NO317737B1 - Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. - Google Patents

Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. Download PDF

Info

Publication number
NO317737B1
NO317737B1 NO19975705A NO975705A NO317737B1 NO 317737 B1 NO317737 B1 NO 317737B1 NO 19975705 A NO19975705 A NO 19975705A NO 975705 A NO975705 A NO 975705A NO 317737 B1 NO317737 B1 NO 317737B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
peptide
group
peptides
tpo
receptor
Prior art date
Application number
NO19975705A
Other languages
English (en)
Other versions
NO975705D0 (no
NO975705L (no
Inventor
William J Dower
Ronald William Barrett
Steven E Cwirla
David J Duffin
Christian M Gates
Sherril S Haselden
Larry C Mattheakis
Peter J Schatz
Christoper R Wagstrom
Nicholas C Wrighton
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of NO975705D0 publication Critical patent/NO975705D0/no
Publication of NO975705L publication Critical patent/NO975705L/no
Publication of NO317737B1 publication Critical patent/NO317737B1/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02Antidotes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Description

KRYSSHENVISNING TIL RELATERTE SAKER
Denne søknad er en CIP av US-patentsøknad serie nr. 08/485.301, av 7. juni, 1995 og US-patentsøknad serie nr. 08/478.128, av 7. juni, 1995.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptider og forbindelser som binder til, og aktiverer, trombopoietinreseptoren (c-mpl eller TPO-R) eller på annen måte virker som TPO-agonist samt farmasøytisk blanding. Oppfinnelsen har anvendelse innen feltet biokjemi og medisinsk kjemi og gir særlig TPO-agonister for anvendelse innen humanmedisinsk sykdomsbehandling.
Megakaryocytter er benmarg-avledede celler som er ansvarlige for dannelsen av sirkulerende blodplater. Selv om de utgjør mindre enn 0,25% av benmargcellene i de fleste arter, har de mer enn ti ganger volumet av typiske margceller. Se Kuter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11104-11108 (1994). Megakaryocytter undergår en prosess som er kjent som endomitose, hvorved de replikerer deres kjerner, men ikke undergår celledeling og således fører til polyploide celler. Som respons på et nedsatt blodplatetall øker den endomitotiske hastighet, det dannes polyploide megakaryocytter, og antallet av megakaryocytter kan øke opptil tre ganger. Se Harker, J. Clin. Invest. 47:458-465 (1968). Derimot avtar den endomitotiske hastighet, dannelse av lavere-ploide megakaryocytter, og antallet av megakaryocytter kan avta med 50% som respons på et forhøyet blodplatetall.
Den nøyaktige fysiologiske tilbakekoblingsmekanisme som massen av sirkulerende blodplater regulerer den endomitotiske hastighet og antallet av benmargs-megakaryocytter med, er ikke kjent. Den sirkulerende trombopoietiske faktor som er involvert ved medieringen av denne tilbakekoblingssløyfe, antas nå å være trombopoietin (TPO). Nærmere bestemt har TPO vært vist å være den humorale hovedregulator i situasjoner hvor trombocytopeni er involvert. Se f.eks. Metcalf Nature, 369:519-520 (1994). TPO har i flere undersøkelser vist seg å øke blodplatetallet, øke blodplatestørrelsen og øke isotop inkorporering i blodplater hos mottagerdyr. TPO antas å påvirke megakaryocytopoiese på flere måter: (1) det frembringer økninger i megakaryocyttenes størrelse og antall; (2) det produserer en økning av DNA-innhold i form av polyploiditet, i megakaryocytter; (3) det øker megakaryocytt-endomitose; (4) det frembringer øket modning av megakaryocytter og (5) det frembringer en økning i prosentandelen av forstadie-celler, i form av små acetyl-kolinesterase-positive celler, i benmargen.
Siden blodplater (trombocytter) er nødvendige for blodkoagulering og siden en pasient er i alvorlig fare for å dø av katastrofal blødning når antallet av disse er meget lavt, har TPO en mulig anvendelse både ved diagnostiseringen og behandlingen av forskjellige hematolo-giske forstyrrelser, for eksempel sykdommer som primært skyldes blodplate-defekter. Pågående kliniske forsøk med TPO har tydet på at TPO trygt kan administreres til pasienter. Dessuten har nylige undersøkelser gitt grunnlag for å forutsi effektivitet av TPO-terapi ved behandling av trombocytopeni, og særlig av trombocytopeni som skriver seg fra kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransplantasjon, som behandling av cancer eller lymfom. Se f.eks. McDonald (1992) Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14:8-21 (1992).
Kato et al., J. Biochemistry, vol. 118,1995, s. 229-236, beskriver isolering og karakterisering av en trombopoietisk faktor (TPO) fra plasma til trombocytopeni-rotter. Det beskrives videre at rotteplasma TPO omfatter minst 163 aminosyrer og har en molekylvekt på omtrent 19 kDa. Peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som er mindre og som har molekylvekt som er mindre enn omtrent 8000 dalton, er derimot ikke beskrevet.
Genet som koder for TPO er blitt klonet og karakterisert. Se Kuter et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91:11104-11108 (1994); Barley et al, Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushansky et ai, Nature 369:568-571 (1994); Wendling et al, Nature 369:571-574
(1994); og Sauvage et al, Nature 369:533-538 (1994). Trombopoietin er et glykoprotein med minst to former med tilsynelatende molekylmasser på 25 kDa og 31 kDa og med en felles N-terminal aminosyresekvens. Se Bartley et al, Cell 77:1117-1124 (1994). Trombopoietin viser seg å ha to distinkte regioner adskilt av et eventuelt Arg-Arg-spaltningssete. Den amino-terminale region er sterkt konservert hos menneske og mus, og har en viss homologi med erytropoietin og interferon-a og interferon-b. Den karboksyterminale region oppviser stor artsdivergens.
DNA-sekvensene og kodede peptidsekvenser for human TPO-R (også betegnet c-mpl) er beskrevet. Se Vigon et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5640-5644 (1992). TPO-R er et ledd i den hematopoietiske vekstfaktor-reseptorfamilien, en familie som kjennetegnes ved en felles strukturutformning av det ekstracellulære domenet, inklusivt fire konserverte C-rester i den N-terminale del og et WSXWS-motiv tett ved den transmembrane region. Se Bazan, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:6934-6938 (1990). Indikasjoner på at denne reseptor spiller en funksjonell rolle for hematopoiese, er bl.a. observasjoner som at ekspresjonen er begrenset til milt, benmarg eller lever i musefostere (se Souyri et al, Cell 63:1137-1147 (1990)) og til megakaryocytter, blodplater og CD34<+->celler hos mennesker (se Methia et al, Blood 82:1395-1401 (1993)). Eksponering av CD34<+->celler for syntetiske oligonukleotider, antisense for mpl RNA, inhiberer signifikant utseendet av megakaryocytt-kolonier uten å påvirke erytroid eller myeloid kolonidannelse. Enkelte forskere har postulert at reseptoren funksjonerer som en homodimer tilsvarende situasjonen med reseptorene for G-CSF og erytropoietin.
Tilgjengeligheten av klonede gener for TPO-R forenkler letingen etter agonister for denne viktige reseptor. Tilgjengeligheten av det rekombinante reseptorprotein gjør det mulig å studere reseptor/ligand-interaksjon i en rekke randomiserte og semi-randomiserte systemer for utvikling av peptid-diversitet. Disse systemene innbefatter det «peptider på plasmider» system som er beskrevet i US-patentene 5.270.170 og 5.338.665; «peptider på fag» systemet beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/718.577, av 20. juni, 1991, US-patentsøknad serie nr. 07/541.108, av 20. juni, 1990 og i Cwirla et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1990); «polysome» systemet beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/300.262, av 2. september, 1994 som er en CIP-søknad basert på US-patentsøknad serie nr. 08/144.775, av 29. oktober, 1993 og PCT W095/11992; det «encoded synthetic library» system beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/146.886, av 12. november, 1993; 07/946.239, av 16. september, 1992 og 07/762.522, av 18. september, 1991 og det «very large scale immobilized polymer synthesis» system som er beskrevet i US-patent 5.143.854; PCT patentpublikasjon nr. 90/15070, publisert 13. desember, 1990; US-patentsøknad serie nr. 07/624.120, av6.desember, 1990; Fodor et al, Science 251:767-773 (2/1991); Dower & Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180 (1991); og US-patentsøknad serie nr. 07/805.727, av 6. desember, 1991.
US patent nr. 5.411.942 beskriver peptidderivater med opp til 5 eventuelle substituerte aminosyrer, fremgangsmåte for fremstilling av peptidene og anvendelse for behandling av glaukom. Peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som er nyttige for behandling av en forstyrrelse som er mottagelig for behandling med en trombopoietin-agonist er derimot ikke beskrevet heri.
Den langsomme gjenopprettelse av blodplatenivåer i pasienter som lider av trombocytopeni, er et alvorlig problem og har påskyndet letingen etter en vekstfaktor-agonist i blodet som kunne aksellerere blodplate-regenerering. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en slik agonist.
SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN
Denne oppfinnelse er tildels rettet mot den nye og uventede oppdagelse at bestemte lavmolekylære peptider og peptid-mimetika har sterke bindingsegenskaper for TPO-R og kan aktivere TPO-R. Slike peptider og peptid-mimetika er følgelig egnet for terapeutiske formål ved behandling av tilstander mediert av TPO (f.eks. trombocytopeni som resultat av kjemo-terapi, strålebehandling eller benmargs transfusjoner) så vel som for diagnostiske formål, ved studiet av mekanismen for hematopoiese, og for in vitro ekspansjon av megakaryocytter og forbundne progenitorceller.
Peptider og peptid-mimetika egnet for terapeutiske og/eller diagnostiske formål, har en IC50 på ca. 2 mM eller mindre, bestemt gjennom bindings-afifnitetstesten beskrevet nedenfor i Eksempel 3, hvor en lavere IC50 korrelerer med en sterkere bindingsaffinitet for TPO-R. For farmasøytiske formål har peptidene og peptid-mimetika en IC50 på maksimalt 100 um, mer foretrukket maksimalt 500 nM. Ifølge en foretrukket utførelsesform er molekylvekten av peptidet eller peptid-mimetikumet fra ca. 250 til ca. 8000 dalton.
Når de benyttes for diagnostiske formål merkes peptidene og peptid-mimetikaene fortrinnsvis med en påvisbar merking, og peptidene og peptid-mimetikaene uten slik merking tjener følgelig som mellomprodukter for fremstillingen av merkede peptider og peptid-mimetika.
Peptider som oppfyller de definerte kriterier med hensyn til molekylvekt og bindingsaffinitet for TPO-R omfatter 9 eller flere aminosyrer, hvor aminosyrene er naturlig fore-kommende eller syntetiske (ikke-naturlig forekommende) aminosyrer.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig forbindelse, kjennetegnet ved at forbindelsen omfatter en sekvens av aminosyrer:
Xi X2 X3 X4 X5 Xe X7
hvor Xi er C, eller P, X2 er T, X3 er L, X4 er R, X5 er E eller Q, X6 er W og X7 er L.
Forbindelsen angitt ovenfor er videre kjennetegnet ved at forbindelsen er et peptid og
hvor fra null til alle -C(0)NH-koblingene i peptidet er erstattet av en kobling valgt fra gruppen bestående av en -CH20C(0)NR-kobling; en fosfonatkobling; en
-CH2-S(0)2NR-kobling; en - CH2NR-kobling; en -C(0)NR<6->kobling og en -NHC(0)NH-kobling, hvor R er hydrogen eller lavere alkyl og R<6> er lavere alkyl: hvor dessuten N-enden i nevnte peptid eller peptid-mimetikum er valgt fra gruppen bestående av en -NRR^gruppe; en -NRC(0)R-gruppe; en -NRC(0)OR-gruppe; en -NRS(0)2R-gruppe; en -NHC(0)NHR-gruppe; en succinimidgruppe; en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe; og en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe som på fenylringen har fra 1 til 3 substituenter, valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, lavere alkoksy, klor og brom, hvor R og R<1> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor ytterligere C-enden av nevnte peptid eller peptid-mimetikum har formelen -C(0)R<2>, hvor R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydroksy, lavere alkoksy og -NR<3>R<4>, hvor R<3> og R<4> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor nitrogenatomet i NR<3>R<4->gruppen eventuelt kan være amingruppen i peptidets N-ende slik at det dannes et cyklisk peptid,
og fysiologisk akseptable salter derav.
I en utførelsesform av oppfinnelsen er forbindelsen kjennetegnet ved at aminosyresekvensen er dimerisert.
I en foretrukket utførelsesform er forbindelsen kjennetegnet ved at forbindelsen omfatter aminosyresekvensen
hvor X2 er T, X3 L, X4 er R, X5 er Q, X$er W og X7 er L. Mer foretrukket omfatter forbindelsen aminosyresekvensen
hvorX2 erT, X3 erL, X4 er R, X5 er E eller Q, Xe er W, X7 er L og Xg er en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene.
Særlig foretrukne forbindelser inkluderer:
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre forbindelse som binder til trombopoietinreseptorer, kjennetegnet ved at nevnte forbindelse er valgt fra gruppen bestående av
De her beskrevne forbindelsene er egnet til forebyggelse og behandling av sykdommer mediert av TPO, og særlig for behandling av hematologiske forstyrrelser, inklusivt, men ikke begrenset til, trombocytopeni som resultat av kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransfusjoner. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således også en farmasøy-tisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter forbindelsen ifølge krav 1, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer. En pasient med en lidelse som er følsom for behandling med en TPO-agonist kan følgelig administreres en farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse.
Disse farmasøytiske blandingene kan tilberedes i en rekke former, inklusivt perorale doseringsformer, så vel som inhalerbare pulvere og løsninger og injiserbare og infuserbare løsninger.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 A-B illustrerer resultatene av en funksjonstest i nærvær av forskjellige peptider. Testen er beskrevet i Eksempel 2. Figur IA er en grafisk fremstilling av resultatene av den TPO-R transfekterte Ba/F3-celleproliferasjonstest for utvalgte peptider ifølge oppfinnelsen:
Figur IB er en grafisk fremstilling av resultatene med de samme peptidene og den parentale cellelinje. Figur 2A-C viser resultatene av peptid-oligomerisering ved bruk av den TPO-R transfekterte Ba/F3-celleproliferasjonstest. Figur 2A viser resultatene av testen for det kompleksene biotinylerte peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) både for de transfekterte og parentale cellelinjer. Figur 2B viser resultatene av testen for det frie biotinylerte peptid (AF 12285) både for de transfekterte og parentale cellelinjer. Figur 2C viser resultatene av testen for kun streptavidin både for de transfekterte og parentale cellelinjer. Figur 3 A-G viser resultatene av en rekke kontrollforsøk som viser aktiviteten av TPO, peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, EPO, og EPO-R-bindende peptider i en celleproliferasjonstest, ved å benytte enten den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje, eller en EPO-avhengig cellelinje. Figur 3A viser resultatene for TPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3B viser resultatene for EPO i celleproliferasjons-testen ved å benytte den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3C viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) og en kompleksert form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF 11505 med SA) i den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje. Resultatene for de tilsvarende parentale cellelinjene er vist i Figur 3D. Figur 3E viser resultatene for TPO i celleproliferasjons-testen ved å benytte den EPO-avhengige cellelinje. Figur 3F viser resultatene for EPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den EPO-avhengige cellelinje. Figur 3G viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12885 med streptavidin (SA)) og den komplekserte form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF 11505 med SA) i den EPO-avhengige cellelinje. Figurene 4A-C illustrerer konstruksjonen av «peptider på plasmider» bibliotek i vektor pJS142. Figur 4A viser et restriksjonskart og genenes posisjon. Bibliotekplasmidet inkluderer mzZ?-trariskripsjonsterminatoren, Wa-genet som tillater seleksjon på ampicillin, M13-fag-intragen-regionen (Ml3 IG) som tillater opprettholdelse av enkeltkjedet DNA, et plasmid-replikasjonsorigo ( ori), to /acOj-sekvenser og arøC-genet som tillater positiv og negativ regulering av araS-promotoren som styrer ekspresjonen av /<2c-fusjonsgenet. Figur 4B viser sekvensen for kloningsregionen i 3'-enden av lac I genet, inklusivt Sfil- og Eagl-setene benyttet under bibliotek-konstruksjonen. Figur 4C viser ligeringen av de hybridiserte bibliotek-oligonukleotidene ON-829 og ON-830, til Sfil-seter av pJS142 for å frembringe et bibliotek. Enkeltstående åpninger i sekvensen antyder ligeringssteder. Figurene 5A-B illustrerer kloning i pELM3- og pELM15 MBP-vektorer. Figur 5A viser sekvensen i 3'-enden av ma/Æ-fusjonsgenet, inklusivt den MBP-kodende sekvens, polyasparagin-linkeren, faktor Xa-proteasespaltningssetet og de tilgjengelige kloningssetene. De øvrige deler av vektorene skriver seg fra pMALc2 (pELM3) og pMALp2 (pELM15) som er tilgjengelige fra New England Biolabs. Figur 5B viser sekvensen av vektorene etter overføring av BspEII-Scal bibliotek-fragmentet til Agel-Scal kuttet pELM3/pELM15. Den overførte sekvens innbefatter sekvensen som koder for GGG-peptid-linkeren fra pJS142 biblioteket. Figur 6A viser et restriksjonskart og posisjonen av genene for konstruksjon av «headpiece» dimer-bibliotek i vektor pCMG14. Bibliotekplasmidet inkluderer: rrnB-transkripsjonsterminatoren, 6/ogenet som tillater seleksjon på ampicillin, M13-fag-intragen-regionen (Ml 3 IG) for å opprettholde enkeltkjedet DNA, et plasmid-replikasjonsorigo ( ori), en /ac(9j-sekvens og araC- genet som muliggjør positiv og negativ regulering av den anjÆ-promotor som styrer ekspresjon av «headpiece» dimer-fusjonsgenet. Figur 6B viser sekvensen av den klonende region i 3'-enden av «headpiece» dimer-genet, inklusivt Sfil- og Eagl-setene benyttet under bibliotek-konstruksjonen. Figur 6C viser ligeringen av hybridiserte ON-1679, ON-829, og ON-830 til Sfil-seter av pCMG14 for fremstilling av et bibliotek. Enkeltstående åpninger i sekvensen indikerer ligeringssteder. Figurene 7 til 9 viser resultatene av ytterligere tester på aktiviteten av peptidene og peptid-mimetika ifølge oppfinnelsen. I denne test gjøres mus trombocytopene med karboplatin. Figur 7 viser typiske resultater når Balb/C-mus behandles med karboplatin (125 mg/kg intrapeirtonealt) på Dag 0. De stiplede linjene representerer ubehandlede dyr fra tre forsøk. Den opptrukne linje representerer karboplatin-behandlede grupper i tre forsøk. Den fete linjen representerer historiske data. Figur 8 viser effekten av karboplatin-titrering på blodplatetallet i mus behandlet med de angitte mengder karboplatin (i mg/kg, intraperitonealt (i.p.) på Dag 0). Figur 9 viser lindringen av karboplatin-indusert trombocytopeni på Dag 10 med peptidet AF12513 (513). Karboplatin (CBP; 50-125 mg/kg, intrapeirtonealt) ble administrert på Dag 0. AF12513 (1 mg/kg, i.p.) ble gitt på Dag 1-9.
BESKRIVELSE AV BESTEMTE UTFØRELSESFORMER
I. DEFINISJONER OG GENERELLE PARAMETERE
De etterfølgende definisjoner er angitt for å illustrere og definere meningen og rammen for forskjellige betegnelser benyttet for å beskrive foreliggende oppfinnelse.
«Agonist» refererer seg til en biologisk aktiv ligand som binder seg til dens komplementære biologisk aktive reseptor og aktiverer sistnevnte enten til å frembringe en biologisk respons i reseptoren eller til å forsterke allerede eksisterende biologisk aktivitet av reseptoren.
«Farmasøytisk akseptable salter» refererer seg til ugiftige alkalimetall-, jordalkali-metall- og ammoniumsalter som vanligvis benyttes innen den farmasøytiske industri, inklusivt natrium-, kalium-, litium-, kalsium-, magnesium-, barium-, ammonium- og protamin sinksalter, som fremstilles etter velkjente fremgangsmåter. Betegnelsen innbefatter også ugiftige syreaddisjonssalter som generelt fremstilles ved å omsette forbindelsene ifølge oppfinnelsen med en egnet organisk eller uorganisk syre. Representative salter er bl.a. hydroklorid, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oksalat, valerat, oleat, laurat, borat, benzoat, laktat, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, napsylat og lignende.
«Farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt» refererer seg til salter som bibeholder den biologiske effektivitet og egenskapene til de frie basene og ikke er biologisk eller på annen måte uønskede, dannet med uorganiske syrer som saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende, samt organiske syrer som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyro-vinsyre, oksalsyre, eplesyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzoesyre, kanelsyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre og lignende. Angående en beskrivelse av farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter som prodrugs, se Bundgaard, H. supra.
«Farmasøytisk akseptabel ester» refererer seg til de estere som etter hydrolyse av esterbindingen, bibeholder den biologiske effektivitet og egenskapene til karboksylsyren eller alkoholen og ikke er uønsket biologisk eller på annen måte. Angående en beskrivelse av farmasøytisk akseptable estere som prodrugs, se Bundgaard, H., red. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse esterne dannes i alminnelighet av den tilsvarende karboksylsyre og en alkohol. Generelt kan esterdannelse oppnås gjennom konvensjonelle synteseteknikker. (Se f.eks. Maren, Advanced Organic Chemistry, 3. utg., John Wiley & Sons, New York (1985) s. 1157 og der angitte referanser, samt Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York
(1980)). Alkoholkomponenten av esteren vil i alminnelighet omfatte (i) en C2-C12 alifatisk alkohol som eventuelt kan inneholde én eller flere dobbeltbindinger og eventuelt kan inneholde forgrenede karboner eller (ii) en C7-C12 aromatisk eller heteroaromatisk alkohol. For denne oppfinnelse kan det også være aktuelt å benytte forbindelser som både er estere, slik som her beskrevet, og samtidig er de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav. «Farmasøytisk akseptabelt amid» refererer seg til amider som etter hydrolyse av amidbindingen, bibeholder den biologiske effektivitet og egenskapene til karboksylsyren eller aminet, og som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket. Angående en beskrivelse av farmasøytisk akseptable amider som prodrugs, se Bundgaard, H., red. Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse amidene dannes i alminnelighet fra den tilsvarende karboksylsyre og et amin. Generelt kan amid-dannelse skje ved hjelp av konvensjonell synteseteknikk. (Se f.eks. March, Advanced Organic Chemistry, 3. utg. John Wiley & Sons, New York (1985) s. 1152 og Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). For denne oppfinnelse kan det også være aktuelt å benytte forbindelser som både er amider, slik som her beskrevet, og samtidig utgjør farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav. «Farmasøytisk eller terapeutisk akseptabel bærer» refererer seg til et bærermedium som ikke forstyrrer effektiviteten av den biologiske virkning av virkestoffet og som ikke er toksisk for verten eller pasienten. «StereoisomeD> refererer seg til en kjemisk forbindelse som har den samme molekylvekt, kjemiske sammensetning og konstitusjon som en annen, men hvor atomene er annerledes gruppert. Det vil si at visse identiske kjemiske deler befinner seg i ulike orienteringer i rommet og derfor i ren tilstand har evnen til å dreie planet for polarisert lys. Enkelte rene stereoisomerer kan imidlertid ha en optisk dreining som er så svak at den ikke kan påvises med dagens instrumentering. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha ett eller flere asymmetriske karbonatomer og derfor innbefatte forskjellige stereoisomerer. Alle stereoisomerer faller inn under rammen for foreliggende oppfinnelse. «Terapeutisk- eller farmasøytisk-effektiv mengde» anvendt på blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse, refererer seg til den mengde av blandingen som er tilstrekkelig til å indusere et ønsket biologisk resultat. Resultatet kan være å lette tegn, symptomer eller årsaker til en sykdom eller en hvilken som helst annen ønskelig endring av et biologisk system. For foreliggende oppfinnelse vil resultatet i alminnelighet innebære en nedsettelse av de immunologiske og/eller inflammatoriske responser på infeksjon eller vevsskade.
Aminosyrerester i peptider er forkortet som følger: fenylalanin er Phe eller F; Leucin er Leu eller L; Isoleucin er Ile eller I; Metionin er Met eller M; Valin er Val eller V; Serin er Ser eller S; Prolin er Pro eller P; Treonin er Thr eller T; Alanin er Ala eller A; Tyrosin er Tyr eller Y; Histidin er His eller H; Glutamin er Gin eller Q; Asparagin er Asn eller N; Lysin er Lys eller K; Asparaginsyre er Asp eller D; Glutaminsyre er Glu eller E; Cystein er Cys eller C; Tryptofan er Trp eller W; Arginin er Arg eller R; og Glycin er Gly eller G. Dessuten står Bu for butoksy, Bzl for benzyl, CHA for cykloheksylamin, Ac for acetyl, Me for metyl, Pen for penicillinamin, Aib for aminoisosmørsyre, Nva for norvalin, Abu for aminosmørsyre, Thi for tienylalanin, Obn for O-benzyl og hyp for hydroksyprolin.
I tillegg til peptider som kun består av naturlig forekommende aminosyrer, tilveie-bringes også peptid-mimetika eller peptidanaloger. Peptidanaloger er vanlig benyttet innen den farmasøytiske industri som ikke-peptid-medikamenter med egenskaper som er analoge med templat-peptidets. Disse typene av ikke-peptid-forbindelse betegnes «peptid-mimetika» eller «peptido-mimetika» (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber & Freidinger TINS s. 392 (1985); og Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Peptid-mimetika som har lignende struktur som terapeutisk anvendelige peptider, kan benyttes til å frembringe en tilsvarende eller forsterket terapeutisk eller profylaktisk effekt. I alminnelighet har peptid-mimetika en struktur som ligner et paradigme-polypeptid (dvs. et polypeptid som har en biologisk eller farmakologisk virkning), så som et naturlig forekommende reseptor-bindende polypeptid, men hvor én eller flere peptidkoblinger eventuelt er erstattet med en kobling valgt fra gruppen bestående av: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- ( cis og trans), -COCH2-,
-CH(OH)CH2-, og -CH2SO-, ved hjelp av kjente fremgangsmåter og som er ytterligere beskrevet i følgende referanser: Spatola, A.F. i Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, red. Marcel Dekker, New York, s. 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (mars, 1983) Bd. 1, utg. 3, Peptide Backbone Modifications (generell oversikt); Morley, Trends Pharm Sei. (1980), s. 463-468 (generell oversikt); Hudson D. et al., Int. J. Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al., Life Sei 38:1243-1249 (1986) (-CH2-S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314
(1982) (-CH=CH-, cis og trans) ; Almquist et al., J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)
(-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (-COCH2-); Szelke et al., Europeisk søknad EP 45665 CA (1982); 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (1983) (-C(OH)CH2-); og Hruby Life Sei 31:189-199
(1982) (-CH2-S-); som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. En særlig foretrukket ikke-peptidbinding er -CH2NH-. Slike peptid-mimetika kan ha vesentlige fordeler fremfor polypeptid-utførelsesformer, som for eksempel: mer økonomisk fremstilling, større kjemisk stabilitet, forbedrede farmakologiske egenskaper (halveringstid, absorpsjon, styrke, effektivitet, etc), endret spesifisitet (f.eks. et bredt spekter av biologiske virkninger), nedsatt antigenitet, m.m. Merking av peptid-mimetika involverer i alminnelighet kovalent tilkobling av én eller flere merkinger, direkte eller via en spacer (f.eks. en amidgruppe) til slike ikke-interfererende stillinger på peptid-mimetikumet som lar seg forutsi gjennom kvantitative struktur-akitvitetsdata og/eller molekyl-modellering. Slike ikke-interfererende stillinger er i alminnelighet stillinger som ikke danner direkte kontakter med makromolekylene (f.eks. molekyler av immunglobulin-superfamilien) som peptid-mimetikumet binder seg til for å frembringe den terapeutiske effekt. Derivatisering (f.eks. merking) av peptid-mimetika bør ikke interferere nevneverdig med peptid-mimetikumets farmakologiske aktivitet. I alminnelighet binder peptid-mimetika av reseptor-bindende peptider, seg med høy affinitet til reseptoren og har påvisbar biologisk virkning (dvs. er agonistisk eller antagonistisk til én eller flere reseptor-medierte fenotypiske endringer).
Systematisk erstatning av én eller flere aminosyrer i en konsensus-sekvens med en D-aminosyre av samme type (f.eks. D-lysin i stedet for L-lysin) kan benyttes for å frembringe mer stabile peptider. Dessuten kan det frembringes spente peptider som omfatter en konsensus-sekvens eller en i det vesentlige identisk konsensus-sekvensvariasjon ved hjelp av kjente fremgangsmåter (Rizo & Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992) som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse); for eksempel ved å addere interne cysteinrester som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som cykliserer peptidet.
Syntetiske eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer refererer seg til aminosyrer som ikke naturlig forekommer in vivo, men som ikke desto mindre kan inkorporeres i de her beskrevne peptidstrukturer. Foretrukne syntetiske aminosyrer er D-a-aminosyrer av naturlig forekommende L-ct-aminosyrer så vel som ikke-naturlig forekommende D- og L-a-aminosyrer representert ved formelen H2NCHR<5>COOH, hvor R<5> er 1) en lavere alkylgruppe, 2) en cykloalkylgruppe med fra 3 til 7 karbonatomer, 3) en heterocyklus med fra 3 til 7 karbon-atomer og 1 til 2 heteroatomer valgt fra gruppen bestående av oksygen, svovel og nitrogen, 4) en aromatisk rest med fra 6 til 10 karbonatomer som på den aromatiske kjerne eventuelt har fra 1 til 3 substituenter valgt fra gruppen bestående av hydroksyl, lavere alkoksy, amino og karboksyl, 5) alkylen-Y hvor alkylen er en alkylengruppe med fra 1 til 7 karbon-atomer og Y er valgt fra gruppen bestående av (a) hydroksy, (b) amino, (c) cykloalkyl og cyklo-alkenyl med fra 3 til 7 karbonatomer, (d) aryl med fra 6 til 10 karbonatomer som på den aromatiske kjerne eventuelt har fra 1 til 3 substituenter valgt fra gruppen bestående av hydroksyl, lavere alkoksy, amino og karboksyl, (e) heterocyklus med fra 3 til 7 karbon-atomer og 1 til 2 heteroatomer valgt fra gruppen bestående av oksygen, svovel og nitrogen, (f) -C(0)R<2>, hvor R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, hydroksy, lavere alkyl, lavere alkoksy og -NR<3>R<4>, hvor R<3> og R<4> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, (g) -S(0)nR<6>, hvor n er et heltall fra 1 til 2 og R<6> er lavere alkyl, og med det forbehold at R<5> ikke utgjør en sidekjede av en naturlig forekommende aminosyre.
Andre foretrukne syntetiske aminosyrer er aminosyrer hvor aminogruppen er adskilt fra karboksylgruppen med mer enn ett karbonatom, så som p-alanin, y-aminosmørsyre og lignende.
Særlig foretrukne syntetiske aminosyrer innbefatter eksempelvis D-aminosyrene av naturlig forekommende L-aminosyrer, L-l-naftylalanin, L-2-naftylalanin, L-cykloheksyl-alanin, L-2-aminoisosmørsyre, sulfoksyd- og sulfon-derivatene av metionin (dvs. HOOC-(H2NCH)CH2CH2-S(0)„R<6>), hvor n og R<6> er som ovenfor definert, så vel som de lavere alkoksyderivatene av metionin (dvs. HOOC-(H2NCH)CH2CH2-OR<6>, hvor R<6> er som definert ovenfor). «Påvisbar merking» refererer seg til materialer som når de kovalent kobles til peptidene og peptid-mimetikaene ifølge oppfinnelsen, muliggjør påvisning av peptidet og peptid-mimetikaene in vivo i vedkommende pasient som peptidet eller peptid-mimetikumet er administrert til. Slike påvisbare merkinger er velkjent på området og inkluderer for eksempel radioisotoper, fluorescerende merkinger (f.eks. fluorescein) og lignende. Den bestemte påvisbare merking som benyttes, er ikke av avgjørende betydning og velges ut fra den mengde av merking som kan benyttes, så vel som av merkingens toksisitet i de merkingsmengder som anvendes. Valget av merking i forhold til slike faktorer er velkjent på området.
Kovalent tilkobling av den påvisbare merking til peptidet eller peptid-mimetikumet oppnås ved hjelp av velkjente konvensjonelle metoder. Når for eksempel ,25I-radioisotopen benyttes som den påvisbare merking, kan kovalent tilkobling av <12>SI til peptidet eller peptid-mimetikumet, oppnås ved å inkorporere aminosyren tyrosin i peptidet eller peptid-mimetikumet, og deretter jodere peptidet. Dersom tyrosin ikke forekommer i peptidet eller peptid-mimetikumet, kan inkorporering av tyrosin i N- eller C-enden av peptidet eller peptid-mimetikumet oppnås ved hjelp av velkjent kjemi. Likeledes kan <32>P inkorporeres i peptidet eller peptid-mimetikumet som en fosfatdel, for eksempel gjennom en hydroksyl-gruppe på peptidet eller peptid-mimetikumet, ved å benytte konvensjonell kjemisk teknikk.
II. OVERSIKT
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som binder seg til og aktiverer TPO-R eller som på annen måte oppfører seg som en TPO-agonist. Disse forbindelsene innbefatter «leder»-peptidforbindelser og «derivat»-forbindelser som er slik konstruert at de har den samme eller lignende molekylstruktur eller form som lederforbindelsene, men som adskiller seg fra lederforbindelsene enten med hensyn til følsomhet for hydrolyse eller proteolyse og/eller med hensyn til andre biologiske egenskaper, som f.eks. øket affinitet for reseptoren. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også blandinger som omfatter en effektiv mengde av en TPO-agonist, og særlig en forbindelse som er egnet for behandling av hematologiske forstyrrelser, og spesielt trombocytopeni assosiert med kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransfusjoner.
III. IDENTIFISERING AV TPO-AGONISTER
Peptider som har bindingsaffinitet for TPO-R kan lett identifiseres ved hjelp av systemer som utvikler tilfeldig peptid-diversitet koblet med en affinitets-anrikningsprosess.
Nærmere bestemt innbefatter systemene som frembringer tilfeldig peptid-diversitet det «peptider på plasmider» system som er beskrevet i US-patent 5.270.170 og 5.338.665; systemet «peptider på fag» beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/718.577, av 20. juni, 1991 som er en CIP av US-patentsøknad serie nr. 07/541.108, av 20. juni, 1990 og i Cwirla et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1980); det «polysome system» som er beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/300.262, av 2. september, 1994 som er en CIP-søknad basert på US-patentsøknad serie nr. 08/144.775, av 29. oktober, 1993 og
PCT W095/11992; det «encoded synthetic library (ESL)» system som er beskrevet i US-patentsøkand serie nr. 08/146.886, av 12. november, 1993 som er en CIP-søknad av US-patentsøknad serie nr. 07/946.239, av 16. september, 1992 som er en CIP-søknad av US-patentsøknad serie nr. 07/762.522, av 18. september, 1991 og det« very large scale immobilized polymer synthesis» system som er beskrevet i US-patent 5.143.854;
PCT patentpublikasjon nr. 90/15070 av 13. desember, 1990; US-patentsøknad serie
nr. 07/624.120, av 6. desember, 1990; Fodor et al., Science 251:767-773 (2/1991),
Dower & Fodor Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180 (1991); og US-patentsøknad serie
nr. 805.727, av 6. desember, 1991.
Ved å benytte de her beskrevne fremgangsmåter ble det konstruert tilfeldige peptider med et definert antall aminosyrerester (f.eks. 12). For å frembringe samlingen av oligonukleotider som koder for de tilfeldige peptidene, ble kodonmotivet (NNK)x, hvor N er nukleotid A, C, G eller T (ekvimolar; avhengig av den valgte metodikk kan det benyttes andre nukleotider), K er G eller T (ekvimolart) og x er et heltall tilsvarende antall aminosyrer i peptidet (f.eks. 12) for å angi en hvilken som helst av de 32 kodoner som er mulig ut fra NNK-motivet: 1 for hver av 12 aminosyrer, 2 for hver av 5 aminosyrer, 3 for hver av 3 aminosyrer og kun én av de tre stoppkodonene. NNK-motivet koder således for alle aminosyrene, koder bare for ett stoppkodon og reduserer kodon-skjevhet.
I de anvendte systemene ble de tilfeldige peptidene presentert enten på fag-partikkelens overflate, som del av et fusjonsprotein som omfattet enten pEQ- eller pVIII-kappeproteinet til et fag fd-derivat (peptider på fag) eller som et fusjonsprotein med Lacl-peptid-fusjonsproteinet bundet til et plasmid (peptider på plasmider).
De fag eller plasmider, inklusivt DNA som koder for peptidene, ble identifisert og isolert ved hjelp av en affinitets-anrikningsprosess ved å benytte immobilisert TPO-R. Affinitets-anrikningsprosessen, enkelte ganger betegnet «panning» involverer flere runder med inkubering av fagen, plasmidene eller polysomene, med den immobiliserte reseptor, oppsamling av fagen, plasmidene eller polysomene som binder seg til reseptoren (sammen med den tilhørende DNA eller mRNA) og danner mer av den oppsamlede fag eller plasmidene (sammen med det ledsagende Lacl-peptid-fusjonsprotein). Det ekstracellulære domenet (ECD) av TPO-R ble i alminnelighet benyttet under utvaskingen.
Etter flere runder affinitets-anrikning ble fagen eller plasmidene og de ledsagende peptider undersøkt ved ELISA for å bestemme hvorvidt peptidene bandt seg spesifikt til TPO-R. Denne testen ble foretatt på lignende måte som de fremgangsmåter som ble benyttet i affinitets-anrikningsprosessen, bortsett fra at brønnene, etter fjerning av ubundet fag, i alminnelighet ble behandlet med kanin-anti-fag-antistoff, deretter med alkalisk fosfatase-(AP)-konjugert geit-anti-kanin-antistoff. Mengden av alkalisk fosfatase i hver brønn ble bestemt ved hjelp av standardmetoder. En tilsvarende ELISA for bruk for peptider på plasmider systemet er detaljert beskrevet nedenfor.
Ved å sammenligne testbrønner med kontrollbrønner (ingen reseptor) kan man bestemme hvorvidt fusjonsproteinet binder seg spesifikt til reseptoren. De fag-ansamlinger som viste seg å binde til TPO-R, ble underkastet screening etter et format for koloni-avtrykk («colony lift») probing ved å benytte radioaktivt merket monovalent reseptor. Denne probe kan fremstilles ved å benytte proteinkinase A til å fosforylere en kemptide-sekvens fusjonert til C-enden av den løselig reseptor. Den «manipulerte» form av TPO-reseptoren uttrykkes deretter i vertsceller, i alminnelighet CHO-celler. Etter PI-PLC-høsting av reseptorene ble reseptoren testet på binding til TPO eller TPO-R-spesifikke fag-kloner. Reseptoren ble deretter merket for høy spesifikk aktivitet med <33>P for bruk som en monovalent probe for identifisering av høy-affinitets ligander ved å benytte koloni-avtrykk.
Peptider som viste seg å binde spesifikt til reseptoren, ble deretter syntetisert som det frie peptid (f.eks. ingen fag) og testet i en blokkeringstest. Blokkerings-testen ble foretatt på lignende måte som ELISA, bortsett fra at brønnene ble tilsatt TPO eller et referanse-peptid før fusjonsproteinet (kontrollbrønnene var av to typer: (1) ingen reseptor og (2) intet TPO eller referansepeptid). Fusjonsproteiner hvis bindingen til reseptoren var blokkert av TPO eller referansepeptidet, inneholder peptider i den tilfeldige peptiddel som er foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen.
TPO-R, så vel som dets ekstracellulære domene, ble produsert i rekombinante vertsceller. En anvendelig form av TPO-R konstrueres ved å uttrykke proteinet som et løselig protein i baculovirus-transformerte vertsceller ved å benytte standardmetoder. En annen anvendelig form konstrueres med et signalpeptid for proteinsekresjon og for glykofosfo-lipidmembran-forankring. Denne form for forankring kalles «PIG tailing». Se Caras & Wendell Science 243:1196-1198 (1989) og Lin et al. Science 249:677-679 (1990).
Ved å benytte PIG-tailing systemet kan man spalte reseptoren fra overflaten av cellene som uttrykker reseptoren (f.eks. transformerte CHO-celler selektert med henblikk på høynivå-ekspresjon av reseptor med en celle-sorterer) med fosfolipase C. Den avspaltede reseptor omfatter fremdeles en karboksyterminal sekvens av aminosyrer, betegnet «HPAP-tail», fra signalproteinet for membran-tilkobling og kan immobiliseres uten ytterligere rensing. Det rekombinante reseptorprotein kan immobiliseres ved å belegge veggene av mikrotiterplatene med et anti-HPAP-hale-antistoff (Ab 179 eller MAb 179), blokkere uspesifikk binding med bovint serumalbumin (BSA) i PBS og deretter binde avspaltet rekombinant reseptor til antistoffet. Ved bruk av denne fremgangsmåte bør man foreta immobiliserings-reaksjonen i varierende reseptorkonsentrasjoner for å bestemme den optimale mengde for et gitt preparat, siden ulike preparater av rekombinante proteiner ofte inneholder forskjellige mengder av det ønskede protein. Dessuten bør man forsikre seg om at det immobiliserende antistoff er fullstendig blokkert (med TPO eller annen blokkerende forbindelse) under affinitets-anrikningsprosessen. Om ikke, kan ublokkert antistoff binde uønskede fag under affinitets-anrikningsprosessen. Man kan benytte peptider som binder seg til det immobliiserende antistoff for å blokkere ubundne steder som er igjen etter reseptor-immobilisering for å unngå dette problem, eller man kan simpelthen immobilisere reseptoren direkte til veggene av mikrotiterplatene uten hjelp av noe immobiliserende antistoff. Se US-patentsøknad serie nr. 07/947.339, av 18. september, 1992, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Når det benyttes systemer for tilfeldig peptid-generering som muliggjør multivalent ligand/reseptor-interaksjon, skal det bemerkes at tettheten av den immobiliserte reseptor er en viktig faktor ved bestemmelse av affiniteten av de ligander som kan binde seg til den immobiliserte reseptor. Ved høyere reseptor-tettheter (f.eks. hver anti-reseptor-antistoff-dekkede brønn behandlet med 0,25 til 0,5 mg reseptor) er det mer sannsynlig at det inntrer multivalent binding enn ved lavere reseptor-tettheter (f.eks. hver anti-reseptor-antistoff-dekkede brønn behandlet med 0,5 til 1 ng av reseptoren). Dersom multivalent binding inntrer, vil man mer sannsynlig isolere ligander med relativt lav affinitet, med mindre man benytter høye tettheter av immobilisert reseptor for å identifisere lederforbindelser og benytte lavere reseptor-tettheter for å isolere derivat-forbindelser med høyere affinitet.
For å skjelne mellom peptider med høyere affinitet benyttes ofte en monovalent reseptor-probe. Denne probe kan fremstilles ved å benytte proteinkinase A for å fosforylere en kemptide-sekvens fusjonert til C-enden av den løselige reseptor. Den «manipulerte» form av TPO-reseptoren uttrykkes deretter i vertsceller, i alminnelighet CHO-celler. Etter PI-PLC-høsting av reseptorene testes reseptoren for binding til TPO eller TPO-R spesifikke fag-kloner. Reseptoren merkes deretter for å gi høy spesifikk aktivitet med <33>P for bruk som en monovalent probe for å identifisere høy-affinitetsligander under bruk av koloni-avtrykk.
Foretrukne screeningmetoder for å lette identifiseringen av peptider som binder TPO-R involverer identifisering av lederpeptider som binder seg til reseptorens ekstracellulære domene, hvoretter andre peptider som ligner lederpeptidene, fremstilles. Nærmere bestemt kan et tilfeldig bibliotek ved å benytte pill- eller pVIII-baserte peptider på et fag-system, underkastes screening for å oppdage en fag som presenterer et peptid som binder seg til TPO-R. Fag-DNA sekvenseres for å bestemme sekvensene av de peptidene som opptrer på fagens overflate.
Kloner som er i stand til spesifikt å binde seg til TPO-R, ble identifisert fra et tilfeldig lineært 10-mer pVIII-bibliotek og tilfeldige cykliske 10-mer og 12-mer pVIII-bibliotek. Disse peptidenes sekvenser tjener som basis for konstruksjonen av andre peptid-biblioteker beregnet på å inneholde en høy frekvens av derivater av de først identifiserte peptider. Disse bibliotekene kan syntetiseres slik at de favoriserer produksjonen av peptider som adskiller seg fra bindingspeptidet i kun noen få rester. Denne fremgangsmåte involverer syntese av et oligonukleotid med det bindende peptids kodende sekvens, bortsett fra at man fremfor å benytte rene preparater av hver av de fire nukleosid-tirfosfatene i syntesen, benytter blandinger av de fire nukleosid-tirfosfatene (dvs. 55% av det «korrekte» nukleotid og 15% hver av de øvrige tre nukleotidene er en foretrukket blanding for dette formål, og 70% av det «korrekte» nukleotid og 10% av hver av de øvrige tre nukleotidene er en annen foretrukket blanding for formålet) slik at det frembringes derivater av det bindende peptids kodende sekvens.
Det har vært benyttet flere strategier for å derivatisere lederpeptidene ved å fremstille «mutagenese over et tema» bibliotek. Blant disse er et pVIII-fagemid mutagenese-bibliotek basert på konsensussekvensen mutagenisert med frekvensen 70:10:10:10 og forlenget i hver ende med tilfeldige rester for å produsere kloner som koder for sekvensen XXXX (C, S, P eller R) TLREWL XXXXXX (C eller S). Et lignende urvidet/mutagenisert bibliotek ble konstruert ved å benytte peptider-på-plasmider systemet for å produsere kloner som koder for sekvensen XXXXX (C, S, P eller R) TLREWL XXXXXXX. Et ytterligere utvidet/mutagenisert bibliotek, XXXX (C, S, P eller R) TLREWL XXXXXX (C eller S), ble konstruert ved å benytte polysom-display systemet. Alle tre bibliotekene ble underkastet screening med peptid-eluering og probe-undersøkt med radioaktivt merket monovalent reseptor.
Teknikkene «peptider på plasmider» ble også benyttet for peptid-screening og mutagenese-undersøkelser og er beskrevet mer detaljert i US-patent 5.338.665, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. I henhold til denne fremgangsmåte fusjoneres tilfeldige peptider til C-enden av LacI gjennom ekspresjon fra en plasmid-vektor som bærer fusjonsgenet. Kobling av Lacl-pepudfusjonen til dens kodende DNA skjer via /acØ-sekvensene på plasmidet under dannelse av et stabilt peptid-LacI-plasmidkompleks som kan underkastes screening ved affinitetsanrikning (panning) på en immobilisert reseptor. De således isolerte plasmidene kan deretter føres inn igjen i E. coli ved elektroporering for å amplifisere den selekterte populasjon i ytterligere screening-runder eller for undersøkelse av individuelle kloner.
I tillegg ble det foretatt tilfeldig peptid-screening og mutagenese-undersøkelser ved å benytte et modifisert C-terminalt Lac-I display-system, hvor display-valensiteten var redusert («headpiece dimer» display-system). Bibliotekene ble underkastet screening og de resulterende DNA-innskuddene ble samlet klonet inn i en maltose-bindende protein-(MBP)-vektor som muliggjorde deres ekspresjon som et C-terminalt fusjonsprotein. Rå cellelysater fra tilfeldig plukkede individuelle MBP-fusjonskloner ble deretter testet på TPO-R-binding ved hjelp av ELISA, slik som omtalt ovenfor.
Det ble også foretatt peptid-mutagenese-studier ved å benytte polysom-display systemet som beskrevet i samtidig verserende US-patentsøknad serie nr. 08/300.262, av 2. september, 1994 som er en CIP basert på US-patentsøknad serie nr. 08/144.775, av 29. oktober, 1993 og PCT WO 95/11992, som samtlige herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Et mutagenese-bibliotek ble konstruert på basis av sekvensen X X X X (C, P, R eller S),tlreflXXXXXX(C eller S), hvor X representerer et tilfeldig NNK-kodon og de små bokstavene representerer aminosyrekodoner som inneholder 70:10:10:10 mutagenese i posisjonene 1 og 2 og K (G eller T) i kodonets posisjon 3. Biblioteket ble affinitetsanriket (panned) i fem runder mot TPO-reseptor som var blitt immobilisert på magnetiske kuler. Etter den femte runden ble den PCR-ampliflserte samling klonet inn i pAFF6 og de ELISA-positive klonene sekvensert. Sekvensene ble subklonet inn i en MBP-vektor og deres bindingsaffiniteter ble bestemt ved en MBP ELISA.
For å immobilisere TPO-R for polysom-screening ble Ab 179 først kjemisk konjugert til tosyl-aktiverte magnetkuler (tilgjengelige fra Dynal Corporation) som beskrevet av produsenten. Kulene ble inkubert med antistoff i 0,5 M boratbuffer (pH 9,5) ved romtemperatur over natten. Kulene ble vasket og kombinert med TPO-R som inneholdt . «HPAP»-halen. De antistoff-dekkede kulene og reseptoren ble inkubert i 1 time ved 4°C, hvorpå kulene på nytt ble vasket før tilsetning av polysom-biblioteket.
En screening av de forskjellige ovenfor beskrevne bibliotek førte til de TPO-reseptor-bindende peptider som er vist i Tabell 1 og 2 nedenfor foruten andre som ikke er angitt.
IC50-verdier for enkelte andre representative peptider er angitt i tabellen nedenfor. Det kan benyttes flere metoder for å vurdere ICS0-verdier. For eksempel ble det benyttet en likevekts-bindende ELISA-test ved enten å benytte MBP-TPO eller iacl-peptid tracer, for å bestemme hvorvidt peptidene inhiberer bindingen av TPO til det ekstracellulære domenet av TPO-reseptoren. IC5ø-verdien ble i alminnelighet bestemt ved å benytte det frie peptidet. ICso-verdien kan bestemmes ved å benytte det frie peptid som eventuelt kan amideres C-terminalt eller kan fremstilles som en ester eller et annet karboksyamid.
For å gjenopprette den eksakte sekvens som oppvises på fagen, innledes de N-terminale og C-terminale aminosyrene av de syntetiske peptidene ofte med én eller to glycinrester. Disse glycinrestene antas ikke å være nødvendige for binding eller aktivitet. For å etterligne den eksakte sekvens av peptider oppvist på polysomer, innledes likeledes de C-terminale aminosyrer av de syntetiske peptidene ofte av sekvensen MAS. Denne sekvens antas heller ikke her å være nødvendig for binding eller aktivitet.
ICso-verdier er angitt symbolsk gjennom symbolene «-«, «+» og «++». Peptider som oppviste ICso-verdier på mer enn 200 uM er for eksempel angitt med «-«. Peptider som ga ICso-verdier på mindre enn eller lik 200 uM er betegnet«+», mens de som ga ICso-verdier på 500 nm eller mindre, er angitt med «++». Peptider som ga ICso-verdier på eller nær grensen for et bestemt symbol, er angitt med en mellombetegnelse, f.eks. «+/-«. Peptider hvor ICso-verdier ikke ble bestemt, er angitt som «N.D.». ICso-verdier for peptider med strukturen: G GCTLREWLHGGFCGGvar 500 nm eller mindre. (Det skal bemerkes at de N-terminale og C-terminale aminosyrene ble innledet med to glycinrester for å gjenopprette den eksakte sekvens som oppvises av fagen. Disse glycinrestene antas ikke å være nødvendige for binding eller aktivitet).
Peptider og peptid-mimetika med en ICso-verdi på mer enn ca. 100 mM mangler tilstrekkelig binding til at de kan benyttes for de diagnostiske eller for de terapeutiske aspektene ved denne oppfinnelse. For diagnostiske formål har peptidene og peptid-mimetikaene en ICso-verdi på ca. 2 mM eller mindre, og for farmasøytiske formål har peptidene og peptid-mimetikaene en ICso-verdi på ca. 100 uM eller mindre.
Den bindende peptidsekvens gir også muligheter for å bestemme minimums-størrelsen av en TPOR-bindende forbindelse ifølge oppfinnelsen. Ved å benytte ESL-(«encoded synthetic library») systemet eller «very large scale immobilized polymer synthesis» systemet kan man ikke bare bestemme minimumsstørrelsen av et peptid med slik aktivitet, men man kan også fremstille alle peptider som danner den peptidgruppe som adskiller seg fra det foretrukne motiv (eller minimumsstørrelsen av vedkommende motiv) i én, to eller flere rester. Denne peptidsamling kan deretter underkastes screening med henblikk på evne til binding til en TPO-reseptor. Disse immobiliserte polymer-syntese-systemene eller andre peptid-syntesemetoder, kan også benyttes for å syntetisere trunkeringsanaloger, delesjonsanaloger, substitusjonsanaloger og kombinasjoner derav, av alle peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen.
Forbindelsen og peptid-mimetikaene ifølge foreliggende oppfinnelse ble også vurdert gjenom en trombopoietin-avhengig celleproliferasjonstest, som mer detaljert beskrevet i Eksempel 2 nedenfor. Celleproliferasjon måles ved hjelp av kjente teknikker, så som en MTT-test som korrelerer med <3>H-tymidin-inkorporering som en indikasjon på celleproliferasjon (se Mossmann, J. Immunol. Methods 65:55 (1983)). De undersøkte peptidene stimulerte som det fremgår av Figur IA, proliferasjon av TPO-R transfekterte Ba/F3-celler på en dose-avhengig måte. Disse peptidene har som det fremgår av Figur IB, ingen effekt på den parentale cellelinje. Figurene 7 til 9 viser resultatene av en ytterligere test som evaluerer aktiviteten av peptidene og peptid-mimetikaene ifølge oppfinnelsen. Ved denne test gjøres mus trombocytopene med karboplatin. Figur 7 viser typiske resultater når Balb/C mus behandles med karboplatin (125 mg/kg intraperitonealt) på Dag 0. De stiplede linjene representerer ubehandlede dyr fra tre forsøk. De fullt opptrukne linjene representerer karboplatin-behandlede grupper i tre forsøk. Den fete fullt opptrukne linje representerer historisk edata. Figur 8 viser effekten av karboplatin-titrering på platetallene fra mus behandlet med de angitte mengder karboplatin (i mg/kg, intraperitonealt (i.p.) på Dag 0). Figur 9 viser lindringen av karboplatin-indusert trombocytopeni på Dag 10 med peptid AF 12513 (513). Karboplatin (CBP; 50-125 mg/kg, intraperitonealt) ble administrert på Dag 0. AF 12513 (1 mg/kg, i.p.) ble gitt på Dagene 1-9. Disse resultatene viser at peptidene ifølge oppfinnelsen kan lindre trombocytopeni i en musemodell.
Dessuten kan enkelte forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse dimeriseres eller oligomeriseres, hvorved affiniteten og/eller aktiviteten av forbindelsene økes. For å undersøke hvilken effekt peptid-dimerisering/oligomerisering har på TPO-mimetisk styrke i celleproliferasjonstester, ble det syntetisert en C-terminalt biotinylert analog av peptidet G G
CADGPTLREWISFCGG(GGCADGPTLREWISFCGGK (Biotin)).
Peptidet ble preinkubert med streptavidin i serum-fritt HEPES-buffret RPMI i molforholdet 4:1. Komplekset ble testet med henblikk på stimulering av celleproliferasjon av TPO-R transfekterte Ba/F3 celler, som ovenfor, sammen med fritt biotinylert peptid og det ubiotinylerte parentale peptid. Figur 2A viser resultatene av testen for det komplekserte biotinylerte peptid (AF12885 med streptavidin (SA)) både for den transfekterte og den parentale cellelinje. Figur 2B viser resultatene av testen for det frie biotinylerte peptid (AF 12285) både for den transfekterte og den parentale cellelinje. Figur 2C viser resultatene av testen for bare streptavidin både for den transfekterte og den parentale cellelinje. Disse figurene illustrerer at det forut dannede kompleks var ca. 10 ganger sterkercenn det frie peptid.
Spesifisiteten av bindingen og aktiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble også undersøkt ved å studere peptidenes kryssreaktivitet overfor erytropoietin-reseptoren (EPO-R). EPO-R er også medlem av hematopoietin-vekstfaktor-reseptorfamilien i likhet med TPO-R. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, så vel som TPO, EPO og et kjent EPO-bindende peptid, ble undersøkt i en celleproliferasjons-test ved å benytte en EPO-avhengig cellelinje. Denne testen gjorde bruk av FDCP-1, en vekstfaktor-avhengig murin multi-potensiell primitiv hematopoietisk progenitorcellelinje (se f.eks. Dexter et al., J. Exp. Med. 152:1036-1047 (1981)) som den parentale cellelinje. Denne cellelinjen kan proliferere, men ikke differensiere, når den suppleres med WEHI-3-kondisjonert medium (et medium som inneholder IL-3, ATCC nummer T1B68). Den parentale cellelinje transfekteres med human eller murin EPO-R for å produsere FDCP-1-EPO-R-cellelinjen. Disse transfekterte cellelinjene kan proliferere, men ikke differensiere, i nærvær av human eller murin EPO.
Cellene ble dyrket halv-veis til stasjonær tetthet i nærvær av de nødvendige vekstfaktorer. Cellene ble deretter vasket i PBS og sultet i 16-24 timer i komplett medium uten vekstfaktorer. Etter bestemmelse av cellenes levedyktighet, ble det fremstillet stamløsninger (i komplett medium uten vekstfaktorene) for å oppnå ca. 10<5> celler per 50 mikroliter. Seriefortynninger av forbindelsene (i alminnelighet peptidet i den frie løsningsfase i motsetning til et fag-bundet eller på annen måte bundet eller immobilisert peptid) som skulle testes, ble fremstillet i 96 brønns vevskulturplater i et sluttvolum på
50 mikroliter per brønn. Celler (50 mikroliter) ble tilsatt til hver brønn og cellene inkubert i 24-48 timer, tidspunktet hvor negative kontroller burde dø eller være tause. Celleproliferasjonen ble deretter målt ved hjelp av kjente teknikker, så som en MTT-test. Figurene 3 A-G viser resultatene av en rekke kontrollforsøk som viser aktiviteten av TPO, peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, EPO og EPO-R-bindende peptider i en celleproliferasjonstest ved å benytte enten den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje, eller en EPO-avhengig cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3A viser resultatene for TPO i celleproliferasjonstesten ved bruk av den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3B viser resultatene for EPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje og dens tilsvarende parentale linje. Figur 3C viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) og en kompleksert form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF11505 med SA) i den TPO-R transfekterte Ba/F3-cellelinje. Resultatene for den tilsvarende parentale cellelinje er vist i Figur 3D. Figur 3E viser resultatene for TPO i celleproliferasjonstesten ved å benytte den
EPO-avhengige cellelinje. Figur 3F viser resultatene for EPO i celleproliferasjons-testen ved bruk av den EPO-avhengige cellelinje. Figur 3G viser resultatene for kompleksert biotinylert peptid (AF 12285 med streptavidin (SA)) og den komplekserte form av et biotinylert EPO-R-bindende peptid (AF11505 med SA) i den EPO-avhengige cellelinje. Disse resultatene viser at peptidene ifølge oppfinnelsen binder og aktiverer TPO-R med en høy grad av spesifisitetsgrad.
IV. FREMSTILLING AV PEPTIDER OG PEPTID-MIMETIKA
A. FASTFASE-SYNTESE
Peptidene og forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles etter kjente klassiske metoder, for eksempel ved å benytte standard fastfase-teknikk. Standardmetodene innbefatter eksklusiv fastfase-syntese, partielle fastfase-syntesemetoder, fragment-kondensasjon, klassisk syntese i løsning og endog rekombinant DNA-teknikk. Se f.eks. Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. På fastfase innledes syntesen i alminnelighet fra peptidets C-terminale ende ved å benytte en alfa-amino-beskyttet harpiks. Et passende utgangsmateriale kan for eksempel fremstilles ved å feste den nødvendige alfa-aminosyre til en klor-metylert harpiks, en hydroksymetyl-harpiks eller en benzhydrylamin-harpiks. En slik klormetylert harpiks omsettes under handelsnavnet BIO-BEADS SX-1 av Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, og fremstillingen av hydroksymetyl-harpiksen er beskrevet av Bodonszky et al., Chem. Ind. (London) 38:1597 (1966). Benzhydrylamin- (BHA) harpiks er beskrevet av Pietta & Marshall, Chem. Commun., 650 (1970) og er kommersielt tilgjengelig fra Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, i hydrokloirdformen.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan således fremstilles ved å koble en alfa-amino-beskyttet aminosyre til den klormetylerte harpiks, eksempelvis ved hjelp av cesium-bikarbonat-katalysator, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Gisin Heiv. Chim. Acta. 56:1467 (1973). Etter den første kobling fjernes alfa-amino-beskyttelsesgruppen ved hjelp av et utvalg av reagenser som inkluderer trifluoreddiksyre- (TFA) eller hydrogenklorid-(HCl)-løsninger i organiske løsningsmidler ved romtemperatur.
Alfa-amino-beskyttelsesgruppene er slike som på dette området har vist seg egnet for trinnvis syntese av peptider. Disse innbefatter beskyttelsesgrupper av acetyltype (f.eks. formyl, trifluoracetyl, acetyl), beskyttelsesgrupper av aromatisk uretantype (f.eks. benzyloksykarbonyl (Cbz) og substituert Cbz), alifatiske uretan-beskyttelsesgrupper (f.eks. t-butyloksykarbonyl (Boe), isopropyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og beskyttelsesgrupper av alkyltype (f.eks. benzyl, trifenylmetyl). Boe- og Fmoc er foretrukne beskyttelsesgrupper. Beskyttelsesgruppen for sidekjeden forblir intakt under koblingen og avspaltes ikke under avbeskyttelsen av den amino-terminale beskyttelsesgruppe eller under kobling. Den sidekjede-beskyttende gruppe må kunne fjernes etter fullført syntese av det endelige peptid og under reaksjonsbetingelser som ikke vil endre det tilsiktede peptid.
De sidekjede-beskyttende grupper for Tyr innbefatter tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz og 2,5-diklorbenzyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Asp innbefatter benzyl, 2,6-diklorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Thr og Ser innbefatter acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz. Den sidekjede-beskyttende gruppe for Thr og Ser er benzyl. De sidekjede-beskyttende grupper for Arg innbefatter nitro, tosyl (Tos), Cbz, adamantyloksykarbonyl, mesitoylsulfonyl (Mts) eller Boe. De sidekjede-beskyttende grupper for Lys innbefatter Cbz, 2-klorbenzyloksykarbonyl (2-Cl-Cbz), 2-brombenzyloksy-karbonyl (2-Br-Cbz), Tos eller Boe.
Etter fjerning av den alfa-amino-beskyttende gruppe, kobles de gjenværende beskyttede aminosyrer trinnvis i den ønskede rekkefølge. Det benyttes i alminnelighet et overskudd av hver beskyttet aminosyre sammen med en passende karboksylgruppe-aktivator, som f.eks. dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i løsning, for eksempel i metylenklorid- (CH2CI2), dimetylformamid- (DMF)-blandinger.
Etter at den ønskede aminosyresekvens er ferdig, frakobles det ønskede peptid fra bærer-harpiksen ved behandling med et reagens som f.eks. trifluoreddiksyre eller hydrogenfluorid (HF), som ikke bare spalter peptidet fra harpiksen, men også spalter alle øvrige sidekjede-beskyttende grupper. Når den klormetylerte harpiks benyttes resulterer hydrogenfluorid-behandling i dannelse av de frie peptidsyrene. Når benzhydrylamin-harpiks benyttes resulterer hydrogenfluorid-behandling direkte i det frie peptidamid. Når som et alternativ, den klormetylerte harpiks benyttes, kan det sidekjede-beskyttede peptid frakobles ved behandling av peptidharpiksen med ammoniakk for å gi det ønskede sidekjede-beskyttede amid, eller med et alkylamin for å gi et sidekjede-beskyttet alkylamid eller dialkylamid. Sidekjede-beskyttelsen fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amidene, alkylamidene eller dialkylamidene.
Disse fremgangsmåtene for fastfase-peptidsyntese er velkjent på området og er ytterligere beskrevet i Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San 'Francisco, (1969)).
Ved å benytte det «encoded synthetic library» eller «very large scale immobilized polymer synthesis» system beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/492.462, av 7. mars, 1990; 07/624.120, av 6. desember, 1990 og 07/805.727, av 6. desember, 1991, kan man ikke bare bestemme minimumsstørrelsen av et peptid med den ønskede aktivitet, men man kan også fremstille alle de peptider som danner den gruppe av peptider som adskiller seg fra det foretrukne motiv (eller minimumsstørrelsen av vedkommende motiv) med hensyn til én, to eller flere rester. Denne samling av peptider kan deretter underkastes screening på evnen til å binde til TPO-R. Dette immobiliserte polymer-syntesesystem eller andre peptidsyntese-metoder kan også benyttes for å syntetisere trunkeringsanaloger og delesjons-analoger, samt kombinasjoner av trunkerings- og delesjons-analoger av alle peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen.
B. SYNTETISKE AMINOSYRER
Disse fremgangsmåtene kan også benyttes til å syntetisere peptider hvor andre aminosyrer enn de 20 naturlig forekommende, genetisk kodede aminosyrene, er substituert i én, to eller flere posisjoner i en hvilken som helst av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan naftylalanin erstatte tryptofan, hvilket letter syntesen. Andre syntetiske aminosyrer som kan substitueres inn i peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er bl.a. L-hydroksypropyl, L-3,4-dihydroksyfenylalanyl, d-aminosyrer som L-d-hydroksylysyl og D-d-metylalanyl, L-a-metylalanyl, p-aminosyrer og isokinolyl. D-aminosyrer og ikke-naturlig forekommende syntetiske aminosyrer kan også inkorporeres i peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Man kan også erstatte de naturlig forekommende sidekjeder i de 20 genetisk kodede aminosyrerne (eller D-aminosyrene) med andre sidekjeder, for eksempel med grupper som alkyl, lavere alkyl, cyklisk 4-, 5-, 6- og 7-leddet alkyl, amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy, karboksy og de lavere ester-derivater derav, samt med 4-, 5-, 6- og 7-leddede heterocykler. Særlig kan det benyttes prolin-analoger, hvor ringstørrelsen av prolinresten er endret fra 5 ledd til 4,6 eller 7 ledd. Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og innettede grupper være aromatiske eller ikke-aromatiske.
Cykliske grupper kan være mettede eller umettede, og de umettede være aromatiske eller ikke-aromatiske. Heterocykliske grupper inneholder fortrinnsvis ett eller flere nitrogen-, oksygen- og/eller svovel-heteroatomer. Eksempler på slike grupper er furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, isotiazolyl, isoksazolyl, morfolinyl (f.eks morfolino), oksazolyl, piperazinyl (f.eks. 1-piperazinyl), piperidyl (f.eks. 1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (f.eks. 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, tiadiazolyl, tiazolyl, tienyl, tiomorfolinyl (f.eks. tiomorfolino), og triazolyl. Disse heterocykliske gruppene kan være substituerte eller usubstituerte. Når en gruppe er substituert, kan substituenten være alkyl, alkoksy, halogen, oksygen eller substituert eller usubstituert fenyl.
Man kan også lett modifisere peptidene og forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ved fosforylering, og andre metoder for fremstilling av peptid-derivater av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet av Hruby et al.<42>. Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener også som basis for fremstilling av peptid-mimetika med lignende biologisk aktivitet.
Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, inklusivt peptid-mimetika, kan modifiseres kovalent til én eller flere av en rekke ikke-proteinholdige polymerer, f.eks. polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkener, som beskrevet i US-patent 4.640.835; US-patent 4.496.689; US-patent 4.301.144; US-patent 4.670.417; US-patent 4.791.192; eller US-patent 4.179.337.
C. TERMINALE MODIFIKASJONER
Fagmannen vil kjenne til at det foreligger en rekke teknikker for konstruksjon av peptid-mimetika med samme eller lignende ønsket biologisk aktivitet som den tilsvarende peptidforbindelse, men med gunstigere aktivitet enn peptidet med hensyn til løselighet, stabilitet og følsomhet for hydrolyse og proteolyse. Se f.eks. Morgan & Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989). I det følgende beskrives fremgangsmåter for fremstilling av peptid-mimetika modifisert i den N-termianle aminogruppe, den C-terminale karboksyl-gruppe og/eller ved endring av én eller flere av amido-bindingene i peptidet til en ikke-amido-binding. Det er underforstått at to eller flere slike modifikasjoner kan foretas i én peptid-mimetisk struktur (f.eks. modifikasjon i den C-terminale karboksylgruppe og inkludering av en -CH2-karbamatkobling mellom to aminosyrer i peptidet).
1. N-TERMINALE MODIFIKASJONER
Peptidene syntetiseres i alminnelighet som den frie syre, men kan som angitt ovenfor, lett fremstilles som amidet eller esteren. Man kan også modifisere amino- og/eller karboksy-enden av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen for å frembringe andre forbindelser ifølge oppfinnelsen.Modifikasjoner i aminoenden innbefatter metylering (dvs. -NHCH3 eller -NH(CH3)2), acetylering, addisjon av en karbobenzoylgruppe, eller blokkering av aminoenden med en hvilken som helst blokkerende gruppe som inneholder en karboksylat-funksjon definert av RCOO-, hvor R er valgt fra gruppen bestående av naftyl, akridinyl, steroidyl og lignende grupper. Karboksyende-modifikasjoner innbefatter erstatning av den frie syre med en karboksamid-gruppe eller dannelse av et cyklisk laktam ved karboksyenden for å innføre strukturelle spenninger.
Aminoterminale modifikasjoner er som nevnt ovenfor og innbefatter alkylering, acetylering, addering av en karbobenzoylgruppe, dannelse av en succinimidgruppe, etc. Den N-terminale aminogruppe kan deretter omsettes som følger: (a) for å danne en amidgruppe med formel RC(0)NH-, hvor R er som definert ovenfor, ved omsetning med et syrehalogenid [f.eks. RC(0)C1] eller syreanhydrid. Reaksjonen kan i alminnelighet foretas ved å bringe ca. ekvimolare mengder eller overskudd (f.eks. ca. 5 ekvivalenter) av et syrehalogenid i kontakt med peptidet i et inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), som fortrinnsvis inneholder et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin, for å oppfange syren utviklet under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er forøvrig de vanlige (f.eks. romtemperatur i 30 minutter). Alkylering av aminoterminalen for å oppnå en lavere-alkyl N-substitusjon etterfulgt av omsetning med et syrehalogenid som ovenfor beskrevet, vil gi N-alkylamid-gruppen med formel RC(0)NR-; (b) for å danne en succinimidgruppe ved omsetning med ravsyreanhydrid. Som tidligere kan det benyttes en ca. ekvimolar mengde av et overskudd av ravsyreanhydrid (f.eks. ca. 5 ekvivalenter), og aminogruppen omdannes til succinimidet etter velkjente metoder, heriblant bruk av et overskudd (f.eks. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin, i et egnet inert løsningsmiddel (f.eks. diklormetan). Se for eksempel Wollenberg, et al., US-patent 4.612.132, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Det er underforstått at succin-gruppen kan substitueres med for eksempel C2-Ce-alkyl- eller -SR-substituenter som fremstilles på konvensjonell måte for å gi substituert succinimid i peptidets N-ende. Slike alkyl-substituenter fremstilles ved omsetning av et lavere olefin (C2-C6) med maleinsyreanhydrid som beskrevet av Wollenberg, et al., supra, og -SR-substituenter fremstilles ved omsetning av RSH med maleinsyreanhydrid, hvor R er som definert ovenfor; (c) for å danne en benzyloksykarbonyl-NH- eller en substituert benzyloksykarbonyl-NH-gruppe, ved omsetning med en tilnærmet ekvivalent mengde eller et overskudd av CBZ-C1 (dvs. benzyloksykarbonylklorid) eller et substituert CBZ-C1 i et passende inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan) som fortrinnsvis inneholder et tertiært amin til oppfangning av syren som utvikles under reaksjonen; (d) for å danne en sulfonamidgruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) R-S(0)2C1 i et passende inert fortynningsmmiddel (diklormetan), for å omdanne det terminale amin til et sulfonamid hvor R er som d efinert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. 10 ekvivalenter) tertiært amin, så som diisopropyletylamin, for å oppfange syren som utvikles under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter); (e) for å danne en karbamatgruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-OC(0)Cl eller R-0C(O)OC6H4-p-NO2 i et egnet inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), for å omdanne det terminale amin til et karbamat, hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin for å oppfange eventuell syre utviklet under reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er forøvrig de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i 30 minutter) og (f) for å danne en ureagruppe ved omsetning med en ekvivalent mengde eller et overskudd (f.eks. 5 ekvivalenter) av R-N=C=0 i et passende inert fortynningsmiddel (f.eks. diklormetan), for å omdanne det terminale amin til en ureagruppe (dvs. RNHC(O)NH-) hvor R er som definert ovenfor. Fortrinnsvis inneholder det inerte fortynningsmiddel et overskudd (f.eks. ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, så som diisopropyletylamin.Reaksjonsbetingelsene er forøvrig de konvensjonelle (f.eks. romtemperatur i ca. 30 minutter).
2. C-TERMINALE MODIFIKASJONER
Ved fremstilling av peptid-mimetika hvor den C-terminale karboksylgruppe er erstattet med en ester (dvs. -C(0)OR, hvor R er som definert ovenfor), anvendes de harpikser som er benyttet til fremstilling av peptidsyrene, og det sidekjede-beskyttede peptid spaltes med base og den passende alkohol, f.eks. metanol. Sidekjede-beskyttende grupper fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å opnå den ønskede ester.
Ved fremstilling av peptid-mimetika hvor den C-terminale karboksylgruppe er erstattet med amidet -C(0)NR<3>R<4>, benyttes en benzhydrylamin-harpiks som den faste bærer for peptidsyntesen. Etter fullført syntese resulterer hydrogenfluoird-behandling for å frigjøre peptidet fra bæreren, direkte i det frie peptidamid (dvs. C-terminalen er -C(0)NH2). Alternativt fører anvendelse av den klormetylerte harpiks under peptidsyntesen sammen med omsetning med ammoniakk for å avspalte det sidekjede-beskyttede peptid fra bæreren, til det frie peptidamid, mens omsetning med et alkylamin eller et dialkylamin fører til et sidekjede-beskyttet alkylamid eller dialkylamid (dvs. C-terminalen er -C(0)NRR', hvor R og R<1> er som definert ovenfor). Sidekjede-beskyttelsen fjernes deretter på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amider, alkylamider eller dialkylamider.
I en annen alternativ utførelsesform kan den C-terminale karboksylgruppe eller en C-terminal ester, induseres til cyklisering ved intern fortrengning av -OH-gruppen eller esteren (-OR) av henholdsvis karboksylgruppen eller estergruppen, med den N-terminale aminogruppe, for å danne et cyklisk peptid. Etter syntese og spaltning for å gi peptidsyren, omdannes for eksempel den frie syre til en aktivert ester ved hjelp av en passende karboksylgruppe-aktivator, så som dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i oppløsning, for eksempel i metylenklorid (CH2CI2), dimetylformamid (DMF) blandinger. Det cykliske peptid dannes deretter ved intem fortrengning av den aktiverte ester med det N-terminale amin. Intern cyklisering i stedet for polymerisering, kan forbedres ved anvendelse av meget fortynnede løsninger. Slike metoder er velkjente på området.
Man kan også cyklisere peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller inkorporere en desamino- eller deskarboksy-rest ved peptidendene slik at det ikke forekommer noen terminal amino- eller karboksyl-gruppe, for å nedsette følsomheten overfor proteaser eller for å begrense konformasjonen av peptidet. C-terminale funksjonelle grupper av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy, og de lavere ester-derivater derav, samt farmasøytisk akseptable salter derav.
D. SKJELETT-MODIFIKASJONER
Andre fremgangsmåter for fremstilling av peptid-derivater av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i Hruby et ai, Biochem J. 268(2):249-262 (1990), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen tjener også som struktur-modeller for ikke-peptidiske forbindelser med lignende biologisk virkning. Fagmannen vil innse at det finnes en rekke teknikker for konstruksjon av forbindelser med samme eller lignende ønsket biologisk virkning som leder-peptidforbindelsen, men med gunstigere virkning enn lederforbindelsen med hensyn til løselighet, stabilitet og følsomhet for hydrolyse og proteolyse. Se Morgan & Gainor Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 (1989), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Disse teknikkene innbefatter erstatning av peptid-skjelettet med et skjelett sammensatt av fosfonater, amidater, karbamater, sulfonamider, sekundære aminer og N-metylaminosyrer.
Peptid-mimetika hvor én eller flere av peptidyl-koblingene [-C(0)NH-] er erstattet med koblinger, som f.eks. en -CH2-karbamat-kobling, en fosfonat-kobling, en -CH2-sulfonamid-kobling, en urea-kobling, en sekundær amin (CH2NH-) kobling, og en alkylert peptidyl-kobling [-C(0)NR<6-> hvor R<6> er lavere alkyl] fremstilles ved konvensjonell peptidsyntese ved kun å benytte en passende beskyttet aminosyre-analog i stedet for aminosyre-reagenset på det passende sted under syntesen.
Egnede reagenser innbefatter for eksempel aminosyreanaloger hvor karboksylgruppen i aminosyren er erstattet med en del som kan danne en av de ovennevnte koblinger. Dersom man for eksempel ønsker å erstatte en -C(0)NR-kobling i peptidet med en -CH2-karbamat-kobling (-CH20C(0)NR-), reduseres først karboksylgruppen (-COOH) i en passende beskyttet aminosyre, til -CHaOH-gruppen som så omdannes på konvensjonell måte til en -OC(0)Cl funksjon eller en para-nitrokarbonat -OC(0)0-C6H4-p-N02 funksjon. Omsetning av slike funksjonelle grupper med det frie amin eller med et alkylert amin på
N-enden av det delvis fremstillede peptid som finnes på den faste bærer, fører til dannelse av en -CH20C(0)NR-kobling. Angående en mer detaljert beskrivelse av dannelsen av slike
-CH2-karbamat-koblinger, se Cho et al, Science 261:1303-1305 (1993).
Tilsvarende kan erstatning av en amido-kobling i peptidet med en fosfonat-kobling oppnås som beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 07/943.805, 08/081.577 og 08/119.700, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Erstatning av en amido-kobling i peptidet med en -CH2-sulfonamid-kobling, kan oppnås ved å redusere karboksylgruppen (-COOH) i en passende beskyttet aminosyre til
-CH2OH-gruppen, hvoretter hydroksylgruppen omdannes til en passende utgående gruppe, så som en tosylgruppe, i henhold til konvensjonelle metoder. Omsetning av det tosylerte derivat med for eksempel tioeddiksyre og påfølgende hydrolyse og oksydativ klorering, vil gi den -CH2-S(0)2Cl-funksjonelle gruppe som erstatter karboksylgruppen i den forøvrig passende beskyttede aminosyre. Anvendelse av denne passende beskyttede aminosyreanalog ved peptidsyntese bevirker inklusjon av en -CH2S(0)2NR-kobling som erstatter amido-koblingen i peptidet, hvorved det oppnås et peptid-mimetikum. Angående en mer fullstendig beskrivelse av aminosyrens karboksylgruppe til en -CH2S(0)2Cl-gruppe, se for eksempel Weinstein, Boris Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins Bd. 7. s. 267-357, Marcel Dekker, Inc., New York (1983), som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Erstatning av en amido-kobling i peptidet med en urea-kobling kan oppnås slik som beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 08/147.805, som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse.
Sekundære amin-koblinger hvor en -CH2NH-kobling erstatter amido-koblingen i peptidet, kan fremstilles ved for eksempel å benytte en passende beskyttet dipeptidanalog, hvor amido-koblingens karbonyl-kobling redusert til en CH2-gruppe ved hjelp av konvensjonelle metoder. Når det for eksempel gjelder diglycin, vil reduksjon av amidet til aminet, etter avbeskyttelse, føre til H2NCH2CH2NHCH2COOH, som så benyttes i N-beskyttet form i den neste koblingsreaksjon. Fremstillingen av slike analoger ved reduksjon av karbonylgruppen av amido-koblingen i dipeptidet er velkjent på området.
Den passende beskyttede aminosyreanalog benyttes innen den konvensjonelle peptidsyntese på samme måte som den tilsvarende aminosyre ville bli benyttet. For eksempel benyttes det for denne reaksjon i alminnelighet ca. 3 ekvivalenter av den beskyttede aminosyreanalog. Et inert organisk fortynningsmiddel, som f.eks. metylenklorid eller DMF, benyttes, og når det som biprodukt utvikles en syre, vil løsningsmidlet i alminnelighet bli tilsatt et overskudd av et tertiært amin for å oppfange syren som utvikles. Et særlig foretrukket tertiært amin er diisopropyletylamin som i alminnelighet benyttes i ca. 10 gangers overskudd. Reaksjonen resulterer i at en aminosyreanalog som har en ikke-peptidyl-kobling inkorporeres i peptid-mimetikumet. En slik substitusjon kan om ønskelig gjentas slik at fra null til samtlige av amido-koblingene i peptidet er erstattet med ikke-amido-bindinger.
Man kan oså cyklisere peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen eller inkorporere en desamino- eller deskarboksy-rest i peptid-endene slik at det ikke forekommer noen terminal amino- eller karboksyl-gruppe, for å minske følsomheten for proteaser eller begrense konforma-sjonen av peptidet. C-terminale funksjonelle grupper av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer amid, amid-lavere-alkyl, amid-di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy og lavere ester-derivater derav, samt farmasøytisk akseptable salter derav. Eksempler på cykliserte forbindelser er angitt i Tabell 4, 5,6, 8 og 9.
E. DANNELSE AV DISULFID-BINDINGER
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan forekomme i en cyklisert form med en intramolekylær disulfid-binding mellom tiolgruppene i cysteinene. Alternativt kan det fremstilles en intermolekylær disulfid-binding mellom cysteinenes tiolgrupper for å oppnå en dimer (eller høyere oligomer) forbindelse. En eller flere av cysteinrestene kan også erstattes med homocystein. Disse intramolekylære eller intermolekylære disulfid-derivatene kan gjengis skjematisk som vist nedenfor:
hvor m og n uavhengig av hverandre er 1 eller 2.
Analoger av disse disulfid-derivatene hvor ett av svovelatomene er erstattet med en CH2-gruppe eller annen isoster for svovel kan fremstilles på kjent måte ved en intramolekylær eller intermolekylær fortrengning som vist nedenfor:
hvor p er 1 eller 2. Fagmannen vil lett innse at denne fortrengning også kan skje ved bruk av andre homologer av a-amino-y-smørsyre-derivater vist ovenfor, og homocystein.
Alternativt kan amino-enden av peptidet avsluttes (capped) med en alfa-substituert eddiksyre, hvor alfa-substituenten er en utgående gruppe, så som en ot-halogen-eddiksyre, for eksempel ct-kloreddiksyre, a-bromeddiksyre eller a-jodeddiksyre. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan cykliseres eller dimeriseres ved fortrengning av den utgående gruppe med svovelet i cystein- eller homocystein-resten. Se f.eks. Barker et al, J. Med. Chem. 35:2040-2048 (1992) og Or et al, J. Org. Chem. 56:3146-3149 (1991), som begge herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Eksempler på dimeriserte forbindelser er angitt i Tabell 7, 9 og 10.
V. ANVENDELSE
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nyttige in vitro som unike hjelpemidler for å forstå den biologiske rolle av TPO, inklusivt vurderingen av de mange faktorer som antas å påvirke, og påvirkes av, produksjonen av TPO og den reseptor-bindende prosess. De foreliggende forbindelser er også egnet for utvikling av andre forbindelser som binder seg til, og aktiverer, TPO-R, siden foreliggende forbindelser gir viktig informasjon angående forholdet mellom struktur og aktivitet som burde lette en slik utvikling.
Forbindelsene er også anvendelige som konkurrerende bindingsmidler i tester for screening av nye TPO-reseptoragonister. I slike testformer kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen benyttes uten modifikasjon eller modifiseres på en rekke måter, eksempelvis ved merking, ved at det f.eks. kovalent eller ikke-kovalent, tilføyes en del som direkte eller indirekte gir et påvisbart signal. I alle disse forsøkene kan de angjeldende materialer merkes enten direkte eller indirekte. Muligheter for direkte merking inkluderer merkingsgrupper som: radioaktiv merking, f.eks. I, enzymer (US-patent 3.645.090) så som peroksydase og alkalisk fosfatase, og fluorescensmerking (US-patent 3.940.475) som gjør det mulig å følge endringen i fluorescens-intensitet, bølgelengde-forskyvning eller fluorescens-polarisasjon. Muligheter for indirekte merking inkluderer biotinylering av én av bestanddelene med påfølgende binding til avidin koblet til én av ovennevnte merkingsgrupper. Forbindelsene kan også innbefatte spacere eller linkere i tilfeller hvor forbindelsene skal tilkobles til en fast bærer.
På basis av deres evne til å binde seg til TPO-reseptoren, kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, dessuten benyttes som reagenser for påvisning av TPO-reseptorer på levende celler, fikserte celler, i biologiske væsker, i vevshomogenater, i rensede, naturlige biologiske materialer, etc. Ved å merke slike peptider kan man for eksempel identifisere celler som har TPO-R på overflaten. I tillegg kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som følge av deres evne til å binde seg til TPO-reseptorer, benyttes ved in situ farving, FACS (fluorescense-activated cell sorting), western blotting, ELISA, etc. I tillegg kan peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som følge av deres evne til å binde seg til TPO-reseptorer, benyttes ved reseptor-rensing eller ved rensing av celler som uttrykker TPO-reseptorer på celleoverflaten (eller inne i permeabiliserte celler).
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også benyttes som kommersielle reagenser for diverse medisinske forsknings- og diagnose-formål. Slike anvendelser innbefatter, men er ikke begrenset til: (1) anvendelse som en kalibreringsstandard for kvantifisering av TPO-agonistkandidater i en rekke funksjonstester; (2) anvendelse for å opprettholde proliferasjonen og veksten i TPO-avhengige cellelinjer; (3) anvendelse ved strukturanalyse av TPO-reseptorer via ko-krystallisasjon; (4) anvendelse for å undersøke mekanismen av TPO-signaltransduksjon/reseptoraktivering og (5) andre forsknings- og diagnose-anvendelser hvor TPO-reseptoren fortrinnsvis aktiveres eller hvor slik aktivering lettvint kalibreres mot en kjen t mengde av en TPO-agonist, og lignende.
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes for in vitro ekspansjon av megakaryocytter og deres tilhørende progenitorceller, både i sammenheng med ytterligere cytokiner eller som sådanne. Se f.eks. DiGiusto et al., PCT publikasjon nr. 95/05843 som herved med hele sitt innhold inkorporeres i foreliggende beskrivelse. Kjemoterapi og strålebehandling bevirker trombocytopeni ved å drepe de hurtig delende, mer modne, megakaryocytt-populasjoner. Disse terapeutiske behandlingene kan også redusere antallet og levedyktigheten av de umodne, mindre mitotisk aktive megakaryocytt-forløperceller. Lindring av trombocytopenien ved hjelp av TPO eller forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan påskyndes ved at pasienten etter kjemoterapi eller strålebehandling, infuseres en populasjon av vedkommendes egne celler som er anriket på megakaryocytter og umodne forløperceller ved in vitro dyrkning.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også administreres til varmblodige dyr, inklusivt mennesket, for å aktivere TPO-R in vivo. Eksempelvis kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres for å behandle en rekke hematologiske forstyrrelser, inklusivt, men ikke begrenset til, blodplateforstyrrelser og trombocytopeni, særlig når denne er assosiert med benmargtransfusjoner, strålebehandling og kjemoterapi.
Aktiviteten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan evalueres enten
in vitro eller in vivo i en av de mange modeller som er beskrevet i McDonald Am. J. Of Pediatric Hematology/Oncology 14:8-21 (1992).
Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet til behandling av trombocytopeni assosiert med benmargstransfusjoner, strålebehandling eller kjemoterapi. Forbindelsene kan i alminnelighet bli administrert profylaktisk før kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransplantasjon eller etter en slik eksponering.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres peroralt, pulmonalt, parenteralt (intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs (i.v.) eller subkutan injeksjon), inhalasjon (ved hjelp av en finpulver-formulering), transdermalt, nasalt, vaginalt, rektalt eller sublingvalt, og kan formuleres i doseringsformer som er egnet for den respektive administrasjonsmåte. Se feks. Bernstein et al, PCT patentpublikasjon nr. WO 93/25221; Pitt et al. PCT patentpublikasjon nr. WO 94/17784; og Pitt et al, Europeisk patentsøknad 613.683.
Faste doseringsformer for peroral administrering er bl.a. kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faste doseringsformer er virkestoffet blandet med minst én inert farmasøytisk akseptabel bærer, så som sukrose, laktose eller stivelse. Slike doseringsformer kan også omfatte, hvilket også er normal praksis, ytterligere substanser utenom inerte fortynningsmidler, f.eks. glattemidler, så som magnesiumstearat. Når det gjelder kapsler, tabletter og piller, kan doseringsformene også omfatte buffere. Tabletter og piller kan dessuten fremstilles med enteriske overtrekk.
Flytende doseringsformer for peroral administrering innbefatter farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper og miksturer som inneholder inerte fortynningsmidler som vanligvis benyttes på området, f.eks. vann. Foruten slike inerte løsningsmidler kan blandingene også inneholde hjelpestoffer, så som fuktemidler, emulgerings- og suspenderings-midler, samt søtningsmidler, smaksforbedrende midler og parfymerende midler.
Preparater for parenteral administrering innbefatter sterile, vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige løsningsmidler eller bæremidler, er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, som olivenolje og maisolje, gelatin og injiser bare organiske estere, som f.eks. etyloleat. Slike doseringsformer kan også inneholde hjelpestoffer som f.eks. konserveringsmidler, fuktemidler, emulgerings-midler og dispergeringsmidler. De kan steriliseres for eksempel ved filtrering gjennom et filter som holder igjen bakterier, ved inkorporering av steriliseirngsmidler i blandingene, ved bestråling av blandingene eller ved oppvarming av blandingene. De kan også fremstilles ved å benytte sterilt vann, eller et annet sterilt injiser bart medium, umiddelbart før bruk.
Blandinger for rektal eller vaginal administrering er fortrinnsvis suppositorier som i tillegg til virkestoffet kan inneholde hjelpestoffer som kakaosmør eller suppositorievoks. Blandinger for nasal eller sublingval administrering fremstilles også med vanlige velkjente hjelpestoffer.
Blandingene som inneholder forbindelsene, kan administreres for profylaktiske og/eller terapeutiske behandlinger. Ved terapeutiske anvendelser administreres blandingene til en pasient som allerede lider av en sykdom, som beskrevet ovenfor, i tilstrekkelig mengde til å helbrede eller i det minste delvis stanse, symptomene på sykdommen og dens komplikasjoner. En riktig mengde for å oppnå dette er definert som en «terapeutisk effektiv dose». Mengder som er effektive for denne anvendelse vil avhenge av sykdommens alvor og pasientens vekt og generelle tilstand.
Blandingene ifølge oppfinnelsen kan også mikro-innkapsles, for eksempel ifølge Tice & Bibi (i Treatise on Controlled Drug Delivery, red. A. Kydonieus, Marcel Dekker, N.Y.(1992), s. 315-339).
Ved profylaktiske anvendelser administreres blandingene som inneholder virke-stoffene ifølge oppfinnelsen, til en pasient som er følsom for eller på annen måte risikerer en bestemt sykdom. En slik mengde er definert som en «profylaktisk effektiv dose». Ved slik anvendelse avhenger den nøyaktige mengde igjen av pasientens helsetilstand og vekt.
De mengder av TPO-agonisten som er nødvendig for effektiv terapi, vil avhenge av mange ulike faktorer, heriblant administrasjonsmåle, målsete, pasientens fysiologiske tilstand og av andre administrerte medikamenter. Behandlingsdosene bør derfor innstilles med henblikk på optimal sikkerhet og effektivitet. Doseringer som benyttes in vitro kan i alminnelighet gi nyttig veiledning med hensyn til egnede metoder for in situ administrering av disse reagensene. Utprøving i dyreforsøk av effektive doser for behandling av bestemte sykdommer vil dessuten gi indikasjon på dosering til mennesker. Forhold å ta i betraktning er beskrevet, f.eks. i Gilman et al., (red.) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. utg., Pergamon Press (1990); og Remington's Pharmaceutical Sciences, 7. utg., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985).
Peptidforbindelsene ifølge denne oppfinnelse er følgelig virksomme ved behandling av TPO-medierte tilstander når de administreres i doseområder fra ca. 0,001 til ca. 10 mg/kg legemsvekt per dag. Den bestemte dose som benyttes reguleres av den tilstand som skal behandles, administrasjonsmåten så vel som av behandlende leges vurdering av slike faktorer som situasjonens alvor, pasientens alder og generelle tilstand og lignende.
EKSEMPEL 1
FASEFASE-PEPTIDSYNTESE
En rekke peptidforbindelser ifølge oppfinnelsen ble syntetisert ved å benytte fastfase-synteseteknikken til Merrifield (se Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utg. Pierce Chemical Rockford, IL (1984) og Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149
(1963)) på et Milligen/Biosearch 9600 automatisert instrument eller en Applied Biosystems Inc., modell 43IA peptid-syntesemaskin. Peptidene ble satt sammen ved å benytte standard protokoller ifølge Applied Biosystems Inc. System Software versjon 1,01. Hver kobling ble foretatt i 1 til 2 timer med BOP (benzotriazolyl-N-okstris-dimetylaminofosfoniumheksa-fluorfosfat) og HOBT (1-hydroksybenzotriazol).
Den anvendte harpiks var HMP-harpiks eller PAL (Milligen/Biosearch), som er en kryssbundet rwlystyrenharpiks med 5-(4'-Fmoc-aminometyl-3,5'-dimetoksyfenoksy)-valeriansyre som linker. Bruk av PAL-harpiks resulterer i en karboksylterminal amid-funksjon etter spaltning av peptidet fra harpiksen. Etter avspaltning fører HMP-harpiksen til en karboksylsyredel i sluttproduktets C-terminal. De fleste reagenser, harpikser og beskyttede aminosyrer (frie eller på harpiksen) ble anskaffet fra Millipore eller Applied Biosystems Inc.
Fmoc-gruppen ble benytte for amino-beskyttelse under koblingsprosessen. Beskyttelse av primært amin på aminosyrer ble oppnådd med Fmoc, og grupper for beskyttelse av sidekjeder var t-butyl for serin, tyrosin, asparagin, glutaminsyre og treonin; trityl for glutamin; PMC (2,2,5,7,8-pentametyIkroma-sulfonat) for arginin; N-t-butyloksykarbonyl for tryptofan; N-trityl for histidin og glutamin og S-trityl for cystein.
Fjerning av peptidene fra harpiksen og samtidig avbeskyttelse av sidekjede-funksjonene ble oppnådd ved behandling med reagens K eller små modifikasjoner derav. Ved syntesen av disse peptidene med en amidert karboksyl-terminal ble det fullstendig sammensatte peptid alternativt avspaltet med en blanding av 90% trifluoreddiksyre, 5% etandiol og 5% vann, innledningsvis ved 4°C og gradvis økende til romtemperatur. De avbeskyttede peptidene ble utfelt med dietyleter. I alle tilfeller ble rensingen foretatt ved preparativ, omvendt-fase HPLC på en Cl 8-bundet silikagelkolonne med en gradient av acetonitril/vann i 0,1% trifluoreddiksyre. De homogene peptidene ble karakterisert ved hjelp av FAB (Fast Atom Bombardment) massespektrometri eller elektrospray massespektrometri og eventuelt ved aminosyreanalyse.
EKSEMPEL 2
BIOTESTER
Bioaktiviteten av peptidene kan måles ved å benytte en test basert på trombopoietin-avhengig celleproliferasjon. IL-3-avhengige Ba/F3-celler fra mus ble transfektert med full-lengde human TPO-R. Når IL-3 ikke er tilstede (WEHI-3 kondisjonert medium), er disse cellene avhengige av TPO for proliferasjon. Den parentale, ikke-transfekterte cellelinje gir ikke respons på human TPO, men forblir IL-3-avhengig.
Det er foretatt biotester på begge ovennevnte cellelinjer ved å benytte syntetiske peptider som skriver seg fra bibliotek-screening. Cellene ble dyrket i komplett RPMI-10 medium inneholdende 10% WEHI-3 kondisjonert medium, deretter vasket to ganger i PBS, resuspendert i medium som manglet WEHI-3 kondisjonert medium og tilsatt til brønner inneholdende fortynninger av peptid eller TPO på 2 x IO<4> celler/brønn. Cellene ble inkubert i 48 timer ved 37°C i fuktighetsregulert 5% CO2 atmosfære, og den metabolske aktiviteten ble bestemt gjennom reduksjonen av MTT til formazan, idet absorbansen ved 570 nm ble målt på en ELISA-plateleser. De undersøkte peptidene stimulerte som vist på Figur 1, proliferasjon av TPO-R transfekterte Ba/F3-celler på dose-avhengig måte. Disse peptidene har ingen effekt på den parentale cellelinje.
EKSEMPEL 3
BINDINGSAFFINITET
Bindingsaffinteter av kjemisk syntetiserte peptider for TPO-R ble målt ved en kompetitiv bindingstest. Brønnene i en mikrotiterplate ble dekket med 1 mg streptavidin, blokkert med PBS/1% BSA, etterfulgt av 50 ng biotinylert anti-reseptor immobiliserende antistoff (Abl79). Brønnene ble deretter behandlet med en 1:10 fortynning av løselig TPO-R høsting. Forskjellige konsentrasjoner av peptid eller peptid-mimetikum ble blandet med en konstant mengde av en trunkert form av TPO bestående av restene 1-56 fusjonert til C-terminalen av maltose-bindende protein (MBP-TPO1S6). Blandingene av peptidet MBP-TPO]56 ble tilsatt til de TPO-R-dekkede brønnene, inkubert i 2 timer ved 4°C og deretter vasket med PBS. Den mengde MPB-TPO156 som ble bundet ved likevekt, ble målt ved å tilsette et kanin-anti-serum rettet mot MPB, og deretter alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-kanin IgG. Mengden av alkalisk fosfatase i hver brønn ble deretter bestemt ved hjelp av standardmetoder.
Testen foretas med en rekke peptidkonsentrasjoner og resultatene avsettes i et diagram hvor y-aksen representerer mengden av bundet MBP-TPO156 og x-aksen representerer konsentrasjonen av peptid eller peptid-mimetikum. Man kan deretter bestemme den konsentrasjon hvor peptidet eller peptid-mimetikumet ville redusere mengden av MBP-TPO156 bundet til immobilisert TPO-R med 50% (IC50). Dissosiasjonskonstanten (Kd) for peptidet vil tilsvare den målte IC50 under bruk av de ovenfor beskrevne testbetingelser.
EKSEMPEL 4
«PEPTIDER PÅ PLASMIDER»
Vektoren pJS142 benyttes for bibliotek-konstruksjon og er vist i Figur 4. Bibliotek-konstruksjonene fordrer tre oligonukleotidsekvenser: ON-829 (5' ACC ACC TCC GG); ON-830 (5' TTA CTT AGT TA) og et bibliotek-spesifikt oligonukleotid av interesse (5' GA GGT GGT [NNK]n TAA CTA AGT AAA GC), hvor [NNK]n angir en tilfeldig region av ønsket lengde og sekvens. Oligonukleotidene kan 5'-fosforyleres kjemisk under syntesen eller etter rensing, med polynukleotidkinase. De hybridiseres deretter i et 1:1:1 molart forhold og ligeres til vektoren.
Den E. coli stamme som fortrinnsvis benyttes for panning har genotypen «A( srl-recA) endAl nupG lon- ll sulAl hsdRl 7 A( ompT- fepC) 266 AclpA319::kan Alacl lac ZU118 som kan fremstilles fra en E. coli stamme fra E. coli Genetic Stock Center ved Yale University ( E. coli b/r, Stock Center-betegnelse CGSC:6573) med genotype lon- ll sulAl. Ovennevnte E. coli stamme tilberedes for anvendelse ved elektroporering som beskrevet av Dower et al., Nucleic Acids Res. 16:6127 (1988), bortsett fra at det benyttes 10% glycerol i alle vasketrinn. Cellene effektivitetstestes ved å benytte 1 pg av et Bluescript plasmid (Stratagene). Disse cellene benyttes for dyrkning av det opprinnelige bibliotek og for amplifisering av den anrikede populasjon etter hver panning-runde.
Peptider på plasmider frigjøres fra celler for panning ved forsiktig enzymatisk oppslutning av celleveggen under bruk av lysozym. Etter pelletering av cellebrokkene, kan det rå lysatet benyttes direkte på de fleste reseptorer. Dersom det trengs ytterligere rensing av plasmidkompleksene, kan det benyttes en gelfiltreringskolonne for å fjerne mange av de lavmolekylære forurensningene i det rå lysatet.
Panning foretas i en buffer (HEKL) med lavere saltkonsentrasjon enn de fleste fysiologiske buffere. Panning kan foretas i mikrotiterbrønner med en reseptor immobilisert på et ikke-blokkerende monoklonalt antistoff (MAb) eller ved panning på kuler eller på en kolonne. Nærmere bestemt kan det i den første panning-runde benyttes 24 brønner som alle er dekket med reseptor. I den andre runden benyttes i alminnelighet 6 brønner dekket med reseptor (PAN-prøve) og 6 brønner uten reseptor (NC-prøve). Sammenligning av plasmid-antallet i disse to prøvene kan gi en indikasjon på hvorvidt reseptorspesifikke kloner anrikes gjennom panning. «Anrikning» er definert som forholdet mellom PAN-transformanter og de som er gjenvunnet fra NC-prøven. En 10 gangers anrikning er i alminnelighet en indikasjon på tilstedeværelse av reseptorspesifikke kloner.
I senere panning-runder er det gunstig å redusere innførselen av lysat i brønnene for å nedsette uspesifikk bakgrunnsbinding av plasmidkompleksene. I runde 2 benyttes vanligvis 100 uL lysat per brønn. I runde 3 benyttes per brønn 100 uL lysat fortynnet med 1/10 i HEKL/BSA. For ytterligere panning-runder benyttes i alminnelighet en tilførsel av plasmid-omdannende enheter på minst 1000 ganger mer enn den anslåtte gjenværende diversitet.
Bindingsegenskapene til peptidene kodet av individuelle kloner undersøkes i alminnelighet etter 3,4 eller 5 panning-runder, avhengig av de observerte anrikningsverdier. I alminnelighet benyttes en ELISA som påviser reseptorspesifikk binding med Lacl-peptid-fusjonsproteiner. Lad er i alminnelighet en tetramer, og den minimale funksjonelle DNA-bindingsart er en dimer. Peptidene opptrer således multivalent på fusjonsproteinet. Under forutsetning av at det i brønnene kan immobiliseres en tilstrekkelig reseptortetthet, vil peptidene fusjonert til LacI binde seg til overflaten på en kooperativ, multivalent måte. Denne kooperative binding gjør det mulig å påvise bindingsbegivenheter av lav naturlig affinitet. Følsomheten for denne test har den fordel at de innledende treff av lav affinitet lett kan identifiseres, men har den ulempe at signalet ved ELISA ikke er korrelert med peptidenes naturlige affinitet. Fusjon av peptidene til maltose-bindende protein (MBP) slik som beskrevet nedenfor, gjør det mulig å foreta en testing ved ELISA, hvor signalstyrken er bedre korrelert med affinitet. Se Figur 5A-B.
DNA fra interessante kloner kan fremstilles i dobbeltkjedet form ved å benytte en hvilken som helst standard miniprep prosedyre. Den kodende sekvens av interessante enkeltkloner eller populasjoner av kloner, kan overføres til vektorer som fusjonerer disse sekvensene i ramme med det gen som koder for MBP, et protein som i alminnelighet forekommer som en monomer i løsning. Kloningen av et bibliotek inn i pJS142 frembringer et BspEI-restriksjonssete nær begynnelsen av bibliotekets tilfeldig kodende region. Kutting med BspEI og Seal muliggjør rensing av et ~900 bp DNA-fragment som kan subklones inn i den ene av to vektorer, pELM3 (cytoplasmatisk) eller pELM15 (periplasmatisk), som er enkle modifikasjoner av henholdsvis pMALc2- og pMALp2-vektorene som er kommersielt tilgjengelige fra New England Biolabs. Se Figur 5 A-B. Kutting av pELM og pELM15 med Agel og Seal muliggjør effektiv kloning av BspEI-Scal-fragmentet fra pJS142-biblioteket. BspEI- og Agel-endene er forlikelige med hensyn til ligering. Korrekt ligering av Scal-setene er dessuten essensiell for å frembringe et funksjonelt bla (Amp-resistens) gen, hvorved nivået av bakgrunnskloner fra uønskede ligeringer senkes. Ekspresjon av de tac-promotor-styrte MBP-peptidfusjoner kan deretter induseres med IPTG.
Lysater for LacI- MBP-ELISA tilberedes fra individuelle kloner ved å lysere celler under bruk av lysozym, og fjerne uløselige cellebrokker ved sentrifugering. Lysatene tilsettes deretter til brønner som inneholder immobilisert reseptor, og til kontrollbrønner uten reseptor. Binding med LacI- eller MBP-pepudfusjonene påvises ved inkubering med et kaninpolyklonalt antiserum rettet mot enten LacI eller MBP, etterfulgt av inkubering med alkalisk fosfatase-merket geit anti-kanin sekundært antistoff. Den bundne alkaliske fosfatase påvises med p-nitrofenylfosfat som farvegivende substrat.
EKSEMPEL 5
«HEADPIECE DIMER» SYSTEM
En variant av LacI peptider-på-plasmider teknikken utnytter et DNA-bindende
protein betegnet «headpiece dimer». DNA-binding av E. coli lac repressoren medieres av det ca. 60 aminosyrers «headpiece» domenet. Dimeren av headpiece domenet som binder seg til /ac-operatoren dannes normalt ved assosiasjon med det vesentlig større, ca. 300 aminosyrers C-terminale domenet. Dette «headpiece dimer» systemet utnytter headpiece dimer-molekyler som inneholder to «headpieces» forbundet via en kort peptidlinker. Disse proteinene binder
DNA med tilstrekkelig stabilitet til assosiering av en peptid-epitop som opptrer ved C-enden av headpiece-dimeren, med plasmidet som koder for peptidet.
De tilfeldige peptidene fusjoneres til C-enden av headpiece-dimeren som binder seg til det plasmid som kodet dette, for å fremstille et peptid-headpiece-dimer-plasmidkompleks som kan underkastes screening ved panning. Headpieace-dimer systemet peptider-på-plasmider, gir mulighet for større selektivitet for høyaffinitetsligander enn Lacl-systemet. Systemet headpiece dimer er således nyttig for fremstilling av mutagenese-bibliotek basert på initiale lav-affinitets treff og selektering av høyere affinitets varianter av disse initiale sekvensene.
Bibliotekene konstrueres som med peptider på plasmider ved å benytte headpiece dimer vektor pCMG14 (se Figur 6A-C). Nærværet av /ac-operatoren fordres ikke for plasmid-binding av headpiece-dimer-proteinet. Bibliotekene ble innført i en bakteriestamme omfattende E. coli ( lon- ll sulAl hsdR17 ( ompT- fepC) AclpA319::kan Alacllac ZU118 A( srl- recA) 306::TnlO og amplifisert under betingelser for basal (A) promotorinduksjon. Panning av headpiece dimer-bibliotek foretas ved hjelp av lignende fremgangsmåter som de benyttet for Lacl-biblioteker, bortsett fra HEK-buffer benyttes i stedet for HEKL-buffer og at eluering av plasmider fra veggene foretas med vandig fenol i stedet for med IPTG. Sekvenser fra headpiece dimer panning karakteriseres ofte etter overføring til MBP-vektoren slik at de kan testes i den affinitetsfølsomme MBP ELISA og også slik at populasjoner av kloner kan underkastes screening ved hjelp av koloni-avtrykk med merket reseptor.
EKSEMPEL 6
I dette eksempel ble cykliserte forbindelser underkastet tre tester. Først ble ICso-verdier oppnådd som beskrevet ovenfor. Deretter ble det foretatt en MTT-celleproliferasjonstest som beskrevet ovenfor, for å beregne ECso-verdier. Tilslutt ble det foretatt en mikrofysiometertest (Molecular Devices Corp.). Ved denne test ble hastigheten av surgjøringen av det ekstracellulære medium som respons på TPO-reseptorstimulering med forbindelsene ifølge oppfinnelsen, bestemt. ECso-områdene er angitt symbolsk som ovenfor beskrevet for IC50. Resultatene er sammenfattet i Tabell 4.
EKSEMPEL 7
I dette eksempel ble erstatninger av aminosyrene i posisjonene D, E, I, S eller F i den cykliserte forbindelse
undersøkt med henblikk på EC50- og ICso-verdier som beskrevet ovenfor. Mikrofysiometer-resultater er angitt i parentes. Resultatene er sammenfattet nedenfor i Tabell 5.
EKSEMPEL 8
I dette eksempel ble aminosyre-substitusjoner i forbindelsen
i posisjonene D, S eller F som angitt nedenfor i Tabell 6, evaluert. EC50- og ICso-verdier ble beregnet som beskrevet ovenfor. Mikrofysiometer-resultater er angitt i parenteser.
EKSEMPEL 9
I dette eksempel ble EC50- og ICso-verdier beregnet som beskrevet ovenfor for dimer-forbindelsene angitt nedenfor i Tabell 7. Den cykliserte monomer
er inkludert for sammenligning.
Forbindelsene i Tabell 8 var inaktive i den maksimalt testede konsentrasjon på 10 nm.
I Tabell 9 er EC50- og ICso-verdier, bestemt som beskrevet ovenfor for cykliserte og dimeriserte varianter avIEGPTLRQWLAARA sammenlignet.
I Tabell 10 er trunkeringer av dimeren
sammenlignet. EC50- og ICso-verdier ble beregnet som beskrevet ovenfor. Mikrofysiometer-resultater er angitt i parenteser.
EKSEMPEL 10
I dette eksempel ble det foretatt forskjellige substitusjoner i posisjonene G, P og W i den cykliserte forbindelse
Tabell 11 angir eksempler på substituerte forbindelser som oppviser TPO-agonist-aktivitet. Substitusjonene som i tabellen er forkortet, er som følger:
Prolin-erstatninger
Tryptofan-erstatninger
Glycin-erstatninger
EKSEMPEL 11
For å fastslå hvorvidt mus er egnet som hensiktsmessige forsøksdyr, er det foretatt flere in vitro eksperimenter beregnet på å måle aktiviteten av testforbindelsene på musereseptorer. I første omgang ble margceller, høstet fra lårbenet til 8-9 uker gamle Balb/C-mus, inkubert i 7 dager i væskekultur med enten rhuTPO eller forskjellige konsentrasjoner av testpeptidene. Etter avsluttet inkubering ble kulturene konsentrert med Cytospin, farvet for acetylcholinesterase (AChE, et diagnostikum for muse-megakaryocytter) og tellet under mikroskopering. Et (1) nM rhuTPO førte til vekst av meget store (<40 um) ikke-adhererende celler som farvet for AChE. Disse cellene synes å være modne megakaryocytter. Fra en initial utsåing av 10<6>helmargceller/mL (i 50 mL kulturer) utviklet det seg anslagsvis 1-2 x 10<6> megakaryocytter. Denne respons på TPO ble betegnet «maksimal». Kontrollkulturer uten tilsatt vekstfaktor produserte meget få AChE-positive celler. Flere av peptidforbindelsene ble i denne test undersøkt i høye konsentrasjoner, og resultatene er sammenfattet i Tabell 12. En konsentrasjon av peptid A på 10 uM ga en maksimal respons i musemargen. Dette funn var den første indikasjon på at denne peptidfamilie er aktive på murinreseptoren. I et andre eksperiment ble margceller høstet og dyrket i halvfast medium (metylcellulose) enten uten noen faktor eller inneholdende 1 nm rhuTPO eller 10 uM peptid A. Etter dyrkning i 7 dager ble kolonier av store celler (antatt å være megakaryocytter) tellet og gruppert i små kolonier (3-5 celler) eller større kolonier (mer enn 6 celler). Resultatene er vist i Tabell 13. TPO og testpeptidene produserte begge vesentlig flere kolonier av begge størrelser enn de negative kontrollkulturene. Dette tyder på at peptidene etterligner TPO med hensyn til evnen til å stimulere ekspansjonen av celle-populasjonen av MK-forløpercellen.
For å oppnå en mer kvantitativ sammenligning av aktiviteten av testforbindelsene på murine og humane reseptorer, ble muTPO-reseptoren klonet og transfektert inn i BaF3-celler. Det ble isolert en TPO-avhengig cellepopulasjon.

Claims (10)

1. Forbindelse, karakterisert ved at forbindelsen omfatter en sekvens av aminosyrer: hvor Xi er C, eller P, X2 er T, X3 er L, X4 er R, X5 er E eller Q, X6 er W og X7 er L.
2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at forbindelsen er et peptid, og hvor fra null til alle -C(0)NH-koblingene i peptidet er erstattet av en kobling valgt fra gruppen bestående av en -CH20C(0)NR-kobling; en fosfonatkobling; en -CH2-S(0)2NR-kobling; en -CH2NR-kobling; en -C(0)NR<6->kobling og en -NHC(0)NH-kobling, hvor R er hydrogen eller lavere alkyl og R<6> er lavere alkyl: hvor dessuten N-enden i nevnte peptid eller peptid-mimetikum er valgt fra gruppen bestående av en -NRR'-gruppe; en -NRC(0)R-gruppe; en -NRC(0)OR-gruppe; en -NRS(0)2R-gruppe; en -NHC(0)NHR-gruppe; en succinimidgruppe; en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe; og en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe som på fenylringen har fra 1 til 3 substituenter, valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, lavere alkoksy, klor og brom, hvor R og R<1> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor ytterligere C-enden av nevnte peptid eller peptid-mimetikum har formelen -C(0)R<2>, hvor R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydroksy, lavere alkoksy og -NR<3>R<4>, hvor R<3> og R<4> uavhengig er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og lavere alkyl, og hvor nitrogenatomet i NR<3>R<4->gruppen eventuelt kan være amingruppen i peptidets N-ende slik at det dannes et cyklisk peptid, og fysiologisk akseptable salter derav.
3. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter forbindelsen ifølge krav 1, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen er dimerisert.
5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at forbindelsen omfatter aminosyresekvensen: hvor X2 er T, X3 L, X4 er R, X5 er Q, X6 er W og X7 er L.
6. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte forbindelse omfatter aminosyresekvensen: hvor X2 er T, X3 er L, X4 er R, X5 er E eller Q, X$ er W, X7 er L og Xg er en hvilken som helst av de 20 genetisk kodede L-aminosyrene.
7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at Xg er G, S, Y eller R.
8. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at forbindelsen omfatter aminosyresekvensen: GGCTLREWLHGGFCGG.
9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte forbindelse er valgt fra gruppen bestående av
10. Forbindelse som binder til trombopoietinreseptorer, karakterisert ved at nevnte forbindelse er valgt frå gruppen bestående av
NO19975705A 1995-06-07 1997-12-05 Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding. NO317737B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48530195A 1995-06-07 1995-06-07
US47812895A 1995-06-07 1995-06-07
PCT/US1996/009623 WO1996040750A1 (en) 1995-06-07 1996-06-07 Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO975705D0 NO975705D0 (no) 1997-12-05
NO975705L NO975705L (no) 1998-02-05
NO317737B1 true NO317737B1 (no) 2004-12-13

Family

ID=27045796

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19975705A NO317737B1 (no) 1995-06-07 1997-12-05 Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding.
NO20041296A NO331550B1 (no) 1995-06-07 2004-03-29 Forbindelser som bindes til trombopoietinreseptor samt farmasoytisk sammensetning.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20041296A NO331550B1 (no) 1995-06-07 2004-03-29 Forbindelser som bindes til trombopoietinreseptor samt farmasoytisk sammensetning.

Country Status (27)

Country Link
US (2) US6083913A (no)
EP (4) EP0885242B1 (no)
JP (1) JP3059218B2 (no)
KR (1) KR100436680B1 (no)
CN (2) CN1315870C (no)
AR (1) AR003431A1 (no)
AT (1) ATE390439T1 (no)
BR (1) BR9608587A (no)
CA (2) CA2223449C (no)
CZ (1) CZ291749B6 (no)
DE (1) DE69637473T2 (no)
DK (1) DK0885242T3 (no)
EA (1) EA001220B1 (no)
ES (1) ES2303338T3 (no)
HK (1) HK1015380A1 (no)
HU (1) HU227678B1 (no)
IL (1) IL122102A (no)
MX (1) MX9709315A (no)
NO (2) NO317737B1 (no)
NZ (1) NZ310778A (no)
PE (1) PE7898A1 (no)
PL (1) PL188795B1 (no)
PT (1) PT885242E (no)
TR (1) TR199701526T1 (no)
TW (1) TW518341B (no)
WO (1) WO1996040750A1 (no)
ZA (1) ZA964814B (no)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
DK0885242T3 (da) * 1995-06-07 2008-07-14 Glaxo Group Ltd Peptider og forbindelser, der binder til en trombopoietinreceptor
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US6172210B1 (en) * 1996-04-02 2001-01-09 Blood Center Research Foundation DNA encoding phospholipid scramblase
US7091311B2 (en) 1996-06-07 2006-08-15 Smithkline Beecham Corporation Peptides and compounds that bind to a receptor
US6593456B1 (en) * 1996-11-06 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Tumor necrosis factor receptor releasing enzyme
US6930084B1 (en) 1996-11-06 2005-08-16 The Regents Of The University Of California Treating arthritis with TNF receptor releasing enzyme
US6121416A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US6420518B1 (en) 1997-04-04 2002-07-16 Genetech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
WO1999052877A1 (en) * 1998-04-14 1999-10-21 Smithkline Beecham Corporation Receptor ligands
CN1810832B (zh) * 1998-10-23 2012-12-12 麒麟-安姆根有限公司 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1141014B1 (en) 1999-01-06 2004-12-08 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor (igf) i mutant variant
US6911314B2 (en) 1999-05-14 2005-06-28 The Regents Of The University Of California Screening for drugs that affect TNF receptor releasing enzyme
EP1216037A2 (en) 1999-09-21 2002-06-26 Emory University Methods and compositions for treating platelet-related disorders using mpl pathway inhibitory agents
TWI284639B (en) 2000-01-24 2007-08-01 Shionogi & Co A compound having thrombopoietin receptor agonistic effect
EP1282437B1 (en) 2000-05-16 2008-03-19 Genentech, Inc. Treatment of cartilage disorders
CY2010012I2 (el) 2000-05-25 2020-05-29 Novartis Ag Μιμητικα θρομβοποιητινης
WO2001092211A1 (fr) * 2000-05-30 2001-12-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composes possedant des activites analogues a celles de la thrombopoietine
ATE544785T1 (de) 2000-12-05 2012-02-15 Alexion Pharma Inc Rationell entworfene antikörper
US7396917B2 (en) 2000-12-05 2008-07-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rationally designed antibodies
US6958213B2 (en) 2000-12-12 2005-10-25 Alligator Bioscience Ab Method for in vitro molecular evolution of protein function
EP1361220A4 (en) 2001-01-26 2005-09-07 Shionogi & Co CYCLIC COMPOUNDS WITH THROMBOPOIETIN RECEPTAGONISM
WO2002078612A2 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Euro-Celtique S.A. Thrombopoietin (tpo) synthebody for stimulation of platelet production
US7332474B2 (en) * 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US20030093229A1 (en) * 2001-11-06 2003-05-15 Wang Ho Chris Meichung System and method for improved computer drug design
ES2416304T3 (es) * 2002-01-18 2013-07-31 Astellas Pharma Inc. Derivado de 2-acilaminotiazol o sal del mismo
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
TWI280128B (en) 2002-05-22 2007-05-01 Smithkline Beecham Corp 3'-[(2Z)-[1-(3,4- dimethylphenyl)-1,5-dihydro-3-methyl-5-oxo-4H-pyrazol-4-ylidene]hydrazino]-2'-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-carboxylic acid bis-(monoethanolamine)
US20040028661A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Bartelmez Stephen H. Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta
US7851503B2 (en) 2002-08-14 2010-12-14 Nissan Chemical Industries, Ltd. Thrombopoetin receptor activator and process for producing the same
CA2499625A1 (en) 2002-09-18 2004-04-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production
FI20021762A0 (fi) * 2002-10-03 2002-10-03 Karyon Oy Ab Ltd Uusia terapeuttisia aineita ja valmisteita
TWI324593B (en) 2002-10-09 2010-05-11 Nissan Chemical Ind Ltd Pyrazolone compounds and thrombopoietin receptor activator
US7736909B2 (en) * 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
MXPA05012313A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.
EP1628686A2 (en) 2003-05-12 2006-03-01 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptides
ATE428727T1 (de) 2003-05-12 2009-05-15 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
BRPI0411160A (pt) * 2003-05-12 2006-07-11 Affymax Inc novos compostos modificados com poli(glicol etilênico) e usos dos mesmos
WO2004108078A2 (en) * 2003-06-02 2004-12-16 Alexion Pharmaceuticals Inc. Rationally designed antibodies
WO2005014561A1 (ja) 2003-08-12 2005-02-17 Shionogi & Co., Ltd. トロンボポエチン受容体アゴニスト作用を有する化合物
US7723295B2 (en) * 2003-08-28 2010-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Peptides and compounds that bind to a receptor
MXPA06002292A (es) * 2003-08-28 2006-09-04 Johnson & Johnson Peptidos y compuestos que se unen a un receptor.
TW200526638A (en) 2003-10-22 2005-08-16 Smithkline Beecham Corp 2-(3,4-dimethylphenyl)-4-{[2-hydroxy-3'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-3-yl]-hydrazono}-5-methyl-2,4-dihydropyrazol-3-one choline
US20060210542A1 (en) * 2004-08-16 2006-09-21 Yurkow Edward J Use of TPO mimetic compounds and pharmaceutical compositions in the treatment of anemia
CN100432102C (zh) * 2004-09-30 2008-11-12 百瑞全球有限公司 血小板增进蛋白及其应用
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
RU2395505C2 (ru) 2004-12-08 2010-07-27 Ниссан Кемикал Индастриз, ЛТД 3-этилиденгидразино-замещенные гетероциклические соединения в качестве активаторов рецептора тромбопоэтина
CA2590204C (en) 2004-12-14 2012-12-04 Nissan Chemical Industries, Ltd. Amide compounds and thrombopoietin receptor activators
US8258258B2 (en) 2005-03-10 2012-09-04 Biontech Ag Dimeric or multimeric microproteins
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
WO2006136450A2 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Aplagen Gmbh Supravalent compounds
AU2006270801B2 (en) 2005-07-15 2011-12-22 Nissan Chemical Industries, Ltd. Thiophene compounds and thrombopoietin receptor activators
US7960425B2 (en) 2005-07-20 2011-06-14 Nissan Chemical Industries, Ltd. Pyrazole compounds and thrombopoietin receptor activators
EP1947101A4 (en) 2005-11-07 2009-09-16 Nissan Chemical Ind Ltd HYDRAZIDE COMPOUND AND THROMBOPOIETIN RECEPTOR ACTIVATOR
AU2006313491B2 (en) * 2005-11-08 2011-01-06 Astellas Pharma Inc. Compositions and methods for treating thrombocytopenia
US7879318B2 (en) * 2006-01-23 2011-02-01 Mcw Research Foundation, Inc. Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand
EP2025671A4 (en) 2006-06-07 2011-04-06 Nissan Chemical Ind Ltd NITROGENIC HETEROCYCLIC COMPOUND AND THROMBOPOIETIN RECEPTOR ACTIVATOR
CA2660283C (en) * 2006-08-08 2014-11-18 Akarx, Inc. 2-acylaminothiazole compositions and methods for increasing blood platlelet levels in humans
EP2118127A4 (en) * 2007-01-31 2010-12-01 Affymax Inc NICKET-BASED LINKER FOR BONDING MODIFYING GROUPS OF POLYPEPTIDES AND OTHER MACROMOLECULES
ECSP077628A (es) 2007-05-03 2008-12-30 Smithkline Beechman Corp Nueva composición farmacéutica
US20090054332A1 (en) * 2007-06-21 2009-02-26 Conjuchem Biotechnologies, Inc. Thombopoietin peptide conjugates
AU2008283357B2 (en) 2007-07-31 2011-08-11 Shionogi & Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing optically active compound having thrombopoietin receptor agonist activity and intermediate thereof
WO2009029682A1 (en) * 2007-08-28 2009-03-05 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with syk kinase inhibitor
US8278057B2 (en) * 2007-09-14 2012-10-02 Nestec S.A. Addressable antibody arrays and methods of use
US8637455B2 (en) * 2007-10-22 2014-01-28 Affinergy, Llc Compositions and methods for delivery of glycopeptide antibiotics to medical device surfaces
CN101481352A (zh) 2008-01-10 2009-07-15 上海恒瑞医药有限公司 双环取代吡唑酮偶氮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
MX2011008936A (es) 2009-02-24 2011-09-21 Alexion Pharma Inc Anticuerpos que contienen peptidos terapeuticos mimeticos de tpo/epo.
ES2605593T3 (es) 2009-05-29 2017-03-15 Novartis Ag Métodos de administración de compuestos agonistas de trombopoyetina
CN102449481B (zh) * 2009-05-29 2016-05-25 德克萨斯大学系统董事会 用于分离和处理自身免疫性t细胞的类肽配体
AU2010256880B2 (en) * 2009-06-02 2015-01-22 Opko Health, Inc. Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
WO2011047257A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for producing cyclic peptoid libraries
EP2492262B1 (en) 2009-10-23 2016-04-20 Nissan Chemical Industries, Ltd. Fused heterocyclic compound and thrombopoietin receptor activator
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
CN104045715B (zh) * 2013-03-15 2018-05-01 兰州大学 二聚体化融合蛋白的制备及应用
TN2017000084A1 (en) * 2014-09-11 2018-07-04 Bristol Myers Squibb Co Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80 (b7-1)/pd-li protein/protein interactions
BR112020001367A2 (pt) * 2017-07-26 2020-08-11 Janssen Pharmaceutica N.V. métodos de proteção da integridade vascular induzida por terapia de radiação direcionada
JPWO2021112249A1 (no) 2019-12-06 2021-06-10

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1319315A (en) 1969-06-19 1973-06-06 Citizen Watch Co Ltd Calendar timepiece
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
NO812612L (no) 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4612132A (en) 1984-07-20 1986-09-16 Chevron Research Company Modified succinimides
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5326558A (en) 1989-08-08 1994-07-05 Genetics Institute, Inc. Megakaryocytopoietic factor
IL96477A0 (en) 1989-12-01 1991-08-16 Amgen Inc Megakaryocyte production
DK167813B1 (da) * 1989-12-07 1993-12-20 Carlbiotech Ltd As Pentapeptidderivat, farmaceutisk acceptable salte heraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf og farmaceutisk praeparat indeholdende et saadant derivat
US5571508A (en) 1989-12-18 1996-11-05 Amrad Corporation Limited Method for the treatment of thrombocytopenia and pharmaceutical compositions useful therefor
US5141851A (en) * 1990-04-18 1992-08-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolated farnesyl protein transferase enzyme
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5250732A (en) 1991-07-18 1993-10-05 Genentech, Inc. Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia
AU669489B2 (en) 1991-09-18 1996-06-13 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US5639603A (en) 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5359115A (en) 1992-03-26 1994-10-25 Affymax Technologies, N.V. Methods for the synthesis of phosphonate esters
ES2181691T5 (es) 1992-06-11 2007-10-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Sistema de distribucion de proteina eritropoyetina.
US5420328A (en) 1992-09-11 1995-05-30 Affymax Technologies, N.V. Methods for the synthesis of phosphonate esters
EP0673387B1 (en) * 1992-12-11 1999-09-22 University Of Florida Materials and methods for control of pests
US5354934A (en) 1993-02-04 1994-10-11 Amgen Inc. Pulmonary administration of erythropoietin
AU685506B2 (en) 1993-08-25 1998-01-22 Systemix, Inc. Method for producing a highly enriched population of hematopoietic stem cells
AU7843394A (en) 1993-10-27 1995-05-22 Regents Of The University Of California, The Antiviral compounds
AU8124694A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
GB2285446B (en) 1994-01-03 1999-07-28 Genentech Inc Thrombopoietin
WO1995021919A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Kirin Brewery Company, Limited Protein having tpo activity
JPH09508797A (ja) 1994-02-14 1997-09-09 ザイモジェネティクス,インコーポレイティド 造血タンパク質及びそれを製造するための材料及び方法
CA2169173C (en) 1994-02-14 2002-10-15 Kenneth Kaushansky Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin
EP0668352A1 (en) 1994-02-14 1995-08-23 Kirin Brewery Company, Ltd. Protein having TPO activity
US5766581A (en) 1994-03-31 1998-06-16 Amgen Inc. Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
US5571686A (en) 1994-04-14 1996-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets
WO1996017062A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-06 Zymogenetics, Inc. Low molecular weight thrombopoietin
US5641655A (en) 1994-11-30 1997-06-24 Zymogenetics, Inc. Methods for producing thrombopoietin polypeptides using a mammalian tissue plasminogen activator secretory peptide
DK0885242T3 (da) * 1995-06-07 2008-07-14 Glaxo Group Ltd Peptider og forbindelser, der binder til en trombopoietinreceptor
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5932546A (en) * 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
US8157793B2 (en) 2006-10-25 2012-04-17 Terumo Kabushiki Kaisha Manipulator for medical use

Also Published As

Publication number Publication date
US6083913A (en) 2000-07-04
CA2223449A1 (en) 1996-12-19
KR19990022576A (ko) 1999-03-25
AU6163496A (en) 1996-12-30
DK0885242T3 (da) 2008-07-14
CN1315870C (zh) 2007-05-16
KR100436680B1 (ko) 2004-09-18
EP0885242B1 (en) 2008-03-26
EP0885242A4 (en) 2000-03-22
HU227678B1 (en) 2011-11-28
CA2636432A1 (en) 1996-12-19
EP1961760A2 (en) 2008-08-27
DE69637473D1 (de) 2008-05-08
HUP9900921A2 (hu) 1999-07-28
NO975705D0 (no) 1997-12-05
ES2303338T3 (es) 2008-08-01
ZA964814B (en) 1998-02-09
AR003431A1 (es) 1998-08-05
WO1996040750A1 (en) 1996-12-19
AU704215B2 (en) 1999-04-15
DE69637473T2 (de) 2009-05-07
CN1192749A (zh) 1998-09-09
JP3059218B2 (ja) 2000-07-04
PE7898A1 (es) 1998-03-05
EP1961760A3 (en) 2008-09-03
NO20041296L (no) 1998-02-05
JPH10507776A (ja) 1998-07-28
CZ389797A3 (cs) 1998-06-17
EP2055712A1 (en) 2009-05-06
PT885242E (pt) 2008-06-18
TW518341B (en) 2003-01-21
EA199700359A1 (ru) 1998-10-29
EP0885242A1 (en) 1998-12-23
CA2636432C (en) 2012-01-03
MX9709315A (es) 1998-08-30
EA001220B1 (ru) 2000-12-25
EP2338897A1 (en) 2011-06-29
CZ291749B6 (cs) 2003-05-14
CN1966520B (zh) 2012-07-11
US6465430B1 (en) 2002-10-15
ATE390439T1 (de) 2008-04-15
HK1015380A1 (en) 1999-10-15
NO331550B1 (no) 2012-01-23
IL122102A (en) 2002-07-25
CN1966520A (zh) 2007-05-23
BR9608587A (pt) 1999-01-05
NO975705L (no) 1998-02-05
NZ310778A (en) 1999-10-28
PL188795B1 (pl) 2005-04-29
CA2223449C (en) 2008-10-07
IL122102A0 (en) 1998-04-05
HUP9900921A3 (en) 1999-11-29
PL323917A1 (en) 1998-04-27
TR199701526T1 (xx) 1998-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO317737B1 (no) Peptider og forbindelser som binder til trombopoietinreseptor, samt farmasoytisk blanding.
US6251864B1 (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
US5932546A (en) Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
US5869451A (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
US8227422B2 (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
WO1996040189A1 (en) Peptides and compounds that bind to a receptor
CZ134099A3 (cs) Inhibitory serinových proteáz, zejména proteázy viru hepatitidy C NS3
NO344233B1 (no) Peptider og forbindelser som binder til thrombopoietin-reseptorer
NO344405B1 (no) Peptidforbindelse som binder til TPO reseptor for terapeutisk behandling av blodplateforstyrrelse eller trombocytopeni hos mennesker
AU704215C (en) Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor

Legal Events

Date Code Title Description
RE Reestablishment of rights (par. 72 patents act)
MK1K Patent expired