptider. Disse bibliotekene kan syntetiseres slik at de favoriserer produksjonen av peptider som adskiller seg fra bindingspeptidet i kun noen få rester. Denne fremgangsmåte involverer syntese av et oligonukleotid med det bindende peptids kodende sekvens, bortsett fra at man fremfor å benytte rene preparater av hver av de fire nukleosid-tirfosfatene i syntesen, benytter blandinger av de fire nukleosid-tirfosfatene (dvs. 55% av det «korrekte» nukleotid og 15% hver av de øvrige tre nukleotidene er en foretrukket blanding for dette formål, og 70% av det «korrekte» nukleotid og 10% av hver av de øvrige tre nukleotidene er en annen foretrukket blanding for formålet) slik at det frembringes derivater av det bindende peptids kodende sekvens.
Det har vært benyttet flere strategier for å derivatisere lederpeptidene ved å fremstille «mutagenese over et tema» bibliotek. Blant disse er et pVIII-fagemid mutagenese-bibliotek basert på konsensussekvensen mutagenisert med frekvensen 70:10:10:10 og forlenget i hver ende med tilfeldige rester for å produsere kloner som koder for sekvensen XXXX (C, S, P eller R) TLREWL XXXXXX (C eller S). Et lignende urvidet/mutagenisert bibliotek ble konstruert ved å benytte peptider-på-plasmider systemet for å produsere kloner som koder for sekvensen XXXXX (C, S, P eller R) TLREWL XXXXXXX. Et ytterligere utvidet/mutagenisert bibliotek, XXXX (C, S, P eller R) TLREWL XXXXXX (C eller S), ble konstruert ved å benytte polysom-display systemet. Alle tre bibliotekene ble underkastet screening med peptid-eluering og probe-undersøkt med radioaktivt merket monovalent reseptor.
Teknikkene «peptider på plasmider» ble også benyttet for peptid-screening og mutagenese-undersøkelser og er beskrevet mer detaljert i US-patent 5.338.665, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. I henhold til denne fremgangsmåte fusjoneres tilfeldige peptider til C-enden av LacI gjennom ekspresjon fra en plasmid-vektor som bærer fusjonsgenet. Kobling av Lacl-pepudfusjonen til dens kodende DNA skjer via /acØ-sekvensene på plasmidet under dannelse av et stabilt peptid-LacI-plasmidkompleks som kan underkastes screening ved affinitetsanrikning (panning) på en immobilisert reseptor. De således isolerte plasmidene kan deretter føres inn igjen i E. coli ved elektroporering for å amplifisere den selekterte populasjon i ytterligere screening-runder eller for undersøkelse av individuelle kloner.
I tillegg ble det foretatt tilfeldig peptid-screening og mutagenese-undersøkelser ved å benytte et modifisert C-terminalt Lac-I display-system, hvor display-valensiteten var redusert («headpiece dimer» display-system). Bibliotekene ble underkastet screening og de resulterende DNA-innskuddene ble samlet klonet inn i en maltose-bindende protein-(MBP)-vektor som muliggjorde deres ekspresjon som et C-terminalt fusjonsprotein. Rå cellelysater fra tilfeldig plukkede individuelle MBP-fusjonskloner ble deretter testet på TPO-R-binding ved hjelp av ELISA, slik som omtalt ovenfor.
Det ble også foretatt peptid-mutagenese-studier ved å benytte polysom-display systemet som beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknad serie nr. 08/300.262, av 2. september, 1994 som er en CIP basert på US-patentsøknad serie nr. 08/144.775, av 29. oktober, 1993 og PCT WO 95/11992, som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Et mutagenese-bibliotek ble konstruert på basis av sekvensen X X X X (C, P, R eller S),tlreflXXXXXX(C eller S), hvor X representerer et tilfeldig NNK-kodon og de små bokstavene representerer aminosyrekodoner som inneholder 70:10:10:10 mutagenese i posisjonene 1 og 2 og K (G eller T) i kodonets posisjon 3. Biblioteket ble affinitetsanriket (panned) i fem runder mot TPO-reseptor som var blitt immobilisert på magnetiske kuler. Etter den femte runden ble den PCR-ampliflserte samling klonet inn i pAFF6 og de ELISA-positive klonene sekvensert. Sekvensene ble subklonet inn i en MBP-vektor og deres bindingsaffiniteter ble bestemt ved en MBP ELISA.
For å immobilisere TPO-R for polysom-screening ble Ab 179 først kjemisk konjugert til tosyl-aktiverte magnetkuler (tilgjengelige fra Dynal Corporation) som beskrevet av produsenten. Kulene ble inkubert med antistoff i 0,5 M boratbuffer (pH 9,5) ved romtemperatur over natten. Kulene ble vasket og kombinert med TPO-R som inneholdt . «HPAP»-halen. De antistoff-dekkede kulene og reseptoren ble inkubert i 1 time ved 4°C, hvorpå kulene på nytt ble vasket før tilsetning av polysom-biblioteket.
En screening av de forskjellige ovenfor beskrevne bibliotek førte til de TPO-reseptor-bindende peptider som er vist i Tabell 1 og 2 nedenfor foruten andre som ikke er angitt.
IC50-verdier for enkelte andre representative peptider er angitt i tabellen nedenfor. Det kan benyttes flere metoder for å vurdere ICS0-verdier. For eksempel ble det benyttet en likevekts-bindende ELISA-test ved enten å benytte MBP-TPO eller iacl-peptid tracer, for å bestemme hvorvidt peptidene inhiberer bindingen av TPO til det ekstracellulære domenet av TPO-reseptoren. IC5ø-verdien ble i alminnelighet bestemt ved å benytte det frie peptidet. ICso-verdien kan bestemmes ved å benytte det frie peptid som eventuelt kan amideres C-terminalt eller kan fremstilles som en ester eller et annet karboksyamid.
For å gjenopprette den eksakte sekvens som oppvises på fagen, innledes de N-terminale og C-terminale aminosyrene av de syntetiske peptidene ofte med én eller to glycinrester. Disse glycinrestene antas ikke å være nødvendige for binding eller aktivitet. For å etterligne den eksakte sekvens av peptider oppvist på polysomer, innledes likeledes de C-terminale aminosyrer av de syntetiske peptidene ofte av sekvensen MAS. Denne sekvens antas heller ikke her å være nødvendig for binding eller aktivitet.
ICso-verdier er angitt symbolsk gjennom symbolene «-«, «+» og «++». Peptider som oppviste ICso-verdier på mer enn 200 uM er for eksempel angitt med «-«. Peptider som ga ICso-verdier på mindre enn eller lik 200 uM er betegnet«+», mens de som ga ICso-verdier på 500 nm eller mindre, er angitt med «++». Peptider som ga ICso-verdier på eller nær grensen for et bestemt symbol, er angitt med en mellombetegnelse, f.eks. «+/-«. Peptider hvor ICso-verdier ikke ble bestemt, er angitt som «N.D.». ICso-verdier for peptider med strukturen: G GCTLREWLHGGFCGGvar 500 nm eller mindre. (Det skal bemerkes at de N-terminale og C-terminale aminosyrene ble innledet med to glycinrester for å gjenopprette den eksakte sekvens som oppvises av fagen. Disse glycinrestene antas ikke å være nødvendige for binding eller aktivitet).
Peptider og peptid-mimetika med en ICso-verdi på mer enn ca. 100 mM mangler tilstrekkelig binding til at de kan benyttes for de diagnostiske eller for de terapeutiske aspektene ved denne oppfinnelse. For diagnostiske formål har peptidene og peptid-mimetikaene en ICso-verdi på ca. 2 mM eller mindre, og for farmasøytiske formål har peptidene og peptid-mimetikaene en ICso-verdi på ca. 100 uM eller mindre.
Den bindende peptidsekvens gir også muligheter for å bestemme minimums-størrelsen av en TPOR-bindende forbindelse ifølge oppfinnelsen. Ved å benytte ESL-(«encoded synthetic library») systemet eller «very large scale immobilized polymer synthesis» systemet kan man ikke bare bestemme minimumsstørrelsen av et peptid med slik aktivitet, men man kan også fremstille alle peptider som danner den peptidgruppe som adskiller seg fra det foretrukne motiv (eller minimumsstørrelsen av vedkommende motiv) i én, to eller flere rester. Denne peptidsamling kan deretter underkastes screening med henblikk på evne til binding til en TPO-reseptor. Disse immobiliserte polymer-syntese-systemene eller andre peptid-syntesemetoder, kan også benyttes for å syntetisere trunkeringsanaloger, delesjonsanaloger, substitusjonsanaloger og kombinasjoner derav, av alle peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen.
Forbindelsen og peptid-mimetikaene ifølge foreliggende oppfinnelse ble også vurdert gjenom en trombopoietin-avhengig celleproliferasjonstest, som mer detaljert beskrevet i Eksempel 2 nedenfor. Celleproliferasjon måles ved hjelp av kjente teknikker, så som en MTT-test som korrelerer med <3>H-tymidin-inkorporering som en indikasjon på celleproliferasjon (se Mossmann, J. Immunol. Methods 65:55 (1983)). De undersøkte peptidene stimulerte som det fremgår av Figur IA, proliferasjon av TPO-R transfekterte Ba/F3-celler på en dose-avhengig måte. Disse peptidene har som det fremgår av Figur IB, ingen effekt på den parentale cellelinje. Figurene 7 til 9 viser resultatene av en ytterligere test som evaluerer aktiviteten av peptidene og peptid-mimetikaene ifølge oppfinnelsen. Ved denne test gjøres mus trombocytopene med karboplatin. Figur 7 viser typiske resultater når Balb/C mus behandles med karboplatin (125 mg/kg intraperitonealt) på Dag 0. De stiplede linjene representerer ubehandlede dyr fra tre forsøk. De fullt opptrukne linjene representerer karboplatin-behandlede grupper i tre forsøk. Den fete fullt opptrukne linje representerer historisk edata. Figur 8 viser effekten av karboplatin-titrering på platetallene fra mus behandlet med de angitte mengder karboplatin (i mg/kg, intraperitonealt (i.p.) på Dag 0). Figur 9 viser lindringen av karboplatin-indusert trombocytopeni på Dag 10 med peptid AF 12513 (513). Karboplatin (CBP; 50-125 mg/kg, intraperitonealt) ble administrert på Dag 0. AF 12513 (1 mg/kg, i.p.) ble gitt på Dagene 1-9. Disse resultatene viser at peptidene ifølge oppfinnelsen kan lindre trombocytopeni i en musemodell.
Dessuten kan enkelte forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse dimeriseres eller oligomeriseres, hvorved affiniteten og/eller aktiviteten av forbindelsene økes. For å undersøke hvilken effekt peptid-dimerisering/oligomerisering har på TPO-mimetisk styrke i celleproliferasjonstester, ble det syntetisert en C-terminalt biotinylert analog av peptidet G G
CADGPTLREWISFCGG(GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin)).
Peptidet ble preinkubert med streptavidin i serum-fritt HEPES-buffret RPMI i molforholdet 4:1. Komplekset ble testet med henblikk på stimulering av celleproliferasjon av TPO-R transfekterte Ba/F3 celler, som ovenfor, sammen med fritt biotinylert peptid og det ubiotinylerte parentale peptid. Figur 2A viser resultatene av testen for det komplekserte biotinylerte peptid (AF12885 med streptavidin (SA)) både for den transfekterte og den parentale cellelinje. Figur 2B viser resultatene av testen for det frie biotinylerte peptid (AF 12285) både for den transfekterte og den parentale cellelinje. Figur 2C viser resultatene av testen for bare streptavidin både for den transfekterte og den parentale cellelinje. Disse figurene illustrerer at det forut dannede kompleks var ca. 10 ganger sterkercenn det frie peptid.
Spesifisiteten av bindingen og aktiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble også undersøkt ved å studere peptidenes kryssreaktivitet overfor erytropoietin-reseptoren (EPO-R). EPO-R er også medlem av hematopoietin-vekstfaktor-reseptorfamilien i likhet med TPO-R. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, så vel som TPO, EPO og et kjent EPO-bindende peptid, ble undersøkt i en celleproliferasjons-test ved å benytte en EPO-avhengig cellelinje. Denne testen gjorde bruk av FDCP-1, en vekstfaktor-avhengig murin multi-potensiell primitiv hematopoietisk progenitorcellelinje (se f.eks. Dexter et al., J. Exp. Med. 152:1036-1047 (1981)) som den parentale cellelinje. Denne cellelinjen kan proliferere, men ikke differensiere, når den suppleres med WEHI-3-kondisjonert medium (et medium som inneholder IL-3, ATCC nummer T1B68). Den parentale cellelinje transfekteres med human eller murin EPO-R for å produsere FDCP-1-EPO-R-cellelinjen. Disse transfekterte cellelinjene kan proliferere, men ikke differensiere, i nærvær av human eller murin EPO.
Cellene ble dyrket halv-veis til stasjonær tetthet i nærvær av de nødvendige vekstfaktorer. Cellene ble deretter vasket i PBS og sultet i 16-24 timer i komplett medium uten vekstfaktorer. Etter bestemmelse av cellenes levedyktighet, ble det fremstillet stamløsninger (i komplett medium uten vekstfaktorene) for å oppnå ca. 10<5> celler per 50 mikroliter. Seriefortynninger av forbindelsene (i alminnelighet peptidet i den frie løsningsfase i motsetning til et fag-bundet eller på annen måte bundet eller immobilisert peptid) som skulle testes, ble fremstillet i 96 brønns vevskulturplater i et sluttvolum på
50 mikroliter per brønn. Celler (50 mikroliter) ble tilsatt til hver brønn og cellene inkubert i 24-48 timer, tidspunktet hvor negative kontroller burde dø eller være tause. Celleproliferasjonen ble deretter målt ved hjelp av kjente teknikker, så som en MTT-test.
Figurene 3 A-G viser resultatene av en rekke kontrollforsøk som viser aktiviteten av TPO, peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, EPO og EPO-R-bindende peptider i en celleproliferasjonstest ved å benytte enten den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje, eller en EPO-avhengig cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3A viser resultatene for TPO i celleproliferasjonstesten ved bruk av den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3B viser resultatene for EPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3C viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) og en kompleksert form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF11505 med SA) i den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje. Resultatene for den tilsvarende parentale cellelinje er vist i Figur 3D. Figur 3E viser resultatene for TPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den
EPO-avhengige cellelinje. Figur 3F viser resultatene for EPO i celleproliferasjons-testen ved bruk av den EPO-avhengige cellelinje. Figur 3G viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) og den komplekserte form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF11505 med SA) i den EPO-avhengige cellelinje. Disse resultatene viser at peptidene ifølge oppfinnelsen binder og aktiverer TPO-R med en høy grad av spesifisitetsgrad.
IV. FREMSTILLING AV PEPTIDER OG PEPTID-MIMETIKA
A. FASTFASE-SYNTESE
Peptidene og forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles etter kjente klassiske metoder, for eksempel ved å benytte standard fastfase-teknikk. Standardmetodene innbefatter eksklusiv fastfase-syntese, partielle fastfase-syntesemetoder, fragment-kondensasjon, klassisk syntese i løsning og endog rekombinant DNA-teknikk. Se f.eks. Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. På fastfase innledes syntesen i alminnelighet fra peptidets C-terminale ende ved å benytte en alfa-amino-beskyttet harpiks. Et passende utgangsmateriale kan for eksempel fremstilles ved å feste den nødvendige alfa-aminosyre til en klor-metylert harpiks, en hydroksymetyl-harpiks eller en benzhydrylamin-harpiks. En slik klormetylert harpiks omsettes under handelsnavnet BIO-BEADS SX-1 av Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, og fremstillingen av hydroksymetyl-harpiksen er beskrevet av Bodonszky et al., Chem. Ind. (London) 38:1597 (1966). Benzhydrylamin- (BHA) harpiks er beskrevet av Pietta & Marshall, Chem. Commun., 650 (1970) og er kommersielt tilgjengelig fra Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, i hydrokloirdformen.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan således fremstilles ved å koble en alfa-amino-beskyttet aminosyre til den klormetylerte harpiks, eksempelvis ved hjelp av cesium-bikarbonat-katalysator, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Gisin Heiv. Chim. Acta. 56:1467 (1973). Etter den første kobling fjernes alfa-amino-beskyttelsesgruppen ved hjelp av et utvalg av reagenser som inkluderer trifluoreddiksyre- (TFA) eller hydrogenklorid-(HCl)-løsninger i organiske løsningsmidler ved romtemperatur.
Alfa-amino-beskyttelsesgruppene er slike som på dette området har vist seg egnet for trinnvis syntese av peptider. Disse innbefatter beskyttelsesgrupper av acetyltype (f.eks. formyl, trifluoracetyl, acetyl), beskyttelsesgrupper av aromatisk uretantype (f.eks. benzyloksykarbonyl (Cbz) og substituert Cbz), alifatiske uretan-beskyttelsesgrupper (f.eks. t-butyloksykarbonyl (Boe), isopropyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og beskyttelsesgrupper av alkyltype (f.eks. benzyl, trifenylmetyl). Boe- og Fmoc er foretrukne beskyttelsesgrupper. Beskyttelsesgruppen for sidekjeden forblir intakt under koblingen og avspaltes ikke under avbeskyttelsen av den amino-terminale beskyttelsesgruppe eller under kobling. Den sidekjede-beskyttende gruppe må kunne fjernes etter fullført syntese av det endelige peptid og under reaksjonsbetingelser som ikke vil endre det tilsiktede peptid.
De sidekjede-beskyttende grupper for Tyr innbefatter tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz og 2,5-diklorbenzyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Asp innbefatter benzyl, 2,6-diklorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Thr og Ser innbefatter acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz. Den sidekjede-beskyttende gruppe for Thr og Ser er benzyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Arg innbefatter nitro, tosyl (Tos), Cbz, adamantyloksykarbonyl, mesitoylsulfonyl (Mts) eller Boe. De sidekjede-beskyttende grupper for Lys innbefatter Cbz, 2-klorbenzyloksykarbonyl (2-Cl-Cbz), 2-brombenzyloksy-karbonyl (2-Br-Cbz), Tos eller Boe.
Etter fjerning av den alfa-amino-beskyttende gruppe, kobles de gjenværende beskyttede aminosyrer trinnvis i den ønskede rekkefølge. Det benyttes i alminnelighet et overskudd av hver beskyttet aminosyre sammen med en passende karboksylgruppe-aktivator, som f.eks. dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i løsning, for eksempel i metylenklorid- (CH2CI2), dimetylformamid- (DMF)-blandinger.
Etter at den ønskede aminosyresekvens er ferdig, frakobles det ønskede peptid fra bærer-harpiksen ved behandling med et reagens som f.eks. trifluoreddiksyre eller hydrogenfluorid (HF), som ikke bare spalter peptidet fra harpiksen, men også spalter alle øvrige sidekjede-beskyttende grupper. Når den klormetylerte harpiks benyttes resulterer hydrogenfluorid-behandling i dannelse av de frie peptidsyrene. Når benzhydrylamin-harpiks benyttes resulterer hydrogenfluorid-behandling direkte i det frie peptidamid. Når som et alternativ, den klormetylerte harpiks benyttes, kan det sidekjede-beskyttede peptid frakobles ved behandling av peptidharpiksen med ammoniakk for å gi det ønskede sidekjede-beskyttede amid, eller med et alkylamin for å gi et sidekjede-beskyttet alkylamid eller dialkylamid. Sidekjede-beskyttelsen fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amidene, alkylamidene eller dialkylamidene.
Disse fremgangsmåtene for fastfase-peptidsyntese er velkjent på området og er ytterligere beskrevet i Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San 'Francisco, (1969)).
Ved å benytte det «encoded synthetic library» eller «very large scale immobilized polymer synthesis» system beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/492.462, av 7. mars, 1990; 07/624.120, av 6. desember, 1990 og 07/805.727, av 6. desember, 1991, kan man ikke bare bestemme minimumsstørrelsen av et peptid med den ønskede aktivitet, men man kan også fremstille alle de peptider som danner den gruppe av peptider som adskiller seg fra det foretrukne motiv (eller minimumsstørrelsen av vedkommende motiv) med hensyn til én, to eller flere rester. Denne samling av peptider kan deretter underkastes screening på evnen til å binde til TPO-R. Dette immobiliserte polymer-syntesesystem eller andre peptidsyntese-metoder kan også benyttes for å syntetisere trunkeringsanaloger og delesjons-analoger, samt kombinasjoner av trunkerings- og delesjons-analoger av alle peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen.
B. SYNTETISKE AMINOSYRER
Disse fremgangsmåtene kan også benyttes til å syntetisere peptider hvor andre aminosyrer enn de 20 naturlig forekommende, genetisk kodede aminosyrene, er substituert i én, to eller flere posisjoner i en hvilken som helst av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan naftylalanin erstatte tryptofan, hvilket letter syntesen. Andre syntetiske aminosyrer som kan substitueres inn i peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er bl.a. L-hydroksypropyl, L-3,4-dihydroksyfenylalanyl, d-aminosyrer som L-d-hydroksylysyl og D-d-metylalanyl, L-a-metylalanyl, p-aminosyrer og isokinolyl. D-aminosyrer og ikke-naturlig forekommende syntetiske aminosyrer kan også inkorporeres i peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Man kan også erstatte de naturlig forekommende sidekjeder i de 20 genetisk kodede aminosyrerne (eller D-aminosyrene) med andre sidekjeder, for eksempel med grupper som alkyl, lavere alkyl, cyklisk 4-, 5-, 6- og 7-leddet alkyl, amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy, karboksy og de lavere ester-derivater derav, samt med 4-, 5-, 6- og 7-leddede heterocykler. Særlig kan det benyttes prolin-analoger, hvor ringstørrelsen av prolinresten er endret fra 5 ledd til 4,6 eller 7 ledd. Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og innettede grupper være aromatiske eller ikke-aromatiske.
Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og de umettede være aromatiske eller ikke-aromatiske. Heterocykliske grupper inneholder fortrinnsvis ett eller flere nitrogen-, oksygen- og/eller svovel-heteroatomer. Eksempler på slike grupper er furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, isotiazolyl, isoksazolyl, morfolinyl (f.eks morfolino), oksazolyl, piperazinyl (f.eks. 1-piperazinyl), piperidyl (f.eks. 1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (f.eks. 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, tiadiazolyl, tiazolyl, tienyl, tiomorfolinyl (f.eks. tiomorfolino), og triazolyl. Disse heterocykliske gruppene kan være substituerte eller usubstituerte. Når en gruppe er substituert, kan substituenten være alkyl, alkoksy, halogen, oksygen eller substituert eller usubstituert fenyl.
Man kan også lett modifisere peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ved fosforylering, og andre metoder for fremstilling av peptid-derivater av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet av Hruby et al.<42>. Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener også som basis for fremstilling av peptid-mimetika med lignende biologisk aktivitet.
Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, inklusivt peptid-mimetika, kan modifiseres kovalent til én eller flere av en rekke ikke-proteinholdige polymerer, f.eks. polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkener, som beskrevet i US-patent 4.640.835; US-patent 4.496.689; US-patent 4.301.144; US-patent 4.670.417; US-patent 4.791.192; eller US-patent 4.179.337.
C. TERMINALE MODIFIKASJONER
Fagmannen vil kjenne til at det foreligger en rekke teknikker for konstruksjon av peptid-mimetika med samme eller lignende ønsket biologisk aktivitet som den tilsvarende peptidforbindelse, men med gunstigere aktivitet enn peptidet med hensyn til løselighet, stabilitet og følsomhet for hydrolyse og proteolyse. Se f.eks. Morgan & Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989). I det følgende beskrives fremgangsmåter for fremstilling av peptid-mimetika modifisert i den N-termianle aminogruppe, den C-terminale karboksyl-gruppe og/eller ved endring av én eller flere av amido-bindingene i peptidet til en ikke-amido-binding. Det er underforstått at to eller flere slike modifikasjoner kan foretas i én peptid-mimetisk struktur (f.eks. modifikasjon i den C-terminale karboksylgruppe og inkludering av en -CH2-karbamatkobling mellom to aminosyrer i peptidet).
1. N-TERMINALE MODIFIKASJONER
Peptidene syntetiseres i alminnelighet som den frie syre, men kan som angitt ovenfor, lett fremstilles som amidet eller esteren. Man kan også modifisere amino- og/eller karboksy-enden av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen for å frembringe andre forbindelser ifølge oppfinnelsen.Modifikasjoner i aminoenden innbefatter metylering (dvs. -NHCH3 eller -NH(CH3)2), acetylering, addisjon av en karbobenzoylgruppe, eller blokkering av aminoenden med en hvilken som helst blokkerende gruppe som inneholder en karboksylat-funksjon definert av RCOO-, hvor R er valgt fra gruppen bestående av naftyl, akridinyl, steroidyl og lignende grupper. Karboksyende-modifikasjoner innbefatter erstatning av den frie syre med en karboksamid-gruppe eller dannelse av et cyklisk laktam ved karboksyenden for å innføre strukturelle spenninger.
Aminoterminale modifikasjoner er som nevnt ovenfor og innbefatter alkylering, acetylering, addering av en karbobenzoylgruppe, dannelse av en succinimidgruppe, etc. Den N-terminale aminogruppe kan deretter omsettes som følger: (a) for å danne en amidgruppe med formel RC(0)NH-, hvor R er som definert ovenfor, ved omsetning med et syrehalogenid [f.eks. RC(0)C1] eller syreanhydrid. Reaksjonen kan i alminnelighet foretas ved å bringe ca. ekvimolare mengder eller overskudd (f.eks. ca. 5 ekvivalenter) av et syrehalogenid i kontakt med peptidet i et inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), som fortrinnsvis inneholder et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin, for å oppfange syren utviklet under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er forøvrig de vanlige (f.eks. romtemperatur i 30 minutter). Alkylering av aminoterminalen for å oppnå en lavere-alkyl N-substitusjon etterfulgt av omsetning med et syrehalogenid som ovenfor beskrevet, vil gi N-alkylamid-gruppen med formel RC(0)NR-; (b) for å danne en succinimidgruppe ved omsetning med ravsyreanhydrid. Som tidligere kan det benyttes en ca. ekvimolar mengde av et overskudd av ravsyreanhydrid (f.eks. ca. 5 ekvivalenter), og aminogruppen omdannes til succinimidet etter velkjente metoder, heriblant bruk av et overskudd (f.eks. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin, i et egnet inert løsningsmiddel (f.eks. diklormetan). Se for eksempel Wollenberg, et al., US-patent 4.612.132, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Det er underforstått at succin-gruppen kan substitueres med for eksempel C2-Ce-alkyl- eller -SR-substituenter som fremstilles på konvensjonell måte for å gi substituert succinimid i peptidets N-ende. Slike alkyl-substituenter fremstilles ved omsetning av et lavere olefin (C2-C6) med maleinsyreanhydrid som beskrevet av Wollenberg, et al., supra, og -SR-substituenter fremstilles ved omsetning av RSH med maleinsyreanhydrid, hvor R er som definert ovenfor; (c) for å danne en benzyloksykarbonyl-NH- eller en substituert benzyloksykarbonyl-NH-gruppe, ved omsetning med en tilnærmet ekvivalent mengde eller et overskudd av CBZ-C1 (dvs. benzyloksykarbonylklorid) eller et substituert CBZ-C1 i et passende inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan) som fortrinnsvis inneholder et tertiært amin til oppfangning av syren som utvikles under reaksjonen; (d) for å danne en sulfonamidgruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) R-S(0)2C1 i et passende inert fortynningsmmiddel (diklormetan), for å omdanne det terminale amin til et sulfonamid hvor R er som d efinert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. 10 ekvivalenter) tertiært amin, så som diisopropyletylamin, for å oppfange syren som utvikles under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter); (e) for å danne en karbamatgruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-OC(0)Cl eller R-0C(O)OC6H4-p-NO2 i et egnet inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), for å omdanne det terminale amin til et karbamat, hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin for å oppfange eventuell syre utviklet under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er forøvrig de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter) og (f) for å danne en ureagruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-N=C=0 i et passende inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), for å omdanne det terminale amin til en ureagruppe (dvs. RNHC(O)NH-) hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin.Reaksjonsbetingelsene er forøvrig de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i ca. 30 minutter).
2. C-TERMINALE MODIFIKASJONER
Ved fremstilling av peptid-mimetika hvor den C-terminale karboksylgruppe er erstattet med en ester (dvs. -C(0)OR, hvor R er som definert ovenfor), anvendes de harpikser som er benyttet til fremstilling av peptidsyrene, og det sidekjede-beskyttede peptid spaltes med base og den passende alkohol, f.eks. metanol. Sidekjede-beskyttende grupper fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å opnå den ønskede ester.
Ved fremstilling av peptid-mimetika hvor den C-terminale karboksylgruppe er erstattet med amidet -C(0)NR<3>R<4>, benyttes en benzhydrylamin-harpiks som den faste bærer for peptidsyntesen. Etter fullført syntese resulterer hydrogenfluoird-behandling for å frigjøre peptidet fra bæreren, direkte i det frie peptidamid (dvs. C-terminalen er -C(0)NH2). Alternativt fører anvendelse av den klormetylerte harpiks under peptidsyntesen sammen med omsetning med ammoniakk for å avspalte det sidekjede-beskyttede peptid fra bæreren, til det frie peptidamid, mens omsetning med et alkylamin eller et dialkylamin fører til et sidekjede-beskyttet alkylamid eller dialkylamid (dvs. C-terminalen er -C(0)NRR', hvor R og R<1> er som definert ovenfor). Sidekjede-beskyttelsen fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amider, alkylamider eller dialkylamider.
I en annen alternativ utførelsesform kan den C-terminale karboksylgruppe eller en C-terminal ester, induseres til cyklisering ved intern fortrengning av -OH-gruppen eller esteren (-OR) av henholdsvis karboksylgruppen eller estergruppen, med den N-terminale aminogruppe, for å danne et cyklisk peptid. Etter syntese og spaltning for å gi peptidsyren, omdannes for eksempel den frie syre til en aktivert ester ved hjelp av en passende karboksylgruppe-aktivator, så som dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i oppløsning, for eksempel i metylenklorid (CH2CI2), dimetylformamid (DMF) blandinger. Det cykliske peptid dannes deretter ved intem fortrengning av den aktiverte ester med det N-terminale amin. Intern cyklisering i stedet for polymerisering, kan forbedres ved anvendelse av meget fortynnede løsninger. Slike metoder er velkjente på området.
Man kan også cyklisere peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller inkorporere en desamino- eller deskarboksy-rest ved peptidendene slik at det ikke forekommer noen terminal amino- eller karboksyl-gruppe, for å nedsette følsomheten overfor proteaser eller for å begrense konformasjonen av peptidet. C-terminale funksjonelle grupper av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy, og de lavere ester-derivater derav, samt farmasøytisk akseptable salter derav.
D. SKJELETT-MODIFIKASJONER
Andre fremgangsmåter for fremstilling av peptid-derivater av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i Hruby et ai, Biochem J. 268(2):249-262 (1990), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener også som struktur-modeller for ikke-peptidiske forbindelser med lignende biologisk virkning. Fagmannen vil innse at det finnes en rekke teknikker for konstruksjon av forbindelser med samme eller lignende ønsket biologisk virkning som leder-peptidforbindelsen, men med gunstigere virkning enn lederforbindelsen med hensyn til løselighet, stabilitet og følsomhet for hydrolyse og proteolyse. Se Morgan & Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Disse teknikkene innbefatter erstatning av peptid-skjelettet med et skjelett sammensatt av fosfonater, amidater, karbamater, sulfonamider, sekundære aminer og N-metylaminosyrer.
Peptid-mimetika hvor én eller flere av peptidyl-koblingene [-C(0)NH-] er erstattet med koblinger, som f.eks. en -CH2-karbamat-kobling, en fosfonat-kobling, en -CH2-sulfonamid-kobling, en urea-kobling, en sekundær amin (CH2NH-) kobling, og en alkylert peptidyl-kobling [-C(0)NR<6-> hvor R<6> er lavere alkyl] fremstilles ved konvensjonell peptidsyntese ved kun å benytte en passende beskyttet aminosyre-analog i stedet for aminosyre-reagenset på det passende sted under syntesen.
Egnede reagenser innbefatter for eksempel aminosyreanaloger hvor karboksylgruppen i aminosyren er erstattet med en del som kan danne en av de ovennevnte koblinger. Dersom man for eksempel ønsker å erstatte en -C(0)NR-kobling i peptidet med en -CH2-karbamat-kobling (-CH20C(0)NR-), reduseres først karboksylgruppen (-COOH) i en passende beskyttet aminosyre, til -CHaOH-gruppen som så omdannes på konvensjonell måte til en -OC(0)Cl funksjon eller en para-nitrokarbonat -OC(0)0-C6H4-p-N02 funksjon. Omsetning av slike funksjonelle grupper med det frie amin eller med et alkylert amin på
N-enden av det delvis fremstillede peptid som finnes på den faste bærer, fører til dannelse av en -CH20C(0)NR-kobling. Angående en mer detaljert beskrivelse av dannelsen av slike
-CH2-karbamat-koblinger, se Cho et al, Science 261:1303-1305 (1993).
Tilsvarende kan erstatning av en amido-kobling i peptidet med en fosfonat-kobling oppnås som beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/943.805, 08/081.577 og 08/119.700, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Erstatning av en amido-kobling i peptidet med en -CH2-sulfonamid-kobling, kan oppnås ved å redusere karboksylgruppen (-COOH) i en passende beskyttet aminosyre til
-CH2OH-gruppen, hvoretter hydroksylgruppen omdannes til en passende utgående gruppe, så som en tosylgruppe, i henhold til konvensjonelle metoder. Omsetning av det tosylerte derivat med for eksempel tioeddiksyre og påfølgende hydrolyse og oksydativ klorering, vil gi den -CH2-S(0)2Cl-funksjonelle gruppe som erstatter karboksylgruppen i den forøvrig passende beskyttede aminosyre. Anvendelse av denne passende beskyttede aminosyreanalog ved peptidsyntese bevirker inklusjon av en -CH2S(0)2NR-kobling som erstatter amido-koblingen i peptidet, hvorved det oppnås et peptid-mimetikum. Angående en mer fullstendig beskrivelse av aminosyrens karboksylgruppe til en -CH2S(0)2Cl-gruppe, se for eksempel Weinstein, Boris Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins Bd. 7. s. 267-357, Marcel Dekker, Inc., New York (1983), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Erstatning av en amido-kobling i peptidet med en urea-kobling kan oppnås slik som beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/147.805, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Sekundære amin-koblinger hvor en -CH2NH-kobling erstatter amido-koblingen i peptidet, kan fremstilles ved for eksempel å benytte en passende beskyttet dipeptidanalog, hvor amido-koblingens karbonyl-kobling redusert til en CH2-gruppe ved hjelp av konvensjonelle metoder. Når det for eksempel gjelder diglycin, vil reduksjon av amidet til aminet, etter avbeskyttelse, føre til H2NCH2CH2NHCH2COOH, som så benyttes i N-beskyttet form i den neste koblingsreaksjon. Fremstillingen av slike analoger ved reduksjon av karbonylgruppen av amido-koblingen i dipeptidet er velkjent på området.
Den passende beskyttede aminosyreanalog benyttes innen den konvensjonelle peptidsyntese på samme måte som den tilsvarende aminosyre ville bli benyttet. For eksempel benyttes det for denne reaksjon i alminnelighet ca. 3 ekvivalenter av den beskyttede aminosyreanalog. Et inert organisk fortynningsmiddel, som f.eks. metylenklorid eller DMF, benyttes, og når det som biprodukt utvikles en syre, vil løsningsmidlet i alminnelighet bli tilsatt et overskudd av et tertiært amin for å oppfange syren som utvikles. Et særlig foretrukket tertiært amin er diisopropyletylamin som i alminnelighet benyttes i ca. 10 gangers overskudd. Reaksjonen resulterer i at en aminosyreanalog som har en ikke-peptidyl-kobling inkorporeres i peptid-mimetikumet. En slik substitusjon kan om ønskelig gjentas slik at fra null til samtlige av amido-koblingene i peptidet er erstattet med ikke-amido-bindinger.
Man kan oså cyklisere peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen eller inkorporere en desamino- eller deskarboksy-rest i peptid-endene slik at det ikke forekommer noen terminal amino- eller karboksyl-gruppe, for å minske følsomheten for proteaser eller begrense konforma-sjonen av peptidet. C-terminale funksjonelle grupper av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy og lavere ester-derivater derav, samt farmasøytisk akseptable salter derav. Eksempler på cykliserte forbindelser er angitt i Tabell 4, 5,6, 8 og 9.
E. DANNELSE AV DISULFID-BINDINGER
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan forekomme i en cyklisert form med en intramolekylær disulfid-binding mellom tiolgruppene i cysteinene. Alternativt kan det fremstilles en intermolekylær disulfid-binding mellom cysteinenes tiolgrupper for å oppnå en dimer (eller høyere oligomer) forbindelse. En eller flere av cysteinrestene kan også erstattes med homocystein. Disse intramolekylære eller intermolekylære disulfid-derivatene kan gjengis skjematisk som vist nedenfor:
hvor m og n uavhengig av hverandre er 1 eller 2.
Analoger av disse disulfid-derivatene hvor ett av svovelatomene er erstattet med en CH2-gruppe eller annen isoster for svovel kan fremstilles på kjent måte ved en intramolekylær eller intermolekylær fortrengning som vist nedenfor:
hvor p er 1 eller 2. Fagmannen vil lett innse at denne fortrengning også kan skje ved bruk av andre homologer av a-amino-y-smørsyre-derivater vist ovenfor, og homocystein.
Alternativt kan amino-enden av peptidet avsluttes (capped) med en alfa-substituert eddiksyre, hvor alfa-substituenten er en utgående gruppe, så som en ot-halogen-eddiksyre, for eksempel ct-kloreddiksyre, a-bromeddiksyre eller a-jodeddiksyre. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan cykliseres eller dimeriseres ved fortrengning av den utgående gruppe med svovelet i cystein- eller homocystein-resten. Se f.eks. Barker et al, J. Med. Chem. 35:2040-2048 (1992) og Or et al, J. Org. Chem. 56:3146-3149 (1991), som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Eksempler på dimeriserte forbindelser er angitt i Tabell 7, 9 og 10.
V. ANVENDELSE
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nyttige in vitro som unike hjelpemidler for å forstå den biologiske rolle av TPO, inklusivt vurderingen av de mange faktorer som antas å påvirke, og påvirkes av, produksjonen av TPO og den reseptor-bindende prosess. De foreliggende forbindelser er også egnet for utvikling av andre forbindelser som binder seg til, og aktiverer, TPO-R, siden foreliggende forbindelser gir viktig informasjon angående forholdet mellom struktur og aktivitet som burde lette en slik utvikling.
Forbindelsene er også anvendelige som konkurrerende bindingsmidler i tester for screening av nye TPO-reseptoragonister. I slike testformer kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen benyttes uten modifikasjon eller modifiseres på en rekke måter, eksempelvis ved merking, ved at det f.eks. kovalent eller ikke-kovalent, tilføyes en del som direkte eller indirekte gir et påvisbart signal. I alle disse forsøkene kan de angjeldende materialer merkes enten direkte eller indirekte. Muligheter for direkte merking inkluderer merkingsgrupper som: radioaktiv merking, f.eks. I, enzymer (US-patent 3.645.090) så som peroksydase og alkalisk fosfatase, og fluorescensmerking (US-patent 3.940.475) som gjør det mulig å følge endringen i fluorescens-intensitet, bølgelengde-forskyvning eller fluorescens-polarisasjon. Muligheter for indirekte merking inkluderer biotinylering av én av bestanddelene med påfølgende binding til avidin koblet til én av ovennevnte merkingsgrupper. Forbindelsene kan også innbefatte spacere eller linkere i tilfeller hvor forbindelsene skal tilkobles til en fast bærer.
På basis av deres evne til å binde seg til TPO-reseptoren, kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, dessuten benyttes som reagenser for påvisning av TPO-reseptorer på levende celler, fikserte celler, i biologiske væsker, i vevshomogenater, i rensede, naturlige biologiske materialer, etc. Ved å merke slike peptider kan man for eksempel identifisere celler som har TPO-R på overflaten. I tillegg kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som følge av deres evne til å binde seg til TPO-reseptorer, benyttes ved in situ farving, FACS (fluorescense-activated cell sorting), western blotting, ELISA, etc. I tillegg kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som følge av deres evne til å binde seg til TPO-reseptorer, benyttes ved reseptor-rensing eller ved rensing av celler som uttrykker TPO-reseptorer på celleoverflaten (eller inne i permeabiliserte celler).
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også benyttes som kommersielle reagenser for diverse medisinske forsknings- og diagnose-formål. Slike anvendelser innbefatter, men er ikke begrenset til: (1) anvendelse som en kalibreringsstandard for kvantifisering av TPO-agonistkandidater i en rekke funksjonstester; (2) anvendelse for å opprettholde proliferasjonen og veksten i TPO-avhengige cellelinjer; (3) anvendelse ved strukturanalyse av TPO-reseptorer via ko-krystallisasjon; (4) anvendelse for å undersøke mekanismen av TPO-signaltransduksjon/reseptoraktivering og (5) andre forsknings- og diagnose-anvendelser hvor TPO-reseptoren fortrinnsvis aktiveres eller hvor slik aktivering lettvint kalibreres mot en kjen t mengde av en TPO-agonist, og lignende.
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes for in vitro ekspansjon av megakaryocytter og deres tilhørende progenitorceller, både i sammenheng med ytterligere cytokiner eller som sådanne. Se f.eks. DiGiusto et al., PCT publikasjon nr. 95/05843 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Kjemoterapi og strålebehandling bevirker trombocytopeni ved å drepe de hurtig delende, mer modne, megakaryocytt-populasjoner. Disse terapeutiske behandlingene kan også redusere antallet og levedyktigheten av de umodne, mindre mitotisk aktive megakaryocytt-forløperceller. Lindring av trombocytopenien ved hjelp av TPO eller forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan påskyndes ved at pasienten etter kjemoterapi eller strålebehandling, infuseres en populasjon av vedkommendes egne celler som er anriket på megakaryocytter og umodne forløperceller ved in vitro dyrkning.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også administreres til varmblodige dyr, inklusivt mennesket, for å aktivere TPO-R in vivo. Eksempelvis kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres for å behandle en rekke hematologiske forstyrrelser, inklusivt, men ikke begrenset til, blodplateforstyrrelser og trombocytopeni, særlig når denne er assosiert med benmargtransfusjoner, strålebehandling og kjemoterapi.
Aktiviteten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan evalueres enten
in vitro eller in vivo i en av de mange modeller som er beskrevet i McDonald Am. J. Of Pediatric Hematology/Oncology 14:8-21 (1992).
Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet til behandling av trombocytopeni assosiert med benmargstransfusjoner, strålebehandling eller kjemoterapi. Forbindelsene kan i alminnelighet bli administrert profylaktisk før kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransplantasjon eller etter en slik eksponering.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres peroralt, pulmonalt, parenteralt (intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs (i.v.) eller subkutan injeksjon), inhalasjon (ved hjelp av en finpulver-formulering), transdermalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller sublingvalt, og kan formuleres i doseringsformer som er egnet for den respektive administrasjonsmåte. Se feks. Bernstein et al, PCT patentpublikasjon nr. WO 93/25221; Pitt et al. PCT patentpublikasjon nr. WO 94/17784; og Pitt et al, Europeisk patentsøknad 613.683.
Faste doseringsformer for peroral administrering er bl.a. kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faste doseringsformer er virkestoffet blandet med minst én inert farmasøytisk akseptabel bærer, så som sukrose, laktose eller stivelse. Slike doseringsformer kan også omfatte, hvilket også er normal praksis, ytterligere substanser utenom inerte fortynningsmidler, f.eks. glattemidler, så som magnesiumstearat. Når det gjelder kapsler, tabletter og piller, kan doseringsformene også omfatte buffere. Tabletter og piller kan dessuten fremstilles med enteriske overtrekk.
Flytende doseringsformer for peroral administrering innbefatter farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper og miksturer som inneholder inerte fortynningsmidler som vanligvis benyttes på området, f.eks. vann. Foruten slike inerte løsningsmidler kan blandingene også inneholde hjelpestoffer, så som fuktemidler, emulgerings- og suspenderings-midler, samt søtningsmidler, smaksforbedrende midler og parfymerende midler.
Preparater for parenteral administrering innbefatter sterile, vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige løsningsmidler eller bæremidler, er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, som olivenolje og maisolje, gelatin og injiser bare organiske estere, som f.eks. etyloleat. Slike doseringsformer kan også inneholde hjelpestoffer som f.eks. konserveringsmidler, fuktemidler, emulgerings-midler og dispergeringsmidler. De kan steriliseres for eksempel ved filtrering gjennom et filter som holder igjen bakterier, ved inkorporering av steriliseirngsmidler i blandingene, ved bestråling av blandingene eller ved oppvarming av blandingene. De kan også fremstilles ved å benytte sterilt vann, eller et annet sterilt injiser bart medium, umiddelbart før bruk.
Blandinger for rektal eller vaginal administrering er fortrinnsvis suppositorier som i tillegg til virkestoffet kan inneholde hjelpestoffer som kakaosmør eller suppositorievoks. Blandinger for nasal eller sublingval administrering fremstilles også med vanlige velkjente hjelpestoffer.
Blandingene som inneholder forbindelsene, kan administreres for profylaktiske og/eller terapeutiske behandlinger. Ved terapeutiske anvendelser administreres blandingene til en pasient som allerede lider av en sykdom, som beskrevet ovenfor, i tilstrekkelig mengde til å helbrede eller i det minste delvis stanse, symptomene på sykdommen og dens komplikasjoner. En riktig mengde for å oppnå dette er definert som en «terapeutisk effektiv dose». Mengder som er effektive for denne anvendelse vil avhenge av sykdommens alvor og pasientens vekt og generelle tilstand.
Blandingene ifølge oppfinnelsen kan også mikro-innkapsles, for eksempel ifølge Tice & Bibi (i Treatise on Controlled Drug Delivery, red. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y.(1992), s. 315-339).
Ved profylaktiske anvendelser administreres blandingene som inneholder virke-stoffene ifølge oppfinnelsen, til en pasient som er følsom for eller på annen måte risikerer en bestemt sykdom. En slik mengde er definert som en «profylaktisk effektiv dose». Ved slik anvendelse avhenger den nøyaktige mengde igjen av pasientens helsetilstand og vekt.
De mengder av TPO-agonisten som er nødvendig for effektiv terapi, vil avhenge av mange ulike faktorer, heriblant administrasjonsmåle, målsete, pasientens fysiologiske tilstand og av andre administrerte medikamenter. Behandlingsdosene bør derfor innstilles med henblikk på optimal sikkerhet og effektivitet. Doseringer som benyttes in vitro kan i alminnelighet gi nyttig veiledning med hensyn til egnede metoder for in situ administrering av disse reagensene. Utprøving i dyreforsøk av effektive doser for behandling av bestemte sykdommer vil dessuten gi indikasjon på dosering til mennesker. Forhold å ta i betraktning er beskrevet, f.eks. i Gilman et al., (red.) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. utg., Pergamon Press (1990); og Remington's Pharmaceutical Sciences, 7. utg., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985).
Peptidforbindelsene ifølge denne oppfinnelse er følgelig virksomme ved behandling av TPO-medierte tilstander når de administreres i doseområder fra ca. 0,001 til ca. 10 mg/kg legemsvekt per dag. Den bestemte dose som benyttes reguleres av den tilstand som skal behandles, administrasjonsmåten så vel som av behandlende leges vurdering av slike faktorer som situasjonens alvor, pasientens alder og generelle tilstand og lignende.
EKSEMPEL 1
FASEFASE-PEPTIDSYNTESE
En rekke peptidforbindelser ifølge oppfinnelsen ble syntetisert ved å benytte fastfase-synteseteknikken til Merrifield (se Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utg. Pierce Chemical Rockford, IL (1984) og Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149
(1963)) på et Milligen/Biosearch 9600 automatisert instrument eller en Applied Biosystems Inc., modell 43IA peptid-syntesemaskin. Peptidene ble satt sammen ved å benytte standard protokoller ifølge Applied Biosystems Inc. System Software versjon 1,01. Hver kobling ble foretatt i 1 til 2 timer med BOP (benzotriazolyl-N-okstris-dimetylaminofosfoniumheksa-fluorfosfat) og HOBT (1-hydroksybenzotriazol).
Den anvendte harpiks var HMP-harpiks eller PAL (Milligen/Biosearch), som er en kryssbundet rwlystyrenharpiks med 5-(4'-Fmoc-aminometyl-3,5'-dimetoksyfenoksy)-valeriansyre som linker. Bruk av PAL-harpiks resulterer i en karboksylterminal amid-funksjon etter spaltning av peptidet fra harpiksen. Etter avspaltning fører HMP-harpiksen til en karboksylsyredel i sluttproduktets C-terminal. De fleste reagenser, harpikser og beskyttede aminosyrer (frie eller på harpiksen) ble anskaffet fra Millipore eller Applied Biosystems Inc.
Fmoc-gruppen ble benytte for amino-beskyttelse under koblingsprosessen. Beskyttelse av primært amin på aminosyrer ble oppnådd med Fmoc, og grupper for beskyttelse av sidekjeder var t-butyl for serin, tyrosin, asparagin, glutaminsyre og treonin; trityl for glutamin; PMC (2,2,5,7,8-pentametyIkroma-sulfonat) for arginin; N-t-butyloksykarbonyl for tryptofan; N-trityl for histidin og glutamin og S-trityl for cystein.
Fjerning av peptidene fra harpiksen og samtidig avbeskyttelse av sidekjede-funksjonene ble oppnådd ved behandling med reagens K eller små modifikasjoner derav. Ved syntesen av disse peptidene med en amidert karboksyl-terminal ble det fullstendig sammensatte peptid alternativt avspaltet med en blanding av 90% trifluoreddiksyre, 5% etandiol og 5% vann, innledningsvis ved 4°C og gradvis økende til romtemperatur. De avbeskyttede peptidene ble utfelt med dietyleter. I alle tilfeller ble rensingen foretatt ved preparativ, omvendt-fase HPLC på en Cl 8-bundet silikagelkolonne med en gradient av acetonitril/vann i 0,1% trifluoreddiksyre. De homogene peptidene ble karakterisert ved hjelp av FAB (Fast Atom Bombardment) massespektrometri eller elektrospray massespektrometri og eventuelt ved aminosyreanalyse.
EKSEMPEL 2
BIOTESTER
Bioaktiviteten av peptidene kan måles ved å benytte en test basert på trombopoietin-avhengig celleproliferasjon. IL-3-avhengige Ba/F3-celler fra mus ble transfektert med full-lengde human TPO-R. Når IL-3 ikke er tilstede (WEHI-3 kondisjonert medium), er disse cellene avhengige av TPO for proliferasjon. Den parentale, ikke-transfekterte cellelinje gir ikke respons på human TPO, men forblir IL-3-avhengig.
Det er foretatt biotester på begge ovennevnte cellelinjer ved å benytte syntetiske peptider som skriver seg fra bibliotek-screening. Cellene ble dyrket i komplett RPMI-10 medium inneholdende 10% WEHI-3 kondisjonert medium, deretter vasket to ganger i PBS, resuspendert i medium som manglet WEHI-3 kondisjonert medium og tilsatt til brønner inneholdende fortynninger av peptid eller TPO på 2 x IO<4> celler/brønn. Cellene ble inkubert i 48 timer ved 37°C i fuktighetsregulert 5% CO2 atmosfære, og den metabolske aktiviteten ble bestemt gjennom reduksjonen av MTT til formazan, idet absorbansen ved 570 nm ble målt på en ELISA-plateleser. De undersøkte peptidene stimulerte som vist på Figur 1, proliferasjon av TPO-R transfekterte Ba/F3-celler på dose-avhengig måte. Disse peptidene har ingen effekt på den parentale cellelinje.
EKSEMPEL 3
BINDINGSAFFINITET
Bindingsaffinteter av kjemisk syntetiserte peptider for TPO-R ble målt ved en kompetitiv bindingstest. Brønnene i en mikrotiterplate ble dekket med 1 mg streptavidin, blokkert med PBS/1% BSA, etterfulgt av 50 ng biotinylert anti-reseptor immobiliserende antistoff (Abl79). Brønnene ble deretter behandlet med en 1:10 fortynning av løselig TPO-R høsting. Forskjellige konsentrasjoner av peptid eller peptid-mimetikum ble blandet med en konstant mengde av en trunkert form av TPO bestående av restene 1-56 fusjonert til C-terminalen av maltose-bindende protein (MBP-TPO1S6). Blandingene av peptidet MBP-TPO]56 ble tilsatt til de TPO-R-dekkede brønnene, inkubert i 2 timer ved 4°C og deretter vasket med PBS. Den mengde MPB-TPO156 som ble bundet ved likevekt, ble målt ved å tilsette et kanin-anti-serum rettet mot MPB, og deretter alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-kanin IgG. Mengden av alkalisk fosfatase i hver brønn ble deretter bestemt ved hjelp av standardmetoder.
Testen foretas med en rekke peptidkonsentrasjoner og resultatene avsettes i et diagram hvor y-aksen representerer mengden av bundet MBP-TPO156 og x-aksen representerer konsentrasjonen av peptid eller peptid-mimetikum. Man kan deretter bestemme den konsentrasjon hvor peptidet eller peptid-mimetikumet ville redusere mengden av MBP-TPO156 bundet til immobilisert TPO-R med 50% (IC50). Dissosiasjonskonstanten (Kd) for peptidet vil tilsvare den målte IC50 under bruk av de ovenfor beskrevne testbetingelser.
EKSEMPEL 4
«PEPTIDER PÅ PLASMIDER»
Vektoren pJS142 benyttes for bibliotek-konstruksjon og er vist i Figur 4. Bibliotek-konstruksjonene fordrer tre oligonukleotidsekvenser: ON-829 (5' ACC ACC TCC GG); ON-830 (5' TTA CTT AGT TA) og et bibliotek-spesifikt oligonukleotid av interesse (5' GA GGT GGT [NNK]n TAA CTA AGT AAA GC), hvor [NNK]n angir en tilfeldig region av ønsket lengde og sekvens. Oligonukleotidene kan 5'-fosforyleres kjemisk under syntesen eller etter rensing, med polynukleotidkinase. De hybridiseres deretter i et 1:1:1 molart forhold og ligeres til vektoren.
Den E. coli stamme som fortrinnsvis benyttes for panning har genotypen «A( srl-recA) endAl nupG lon- ll sulAl hsdRl 7 A( ompT- fepC) 266 AclpA319::kan Alacl lac ZU118 som kan fremstilles fra en E. coli stamme fra E. coli Genetic Stock Center ved Yale University ( E. coli b/r, Stock Center-betegnelse CGSC:6573) med genotype lon- ll sulAl. Ovennevnte E. coli stamme tilberedes for anvendelse ved elektroporering som beskrevet av Dower et al., Nucleic Acids Res. 16:6127 (1988), bortsett fra at det benyttes 10% glycerol i alle vasketrinn. Cellene effektivitetstestes ved å benytte 1 pg av et Bluescript plasmid (Stratagene). Disse cellene benyttes for dyrkning av det opprinnelige bibliotek og for amplifisering av den anrikede populasjon etter hver panning-runde.
Peptider på plasmider frigjøres fra celler for panning ved forsiktig enzymatisk oppslutning av celleveggen under bruk av lysozym. Etter pelletering av cellebrokkene, kan det rå lysatet benyttes direkte på de fleste reseptorer. Dersom det trengs ytterligere rensing av plasmidkompleksene, kan det benyttes en gelfiltreringskolonne for å fjerne mange av de lavmolekylære forurensningene i det rå lysatet.
Panning foretas i en buffer (HEKL) med lavere saltkonsentrasjon enn de fleste fysiologiske buffere. Panning kan foretas i mikrotiterbrønner med en reseptor immobilisert på et ikke-blokkerende monoklonalt antistoff (MAb) eller ved panning på kuler eller på en kolonne. Nærmere bestemt kan det i den første panning-runde benyttes 24 brønner som alle er dekket med reseptor. I den andre runden benyttes i alminnelighet 6 brønner dekket med reseptor (PAN-prøve) og 6 brønner uten reseptor (NC-prøve). Sammenligning av plasmid-antallet i disse to prøvene kan gi en indikasjon på hvorvidt reseptorspesifikke kloner anrikes gjennom panning. «Anrikning» er definert som forholdet mellom PAN-transformanter og de som er gjenvunnet fra NC-prøven. En 10 gangers anrikning er i alminnelighet en indikasjon på tilstedeværelse av reseptorspesifikke kloner.
I senere panning-runder er det gunstig å redusere innførselen av lysat i brønnene for å nedsette uspesifikk bakgrunnsbinding av plasmidkompleksene. I runde 2 benyttes vanligvis 100 uL lysat per brønn. I runde 3 benyttes per brønn 100 uL lysat fortynnet med 1/10 i HEKL/BSA. For ytterligere panning-runder benyttes i alminnelighet en tilførsel av plasmid-omdannende enheter på minst 1000 ganger mer enn den anslåtte gjenværende diversitet.
Bindingsegenskapene til peptidene kodet av individuelle kloner undersøkes i alminnelighet etter 3,4 eller 5 panning-runder, avhengig av de observerte anrikningsverdier. I alminnelighet benyttes en ELISA som påviser reseptorspesifikk binding med Lacl-peptid-fusjonsproteiner. Lad er i alminnelighet en tetramer, og den minimale funksjonelle DNA-bindingsart er en dimer. Peptidene opptrer således multivalent på fusjonsproteinet. Under forutsetning av at det i brønnene kan immobiliseres en tilstrekkelig reseptortetthet, vil peptidene fusjonert til LacI binde seg til overflaten på en kooperativ, multivalent måte. Denne kooperative binding gjør det mulig å påvise bindingsbegivenheter av lav naturlig affinitet. Følsomheten for denne test har den fordel at de innledende treff av lav affinitet lett kan identifiseres, men har den ulempe at signalet ved ELISA ikke er korrelert med peptidenes naturlige affinitet. Fusjon av peptidene til maltose-bindende protein (MBP) slik som beskrevet nedenfor, gjør det mulig å foreta en testing ved ELISA, hvor signalstyrken er bedre korrelert med affinitet. Se Figur 5A-B.
DNA fra interessante kloner kan fremstilles i dobbeltkjedet form ved å benytte en hvilken som helst standard miniprep prosedyre. Den kodende sekvens av interessante enkeltkloner eller populasjoner av kloner, kan overføres til vektorer som fusjonerer disse sekvensene i ramme med det gen som koder for MBP, et protein som i alminnelighet forekommer som en monomer i løsning. Kloningen av et bibliotek inn i pJS142 frembringer et BspEI-restriksjonssete nær begynnelsen av bibliotekets tilfeldig kodende region. Kutting med BspEI og Seal muliggjør rensing av et ~900 bp DNA-fragment som kan subklones inn i den ene av to vektorer, pELM3 (cytoplasmatisk) eller pELM15 (periplasmatisk), som er enkle modifikasjoner av henholdsvis pMALc2- og pMALp2-vektorene som er kommersielt tilgjengelige fra New England Biolabs. Se Figur 5 A-B. Kutting av pELM og pELM15 med Agel og Seal muliggjør effektiv kloning av BspEI-Scal-fragmentet fra pJS142-biblioteket. BspEI- og Agel-endene er forlikelige med hensyn til ligering. Korrekt ligering av Scal-setene er dessuten essensiell for å frembringe et funksjonelt bla (Amp-resistens) gen, hvorved nivået av bakgrunnskloner fra uønskede ligeringer senkes. Ekspresjon av de tac-promotor-styrte MBP-peptidfusjoner kan deretter induseres med IPTG.
Lysater for LacI- MBP-ELISA tilberedes fra individuelle kloner ved å lysere celler under bruk av lysozym, og fjerne uløselige cellebrokker ved sentrifugering. Lysatene tilsettes deretter til brønner som inneholder immobilisert reseptor, og til kontrollbrønner uten reseptor. Binding med LacI- eller MBP-pepudfusjonene påvises ved inkubering med et kaninpolyklonalt antiserum rettet mot enten LacI eller MBP, etterfulgt av inkubering med alkalisk fosfatase-merket geit anti-kanin sekundært antistoff. Den bundne alkaliske fosfatase påvises med p-nitrofenylfosfat som farvegivende substrat.
EKSEMPEL 5
«HEADPIECE DIMER» SYSTEM
En variant av LacI peptider-på-plasmider teknikken utnytter et DNA-bindende
protein betegnet «headpiece dimer». DNA-binding av E. coli lac repressoren medieres av det ca. 60 aminosyrers «headpiece» domenet. Dimeren av headpiece domenet som binder seg til /ac-operatoren dannes normalt ved assosiasjon med det vesentlig større, ca. 300 aminosyrers C-terminale domenet. Dette «headpiece dimer» systemet utnytter headpiece dimer-molekyler som inneholder to «headpieces» forbundet via en kort peptidlinker. Disse proteinene binder
DNA med tilstrekkelig stabilitet til assosiering av en peptid-epitop som opptrer ved C-enden av headpiece-dimeren, med plasmidet som koder for peptidet.
De tilfeldige peptidene fusjoneres til C-enden av headpiece-dimeren som binder seg til det plasmid som kodet dette, for å fremstille et peptid-headpiece-dimer-plasmidkompleks som kan underkastes screening ved panning. Headpieace-dimer systemet peptider-på-plasmider, gir mulighet for større selektivitet for høyaffinitetsligander enn Lacl-systemet. Systemet headpiece dimer er således nyttig for fremstilling av mutagenese-bibliotek basert på initiale lav-affinitets treff og selektering av høyere affinitets varianter av disse initiale sekvensene.
Bibliotekene konstrueres som med peptider på plasmider ved å benytte headpiece dimer vektor pCMG14 (se Figur 6A-C). Nærværet av /ac-operatoren fordres ikke for plasmid-binding av headpiece-dimer-proteinet. Bibliotekene ble innført i en bakteriestamme omfattende E. coli ( lon- ll sulAl hsdR17 ( ompT- fepC) AclpA319::kan Alacllac ZU118 A( srl- recA) 306::TnlO og amplifisert under betingelser for basal (A) promotorinduksjon. Panning av headpiece dimer-bibliotek foretas ved hjelp av lignende fremgangsmåter som de benyttet for Lacl-biblioteker, bortsett fra HEK-buffer benyttes i stedet for HEKL-buffer og at eluering av plasmider fra veggene foretas med vandig fenol i stedet for med IPTG. Sekvenser fra headpiece dimer panning karakteriseres ofte etter overføring til MBP-vektoren slik at de kan testes i den affinitetsfølsomme MBP ELISA og også slik at populasjoner av kloner kan underkastes screening ved hjelp av koloni-avtrykk med merket reseptor.
EKSEMPEL 6
I dette eksempel ble cykliserte forbindelser underkastet tre tester. Først ble ICso-verdier oppnådd som beskrevet ovenfor. Deretter ble det foretatt en MTT-celleproliferasjonstest som beskrevet ovenfor, for å beregne ECso-verdier. Tilslutt ble det foretatt en mikrofysiometertest (Molecular Devices Corp.). Ved denne test ble hastigheten av surgjøringen av det ekstracellulære medium som respons på TPO-reseptorstimulering med forbindelsene ifølge oppfinnelsen, bestemt. ECso-områdene er angitt symbolsk som ovenfor beskrevet for IC50. Resultatene er sammenfattet i Tabell 4.
EKSEMPEL 7
I dette eksempel ble erstatninger av aminosyrene i posisjonene D, E, I, S eller F i den cykliserte forbindelse
undersøkt med henblikk på EC50- og ICso-verdier som beskrevet ovenfor. Mikrofysiometer-resultater er angitt i parentes. Resultatene er sammenfattet nedenfor i Tabell 5.
EKSEMPEL 8
I dette eksempel ble aminosyre-substitusjoner i forbindelsen
i posisjonene D, S eller F som angitt nedenfor i Tabell 6, evaluert. EC50- og ICso-verdier ble beregnet som beskrevet ovenfor. Mikrofysiometer-resultater er angitt i parenteser.
EKSEMPEL 9
I dette eksempel ble EC50- og ICso-verdier beregnet som beskrevet ovenfor for dimer-forbindelsene angitt nedenfor i Tabell 7. Den cykliserte monomer
er inkludert for sammenligning.
Forbindelsene i Tabell 8 var inaktive i den maksimalt testede konsentrasjon på 10 nm.
I Tabell 9 er EC50- og ICso-verdier, bestemt som beskrevet ovenfor for cykliserte og dimeriserte varianter avIEGPTLRQWLAARA sammenlignet.
I Tabell 10 er trunkeringer av dimeren
sammenlignet. EC50- og ICso-verdier ble beregnet som beskrevet ovenfor. Mikrofysiometer-resultater er angitt i parenteser.
EKSEMPEL 10
I dette eksempel ble det foretatt forskjellige substitusjoner i posisjonene G, P og W i den cykliserte forbindelse
Tabell 11 angir eksempler på substituerte forbindelser som oppviser TPO-agonist-aktivitet. Substitusjonene som i tabellen er forkortet, er som følger:
Prolin-erstatninger
Tryptofan-erstatninger
Glycin-erstatninger
EKSEMPEL 11
For å fastslå hvorvidt mus er egnet som hensiktsmessige forsøksdyr, er det foretatt flere in vitro eksperimenter beregnet på å måle aktiviteten av testforbindelsene på musereseptorer. I første omgang ble margceller, høstet fra lårbenet til 8-9 uker gamle Balb/C-mus, inkubert i 7 dager i væskekultur med enten rhuTPO eller forskjellige konsentrasjoner av testpeptidene. Etter avsluttet inkubering ble kulturene konsentrert med Cytospin, farvet for acetylcholinesterase (AChE, et diagnostikum for muse-megakaryocytter) og tellet under mikroskopering. Et (1) nM rhuTPO førte til vekst av meget store (<40 um) ikke-adhererende celler som farvet for AChE. Disse cellene synes å være modne megakaryocytter. Fra en initial utsåing av 10<6>helmargceller/mL (i 50 mL kulturer) utviklet det seg anslagsvis 1-2 x 10<6> megakaryocytter. Denne respons på TPO ble betegnet «maksimal». Kontrollkulturer uten tilsatt vekstfaktor produserte meget få AChE-positive celler. Flere av peptidforbindelsene ble i denne test undersøkt i høye konsentrasjoner, og resultatene er sammenfattet i Tabell 12. En konsentrasjon av peptid A på 10 uM ga en maksimal respons i musemargen. Dette funn var den første indikasjon på at denne peptidfamilie er aktive på murinreseptoren. I et andre eksperiment ble margceller høstet og dyrket i halvfast medium (metylcellulose) enten uten noen faktor eller inneholdende 1 nm rhuTPO eller 10 uM peptid A. Etter dyrkning i 7 dager ble kolonier av store celler (antatt å være megakaryocytter) tellet og gruppert i små kolonier (3-5 celler) eller større kolonier (mer enn 6 celler). Resultatene er vist i Tabell 13. TPO og testpeptidene produserte begge vesentlig flere kolonier av begge størrelser enn de negative kontrollkulturene. Dette tyder på at peptidene etterligner TPO med hensyn til evnen til å stimulere ekspansjonen av celle-populasjonen av MK-forløpercellen.
For å oppnå en mer kvantitativ sammenligning av aktiviteten av testforbindelsene på murine og humane reseptorer, ble muTPO-reseptoren klonet og transfektert inn i BaF3-celler. Det ble isolert en TPO-avhengig cellepopulasjon.
Claims (10)
1. Forbindelse, karakterisert ved at forbindelsen omfatter en sekvens av aminosyrer:
hvor Xi er C, eller P, X2 er T, X3 er L, X4 er R, X5 er E eller Q, X6 er W og X7 er L.
2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at forbindelsen er et peptid, og hvor fra null til alle -C(0)NH-koblingene i peptidet er erstattet av en kobling valgt fra gruppen bestående av en -CH20C(0)NR-kobling; en fosfonatkobling; en -CH2-S(0)2NR-kobling; en -CH2NR-kobling; en -C(0)NR<6->kobling og en -NHC(0)NH-kobling, hvor R er hydrogen eller lavere alkyl og R<6> er lavere alkyl: hvor dessuten N-enden i nevnte peptid eller peptid-mimetikum er valgt fra gruppen bestående av en -NRR'-gruppe; en -NRC(0)R-gruppe; en -NRC(0)OR-gruppe; en -NRS(0)2R-gruppe; en -NHC(0)NHR-gruppe; en succinimidgruppe; en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe; og en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe som på fenylringen har fra 1 til 3 substituenter, valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, lavere alkoksy, klor og brom, hvor R og R<1> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor ytterligere C-enden av nevnte peptid eller peptid-mimetikum har formelen -C(0)R<2>, hvor R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydroksy, lavere alkoksy og -NR<3>R<4>, hvor R<3> og R<4> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor nitrogenatomet i NR<3>R<4->gruppen eventuelt kan være amingruppen i peptidets N-ende slik at det dannes et cyklisk peptid, og fysiologisk akseptable salter derav.
3. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter forbindelsen ifølge krav 1, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen er dimerisert.
5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at forbindelsen omfatter aminosyresekvensen:
hvor X2 er T, X3 L, X4 er R, X5 er Q, X6 er W og X7 er L.
6. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte forbindelse omfatter aminosyresekvensen:
hvor X2 er T, X3 er L, X4 er R, X5 er E eller Q, X$ er W, X7 er L og Xg er en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene.
7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at Xg er G, S, Y eller R.
8. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at forbindelsen omfatter aminosyresekvensen: GGCTLREWLHGGFCGG.
9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte forbindelse er valgt fra gruppen bestående av
10. Forbindelse som binder til trombopoietinreseptorer,
karakterisert ved at nevnte forbindelse er valgt frå gruppen bestående av
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48530195A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
US47812895A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
PCT/US1996/009623 WO1996040750A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO975705D0 NO975705D0 (no) | 1997-12-05 |
NO975705L NO975705L (no) | 1998-02-05 |
NO317737B1 true NO317737B1 (no) | 2004-12-13 |
Family
ID=27045796
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19975705A NO317737B1 (no) | 1995-06-07 | 1997-12-05 | Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. |
NO20041296A NO331550B1 (no) | 1995-06-07 | 2004-03-29 | Forbindelser som bindes til trombopoietinreseptor samt farmasoytisk sammensetning. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20041296A NO331550B1 (no) | 1995-06-07 | 2004-03-29 | Forbindelser som bindes til trombopoietinreseptor samt farmasoytisk sammensetning. |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6083913A (no) |
EP (4) | EP0885242B1 (no) |
JP (1) | JP3059218B2 (no) |
KR (1) | KR100436680B1 (no) |
CN (2) | CN1315870C (no) |
AR (1) | AR003431A1 (no) |
AT (1) | ATE390439T1 (no) |
BR (1) | BR9608587A (no) |
CA (2) | CA2223449C (no) |
CZ (1) | CZ291749B6 (no) |
DE (1) | DE69637473T2 (no) |
DK (1) | DK0885242T3 (no) |
EA (1) | EA001220B1 (no) |
ES (1) | ES2303338T3 (no) |
HK (1) | HK1015380A1 (no) |
HU (1) | HU227678B1 (no) |
IL (1) | IL122102A (no) |
MX (1) | MX9709315A (no) |
NO (2) | NO317737B1 (no) |
NZ (1) | NZ310778A (no) |
PE (1) | PE7898A1 (no) |
PL (1) | PL188795B1 (no) |
PT (1) | PT885242E (no) |
TR (1) | TR199701526T1 (no) |
TW (1) | TW518341B (no) |
WO (1) | WO1996040750A1 (no) |
ZA (1) | ZA964814B (no) |
Families Citing this family (81)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6251864B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-06-26 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
DK0885242T3 (da) * | 1995-06-07 | 2008-07-14 | Glaxo Group Ltd | Peptider og forbindelser, der binder til en trombopoietinreceptor |
US5869451A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US6172210B1 (en) * | 1996-04-02 | 2001-01-09 | Blood Center Research Foundation | DNA encoding phospholipid scramblase |
US7091311B2 (en) | 1996-06-07 | 2006-08-15 | Smithkline Beecham Corporation | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US6593456B1 (en) * | 1996-11-06 | 2003-07-15 | The Regents Of The University Of California | Tumor necrosis factor receptor releasing enzyme |
US6930084B1 (en) | 1996-11-06 | 2005-08-16 | The Regents Of The University Of California | Treating arthritis with TNF receptor releasing enzyme |
US6121416A (en) | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
US6420518B1 (en) | 1997-04-04 | 2002-07-16 | Genetech, Inc. | Insulin-like growth factor agonist molecules |
WO1999052877A1 (en) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Smithkline Beecham Corporation | Receptor ligands |
CN1810832B (zh) * | 1998-10-23 | 2012-12-12 | 麒麟-安姆根有限公司 | 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽 |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
EP1141014B1 (en) | 1999-01-06 | 2004-12-08 | Genentech, Inc. | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant |
US6911314B2 (en) | 1999-05-14 | 2005-06-28 | The Regents Of The University Of California | Screening for drugs that affect TNF receptor releasing enzyme |
EP1216037A2 (en) | 1999-09-21 | 2002-06-26 | Emory University | Methods and compositions for treating platelet-related disorders using mpl pathway inhibitory agents |
TWI284639B (en) | 2000-01-24 | 2007-08-01 | Shionogi & Co | A compound having thrombopoietin receptor agonistic effect |
EP1282437B1 (en) | 2000-05-16 | 2008-03-19 | Genentech, Inc. | Treatment of cartilage disorders |
CY2010012I2 (el) | 2000-05-25 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Μιμητικα θρομβοποιητινης |
WO2001092211A1 (fr) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composes possedant des activites analogues a celles de la thrombopoietine |
ATE544785T1 (de) | 2000-12-05 | 2012-02-15 | Alexion Pharma Inc | Rationell entworfene antikörper |
US7396917B2 (en) | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US6958213B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
EP1361220A4 (en) | 2001-01-26 | 2005-09-07 | Shionogi & Co | CYCLIC COMPOUNDS WITH THROMBOPOIETIN RECEPTAGONISM |
WO2002078612A2 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Euro-Celtique S.A. | Thrombopoietin (tpo) synthebody for stimulation of platelet production |
US7332474B2 (en) * | 2001-10-11 | 2008-02-19 | Amgen Inc. | Peptides and related compounds having thrombopoietic activity |
US20030093229A1 (en) * | 2001-11-06 | 2003-05-15 | Wang Ho Chris Meichung | System and method for improved computer drug design |
ES2416304T3 (es) * | 2002-01-18 | 2013-07-31 | Astellas Pharma Inc. | Derivado de 2-acilaminotiazol o sal del mismo |
US20040009944A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-01-15 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same |
TWI280128B (en) | 2002-05-22 | 2007-05-01 | Smithkline Beecham Corp | 3'-[(2Z)-[1-(3,4- dimethylphenyl)-1,5-dihydro-3-methyl-5-oxo-4H-pyrazol-4-ylidene]hydrazino]-2'-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-carboxylic acid bis-(monoethanolamine) |
US20040028661A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-12 | Bartelmez Stephen H. | Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta |
US7851503B2 (en) | 2002-08-14 | 2010-12-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Thrombopoetin receptor activator and process for producing the same |
CA2499625A1 (en) | 2002-09-18 | 2004-04-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production |
FI20021762A0 (fi) * | 2002-10-03 | 2002-10-03 | Karyon Oy Ab Ltd | Uusia terapeuttisia aineita ja valmisteita |
TWI324593B (en) | 2002-10-09 | 2010-05-11 | Nissan Chemical Ind Ltd | Pyrazolone compounds and thrombopoietin receptor activator |
US7736909B2 (en) * | 2003-01-09 | 2010-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising capture agents |
MXPA05012313A (es) * | 2003-05-12 | 2006-04-18 | Affymax Inc | Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina. |
EP1628686A2 (en) | 2003-05-12 | 2006-03-01 | Affymax, Inc. | Spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptides |
ATE428727T1 (de) | 2003-05-12 | 2009-05-15 | Affymax Inc | Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide |
BRPI0411160A (pt) * | 2003-05-12 | 2006-07-11 | Affymax Inc | novos compostos modificados com poli(glicol etilênico) e usos dos mesmos |
WO2004108078A2 (en) * | 2003-06-02 | 2004-12-16 | Alexion Pharmaceuticals Inc. | Rationally designed antibodies |
WO2005014561A1 (ja) | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Shionogi & Co., Ltd. | トロンボポエチン受容体アゴニスト作用を有する化合物 |
US7723295B2 (en) * | 2003-08-28 | 2010-05-25 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Peptides and compounds that bind to a receptor |
MXPA06002292A (es) * | 2003-08-28 | 2006-09-04 | Johnson & Johnson | Peptidos y compuestos que se unen a un receptor. |
TW200526638A (en) | 2003-10-22 | 2005-08-16 | Smithkline Beecham Corp | 2-(3,4-dimethylphenyl)-4-{[2-hydroxy-3'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-3-yl]-hydrazono}-5-methyl-2,4-dihydropyrazol-3-one choline |
US20060210542A1 (en) * | 2004-08-16 | 2006-09-21 | Yurkow Edward J | Use of TPO mimetic compounds and pharmaceutical compositions in the treatment of anemia |
CN100432102C (zh) * | 2004-09-30 | 2008-11-12 | 百瑞全球有限公司 | 血小板增进蛋白及其应用 |
JP2008519858A (ja) * | 2004-11-11 | 2008-06-12 | アフィーマックス・インコーポレイテッド | エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド |
WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
RU2395505C2 (ru) | 2004-12-08 | 2010-07-27 | Ниссан Кемикал Индастриз, ЛТД | 3-этилиденгидразино-замещенные гетероциклические соединения в качестве активаторов рецептора тромбопоэтина |
CA2590204C (en) | 2004-12-14 | 2012-12-04 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Amide compounds and thrombopoietin receptor activators |
US8258258B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-09-04 | Biontech Ag | Dimeric or multimeric microproteins |
US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
WO2006136450A2 (en) * | 2005-06-23 | 2006-12-28 | Aplagen Gmbh | Supravalent compounds |
AU2006270801B2 (en) | 2005-07-15 | 2011-12-22 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Thiophene compounds and thrombopoietin receptor activators |
US7960425B2 (en) | 2005-07-20 | 2011-06-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Pyrazole compounds and thrombopoietin receptor activators |
EP1947101A4 (en) | 2005-11-07 | 2009-09-16 | Nissan Chemical Ind Ltd | HYDRAZIDE COMPOUND AND THROMBOPOIETIN RECEPTOR ACTIVATOR |
AU2006313491B2 (en) * | 2005-11-08 | 2011-01-06 | Astellas Pharma Inc. | Compositions and methods for treating thrombocytopenia |
US7879318B2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-02-01 | Mcw Research Foundation, Inc. | Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand |
EP2025671A4 (en) | 2006-06-07 | 2011-04-06 | Nissan Chemical Ind Ltd | NITROGENIC HETEROCYCLIC COMPOUND AND THROMBOPOIETIN RECEPTOR ACTIVATOR |
CA2660283C (en) * | 2006-08-08 | 2014-11-18 | Akarx, Inc. | 2-acylaminothiazole compositions and methods for increasing blood platlelet levels in humans |
EP2118127A4 (en) * | 2007-01-31 | 2010-12-01 | Affymax Inc | NICKET-BASED LINKER FOR BONDING MODIFYING GROUPS OF POLYPEPTIDES AND OTHER MACROMOLECULES |
ECSP077628A (es) | 2007-05-03 | 2008-12-30 | Smithkline Beechman Corp | Nueva composición farmacéutica |
US20090054332A1 (en) * | 2007-06-21 | 2009-02-26 | Conjuchem Biotechnologies, Inc. | Thombopoietin peptide conjugates |
AU2008283357B2 (en) | 2007-07-31 | 2011-08-11 | Shionogi & Co., Ltd. | Pharmaceutical composition containing optically active compound having thrombopoietin receptor agonist activity and intermediate thereof |
WO2009029682A1 (en) * | 2007-08-28 | 2009-03-05 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy with syk kinase inhibitor |
US8278057B2 (en) * | 2007-09-14 | 2012-10-02 | Nestec S.A. | Addressable antibody arrays and methods of use |
US8637455B2 (en) * | 2007-10-22 | 2014-01-28 | Affinergy, Llc | Compositions and methods for delivery of glycopeptide antibiotics to medical device surfaces |
CN101481352A (zh) | 2008-01-10 | 2009-07-15 | 上海恒瑞医药有限公司 | 双环取代吡唑酮偶氮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用 |
MX2011008936A (es) | 2009-02-24 | 2011-09-21 | Alexion Pharma Inc | Anticuerpos que contienen peptidos terapeuticos mimeticos de tpo/epo. |
ES2605593T3 (es) | 2009-05-29 | 2017-03-15 | Novartis Ag | Métodos de administración de compuestos agonistas de trombopoyetina |
CN102449481B (zh) * | 2009-05-29 | 2016-05-25 | 德克萨斯大学系统董事会 | 用于分离和处理自身免疫性t细胞的类肽配体 |
AU2010256880B2 (en) * | 2009-06-02 | 2015-01-22 | Opko Health, Inc. | Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases |
WO2011047257A1 (en) * | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for producing cyclic peptoid libraries |
EP2492262B1 (en) | 2009-10-23 | 2016-04-20 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Fused heterocyclic compound and thrombopoietin receptor activator |
WO2011098095A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Aplagen Gmbh | Peptides binding the tpo receptor |
CN104045715B (zh) * | 2013-03-15 | 2018-05-01 | 兰州大学 | 二聚体化融合蛋白的制备及应用 |
TN2017000084A1 (en) * | 2014-09-11 | 2018-07-04 | Bristol Myers Squibb Co | Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80 (b7-1)/pd-li protein/protein interactions |
BR112020001367A2 (pt) * | 2017-07-26 | 2020-08-11 | Janssen Pharmaceutica N.V. | métodos de proteção da integridade vascular induzida por terapia de radiação direcionada |
JPWO2021112249A1 (no) | 2019-12-06 | 2021-06-10 |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1319315A (en) | 1969-06-19 | 1973-06-06 | Citizen Watch Co Ltd | Calendar timepiece |
US3940475A (en) | 1970-06-11 | 1976-02-24 | Biological Developments, Inc. | Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
NO812612L (no) | 1980-08-06 | 1982-02-08 | Ferring Pharma Ltd | Enzym-inhibitorer. |
US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
US4612132A (en) | 1984-07-20 | 1986-09-16 | Chevron Research Company | Modified succinimides |
DE3675588D1 (de) | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5326558A (en) | 1989-08-08 | 1994-07-05 | Genetics Institute, Inc. | Megakaryocytopoietic factor |
IL96477A0 (en) | 1989-12-01 | 1991-08-16 | Amgen Inc | Megakaryocyte production |
DK167813B1 (da) * | 1989-12-07 | 1993-12-20 | Carlbiotech Ltd As | Pentapeptidderivat, farmaceutisk acceptable salte heraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og farmaceutisk praeparat indeholdende et saadant derivat |
US5571508A (en) | 1989-12-18 | 1996-11-05 | Amrad Corporation Limited | Method for the treatment of thrombocytopenia and pharmaceutical compositions useful therefor |
US5141851A (en) * | 1990-04-18 | 1992-08-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Isolated farnesyl protein transferase enzyme |
US5723286A (en) | 1990-06-20 | 1998-03-03 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening systems |
US5250732A (en) | 1991-07-18 | 1993-10-05 | Genentech, Inc. | Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia |
AU669489B2 (en) | 1991-09-18 | 1996-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Method of synthesizing diverse collections of oligomers |
US5639603A (en) | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
US5359115A (en) | 1992-03-26 | 1994-10-25 | Affymax Technologies, N.V. | Methods for the synthesis of phosphonate esters |
ES2181691T5 (es) | 1992-06-11 | 2007-10-01 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Sistema de distribucion de proteina eritropoyetina. |
US5420328A (en) | 1992-09-11 | 1995-05-30 | Affymax Technologies, N.V. | Methods for the synthesis of phosphonate esters |
EP0673387B1 (en) * | 1992-12-11 | 1999-09-22 | University Of Florida | Materials and methods for control of pests |
US5354934A (en) | 1993-02-04 | 1994-10-11 | Amgen Inc. | Pulmonary administration of erythropoietin |
AU685506B2 (en) | 1993-08-25 | 1998-01-22 | Systemix, Inc. | Method for producing a highly enriched population of hematopoietic stem cells |
AU7843394A (en) | 1993-10-27 | 1995-05-22 | Regents Of The University Of California, The | Antiviral compounds |
AU8124694A (en) | 1993-10-29 | 1995-05-22 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
GB2285446B (en) | 1994-01-03 | 1999-07-28 | Genentech Inc | Thrombopoietin |
WO1995021919A2 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-17 | Kirin Brewery Company, Limited | Protein having tpo activity |
JPH09508797A (ja) | 1994-02-14 | 1997-09-09 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 造血タンパク質及びそれを製造するための材料及び方法 |
CA2169173C (en) | 1994-02-14 | 2002-10-15 | Kenneth Kaushansky | Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin |
EP0668352A1 (en) | 1994-02-14 | 1995-08-23 | Kirin Brewery Company, Ltd. | Protein having TPO activity |
US5766581A (en) | 1994-03-31 | 1998-06-16 | Amgen Inc. | Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation |
US5571686A (en) | 1994-04-14 | 1996-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets |
WO1996017062A1 (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-06 | Zymogenetics, Inc. | Low molecular weight thrombopoietin |
US5641655A (en) | 1994-11-30 | 1997-06-24 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombopoietin polypeptides using a mammalian tissue plasminogen activator secretory peptide |
DK0885242T3 (da) * | 1995-06-07 | 2008-07-14 | Glaxo Group Ltd | Peptider og forbindelser, der binder til en trombopoietinreceptor |
US5869451A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Glaxo Group Limited | Peptides and compounds that bind to a receptor |
US5932546A (en) * | 1996-10-04 | 1999-08-03 | Glaxo Wellcome Inc. | Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor |
US8157793B2 (en) | 2006-10-25 | 2012-04-17 | Terumo Kabushiki Kaisha | Manipulator for medical use |
-
1996
- 1996-06-07 DK DK96919241T patent/DK0885242T3/da active
- 1996-06-07 PT PT96919241T patent/PT885242E/pt unknown
- 1996-06-07 KR KR1019970709057A patent/KR100436680B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 EP EP96919241A patent/EP0885242B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 EP EP10184658A patent/EP2338897A1/en not_active Withdrawn
- 1996-06-07 EP EP08075859A patent/EP2055712A1/en not_active Withdrawn
- 1996-06-07 DE DE69637473T patent/DE69637473T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 NZ NZ310778A patent/NZ310778A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 PL PL96323917A patent/PL188795B1/pl unknown
- 1996-06-07 JP JP9501903A patent/JP3059218B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 PE PE1996000437A patent/PE7898A1/es not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 EP EP07024601A patent/EP1961760A3/en not_active Withdrawn
- 1996-06-07 TR TR97/01526T patent/TR199701526T1/xx unknown
- 1996-06-07 CZ CZ19973897A patent/CZ291749B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 IL IL12210296A patent/IL122102A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 CA CA002223449A patent/CA2223449C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 BR BR9608587A patent/BR9608587A/pt active Search and Examination
- 1996-06-07 CN CNB961961422A patent/CN1315870C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 CA CA2636432A patent/CA2636432C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 ES ES96919241T patent/ES2303338T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 EA EA199700359A patent/EA001220B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 AR ARP960103057A patent/AR003431A1/es active IP Right Grant
- 1996-06-07 CN CN200610154077XA patent/CN1966520B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 WO PCT/US1996/009623 patent/WO1996040750A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-07 HU HU9900921A patent/HU227678B1/hu unknown
- 1996-06-07 ZA ZA9604814A patent/ZA964814B/xx unknown
- 1996-06-07 AT AT96919241T patent/ATE390439T1/de active
- 1996-06-07 US US08/973,225 patent/US6083913A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-02 TW TW085109336A patent/TW518341B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-12-01 MX MX9709315A patent/MX9709315A/es unknown
- 1997-12-05 NO NO19975705A patent/NO317737B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-01-22 HK HK99100309A patent/HK1015380A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-04-13 US US09/549,090 patent/US6465430B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-29 NO NO20041296A patent/NO331550B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO317737B1 (no) | Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. | |
US6251864B1 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
US5932546A (en) | Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor | |
US5869451A (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
US8227422B2 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
WO1996040189A1 (en) | Peptides and compounds that bind to a receptor | |
CZ134099A3 (cs) | Inhibitory serinových proteáz, zejména proteázy viru hepatitidy C NS3 | |
NO344233B1 (no) | Peptider og forbindelser som binder til thrombopoietin-reseptorer | |
NO344405B1 (no) | Peptidforbindelse som binder til TPO reseptor for terapeutisk behandling av blodplateforstyrrelse eller trombocytopeni hos mennesker | |
AU704215C (en) | Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RE | Reestablishment of rights (par. 72 patents act) | ||
MK1K | Patent expired |