DE69032136T2

DE69032136T2 - Polypeptid mit der zelladhäsions-, zellausdehnungs- und zellbeweglichkeitsaktivität von typ-iv-kollagen

Info

Publication number: DE69032136T2
Application number: DE69032136T
Authority: DE
Inventors: Mary K. Minneapolis Mn 55406 Chelberg; James B. Minneapolis Mn 55406 Mccarthy; Photini-Effie C. Minneapolis Mn 55408 Tsilibary
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities
Priority date: 1989-12-14
Filing date: 1990-12-06
Publication date: 1998-12-03
Anticipated expiration: 2010-12-07
Also published as: DE69032136D1; US5082926A; CA2071512A1; EP0505488A4; WO1991008755A1; ATE163859T1; EP0505488B1; EP0505488A1

Description

Unterstützung der Regierung

Diese Erfindung wurde mit Regierungs-Unterstützung unter den Verträgen Nr. CA 43924 und 39216 der U.S. Institutes of Health gemacht. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.

Hintergrund der Erfindung

Typ-IV-Kollagen ist ein bestimmtes Glycoprotein, das fast ausschließlich in Basalmembranen vorkommt, Strukturen, die in der basalen Oberfläche zahlreicher Zelltypen gefunden werden, einschließlich vaskulären Endothelzellen, Epithelzellen usw. Typ-IV-Kollagen ist eine Hauptkomponente von Basalmembranen. Es unterscheidet sich von interstitiellen Kollagenen. Vergleiche New Trends in Basement Membrane Research, K. Kuehn et al., Herausgeber, Raven Press, NY, auf Seiten 57 bis 67 (1982). Typ-IV-Kollagen hat ein Molekulargewicht (Mw) von etwa 500000 und besteht aus drei Polypeptidketten: zwei αl (MW 185000)-Ketten und eine α2 (MW 170000)-Kette. Typ-IV-Kollagen weist zwei proteolytische Haupt-Domänen auf: eine große, globuläre, nicht-kollagene NC1-Domäne und eine weitere kollagene dreifach helikale Haupt-Domäne. Die letztere Domäne wird durch nicht-kollagene Sequenzen variabler Länge unterbrochen. Eine Diagramm-Darstellung des Typ- IV-Kollagen-Moleküls ist in Figur 1 gezeigt. Es ist ein komplexes Multi- Domänen-Protein mit verschiedenen biologischen Aktivitäten, die in verschiedenen Domänen angeordnet sind.
Typ-IV-Kollagen ordnet sich selbst zu polymeren Strukturen, die die Stützstruktur der Basalmembranen bilden. Verschiedene weitere makromolekulare Komponenten binden an Typ-IV-Kollagen, wie: Laminin, Entactin/Nidogen und Heparinsulfat-Proteoglykan. Eine zusätzliche Funktion von Typ-IV-Kollagen ist die Vermittlung der Zellbindung. Eine Vielzahl von Zelltypen binden und verteilen sich spezifisch auf Typ-IV-Kollagenüberzogenen Substraten Vergleiche J. C. Murray et at., J. Cell Biol., 80, 197-202 (1979); M. Aumailley et al., J. Cell Biol., 103, 1569-1576 (1986); T. J. Herbst et al., J. Cell Biol., 106, 1365-1373 (1988). Von verschiedenen Zelloberflächenproteinen, einem 47 kD-Protein [M. Kurkunen et al., J. Biol. Chem., 259, 5915-5922 (1984)], einem 70 kD-Protein [S. P. Sugrue, J. Biol. Chem., 262, 3338-3343 (1987)] und Mitgliedern der Superfamilie der Integrine [K. J. Tomaselli et al., J. Cell Biol., 105, 2347-2358 (1987)] wurde berichtet, daß sie die Zellbindung an Typ-IV- Kollagen vermitteln.
Die Vielzahl der Funktionen von Typ-IV-Kollagen legt nahe, daß dieses Glycoprotein in zahlreichen verschiedenen und klinisch relevanten Prozessen von Bedeutung ist wie Zelihaftung und Migration bei der Wundheilung, Tumorzelleninvasion und Metastase, diabetische Mikroangiopathie, vaskuläre Hypertrophie aufgrund von Hypertension und verschiedene Nierenerkrankungen wie diabetische Nephropathie und nephrotische Syndrome verschiedener Etiologie. Beispielsweise wird bei Goodpasture-Syndrom, einer Erkrankung, die charakterisiert wird durch Hämoptyse und Hämatune aufgrund Alveolitis und Nephritis jeweils ein Antikörper gegen die nicht-kollagene NC1-Haupt- Domäne vom Typ-IV-Kollagen im Serum aller Goodpasture-Patienten gefunden. Eine weitere vererbliche Nierenerkrankung, Alport's-Familien-Nephritis, ist offensichtlich zurückzuführen auf einen genetischen Defekt der NC1-Domäne von Typ-IV-Kollagen. Zusätzlich werden bei Diabetes mellitus intaktes Typ- IV-Kollagen genauso wie die Dreifachhelix-reiche Domäne durch die erhöhten Mengen an Glukose chemisch modifiziert und funktionell geschädigt, die im Plasma und in der unmittelbaren Nachbarschaft der Basalmembranen vorhanden ist, d.h. in der extrazellulären Matrix.
Um die Pathophysiologie dieser Prozesse auf molekularer Ebene besser zu verstehen, besteht die Notwendigkeit, mindestens einige der oben genannten biologischen Aktivitäten von Typ-IV-Kollagen den spezifischen proteolytischen Domänen (d.h. NC1, Dreifachhelix-reiche Domänen) oder Oligopeptiden von Typ-IV-Kollagen zuzuordnen. Falls dies erreicht werden kann, wird es mlglich sein, kleine Peptide herzustellen, die die Basis für wichtige pharmazeutische Zusammensetzungen bilden können.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Inhibierung von Metastase und Befall durch Tumorzellen;
wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen den Aminosäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der al-Kette von Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist: gly-val-lys-gly-asp-lys-glyasn-pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polypeptid an ein chemotherapeutisches Mittel gekoppelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Polypeptids für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Förderung der Nervenregeneration;
wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen den Aminosäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der aI-Kette von Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel hat: gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn- pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid bereit mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen den Aminosäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der al-Kette vom Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist: gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro; wobei das Polypeptid an ein chemotherapeutisches Mittel gekoppelt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine diagnostische Vorrichtung zum Nachweis von malignem Zellwachstum bereit, umfassend: ein Polypeptid, das auf ein Trägersubstrat immobilisiert ist; wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen den Aminosäurerest 1263 bis 1277 der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der al-Kette vom Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist: gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-ala- pro.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid bereit (im folgenden als "IV-H1") bezeichnet, welches ein Fragment der al-Kette von Human-Typ-IV- Kollagen darstellt, das aus der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne gewonnen wird. Dieses Polypeptid kann durch übliche Festphasen-Synthese hergestellt werden. Die Formel des Polypeptids ist:
gly-val- lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro.
Das Polypeptid IV-H1 stellt formal die isolierten Typ-IV-Kollagen-Reste 1263 bis 1277 der dreifach helikalen Hauptregion der al-Kette von Typ-IV- Kollagen dar. Der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code für dieses Polypeptid ist GVKGDKGNPGWPGAP.
Dieses synthetische Polypeptid wurde hinsichtlich der biologischen Aktivität in einem Assay untersucht, und es wurde gefunden, daß das Protein die Adhäsion und Ausbreitung vieler Zelltypen fördert und ein Anlockungsmittel für die Melanom-Zellen-Motilität ist. Zusätzlich ist das Peptid IV-H1 hochspezifisch hinsichtlich seiner Zellbindungseigenschaften. Beispielsweise fördert das Peptid die Bindung von Nervenzellen, jedoch nicht diejenige von Endothelzellen. Daher wird angenommen, daß Polypeptid IV-H1 einsetzbar ist für (a) die Förderung der zellulären Bindung an Kultursubstrate und (b) die Inhibierung der Metastase und des Befalls durch Tumorzellen. Da gezeigt wurde oder erwartet wird, daß bestimmte Zelltypen zellspezifische Bindungseigenschaften als Antwort auf das Peptid IV-H1 aufweisen, werden weitere Verwendungen dieses Peptids in Betracht gezogen, wie Unterstützung bei der Nervenregeneration und diagnostische Verwendung. Da erwartet wird, daß weitere Verdauung/Hydrolyse des Peptids IV-H1 in vitro oder in vivo einige Fragmente mit im wesentlichen equivalenter Bioaktivität ergeben wird, wird weiter angenommen, daß solche Peptide mit niedrigerem Molekulargewicht auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine Diagramm-Darstellung von Typ-IV-Kollagen, die die Struktur der α1(IV) und α2(IV)-Ketten angibt, jeweils mit einer nicht-kollagenen Haupt-NC1-Domäne und der Dreifachhelix-reichen Domäne, die Unterbrechungen des gly-X-Y-dreifachhelikalen Motivs enthält.
Figur 2 stellt die primäre Aminosäuresequenz der humanen und der murinen αI-Kette von Typ-IV-Kollagen im Vergleich dar.
Figur 3a ist ein Graph, der die prozentuale Melanom-Zell-Adhäsion pro Konzentration des Peptids IV-H1 (o), und der Kontrolipeptide 15 ( ), 17 ( ) und 18 ( ) zeigt, die auf Immulon I-Vertiefungen aufgezogen sind.
Figur 3b ist ein Graph, der die prozentuale Melanom-Zell-Ausbreitung pro Konzentration des Peptids IV-H1 (o), und der Kontrolipeptide 15 ( ), 17 ( ) und 18 ( ) zeigt, die auf Immulon I-Vertiefungen aufgezogen sind.
Figur 4a ist ein Graph, der die durchschnittliche Zellmotilität von Melanom-Zellen als Antwort auf Peptid IV-H1 (0) und BSA ( ) zeigt, die auf Polycarbonatfilter aufgezogen sind.
Figur 4b ist ein Graph, der die Anzahl von Melanom-Zellen zeigt, die durch einen in einer Boyden-Kammer angebrachten Polycarbonat-Filter gewandert waren, als Antwort darauf, daß die unteren Vertiefungen dieser Kammer mit Typ-IV-Kollagen gefüllt waren.
Figur 5a ist ein Graph, der die relative Inhibierung der Adhäsion von Melanom-Zellen an Immulon I-Vertiefungen zeigt, die mit Peptid IV-H1 (0), Typ-I-Kollagen ( ), und Typ-IV-Kollagen ( ) überzogen waren, pro Konzentration von überschüssigem löslichem Peptid IV-H1, und die mit Typ- IV-Kollagen überzogen waren pro Konzentration von überschüssigem löslichem Kontrollpeptid 17 ( ).
Figur 5b ist ein Graph, der die relative Inhibierung der Ausbreitung von Melanom-Zellen auf Immulon I-Vertiefungen zeigt, die mit Peptid IV-H1 (0), Typ-I-Kollagen ( ), und Typ-IV-Kollagen ( ) pro Konzentration von überschüssigem löslichem Peptid IV-H1, und mit Typ-IV-Kollagen überzogen waren pro Konzentration von überschüssigem löslichem Kontrollpeptid 17 ( ).
Figur 5c ist ein Graph, der die Inhibierung der Melanom-Zell-Motilität durch Polycarbonat-Filter zeigt, die mit Typ-IV ( ) und Typ-I ( )-Kollagen überzogen waren, als Antwort auf überschüssiges lösliches Peptid IV-H1, und die mit Typ-IV-Kollagen überzogen waren als Antwort auf überschüssiges lösliches Kontrollpeptid 17 (Δ).
Figur 6a ist ein Graph, der die relative Inhibierung der Adhäsion von Melanom-Zellen an Immulon I-Vertiefungen zeigt, die mit Peptid IV-H1 (0), Typ-I-Kollagen ( ) oder Typ-IV-Kollagen ( ) überzogen waren pro Konzentration von Anti-IV-H1 IgG und die mit Typ-IV-Kollagen überzogen waren pro Konzentration von normalem Kaninchen-IgG ( ).
Figur 6b ist ein Graph, der die relative Inhibierung der Ausbreitung von Melanom-Zellen auf Immulon I-Vertiefungen zeigt, die mit Peptid IV-HI (0), Typ-I-Kollagen ( ) oder Typ-IV-Kollagen ( ) überzogen waren pro Konzentration von Anti-IV-H1 IgG und die mit Typ-IV-Kollagen pro Konzentration von normalem Kaninchen-IgG ( ).
Figur 6c ist ein Graph, der die Inhibierung der Melanom-Zellen-Motilität auf Polycarbonat-Filtern zeigt, die mit Typ-I-Kollagen ( ) und Typ-IV- Kollagen ( ) überzogen waren als Antwort auf Anti-IV-H1 IgG und die mit Typ-IV-Kollagen überzogen waren als Antwort auf normales Kaninchen IgG ( ).
Figur 7 ist ein Graph, der dem Prozentsatz von Küken-Neuronen zeigt, die an Immulon I-Vertiefungen haften, welche mit verschiedenen Konzentrationen von Peptid IV-H1 überzogen sind, und den Prozentsatz der anhaftenden Neuronen mit ausgestreckten Neunte pro Konzentration von Peptid IV-H1.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Struktur der zwei al-Ketten und der einzelnen α2-Kette von Typ-IV- Kollagen war Gegenstand zahlreicher Studien. Vergleiche J. Oberbäumer et al., Eur. J. Biochem., 147, 217 bis 224 (1085); T. Pihlajanien et al., J. Biol. Chem., 260, 7681-7687 (1985); U. Schwarz-Magdolen et al., Febs. Lett., 208, 203-207 (1986); D. Brazel et al., Eur. J. Biochem., 172, 35-42 (1988); R. Soininemi et al., Febs. Lett., 225, 188-194 (1987); D. Brazel et al., Eur. J. Biochem., 168, 529-536 (1987); G. Muthukamaran et al., 3. Biol. Chem., 264, 6310-6317 (1989); J. Saus et al., J. Biol. Chem., 264, 6318-6324 (1989). Die Sequenz der al-Kette ist in Figur 2 dargestellt. Die Gesamtzahl der Aminosäuren pro Kollagen-Molekül ist etwa 4550, wobei jede α1(IV)-Kette etwa 1390 Aminosäuren enthält.
U.S.-Patent Nr. 4,876,332 beschreibt drei Peptide (als "TS-1, TS-2 und TS- 3" bezeichnet) aus der NC1-Domäne der al(IV)-Kette von Typ-IV-Kollagen, die die Adhäsion einer Anzahl von Zelltypen einschließlich Endothel-Aorta- Zellen und metastatischen Karzinom-Zellen fördern. Zwei dieser Peptide (TS- 2 und TS-3) binden auch an Heparin.
Das hier beschriebene Peptid IV-H1 wird aus dem mit Pepsin erzeugten dreifach helikalen Haupt-Fragment von Typ-IV-Kollagen erhalten. Peptid IV- H1 fördert die Zelladhäsion und Ausbreitung und ist ein wirkungsvolles Anlockungsmittel für M4-Melanom-Tumorzell-Motilität. Peptid IV-H1 bindet jedoch nicht an Heparin. Vergleiche G. F. Koliakos et al., J. Biol. Chem., 264, 2313-2323 (1989). Als wichtiger Punkt wurde gefunden, daß Peptid IV-H1 nur die Adhäsion bestimmter spezifischer Zelltypen wie Melanom- und Nervenzellen fördert, jedoch nicht diejenige von Endothelial- oder Fibrosarkom-Zellen.

Synthese des Polypeptids

Das Polypeptid gemäß der Erfindung wurde unter Verwendung der Merrifield- Festphasen-Methode hergestellt. Dies ist die Methode, die am häufigsten für die Peptidsynthese angewendet wird, und ist umfassend beschrieben von J. M. Stewart und J. D. Young in Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Herausgeber, Rockford, IL (zweite Auflage, 1984).
Das Merrifield-System der Peptidsynthese verwendet ein 1 % vernetzes Polystyrolharz, das mit Benzylchloridgruppen funktionalisiert ist. Die Halogene reagieren mit dem Salz einer geschützten Aminosäure unter Bildung eines Esters, wobei dieser kovalent an das Harz gebunden wird. Die Benzyloxycarbonyl (BOC)-Gruppe wird zum Schützen der freien Aminogruppe der Aminosäure verwendet. Diese Schutzgruppe wird mit 25 %iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) entfernt. Die neu exponierte Aminogruppe wird mit 10 % Triethylamin (TEA) in DCM in die freie Base umgewandelt. Die nächste BOC-geschützte Aminosäure wird dann an die freie Aminogruppe der vorherigen Aminosäure unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gekoppelt. Die funktionellen Seitenkettengruppen der Aminosäuren werden während der Synthese mit TFA- stabilen Benzylderivaten geschützt. Alle diese repetitiven Reaktionen können automatisiert werden, und die Peptide der vorliegenden Erfindung wurden in der mikrochemischen Anlage der University of Minnesota unter Verwendung eines Beckman System 990 Peptid-Synthesizers hergestellt.
Im Anschluß an die Synthese eines blockierten Polypeptids auf dem Harz wird das Polypeptid mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (HF) zur Spaltung der Benzylesterbindung mit dem Harz und damit zur Freisetzung des freien Polypeptids behandelt. Die Benzyl-Derivat-Seitenketten-Schutzgruppen werden ebenfalls durch die HF-Behandlung entfernt. Das Polypeptid wird dann aus dem Harz extrahiert unter Verwendung von 1,0 M Essigsäure, gefolgt von Lyophilisierung des Extrakts. Lyophilisierte rohe Polypeptide werden durch präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) durch Umkehrphasentechnik auf einer C-18-Säule gereinigt. Ein typischer Elutionsgradient wie im vorliegenden Fall verwendet, ist 0 % bis 60 % Acetonitril mit 0,1 % TFA in H&sub2;O. Die Absorption des Eluens wird bei 220 nm gemessen, und Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Die Charakterisierung des gereinigten Polypeptids erfolgt durch Aminosäureanalyse. Die Polypeptide werden zunächst anaerob während 24 Stunden bei 110ºC in 6 m HCl (konstantes Sieden) oder in 4 N Methansulfonsäure hydrolysiert, wenn Cystein oder Tryptophan anwesend sind. Die hydrolysierten Aminosäuren werden durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines Beckman System 6300-Aminosäure-Analysators getrennt unter Verwendung von von Beckman gelieferten Citrat-Puffern. Die quantitative Messung wird durch Absorption bei 440 und 570 nm und Vergleich mit Standard-Kurven durchgeführt. Die Polypeptide können darüber hinaus durch Sequenzbestimmung charakterisiert werden. Dieser Weg ist besonders für längere Polypeptide nützlich, wo Aminosäurezusammensetzungs-Daten inhärent weniger informativ sind. Die Sequenzbestimmung wird durch einen sequentiellen Edman-Abbau vom Amino-Terminus aus durchgeführt, automatisiert auf einem Modell 470A-Gasphasen-Sequenator (Applied Biosystems, Inc.), nach der Methodologie von R. M. Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990 (1981).
Das Peptid gemäß der Erfindung, IV-H1 (GVKGDKGNPGWPGAP), wurde aus der Sequenz der dreifach helikalen Hauptdomäne von Human-Typ-IV-Kollagen hergestellt. Als weitere Kontrolle wurden weitere von Typ-IV-Kollagen abgeleitete Peptide aus der dreifach helikalen Hauptdomäne hergestellt und untersucht (vergleiche Tabelle 1). Bestimmte Peptide wurden mit einem Tyrosylrest am Carboxy-Ende synthetisiert, um die radioaktive Iodierung des Peptids zu ermöglichen. Tabelle 1
* Unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Aminsäure-Cods: A = Alanin, D = Aspartat, E = Glutamat, G = Glycin, I = Isoleucin, K = Lysin, L = Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutamin, S = Serin, V = Valin. Jedes Peptid enthielt einen Tyrosin-Rest (Y) am Carboxy-terminalen Ende, so daß die Peptide iodiert werden konnten.
** Die Rest-Nummern wurden zugeordnet, indem mit dem Amino-terminalen Ende begonnen wurde, basierend auf der Sequenz, die in Muthukumaran, Blumberg und Kurkinen, J. Biol. Chem., 264, 6310-6317 (1989) angegeben ist.

Zellkulturen

Hochmetstatische murine Melanom-Zellen, K-1735-M4 wurden ursprünglich von Dr. I. J. Fidler vom Anderson Hospital, University of Texas Health Sciences Center, Houston, Texas zur Verfügung gestellt. Als die Zellen erhalten wurden, wurde eine große Anzahl früher Passagezellen (early passage cells) vermehrt und im flüssigen Stickstoff eingefroren. Die Tumorzellen werden üblicherweise in vitro für nicht mehr als sechs Wochen kultiviert, und die Anzahl an in vitro-Passagen ist auf acht beschränkt. Die Zellen werden dann verworfen und neue Zellen aus dem Lager für die Verwendung bei in vitround in vivo-Experimenten entnommen. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden ergriffen, um Phänotypische Abweichungen zu minimieren, die ajs Ergebnis von kontinuierlicher in vitro-Passagen auftreten können. Die Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle's Medium (DME) kultiviert, das 10 % Hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum enthielt. Die Kulturen wurden in 37ºC- Inkubatoren in feuchter Atmosphäre gezüchtet, die 5 % CO&sub2; enthielt. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich durch vorsichtige Entnahme von Zellen aus dem Kolben unter Verwendung von 0,05 % Trypsin und 1 mM EDTA subkultiviert, wie beschrieben von Mccarthy et al., Biochemistry, 27, 1380-1388 (1988).
Zur Charakterisierung des Peptids IV-H1 wurde die Wechselwirkung des Peptids mit anderen Zellinien untersucht. Diese Zellinien schließen die hochmetastatische humane Melanom-Zell-Linie A375 M ein (ebenfalls von Dr. Fidler zur Verfügung gestellt), die in MEM mit hinzugegebenen Vitaminen und 10 % FBS gelagert wurde; und die Fibrosarkom-Zell-Linie UV2237 MM, die in DME mit 10 % FBS gelagert wurde. Weitere untersuchte Zellinien schließen ein: die C6 Ratten-Gliom-Zellinie (ATCC, #CCLIO7), die in DME plus 10 % CS gelagert wurde; die SCC9 Human-Schuppen-Karzinom-Zell-Linie (squameous carcinoma) (ATCC, #CRL1629), die in einer 1 : 1-Lösung von DME und HAM F12, enthaltend 10 % FBS gelagert wurde; die murinen B65 und B104 Neuroblastom- Zell-Linien, die von Dr. David Schubert vom Salk Institute (Schuber et al., Nature, 249, 224-227 (1974)) erhalten wurden und in F12H-Medien mit Zusätzen gelagert wurden; und Rinder-Aorten-Endothelzellen, die isoliert und gelagert wurden wie von Herbst et al., J. Cell Biol, 106, 1365-1373 (1988) beschrieben.

Proteinreinigung und Herstellung von proteolytischen Fragmenten von Typ-IV- Kollagen

Typ-IV-Kollagen wurde aus den Englebreth-Holm-Swarm-Sarkomen aus lathyritischen Mäusen extrahiert, entsprechend einer Modifikation der Methode von Kleinman et al., Biochemistry, 21, 6188-6193 (1982), wie beschrieben in Herbst et al., J. Cell Biol., supra. Typ-IV-Kollagen, gereinigt durch DEAE-Anionenaustausch-Chromatographie, wurde Ultrazentrifugation bei 110000 x g während 90 Minuten unterzogen, um Aggregate von mehr als 505 abzutrennen. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und bis zur Verwendung in 2M Guanidin, enthaltend 2 mM Dithiothreitol, bei 4 C gelagert. Die Konzentration von Typ-IV wurde spektrophotometrisch bestimmt wie von Waddell, J. Lab. Clin. Med., 48, 311-314 (1956) beschrieben. Typ-I-Kollagen (Vitrogen) wurde von Collagen Corporation, Pab Alto, CA bezogen.

Iodierung von Peptiden und Bestimmung der Bindungseffizienz auf Immulon 1- Platten

Die Markierung von Peptiden mit Na¹²&sup5;I wurde durchgeführt, wie von McCanahey und Dixon, Methods Enzymol., 70, 210-213 (1980) beschrieben. Kurz gesagt wurden 0,1 mg jedes Peptids in NaHPO&sub4;-Puffer (pH 7,2) während 2 Minuten mit 0,05 mg Chloramin T und 0,5 mCi Na¹²&sup5;I (NEN Division Du Pont Co., Boston, MA) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,2 mg Na&sub2;S&sub2;O&sub5; beendet. Freies Iod wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung von Sep-pak C-18-Säulen (Waters Division of Millipore, Bedford, MA) entfernt, aus denen radioaktiv markierte Peptide mit Acetonitril (50 %), enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert wurden. Die markierten Peptide wurden lyophilisiert und bis zur Verwendung bei -80ºC gelagert. Die Effizienz der Peptidbindung an die Vertiefungen von 96-Vertiefungs- Polystyrol-Immulon I-Platten (Dynatech Laboratoies, Inc., Chantilly, VA) wurde bestimmt durch Eintrocknen von 100 ul-Aliquots der radioaktiv iodierten Peptide, die in Voller's Carbonat-Puffer auf Konzentrationen von 1 bis 10 ug/ul verdünnt worden waren. Um die Bindungsbedingungen der Peptide bei Adhäsions- und Ausbreitungs-Assays zu simulieren, wurden die Vertiefungen dann gewaschen und während zwei Stunden mit 150 ul/Vertiefung einer 10 mg/ml-Lösung von BSA in Voller's Carbonat-Puffer inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann gewaschen und die Menge der an die Oberflächen gebundenen Peptide quantitativ bestimmt, indem die Peptide mit 150 ul/Vertiefung 0,5 N NaOH, enthaltend 1 % SDS gelöst wurden. Die gebundene Radioaktivität wurde in einem Tm analytischen gamma-Zähler Modell 1193 quantifiziert.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die folgenden detaillierten Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Melanom-Zell-Adhäsion und Ausbreitung auf Peptid-IV-H1

Eine Anzahl von aus der dreifach helikalen Haupt-Region von humanem Typ-IV- Kollagen gewonnen Peptid wurden synthetisiert wie oben beschrieben. Diese Peptide einschließlich Peptid IV-H1 wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Förderung der Adhäsion und Ausbreitung von K 1735 M4-Melanom-Zellen wie folgt gescreent:
subkonfluente Kulturen von M4-Melanom-Zellen wurden über Nacht mit 3 uCi/ml ³H-Thymidin radioaktiv markiert. Vor dem Adhäsions-Assay wurden die Zellen mit 10 mM EDTA in Hank's Medien oder alternativ in einer Trypsin-Lösung (0,05 % Trypsin mit 0,02 % EDTA) aus den Kulturkolben entnommen, um zu bestätigen, daß die Zelladhäsion keine endogenen Zelloberflächenproteine erforderte, die nach der EDTA-Behandlung zurückbleiben würden. Die Melanomzellen wurden dann gewaschen und auf eine Endkonzentration von 3 bis 4 x 10&sup4; Zellen/ml in DME, versetzt mit 20 mM Hepes und 10 mg/ml BSA resuspendiert. Die Zellen blieben nach diesem Verfahren lebensfähig (> 95 %), basierend auf Ausschluß von Trypan-Blau-Farbstoff.
Immulon 1-Mikrotiter-Platten wurden hergestellt, indem 100 ≤l/Vertiefung IV-H1-Peptid eingetrocknet wurde, das auf verschiedene Konzentrationen (1 - 500 ug/ml) in Voller's Carbonat-Puffer verdünnt worden war. Die Fähigkeit des IV-H1-Peptids zur Bindung an die Platten wurde unter Verwendung von radioaktiv iodierten Peptiden (zuvor beschrieben) bestimmt, um sicher zu sein, daß Unterschiede bei der Zelladhäsion (oder Ausbreitung) nicht auf verschiedene Bindungen an die Oberfläche zurückzuführen waren. Nicht spezifische Zelladhäsion an Stellen auf dem Kunststoff wurde blockiert durch Verwendung einer 10 mg/ml-Lösung von BSA in Voller's Carbonat-Puffer bei 37ºC während einer Stunde. Die Voller's/BSA-Lösung wurde dann aspiriert, und 5 - 6 x 10³ M4-Melanom-Zellen wurden in jede Vertiefung in 150 ul Adhäsions-Medien (DME, enthaltend 20 mM Hepes und 10 mg/ml BSA) gegeben. Die Zellen wurden während 30 bis 40 Minuten bei 37ºC (oder bis zu 90 Minuten bei bestimmten Assays) inkubiert, wobei zu dieser Zeit die Zellen entweder hinsichtlich der Ausbreitung beobachtet oder zur Bestimmung der Adhäsion entnommen wurde. Die Adhäsion wurde nach dem Waschen zur Entfernung nicht anhaftender und schwach anhaftender Zellen quantitativ bestimmt, indem die Zellen mit 150 ul/Vertiefung 0,5 N NaOH, enthaltend 1 % SDS solubilisiert wurden. Die gebundene Radioaktivität wurde in einem Beckman LS 3801 Flüssigkeits-Scintillations-Zähler quantifiziert. Die Ausbreitungsbestimmungen wurden von zwei verschiedenen Individuen in Doppelblindstudien durchgeführt, indem mindestens 100 Zellen/Vertiefung beobachtet wurden und der Prozentsatz der ausgebreiteten Zellen berechnet wurde. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt, und innerhalb eines gegebenen Experiments wurde jeder experimentelle Punkt dreifach bestimmt.
Die von IV-H1-Peptid geförderte Melanom-Zell-Adhäsion tritt in einer konzentrationsabhängigen Weise in einem Oberzugsbereich von 1 bis 500 ug/ml auf (Figur 3a). Signifikante Zell-Adhäsion (35 % der eingeführten Zellen) trat bei einer Überzugskonzentration von 10 ug/ml Peptid IV-H1 auf, und eine maximale Zell-Adhäsion 0 50 % zugegebener Zellen) wurde in Vertiefung beobachtet, die mit einer 100 ug/ml-Lösung des Peptids IV-H1 überzogen waren. Auch die Ausbreitung der Melanom-Zellen trat auf mit Peptid IV-H1 überzogenen Oberflächen in einer konzentrationsabhängigen Weise ein. Die maximale Ausbreitung (etwa 70 % der eingeführten Zellen) wurde innerhalb von 40 Minuten bei 100 ug/ml Überzugs-Konzentration von Peptid IV-H1 beobachtet (Figur 3b).

Beispiel 2

Vergleichende Adhäsion und Ausbreitung verschiedener Zelltypen auf Peptid IV-H1

Um sicherzustellen, daß die Peptid IV-H1 vermittelte Zell-Adhäsion- und Ausbreitung nicht einzigartig für K1735 M4-Melanom-Zellen war, wurden verschiedene andere Zelltypen hinsichtlich der Adhäsion und Ausbreitung auf mit dem Peptid überzogenen Oberflächen gescreent. Zellen aus verschiedenen Embryonen und aus verschiedenen Spezies wurden hinsichtlich der Fähigkeit zur Adhäsion und Ausbreitung auf mit Peptid IV-H1 überzogenen Oberflächen untersucht. Die Zelltypen umfaßten drei Hauptgruppen (vergleiche Tabelle 2): zunächst Zellen, die sowohl auf Peptid IV-H1 als auch auf Typ-IV- Kollagen haften und sich ausbreiten, die, zusätzlich zur murinen hochmetastatischen K1735 M4-Melanom-Zellen ein hochmetastatisches humanes Melanom (A375 M), ein Rattengliom (C6) und ein Ratten-Neuroblastom (B104) einschließen; zweitens Zellen, die auf Typ-IV-Kollagen, jedoch nicht auf Peptid IV-H1 haften und sich ausbreiten, einschließlich Rinder-Aorta- Endothel-Zellen und humanen Schuppen-Karzinom-Zell-Linie (SCC9); und drittens Zellen, die weder an Typ-IV-Kollagen noch an Peptid IV-H1 haften, einschließlich dem murinen UV2237 MM Fibrosarkom und dem Ratten-B65- Neuroblastom. In allen Fällen war die Zell-Adhäsion- und Ausbreitung auf mit BSA oder Kontrollpeptiden überzogenen Oberflächen < 5 %. Tabelle 2
* Die Oberflächen wurden mit 100 ul/Vertiefung Peptid IV-H1 oder intaktem Typ-IV-Kollagen mit 100 ug/ml in Voller's Carbonat-Puffer überzogen.
@ Prozent zugegebener Zellen, die hafteten oder sich ausbreiteten wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwert von drei Experimenten, wobei jedes Experiment dreimal durchgeführt wurde.

Beispiel 3

Melanom-Zell-Motilität auf Peptid IV-H1

Im Licht der Beteiligung der Zell-Adhäsion- und Ausbreitung bei der Motilität wurde Peptid IV-H1 hinsichtlich seiner Fähigkeit zur direkten Förderung der Melanom-Zell-Motilität untersucht. Die Peptid-vermittelte M4- Melanom-Zell-Motilität wurde in 48-Vertiefungs-Mikrochemotaxis-Kammern (Neuroprobe, Bethesda, MD) untersucht, die ausgerüstet waren mit 8 um Porengröße Polyvinylpyrrolidon-freien Polycarbonat-Filtern nach einer Modifikation eines Verfahrens, das von Herbst et al., supra, beschrieben wurde. Kurz gesagt, wurden Peptide mit Voller's Carbonat-Puffer verdünnt und in dreifachen 50 ul/Aliquots in die unteren Vertiefungen der Kammern gegeben. Die Kammern wurden mit den Filtern an Ort und Stelle zusammengesetzt und über Nacht bei 37ºC inkubiert, um die Adsorption der Peptide an die unteren Oberflächen der Filter zu ermöglichen. Die Filter wurden dann gewaschen und in frische Kammern transferiert, die lediglich Medien enthielten (DME, enthaltend 20 mM Hepes, pH 7,4). Die Zellen wurden dann in die oberen Vertiefungen mit 20000/Vertiefung in DME/Hepes-Medien gegeben und während 6 Stunden bei 37 C in einer feuchten CO&sub2;-Kammer inkubiert. Die Filter wurden dann gewaschen, fixiert und gefärbt, und die Anzahl der Zellen, die durch die Filter gewandert war, wurde unter Verwendung eines Optomax Bildanalyse-Systems wie in Herbst et al., supra, beschrieben, quantifiziert. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Die Ergebnisse zeigen, daß das Peptid IV-H1 einen konzentrationsabhängigen Anstieg der Melanom-Zell-Motilität in Mikrochemotaxis-Kammern förderte (Figur 4a). Während ein signifikanter Spiegel der Motilität (zweifacher BSA-Kontroll-Spiegel) bei einem Überzugsspiegel von lediglich 20 ug/ml beobachtet wurde, wurde die maximale Zell-Motilität (fünffacher BSA-Kontroll-Spiegel) beobachtet, wenn der Filter mit einer 100 bis 200 ug/ml-Lösung von Peptid IV-H1 überzogen wurde. Dies ist vergleichbar mit der Melanom-Zell-Motilität von zehnfachem Hintergrund-Spiegel als Antwort auf eine 10 ug/ml-Lösung von intaktem Typ-IV-Kollagen (Figur 4b).

Beispiel 4

Inhibierung der Zell-Adhäsion, Ausbreitung und Motilität durch exogenes Peptid IV-H1

Die Fähigkeit von überschüssigem löslichen Peptid IV-H1 zur Inhibierung von Typ-IV-Kollagen-vermittelter M4-Melanom-Zell-Adhäsion-Ausbreitung und - Migration wurde untersucht. Die Spezifität der Peptid IV-HI-Sequenz im Typ-IV-Kollagen wurde bestimmt, indem Typ I-Kollagen in die Inhibierungs- Studien einbezogen wurde. Als zusätzliche Kontrolle wurde das Typ-IV- Kollagen-abgeleitete Peptid 17 hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Inhibierung der Kollagen-vermittelten Zellaktivität untersucht. Peptid 17 hat eine Länge und Aminosäuregehalt ähnlich wie Peptid IV-H1, fördert jedoch nicht die Melanom-Zell-Adhäsion oder -Ausbreitung. Die Zellen blieben in Gegenwart aller untersuchten Konzentrationen von Peptiden lebensfähig, wie durch Ausschluß von Trypan-Blau-Farbstoff gezeigt.
In diesen Beispielen wurden Immulon 1-Platten wie in Beispiel 1 oben beschrieben überzogen für die Verwendung in Zell-Adhäsions-Assays unter Verwendung von Konzentrationen von Peptid IV-H1, Typ-IV-Kollagen oder Typ-I-Kollagen (50 ug/ml des Peptids und 5 ug/ml des intakten Proteins), was halbmaximale M4-Melanom-Zell-Adhäsion in vorherigen Dosis-Antwort- Experimenten ergab. Die Zellen wurden während 20 Minuten bei 37ºC in Gegenwart (oder Abwesenheit) verschiedener Konzentrationen der Peptide vorinkubiert, um die Zelloberflächen-Bindungsproteine zu besetzen, die diese Peptide erkennen. Die Ausbreitungs- und Adhäsionsbestimmungen wurden quantifiziert wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
Die Fähigkeit von Peptid IV-H1 zur Inhibierung von Typ-IV-Kollagenvermittelter haptotaktischer Motilität wurde bestimmt, indem Filter auf der Unterseite mit entweder Typ-IV-Kollagen oder Typ-I-Kollagen in Voller's Carbonat-Puffer vorüberzogen wurden wie in Beispiel 3 oben beschrieben. Die Kollagen-Oberzugs-Konzentration (5 ug/ml) wurde ausgewählt auf der Basis der Konzentration, die halbmaximale Spiegel der zellulären Motilität ergaben. Die inhibitorische Wirkung der Peptide auf die Zell-Motilität wurde bestimmt, indem die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen der Peptide während 20 Minuten vor dem Assay vorinkubiert wurden, um die Bindung an die Zelloberflächen-Rezeptoren zu ermöglichen. Zellen in fortgesetzter Gegenwart von Peptiden wurden dann in die oberen Vertiefungen der Kammern gegeben, die die Protein-überzogenen Filter enthielten.
In den Adhäsions-Assays inhibierte exogenes lösliches Peptid IV-H1 stark die IV-H1- und Typ-IV-Kollagen-vermittelte Melanom-Zell-Adhäsion (Figur 5a). Die Melanom-Zell-Adhäsion auf mit Peptid IV-H1 überzogenen Oberflächen wurde zu fast 40 % in Gegenwart des löslichen Peptids IV-H1 bei 20 ug/ml, und zu 80 % bei der höchsten getesteten Konzentration des Peptids IV-H1 (500 ug/ml) inhibiert (Figur 5a). Genauso wurde die Melanom-Zell-Adhäsion an mit Typ-IV-Kollagen überzogene Oberflächen zu 20 % in Gegenwart von 20 ug/ml löslichem Peptid IV-H1 und zu sogar 70 % bei der höchsten untersuchten Konzentration des Peptids (500 ug/ml) inhibiert. Im Gegensatz dazu wurde die Melanom-Zell-Adhäsion auf mit Typ-I-Kollagen überzogenen Oberflächen nicht durch die Gegenwart des löslichen Peptids IV-H1 beeinflußt. Zusätzlich wurde keine Wirkung des Kontrollpeptids 17 (Figur 3a) auf Typ-IV-Kollagen-vermittelte Melanom-Zell-Adhäsion beobachtet, sogar bei der höchsten getesteten Konzentration (500 ug/ml).
Die Zellausbreitung auf mit Peptid IV-H1 überzogenen Oberflächen wurde bis zu 70 % in Gegenwart von löslichem Peptid IV-H1 mit 200 ug/ml inhibiert (Figur 5b). Genauso wurde die Zellausbreitung auf Typ-IV-Kollagenüberzogenen Oberflächen zu 20 % bei einer 100 ug/ml Konzentration von Peptid IV-H1 inhibiert, und der Grad der Zellausbreitung nahm um 50 % bei der höchsten untersuchten Konzentration ab (200 ug/ml). Im Gegensatz dazu hatte die Vorbehandlung von Zellen mit Peptid IV-H1 keine Wirkung auf den Prozentsatz der Zellen, die sich auf mit Typ-I-Kollagen überzogenen Oberflächen ausbreiteten. In Kontrollstudien hatte überschüssiges Peptid 17 (Figur 5b) keine Wirkung auf die Zellausbreitung auf mit Typ-IV-Kollagen oder Peptid IV-H1 überzogenen Öberflächen.
Schließlich wurde die Typ-IV-Kollagen-vermittelte Zell-Motilität durch Peptid IV-H1. auf eine Dosis-abhängige Weise mit einer maximalen Inhibierung von 80 % bei einem 50 ug/ml-Spiegel von Peptid IV-H1 inhibiert (Figur 5c). Die Melanom-Zell-Motilität durch mit Typ-I-Kollagen vorüberzogene Filter wurde jedoch nicht durch die Gegenwart von Peptid IV-H1 inhibiert. Peptid 17 hatte keine Wirkung auf die Typ-IV-Kollagen-vermittelte Zell-Motilität.

Beispiel 5

Polyklonale IgG-Inhibierung von Typ-IV-Kollagen-vermittelter Zell-Adhäsion, -Ausbreitung und -Motilität

A. Herstellung und Reinigung von polyklonalen Antikörpern

Polyklonale Antikörper wurden gegen an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH: Sigma Chemical Co.) gekoppeltes Peptid IV-H1 unter Verwendung von Carbodiimid als Kupplungsmittel erzeugt, basierend auf einem von Bauminger und Wilchek in Methods in Enzymology, H. Van Bunakis und J.J. Langone, Herausgeber, 70, 151-159 (1980) beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, wurden gleiche Menge (nach Gewicht) Peptid und KLH in Wasser solubilisiert und mit einem zehnfachen Überschuß (nach Gewicht) 1-Ethyl-3(3- dimethylamonopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (Sigma Chemical Co.) gelöst in Wasser gemischt. Weiße Neuseeland-Kaninchen (New Zealand White Rabbits) wurden auf dem Rücken durch mehrfache intradermale Injektionen von etwa 2 mg pro Kaninchen Peptid/KLH-Konjugat in vollständigem Freund's-Adjuvant immunisiert. Anschließende zwei-wöchentliche Nachinjektionen wurden intramuskulär in unvollständigem Freund's-Adjuvans gegeben. Die Seren wurden 14 Tage nach der vierten Immunisierung gesammelt und durch RIA hinsichtlich der Reaktivität gegen ungekoppeltes Peptid, das Ursprungsprotein und verschiedene andere Liganden getestet.
Immunglobulin G (IgG) wurde aus normalem Kaninchen-Serum und gepooltem Immunserum durch Fällung mit Ammoniumsulfat mit einer Endkonzentration von 50 % über Nacht bei 4ºC gereinigt. Der resolubilisierte Niederschlag wurde gegen 0,035 M NaCl in 0,025 M Tris, pH 8,8 dialysiert, und das IgG wurde durch DEAE-Säulenchromatographie wie zuvor beschrieben gereinigt (Skubitz et al., 1987). Die Reinheit des IgG wurde durch SDS-PAGE bestimmt. Die erhaltene Immunreaktivität des gereinigten IgG wurde durch RIA verifiziert.

B. Assays für die IV-H1-Antikörper-Spezifitäten

Immun-Seren und gereinigtes Anti-Peptid-IV-H1-IgG wurde hinsichtlich der Spezifität durch einen indirekten Festphasen-RIA in 96-Vertiefungs- Polystyrol-Immulon 1-Platten gescreent wie von Skubitz et al., Exp. Cell. Res., 173, 349-369 (1987) beschrieben. Kurz gesagt wurden 50 ug Proteine oder Peptide mit verschiedenen Konzentrationen in Voller's Carbonat-Puffer in jede Vertiefung gegeben und über Nacht bei 29ºC getrocknet. Am nächsten Tag wurden 200 ul PBS, enthaltend 5 % BSA (Fraktion V, Fettsäure-frei, Sigma Chemical Co.), 0,1 % Triton X-100 und 0,02 % NaN&sub3; in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 60 minütigen Inkubation bei 37ºC. Nach Entfernung dieses Puffers wurden 100 ul gereinigtes IgG mit verschiedenen Verdünnungen in PBS, enthaltend 5 % BSA und 0,02 % NaN&sub3; dreifach zugegeben, und die Vertiefungen wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit dem obigen Puffer wurde gebundenes IgG durch Zugabe von 100 ul 5 % BSA in PBS/NaN&sub3;, enthaltend etwa 100000 cpm ¹²&sup5;I-markiertes Esel-IgG, gerichtet gegen Kaninchen-IgG (sp. act. 5 uCi/ug; Amersham, Arlington Heights, IL) bestimmt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC wurde ungebundener Antikörper durch Waschen entfernt. Im Anschluß an eine Inkubation mit 100 ul 2 M NaOH während 15 Minuten bei 60ºC wurden die solubilisierten Proteine in Glasröhrchen gegeben, und die Radioaktivität wurde in einem Tm-analytischen Gamma-Zähler Modell 1193 gemessen.
Gegen KLH-gekoppeltes Peptid IV-H1 erzeugtes gereinigtes IgG wurde hinsichtlich der Immunoreaktivität durch RIA gescreent (vergleiche Tabelle 3). Die Reaktivität des Anti-Peptid IV-H1 IgG war Typ-IV-Kollagenspezifisch, da das IgG Typ-IV-Kollagen und Peptid IV-H1 erkannte, jedoch nicht Typ I-Kollagen. Das als Kontrolle verwendete gereinigte normale Kaninchen-IgG reagierte nicht mit Typ-IV-Kollagen oder einem der synthetischen aus Typ-IV-Kollagen erhaltenen Peptide.

C. Wirkung des Anti-Peptid-IV-H1-IgG auf Kollagen-vermittelte Zell- Adhäsion, -Ausbreitung und -Motilität

Polyklonale Antikörper wurden gegen Peptid IV-H1 erzeugt und hinsichtlich der Fähigkeit zur Inhibierung von Typ-IV-Kollagen-vermittelter M4-Melanom- Zell-Adhäsion, -Ausbreitung und -Motilität getestet. In diesen Assays wurden Immulon 1-Platten wie oben in Beispiel 1 beschrieben für die Verwendung in Zell-Adhäsions-Assays unter Verwendung von Konzentrationen von Peptid IV-H1, Typ-IV-Kollagen oder Typ-I-Kollagen (50 ug/ml des Peptids und 5 ug/ml des intakten Proteins) überzogen, welche die halbmaximale M4- Melanom-Zell-Adhäsion in vorherigen Dosis-Antwort-Experimenten ergeben hatten.
Die Protein-überzogenen Oberflächen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von gereinigtem normalen Kaninchen-IgG oder gereinigtem IgG gegen Peptid IV-HI inkubiert, um die korrespondierende Sequenz im Oberflächen-gebundenen Protein zu blockieren. Die Zellen wurden dann in die Vertiefungen in der fortgesetzten Gegenwart von Peptid oder IgG gegeben und bei 37ºC während 30 Minuten inkubiert. Ausbreitungs- und Adhäsions- Bestimmungen wurden quantifiziert wie oben beschrieben.
Zusätzlich wurde die inhibitorische Wirkung von Anti-Peptid-IV-H1-IgG auf die Haptotaxis durch Inkubieren der Protein-überzogenen Filter während 20 bis 30 Minuten mit dem Antikörper in den unteren Vertiefungen (und dadurch Blockierung) der IV-H1-Sequenz im Typ-IV-Kollagen-Molekül bestimmt. Die Zellen wurden dann in die oberen Vertiefungen gegeben und der Assay fortgesetzt wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Tabelle 3
* Gereinigtes Anti-Peptid-IV-H1-IgG wurde hinsichtlich der Spezifität durch einen indirekten Festphasen-RIA gescreent. Kurz gesagt wurden die Oberflächen mit Proteinen oder Peptiden wie zuvor beschrieben überzogen. Gereinigtes IgG bei verschiedenen Verdünnungen wurde zugegeben. Gebundenes IgG wurde durch Zugabe von ¹²&sup5;1-markiertem sekundärem IgG (sp. act. 5 uCi/ug) bestimmt.
@ Quantifizierung von ¹²&sup5;I-markiertem gebundenem sekundärem IgG, ausgedrückt als cpm.
Die Melanom-Zell-Adhäsion auf mit Peptid IV-H1, intaktem Typ-IV-Kollagen oder Typ-I-Kollagen überzogenen Oberflächen wurde in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen des Anti-Peptid-IV-H1-IgG gemessen. Die Melanom-Zell-Adhäsion auf mit 50 ug/ml Peptid IV-H1 überzogenen Oberflächen wurde zu 40 % durch Anti-IV-H1-IgG bei 20 ug/ml inhibiert (Figur 6a). Die maximale Inhibierung (70 %) wurde bei der höchsten getesteten Konzentration des Antikörpers beobachtet (500 ug/ml). Die Zell-Adhäsion an Typ-IV- Kollagen wurde auch auf Konzentrations-abhängige Art durch Vorinkubation mit Anti-IV-H1-IgG reduziert. Eine signifikante Inhibierung (20 %) wurde in Gegenwart von nur 20 ug/ml Anti-Peptid-IV-H1-IgG beobachtet, und eine 40 %ige Inhibierung der Adhäsion wurde bei 500 ug/ml Anti-Peptid-IV-H1-IgG beobachtet. Im Gegensatz dazu reduzierte die Vorinkubation mit dem Anti- Peptid-IV-H1-IgG nicht den Grad der Melanom-Zell-Adhäsion an mit Typ-I- Kollagen überzogenen Oberflächen. Keine Inhibierung der Zell-Adhäsion an mit einem der kollagenen Proteine überzogenen Oberflächen wurde in Gegenwart von normalem Kaninchen-IgG beobachtet, sogar bei den höchsten verwendeten Konzentrationen (500 ug/ml); demonstriert durch das Fehlen der Inhibierung der Zell-Adhäsion an Peptid IV-H1 mit normalem Kaninchen-IgG (Figur 6a).
Die Melanom-Zell-Ausbreitung auf mit Peptid IV-H1, intaktem Typ-IV-Kollagen oder Typ-I-Kollagen überzogenen Oberflächen wurde in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen Anti-Peptid-IV-H1-IgG gemessen. Die Zell- Ausbreitung auf mit Peptid IV-H1 überzogenen Oberflächen wurde signifikant (50 %) bei Spiegeln von Anti-Peptid-IV-H1-IgG von nur 20 ug/ml vermindert, und die maximale Inhibierung (80 %) wurde bei 50 ug/ml beobachtet (Figur 6b). Auf gleiche Weise wurde die Zell-Ausbreitung auf mit Typ-IV-Kollagen überzogenen Oberflächen um 20 % in Gegenwart von 50 ug/ml Anti-Peptid-IV- H1-IgG und sogar um 60 % vermindert, wenn 100 ug/ml dieses IgG anwesend war. Im Gegensatz dazu wurde die Zell-Ausbreitung auf mit Typ-I-Kollagen überzogenen Oberflächen nicht durch dieses IgG beeinflußt (Figur 6b). Das als Kontrolle dienende normale Kaninchen-IgG beeinflußte die Zell- Ausbreitung auf mit Peptid-IV-H1, Typ-IV-Kollagen oder Typ-I-Kollagen überzogenen Oberflächen nicht.
Die Wirkung des Anti-Peptid-IV-H1-IgG auf die durch Typ-IV-Kollagen vermittelte Melanom-Zell-Haptotaxis wurde durch Inkubieren des Kollagenüberzogenen Filters mit Anti-Peptid-IV-H1-IgG vor der Zugabe der Zellen zum Motilitäts-Assay untersucht (Figur 6c). Die Motilität wurde auf Konzentrations-abhängige Weise bei einer maximalen Inhibierung von 70 % bei 100 ug/ml IgG vermindert. Im Gegensatz dazu wurde die Zell-Motilität durch mit Typ-I-Kollagen vorüberzogenen Filter (Figur 6c) nicht durch Vorinkubation der Filter mit Anti-Peptid-IV-Hl-IgG inhibiert. Normales Kaninchen-IgG hatte keine Wirkung auf die Typ-IV-Kollagen-vermittelte Zell- Motilität.

Beispiel 6

Bindung von Peptid IV-H1 an Neuralzellen

Rückenwurzel-Ganglien wurden chirurgisch aus 9-Tage alten Kükenembryos isoliert. Bindegewebe wurde aus dem Nervengewebe sowohl chirurgisch als auch enzymatisch entfernt. Der Rest der isolierten Zellen beinhaltete Neuronen, Glialzellen, und restliche Fibroblasten. Die Zellen wurden dann 20 auf 40000 Zellen pro Milliliter Medium verdünnt. 0,5 ml der Zellsuspension wurden in die Vertiefungen von 24 Immulon I-Platten gegeben, die wie oben in Beispiel 1 gezeigt mit Peptid IV-H1 und mit verschiedenen positiven und negativen Kontrollen überzogen worden waren.
Der Assay wurde in einem feuchten Inkubator bei 37ºC während 24 Stunden inkubiert. Die Medien wurden dann entfernt, und die Platten wurden zur Entfernung nicht haftender Zellen gewaschen. Anhaftende Zellen wurden unter Verwendung einer 1 %igen Glutaraldehyd-Lösung fixiert. Die Quantifizierung der Anzahl an Neuronen, die an den Oberflächen hafteten, genauso wie der Anzahl der Neuronen mit ausgebreiteten Neunte wurde von zwei Individuen unter Doppelblind-Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Neuronen-Adhäsion und Neunte-Ausbreitung auf Konzentrations-abhängige Weise gefördert wurden (Figur 7). Eine Konzentration von 5 ug/ml Peptid IV- H1 resultierte in maximaler Zell-Adhäsion, während 50 ug/ml die stärkste Ausstreckung von Neunte aus anhaftenden Neuronen verursachte. Diese zusammengenommenen Ergebnisse zeigen, daß Peptid IV-H1 ein wesentlicher Bestandteil im Verlauf der Tumor-Zell-Adhäsion, Ausbreitung und Motilität ist und hoch-spezifisch für den Zelltyp ist, an den es bindet.
Eine Anzahl praktischer Anwendungen für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ins Auge gefaßt werden. Solche Anwendungen beinhalten die Fähigkeit zur Inhibierung von Metastase und Eindringen maligner Zellen, die Verwendung als diagnostisches Werkzeug und zur Förderung der Regeneration von Nerven.
In der Vergangenheit wurden ausgewählte Laminin-Domänen hinsichtlich der Fähigkeit zur Verminderung des metastatischen Potentials invasiver Zell- Linien untersucht [Mccarthy et al., Cancer Met. Rev., 4, 125-152 (1985)). Diese Wirkung wird durch die Sättigung vermittelt und daher durch Neutralisation der Zelloberflächen-Rezeptoren für Laminin. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung legen die hier dargestellten Daten nahe, daß Rezeptoren für das Polypeptid IV-H1 aus Typ-IV-Kollagen auf den Zelloberflächen maligner Zellen existieren. Dementsprechend könnten überschüssiges lösliches Polypeptid oder polyklonale IgG-Antikörper für Peptid IV-H1 verwendet werden, um Typ-IV-Kollagen-Rezeptoren metastatischer Zellen zu blockieren und dadurch deren metastatisches Potential zu vermindern. Zusätzlich könnte an ein geeignetes chemotherapeutisches Mittel gekoppeltes Peptid IV-H1 zur Diagnose und Behandlung von malignem Zellwachstum verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Peptid kann sich auch zur Erleichterung der Regenerierung von beschädigtem Nervengewebe als nützlich erweisen. Insbesondere begünstigt Peptid IV-HI Nervenzellen-Wachstum, da das Peptid lediglich die Adhäsion von Zellen neuralen Ursprungs fördert. Beispielsweise haften Neuronen an, Endothelzellen aber nicht. Daher schließt die Bindungsspezifität des Peptids eine Störung des künstlichen Nervenwachstums durch Endothelzellen aus.

Claims

1. Verwendung eines Polypeptlds zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Verwendung zur Inhibierung der Metastase und des Befalls durch Tumorzellen;

wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die Im wesentlichen den Aminosäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen koliagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der α1-Kette des Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist:

gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro.

2. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid an einen chemotherapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.

3. Verwendung eines Polypeptids zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Verwendung zur Förderung der Nervenregeneration;

wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen den Aminösäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der α1-Kette des Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist:

gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro.

4. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen den Aminosäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen kollagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der α1- Kette des Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist:

gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-ala-pro.

5. Diagnostische Vorrichtung zum Nachweis von malignem Zellwachstum, umfassend:

ein auf einem Trägersubstrat immobilisiertes Polypeptid;

wobei das Poiypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen den Aminosäureresten 1263 bis 1277 der kontinuierlichen koliagenen Region der dreifach helikalen Hauptdomäne der α1-Kette des Typ-IV-Kollagen entspricht und die folgende Formel aufweist:

gly-val-lys-gly-asp-lys-gly-asn-pro-gly-trp-pro-gly-als-pro.