HU227678B1 - Peptides and compounds that bind to a thrombopoietin receptor - Google Patents

Description

TRÖMBOPOIETIN~R£€ETTÖRSOZ KÖTŐDŐ PEPTÍDEK ÉS VEGYÜIETEK

A TALÁLMÁNY HÁTTERE

Á találmány peptidekre és vegyűletekre vonatkozik, amelyek a trombopoietinreceptorhoz (c-mpl vagy TFÖ-R) kötődnek és azt aktiválják, vagy egyéb módon hatnak TPO agonisíaként. A találmány a biokémia és a gyógyszerkéma területén alkalmazható, és főleg humán betegségek kezelésére alkalmazható TPO agonistákat szolgáltat.

A megakariociták csontvelőből származó sejtek, amelyek a keringő vérlemezkék termelődéséért felelősek. Noha a esontvelősejteknek kevesebb, mint 0,25-át teszik ki a legtöbb fajban, térfogatuk nagyobb, mint 10-szérese a szokásos velősejteknek [Kuter és munkatársai, Proc. Natl. Aead, Sei. USA 91, 11IÖ4-1.1108 (199-4)3. A. megakariociták egy endomitőzísnak nevezett .folyamaton mennek keresztül, amelynek során sejtmagjuk replikálodik, de nem mennek át sejtosztódáson, és ezáltal poliploid sejtek képződnek. A vérlemezkeszám csökkentésére válaszként az endomitózis aránya növekszik, nagyobb ploiditású megakariociták keletkeznek, és a megakariociták száma háromszorosára növekedhet [Marker: J. Clin. ín vési. 47, 458-465 (1968)].

Ezzel szemben a vérlemezkeszám megnövekedésére válaszként az endomitózis sebessége csökken, kisebb ploiditású megakariociták keletkeznek, és a megakariociták száma 50%-fcal is csökkenhet.

Nem ismert a pontos fiziológiás feedback mechanizmus, amellyel a keringő vériemezkék tömege szabályozza az endomitózis sebességét és a csontvelő megakariociták számát. Jelenleg az a nézet, hogy a fenti feedback hurok szabályozásában szerepet játszó, keringésben lévő irombopolerikus faktor a tromboíetin (TPO). Közelebbről, kimutatták, hogy a TPO a tö humorális regulator a iromhoeítepéniávai járó állapotokban [lásd például Metcalf, Natúré 369, 519-520 (1994)]. Számos vizsgálatban kimutatták, hogy a TPO növeli a vérlemezkeszámot, növeli a vérlemezke méretét, és növeli az izotópok beépülését a reeípiens állatok vérlemezkéibe. Közelebbről, úgy gondolják, hogy a TPO a megakarlocita képződést több módon is befolyó7 ♦ * solja:

1} növekedést, idéz elő a megakariocíták méretében és számában;

2) növekedést okoz a DNS-tartaío-mban, a políploíditás formájában, a megakari ocí fákban;

3j fokozza a megakariooiták endomítózisát;

4) a megakarioeiták fokozott érését idézi elő, és

5) növekedést idéz elő az acetilkolín-észteráz-pozitív kis sejtek formájában lévő prekurzor sejtek százalékos mennyiségében, a csontvelőben.

Mivel a vérlemezkék (trombociták) a véralvadáshoz szükségesek, és amikor számuk egv betegben nagyon alacsony, a betegben igen nagy a rizikója a katasztrofális vérzékenységből származó elhalálozásnak, a TFO potenciálisan alkalmazható különféle hematolőgiás rendellenességek diagnózisában és kezelésében, például az elsődlegesen vérlemezke defektusoknak tulajdonítható betegségekben. A TPO-val végzett, folyamatban lévő klinikai kísérletek azt mutatják, hogy a TPÖ-t biztonságosan lehet alkalmazni a betegeknek. Ezenkívül, a legújabb vizsgálatok alapján a TPÖ terápia hatékonyan alkalmazható Irombociíopénía kezelésére, és különösen a kemoterápiából, sugárterápiából, vagy csontvelő átültetésből eredő írombocitopénia kezelésére, amelyeket rák vagy Iimfóma kezelésére alkalmaznak [McDonald, Ám. J, Fed, Hematology/Oncology 14, 8-21 (1992}].

A TPÖ-f kódoló gént már klónozták és jellemezték [Kufer és munkatársai, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 11104-11108 (1994); Barley és munkatársai, Cell 77. 1117-1124 (1994); Kaushansky és munkatársai. Natúré 369, 568-571 (1994); Wendling és munkatársai, Natúré 369, 571-574 (1994); és Sauvage és munkatársai, Natúré 369, 533-538 (1994)j, A trombopoietm egy glikoprotem, amelynek legalább két formája van, amelyek látszólagos móltömege 25 kDa, illetve 31 kDa, és közös N-terminálís aminosav-szekveneiával rendelkeznek íBartley és munkatársai, Cell 77, 111.7-1124 (1994)1. A trombopoietín láthatólag két elkülönülő régióval rendelkezik, amelyeket egy potenciális ArgArg hasítási hely választ el egymástól. Az amino-terminális régió nagymértékben konzerválódik emberben és egérben, és bizonyos mértékű χ ♦

ΦΦ ΦΦΧβ homológiát mutat az erítropoíetínnel és az interferon~a és ínterferon-b-vek A karboxi-terraínális régió .fájtától függően erős eltéréseket mutat,

A humán TPO-R (amely c-mpi néven is ismert) peptid-szekveneiája, és az ezt kódoló DNS-szekvenciák ismertek [Vigon és munkatársai, Proo. Natl. Acad, Sci. USA 89, 5640-5644 (1992)]. A TPO-R a hemaiopoíetin növekedési faktor receptor család egyik tagja, a családra jellemző az extracelluláris dómén közős szerkezeti felépítése, beleértve az N-ternrinálís részben négy konzervált C-maradékot, és egy WSXWS motívumot a transzmembrán régió közelében [Bazan: Proc. Nat, Acad. Sci, USA 87, 6934-6938 (1990)]. A fenti receptor funkcionális szerepét a vérképzésben többek között azok a megfigyelések bizonyítják, hogy expresszíója egérben a lépte, csontvelőre vagy a magzati májra korlátozódik [Souyri és munkatársai, Celi 63, 1137-1147 (1.990)], míg emberben a nwgakaríociiákra, vérlemezkékre és CD34⁺ sejtekre [Melhia és munkatársai, Blood 82, 1395-1401 (1993)], Ezenkívül, ha a CD34⁺ sejteket az mpl RNS-re antíszensz szintetikus oligonnkleotidokkal hozzák érintkezésbe, szignifikánsan gátlódik a megakariocita telepek megjelenése anélkül, hogy az eritroíd vagy mieloid kolónia képződés megváltozna. Néhány kutató feltételezi, hogy a receptor homodímerként működik, hasonlóan a G-CSF és eritropoietin receptoraihoz.

A TPO-R klónozott génjeinek hozzáférhetősége megkönnyíti a fenti fontos receptor agoni stábnak kutatását A rekombináns receptor protein hozzáférhetősége lehetővé teszi a receptor-ligandum kölcsönhatás tanulmányozását különféle random és semi-random pepiid diverzitást létrehozó rendszerekben. Ilyen rendszer például a ”peplid-a~plazmidon rendszer, amelyet az US 5270170 és 5338665 számú szabadalmi leírásokban ismertetnek; a peptid-a-fágon. rendszer, amelyet az US 07/718577 számú (1991, június 20-án bejelentett), US 07/541108 (Í99Ö. június 20-án bejelentett) szabadalmi leírásokban és CwírU és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87, 6378-6382 (1990)) ismertetnek; a poliszóma” rendszer, amelyet a 08/300262 számú (1994. szeptember 2-án bejelentett) szabadalmi leírásban (amely az US 08/144775 számon 1993. október 29-én benyújtott szabadalmi, leíráson és a PCT WÖ95/11992 számú szabadalmi leíráson alapuló részben folytatólagos ~4~

X * > * * ♦:*·* bejelentés) ismertetnek; a ''kódolt szintetikus könyvtár rendszer, amelyet az US 08/146886 számú (1993. november 12-én bejelentett)·; 07/946239 számú (1992. szeptember ló-án bejelentett) és 07/762522 számú (1991. szeptember 18-án bejelentett) szabadalmi leírásokban ismertetnek; és az “igen nagy léptékű immobíllzátt polimer szintézis rendszer, amelyet az US 5143854 számú szabadalmi leírásban, a W090/15070 számon publikált PCT szabadalmi bejelentésben (közzététel: 1990. december 13.); az US 07/624120 számú. (1990. december 6-án benyújtott) szabadalmi leírásban; Fodor és munkatársai, Science 251, 767-773 (2/1991); Dower és Fodor, Ann. Rep. Med. Chem. 26, 27.1-180 (1991); és az US 07/805727 számú (1991. december 6-án benyújtott) szabadalmi leírásban ismertetnek.

Á trombocítopéníában szenvedő betegekben a vérlemezke-szint lassú visszatérése a normális szintre komoly problémát jelent, és ez indokolja az olyan vérképző faktor agonístákra irányuló kutatás fokozását, amelyek képesek a vérlemezke-regeneráciőt felgyorsítani. Találmányunk ilyen agonístákra vonatkozik.

Az LU88573A (öeneuteeb) szabadalmi publikációban bizonyos trombopoietm polipepiideket ismertetnek, amelyek az mpl citokin receptor itgandumai, és ezekről leírják, hogy trombocííopénia és hasonló állapotok kezelésére alkalmasak.

A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA

A jelen találmány olyan vegyületre vonatkozik, amely trombopcietín-receptorhoz kötődik, az említett vegyidet (1) molekulatömege kisebb, mint körülbelül 8000 dalton, és (2) kötődési affinitása trombopoietin-receptorhoz ICjo értékként kifejezve nem nagyobb, mint körülbelül 100 umol/l, ahol az említett vegyüiet egy

XsGX^XUqXsWXáltalános képletű aminosav szekvenciát tartalmaz, ahol

X§ jelentése a 20 genetikailag kódolt L-aminosav egyike; Xi jelentése P; X₂ jelentése T; X₃ jelentése L; X₄ jelentése R; X₅ jelentése E vagy Q; X? jelen.··♦

Φ ·« φ *

,.«.φ|ι Φ.Φ* lése I vagy L.

Egy további aspektusában a jelen találmány vegyülctre vonatkozik, amely tromhöpöíetin-reoeplorhöz kötődik, az említett vegyület (1) molekulatömege kisebb, mint körülbelül 8000 dalion, és (2) kötődési affinitása tromhopoietin-receptorhoz IC50 értékként kifejezve nem nagyobb, mint körülbelül 100 pmol/l, ahol az említett vegyület egy GGCTLS.EWLHGGECGG amisosav-szekvenciát tartalmaz.

Sgy további aspektusában a jelen találmány vegyületetet biztosít, amely Irombopoieiin-receptorhöz kötődik, ahol az említett vegyület a

O » C-ASGTO.nSWSSFC ity---1 és i

(R-y képietö vegyöletek csoportjából megválasztott.

A találmány azon az űj és meglepő felismerésen alapul, hogy bizonyos kis mőltömegü. peptidek és peptíd-mímetikumok erősen kötődnek a TEG-R-hez, és aktiválni képesek a TPO-R-t. Ennek megfelelően az ilyen peptidek és peptid-mímetikumok gyógyászati célokra alkalmazhatók a TPO által médiáit állapotok (például kemoterápiás vagy sugárterápiás kezelésből, vagy csontvelő átültetésből eredő tromboeítopénia) kezelésére, valamint diagnosztikai célokra alkalmazhatók a vérképzés mechanizmusának és a megakariocíták és a megfelelő őssejtek in vitro expanziójának tanulmányozására.

* # ♦

A terápiás és/vagy diagnosztikai célokra alkalmas peptídek és peptíd-mímetikamok IC50 értéke körülbelül 2 mmol/1 vagy ennél kisebb, a 3. példában ismertetett kötődési affinitás vizsgálattal meghatározva, ahol az alacsonyabb IC50 érték TRÖ-R-hez való erősebb kötődési affinitásnak felei meg. Gyógyászati célokra a peptidek és peptid-mímetikumok 1C$_Ö értéke legfeljebb körülbelül löö umol/l, még előnyösebben legfeljebb 500 nmol/1, Egy előnyös kiviteli alakban a pepiid vagy peplld-mimetikum mőlíőnwg körülbelül 250 - körülbelül 8000 dalion.

Diagnosztikai célokra történő alkalmazásra a peptideket és peptíd-mím etikamókát előnyösen detektálható jelzőanyaggal jelezzük, és ennek megfeleljen a jelzés nélküli peptídek vagy peptld-mimetikumok köztitermékként szolgálnak a jelzett peptidek és peptid-mimetiknmok előállítására.

Á mőltömegükre és TPÖ-R-hez való kötődési affinitásukra megállapított kritériumoknak megfelelő peptídek 9 vagy több amínosavből állnak, ahol az annnosavak természetben előforduló vagy szintetikus (nem-természetes eredetű) aminosavak lehetnek. A peptid-mimetiknmok közé tartoznak az. olyan peptidek, amelyek egy vagy több alábbi módosítást tartalmaznak:

peptidek, amelyekben egy vagy több peptid kötés [-C(O)N'R-] egy nem-peptid kötéssel, például -CRs-karhantát kötéssel [-CH2~OC(0)HR-}; foszfonát kötéssel; -CH^-szullonamid kötéssel f-CHr-SÍOhNR-}; karbamid kötéssel (-NHC(O)NH-]; ~Cíi?-szekunder-amín kötéssel vagy alkilezett peptid-kötéssel [-C(Ö)NR\ ahol R^ö jelentése rövid szénláneú alkilesoport] van helyettesítve;

peptidek, amelyek N-tenninálisa -NRR⁵ csoporttá; -NRC(O)R csoporttá; -NK€(O)OR csoporttá; -NRS(Ö)3R csoporttá; -NHC(O)NHR csoporttá (ahol R és R^: jelentése hidrogénatom vagy rövid szénláncú aikilesoport, azzal a megkötéssel, hogy R és R^; jelentése egyidejűleg nem lehet hidrogénatom); sznkcinímídcsoporttá; benzli-oxi-karboníl-NH-csoporttá ÍCBZ-NH-); vagy a fenílgynrüben 1-3, rövid szénláncú aikilesoport, rövid szénláncú alkoxiosoport, klóratom és brőmatom közül választott szubsztituensse I sznbsztítuált. bcnzil-oxi-karboail-NH-csoportlá van alakítva;

vagy ~7 •X *

X » * » Φ X

Φ » * ΦΧΧΦ ΧΦ

Χ·*Φ ♦ ♦ « « · » *

ΦΦΦ » *

X Φ' * » »«« ♦* ♦ peptidek, amelyek C-terminálisa -C(O)R² (ahol R² jelentése rövid szénláncú alkoxicsoport), vagy -NR’R⁴ (ahol R³ és R⁴ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövid szénláncú alkilcsoport) általános képietn csoporttá van alakítva.

Ennek megfelelően előnyös peptidek és peplid-mímetíkumok azok a vegyületek, amelyek (1) molekulatömege körülbelül 5000 öahonnál kisebb, és (2) ICso értékkel kifejezett TPÖ-R-hez való kötődési affinitásuk legfeljebb körülbelül 100 pmol/l, és amelyekben nulla - Összes -C(0)NR- képletű peptidkötés -CHrOCföjNRkötés, foszfonát kötés, -CS₂S(Ö)₂NR- kötés, -CH₂NR- kötés, -C<O)NR⁶- kötés és ~NHC(O)NH~ kötés közül választott kötéssel van helyettesítve, amelyekben R jelentése hidrogénatom vagy rövid szénláneú alkilcsoport, és R⁶ jelentése rövid szénláneú alkilcsoport, továbbá amelyekben a pepiid vagy peptid-mimetikum N-tenoinálls része egy -NRR‘ csoport, -NR€(Ö)R csoport, -NRC(Ö)OR csoport,~NRS(O)₂R csoport, -NHC(0)NHR csoport, szukcinímidcsoporí, henzil-oxí-karbonil-NH-esoport, és fenilgvürnben 1-3 rövid szénláncú alkilcsoport, rövid szénláncú alkoxicsoport, klóratom, hromaiom közül választott szufesztituenssel szubsztituált benzíÍ-oxi-karhonil-NH~csoport közül választott csoportot jelent, ahol R és R^: jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövid szénláneú alkilcsoport, és továbbá amelyekben a pepiid vagy peptiá-mimetiknm C-terminális része egy ~C(Ö)R² általános képletű csoportot jelent, amelyben R² jelentése hídroxílcsoport, rövid szénláncú alkoxtesoporí, vagy -NRR‘ általános képletű csoport, amelyben R³' és R⁴ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövid szénláneú alkilcsoport, és ahol az -NR'R⁴ csoport nitrogénatomja adott esetben a pepiid N-termínális ammesoportja is lehet, azaz .ciklusos pepiid alakul ki, valamint ezek gyógyászatilag elfogadható sói.

A találmány továbbá jelzett peptidekre vagy peptid-mimetikumokra vonat-8«»φφ φφ* kozik, amelyek egy fent definiált pepiidet vagy peptid-mímetikumof, és ahhoz kovalensen kapcsolt, kimutatásra alkalmas jelzőanyagot tartalmaznak.

A különösen előnyös peptidek közé tartoznak a kővetkezők: GGCADGPTLREWISFCGG; GNADGPTLRQWLEGRRPKN; GGCADGPTLREWISFCGGK.; TIKGPTFRQWLKSREHTS; S1BGPTLREWLTSRTPHS; LAIEGPTLRQWLHGNGRDT; CADGPTLREWíSFC és 1EGFTLRQWLAARÁ.

A találmány szerinti vegyüietek 'TPO által médiáit betegségek kezelésére és megelőzésére alkalmazhatók, különösen hematológiai rendellenességek, kezelésére, amelyek közé tartozik például a trombocitopénia, amely kemoterápiás vagy sugárkezelésből vagy csontvelő franszfúzioból származik. így a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti vegyüietek alkalmazása TPO kezelésre érzékeny rendellenességben szenvedő betegek kezelésére. A fenti kezelés során a betegnek gyógyászatiiag hatékony dózisban vagy mennyiségben adjuk a találmány szerinti vegyületet.

A találmány tárgyát képezik, továbbá gyógyászati készítmények is, amelyek egy vagy több találmány szerinti vegyületet és fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaznak. Ezek a gyógyászati készítmények különféle formákban lehetnek, például orális dózisíormákban, valamint inhalálhatő porok és oldatok, és injektálható vagy infundáiható oldatok formájában,

AZ ÁRRÁK RÖVID ISMERTETÉSE

Az 1A-B. ábrán láthatók a 2, példában ismertetett funkcionális vizsgálat eredményei különféle peptidek jelenlétében, Az 1A ábrán grafikusan mutatjuk be a TPO-R-rel transzfektált Ba/F3 sejtek proliferáeiójának vizsgálati eredményeit az alábbi találmány szerinti peptídek jelenlétében:

- 8 - GGCADGPTLREWISFCGGK(biotín) jelenlétében kapott eredmények;

- X - GGCADGPTLREWISFCGG jelenlétében kapott eredmények;

- - LAIEGPTLRQWLHGNGRDT;

- O - GNADGPTLRQWLEGRRPKN és

- v - TIKGFTLRQWEKSRE'fíTS.

Az IB ábra grafikusan mutatja ugyenezekkel a peptidekkel és a szülői sejt9 9 9 9

9 9

9 9 9

Χ999

9* ♦ * ·« φ © 99 9

9

99Χ 9*99 999 vonallal kapott eredményeket

A 2A-C ábrákon láthatók a pepiid oligomerizáetó eredményei a TPO-R-rel transzíektált Ba/F3 sejt-prolíferáeió vizsgálat alkalmazásával. Á 2A ábra mutatja. a vizsgálati eredményeket komplexált biotinilezett pepiidre [ÁF 12285 streptavidinnel (SA)], mind a transzíektált, mind a szülői sejtvonalban.. A 2B ábra mutatja a vizsgálati eredményeket szabad biotinilezett pepiidre (A.F 12285), mind a transzíektált, mind a szülői sejtvonalban. A 2C ábra mutatja a vizsgálati eredményeket csak .streptavidínre mind a transzfektált, mind a szülői sejtvonalban.

A 3A-G ábrán láthatók egy kontroll kísérletsorozat eredményei, amelyek a TPO, a találmány szerinti peptídek, az EPÖ és az EPO-.R-.b-.ez kötődő peptídek aktivitását mutatják sejtproliferáciős vizsgálatban, TPÖ-R-rel transzíektált Ba/F3 sejtvonal, vagy az annak megfelelő szülőt sejtvonal, vagy egy EPO-dependens sejtvonal alkalmazásával. A 3Á ábrán láthatók a TPO—val kapott eredmények TPO-R-rel transzíektált Ba/F3 sejtvonal és az annak megfelelő szülői sejtvonal alkalmazásával végzett sejtproliferációs vizsgálatban, A 3B ábrán, láthatók az EPO-val kapott eredmények TPO-R-rel transzíektált Ba/F3 sejtvonai és az annak megfelelő szülői sejtvonai alkalmazásával végzett sejtproliferáeiós vizsgálatban. A 3C ábrán láthatók a komplexált, biotinilezett pepiiddel [ÁF 12285 4- streptaviám (SA)] és a biotinilezett EPO-R-hez kötődő pepiid komplexált formájával (ÁF 115-05 ·*· SA) kapott eredmények TPO-R-rel transzíektált Ba/F3 sejtvonalban. A megfelelő szülői sejtvonattál kapott eredmények a 3D ábrán láthatók. A 3E ábrán láthatók a TPO-val kapott eredmények EPO-dependens sejtvonal alkalmazásával végzett sejtproliferációs vizsgálatban. A 3F ábrán láthatók az EPO-val kapott eredmények EPG-dependens sejtvonal alkalmazásával végzett sejtproliferációs vizsgálatban, A 3G ábrán láthatók a komplexéi! biotinilezett pepiiddel (ÁF 12885 + strepíavtdin (SA)] és a biotinilezett EPO-R-hez kötődő pepiid komplexált formájával (ÁF 11505 + SA) kapott eredmények EPO-dependens sejtvonalban.

A -4A-C ábrán látható a peptid-a-plazrnídon” könyvtárak szerkesztőse pJS142 vektorban. A 4A ábra matatja a gének restrikciós térképét és pozícióját. A könyvtár plazmid magában foglalja az rrsB transzkripciós terminátort, a bla • 10φ * »9* * Φ * * *

X Φ · * ♦ ·♦ « X * ♦ ♦ φ X * ♦ * ♦ «*«♦ **99 99* ΦΦ ΦΦΧ* gént. amely lehetővé teszi az ampíclllinnel történő szelektálást, az Ml3 fág íntragén régiót (Ml 3 IG), amely lehetővé teszi az egyes szálú DNS mentését, egy plazmid replikáeiő origót (őri), két laeO_s szekvenciát, és az araC gént, amely lehetővé teszi a lac fúziós gén expressziöját elörehajtó araB promoter pozitív és negatív szabályozását. A 4B ábrán látható a klónozó régió szekvenciája a iacl gén 3^! végén, amely a könyvtár szerkesztése során alkalmazott Stíl és Eag.I helyeket foglalja magában. A 4-C ábrán látható az ON-S29 és ÖN-830 beillesztett könyvtár oligonnkleotidok ligálása a pJS142 Sfil helyeihez a könyvtár kialakítása érdekében, Á szekvenciában az egyes térközök a ligálás helyeit jelzik.

Az 5A-B ábrán látható pBLM3 és pEBM15 MBF vektorokba történő klónozás. Az SA ábrán látható a malE fúziós gén 3' végének szekvenciája, amely magában foglalja az MBF kódoló szekvenciát,, a pohaszparagin linkért, a proteáz hasítási hely Xa faktort és a hozzáférhető klónozó helyeket. A vektorok fennmaradó részei a pMÁLc2 (pELM3) és pMALp2 (pELMlS) plazmidokhől származnak, amelyek a New England Biolabs.-től szerezhetők be. Az 5B ábra mutatja a vektorok szekvenciáját a BspEIÍ-Seal könyvtár fragmeus Agel-Scal-gyel emésztett pEL.M3/pELM15-he történő átvitele után. Az átvitt szekvenciák magukban foglalják a GGG pepiid linkért kódoló szekvenciát a plS142 könyvtárhói.

Á ÖÁ ábrán látható a fejrész dimer (headpiece dimer) könyvtárak szerkesztéséhez szükséges gének restrikciós térképe és pozíciója a p€MG14 vektorban. A könyvtár plazmid tartalmazza; az rrnB transzkripciós terminálért, a hla gént, amely lehetővé teszi az ampíeil!ínnel történő szelektálást, az Ml3 fág íntragén régiót (MI3 IG), amely lehetővé teszi egy egyes szálú DNS mentést, egy plazmid replikációs origót (őri), egv lacö_s szekvenciát, és az araC gént, amely a fejrész dimer fúziós gén expressziöját eiőrebajíő araB promoter pozitív és negatív szabályozását teszi lehetővé. A ÓB ábrán látható a fejrész dimer” gén 3’ végének klónozó régiója, amely magában foglalja a könyvtár szerkesztése során alkalmazóit Stíl és Eagl helyeket. A őC ábrán látható a beillesztett ÖN-1Ö79, ÖN-829 és ON-83Ö ligálása a pCM.GI4 Stíl helyeire, a könyvtár előállítása érdekében. Az egyes térközök a szekvenciában a ligálás

*.*·*

helyét jelölik.

A 7-9. ábrán láthatók a találmány szerinti peptidek és pepííd-mimeíikmnok aktivitásának kiértékelésére végzett további kísérletek eredményei. Ebben a vizsgálatban az egereket karboplatinnal tromboeítopéníássá tettünk. A ?. ábrán láthatók a tipikus eredmények, amikor a Balb/C egereket 125 mg/kg karboplatianal kezeljük íutraperitoneálisan a Ö. napon. A szaggatott vonalak mutatják a kezeletlen állatokkal kapott eredményeket három kísérletből. Az összefüggő vonal mutatja a karboplatinnal kezelt csoporttal kapott eredményeket három kísérletből. A vastagított összefüggő vonal mutatja az irodalmi értékeket. Á 8. ábrán látható a karboplatinnal végzett titrálás hatása a vériemezkeszámra a megadott, mennyiségi karboplatinnal (mg/kg, íntraperitoneálísan a 0. napon) kezelt egerekben. A 9, ábrán látható Á.F 12513 jelű pepiid (513) karboplatin által indukált tromboeitopémára kifejtett enyhítő hatása a 10. napon. A karhoplatint (CBP; 50-125 rag/kg, intraperitoneálisan) a 0. napon adagoltuk. Az AF 12513-at (1 mg/kg, ip) az 1-9. napokon adtuk.

i. eiFINÍCíÓK ÉS ÁLTALÁNOS PARAMÉTEREK

Ágonista alatt olyan biológiailag aktív lígandumokaí értünk, amelyek komplementer biológiailag aktív receptoraikhoz kötődnek, és aktiválják azt vagy azáltal, hogy biológiai választ váltanak kí a receptorban, vagy fokozzák a receptor már eleve meglévő biológiai aktivitását.

Győgyászatílag elfogadható só alatt nem-toxikus alkálifém-, alkáíiföldféraés ammóníumsókat értünk, amelyeket a gyógyszeriparban szokásosan alkalmaznak, ilyenek például a nátrium-, kálium-, lítium-, kalcium-, magnézium-, bárium-,, ammónium- és protamin-cmk-sók, amelyeket ismert eljárásokkal állítunk elő. A gyógyászatllag elfogadható só alatt nem-toxikus savaddíciós sókat is értünk, amelyeket általában úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti vegyületeket megfelelő szerves vagy szervetlen savval reagáltatjuk. A fenti sókra példaként említjük a hidroklorid-, hidrohromid-, szulfát-, biszulfát-, aeetát-, oxalát-, valerát-, oleát-, lanrát-, borát-, benzoát-, laktál-, foszfát-, toxílát-, cifrát-, maleát-, fumarát-, sznkcinát-, tartarát-, napszilát-sőt ős hasonlókat.

-12φ* «φ ÍÍÍÍ1 *<

* Φ * X Φ * * « φ φ»5ί S « « φ φ Φ * * *

ΛΦΦ* *»«« *»« «« **«*

Gyógyászatíiag elfogadható savaddieiös só alatt olyan sókat értünk, amelyek .megtarlját a szabad bázis formában lévő hatóanyag biológiai hatékonyságát és tulajdonságait, és amely egy biológiailag vagy egyébként nem károsak, ezeket szervetlen savakkal, példáid sósavval, hídrogén-bromiddal, kénsavval, salétromsavval, foszforsavvai és hasonlóval, vagy szerves savakkal, például ecetsavval, propionsavval, glíkolsavval, píroszőlősavval, oxáisavval, almasavval, maionsavval, horostyánkosavval, maleinsavval, fnmársavval, borkősavval, eitromsavval, benzoesavvak fahéjsavval, mandulasavval, metánszulfonsavval, etánszutfonsavval, ρ-toíuolsztdfonsavval, szalíeílsavval és hasonlóval képezzük. A gyógyászatilag elfogadható savaddícíós sókat, mint prodrogokat Rundgaard H. és munkatársai (supra) ismertetik.

Gyógyászatilag elfogadható észter alatt olyan észtereket értünk, amelyek az észterkötés hidrolízise után megtartják a karbonsav vagy alkohol biológiai hatékonyságát és tulajdonságait, és biológiailag vagy egyébként nem rendelkeznek káros hatásokkal. A győgyászatilag elfogadható észtereket, mint prodrogokat Rundgaard B ismerteti [Design of Prodrags, Blsevier Science Pubiishers, Amsterdam (1985)]. Ezeket az észtereket, rendszerint a megfelelő karbonsavból és alkoholból állítjuk elő. Az észterképzést általában szokásos szintetikus módszerekkel hajtjuk végre [lásd például Marék·. Advanced Orgamc Chemíslry, 3, kiadás, 1157. oldal, John Wiley & Sons, New York, (1985), valamint az ott idézett irodalmak, és Mark és munkatársai, Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Az észter alkohol komponense általában

i) 2-12 szénatomos alifás alkohol, amely adott esetben egy vagy több kettős kötést tartalmaz, és adott esetben a szénláncban elágazásokat tartalmaz, vagy rí) 7-12 szénatomos aromás vagy heteroaromás alkohol.

A találmány értelmében olyan vegyületek is alkalmazhatók, amelyek egyrészt észterek (a fentiek szerint), és ugyanakkor gyógyászatilag elfogadható savaddiciós sók is,

Gyógyászatilag elfogadható amid alatt olyan amidokat értünk, amelyek az amidkötés hidrolízise után megtartják a karbonsav vagy amin biológiai

». *

9* »« «· ♦ ♦ « χ ♦ e «

9 99*

Μ 9

99 X 9**9 Κ99 * 9 * ♦ * 9 » X

X 9

9 9»«* hatékonyságát és tulajdonságát, és biológiailag vagy egyébként sem rendelkeznek káros hatásokkal A gyógyászatilag elfogadható amídokat, mint prodrogokat Bundgaard H. ismerteti [Design of Prodntgs, Elsevíer Science Publishets, Amsterdam (1985)], Ezeket az amídokat rendszerint a megfelelő karbonsavból ős amisből állítjuk elő, Általában az amid-képzést szokásos szintetikus módszerekkel hajthatjuk végre [lásd például March: Advanced Organic Chemistry, 1152. oldal, 3, kiadás, John Wiley & Sons, New York (1985) és Mark és munkatársai, Bncvclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). A találmány tárgykörébe tartoznak azok a hatóanyagok is, amelyek egyrészt amidok (a fentiek szerint), és ugyanakkor gyógyászatilag elfogadható savaddíeiós sók is.

Gyógyászatilag vagy terápiásán elfogadható hordozó alatt olyan hordozóközeget értünk, amely nem zavarja a hatóanyagok biológiai aktivitásának hatékonyságát, és amely a gazda vagy a beteg szervezetére nem toxikus.

Sztereoizomer alatt olyan kémiai vegyületet értünk, amely molekulatömegét, kémiai összetételét és szerkezetét tekintve azonos egy másikkal, de az atomok eltérően csoportosulnak. Ez azt jelenti, hogy bizonyos azonos kémiai csoportok a térben eltérő orientációban vannak, és ezáltal tiszta formában képesek a polarizált fény síkját elforgatni. Azonban bizonyos tiszta sztereozímerek optikai rotációja olyan gyenge, hogy kimutathatatlan a jelenlegi berendezésekkel. A találmány szerinti vegyületek egy vagy több aszimmetriás szénatomot tartalmazhatnak, ezért különféle sztereoízomerek formájában létezhetnek, A találmány tárgykörébe tartozik az összes sztereoizomer forma.

A találmány szerinti készítményekkel kapcsolatban alkalmazott gyógyászati! ag vagy gyógyszerészetileg hatásos mennyiség alatt a készítmény azon mennyiségét értjük, amely a kívánt biológiai eredmény kiváltásához elegendő. Ez az eredmény lehet egy betegség jelének, tünetének vagy okának enyhítése, vagy egy biológiai rendszer bármely kívánt megváltoztatása. A találmány szerinti megoldásban az eredmény rendszerint a fertőzésre vagy szövetsérülésre adott immunológiai és/vagy gyulladásos válaszok csökkentését jelenti.

Á peptidekben lévő amínosav-maradékokat az alábbiak szerint rövidítjük·, fenil-aianin: Phe vagy F;

lettem:	Len vagy L;
izoleuein:	He vagy I;
meüonin:	Met vagy M;
valin:	Val vagy V;
szerin:	Ser vagy S;
prolin;	Pro vagy P;
treonin:	Thr vagy T;
alanín:	Alá vagy A;
íirozin:	Tyr vagy Y;
hísztí din:	Hls vagy H;
glutamín:	Gin vagy Q;
aszparagis:	Asn vagy N;
lízin:	Lys vagy K;
aszparaginsav:	Asp vagy D;
glntaminsav: eisztein:	Gin vagy E; Cys vagy C;
tnptofán:	Trp vagy W:
arginln:	Arg vagy R és
glíeín:	Gly vagy G.

Továbbá,

Bu jelentése butoxíesoporí,

Bzl jelentése benzi le söpöri,

CHA jelentése cíklofeexil-amin,

Ac jelentése aceti leső port,

Me jelentése metílcsoport,

Pen jelentése penicillanaín,

Alb jelentése atníno-izovajsav, Nva jelentése norvalin,

Ábu jelentése arníno-vajsav,

Thi jelentése dernl-alanin,

ÖBn jelentése 0-benzi 1-csoport és hyp jelentése bidroxi-prolin.

A csak természetes aminosavakaí tartalmazó peptideken kívül a találmány

- 15X φ »♦ Φ»*ί Φ* Φ* χ X Φ ♦ * φ χ φ

Φ « φΦΧ Φ » Φ φ Φ ΧΦΦ X

ΦΦΧΧ ΧΧΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ» pepiid-mitnetikumekra vagy peptid-analégokra is vonatkozik, .Pepíid-aaalógok alatt a gyógyszeriparban olyan nem-pepiid szereket értünk, amelyek tulajdonságai hasonlóak a templát pepiidéhez. Az ilyen típusú nem-pepiid vegyüieteket nevezzük peptid-mimetikumoknak vagy peptíd-mímetikumoknak [Fauehere J. Adv, Drog Rés. 15, 29 (198ő); Veber és Freídtnger: TINS, 392 (1985); és Evans és munkatársai, L Med. Chem, 30, 1229 (198?)]. A gyógyászaiiiag hatásos peptídekbez hasonló szerkezetű peptid-mímetikumokaí ekvivalens vagy fokozott terápiás vagy proülaktikus hatás kiváltására alkalmazhatjuk, Általában a peptid-mimetikumok szerkezetileg hasonlóak egy paradigma polipeptídhez (azaz olyan polipeptídhez, amely biológiai vagy fannakológíai aktivitással rendelkezik), például egy természetben előforduló, receptorhoz kötődő poüpepíidhez, de egy vagy több peptídkötés adott esetben egy alábbiak közül választott kötéssel van helyettesítve: -CBjS-,

-CH2-CH2-, -CH-CH- (cisz és transz), -COCH2-, -CH(OH)CH₂- és -CH2SÖ-, olyan módszerekkel, amelyek szakirodalomból jól ismertek {Spatola A.. F.: Cbemistry aad Rioehemístry of Amino Aeids, Peptides, and Proíeíns, B. Weinstem, szerk. Mareel .Dekker, New York, 267.. oldal (1983); Spatola A, F,; Vega Data, 1. kötet, 3. kiadás (1983. március), Peptide Baokbone Modiftcaíions (általános áttekintés); Morley, Trends Phann. Sci., 463-468 (általános áttekintés) (1980); Hudson D. és munkatársai, Int. J, Pepi. Prot. Rés. 14, 177-185 (1979) (-CH₂NH-_? -CH₂CH₂-); Spatola és munkatársai, Life Sci. 38, 1243-1249 (.1986) (-CH₂-S); Hann, J, Chem. Soe, Perkin Trans. 1. 307-314 (1982) (-CH-CH-, cisz és transz); Álntquisl és munkatársai, L Med. Chem. 23, 1392-1398 (1980) (-COCH2-); Jennings-White és munkatársai, Tetrahedron Lett. 23. 2533 (1982) (-COCHj-); Szelke és munkatársai, EP 45665, CA 97, 39405 (1982); (-CH(OH)CH₂-); Holladay és munkatársai, Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (1983) <-C(0H)CH₂-); és Hruby.· Life Sci. 31, 189-199 (1982) (-€H2~S-)j, Különösen előnyös nem-pepiid kötés a -CH2NH-. Az ilyen peptid-mimetíkumok jelentős előnyökkel rendelkeznek a polipeptídhez viszonyítva, ilyenek például: gazdaságosabb előállítás, nagyobb kémiai stabilitás, jobb farmakológíai tulajdonságok {fél-élettartam, abszorpció, potenciál, hatékonyság, stb.), megváltozott specificítás (például biológiai aktivitások széles spektruma), csökkent antigén tulajdonság és egyebek, A

- lö

ΦΦ** φΑ φ <í % Φ ♦ X * » Φ *

V * « Φ Φ «ί

ΦΦ.ΧΦ φφφφ φφφ φφ Φ φ Φ Φ peptid-míme-iikumok jelzése rendszerint egy vagy több jelzőanyag kovalens kapcsolását jelenti közvetlenül, vagy egy spaceren (például amidesoporton) keresztül a peptid-mimetikum aktivitását nem zavaró helyzetéhez, amelyet kvantitatív szerkezet-aktivitás adatokból és/vagy molekuláris modellezésből lehet előre megjósolni. Az ilyen nem zavaró helyzetek általában azok a helyzetek, amelyek nem kerülnek közvetlen kapcsolatba olyan makromolekulákkal (például immunglobulin főcsoportba tartozó molekulákkal), amelyekhez a peptid-mimetikum a gyógyászati hatás kiváltásakor kötődik. Á peptld-mimetikumok átalakítása (például jelzése) alapvetően nem zavarhatja a kívánt biológiai vagy íármakológiaí aktivitást. Általában a receptorhoz' kötődő peptidek peptid-mimetikumaí nagy affinitással kötődnek a receptorhoz, és kimutatható biológiai aktivitással rendelkeznek (azaz egy vagy több receptor által médiáit fenotípusos változásra agonistaként vagy antagonistaként hatnak).

Nagyobb stabilitású peptidek előállítására alkalmazható egy konszenzus -szekvencia egy vagy több amínosavjának szisztematikus szubsztitúciója ugyanazon típusú D-aminosawal (például D-lizínne! L-lizin helyett). A konszenzus szekvenciát tartalmazó nem-természetes peptidekeí vagy egy lényegében azonos konszenzus szekvencia változtatást ismert módon hajthatunk végre (Rlzo és Gierasch, Ann. Rév. Siochem. 61, 387 (1992)}; például belső cisztoin-maradékok beépítésével, amelyek képesek mtramöiekulárís diszulfid-hidák kialakítására, amellyel a pepiidet cikiízáljuk.

Szintetikus· vagy természetben nem előforduló aminosavak alatt olyan aminosavakat értünk, amelyek ín vivő nem fordulnak elő természetben, de amelyeket a találmány szerinti peptldszerkezetekbe beépíthetünk. Előnyős szintetikus aminosavak a természetben előforduló L-a-amínosavaknak megfelelő D-a-amínosavak, valamint a H2NCHR⁵CÖOH általános képletü nem természetes D- és L-a-aminosavak, a képletben

R³ jelentése

1) rövid szénláncú alkilcsoport,

2) 3-7 szénatomos cikloalkílesöpört,

3) 3-7 szénatomot és 1-2, oxigén, kén és nitrogén közül választott heteroatomoí tartalmazó heterocíklus,

00*0 0« 0.0 * * * ♦ 0 * « < * * « 0 0 0 * 0 0 0 0 X0 X 0 00. 00 0 0 0 0 0*

4) ő-IO szénatomot tartalmazó aromás csoport, amely adott esetben az aromás magban hidroxi lesöpört, rövid szénláncú alkoxiesoport, amínocsoport és karboxilcsoport közül választott 1-3 szubsztítuenst tartalmazhat,

5) -alkilén-Y általános képletü csoport, ahol alkllén jelentése 1-7 szénatomos alkiléncsoport, és ¥ jelentése

a) hidroxilesoport, fe) amínocsoport,

c) 3-7 szénatomos cikloalkilcsoport és cikloalkenilcsoport,

d) 6-10 szénatomos ariiesoport, amely az aromás magban hidroxilesoport, rövid szénláncú alkoxicsoport, aminoesoport és karboxilcsoport közül választott 1-3 szubsztituenst tartalmazhat,

e) 3-7 szénatomot és 1-2, oxigén-, kén- és nitrogénatom közül választott heteroatomot tartalmazó heterociklns,

f) -C(O).R általános képletü csoport, amelyben R* jelentése hidrogénatom, hidroxilesoport, rövid szénláncú alkilcsoport, rövid szénláneű alkoxicsoport vagy -NR^JR⁴ általános képletü csoport, ahol R'' és R⁴ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövid szénláncú alkilcsoport, vagy

g) -S(Ö)_sR általános képlete csoport, ahol n értéke 1 vagy 2, és R⁶ jelentése rövid szénláncú alkílesoport, azzal a megkötéssel, hogy R⁵ jelentése egy természetben előforduló aminosav oldalláncútól eltérő.

Egyéb előnyös szintetikus aminosavak közé tartoznak azok az aminosavak, amelyekben az aminoesoportot a karboxilesoporttól egynél több szénatom választja el, például a β-alanin, y-amino-vajsav és hasonlók.

Különösen előnyös szintetikus aminosavak közé tartoznak példán! a természetben előforduló L-amínosavaknak megfelelő D-aminosavak, az L-l-naítílalanín, L-2-naftil-alanín, L-eiklohexil-alanín, L-2-amino-izovajsav, a metíonin szulfoxid- és szulfon-származékai [például az HOOC-CHfNHsjCHaCHa18fi.fi «fi ♦ «»* ·* * fi fi fi fi * fi. * K fi fi ♦ W » fi fi fi ♦ fi fi fi fi ♦ fi fi fi Xfififi fififi «» fififi.fi

-SfOKR* általános képletű vegyületek, ahol R⁶ jelentése a fent megadott), valamint a metionín rövid szénláncú. alkoxi-származékai (például a HÖÖC-CHfNHajCHjCHs-ÖR⁰, általános képletű vegyületek, ahol R⁶ jelentése a fent megadott}.

Detektálható jelzőanyag alatt -olyan anyagokat értünk, amelyek a találmány szerinti peptídekhez és peptid-mírnetíkuxnokhoz kovalensen kapcsolódva lehetővé teszik a peptid vagy peptid-mimetikum ín vivő detektálását egy olyan betegben, akinek a peptidet vagy pepfíd-tnimetíkumot beadtuk. A megfelelő detektálható jelzőanyagok jól ismertek a szakirodalomban, ilyenek például a radíoizotópok, a fluoreszcens jelzőanyagok (például fluoreszceín),. és hasonlók. Az adott esetben alkalmazott detektálható jelzőanyag nem kritikus, és a jelzőanyag alkalmazandó mennyiségétől, valamint a jelzőanyag alkalmazott mennyiségben mutatott toxieitásától függően választjuk meg. A jelzőanyag megválasztása a fenti faktorok figyelembevételével, szakember számára nem jelent problémát,

A detektálható jelzőanyag pepiidhez vagy peptid-mimetikumhoz történő kovalens kapcsolását szokásos eljárásokkal végezzük, így például, ha ^USI radioízotópot alkalmazunk detektálható jelzőanyagként, a ^U;5I kovalens kötését a pepiidhez vagy peptid-mimetikumhoz úgy hajthatjuk végre, hogy a pepiidbe vagy peptíd-mimetikumha beépítjük a tirozín amlnosavat, majd a peptidet jódozzuk. Ha a találmány szerinti pepiidben vagy peptid-mimetikum-ban tirozín nincs jelen, a tírozlnt a peptíd vagy peptid-mimetikum N- vagy C-terminálisához ismert módon kapcsolhatjuk. Hasonlóképpen a ^?AP~t foszfor-maradékként épít hetjük he a pepiidbe vagy peptid-mímetikumha, például a peptíd vagy peptid-mimetikum hidroxilesoportján keresztül, szakemberek számára jól ismert módon.

11. ÁTTEKINTÉS

A találmány tehát olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek a TPÖ-R-hez kötődnek, vagy azt aktiválják, vagy egyéb módon TP'O agonistakéni viselkednek, Ezeket a vegyületeket elsődleges peptidvegyületekre és származék peptidvegyületekre oszthatjuk, amelyeket úgy szerkesztünk meg, hogy ugyanolyan vagy hasonló molekulaszerkezettel vagy alakkal rendelkeznek, mint az elsődleges vegyületek, de hidrolízissel vagy proteolízíssel szembeni érzéφ ♦

-19 flf X · φ Φ

ΦΦ «

ΧΦΦΦ φφΛ kenységük és/vagy egyéb biológiai tulajdonságaik, például fokozott affinitásuk a receptorhoz különbözik az elsődleges vegyüleíétol, A találmány gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek egy TPO agonista hatékony mennyiségét tartalmazzák, közelebbről, egy olyan vegyület hatékony mennyiségét, amely hematológiai· rendellenességek és különösen kemoterápiával, sugárterápiával vagy csontvelő íranszfúzioval kapcsolatos trombocitopénia kezelésére alkalmazható.

ΙΠ, TPO-AGONISTÁK AZONOSÍTÁSA

A TPO-R-hez kötődési affinitással rendelkező peptideket egyszerűen azonosíthatjuk affinitáson alapuló dúsító eljárással összekapcsolt, véletlenszerű peptidválasztékot létrehozó rendszerekkel.

Közelebbről, a véletlenszerű peptidválasztékot létrehozó rendszerek közé tartoznak a peptid-a-plazmídon rendszer (US 5270170 és 5338665 számú szabadalmi leírás); a peplíd-a- -tagon rendszer (US 07/718.577 számú (199.1. június 20-án bejelentett) szabadalmi leírás, amely a 07/541108 számú (1991. június 20-án bejelenteti) szabadalmi leírás részben folytatólagos bejelentése; és Cwirla és munkatársai, Proc. Matt Ácad. Scí. USA 87, 6378-6382 (1980)]; a poliszóma rendszer (US 08/3ÖÖ262 számú (1994, szeptember 2-án bejelentett) szabadalmi leírás, amely az US 08/144775 számú (1993. október 29-én bejelentett) szabadalmi leírás és a PCT WO95/11992 számon publikált szabadalmi leírás részben folytatólagos bejelentése]; a kódolt szintetikus könyvtár (ESL)” rendszer (US 08/146886 számú (1993. november 12-én bejelentett) szabadalmi leírás, amely a 07/946239 számú (1992. szeptember 16-án bejelentett) szabadalmi leíráson alapuló részben folytatólagos bejelentés, amely a 07/762522 számú (1991. szeptember 18-án bejelentett) szabadalmi leíráson alapuló részben folytatólagos bejelentés]; és az igen nagy léptékű immohílízáít polimer szintézis rendszer [US 5143854 számú szabadalmi leírás; PCT W09Ö/15070 számon publikált szabadalmi leírás (közzététel: 1990. december 13.), US 07/624120 számú (1990. december ő-án benyújtott) szabadalmi leírás; Fodor és munkatársai, Science '251, 767-773 (2/1991); Dower és Fodor; Asm. Rep. Med. Chem. 26, 271-180 (1991); és US 07/305727 számú (1991, december 6-án benyújtott) szabadalmi leírás].

A fenti eljárások alkalmazásával a random. peptideket általában úgy terveztük.

20** «φ « «

X » X « * β · ««« * » 9

X *9 «»«9 9 9« »χ *«*♦ hogy meghatározott számú (például 12) amínosav-maradékböl álljanak. A véletlenszer pepííddíverzítási kódoló oligonukleotidok kollekciójának előállítására az (NNK)x kódoló motívumot - ahol N jelentése A, C, G vagy T nnkleotid (ekvimoláris; az alkalmazott módszertől függően egyéb nukleoiidok is alkalmazhatók), K jelentése G vagy T (ekvimoláris), és x jelentése a pepiidben lévő amino savak számának (például 12) megfelelő szorzó - alkalmaztuk az NNK motívumból származó 32 lehetséges kodon bármelyikének specifikálására: egyet 1.2 aminosav mindegyikére, kettőt 5 aminosav mindegyikére, hármat 3 aminosav mindegyikére és csak egyet a három stop kódomra. így az NNK motívum kódolja az összes aminosavai, csak egy stop kodont kódol, és csökkenti a kodondegeneráeiőt.

Az alkalmazott, rendszerekben a random peptidek vagy a fág részecskék felületén jelennek meg egy fúziós protein részeként, amely egy fág fd-szár~ mazék pl 11 vagy pVíII hurok-proteinjének egyikét tartalmazza (peptid-atagon), vagy egy plazmidhoz kötött Laci pepiid fúziós proteinnel alkotott fúziós proteinként (peptid-a-plazmidon).

A fágot vagy plazmidot, amely a pepiidet kódoló DNS-t tartalmazza, imrnobílízált TPO-R alkalmazásával affinításos dúsító eljárással azonosítjuk és izoláljuk. Az affinitáson alapuló dúsító eljárás - amelyet ”parming-nek is neveznek - több olyan ciklusból áll, ahol az egyes ciklusokban a fágot vagy poliszömát az immobilizáit receptorral ínkubáíjuk, a receptorhoz kötődött fágot, plazmidot vagy poliszomét (a kapcsolódó DNS-sel vagy .mRNS-set együtt) összegyűjtjük, és az összegyűjtött fágot vagy plazmidot (a kapcsolódó Lacl-peptid fúziós proteinnel együtt) megsokszorozzak, A TPO-R exíracellulárís doménjét (ECD) alkalmazzuk tipikusan a panníng” során,

Az affinitáson alapuló dúsítás néhány ciklusa után a fágot vagy plazmidokat és a kapcsolódó peptideket LLiSÁ-val vizsgáljuk, hogy megbaíározzuk, vajon a peptidek specifikusan kötődnek-e a TPÖ-R-hez. Ezt a vizsgálatot az affinitáson alapuló dúsító eljárásban alkalmazott műveletekhez hasonlóan hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a nem-kötött fág eltávolítása után a rezervoárokat jellegzetesen nyúl antífág antitessei, majd lúgos íoszfatázza! (AP) konjugált kecske anti-nyúl antitesttel kezeljük, A lúgos foszfatáz mennyiségét ♦ * “21 φ·« «ίί» «φ χ « φ χ « χ φ « « * «φ ΦΦΧ «

Φ X χ Φ * χ

ΦΦΦΧ ΦΦ*Φ <Γ·ΦΦ «♦ «ΦΦΧ az egyes rezervoárokban standard eljárásokkal határozzuk meg. Hasonló ELISÁ eljárást alább részletesen ismertetünk a peptid-a-plazmidokon rendszerben történd alkalmazás esetén,

A teszt rezervoárok kontroll rezervoárokkal (receptor nélkül) történő összehasonlításával, meghatározhatjuk, hogy a fúziós proteinek a receptorhoz specifikusan kötődnek-e. A fág állományokat, amelyekről kimutattuk, hogy a TPO-R-hez kötődnek, radioaktívat! jelzett monovalens receptor kolónia kiemelő próba formában történő alkalmazásával szűrővizsgálatnak vetettük alá. Ezt a próbát az oldható receptor C-terminálisához fuzionált kempíid szekvencia foszforilezésére protein kináz A alkalmazásával állíthatjuk elő. A TPO-reeeptor megszerkesztett” (génsebészetileg átalakított) formáját ezután gazdasejtben, rendszerint CHO sejtekben expresszáljuk. A receptorok PI-PLC Összegyűjtése után a receptort TPO vagy TPO-R specifikus fág klánokhoz való kötődésre vizsgáljuk. A receptort ezután nagy specifikus aktivitással ^?’*P-vel jelezzük, hogy monovalens próbaként nagy aktivitású iigandumok felismerésére alkalmazhassuk, a kiemelt kolóniák alkalmazásával.

Azokat a peptideket, amelyekről kimutattuk, hogy a receptorhoz specifikusan kötődnek, ezután szabad pepiid formában (például fág nélkül) szintetizáljuk, és gátlás! vizsgálatnak vetjük alá. A gátlás! vizsgálatot az ELISÁ-hoz hasonló módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy TPÜ-t vagy egy referencia pepiidet adunk a rezervoárba a fúziós protein előtt (a kontroll rezervoárok kétfélék: 1) receptor nélkül; és 2) TPO vagy referencia pepiid nélkül). Azok a fúziós proteinek, amelyek a receptorhoz való kötődését a TPO vagy a referencia pepiid gátolja, a random peptid-részfeen olyan peptideket tartalmaznak, amelyek találmány szerinti előnyös vegyületek.

A TPÖ-R-í, és annak extracelíuláris doménjét rekombináns gazdasejtekben állítottuk elő. Á TPO-R egyik használható formáját úgy szerkesztettük meg, hogy a proteint oldható proteinként haculovtrussal transzformált gazdasejtben expresszáltuk szokásos eljárások alkalmazásával; egy másik használható formát egy szignál pepiiddel szerkesztettünk, amely a protein szekréciójára és a giiköföszfolipíd-membrán horgony” kapcsolódásra szolgál, A horgony” kapcsolódásnak ezt a formáját PIG-farkazásnak (PlG-taíüng) nevezzük

-22•ΦΦ* «♦ φ φ»φ » φ φ«»φ ««« (Garas és Wende.ll: Science 243, 1196-1198 (1989) és Lin és munkatársai, Science 249, 677-679 (1.990)].

A PIG-tailing rendszer alkalmazásával le ledet hasítani a receptort a receptort expresszáló sejtek (például sejt kiválaxztőval magas szintű receptor expresszióra szelektált transzformált CHO sejtek) felületéről feszfolípáz C-vel A lehasitott receptor még. mindig tartalmaz egy karhoxil-terminális atninosav-szekvenciát - amelyet HPÁP-íaroknak (HPÁP tail) nevezünk a membránhoz, való kapcsolódásra szolgáló szignál proteinből - és további tisztítás nélkül immobílizálhatő. A rekombináns receptor protein úgy immobíl.izálható, hogy a mikrotitráló lemez rezervoárjalt anti-HPAP-ferok antitesttel (Ab 179 vagy MAb 17.9) vonjak be, a nem-specifikus kötődést marha szérumalbuminnal (BSA) blokkoljuk PBS-ben, majd az antitesthez kötjük a lehasított rekombináns receptort. A fenti eljárás alkalmazásakor a receptor változó koncentrációinak jelenlétében kell végrehajtani az immobilizáciés reakciót egy adott preparátum optimális mennyiségének meghatározására, mivel a rekombináns protein különféle preparátumai gyakran különféle mennyiségben tartalmazzák a kívánt proteint. Ezenkívül biztosítani kell azt, hogy az immobilízáló antitest teljesen blokkolt legyen (TPO~vaI vagy valamely egyéb blokkoló vegytlletíel) az affinitáson alapuló dúsító eljárás során. Egyébként a nem blokkolt antitest nemkívánatos fágot köthet meg az affinitáson alapuló dúsító eljárásban. Az immobilízáló antitesthez kötődő peptidek alkalmazható a le nem kötött helyek blokkolására, amelyek a receptor immobílizálása után szabadon maradnak, hogy elkerüljük ezt a problémát, vagy egyszerűen a receptort közvetlenül a mikrotitráló lemezek rezervoárján immobílízáljuk, immobilízáló antitest alkalmazása nélkül [US 07/947339 számú (1992. szeptember 18-án benyújtott) szabadalmi leírás).

Amikor olyan randont peptid-fermclő rendszereket alkalmazunk, amelyek multivalcns lígandmn-receptor kölcsönhatást tesznek lehetővé, ügyelni kell arra, hogy az immobilízált receptor sűrűsége fontos faktor az immohilizált receptorhoz kötődni képes ligandntnok affinitásának meghatározásában. Nagyobb receptor-sűrűségeknél (például az egyes anti-receptor antitesttel bevont rezervoárí 0,25 - 0,5 mg receptorral kezelve) nagyobb a valószínűsége a múl-2399

9 9 9 99 9 9

Λ X 9 9 X 9 9 9 · · ♦ « •X « * 9 9 9

9999 9999 999 99 999 íivalens kötődésnek, mint alacsonyabb receptor sűrűségnél (például amikor az egyes anti-receptor antitesttel bevont rezervoárokai 0,5-1 ng receptorral kezeljük). Ha a multivalens kötődés játszódik le, akkor sokkal valószínűbb az, hogy viszonylag kisebb affinitásé Hgandnmokat izolálunk, hacsak nem alkalmazzak nagy sűrűségben az immobilizéit receptort az elsődleges vegyületek azonosítására, és kisebb receptor sűrűségeket a nagyobb affinítású származékok izolálására.

A nagyobb affinítású peptidek közötti különbségtételre gyakran alkalmazunk monovalens receptor próbát. Ezt a próbát protein kinéz A alkalmazásával ál Irthatj uk elő, az oldható receptor C-ierminálísáboz fuzionált fcemptíd szekvencia foszforitezésére. A TPÖ-receptornak ezt a genetikailag átalakított” formáját azután gazdasejtekben, rendszerint CHÖ sejtekben expresszáljuk. A receptorok PI-PLC összegyűjtését követően a .receptort TPO vagy TPG-R specifikus fág klónokboz történő kötődésre vizsgáljuk. A receptort ezután nagy specifikus aktivitásban ³'’P-vel jelezzük, hogy monovalens próbaként alkalmazhassuk nagy affinitást Iigandumok azonosítására, kiemeli telepek alkalmazásával,

A TPO-R-hez kötődő peptídek felismerésének megkönnyítésére előnyös szűrővizsgálatokkal először azonosítjuk a receptor extraeelluláris doménjébez kötődő elsődleges peptideket, majd előállítjuk azokat a peptideket, amelyek ezekre az elsődleges pepfidekre hasonlítanak. Közelebbről, plfi vagy pVIII alapú peptid-a-fágon’' rendszert alkalmazva egy random könyvtár szűrővizsgálattal kiszűrhetjük azt a fágot, amelyen TPÖ-R-hez kötődő peptid van. A fág DNS-eket szekvenálva meghatározzuk a fágok felületén lévő peptídek

A TPO-R-bez specifikusan kötődni képes klőnokat random lineáris 10-mer pVIII könyvtárból és random ciklikus 10-mer és 12-mer pViH könyvtárakból azonosítottunk. A fenti peptidek szekvenciái szolgáinak alapul az egyéb peptid könyvtárak megszerkesztésére, amelyek nagy gyakorisággal tartalmazzák az eredetileg azonosított peptídek származékait. Ezeket a könyvtárakat úgy szintetizálhatjuk meg, hogy azon peptidek termelődése kerüljön előtérbe, amelyek csak néhány maradékban különbőznek a kötődő pepiidtől. Ez a φ

X ♦ ?.

megoldás magában foglalja a kötődő peptíd kódoló szekvenciájával rendelkező oíígonukleotid szintézisét, azzal az eltéréssel, hogy ahelyett, hogy a szintézisben a négy nukleozid trífoszfát mindegyikét tiszta készítményként alkalmaznánk, a négy nukleozid-trifoszfát elegyet alkalmazzuk (azaz 55%bán a helyes nnkleotídot és 15%-bas a másik három nukleotíd mindegyikét egy erre a célra szolgáló előnyös elegyhen, és egy másik előnyös elegy 7Ö%ban. tartalmazza a helyes nukleotidot és 10%-ban a másik három nukleotíd mindegyikét), így hozzuk leire a kötődő pepiidet kódoló szekvencia származékait

Többféle stratégiát alkalmaztunk az elsődleges peptidek származékainak előállítására ”mutagenézis egy témára” könyvtárak készítésével. Ezek közé tartozott egy pVIII fagmíd mutagenezís könyvtár, a 7Ö/10/1Ö/1Ö gyakoriságban. muíagenizált konszenzus szekvencia alapján, amelyet mindkét végén véletlenszerűen maradékokkal hosszabbítottunk meg, hogy olyan kiónokat kapjunk, amelyek az XXXX (C, S, P vagy R) TLREWL XXXXXX (C vagy S) szekvenciát kódolják. Egy hasonló meghosszabhított/mutagenizált könyvtárat szerkesztettünk peptid-a-plazmidon rendszer alkalmazásával, hogy olyan kiónokat kapjunk, amelyek az XXXXX (C, S, P vagy R) TLREWL XXXXXXX szekvenciát kódolják. Egy további meghosszabbított/mutagenizált könyvtárat - XXXX (C, S, P vagy R) TLREWL XXXXXX (C vagy S) - szerkesztettünk poiiszónta display rendszer alkalmazásával. Mind a három könyvtárat peptíd eluciöval szűrtük, és radiojelzett monovalens receptorral szondáztuk.

A peptid-a-plazmidon” módszereket szintén alkalmaztuk a peptidek szűrésére és a mntagenezis vizsgálatára, ezeket részletesen az US 5338665 számú szabadalmi leírásban ismertetik, amelynek teljes tartalmát referenciaként leírásunkba beépítettük. Ezen. megoldás szerint a random peptideket az Laci C-termínálísáboz fuzionáltuk a fúziós gént hordozó plazmid vektorból történő expresszién keresztül. A Lael-peptíd fúzió kapcsolódása az azt kódoló DNS-hez a plazmidon lévő lacö szekvenciákon keresztül megy végbe, pepiidLacl-p1azm.id komplex képződése közbe, amely affinitást tisztítással (panníng) szkrinelhető immohilízáh receptoron, Az így izolált piazmidok ezután újra bevezethetők elektroporálással fi., coli-ba, hogy a kiválasztott po25** **»4 99 »<ί

X X * * X * » β » * * *** « « ♦ « * Μ 9 9 Λ

9«»9 9»99 999 99 9 9 9 9 pnlációt további szűrési ciklusokhoz felerősítsük, vagy az egyes kiónok vizsgálatára.

Ezenkívül random peptídek szűrését és mntagenezís vizsgálatokat hajtottunk végre egy módosított C-ierminális Lac-I display rendszer alkalmazásával, amelyben a display valencia csökkent (fejrész dimer” (headpteee dimer”) display rendszer]. A könyvtárakat szűrtük, és a kapott DNS inszerteket állományként klónoztuk maltöz kötő protein (MBP) vektorba, ami lehetővé tette ezek expresszié)át C-termínális fúziós proteinként. A véletlenszerűen kiemelt egyes MBP fúziós kiónokból nyert nyers sejt lízáfumokat azután BUSA vizsgálattal vizsgáltuk TPO-R-hez való kötődésre a fentiek szerint

Pepiid nrutagenezis vizsgálatokat poliszóma display rendszer alkalmazásával is végeztünk, az US 08/300262 számon 1994. szeptember 2-án benyújtott szabadalmi leírás szerint, amely az US 08/144775 számú 1993. október 29-én benyújtott szabadalmi leíráson és a WO95/11992 számon publikált szabadalmi leíráson alapuló részben folytatólagos bejelentése, amelyek mindegyikét leírásunkba referenciaként beépítettük. Az XXXX {€, P, R vagy S) tirefiXXXXXX (C vagy S) szekvencia - amelyben X jelentése random NNK kodon, és a kisbetűk amínosav kodonokat jelentenek, amelyek a kodon 1-es és 2-es helyzetében 70/10/10/10 mulegenezist, és a kodon 3-as helyzetében K-t (G vagy T) - alapján mntagenezís könyvtárat szerkesztettünk. A könyvtárat 5 cikluson keresztül dúsítottak TPO-receptorral szemben, amelyet mágneses gyöngyökön immobilizáltunk. Az 5. ciklus után a PCR-rei felerősített állományt pAFFó plazmádba klónoztuk, és az ELISA-pozitív kiónokat szekvenáltuk. A szekvenciákat egy MBP vektorba szübkiónoztuk, és MBP ELISÁ-val meghatároztuk kötődési affinitásaikat.

Poliszóma szűréshez a TPO-R immobílízálására az Ab 179-et először tozílaktíváit mágneses gyöngyökkel (Dynal Corporation) kémiailag konjugáltuk, a gyártó útmutatása szerint. A gyöngyöket az antitesttel 0,5 moi/l koncentrációjú borát pufferben (pH 9,5) egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten inkubálluk, A gyöngyöket mostuk, és egyesítettük a HPÁP-farkat tartalmazó TPG-R~rel. Az antitesttel bevont gyöngyöket és a receptort 4 ^l!C-on 1 órán keresztül inkubálluk, és a gyöngyöket ismét mostuk, majd hozzáadtuk

9*

- 26a pollszóma könyvtárat,

A fentiekben ismertetett különféle könyvtárak szűrésével kaptuk az. 1. és 2; táblázatban bemutatott TPO-receptorhoz kötődő peptideket, valamint egyéb, itt fel nem tüntetett peptideket is.

í, táblázat

CRASPILtEWtTLC

CRAaPTUEWLTÍC

CRQGPTLTAWLLC

CAOSPTLRE'AHSFC CELVePSlMSWLTÖ CQT S Q P T L GTw?öe CÖQiGVTLSRWlFc SQTGLTLREWLGÜFSLLS CREOPTLLÖWLKRQVSSC R Ö 0 Q P T L S Q W L V S L Μ! M C MVAÖRTLREFÍASLP5WC i SMQÖFTFRSWVSMMKVLC j

SVCCGPTLRÖWLAARNHLS G H ABQ P TL RÖW LE G R R P K N

S V R CG RT L RQ W LAA RTW L S

L A i 6 G P T IRQ W L H G N G R Ο T

H Q R V G R TL R E W K T Q V AT Κ X

CAOCRTL REWLSEO

5S0GPTLKEWLSVTRGAS

EÍEGRTLREWLTSRTRRS

TÍKQPTtRQWLKSRSHTS ^radgptlrqwlsgrÁr’o sÍSGPTL Rí WLT SR T P H S ssdgrtlkewlsvtrgasI « »

X «

2. táblázat

CTFREFVNÖC CSRADFLAAC CSCACVVOCC

CTLFCWULGááC

CSLQEfLSHÖGYVC

CSLKSFLHSSLMQC

CTFfíOLLEYGVSSC

CTMREFLVASeVAC

CTtAEFLASaVEQC I

-|

CTtASFtASSVSSC

-28Λ ♦* * ttábláz&t folytatása.

CTtKewLvsHSvwc

CTtREFS-SLGMHAC ^ctLREFLÜPTTAVc

CSLIEFLAIGVALC

GGGRGCTLKGWKG6DCGRS i

ONRSGLLAAC

CTLQOWLSGC

CTLRSFXAÖC

CTRAGFLXGC

GTLREF&RGC

CTLSOFKRGC

CTFBQWKEAC iCTLSEFRGGf ;CTLQSFLEGC

ICTLQQWKDQC

ICTR8ÖWIEGC j CTLGEWKRGC | CTLWGCQXRGC

CTLQEWRGGC

ÍTRLSGCWLC fRTQWLLÖC

CTLASFRRGC

CTSTGWLLAC

CSRSÖFLRSC

CTLREWLEGC

CTLREFLLMQAC

C7LXEWLLWGGC

CTLLEWLRRFVC

CTLRQWLGGA1

CTtGOWtQMÖMC

------J } CTLREWVFAGLC ί CL.LL£FLSG ADC

CTLGEFLAGHLC i CRLREFLVGLTC TcGFRSWLVOOTC i: CTLREWLEDLGC icTLGOWLVGWT C

--1

I, táblázat folytatása

CTLSSWt S gí-SC Έ TLMGWLGGWí

CT'.RgWLSVGTC iCTLGGWtSGGLC | GSHGCYLR£WLC^XSVRC

I GWGGGTLROCTLRGVFWS j SVNSCTLREFLTQCRVFC

Γ§ Y00CTLRHWL M0SYGÖC [ ORSGCTLRDWVLLNCtAS | N V R G C T L S G W V S E Ö i V G C ’ o « s s c τ l révig sievt?

A S W Y C T V R EtME'MOtREc

G S T S C T L R Η X L Η M L G L 0 C A^EQCTtKoWt¥YVRVGC~ AQRGCTLSYF’.'SYSXC-^f' G YCGCt ErEFLA S F HTSC S E G G C T t R Έ W Y AS* St?A S C

SRSRCTIREWU QGcWfs

SG SRCTL.RSW: ÍQ GC OF S

1GtGCTLSOWRKRTRCDTH

I YRGCSRAQLIGGSCRKK j GR GCT LKa W KqgFcTr s f V R G C A LROWVAGECrδW T i 1ΛΥ R GCTLN G F K 8 RHCGSP £ j CTL8SWKHRSCA?

GRGCTRAGWtAGCCTGI

RAGCTLREFRXGCLAL KRGCT LA EMf R GCNRSN G R Q C T L X QWKQ80C9B8

RWRGCSLAXLXKGAACGRG

RGGCTLREWRS VRV S*t

GRGCTLXOWKGGDCGRS

R Y G C T R R Q &t l V 3 T C V R i

Φ ΦΦ

Μ· *

Λ

- 30 A találmány szerinti néhány további peptid ÍC50 értékeit az alábbi táblázatban ismertetjük, Az ICys értékek kiértékelésére különféle eljárások alkalmazhatók, így például egy egyensúlyi kötődési BUSA vizsgálatot - MBP-TPÖ vagy lacl-peptid tracer alkalmazásával - használtunk annak meghatározására, hogy a peptidek gátolják-e a TPÖ kötődését a TFG-receptor exíraeellulárís doménjébez. Az IC$© értéket rendszerint a szabad pepiid alkalmazásával határoztuk meg, Áz IC50 értéket a szabad pepiid alkalmazásával határozhatjuk meg, amely adott esetben C-terminálísán amidálva lehet, vagy észterként vagy egyéb karboxamidként állítható elő.

A fágon lévő pontos szekvencia leutánzására a szintetikus peptidek N-termínálts és C~terminálís arninosavjait gyakran még egy vagy két glicin-maradék előzi meg. Ezek a glicinek valószínűleg nem. szükségesek a kötődéshez vagy aktivitáshoz. Hasonlóképpen a poliszómákon lévő peptidek pontos szekvenciájának leutánzására a szintetikus peptidek €-terminális arninosavjait gyakran az M AS szekvencia előzi meg. Ügy gondoljuk, hogy ez a szekvencia sem szükséges a kötődéshez vagy aktivitáshoz.

Az ÍC50 értékeket szimbólikusan + és -H- jelekkel értékeltük. Így például azokat a peptideket, amelyek IC50 értéke nagyobb volt, mint 200 pmol/l, egy - jellel értékeltük. Azokat a peptideket, amelyek IC50. értéke <2ÖÖ pmol/l, + jellel értékeltük, míg azokat, amelyek ICjo értéke A5ÖÖ nmol, jellel értékeltük. Azokat a peptideket, amelyek ICso értékei határértéket jelentenek két szimbólum között, egy vegyes jellel, például +/- jellel értékeltük. Azoknál a peptideknél, amelyek IC50 értékeit nem határoztuk meg, az N.D. jelölést alkalmaztuk. A GGCTLREWLHGGFCGG szekvenciát tartalmazó peptidek. ICs» értéke 500 nmol vagy kisebb, (Megjegyezzük, hogy az Ν-terminális és C-ter~ minális aminosavakat két gHeín-maradék előzi meg, hogy a fágon lévő pontos szekvenciát kapjuk. Ezek a glicinek valószínűleg nem szükségesek a kötődéshez vagy aktivitáshoz.) »00# * ~31 3. táblfeat

Pepiid

ÍAfinasás i

3SC AOGPTLBHWiSFCOO i GUAOOPTtRQWt-gOnnPKU i --ίOGCAO0PTtR£Wisac<5Gx | θ Ϊ iKQPTLRQWLKS RSHTS 1 +0

S GPTLRQWt i ASEOPTLRÖWLHGUGRÖtS -ΜΙ UE.©PTLREWLTS«TPWS 1 -Μι_λ_......

Azok a peptidek és pepíid-mímetikumok, amelyek IC50 értéke nagyobb, mint körülbelül 100 mmol/1, a találmány érteimében diagnosztikámként vagy terápiás szerként kielégítően alkalmazhatók, A diagnosztikai célokra előnyösen alkalmazható peptidek és peptid-mimetikumok ÍC50 értéke körülbelül 2 mmol/1 vagy ennél kisebb, és a gyógyászati célokra előnyösen alkalmazható találmány szerinti peptidek és peptid-mimetikumok ICso értéke körülbelül 100 pmolZl vagy kisebb.

A kötődő pepiid szekvencia alkalmas eszközt biztosit a találmány szerinti TPO-R-hez kötődő vegyület minimális méretének meghatározásához is. A kódolt szintetikus könyvtár (ESI/} rendszer vagy a nagyléptékű immobilizálí polimer szintézis rendszer alkalmazásával nemcsak az ilyen aktivitással rendelkező pepiid minimális méretét tudjak meghatározni, hanem minden olyan pepiidet ís elő tudunk állítani, amely a peptidek azon csoportját képezi, amelyek az előnyös motívumtól (vagy az ilyen motívum minimális méretétől) egy, kettő vagy több maradékban különböznek, Á peptidek ezen csoportját azután TPO-reeepíorhoz való kötődési képességükre szűrhetjük. Ezek az Ímmobilizált polimer szintézis rendszerek vagy egyéb pepiid szintézis módszerek alkalmazhatók a csonka analógok, deléeíós analógok, szubsziítúciós analógok és ezek kombinációi előállítására is.

A találmány szerinti peptídeket és peprid-mímetikumokat tromhopoietinis sejt-prolííeráeío vizsgálattal is kiértékeltük, amelyet részletesen a ismertetünk, A sejt-proliferációt ismert eljárásokkal határoztuk meg, például MTT vizsgálattal, ami korrelációban van a ^H-tlmidin beépüléssel a sejt-proliferácsó Indikátoraként [Mossmanm J, Immunok Methods 65,

-32* ♦ V» (1983)]. A vizsgált peptidek dózisíuggo módon stimulálták a TPO-R-rel transzfektált Ba/F3 sejtek prolíferációját, amint azt az IA ábra mutatja. Ezek a peptidek nem fejtettek ki hatást a szülői sejtvonalra (lásd az IB ábrát).

A 7-9, ábrán láthatók a találmány szerinti peptidek és peptíd-mimetikumok aktivitásának kiértékelésére végzett másik vizsgálat eredményei. Ebben a vizsgálatban az egereket karboplatinnal trombocítopéniássá tettük, Á 7. ábrán láthatók azok az eredmények, amelyeket akkor kapunk, amikor a Balh/C egereket a Ö. napon 125 mg/kg intraperitoneális dózisban karboplatinnal kezeljük. A szaggatott vonalak mutatják a kezeletlen állatokkal kapott, három kísérletből származó eredményeket. Az összefüggő vonal mutatja a karboplatinnal kezelt csoporttal kapott eredményeket három kísérletből. A vastagított, összefüggő- vonalak mutatják az irodalmi adatokat. A 8. ábrán látható a karboplatinnal végzett titrálás hatása a vérlemezkeszámra a megadott mennyiségben karboplatinnal kezeit egerekben [mg/kg, intraperitoneálisan (ip), a Ö, napon], A 9. ábrán látható a karboplatinnal indukált trornhocítöpénia csökkenése az ÁF12513 jelű peptid (513) hatására a lö. napon, A karboplatint (CBF; 50-125 mg/kg, íntraperítoneálisan) a ö. napon adtuk. Az AF12513-at (1 mg/kg, ip) az 1-9, napon adagoltuk. Ezek az eredmények mutatják, hogy a találmány szerinti peptidek képesek a trombocitopéníát csökkenteni egér modellben.

A találmány szerinti peptidek közül némelyik dimerizálhatő vagy oligomerizálhalő, ezáltal fokozható a fenti vegyületek affinitása és/vagy aktivitása. A peptid. dinrerizáiás/oiigonierízálás TPG mímetikus potenciálra sejt-prohferáeiós vizsgálatban kifejtett hatásának vizsgálatára szintetizáltuk a GGCADGPTLREW1SFCGG peptid C-terminálison biotinilezett analógját [GGCADGPTEREWISFCGGK (Biotin)]. A pepiidet szérummentes, HEFES-szel pnfferolt RPMI-ben 4/1 mőlarányban előinkuháltuk streptavidínneh A komplex TFÖ-R-rel Íranszfektált Ba/F3 sejtek prolíferációját serkentő hatását a fent ismertetett módon vizsgáltuk, a szabad, biotinilezett pepiiddel és a nem biotinilezett szülői pepiiddel együtt. A 2Á ábrán láthatók a vizsgálat eredményei a komplexált, biotinilezett pepiidre ÍÁF 12885 -t- streptavidin <8A}], mind a transzfektált, mind a szülői seíivonalon. A 2B ábrán láthatók a vizs-33 gáláit eredmények a szabad biotinílezett pepiidre (AF 12235), mind a transzfektált, mind a szülői sejtvonalön. A 2C ábrán láthatók a vizsgálat eredményei magára a streptavidinre, mind a iranszfektálí, mind a szülői sejtvonalon. Ezek az ábrák mutatják, hogy az előzetesen kialakított komplex körülbelül iö-szer hatásosabb volt, mist a szabad pepiid.

A találmány szerinti peptidek kötődésének és aktivitásának speeífieitását a peptidek eritropoierin receptorral (EPO-R) szembeni kereszt-reaktivitásának tanulmányozásával Is megvizsgáltuk. Az EPO-R szintén a hematopoíetín növekedési faktor receptor család tagja, ugyanúgy, mint a TPÖ-R. A találmány szerinti peptideket, valamint a TPO-t, EPO~t és egy ismert EPO-kötő pepiidet sejt-proliferáeiós vizsgálatban vizsgáltunk, egy EPÖ-dependens sejtvonal alkalmazásával. Ebben a vizsgálatban növekedési faktor-dependens egér melti-poísneiális primitív vérképző őssejt-vonalai, az FDCP~l~et alkalmaztuk szülői sejlvonalként (Dexter és munkatársai, 1. Exp. Med. 152, 1036-1047 (1931)]. Ez a sejtvonal képes proliferálódní, de nem differenciálódik, amikor WEHI-3-kondicionált közeggel (IL-3-ai tartalmazó közeg, ATCC szám T1BŐ8) kiegészítjük. A szülői sejtvonalat humán vagy egér EPO-R-reí transzformálva állítjuk elő az FDCP-l-EPO-R sejtvonalat. Ezek a transzfektált sejtvonalak képesek proliferálódni, de nem differenciálódnak humán vagy egér EPO jelenlétében.

A sejteket a stacioner sűrűségi érték felének eléréséig szaporítottuk a szükséges növekedési faktorok jelenlétében. A sejteket ezután PBS-sel mostuk, és 16-24 órán keresztül ébezteítük a növekedési faktorok nélküli teljes tápközegben. A sejtek életképességének meghatározása után lőrzsoldaiokat (teljes tápközegben, növekedési faktorok nélkül) készítettünk, amelyekben a sejtek sűrűsége lö⁵ sejí/50 míkroliter volt. A vegyületek soro2athígításaít (rendszerint szabad oldat fázisú pepiidet, szemben a fághoz kötött vagy egyéb módon kötött vagy ímmohilizált pepiiddel) 9ó-rezervoáros szövettenyésztő lemezeken 50 míkroiíter/rezervoár végkoncentrációban készítettük el. A sejteket (50 míkroliter) bemértük az egyes rezervoárokba, majd 24-48 órán keresztül inkubáliuk, amely ponton a negatív kontroliaknak et kelt pusztulniuk, vagy nyugalomba kelt jutniuk. A sejí-proliféráeióí ezután ismert módon, pél-34dán! MTT módszerrel mértük.

A 3A-ö ábrákon láthatók egy kontroll kísérfeísorozai eredményei, amelyek a TPO, a találmány szerinti peptidek, az EPO és az EPÖ-R-hez kötődő peptidek aktivitását mutatják sejt-prolíferációs vizsgálatban, a TPO-R-rel transzíekláli Ba/F3 sejtvonal és az annak megfelelő szülői sejtvonal, vagy egy EFO-dependens sejtvonal és az annak megfeleld szülői sejtvonal alkalmazásával. A 3A ábrán láthatók a sejt-proiiferációs vizsgálatban TPO-val kapott eredmények, TPÖ-R-rel transzfekíált Ba/F3 sejtvonal és az. annak megfelelő szülői sejtvonal alkalmazásával, A 3B ábrán láthatók a sejt-prollferációs vizsgálatban EPO-val kapott eredmények, TPO-R-rel transzfekíált Ba/F3 sejtvonal és az annak megfelelő szülői sejtvonal alkalmazásával, A 3C ábrán láthatók a komplexált biotínilezett peptiddel (AF 12285 + SA) és egy biötmílezett EPO-R-kötődő peptíd komplex formájával (AF 115(55 + SA) kapott eredmények, TPO--R-rel transzfektált Ba/F3 sejtvonalon. A megfelelő szülői sejtvonallal kapott eredmények a 3D ábrán láthatók. A 3E ábrán láthatók a sejt-prolíferációs vizsgálatban TPO-val kapott eredmények, EPÖ-dependens sejtvonal alkalmazásával. A 3F ábrán láthatók a sejt-prollferációs vizsgálatban EPO-val kapott eredmények, EPO-dependens sejtvonal alkalmazásával. Á 3G ábrán láthatók a komplexált biotínilezett pepiiddel (AF 12285 + SA) és egy biotínilezett EPÖ-R-kötődő pepiid komplexált formájával (AF 11505 + SA) kapott eredmények EPO-dependens sejtvonalon. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti peptidek nagymértékű speeificitással kötődnek aTP0-R~hez, és aktiválják azt,

IV. PBPTÍDEK ÉS PIPTIP-MIMBTIKUMÖK ELŐÁLLÍTÁSA

A) Szilárd fázisú szintézis

A találmány szerinti peptideket klasszikus eljárásokkal állíthatjuk elő, például szokásos szilárd fázisú eljárások alkalmazásával. A standard eljárások közé tartoznak a kizárólagosan szilárd fázisú szintézis, a részlegesen szilárd fázisú szintézis, a fragmens kondenzáció, a klasszikus oldat fázisú szintézis, sőt a rekombináns DNS módszerek ts [lásd például Memfield: 3. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963), amelynek tartalmát leírásunkba referenciaként beépítettük], A szilárd fázisban a szintézis tipikusan a pepiid C-termínális végétől indul ki.

- 35 *:*·

9X9 9 »9 *

Χ*«

9' 99 tv * ♦ · «» xt alfa-amino védett gyanta alkalmazásával. A megfelelő kiindulási anyagot úgy állíthatjuk elő például, hogy a kívánt alfa-aminosavat egy klor-metilezett gyantához, hídroxi-metil-gyantához vagy benzhidril-amin-gyantáboz kapcsoljuk, Egy ilyen klor-metílezeíí gyantát BIO-BEADS S-X.-1. néven forgalmaznak (Bio Rád Laboratories, Richmond, CA) és a hidroxi-metil-gyanta előállítását Bodonszky és munkatársai [Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966)] ismertetik, A benzhidril-amin-gyantát (BHA) Pietta és Marshall ismerteti [Chem. Commn, 650 (1970)] és kereskedelmi forgalomban is kapható (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) hídroklorid formában.

Fentieknek megfelelően a találmány szerinti vegyüieteket úgy állíthatják elő, hogy egy alfa-amino-védett aminosavat a kiór-metilezetí gyantához kapcsolunk például cézium-hidrogén--karbonát katalizátor segítségével, Gisin módszere szerint [Helv, Chim. Acta. 56, 1467 (1973)]. A kiindulási kapcsolás után az alfa-amíno-védőesoportot különféle reagensekkel távolíthatjuk el, például trífluor-ecetsavval (TFÁ) vagy sósavval (HC1), szerves oldószerekben, szobahőmérsékleten.

Alfa-anbno-védöcsoporlként a peptídek lépésenkénti szintézisében szokásosan alkalmazott védőcsoportokat használhatjuk, ilyenek például az acil típusú védőcsoportok (például forrni!-, írííluor-acetÍl-, acetilcsoporí), az aromás uretán típusú védőesoportok [például henzil-oxi-karhonil-esoport (Cbz) és szübsztituált Cbz-csoport'j, alifás uretán védőesoportok (például tere—butoxikarbonil- (Boc), izopropil-oxi-karbonil-, cíklohexil-oxi-karbonil-csoport] és az alkil típusú védőcsoportok (például benzii-, trífeníl-metil-csoport), Előnyős védőesoportok a Boc és az Fmoc. Áz oldanáne-védocseporíok érintetlenül maradnak a kapcsolás során, és nem hasadnak le az amiao-íermínális védőcsoport eltávolítása vagy a kapcsolási reakció során. Az oldalláncot a teljes peptíd szintézisének befejezése után kel! eltávolítani olyan reakciókörülmények között, amelyek nem változtatják meg a cél pepiidet.

A Tyr oldallánc-védőesoportja például a tetrahídropíraníl-, tere-buti!-, trifil-, benzii-, Cbz-, Z-Br-Cbz- és 2,5-díklőr-benzíí—csoport. Az Asp oldallánc-védőesoportja például a benzii-, 2,ő~dik.lór-henzii-, metil-, etil- és eiklobexilesoport. Á Thr és Ser oldaíláne-védöcsoportjaí például az acetil-, benzoii-,

- 3Ő trítil-, tetrahidropiranü-, benzil-, 2,ő-diklór-beozil- és Cbz-csoport. A Thr és Ser oldallánc védöesoportja a benziiesoport. Az Arg oldalláne védöesoportja például a nitro-, tozil- (Tos-), Cbz~, adamantil-oxi-karbonil-, mezítoil-szolfonil- (Mis··) és Boc-csopon. A Lys öldalláne-védőcsöporíjai közé tartozik például a Cbz-, 2-klór-benzil-oxi~karhonil~ (2-Cl-Cbz-), 2-bróm-henzil-oxikarbosil- (2-Br-Cbz-), Tos- és Boo-csoport.

Az alfa-amino-védocsöport eltávolítása után a többi védett aminosavaí egyenként kapcsoljuk a kívánt sorrendben. Általában minden egyes védett aminosavat feleslegben alkalmazunk egy megfelelő karboxilcsoport aktíváiénál, például dieiklöhexil-karbödiimíddel (DCC), oldatban, például metilén-kloríd, dimetíl-formamíd (DMF) elegyekben.

A kívánt atnínosav-szekvencia kialakítása után a kívánt pepiidet egy reagenssel végzett kezeléssel hasítjuk le a gyantáról., például trifiuor-eeetsavval vagy hídrogén-fluoriddal (HP), amely nemcsak a peptidet hasítja le a gyantáról, hanem az összes maradék oldafláne-vedőcsoportot is hasítja. Abban az esetben, ha klór-metilezett gyantát alkalmazunk, a hidrogén-fluorídos kezelés szabad pepiíd-savak keletkezését eredményezi. Ha benzhídríl-amin gyantái alkalmazunk, a hidrogén-fluorídos kezeléssel közvetlenül szabad peptidantídot kapunk. Alternatív módon, ha klór-metilezett gyantát alkalmazunk, az oldalláne-védőesoportökat tartalmazó peptidet a peptíd-gyanta ammóniával végzett kezelésével hasíthatjuk le a gyantáról, amelynek eredményeként a kívánt, oldalláncban védett amídot kapjuk, vagy egy aikil-aminnal végzett kezeléssel, amikor oldalláneban védett alkil-amidot vagy díalkíl-amídot kapunk. Az oldallánc-védöcsoportot ezután szokásos módon távolítjuk el hidrogén-íluoriddal végzett kezeléssel, így kapjuk a szabad amidokaí, alkiiamí dókat vagy diaiki 1-ami dókat.

A szilárd fázisú peptid-sziníézrs szakirodalomból jól ismert, lásd például Síewart vonatkozó munkáját [Solíd Phase Peptide Syntheses, Freeman and Co., San Francisco (1969)].

A kódolt szintetikus könyvtár vagy “nagyléptékű ímmobilízált polimer szintézis rendszerek alkalmazásával [amelyeket az US 07/492462 (bejelentési napja 1990. március 7.), 07/624120 (bejelentési napja 1990.

X * •Α.·*»

Λ

Φ Φ

Φ * φφ*

Φ

Φ ΦΦ

Μ ΦΦ

Φ Φ ΦΦ ♦ * «

« φ

ΦΦ Φ december 6,) és 07/805727 (bejelentési napja 1991, december 6.) számú szabadalmi leírásokban ismertetnek] nemcsak a kívánt aktivitással rendelkező peptid minimális méretét lehet meghatározni, hanem olyan peptídek is előállíthatok., amelyek, az előnyös motívumtól (vagy a fenti motívum minimális méretétől) egy, kettő vagy több maradékban különböznek, A peptideknek ezt az állományút azután TPO-R-hez való kötődési képességükre szűrhetjük. Ez az immobilizálí polimer szintézis rendszer vagy egyéb peptid szintézis módszer is alkalmazható a találmány szerinti peptidvegyüleíek csonka analógjainak és deléciós analógjainak vagy a csonka és delécíós analógok kombinációinak e Idái litására,

B) Szintetikus aminosavak

A fenti eljárások olyan peptídek szintetizálására is alkalmazhatók, amelyekben a 20 természetben, előforduló·, genetikaílas kódolt aminosavtól eltérő aminosavak helyettesítik a találmány szerinti vegyuletek egy, kettő vagy több helyzetét, Így például tríptofán helyett na.ft.il-alanínt alkalmazhatunk, ami a szintézist elősegíti. Egyéb szintetikus aminosav-maradékok is lehetnek a találmány szerinti peptidekben, például 1-hidroxi-prolil, L-3,4-dihíd.roxi~feníl\-alanil, d-aminosav-maradékök, például L-d-bídroxí-lizil- és D-d-metíl-alanil~, L-a-metíI-ala-mi-, .S-aminosav-maradekok és izokinolíl-esoport, D-aminosavak és nem természetes szintetikus aminosavak is beépíthetők a találmány szerinti peptidekbe.

A 20 genetikailag kódolt amínosav (vagy a megfelelő D-aminosav) természetes oldalláncát egyéb oidalláncokkal is helyettesíthetjük, például aikil-, rövid szénláncú alktl-, 4-7 szénatomos cikloalkii-, amino-, rövid szénláncú alkíl-amíno-, dí(röv.íd szénláncú)alkii-amíno-_y rövid szénláncú aikoxi-, hídroxí-, karboxi Íesoporttal és rövid szénláncú észter-származékaival, és 4-, 5-, 6- vagy 7~tagá heterociklusos csoportokkal. Különösen olyan proiin-analógokat alkalmaz hatunk, amelyekben a prolin-maradék gyűrűmérete 5-tagúról 4-, 6- vagy 7-tagúra változott.

A gyűrűs csoportok 'lehetnek telítettek vagy telítetlenek, és ha telítetlenek, lehetnek aromásak vagy nem aromásak.

-38A heterociklusos csoportok előnyösen egy vagy több nitrogénatomot, oxigénatomot és/vagv kénatomot tartalmaznak heteroatomként. A fenti csoportokra példaként említjük a turaxanil·, furil-, imidazolidinil-, imidazol.il-, imiáazolinil-, izoíiazolil-, izoxazolíl-, morfolinil- (például morfollno-), oxazoiíl-, piperaziuii- (például 1 -píperazinil-), piperidil- (például 1 -piperid.il-, píperidino-), piran.il-, pirazin.il-, pirazoliáinil-, pirazolinil-, pitazoKÍ-, piridaziuil-, piridii-, pirimldinii-, pirroHdinil· (például l-pirroiidi.níl~), pírrolinil-, pirrolii-, tiadiazolíl-, riazolil-, tienil-, tiomorfolinil- (például tiomorfdlino-) és íriazoÉlcsoportot. Ezek a heterociklusos csoportok vagy szobsztiiuáltak, vagy szubsziiiuálatlanok. Ha a csoport szubsztituált, a szubsztituens például alkilcsoport, aíköxicsoport, halogénatom, oxigénatom vagy szubsztituált vagy szuhsztituálaílan fenilcsoport lehet.

A találmány szerinti peptideket egyszerűen módosíthatjuk foszforilezésseL és a találmány szerinti peptid-származékok előállítására alkalmas egyéb eljárásokat lásd például Hruby és munkatársai⁴² munkájúban, így a találmány szerinti peptidvegyületek kiindulási anyagként is szolgálnak a hasonló biológiai aktivitással rendelkező peptid-mimetíkumok előállítására.

A találmány szerinti peplídvegyuleíekeí, így a peptíd-mímetikumokat is kovalensen módosíthatjuk egy vagy több különféle, nem protein típusú polimerrel, például polietilénglikollal, poiipropilénglikolia! vagy poli(oxi-aike.n)-ekkel (lásd például US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 vagy US 4179337 számú szabadalmi bejelentéseket, amelyek tartalmát leírásunkba referenciaként beépítettük).

C) Terminális módosítások

Szakemberek számára sokféle módszer ismert olyan peptid-mimetikumek előállítására, amelyek azonos vagy hasonló kívánt biológiai aktivitással rendelkeznek, mint a megfelelő peptidvegyületek, de oldhatóságukat, stabilitásukat és hidrolízissel és proteolízissel szembeni érzékenységüket tekintve előnyösebb tulajdonságokkal bírnak a pepiidnél [lásd például Morgan és Gainor: Ann. Rep. Med. Chem. 24, 243-252 (1989)}. Az alábbiakban eljárásokat ismertetünk N-tenninálís amísocsoportjukban, C-terminális karhoxilesoportjakban módosított, és/vagy egy vagy több peptidkötés helyett nem amidkötést

-39tartalmazó peptid-mimetikumok előállítására, Magától értetődően két vagy több ilyen módosítás is összekapcsolható· egyetlen peptíd-mímetikmn szerkezetében (például a C-terminális karhozilesöpört módosítása és egy -CH₂~ karhamát kötés bevezetése két antínosav közé a pepiidbe).

1) ^-terminális módosítások

A pepíideket rendszerint szabad sav formájában szintetizáljuk, amist azt fent Ismertettük, de egyszerűen előállíthatók amid vagy észter formában is. A találmány szerinti peptídvegyületsk amino- és/vagy karboxíi-terminálísát Is módosíthatjuk, hogy eltérő találmány szerinti vegyüieteket kapjunk. Az amino-terminális módosításai közé tartozik a metiiezés [azaz -NCH3 vagy -NH(CHs)2 kialakítása], acetilezés, karhohenzoilcsoport hozzákapcsolása, vagy az aminö-terminális védése olyas védőcsoporítal, amely egy RCO0- általános képlete karhoxilál funkciós csoportot tartalmaz, ahol R jelentése nafti lesöpört, akti dini lesöpört, szteroidilcsoport vagy hasonló csoport lehet. A karboxíi-terminális .módosítások közé tartozik a szabad sav helyettesítése karboxamíd-csoporttai vagy gyűrűs 1 aktám kialakítása a karboxil-terminálison, szerkezeti korlátozás bevezetésére.

Az amino-terminális módosítások a fent megadottak, és idetartozik az alkrlezés, acetilezés, karbobenzoilesoport bevezetése, szukemimidcsoport kialakítása, stb. Közelebbről, az N-termlnális aminocsoportot az alábbiak az érint reagál t at h atj uk:

a) RC(O)NH- általános képletű amídesoport kialakítására (ahol R jelentése a fent megadott) egy savhalogeniddel [például RC(0)C1 általános képletű vegyülettel] vagy savanhidriddel végezzük a reagáltatást. A reakciót rendszerint úgy játszatjuk le, hogy a savhaíogeoidet a pepiiddel ekvimoláris mennyiségben vagy feleslegben (például 5 ekvivalens feleslegben) alkalmazzuk inért htgííószerben (például diktór-metánban), amely előnyösen feleslegben (például körülbelül 19 ekvivalens mennyiségben) egy tercier-amim, például díízopropil-etil-amlnt tartalmaz, a reakció során keletkezett sav megkötésére. A reakciókörülmények egyébként szokásosak, például szobahőmérsékleten 30 percen keresztül dolgozunk. A terminális aminoesoport alkilezésével - amellyel a nítrogénatomot rövid

Μ »

-40& » * * ·»** »

Φ 9 9 9 999 szénláncú alkílcsoporttal sznbsztituáljuk -, majd a kapott vegyületet a fent ismertetett módon savhaíogeniddel reagáltatva RC(O)NR~ általános képletű N-alkíl-amid-csoportot kapunk;

b) sznkcínimídcsoport kialakítására borostyánkősavanhídríddel végezzük a reagáltatást. Mint az előbbiekben is, közelítőleg ekvimoláris mennyiségben, vagy feleslegben használjuk a börostyánkösavanhídridei (például 5 ekvivalens mennyiségben), és az aminocsoporiot szakirodalomból ismert módon alakítjuk sznkcinimidcsoporttá, például egy tercier-amin, például dilzopropii-etil-amín feleslegben (például 10 ekvivalens mennyiségben) történő alkalmazásával, megfelelő inért oldószerben (például diklórmetánban) (lásd például Wollenberg és munkatársai, US 4612132 számú szabadalmi leírás]. Magától értetődően a szukciniicsoportot például 2-ó szénatomos alkílcsoporttal vagy -SR általános képlet δ csoporttal szubsztituálhaíjak ismert módon, így N-terminálisán sznbsztitnált szűkeinlmidcsoportot tartalmazó peptideket kapunk. Az ilyen alkil szubsztituenseket úgy állítjuk elő, hogy egy rövid szénláneú, 2-5 szénatomos olefint rnaleinsavanhidriddei reagáltatunk például Wollenberg és munkatársai fent idézett módszere szerint, az -SR sznbsztítuenseket egy RSH általános képletű vegyület maleinsavanhidríddel történő reagáltatásával állítjuk elő, ahol R jelentése a fent megadott;

c) benzil-oxí-karbonil-NH- vagy szubsztituált benztl-oxi-karbonil-HH-csoport kialakítására közelítőleg ekvivalens mennyiségű vagy feleslegben lévő benzil-oxi-karboníi-kloriddal (CBZ-C1) vagy szubsztituált benzil-oxí-karbonil-kíoriddal végezzük a reagáltatást megfelelő inért hígítószerben, például diklőr-metánban, amely előnyösen tereíer-amint tartalmaz a reakció folyamán keletkező sav megkötésére;

d) szulfonamídesoport kialakítására a reagáltatást ekvivalens mennyiségű, vagy feleslegben lévő (például 5 ekvivalens) R-S(O)2-Cl általános képletű vegyülettel végezzük, megfelelő isiért hígítószerben, például diklór-metánban, ezzel a terminális amlnoesoportot szulfonamiddá alakítjuk, ahol R jelentése a fent megadott. Az inért hígltőszer előnyösen tereíer-amint (díízopropíl-etíl-amlnt) tartalmaz feleslegben (például 10 ekvivalens . »

- 41 mennyiségben) a reakció során keletkező sav megkötésére. A reakciókörülmények egyébként szokásosak (például szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül véaezzük a reagáltatást);

χ.» f · karbamátcsoporí kialakítására a reagáltatást ekvivalens mennyiségű vagy feleslegben lévő (például 5 ekvivalens) R-OC(O)CI vagy

R.“ÖC(O)OCgH4-p-NÖ2 általános képletű vegyül ette! végezzük megfelelő ínért hígitószerben (például diklór-metánban), ezzel a terminális aminocaoportot karbamátcsoporttá alakítják, ahol R jelentése a fent megadott, Az ínért bigítószer előnyösen feleslegben lévő (például körülbelül 10 ekvivalens) iereier-amínt, például díízopropil-etil-amínt tartalmaz a reakció során keletkező sav megkötésére, A reakciókörülmények egyébként szokásosak (például szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül játszatjuk le a reakciót); és

í) karbamidcsoport kialakítására a reagáltatást ekvivalens- mennyiségű vagy feleslegben lévő (például 5 ekvivalens) R-N-OG általános képletű vegyűlöltei végezzük inért hígitószerben (például diklőr-nietánban), ezzel a terminális aminoesoporíot karbamidcsoporttá, azaz RNHC(0)NH- általános képletű csoporttá alakítjuk, ahol R jelentése a fent megadott, Áz inért hígítószer előnyösen feleslegben lévő (körülbelül lö ekvivalens) tereier-amint, például díízopropíl-etíl-amint tartalmaz. A reakciókörülmények egyébként szokásosak (például szobahőmérsékleten, 30 percen keresztül végezzük a reagáltatást).

2) C-termináíís módosítások .Az olyan peptid-mimetikomok előállítására, amelyekben a C-termánális karboxi 1c söpört egy észtercsoporttal van helyettesítve (azaz C~termi.nálisukon egy -C(O)OR általános képletű csoportot tartalmaznak, ahol R jelentése a fent megadott}, a peptíds&v előállítására alkalmazott gyantákról az oldalláncában védett pepiidet bázissal és a megfelelő alkohollal, például metanollal hasítjuk le, Az oldallánc-védőcsoportokat ezután szokásos módon hídrogén-fluoríddal végzett kezeléssel eltávolítva kapjuk a kívánt észtert.

Az olyan pepiíd-mimetikumok előállítására, amelyekben a C-terminális karboxiicsoporí egv ~C(O)NR'R⁴ általános képletű amidc soporttal van helyet-42tesítve,. beazhidril-amis gyantát alkalmazunk szilárd hordozóként a peptid-színtézisben. A szintézis befejezésekor a hidrogén-fluoridos kezelést - amelyet a peptid hordozóról történő lebasítására alkalmazunk - közvetlenül szabad peptid-amidot [azaz a C-terminális -C('0)NH2 csoportot] eredményez. Alternatív módon, ha klór-metilezett gyantát alkalmazunk a peptiá-szintézísben, és az oldalláncúban védett pepiidet a hordozóról ammóniával reagáltatva hasítjuk le, szabad peptid-amidot kapunk, míg a hasítást egy alkilaminnal vagy díalkíl-amínnal végezve oldalláncában védett alkil-amidot vagy dialkii-amidot [azaz a C-terminálís -C(O)NRR? általános képleté csoport, ahol R és R^s jelentése a fent megadott] kapunk. Az oldalláne védőesoportjáí ezután szokásos módon hidrogén-fluoriddal végzett kezeléssel eltávolítva kapjuk a szabad amidokat, alkil-amidokat vagy dialkibamidokat.

Egy alternatív kiviteli alakban a C-termínális karboxilesoport vagy C-terniiaális észtercsoport ciklízálását is kiválthatjuk a karboxilesoport vagy észtercsoport -OH vagy (-OR) része és az N-terminális aminocsoport közötti belső kiszontásos reakcióval, Így ciklusos pepiidet kapunk. Például a peptidsav előállítása és lehasííása után a szabad savat aktív észterré alakítjuk megfeleld karboxilesoport aktivátorral, például dícíklohexil-karhödiimíddel (DCC) oldatban, például díklór-metán, dímetil-formamid (DMF) eíegyekben. Ezután az aktivált észter és az N-terminális amin között lejátszódó belső kiszoriíásos reakcióval ciklusos pepiid keletkezik. A belső ciklízáeió előtérbe kerül a polímerízáciovai szemben, ha nagyon híg oldatokat alkalmazunk. Ezek a módszerek szakirodalomból jól ismertek.

A találmány szerinti peptideket ciklizálbatjuk, vagy peptid terminálisain dezaminálást vagy dekarboxilezést végezhetünk, így a pepiidben nem lesz terminális amino- vagy kafboxílcsoport, ezáltal proteázokkal szembeni érzékenysége csökken, vagy a peptid konformációját korlátozódik, A találmány szerinti vegyületek C-terminálís funkciós csoportja lehet például amid, rövid szénláneú alkíl-amid-, di(rövíd széniáncújalkibamíd-, rövid szénláncú alkoxi-, hidroxi- és karboxílesopori, és ennek rövid szénláneú észterszármazéka, valamint ezek gyógyászatilag elfogadható sók

-43:·** :: «** **

I>) Mölekstaláneba® történő módosítások

A találmány .szerinti vegyületek peptíd-származékainak előállítására alkalmas egyéb eljárásokat Brnby és munkatársai ismertetik [Biochem. J. 268(21 249-262 (1990)). így a találmány szerinti peptídvegyületek szerkezeti modellként is szolgálnak, nem peptid típusú vegyületekhez, amelyek hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Szakember számára jól ismertek azok a módszerek, amelyekkel olyan vegyületek állíthatók elő, amelyek az elsődleges- peptid» vegyülethez hasonló- vagy azonos kívánt biológiai aktivitással rendelkeznek, de oldhatóságuk, stabilitásuk és hidrolízissel és proteolizissel szembeni érzékenységük kedvezőbb [Morgan és Gainor: An®. Rep, Med, Chem. 24, 243-252 (1989)}, E módszerek közé tartozik a peptid molekulaiánc helyettesítése fősz fon átokból, amídátokbó-1, karbanaátokból, szulfonamidokból, szekunder aminokből. és N-metil-amíno-savakból kialakított molekulaláncc-al.

Azok a peptid-mimetikumok, amelyekben egy vagy több peptidkötés [~C(G)NH»j -CHx-karbamát kötéssel, foszfonát kötéssel, -CH?-szül fonandó kötéssel, karfeamid kötéssel, szekunder amin (-CH->NH~) kötéssel vagy alkilezeit peptidkötéssel [-€{€))NR⁶-, ahol R⁶ jelentése rövid szénláneú alkilesoportj van helyettesítve, szokásos peptíd-színtézissel állíthatók elő, egyszerűen úgy, hogy a megfelelően védett amino-sav-analó-got alkalmazzuk az amínosav helyett a szintézis megfelelő pontj án.

Megfelelő reagensek például az olyan amínosav analógok, amelyekben az amínosav karboxílcsoportját a fenti kötések kialakítására alkalmas rész helyettesíti, így például, ha a -C(O)NR- kötést a pepiidben -ClL-karbatnát kötéssel (»CH2Ö'C(O)NR~] kívánjuk helyettesíteni, akkor a megfelelően védett amínosav karboxílcsoportját (-COOfí) először -CHsOH csoporttá redukáljuk, majd szokásos módon -OC(O)C1 funkciós csoporttá, vagy para-nitro-karbonát [OCÍOjö-CsHU-p-NGé] funkciós csoporttá alakítjuk. Az ilyen funkciós csoportok bármelyikének reakciója szabad aminnal, vagy a szilárd hordozón lévő, részlegesen szintetizált peptid N-terminálisán lévő alkiiezett aminnal ~CH?OC(Ö)NS kötés kialakulásához vezet. Az ilyen -CHá-karbamát kötés kialakításának részletesebb leírását lásd például Cbo és munkatársai cikkében [Science 261, 1303-1305 (1993)j.

Hasonló módon a peptidláncbau tevő. amidkötés helyettesítése egy fősz fonál kötéssel az US 07/943805, 08/081577 és 08/119700 számú szabadalmi leírásokban. ismertetett módon érhető el.

A pepiidben lévő amidkötés helyettesítése -CHx-szulfonamid kötéssel ágy érhető el, hogy egy megfelelően védett aminosav karÖöxílcsoportját (-COOH) -CHdOH csoporttá redukáljuk, és a hidroxilcsoportot azután megfelelő kilépő csoporttá, például toxilcsoporttá alakítjuk szokásos módon. A tozilált származékot például tioecetsavval reagáltatok, majd hidrolízáljuk, és oxídativan klórozzuk, így olyan, egyébként megfelelően védett aminosavat kapunk, amelynek karhoxílcsoportját egy -CHj-SfOjjCI funkciós csoport helyettesíti. Ezt a megfelelően védett amínosav-analógot használva azután a pepiidszintézisben, egy -CHjSCOjjNR- kötést viszünk be a pepiidbe, amely a pepiidben lévő amidkötést helyettesíti, ezáltal peptid-mímetikumot kapunk. Az aminosav karboxilcsoportjának -CFbSföhCl csoporttá történő átalakítását részletesebben Weínsiein [Weínsiein Boris: Chemísiry & Bíoehemistry of Amino Acids, Peptides and Froteins 7, 267-357, Marcel Dekker, Inc., New York (1983)] ismerteti,

A szekunder amin kötéseket, ahol a pepiid amídkőtését egy -CbUNH- kötés helyettesíti, olyan megfelelően védett dipeptid- -analóg alkalmazásával állíthatjuk elő, amelyben az amidkötés karbontlesoporíját CHj csoporttá redukáltuk szokásos módon. Így például a digllcis esetében az amid redukciója aminná a védőesoport eltávolítása után H^NCBaCHaNHCHjCÖÖH képletű vegyeletet eredményez, amelyet azután N-védeít formában használunk fel a következő kapcsolási reakcióban. Az ilyen analógok előállítása a dípeptidben lévő amidkötés karboníiesoporijának redukálásával, szakirodalomból jól ismert

A megfelelően védett amínosav-analógot a szokásos peplld-színtézisben ugyanolyan módon alkalmazzuk, mintha a megfelelő amínosavat alkalmaznánk. Így például ebben a reakcióban rendszerint 3 ekvivalens védett arninosav-analőgot alkalmazunk. Inért szerves oldószerként metilén-kloridot vagy dímetíl-formamidoi alkalmazunk, és ha a reakció melléktermékeként egy sav keletkezik, a reakció oldószere rendszerint feleslegben lévő mennyiségben tercier amint tartalmaz a reakció során keletkezett sav megkötésére. Egyik

-45*« *» különösen előnyös tercier amin a diizopropil-etil-amín, amelyet rendszerint körülbelül lö-szeres feleslegben alkalmazunk, A reakció eredményeként a pepiíd-mírnetíkumba egy nem-peplíd kötést tartalmazó amínosav-analóg épül be. Bzt a szubsztitúciói kívánt számban megismételhetjük, azaz ö-tól a pepiidben lévő összes amídkőtés helyettesíthető nem-amid kötéssel,

A találmány szerinti peptideket ciklizálhatjuk, vagy a pepiid terminálisain dezamínáíást vagy dekarboxilezést végezhetünk, így a peptid nem tartalmaz terminális amino- vagy karhoxilesoportot, ezáltal a proteázokkal szembeni érzékenysége csökken, vagy a peptid konformációját korlátozódik, A találmány szerinti vegyületek C-terminális funkciós csoportja lehet például amid-, rövid szénláncú alkíl-amid-, di(rövid szénláncá)alkíl~amid~, rövid szénláncú aikoxi-, hídroxi- és .karhoxílcsoport, es ennek rövid szénláncű észterszártnazéka, valamint ezek gyógyászatílag elfogadható sói. A ciklizált vegyületekre példákat a 4., 5., ő., 8, és 9, táblázat tartalmaz,

E) Biszulfíd-kötés kialakítása

A találmány szerinti vegyületek a cisztemek ilolesoportjai közötti intramolekuláris díszulfíd-kötés kialakulása miatt ciklizált formában is lehetnek. Alternatív módon a císzleínek tíole soportj aí között íntennolekulárís diszulOd-kötést is kialakíthatunk, így dimereket (vagy magasabb oiigomereket) kapunk. A císztein-maradékok közül egy vagy több homocisztetnnel is helyettesíthető. Ezek az íntramolekuláris vagy intermolekuláris disznlfíd-származékok sematikusan az (a) általános képlettel ábrázolhatok, amelyben m és n értéke egymástól függetlenül I vagy 2.

A találmány további kiviteli alakja a fenti díszültid-származékok olyan analógjaira vonatkozik, amelyekben a kénaiomok egyikét CHx csoport vagy a kén egy másik ízoszterje helyettesíti. Ezek az analógok Íntramolekuláris vagy intermolekuláris helyettesítéssel állíthatók elő, az 1, reakeióvázlattai szemlélteiéit ismert eljárás alkalmazásával, a reakcióvázlat képleteiben p értéke I vagy 2, Szakember számára nyilvánvaló, hogy ez a helyettesítés akkor is végbemehet, ha a fenti a-antíno-y-vajsav-származék eltérő homológjait és homoei szteint alkalmazunk.

~ 4ő

Alternatív módon a peptid amino-íermináiisát egy a-szubsztituált ecetsavval is megfejelhetjük” (ahol az a-szubsztltuens egy kilépő csoport), például a-balogén-eeetsavval, igy például a-klór-ecetsavval, a-brém-eeetsavval vagy ct-jód-eeetsavvaL Á találmány szerinti vegyületek a kilépő csoport eiszteinvagy homocíszteín-maradék késatomja általi helyettesítésével ciklízálhatók vagy dimetizálhatók. [Barker és munkatársai, J. Med, Chem. 35, 2040-2048 (1992) és Or és munkatársai, 3, Org, Chem, 56, 3146-3149 (1991)], A dímcrízált vegyüietekre a 7., 9. és l ö, táblázat tartalmaz példákat.

A találmány szerinti vegyületek is vitro egyedülálló eszközként alkalmazhatók a TFO biológiai szerepének megértésére, beleértve sok olyan faktor kiértékelését is, amelyekről feltételezzük, hogy befolyásolják a TFO termelődéséi, vagy a TFO termelődése' által befolyásolódnák, valamint a receptorhoz való kötődés folyamatát, Á találmány szerinti vegyületek olyan egyéb vegyületek kifejlesztésére is alkalmazhatok, amelyek a TFO-R-hez kötődnek és azt aktiválják, mivel a találmány szerinti vegyületek fontos információt szolgáltatnak a szerkezet és aktivitás közötti összefüggésre, ami megkönnyíti az ilyen fejlesztést,

A találmány szerinti vegyületek kompetiiív kötőanyagként is alkalmazhatók új TRO-recepior agonísták kiszűrésére irányuló vizsgálatokban. Az ilyen vizsgálatokban a találmány szerinti vegyüieteket módosítás nélkül, vagy különféle módokon módosított formában alkalmazhatjuk, például jelzett formában, például kovalensen vagy nem kovalensen egy olyan maradékkal összekapcsolva, amely közvetlenül vagy közvetve detektálható szignált szolgáltat. Ezekben a vizsgálatokban az anyagokat közvetlenül vagy közvetve jelezhetjük, A. közvetlen jelzésre alkalmazható jelzöcsoportok például a radioaktív jelzések, például a ⁿ⁵I, az enzimek (US 3645Ö9Ö számú szabadalmi leírás), például a peroxidáz és a lúgos foszfatáz, és a fluoreszcens jelzőanyagok (US 3940475 számú szabadalmi leírás), amelyek lehetővé teszik a fluoreszcencia intenzitásának, a hullámhossz eltolódásának vagy a fluoreszcencia polanzácíója változásának követését. Közvetett jelzés lehet például az összetevők egyikének híotiniiezése, majd egy vagy több fenti jelzőcsoporttal összekapcsolt

-47X * φ

X «♦ * * φ φ φ «

♦ «X avidinhez kapcsolása. A vegyületek spacereket (térközbiztosító csoportokat) vagy linkereket (összekötő csoportokat) ís tartalmazhatnak, ha szilárd hordozóhoz kell azokat kapcsolni.

TPO-receptorhoz való kötődési képességük következtében a találmány szerinti peptidek reagenskést alkalmazhatók TPÖ-receptorok detektálására élő sejtekben, fixált sejtekben, biológiai folyadékokban, szövet-homogenizáíumokban, tisztított természetes biológiai anyagokban, stb. így például az ilyen peptidek jelzésével azonosíthatjuk azokat a sejteket, amelyek TPÖ-R-i tartalmaznak felületükön. TPÖ-reeeptorhoz való kötődési képességük következtében a találmány szerinti peptidek ín sita festésre, FACS~.re (finoreszcencía-aktivált sejt kiválogatás), Western biot analízisre, ELISA-ra, stb. is alkalmazhatók. Ezenkívül TPO-receptorhoz való kötődési képességük következtében a találmány szerinti peptidek a receptor tisztítására, vagy a sejtfelületűkön (vagy a permeabiiizált sejtek belsejében) TPO-reeeptorokat expresszáló sejtek tisztítására is alkalmazhatók.

A találmány szerinti vegyületeket különféle gyógyszerfcutatási és diagnosztikai célokra kereskedelmi forgalomban lévő reagensként is alkalmazhatjuk. Ilyen alkalmazások közé tartoznak például az alábbiak:

1) kalibrációs standardként való alkalmazás egy TPOagomsia aktivitásának kvantitatív meghatározására különféle funkcionális vizsgálatokban;

2} TPO-dependens sejtvonalak prolíferácíójának és növekedésének fenntartására;

3) TPÖ-receptorok szerkezeti analízisére ko-kristályositás útján;

4) a TPÖ szignál transzdukció/receptor aktiválás mechanizmusának tanulmányozására; és

5) egyéb kutatási és diagnosztikai alkalmazásokra, amelyekben a TPO-re~ ceptor előnyösen aktíváit vagy az ilyen aktiválás célszerűen kalibrált a TPÖ agonísta ismert mennyiségével szemben, és hasonlókra,

A találmány szerinti vegyületeket hozzáadott ciíokinekkcl együtt, vagy önmagukban megakariocíták és a megfelelő őssejtek in vitro megnövelésére is alkalmazhatjuk (lásd például DíGiusto és munkatársai WO95/Ö5843 számon publikált PCT szabadalmi leírását, amelynek tartalmát leírásunkba refe-4899 Μ »99 9 « » 9 * * * * «9» 9

X * * *

AA99 99** **♦

99 renciaként beépítettük], A kemoterápia és sugárterápia trombocitopéniát okoz azáltal, hogy elpusztítja a megakariociták gyorsabban osztódó, érettebb populációját. Ezenkívül az ilyen terápiás kezelések az éretlen, mitötíknsaa kevésbé aktív megakariocíta prekurzor sejtek életképességét és számát is csökkenthetik. igy a trombocitopénia csökkentését TPO vagy a találmány szerinti vegyületek alkalmazásával elősegíthetjük azáltal, hogy a betegnek a kemoterápiás vagy sugárterápiás kezelés után in vitro tenyészetben megakariocitákban és éretlen prekurzoraíkhan feldúsított saját sejtek populációját infundáljuk.

A találmány szerinti vegyületeket melegvérű élőlényeknek, így embernek ís adhatjuk a T.PO-R aktiválása céljából in vivő. így a találmány szerinti vegyületek TPO-val kapcsolatos rendellenességek terápiás kezelésére ís alkalmazhatók oly módon, hogy a találmány szerinti vegyületet olyan mennyiségben adagoljuk, amely in vivő elegendő a TPO TPO-& receptorra kifejtett hatásának utánzására. így például a találmány szerinti peptideket és vegyületeket különféle hematológiai rendellenességek kezelésére alkalmazhatjuk, beleértve - a korlátozás szándéka nélkül - a vérlemezke rendellenességeket és tromboeítopémáí, különösen akkor, ha azok csontvelő transzfuzióval, sugárterápiával vagy kemoterápiával kapcsolatosak.

A kemoterápiának vagy sugárterápiának alávetett betegnek először előnyösen TPO-aniagonisíákaí adagolunk, majd ezután adjuk a találmány szerinti TPO-agoníslákat.

A találmány szerinti vegyületek aktivitását in vitro vagy in vívó értékelhetjük ki különféle modell kísérletekkel [McDonald; Am, J. of Pedíairie Hematology/Oneology 14, 8-21. (1992)],

Egyik kiviteli alak szerint a találmány szerinti gyógyászati készítmények esontvelö-íranszfúzíóval, radioterápíával vagy kemoterápiával kapcsolatos tromhocítopénia kezelésére alkalmazhatók. A vegyületeket rendszerint profilaktikusan alkalmazzuk, a kemoterápia, sugárterápia vagy csontvelőtranszplantáció előtt, vagy az ilyen kezelések után.

Fentieknek megfelelően a találmány tárgyát képezik a gyógyászati készítmények is, amelyek hatóanyagként legalább egy találmány szerinti pepiidet vagy peptíd-mimetikumot tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható hordozó- 49 anyaggal vagy hígító-szerrel együtt; A találmány szerinti vegyületeket orálisan, pulmonárísan, parenterálisan [intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás (IV) vagy sznbkután injekció formájában), inhalálással (fisom por készítmény formájában), transzdermálisan, nazálisán, vagináiban, rekláíísan vagy szublinguálisan adagolhatjuk, és a fenti adagolási módokra alkalmas dó~ zisformákká formálhatjuk (lásd például Bernsleín és munkatársai WO93/2522! számon publikált PCT szabadalmi leírását; Fitt és munkatársai, WO94/I7784 számon publikált PCT szabadalmi leírását és Fitt és munkatársai EP-A 613ŐS3 számú szabadalmi leírását).

Orális adagolásra alkalmas szilárd dózisformák például a kapszulák, tabletták, pirulák, porok és granulák. Áz ilyen szilárd dózisformákban a hatóanyagot legalább egy inért, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, például szacharózzal, laktózzal vagy keményítővel elegyítjük. Áz ilyen dózisfonnák szokásos módon további anyagokat is tartalmazhatnak az ínért hígítóanyagokon kívül, így például csúsztatószereket, például magnézium-sztearátót. Kapszulák, tabletták és pirulák esetében a dózisforma pufferanyagokat ís tartalmazhat. Ezenkívül a tabletták és pirulák enterálls bevonattal is előállíthatok.

Orális adagolásra alkalmas cseppfolyós dózisformák például a gyógyászatilag elfogadható emulziók, oldatok, szuszpenziók, szirupok és elixirek, amelyek szokásosan alkalmazott inért hígitóanyagokat, például vizet tartalmaznak. Az ilyen ínért hígítóanyagokon kívül a készítmények tartalmazhatnak adjuvánsokat, például nedvesítöszereket, emulgeálószereket és szuszpendálőszerekeí, valamint édesítőszereket, Ízesítőszereket és illaiositóanyagokat is.

A parenterális adagolásra alkalmas találmány szerinti készítmények közé tartoznak a steril vizes vagy nem-vizes oldatok, szuszpenziók vagy emulziók. A nem-vizes oldószerek vagy vivőanyagok közé tartozik a propílénglíkol, pöiieítléngííkol, növényi olajok, például olívaolaj és kukoricaolaj, zselatin, és az injektálható szerves észterek, például etil-okát. Áz ilyen dózisformák adjuvánsokat is tartalmazhatnak, például konzerválószereket, nedvesítőszerekét, emulgeálószereket és díszpergálászerekeí. A készítményeket sterilizálhatjuk például baktériumokat visszatartó szűrön keresztüli szűréssel, vagy

-50a készítményekbe steriiizálőszerek bevitelével, vagy a készítmények besugárzásával, vagy a készítmények hevítésével. A készítményeket steril víz vagy egyéb steril, injektálható közeg alkalmazásával is előállíthatjuk közvetlenül beadás előtt.

A rektálís vagy vaginális adagolásra, alkalmas készítmények előnyösen kúpok, amelyek a hatóanyagon kívül segédanyagokat, például kakaóvajat vagy kúpkészítésre alkalmas viaszt tartalmazhatnak. A nazális vagy szublínguális adagolásra alkalmas készítményeket is szokásos segédanyagokkal állítjuk elő.

A találmány szerinti vegyületeket tartalmazó készí tményeket profi taktikusan és/vagy terápiás kezelésekben adagolhatjuk. Terápiás alkalmazásra a fent ismertetett betegségben szenvedő betegnek olyan mennyiségben adjuk a találmány szerinti kompozíciót, amely elegendő a betegség tüneteinek és szövődményeinek megszűntetésére, vagy legalábbis részleges enyhítésére. A fenti célra megfelelő mennyiséget nevezzük gyógyászatilag hatásos dózisnak. A fenti alkalmazásra hatásos mennyiségek a betegség súlyosságától, és a beteg testtömegétől és általános állapotától függően változnak.

A találmány szerinti kompozíciókat unkrekapszulázhaíjuk is például T'iee és Bibi módszerével [Treatíse on Controlled Drug Delivery., kiadó: A. Kydoníeus, Marceí Bekkor, N.Y., 315-339 (1992)].

Profdaktíkus alkalmazásra a találmány szerinti vegyületeket- tartalmazó készítményeket a betegségre érzékeny betegnek adagoljuk. Ezt a mennyiséget pronlaktíknsan hatásos dózisnak nevezzük, ilyen alkalmazásra a pontos mennyiségek szintén a beteg egészségi állapotától és testtömegétől függnek.

A hatékony terápiához szükséges TFÖ-agonista mennyisége különféle faktoroktól függ, így például az adagolás módjátói, a hatás helyétől, a beteg fiziológiai állapotától, és az egyidejűleg alkalmazott egyéb gyógyszerektől, így a kezelésre alkalmazott dózisokat meg kell határozni ahhoz, hogy a biztonságosságot és a hatékonyságot optimalizáljuk. Az ín vitro alkalmazott dózisok rendszerint hasznos információt szolgáltatnak a fenti reaktánsok in sítu adagolásához használható mennyiségek tekintetében. Az adott rendellenesség kezelésére alkalmas hatásos dózisok állatokban való tesztelése további Indikációt szolgáltat a humán dozírozáshoz [lásd például Güman és

- SÍ *

φ φ * χ χ Φ Φ ♦ X φφ»» * * munkatársai, szerk. Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis of Tberapeutics, 8. kiadás, Pergamen Press (1990); és Remington’s Pharmacentieal Sciences, 7. kiadás, Maek Puhlishing Co., Easton, Penn. (19SS), amelyek tartalmát leírásunkba referenciaként beépítettük],

A találmány szerinti peptidek és peptid-mimetikumok TPO által médiáit állapotok kezelésére körülbelül 0,001 mg ~ körülbelül 10 mg/kg testtömeg/nap dőzístartományban hatásosak. Áz adott esetben alkalmazott dózis a kezelendő állapottól, az adagolás módjától, valamint a kezelést végző orvos megítélésétől függően változik, mely utóbbi olyan faktorokon alapul, mint a kezelendő állapot súlyossága, a páciens általános egészségi állapota és kora, és hasonlók.

Szilárd fázisú peptid-színtézis

A találmány szerinti különféle peptideket Merrifield szilárd fázisú szintézissel [Steward és Yonng, Solíd Phase Peptíde Synthesis, 2. kiadás, Pieroe Chemical, Roekford, IL (1984) és Marrifield: 3. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)] szintetizáltuk Minigen/Biosearch 9600 automata készülékkel, vagy Applied Biosystems Inc. modell 431A peptid szintetizátorral, A peptideket az Applied Biosystems Inc, System 1.01 Software verziója szerint állítottuk össze. Minden egyes kapcsolást 1-2 óra alatt BOP-vel [benzotiazo!il-N-ox-trisz(dimctíl~amino-foszfónium—hexafluor-foszfát] és IIOBt-vel (1 -hidroxi-benzoiíazot) végeztük.

Gyantaként HMP gyantát, vagy PÁL gyantát (Miiligen/Biosearch) alkalmaztunk, amely egy térhálósított polisztriol gyanta, kötőként 5-[4‘«(Fmoc~ -amíno-metil)~3,5’~dimeíoxí-fenoxij-valeriánsavat használtunk. A PÁL gyanta alkalmazásával karboxil—terminálisán amid funkciós csoportot tartalmazó pepiidet kaptunk a peptid gyantáról történő lebasitása után. HMP gyantáról történő hasítás után C-terminálísán karboxilcsoportot tartalmazó végterméket kaptunk, A reagensek, gyanták és védett amínosavak (szabad tormában vagy gyantán) többségét a Millípore vagy az Applied Biosystem Inc. cégtől szereztük be.

A kapcsolási eljárásban amíno-védőcsoportként Fmoc-csoportot alkalmaz- 52 ΦΦΦΧ *♦ φ«φφ φφ* tank. Az antinosavak primer aminoesoportjának védését Fmoe-vel, és az oldallánc védését szerín, tírozin, aszparagin, glutaminsav és treonin esetén tere-butíl -csoporttal, giutamin esetén tritilcsop-orttal, arginín esetén 2,2,5,/jS-pentametil-kroma-szulfonát-csoporttal (Pmc), triptofán esetén N~ -(terc-bntoxi-karbonil)-csoporttal, hisztídin és giutamin esetén N-tritíl-csoporítal és risztéin esetén S-tritil-esoporttaí végeztük.

A peptidek gyantáról történő eltávolítását és ezzel egyidejűleg az oklallánevédőesoportok eltávolítását K-reagenssel végzett kezeléssel vagy annak kisebb módosításával végeztük. Ezzel szentben az amid ált karfeoxil-terminálist tartalmazó peptidek esetén a teljesen összeállított pepiidet 90% trifíuor-ecetsav/5% etán-dítiol/5% víz elegyével hasítottuk le a gyantától, kiinduláskor 4 °C-on, majd a hőmérsékletet fokozatosan szobahőmérsékletre emeltük. A védőcsoport nélküli peptideket dietil-éterrel csaptuk ki, A. tisztítást minden esetben preparatív fordítóit fázisú, nagynyomásé folyadékkromatoráfiás eljárással végeztük Cjs-kötött szilíkagél-oszlopon, acetonítril/viz gradienssel 0,1 %-os tríftuor-eceisavban. A homogén peptideket gyorsatom-bombázásos tömegspektrometríávai vagy elektrospray tömegspektrometriával azonosítottuk, valamint adott esetben elvégeztük az aminosav-analízist.

2. példa

A találmány szerinti peptidek biológiai aktivitását trombopoíetin-függő sejtprolíferációs vizsgálattal határoztak meg. Egér IL-3 dependens Ba/F3 sejteket teljes hosszúságú humán TPO-R-rel transzfektált unk. ÍL-3 távol létében (WEHI-3 kondicionált tápközeg) ezeknek a sejteknek a proliferácíója TFO-függő. A szülői transzfektálatlan sejtvonal nem érzékeny humán TPO-ra, de IL-3 függő maradt,

A biológiai vizsgálatokat mindkét fenti sejtvonalon elvégeztük, a könyvtár szűrésből származó szintetikus peptidek alkalmazásával. A sejteket komplett RFMI-lö közegben tenyésztettük, amely íö% WEHI-3 kondicionált tápközeget tartalmazott, majd kétszer mostak FBS-sel, WEHI-3 kondicionált közeg nélküli tápközeggel újra szusxpendáltuk, és a peptid megfelelő hígításait, vagy TPO-t tartalmazó rszervoárokba mértük, 2 x 1Ö⁴ sejt/rezerveár sűrű- 53 « * * ségben. Á sejteket 48 órán keresztül 37 '°C-on Inkubáltuk 5% szén-dioxidot tartalmazó nedves atmoszférában, és a metaboliRus aktivitást az MTT fbrmazánná történő redukciójával határoztuk meg ELISA lemez-leolvasóval, az 579 ntn-en mért abszorpció alapján. A vizsgált peptidek dózis.függo módon stimulálták a TPO-R-rel transzfektált Ba/F3 sejtek proíiíerációját, amint az az

1. ábrán látható, Ezek a peptidek nem fejtettek ki hatást a szülői, sejlvonalra.

A kémiailag szintetizált peptidek TPO-R-rel szembeni kötődési affinitását kompetiliv kötődési vizsgálattal határoztuk meg. A mikrotitráió lemez rezervoárjait 1 mg sireptavidinnel vontuk be, PBS/l% BSA-val blokkoltuk, majd hozzáadtunk 59 ng biotinilezett antí-receptor immobilizáló antitestet (Áfe 179). A rezervoárokat ezután az összegyűjtött, oldható TPO-R. 1/19 hígításaival kezeltük. A pepiidet vagy peptid-mimetikumoí különböző koncentrációkban elegyítettük a TPO csonka formájának konstans mennyiségével, amely a maltózhoz kötődő protein terminálisához fuzionált 1-156, maradékokat tartalmazza (MBP-TPOiss), A peptid/MBP-TPOrss elegyekel bemértük a TPO-R-rel bevont rezervoárokba, 2 órán keresztül 4 ^aC-on inkubáltuk, majd PBS-seí mostuk. Az MBP-TPO^ ekvílíbríumban kötődött mennyiségét MBP elleni nyál antiszérum, majd lógós foszfatázzal konjugált kecske antí-nyúl IgG hozzáadásával határoztuk meg. Ezután standard eljárásokkal meghatároztuk az egyes rezervoárokban a lúgos íoszfatáz mennyiségét.

A vizsgálatot széles peptidkoneentrácio-tarlományban elvégeztük, és az eredményeket grafikusan ábrázoltuk oly módon, hogy az v tengelyen tüntettük fel a kötött MBP-TPOjse mennyiségét, és az x tengelyen tűntettük fel a pepiid vagy pepíid-mímetíkum koncentrációját Ezután meghatároztuk azt a koncentrációt (ICsö), amelynél a peptid vagy peptid-mlmetikum 50%-kal csökkenti az inunobílizált TPÖ-R-hez kötött MBP—TPÖ-.js mennyiségét. A peptid disszociáeiós állandójának (Kd) hasonlónak kell lennie a mért ICjo értékhez a fent alkalmazott vizsgálati körülmények között.

- 54 >««< *ΧΦ* *♦*

4. példa ” Peptid-a-p lazmí dón ^M

A könyvtár megszerkesztésére a pJ.S142 vektort alkalmaztuk, és a 4. ábrás ábrázoljuk. A könyvtár megszerkesztéséhez bárom oligonukleotíd szekvencia szükséges; ON-829 (5’ ACC ACC TCC GG); ON-830 (5' TTA CTT AGT TA) és egy könyvtár specifikus kívánt oiigonukleotid [5’ GAG GTG GT(NNK)_a TAA C'TA .AGT AAA GC], ahol (NNK)_a a kívánt hosszúságú szekvencia random régióját jelenti. Áz oligonnkleofidokat kémiailag foszfort láthatjuk 5’-helyzetben a szintézis során, vagy polínukieotid-kínázzai történő tisztítás után. Az olígonukleotidokat ezután 1/1/1 móiarányban illesztjük, és a vektorhoz ligáljuk.

Az. affinitáson alapuló dúsításra (panning”) előnyösen alkalmazott E. coli törzs genotípusa; A(srt-recA) endAl nupC Ion-11 sulAl hsdRI? A(ompT-fepC)2ó6 ÁeIpA319;;kan Álací lac ZU118, amelyet a Yale Egyetemen hozzáférhető E. coli törzsből lehet előállítani (E. coli b/r, Genetie Sínek Center-beli jelölése CGSC:6573), amely Ion-11 sulAl genotípussal rendelkezik. A fenti E, coli törzset Dower és munkatársai eljárása szerint [Nucleic Ácíds Rés, ló, 6127 (1988)] preparáljuk elekíroporálásban történő alkalmazásra, azzal az eltéréssel, hogy minden mosási lépésben 10% glicerint alkalmazunk. A sejteket hatékonyságuk szempontjából 1 pg Bíuescrípt piazmid (Stratagene) alkalmazásával vizsgáljuk. Ezeket a sejteket alkalmazzuk az eredeti könyvtár előállítására, és a panning” minden egyes ciklusa után a feldúsult populáció megsokszorozására,

A peptideket a plazmidokon a panning”-re alkalmazott sejtekből a sejtfal lizozimmel történő enyhe enzimatíkns emésztésével szabadítjuk fel. A sejttörmelék tömörítése után a nyers lizáímuot közvetlenül alkalmazhatjuk a legtöbb receptoron.· Ha a piazmid komplexek további tisztítása szükséges, gélszüréses oszlopot alkalmazhatunk a kis mőlíömegű szennyeződések fő tömegének eltávolítására a nyers lízátumbóL

A panning^!,~ei a legtöbb fiziológiás puffernél kisebb sókoncentráciőjú pufferben (HEKL) hajthatjuk végre. A '*panning-ei mikrotítráíó rezervoárokbas hajthatjuk végre egy nem-blokkoló monoklónál is antitesten (MÁb) ímmo- 55 * ♦ X ** ·*** «·»

Φ ♦ ♦ X ♦ *

Λ- « »-«-« * * ¢, « * * > f«x Μ** «-♦* χ* hihzált receptorral v-agy gyöngyökön vagy oszlopokban végezhetjük. Közelebbről, a “panning'’ első ciklusában 24 rezervoárt alkalmazhatunk, amelyek mindegyike receptorral van bevonva. A második ciklushoz 6 rezervoárt receptorral vonunk be (FAN minta) és 6 rezervoárt receptor nélkül (NC minta) alkalmazunk. A plazmidok számának összehasonlítása ebben a két mintában mutatja azt, hogy a receptorra specifikus kiónok .feldúsultak-e a panning során. A feldúsulást, mint a PAN íranszíormánsok NC mintából nyert transzformánsokhoz viszonyított arányát definiáljuk. Egy 10-szeres dúsulás rendszerint azt jelzi, hogy jelen vannak receptor specifikus kiónok.

A panning további ciklusaiban ajánlatos csökkenteni a hzátum bevitelét a rezervoárokba, hogy a plazmíd komplexek nemspecifikus, háttér kötődését csökkentsük. A 2. ciklusban rezervoáronként rendszerint 100 μΐ íizátumot alkalmazunk. A 3. ciklusban rezervoáronként HEKL/BSA-val 1/10 arányban hígított 100 μΐ lizáiumokat alkalmazunk. A panning” további ciklusaiban rendszerint a becsült maradék diverzitás feletti legalább lööö-szeres plazmid transzformáló egység bevitelt alkalmazunk,

Az egyes kiónok által kódolt peptidek kötődési tulajdonságait rendszerint a panning” 3., 4. vagy 5. ciklusa után vizsgáljuk, a megfigyelt dúsulási számoktól függően. Rendszerint a Lacl-peptid fúziós proteinek általi receptor .specifikus kötődést detektáló ELíSÁ-t alkalmazunk. A Laci normálisan egy tetramer, és a legkisebb funkcionális DNS-kötő fajta egy dimer. így a p-eptidek multívalensnek mutatkoznak a fúziós proteinen. Ha a receptort megfelelő sűrűségben tudjuk rmmobíiizální a rezervoárokban, a Lacl-hez fuzionált peptidek a felülethez kooperatív, nmíflvalens módon kötődnek. Ez a kooperatív kötődés lehetővé teszi az alacsony intrinsic affinitássá kötődési események kimutatását. A fenti vizsgálat érzékenysége annyiban előnyös, hogy könnyén kimutathatók az alacsony affinítású kezdeti találatok, de annyiban hátrányos, hogy az ELISÁ-ban a jel nincs korrelációban a peptidek intrinsic affinitásával. A peptidek mahőz-kotö proteinnel (MBP) történő fúziója - amelyet alább ismertetünk - olyan ELISA formában történő tesztelést tesz lehetővé, ahol a jel erőssége jobb korrelációban van az affinitással (lásd 5A-5B ábra).

- 56 »6

ΧΧΦ«

Az érdekes klánokból a DNS kettős-szálú formában preparálható, standard niínipreparatív eljárás alkalmazásával. Az érdekes egyes klórnak vagy klónpopulációk kódoló szekvenciáit vektorokba vihetjük át, amelyek ezeket a szekvenciákat az MBP-t kódoló génnel keretben fúziónál) ák (az MBP egy olyan protein, amely általában monomerként fordul elő oldatban), A könyvtár pJSI42~be történő klónozása egy BspEl restrikciós helyet alakit ki a könyvtár random kódoló régiója kezdetének közelében, BspEI-gyel és Scal-gyel történő emésztés lehetővé teszi egy körülbelül 9ÖÖ bp hosszúságú DNS fragmens tisztítását, amelyet két vektor, a pELM3 (citoplazmatíkus) vagy pELMIS (periplazmatikus) egyikébe szubklónozhatunk, ezek a pMALe2, illetve pMALp2 vektorok egyszerű módosításai, amelyek a New England Bíolabs.-től szerezhetők be (lásd 5A-B ábra). A pELMŐ és pBLMlS emésztése Ageí-gyel és Scal-gyel lehetővé teszi a p.IS142 könyvtárból származó BspEI-Scal fragmens hatékony klónozását. A BspEl és Ágéi végek kompatibilisek a Hgálásra, Ezenkívül az Seal helyek korrekt Hgálása esszenciális egy funkcionális bla (Amp rezisztencia) gén kialakításához, ami a nem kívánatos ligációs eseményekből származó háttér kiónok szintjét csökkenti. Ezután IPTG-vel indukálható a tae promóter által hajtott MBP-peptíd fúziók expresszálása.

Az egyes kiónokból as Laci vagy MBP ELISA-hez a lizátumokat úgy állítjuk elő, hogy a sejteket lizozim alkalmazásával· íizáljuk, és az oldhatatlan sej (törmeléket centrifugálással eltávolítjuk. A lizátumokat ezután az immobilizált receptort tartalmazó rezervoárokhoz, és a receptor nélküli kontroll rezervoárokhoz adjuk. A Laci- vagy MBP-peptíd fúziók általi kötődést Laci vagy MBP elleni nyúl poliklonális antíszérummal történő ínkubálássaí, majd kecske anti-nyúl másodlagos antitesttel jelzett lúgos foszfatázzal történő inkubálássaí detektáljuk. A kötött lúgos íoszíaiázt p-nitrofenil-foszfát króm agán szubszíráttal mutatjuk ki.

, példa

Fejrész átmér” (beadpieee dimer) rendszer

Az Laci peptid-a-plazmidon módszer egyik változatában DNS-kötő proteint, un, fejrész dimer-t alkalmazunk, A DNS E- colt lac represszor általi kötőX * ♦ X X ** *

X «* * X * X ♦ χ *

V 9 *

XX *Φ*>

dósét a körülbelül 60 amlnosavból álló fejrész dómén mediálja. A lac operátorhoz kötődő fejrész dotnének dímerje rendszerint a sokkal nagyobb, körülbelül 300 aminosavbóí álló C-terudnálís dómén asszociációjával alakul ki. A fejrész dimer” rendszerben fejrész dímer molekulákat használnak, amelyek egy rövid peptíd linkénél összekapcsolt két fejrészt tartalmaznak. Ezek. a proteinek a DNS-t megfelelő stabilitással kötik meg, ezáltal lehetővé teszik a fejrész dimer C-termínálisán lévő peptíd epitóp asszociációját a fenti

A random peptidekeí a fejrész dímer C-terminálisával fuzionáljuk, amely dimer az azt kódoló plazmádhoz kötődik, ezáltal egy pepíid-fejrész dímerplazmid komplex keletkezik, amely ^?'panning-gel szűrhető. A fejrész dimer peptid-a-plazmídon rendszer nagyobb szelektivitást tesz lehetővé nagy affiniiású li-gandmnokra, mint a lael rendszer. Így a fejrész, dimer rendszer a kezdeti kis affinitásé találatokon alapján mntagenezis könyvtárak előállítására, és a kezdeti szekvenciákból a nagyobb affinitásé variánsok szelektálására használható.

A könyvtárakat úgy szerkesztjük meg, mint a pepiid-a-plaz,midőn rendszer esetén, pCMB14 fejrész dimer vektor alkalmazásával (lásd 6A-C ábra). A lac operátor jelenléte nem szükséges a plazmid kötődéséhez a fejrész dímer proteinnel A könyvtárakat E. coli [lon-11 sulÁl hsdRl7 (ompí-fepC) ÁclpÁ319::kan Álad lac ZU11S Á(srl-recA) 306;;TnlOJ baktériumtörzsbe vezetjük be, és bazális (A) promoter indukció körülmények között megsokszorozzak. A fejrész dímer könyvtárak ^Mpanning”-j-ét hasonló módon végezzük, mint a lael könyvtárakét, azzal eltéréssel hogy OEK puffért alkalmazunk HEKL puffer helyett, és a plazmídok eiuálását a rezervoárokból vizes fenollal végezzük IPTG helyett. A fejrész dimer panning-’-ből származó szekvenciákat gyakran MSP vektorba történő átvitel után elemezzük, ezáltal ezeket affinitás-érzékeny MSP ELÍSA-val lehet vizsgálni, vagy a kión-populáeiókat kolónia kiemeléssel lehet szúrni, jelzett receptorral

6. példa

Ebben a példában ciklízált vegyüieteket vizsgálunk háromféle vizsgálatban. Először az I.C50 értékeket határozzuk meg a fentiek szerint. Ezután MTT sejtfifiX» fi fi fi x Se fi* ♦ fi xfififi fifi* fi*

58♦fi* fi fi proliferáeiős vizsgálatot végzünk a fent. leírtak szerint, és kiszámítjuk és az E€s® értékeket. Végük mikroírzÍGméteres vizsgálatot (Moleeular Devices Corp.) végzünk. Ebben a vizsgálatban alapvetően az extracelluláns közeg savanyodásának sebességét határozzuk meg a találmány szerinti vegyületek által kifejtett TPO-receptor stiraulálásra adott válaszként. Az ECbo tartományokat is az ICj-e értékre fent megadott módon jelöljük. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.

φ ♦ * ·

-59* « * X * φ φφ

Szerkezei

4. táblázat

ECas {sKKölá} HCjs (sjssoVh lC$s (’VRcVl'i pmtsfeáeió míkröfeássite (Η1 ~ (Faas onuwSF (Cys > - |W ₂]

-,_S í

í

S<

W· ^4(oc~r®l -MXtRTLtwxsr tcy» > - o c%2 ..................................--S •W· f»4·

W ~ (HosKOcys? WOmrtZWSF (Cys) ~ (®β| l O«c-ííl -MCTWUStXSF- < cys 1

•ÍSBl 4- -b

-ÓÖ♦♦ Φ

4. táblázat folytatás® >f>n6tKtintcem

S$«rk«eí

EG» (síssöVü EG» <88x44 íCj® preisísrac® msteöfútoa&sr (aiKot'y —T . .

t&5-(aern^sjAöSTOMaXCTmessöcyjsJ - {W 2?

• s s

g...„..................„...................3 íeas~ro -wnffiKs? messw«y« t»wn

0¾.

4- 4· 44

J0«C-SIgl-MXSTO8OXS?f?^t-{SS2^ _{f t}.

CS₅......................s (G*C-t®l«AS<SmS^SrCCy2íOÍ®2l _w * P&-CH----—-1 (HPKWimJWISFB-CWsJ 4- 4 ®<~0 ~όί » φ X ♦♦ β*φφ *»

X ♦ ♦

Φ*Χ * * φ β «

ΦΦΦ »*

ΦΦ

Φ * * *

ΦΦΦ»

4, táblázat folytatása

SxerkesM (isresáp

CÖ*C~mn “&WPTXS£WXSFÍCys J - Pffi pl

-$ ♦ f· ,«0

LOffiS»—«aj —<Cys 1 · * * ·*·—

β^ΧΜΦ

Ebben a példában a

CAOSFTLítBWISFC képletű eiklizált vegyűlet D-, fi-» 1-, S- vagv F-helyzetben aminosav-bdyetteslíésí tartalmazó származékait vizsgáltuk a fent ismertetett módon, és meghatároztuk az EC_5Ö és ICsö értékeket. A mikro.fizíoméíeres eredményeket zárójelben adjuk meg, Áz eredményeket az 5. táblázatban foglaljuk össze.

9*« **

X » * 9

9

9*«9

9 9 * *

:9 * β·* **

9«* *' »

♦ **

5, táblázat ^ΜΟΟΜΘΟΟΟΜΟΟΜβ

S

- 63 « * * '« φ *

X * »8«φ ♦ »»ΦΦ «

*

Φφφ

ΦΦ ♦ * az 5,. táblázat folytatása

ΜΟΜββΟΜΜΜΦ

64♦ «X φ Χ<Φ φ * ♦ φ » φ * φ

X »*

X · » φ ♦ φ « φ * * * φφ az 5. táblázat folytatása

Ebben apáidéban a (o » c - wri - a ο α ? τ l a s » ς s ? {«sí képletü eíklizált vegyület D-, S- vagy F-helyzetben aminosav- -helyettesítést tartalmazó származékait vizsgáltuk a fent ismertetett módon, és meghatároztuk az ECso és ÍC59 értékeket. A mikrofiziométeres eredményeket zárójelben adjuk meg. Az eredményeket a 6. táblázatban foglaljuk össze.

- 65 * * * * » * « *

Φ Φ «>«Χ *

*** »

Λ«* «« « Φ * « « * ** <* * * * ·* ♦ * «»

6. táblázat ί<Μ>ΝΒ| ~iWGFTLHEWXSF (Cys |

Ebben a példában az EC_5Ö és IC_5Ö értékeket a fentiek szerint határoztuk meg a ?, táblázatban felsorolt dimer vegyületekre. Összehasonlításként közöljük

CASSFTtRíMXSFC

L....................

képletü ciklizált monomerrel kapott eredményeket is,

A 8. táblázatban ismertetett vegyültek inaktívak voltak a vizsgált legnagyobb, pntol/l koncentrációban.

A 9. táblázatban az fcr 9».

Φ Φ *

9 *

Φβ

Μ Α »

«φφχ ϊ Ε G Ρ Τ L R Q W L A A R Α képletü. pepiid eiklizált és dimerizált változataira a fentiek szerint meghatározott ECse és ICsa értékeket hasonlítjuk össze.

10, táblázatban a

CM? - XSOPTS.Ra«X,AARA <M) ~í£«FTI,RQWl,AÁRA ($aXas? X ~ <M«j>

képletü dimer csonka változatait hasonlítjuk össze. Az ECso és IC$a értékeket a fent ismertetett módon határoztak meg, A mikroflziométeres eredményeket zárójelben közöljük.

« κ » fifi fi :« * « fifi fifi * fi «fifi fi fi « » ♦ « «fifi fi

7. táblázat

BCsa (amot/1) [C?_g (nmol/1 Mskrefíx, ProHf,

-ASGPTiasnSFC- (1¾ 1 »1 íHi-a

Ι^βΟΟβί^ΒΒ wáfi (Hl (¾] cm SWWOAms-i (Ml <WSSX” (HM21

- 68 a 7, táblázat folytatása

X* X Φ ♦♦♦* «X x« » « ♦ « ♦ * « Φ « X «<« X # X ♦ * * X ♦ ♦

XX* »»»» «»* χχ **«« £Cs3 (omol/1) fCsa (ntaol/l Mikro fiz. Proli fi

- 69 8, táblázat ím<mSRá8X~f8R₂1 ^ΟΟββββΜββΜΜββΗΜΜΜΜΟΦ (Ηΐ<δί33Μ««ίί®2ΐ

9eemi<iiMHiwUÍuaÍ8QuL'9B9»«o tm <wx»í> (¾ i fc...... w

CS3 AWffiSFC-1®21

ÁMVBBBMMoeoeeM9MaMi«e«Mt fai -axOTOT- (¾!

^ΜΟΟΜΟΟΜΝββΝΜΜΟΜΜΜΟΜβΟΜ»» (sí ’CTEtFast&aBH cw^i

So«o«SB5»eeeeew«eeeeeeeeM«w» (SÍ <WM“ »21 (Sí ~ (®2 1 mi -OűffiMK- (m₂1 (Sí OSWKX300C^•MOOOOOMees0BMoeMMeOMOOM«tnaBBBw£ (Hl»3Mt1 sgHOLTC«MM4«9Mmanw4 (Wji ^,--,1,,,,,,,,,,.,.,-,111,,-,-,..........-.? ^£ tm «m«xwsx« (^21 [sí mmÍ (Sl tmg!

- 70 ΦΦΦΧ φΧΦΦ ΦΦΦ

9. táblázat

EC<® (aaiöI/S) IC (amoíZl MikroOz, Prolii.

íh]

ÍO, 44 44 esi »cxorntgw>C” cm i

.....mi............. un in.n i nlai.-..........¹¹

8LÖ. 44 44 (Ml «Χ®«β& \ f KI

44 44 (Ki »1 (Ki -CWWÖM- (KK₂1

44 44“ ♦ χ X* *»*« ** ·· * * * ♦ * * * * * ! 1 ~ 9 * *** * * ♦ « 9 9 * * * ♦ 9X9 »«** *** ·* **»*

10, táblázat

Í8Í 4&KW»«

I i ss8 &» <wy

	Szekvencia	ECss (meál) Sej!-grolsfe- ráció	IC se (amöt/l)
	M-Sramm í Utói	>h*b	WO
* s	®-®wum 1	*T*T^	MG
I ISMWWSM í 1 sa-ramam-MíW		WO
	Ute} -BSmSSa&MSA 1 Utó í ~3OT3OiMMM^~&ÍS8y	WG	MG I
	®'»SSfl8Uttfc i ío «BsamwotóA-^xca^í	**	MG '
		•f4* (ÁO	MG
	oehonm 1 í&e? -WOW-M < W	4*4·	WG
	í i^smwm’MíW	: <w	WG

φ « ν X * * «««» «ΦΦ ** ****

Ebben a példában a (H1-CADGFTLREWíSFC«[NR₃] l_I képletü eiklízált vegyület G-_s P- és W-helyzetébe vezettünk be amisosavszubsztitúeíékat. A 11, táblázatban közöljük azokat a szubsztitnáit vegyűleíeket, amelyek TPÖ-agonista aktivitást mutatnak.

11, táblázat

« -€A 0 $ V T t S% S W Ϊ s F € -
ó	F	W
Ssr
Sv?	wjstoem
w	Rv	Τφ
	Rv	Τφ
Sár	HyvtGRÜ
Gv&v	Pwí	Τφ
cpr-ótv	Rv	Τφ
Sa?	WrtÜSoi
et*	R«	Τφ
ÖSy	Rv
Sár	Rv	'Τφ
Cv?-W	l-tsc
w	tXífo	β-Τφ
Cpr-W	t>Tsc	Τφ
L ....................	HypiOSrst sssssHeg»»*^^	Τφ ί

Prolin faeivettesitések

Az E-prolin, és az azt helyettesítő amínosavak az (1) - (lö) képlet szerinti vegyületek.

Tnotof'án helyettesítések

Az L-tríptofán, és az azt helyettesítő amínosavak a (11) - (23) képlet szerinti

-73χ 0. 0.0 *x * 0 ♦

Χ000 00XX XX vegyületek.

Glicin helyettesítések

A glicin, és az azt helyettesítő amisosak a (24) - (29) képlet szerinti vegyületek,

11. példa

Annak eldöntésére, hogy az egér, mint célszerű kísérleti állat alkalmazható-e, számos in vitro kísérletet végeztünk, amelyben egér receptoron mértük a teszt-vegynletek aktivitását Először, 8-9-hetes Balb/C egér combcsontjából összegyűjtött velősejteket 7 napon keresztül inkubáltunk cseppfolyós tenyészetben rhuTPO-val vagy a vizsgált peptidek különféle koncentrációival. Az Inkuhálásí szakasz végén a tenyészeteket. Gytospin-nel koncentráltuk, acetil-kolin-észterázzal (AChE, egér megakarioeíták diagnosztíkuma) festettük, és mikroszkopikus analízissel számoltuk. I nmol/I rhuTPÖ igen nagyméretű (>4<) pm), nem-tapadó sejtek elszaporodását indukálja, amelyek AChE-vel festődnek. Ezek a sejtek érett megakarioeítáknak tűnnek. Egy 10^ö osszvelősejt/ml leoltáshól (50 ml tenyészetben) körülbelül 1-2 x lö⁶ megakaríocita fejlődik kí, A TPO-ra adott ezen választ jelöltük maximálisnak. A hozzáadott növekedési faktorokat nem tartalmazó kontroll tenyészetekben nagyon kevés AChE-pozitív sejt képződik, Á találmány szerinti peptidvegyületek közül többet is megvizsgáltunk nagy koncentrációban ezzel a vizsgálati módszerrel, az eredményeket a 12, táblázatban foglaljuk össze. A pepiid A 10 p.mol/l koncentrációban maximális választ fejtett, kí egér velősejtre. Ez az eredmény volt az első bizonyítéka annak, hogy ez a peptidcsalád hatásos egér receptoron. Egy másik kísérletben a velősejteket összegyűjtöttük, és félszilárd közegben (mstil-cellulóz) tenyésztettük, amelyhez vagy nem adtunk faktorokat, vagy 1 nmol/l rhuTPO-t vagy lö pmol/i pepiid A-t adtunk. 7 nap elteltével a tenyészetben lévő nagysejt-kolóniákat (amelyek valószínűleg megakarioeíták) megszámoltuk, és 3-5 sejtből álló kisebb kolóniákba, vagy 6 sejtnél nagyobb nagy kolóniákba csoportosítottuk. Az eredmények a 13. táblázatban láthatók. A TPO és a vizsgált peptidek lényegesen több kolóniát indukáltak mind a két méretben, mint a negatív kontroll tenyészetek, Ez. azt jelenti, hogy a peptidek a TPÖ-t utánozzák azon képességükben, hogy « »««« * « Φ X

Φ Φ Φ ♦ Κ Φ φ ♦ «ΦΦΧ ΦΧ«Φ *

stimulálják az Mk prekurzor sejt populáció expanzióját.

A vizsgált vegyületek egér és humán receptorokra kifejtett aktivitásának kvantitatívabb Összehasonlítása érdekében az muTPÖ receptort klónoztuk, és BaF3 sejtekbe transzfektáltak. A TPO dependens sejt-populációt izoláltuk.

Rekombináns barnán TPO-val összehasonlítva 25-30% AChE-íestodő sejt citospin után

Faktor nélküli tenyészetek - körülbelül 5% AChB-festődő sejt (alacsonyabb eeíiularítás).

13. táblázat

Ve gy ület	| 3-5 nagy sejt	6-12 nagy sejt {
Faktor nélkül	1		i 1
Faktor nélkül	2	ί 1	i l
1 nniol/1 TPÖ	#1-1	i 15	i 6 j
1 nmol/I TFO	#1-2	12	í 1 I
1 nmol/1 TPO	#2-1	| 16	| 8 l
1 nmol/I TPO	#2-2	| 13	“Ί 3 1
10 urnol/I pepiid	#1-1.	1 25	1 10 l
10 pmol/l pepiid	#1-2	1 22	j 8 í
10 umol/l pepiid	#2-1	i 22	i / t
10 omol/1 pepiid	#2-2	ί 21	í 10 i

- 75 ΦΦ φφφ» ♦ φφφ φ Χ > «

Φ X Φ * » φ Φ

Φ Φ «χ 4*»»

Claims (12)

1. Szabadalmi igénypontok

   L Vegyölet, amely trombopoietin-reeeptorhoz kötődik, amely vegyület (1) molekulatömege kisebb, mint 8000 dalion, és

   (.2) kötődési affinitása trombopoíetin-receptorhoz értékként kifejezve nem nagyobb, mint 100 pmol/l, ahol az említett vegyület egy

   X8GX5X2X3X4X5WXáltalános képletü amínosav-szekveneiát tartalmaz, ahol X₈ jelentése a. 20 genetikailag ködőit L-aminosav egyike; X₅ jelentése P; X₂ jelentése T; X3 jelentése L; X₄ jelentése R; X₅ jelentése £ vagy Q; X? jelentése 1 vagy L.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület egy

   X«X_sGX_sX₂X₃X4XsWX₇ általános képletü amínosav-szekveneiát tartalmaz, ahol X._s jelentése A, C, D, E, K, L, Q, R, 8, T vagy V; és X₉ jelentése A, C, E, G, 1, L, Μ, P, R, Q, S, T vagy V,
3. 3. A 2. igénypont szerinti vegyület, ahol Xg jelentése D, E vagy K; és X$. jelentése A vagy I.
4. 4. A 3. igénypont szerinti vegyület, amely

   GGCADGPTLREWISFCGG;

   GNADGPTLRQWLEGRRPKX;

   GGCADGPTLREW1SFCGGK;

   TIKGPTLRQWLKSREHTS;

   SÍEGRTLREWLTSRTPHS;

   LAIEGPTLRQWLHGXGRDT;

   CADGFTLREWISEC és

   IEGPTLRQWLAARá képiéin vegyületek csoportjából megválasztott.
5. 5. Vegyület, amely trombopoíetin-reeeptorhoz kötődik, amely vegyület (1) molekulatömege kisebb, mint 8000 dalion, és fifi fi» fifi fifi fi* fi fi fi fi » fi fi * * «fifi fi * fi fi fi * Sí « fifi fi fi 0r 9r «XX fifi fi**» (2) kötődési affinitása trombopoietin-receptorhoz l€$o értékként kifejezve nem nagyobb, mint 100 pmol/l, ahol az említett vegyület egy GGCTLRBWLHGGFCGG képletű aminosav-szekvenciát t ártál máz.

   ő. Vegyület, amely trombopoietin-receptorhoz kötődik, ahol a vegyület caosphssw&sfc !_i ' (mi xwsRutewsFc « i ......

   O * C-AWFtRSWíSfC

   R-y es l^HJ képletű vegyületek csoportjából megválasztott.
6. 7. Gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti vegyületet tartalmazza gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval kombinációban,
7. 8. Áz l-ő. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása emberben tromhopoierin-receptor aktiválására alkalmas gyógyszer előállításában.
8. 9. Áz l-ő. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása hematológiai rendellenesség kezelésére alkalmas gyógyszer előállításában.

   IÖ. A 9; igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rendellenesség egy vérlemezke rendellenesség vagy tromhoeitopéma.

   .-\Ü ν'-.·Ή Ο δ
9. 11. χΑ lö. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rendellenesség kemoterápiából, sugárterápiából vagy csontvelő transzfuzióból eredő trombocitopénia.
10. 12. Az 1-6. igénypontok bármelyike- szerinti vegyüiet, ahol a vegyüiet egy nem-protein jellegű polimerhez van kovalensen kapcsolva.
11. 13. A 12. igénypont szerinti vegyüiet, ahol a nem-protein jellegű polimer poli(etilén-glikoí), poii(propilén-glikol) és poli(oxi-alkén)-ek csoportjából megválasztott.
12. 14. Az 1. igénypont szerinti vegyüiet, ahol a vegyüiet