DE69427370T2

DE69427370T2 - Neue integrinbindende peptide

Info

Publication number: DE69427370T2
Application number: DE69427370T
Authority: DE
Inventors: Erkki Koivunen; Erkki Ruoslahti
Original assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; La Jolla Cancer Research Foundation
Current assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; La Jolla Cancer Research Foundation
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1994-11-22
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2014-11-23
Also published as: JPH09509142A; DE69427370D1; WO1995014714A1; EP0906919A3; AU682561B2; AU1259695A; US7067619B2; EP0906919A2; EP0730607A1; US20020103130A1; US5981478A; CA2177070A1; EP0730607B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Integrine sind heterodimere α,β-Transmembranrezeptoren, die auf einer großen Vielzahl von Zellen exprimiert werden. Sie vermitteln die Anheftung von Zellen an die extrazelluläre Matrix ("EZM"). Es gibt acht bekannte β-Untereinheiten und vierzehn bekannte α-Untereinheiten, die in verschiedenen Kombinationen assoziieren, um mindestens zwanzig Rezeptoren mit unterschiedlichen Ligandenspezifitäten zu bilden. Die Liganden für mehrere der Integrine sind Adhäsionsproteine der extrazellulären Matrix (EZM), wie Fibronectin, Vitronectin, Collagene und Laminin.
Es wird zunehmend klar, dass die EZM die Genexpression beeinflusst und dass Veränderungen in der Expression von Genen, die Matrixproteine kodieren, die Zusammensetzung der EZM verändern. Integrine scheinen Nachrichten von der äußeren Umgebung einer Zelle in deren Inneres zu vermitteln, wodurch Veränderungen in der Genexpression induziert werden. Aufgrund dieser Fähigkeit kontrollieren die Integrine viele medizinisch wichtige biologische Phänomene, einschließlich der Zellmigration während der Entwicklung, Gewebereparatur, Krebszelldifferenzierung, Metastasierung von Tumorzellen, Plättchenaggregation, Homing von Zellen des Immunsystems und die Ausdehnung von neuronalen Prozessen zu Zielstellen.
Viele Integrine, einschließlich α&sub5;β&sub1;, αVβ&sub5;, αIIbβ&sub3; und αVβ&sub3; erkennen die Aminosäuresequenz RGD (Arginin-Glycin-Asparaginsäure), die in Fibronectin und anderen Adhäsionsproteinen vorhanden ist.
Fibronectin ist der einzige bekannte EZM-Ligand für das α&sub5;β&sub1;-Integrin und die Bindung von Fibronectin an dieses Integrin wird durch eine RGD-Sequenz vermittelt. Im Gegensatz dazu können die Integrine αVβ&sub3; und αIIbβ&sub3;, die ebenfalls die RGD- Sequenz erkennen, viele verschiedene Adhäsionsproteine binden.
Das α&sub5;β&sub1;-Integrin ist wichtig bei der Förderung des Zusammenbaus der Fibronectin-Matrix und der Initiierung der Zellanheftung an Fibronectin. In ähnlicher Weise sind die αVβ&sub3;-, αVßs- und αIIbβ&sub3;-Integrine wichtig bei der Förderung der Zellanheftung an Vitronectin, Fibrinogen, Fibronectin, Osteopontin und einige andere RGD-enthaltende Proteine. Peptide und Proteinfragmente, die die RGD-Sequenz enthalten, können verwendet werden, um die Aktivität der RGD-erkennenden Integrine zu modulieren. Die Verwendung von RGD-Peptiden erlaubt eine zielgerichtete Modulation und Manipulation der Zelladhäsion und anderer Integrinvermittelter zellulärer Ereignisse in verschiedenen medizinischen Situationen, einschließlich Plättchenaggregation, Thrombose, Wundheilung, Osteoporose, Gewebereparatur und Tumorinvasion. Ruoslahti, J. Clin. Invest., 87: 1-5 (1991).
Während RGD-Peptide, die an mehr als eines der durch die RGD- Sequenz dirigierten Integrine binden, in einigen dieser Anwendungen verwendet worden sind, hängt die am weitesten entwickelte Anwendung, die Verwendung zur Verhinderung von Thrombosen, von Peptiden ab, die für das Ziel-Integrin eine höhere Selektivität zeigen. Die Thrombosen verhindernden Peptide sind auf das Plättchenintegrin αIIbβ&sub3; gerichtet (z. B. Collen et al., Thromb. Haemos., 71: 95-102 (1994)).
Folglich besteht ein Bedarf an Liganden, die selektiv Integrine binden. Die Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt ebenfalls damit in Zusammenhang stehende Vorteile bereit.
Diese Erfindung stellt Peptide bereit, die an verschiedene Integrine binden. Diese schließt Peptide ein, die an die αVβ&sub5;- und αVβ&sub3;-Integrine binden und die die Sequenz X&sub1;X&sub2;X&sub3;RGDX&sub4;X&sub5;X&sub6; [SEQ ID NO: 3] enthalten, wobei X&sub1;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub6; in der Lage sind, eine cyclisierende Bindung zu bilden und X&sub2; und X&sub5; 1 bis 5 Aminosäuren sind.
Gemäß bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung zeigen Peptide, die die Sequenzmotive enthalten, eine verstärkte Bindungsaffinität, wenn sie als Ergebnis von beispielsweise einer Cyclisierung eine eingeschränkte Sekundärkonformation annehmen.
Diese Erfindung stellt auch Verfahren, die diese Peptide verwenden, bereit. Ein Verfahren, das zum Isolieren eines αv- oder α&sub5;-enthaltenden Integrins aus einer Probenmischung nützlich ist, umfasst, ein Peptid dieser Erfindung mit der Probenmischung unter ionischen Bedingungen zu kontaktieren, um das Binden des Integrins an das Peptid zu ermöglichen, und das Integrin von dem Peptid zu trennen. Die Integrine sind beispielsweise bei der Evaluierung der Spezifität von Integrinbindenden Arzneimitteln, wie Anti-Thrombotika, nützlich. Tschopp et al., Coronary Artery Disease, 4: 809-817 (1993). Ein Verfahren, das nützlich ist, um Zellen an ein Substrat anzuheften, und umfasst, ein Peptid der Erfindung an ein Substrat zu binden und das Substrat mit der Zelle zu kontaktieren, wird ebenfalls bereitgestellt. Eine Zellkultur erfordert ein korrektes Anheften von Zellen. Folglich stellt diese Erfindung ebenfalls Vorrichtungen bereit, die ein Peptid dieser Erfindung angeheftet an die Oberfläche eines Substrats aufweisen.
Diese Erfindung stellt auch therapeutische Verfahren und Vorrichtungen, die diese Peptide einsetzen, bereit. Ein Verfahren, das zum Anziehen von Zellen zu der Oberfläche eines implantierbaren Prosthetikums nützlich ist, umfasst, ein Peptid der Erfindung an der Oberfläche des implantierbaren Prosthetikums anzuheften, und kann ferner umfassen, das Prosthetikum in ein Individuum zu implantieren. Die Erfindung stellt auch Vorrichtungen bereit, die ein Peptid der Erfindung angeheftet an die Oberfläche eines implantierbaren Prosthetikums aufweisen. Verfügbare Literatur zeigt, dass solche Vorrichtungen Vorteile gegenüber unbeschichteten Vorrichtungen aufweisen. Glass et al., Mat Res. Soc. Symp. Proc., 252: 331-337 (1992).
Diese Erfindung ist auf Hauttransplantate oder Patchgrafts gerichtet, die ein Peptid dieser Erfindung angeheftet an eine Trägermatrix aufweisen. Ein Verfahren der Erfindung, das zur Förderung der Wundheilung nützlich ist, umfasst, ein Patchgraft der Erfindung auf die Wunde aufzubringen.
Ein therapeutisches Verfahren, das nützlich ist, um die Anlagerung von Osteoklasten an Knochen zu inhibieren und dementsprechend um Osteoporose zu behandeln, umfasst, an ein Individuum ein Peptid der Erfindung, das an das αVβ&sub3;-Integrin bindet, zu verabreichen.
In ähnlicher Weise umfassen therapeutische Methoden, die zur Inhibierung von Angiogenese nützlich sind, auch, ein Peptid der Erfindung, das an das αVβ&sub3;-Integrin bindet, an ein Individuum zu verabreichen. Die Inhibierung der Angiogenese ist beispielsweise in der Tumortherapie von Bedeutung.
Diese Erfindung stellt auch ein therapeutisches Verfahren bereit, das nützlich ist, um die Metastasierung von Tumorzellen, die beispielsweise das αVβ&sub3;-Integrin exprimieren, zu inhibieren, das umfasst, an ein Individuum ein Peptid dieser Erfindung, das an diese Integrine bindet, zu verabreichen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, das nützlich ist, um die Migration von glatten Muskelzellen zu inhibieren, das umfasst, an ein Individuum ein Peptid der Erfindung, das an das αVβ&sub3;-Integrin bindet, zu verabreichen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Inhibition der ¹²&sup5;I-Fibronectin-Bindung an α&sub5;β&sub1;-Integrin durch synthetische cyclische Peptide.
Fig. 2 zeigt die Inhibition der Bindung von ELRGDGW [SEQ ID NO: 4]-präsentierenden Phagen an α&sub5;β&sub1;-Integrin durch synthetische cyclische Peptide GACRGDCLGA [SEQ ID NO: 5] und GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6].
Fig. 3 zeigt die Wirkung auf die Bindung von CRGDCL [SEQ ID NO: 7]-präsentierenden Phagen an αVβ&sub3;-Integrin durch die cyclischen Peptide GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6] und GACRGDCLGA [SEQ ID NO: 5].
Fig. 4 zeigt die Inhibition der Bindung von RRETAWA [SEQ ID NO: 8]-präsentierenden Phagen an α&sub5;β&sub1;-Integrin durch die cyclischen Peptide GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6] und GACRGDCLGA [SEQ ID NO: 5].
Fig. 5 zeigt die Inhibition der α&sub5;β&sub1;-vermittelten Zellanheftung an Fibronectin durch synthetische Peptide.
Fig. 6 zeigt die Inhibition der α&sub5;β&sub1;-vermittelten Zellanheftung an Fibronectin durch synthetische Peptide.
Fig. 7 zeigt die Inhibition der αVβ&sub5;-vermittelten Zellanheftung an Vitronectin durch synthetische Peptide.
Fig. 8 zeigt die Bindung von α&sub5;β&sub1;-exprimierenden Zellen und αVβ&sub5;-exprimierenden Zellen an das GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6]- Peptid.
Fig. 9 zeigt die Inhibition der Phagenanheftung an das α&sub5;β&sub1;-Integrin durch cyclische RGD-enthaltende Peptide. Der Phagenklon, der die RGDGW [SEQ ID NO: 9]-Sequenz enthielt, wurde 1 h in mit Integrin beschichteten Mikrolitervertiefungen in Gegenwart der kompetitierenden Peptide inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen wurden die verbleibenden gebundenen Phagen, wie in Beispiel XII beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte ausgehend von jeweils zwei Vertiefungen.
Fig. 10 zeigt die Inhibition der Phagenbindung an das αVβ&sub5;-Integrin durch cyclische RGD-Peptide. Phagen, die die ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Sequenz enthielten, wurden 1 h in mit Integrin beschichteten Vertiefungen in Gegenwart der kompetitierenden Peptide oder von Dimethylsulfoxid-Lösemittel als Kontrolle inkubiert. Die gebundenen Phagen wurden, wie hier beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte ausgehend von jeweils zwei Vertiefungen.
Die Fig. 11 bis 13 zeigen die Peptidinhibition der Zelladhäsion. Die Wirkung der synthetischen Peptide wurde, wie folgt, getestet:
Fig. 11 -- α&sub5;β&sub1;-vermittelte Anheftung von B2/a27-Zellen an Fibronectin.
Fig. 12 -- αVβ&sub5;-vermittelte Anheftung von HT-29-Zellen an Vitronectin.
Fig. 13 -- αVβ&sub3;-vermittelte Anheftung von IMR-90-Zellen an Vitronectin. Die Zellen, die banden, wurden, wie hier beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen Mittelwerte ausgehend von jeweils zwei Vertiefungen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung ist auf neue Integrin-bindende Peptide gerichtet. Diese Peptide enthalten
X&sub1;X&sub2;X&sub3;RGDX&sub4;X&sub5;X&sub6; [SEQ ID NO: 3].
Wenn diese Peptide eine konformatorisch stabilisierte Konfiguration annehmen, neigen sie dazu, eine größere Integrin- Bindungsaffinität aufzuweisen.
Die Peptide dieser Erfindung haben viele praktische Verwendungen. Diese Verwendungen umfassen das Isolieren von α&sub5;- und βV- enthaltenden Integrinen aus einer Mischung; das Fördern der Anheftung von Zellen, die das geeignete Integrin tragen, an eine Oberfläche, und das Inhibieren der Bindung solcher Zellen an Makromoleüle, wie Fibronectin, Vitronectin und Osteopontin. Jede dieser Aktivitäten ist in verschiedenen Anwendungen nützlich, wie nachfolgend detailliert ausgeführt wird.
Diese Erfindung stellt auch Peptide bereit, die an αVβ&sub5;- und αVβ&sub3;-Integrine binden und die Sequenz X&sub1;X&sub2;X&sub3;RGDX&sub4;X&sub5;X&sub6; [SEQ ID NO: 3] enthalten, wobei sich die Sequenz in einer eingeschränkten Sekundärkonformation, die durch zwei cyclisierende Bindungen vermittelt wird, befindet, wobei X&sub1;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub6; Reste sind, die in der Lage sind, eine Brücke zu bilden, und X&sub2; und X&sub5; 1 bis 5 Aminosäuren sind. In einer Ausführungsform der Erfindung enthält das Peptid die Sequenz CX&sub2;CRGDCX&sub5;C [SEQ ID NO: 15]. Spezielle Ausführungsformen dieser Erfindung umfassen Peptide, die die Sequenz CDCRGDCFC [SEQ ID NO: 16], CDCRGDCLC [SEQ ID NO: 17] oder CLCRGDCIC [SEQ ID NO: 18] enthalten. Siehe Tabelle 5. Die doppelt cyclische Struktur dieser Peptide ist ungewöhnlich. Die Anwesenheit der zwei Disulfidbindungen wurde durch Massenspektrometrie gezeigt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Peptid" auf zwei oder mehr Aminosäuren, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind, was Aminosäureäquivalente und andere nicht-Aminosäure- Gruppen mit einschließt, die die gewünschte funktionale Aktivität, die für ein Peptid dieser Erfindung charakteristisch ist, bewahren. Peptidäquivalente können sich von herkömmmlichen Peptiden durch das Ersetzen von einem oder mehreren Aminosäureanalogen durch verwandte organische Säuren (wie PABA), Aminosäuren oder ähnliches oder die Substitution oder Modifizierung von Seitenketten oder funktionellen Gruppen unterscheiden.
Die Peptide dieser Erfindung sind synthetisch. Das bedeutet, sie schließen spezifisch alle natürlich vorkommenden Peptide, die die beschriebenen Aminosäuresequenzmotive enthalten, aus. Diese Erfindung zieht Peptide, in denen die beschriebenen Motive in längeren Peptiden enthalten sind, wobei andere Aminosäuresequenzen eine oder beide Enden des Motivs flankieren, mit in Betracht. Die Peptide dieser Erfindung sind hinsichtlich der Größe nicht beschränkt. Jedoch zieht die Erfindung insbesondere Peptide mit in Betracht, die insgesamt weniger als ungefähr 50 Aminosäuren aufweisen. Sie zieht auch Proteine mit in Betracht, in denen die Kernmotivsequenz künstlich in die Sequenz des Polypeptids implantiert ist, wie Peptide, die durch DNA-Rekombinationstechniken oder durch chemische Synthese hergestellt worden sind. Die Bindungsaffinität eines jeglichen hier umfassten Peptids kann durch die hier beschriebenen Affinitätsassays und durch andere Affinitätsassays, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, untersucht werden.
Wie hier verwendet, wird der Begriff "Aminosäure" und eine jegliche Bezugnahme auf eine spezielle Aminosäure allgemein so verstanden, dass er bzw. sie natürlich vorkommende proteogene Aminosäuren wie auch nicht-natürlicherweise vorkommende Aminosäuren, wie Aminosäureanaloga, einschließt. Angesichts dieser breiten Definition wird ein Fachmann auf diesem Gebiet wissen, dass eine hier erfolgende Bezugnahme auf eine Aminosäure, sofern nicht speziell anders angegeben, beispielsweise natürlich vorkommende proteogene (L)-Aminosäuren, (D)-Aminosäuren, chemisch modifizierte Aminosäuren, einschließlich Aminosäureanaloga, wie Penicillamin (3-Mercapto-D-valin), natürlich vorkommende nicht-proteogene Aminosäuren, wie Norleucin, und chemisch synthetisierte Verbindungen, die Eigenschaften aufweisen, von denen in diesem Fachgebiet bekannt ist, dass sie für eine Aminosäure charakteristisch sind, einschließt.
Die Wahl, eine (L)- oder eine (D)-Aminosäure in ein Peptid der Erfindung aufzunehmen, hängt zum Teil von den gewünschten Eigenschaften des Peptids ab. Beispielsweise kann das Aufnehmen von einer oder mehreren (D)-Aminosäuren dem Peptid in vitro oder in vivo erhöhte Stabilität verleihen. Das Aufnehmen von einer oder mehreren (D)-Aminosäuren kann auch die Bindungsaktivität des Peptids erhöhen oder verringern, wie beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Bindungsassays oder von anderen Methoden, die in diesem Fachgebiet wohl bekannt sind, bestimmt werden kann. In einigen Fällen, wie beispielsweise wenn ein Patient behandelt wird, kann es wünschenswert sein, es dem Peptid der Erfindung zu erlauben, nur eine kurze Zeitspanne aktiv zu bleiben. In jenen Fällen kann das Aufnehmen von einer oder mehreren (L)-Aminosäuren in das Peptid es beispielsweise endogenen Peptidasen in dem Patienten erlauben, das Peptid in vivo zu verdauen, wodurch die Exposition des Patienten gegenüber einem aktiven Peptid begrenzt wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Aminosäureäquivalent" auf Verbindungen, die von der Struktur der natürlich vorkommenden Aminosäuren abweichen, die aber im wesentlichen die Struktur einer Aminosäure haben, so dass sie innerhalb eines Peptids, das seine biologische Aktivität beibehält, substituiert werden können. Folglich können Aminosäureäquivalente beispielsweise Aminosäuren, wie oben beschrieben, umfassen, die Seitenkettenmodifizierungen oder -substitutionen aufweisen oder zu einer verwandten Klasse von organischen Säuren, wie Amiden oder ähnlichem, gehören. Der Begriff "Aminosäure", wie oben beschrieben, soll Aminosäureäquivalente umfassen. Der Begriff "Reste" kann sich auch auf eine Aminosäure oder ein Aminosäureäquivalent beziehen und ist mit diesen Begriffen synonym. Allgemein können begrenzte Modifizierungen an einem Peptid vorgenommen werden, ohne dessen biologische Funktion zu zerstören.
Wie hier verwendet, bedeutet "Binden" ein spezifisches Binden im Gegensatz zu einem nicht-spezifischen. Das spezifische Binden an ein Integrin kann durch die Fähigkeit eines Peptids dieser Erfindung, mit sich selbst oder mit dem Peptid GRGDSP [SEQ ID NO: 21] hinsichtlich des Bindens an das Integrin zu kompetitieren, bestimmt werden. Ein Unterscheidungsmerkmal eines solchen Bindens ist, dass das gebundene Peptid abgelöst oder an einem Binden an ein Integrin gehindert werden kann durch spezifische Elution bzw. anfänglichen Kontakt mit dem von Fibronectin abgeleiteten synthetischen GRGDSP [SEQ ID NO: 21]- Peptid. Siehe Pytela et al., Cell, 40: 191-198 (1985) und Pytela et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 5766-5770 (1985), von denen jedes in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Zusätzlich kann ein spezifisches Binden unter Verwendung eines Mittels, wie EDTA, das ein Integrin inaktiv macht, oder unter Verwendung eines Denaturierungsmittels, wie eines Puffers mit niedrigem pH, wie in den nachfolgend ausgeführten Verfahren beschrieben, zerstört werden.
Wie hier verwendet, "bindet" ein Peptid "selektiv" an ein Integrin, wenn es mit einer 10-fachen oder höheren Affinität an jenes Integrin im Vergleich zu einem anderen Integrin bindet, wie in dem gleichen Typ von Bindungsassay gemessen. Ein Peptid ist "spezifisch für" ein Integrin, wenn es an jenes Integrin mit einer 100-fach höheren Affinität bindet im Vergleich zu einem anderen Integrin, wie in dem gleichen Typ von Bindungsassay gemessen. Alternativ werden diese Werte aus Experimenten abgeleitet, in denen die Unterschiede zwischen dem Assay für die verschiedenen Integrine durch Vergleich mit einem nicht-selektiven RGD-Peptid, GRGDSP [SEQ ID NO: 21], kompensiert werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "hohe Bindungsaffinität" auf Peptide, die eine IC&sub5;&sub0; von 1 · 10&supmin;&sup7; M oder weniger in mindestens einem kompetitiven Bindungsassay für ein Integrin aufweisen. In den kompetitiven Bindungsassays, die hier beschrieben werden, wurde der IC&sub5;&sub0;-Wert durch Kompetition gegen ein Standardpeptid von bekannter Bindungsaffinität bestimmt. So zeigt CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] hohe Bindungsaffinität für α&sub5;β&sub1;. Siehe Beispiele VI und VII.
Wie hier verwendet, bezieht sich "relative Bindungsaffinität" auf die vergleichsweise Affinität von zwei Peptiden gegenüber einem bestimmten Integrin. Relative Bindungsaffinität kann durch direkte Bindungskompetitionsassays oder durch Vergleichen der Bindungsaffinität mit einem Integrinbindenden Standard- Peptid, wie GRGDSP [SEQ ID NO: 21], bestimmt werden. Ein Maß, um die relative Bindungsaffinität zu bestimmen, ist die halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC&sub5;&sub0;) dieser Peptide, um das Binden von beispielsweise GRGDSP [SEQ ID NO: 21] an ein Integrin zu inhibieren.
Die Peptide dieser Erfindung können unter Verwendung von wohl bekannten Methoden, einschließlich Methoden der in vitro-DNA- Rekombination und chemische Synthese, synthetisiert werden. Ein lineares Peptid kann beispielsweise durch die Festphasenpeptidsynthesemethode von Merrifield unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthetisiervorrichtung synthetisiert werden (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird). Alternativ kann ein Peptid der Erfindung unter Verwendung von in Lösung erfolgenden Standardmethoden, die in diesem Fachgebiet wohl bekannt sind, (siehe beispielsweise Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, 1984), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) synthetisiert werden. Solche neu synthetisierten Peptide können in relativ reiner Form unter Verwendung von beispielsweise Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPCL) erhalten werden und können unter Verwendung von beispielsweise Massenspektrometrie oder Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert werden. Obwohl eine Reinheit von mehr als 95 Prozent für das synthetisierte Peptid bevorzugt ist, kann eine geringere Reinheit annehmbar sein.
Die Peptide dieser Erfindung, die das offenbarte Motiv in einer eingeschränkten Sekundärstruktur aufweisen, zeigen im allgemeinen eine relativ höhere Bindungsaffinität für Integrine als Peptide, die das Motiv nicht in einer solchen Konfiguration aufweisen, und neigen dazu, eine höhere Selektivität in der Integrinbindung zu zeigen. Wie hier verwendet, geben die Begriffe "eingeschränkte Sekundärstruktur", "stabilisiert" und "konformatorisch stabilisiert" an, dass die Peptidbindungen, die das Peptid umfasst, nicht in der Lage sind, frei im Raum zu rotieren, sondern stattdessen in einer relativ fixierten Struktur gehalten werden.
Die Bedeutung einer eingeschränkten Sekundärkonformation in den Peptiden der Erfindung wird durch die Tatsache gezeigt, dass die Bindungsaktivität des cyclischen Peptids GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6] nach einer Reduktion der Disulfidbindung und Alkylierung der Cysteinreste stark verringert war.
Verschiedene Methoden zum Einschränken der Sekundärstruktur eines Peptids sind in diesem Fachgebiet wohl bekannt. Bei einer besonders nützlichen Methode kann ein neu synthetisiertes lineares Peptid durch die Bildung einer Bindung zwischen reaktiven Aminosäureseitenketten cyclisiert werden. Beispielsweise kann ein ein Cystein-Paar enthaltendes Peptid synthetisiert und eine Disulfidbrücke durch Oxidieren einer verdünnten wässrigen Lösung des Peptids mit K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] gebildet werden. Die Disulfidbrücke kann auch unter Verwendung von Penicillamin gebildet werden.
Andere besonders nützliche Wege zum Einschränken der Sekundärstruktur eines neu synthetisierten linearen Peptids bestehen darin, das Peptid unter Verwendung einer jeglichen von verschiedenen Methoden, die in diesem Fachgebiet wohl bekannt sind, zu cyclisieren. Beispielsweise kann ein cyclisiertes Peptid der Erfindung hergestellt werden, indem eine Peptidbindung zwischen nicht-benachbarten Aminosäureresten gebildet wird, wie beispielsweise von Schiller et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 25: 171 (1985), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Peptide können an dem Merrifield-Harz synthetisiert werden, indem die lineare Peptidkette unter Verwendung von Nα-Fmoc-Aminosäuren und Boc und tert. -Butylprotein zusammengebaut wird, und dann kann nach Freisetzung des Peptids von dem Harz eine Peptidbindung zwischen dem Aminoterminus und dem Carboxyterminus gebildet werden.
Alternativ kann ein Lactam, wie eine &epsi;-(γ-Glutamyl)-Lysin- Bindung zwischen Lysin- und Glutaminsäureresten gebildet werden, kann eine Lysinonorleucinbindung zwischen Lysin- und Leucinresten gebildet werden oder kann eine Dityrosinbindung zwischen zwei Tyrosinresten gebildet werden. Cyclische Peptide können auch so konstruiert werden, dass sie beispielsweise vier Lysinreste enthalten, die die heterocyclische Struktur von Desmosin bilden können (siehe beispielsweise Devlin, Textbook of Biochemistry, 3. Auflage (1992), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird). Verfahren zur Bildung von dieser und anderen Bindungen sind in diesem Fachgebiet wohl bekannt und basieren auf wohl bekannten Regeln chemischer Reaktivität.
Ein Peptid dieser Erfindung kann auch in einer eingeschränkten Sekundärstruktur stabilisiert werden durch Inkorporieren des Peptids in eine größere Peptidsequenz, die eine bekannte Sekundärstruktur bildet. Beispielsweise kann ein Peptid der Erfindung stabilisiert werden durch Inkorporieren von diesem in eine Sequenz, die eine Helix bildet, wie eine alpha (α)- Helix oder Dreifachhelix, gemäß Methoden, die beispielsweise von Dedhar et al., J. Cell Biol., 104: 585 (1987); von Rhodes et al., Biochemistry, 17: 3442 (1978); und von Carbone et al., J. Immunol., 138: 1838 (1987), von denen jedes in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben wurden.
Wie hier verwendet, sind die "Glieder" eines Cyclus in einem cyclisierten Peptid die Aminosäuren in jenem Cyclus. Folglich wird beispielsweise *CRRETAWAC* [SEQ ID NO: 12] als ein neungliedriger Cyclus angesehen. Das "*" bezeichnet den Cysteinrest, der an der Bildung der Disulfidbrücke beteiligt ist.
Obwohl bestimmte Cyclusgrößen möglicherweise die Bindungsaffinität und Selektivität eines Peptids für ein Integrin optimieren könnten, zieht diese Erfindung Cyclen verschiedener Größen, die die Kernsequenz enthalten, in Betracht. Verschiedene Cyclusgrößen können erhalten werden, indem die Lage der brückebildenden Elemente innerhalb des Peptids variiert wird. Ein jeder Fachmann auf diesem Gebiet kann (ob) den Bereich von Cyclusgrößen bestimmen, innerhalb welchem das Peptid die Integrin-bindende Fähigkeit beibehält. Folglich zieht diese Erfindung beispielsweise in Betracht, dass die Kernsequenz RLD innerhalb von Cyclen verschiedener Größen, die ihrerseits innerhalb von längeren Peptiden enthalten sind, enthalten ist.
Diese Erfindung zieht viele Verwendungen für die hier beschriebenen Peptide in Betracht. Sie sind in allen Verfahren und Materialien, für die andere RGD-Peptide nützlich sind, nützlich. Insoweit, als sie hohe Bindungsaffinitäten aufweisen, muss man weniger von den Peptiden der Erfindung als von anderen RGD enthaltenden Peptiden verwenden. Insoweit, als sie Integrine selektiv oder spezifisch binden, können die Peptide dieser Erfindung präziser als andere RGD-enthaltende Peptide zielgerichtet eingesetzt werden und haben dementsprechend eine spezifischere Wirkung und/oder benötigen eine geringere Dosis. Folglich stellen die Peptide dieser Erfindung eine Verbesserung gegenüber den bekannten Klassen von RGD enthaltenden Peptiden dar.
Gebunden an eine Affinitätssäule oder ein anderes geeignetes Reinigungssystem sind die Peptide dieser Erfindung nützlich, um aus einer Probenmischung die α&sub5;- und αV-enthaltenden Integrine, an die sie binden, zu isolieren. Dementsprechend stellt diese Erfindung Verfahren bereit, die zum Isolieren eines Integrins, das an ein Peptid dieser Erfindung bindet, nützlich sind. Die Verfahren umfassen, das Peptid mit einer Probenmischung unter ionischen Bedingungen zu kontaktieren, um das Binden eines Integrins an das Peptid zu ermöglichen. Die Integrine werden dann von den Peptiden durch Verfahren, die in diesem Fachgebiet wohl bekannt sind, abgetrennt. Typischerweise werden die Peptide an eine Affinitätssäule gebunden. Die Probenmischung wird über die Säule unter Bedingungen geleitet, die das Binden des Integrins an das Peptid ermöglichen. Dann werden die ungebundenen Moleküle entfernt, indem die Säule gewaschen wird. Die Integrine werden isoliert, indem die Säule mit einem Puffer gewaschen wird, der die gebundenen Integrine von den Peptiden eluiert. Ein Isolierungsverfahren wird eingehender in Beispiel XIV beschrieben.
Die Peptide vom Typ CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] ermöglichen die spezifische Isolierung des α&sub5;α&sub1;-Integrins. Siehe Beispiele VI und VII.
Die Peptide der Erfindung sind für diese Zwecke besonders nützlich, da sie leicht und preiswert synthetisiert werden und dementsprechend leichter erhältlich sind als beispielsweise die natürlichen Liganden von Integrinen oder Antikörper, die für ein Integrin oder für eine Integrin-Untereinheit spezifisch sind.
Wenn sie an eine feste Oberfläche gebunden sind, fördern die Peptide der Erfindung die Anheftung von Zellen, die das geeignete Integrin tragen, an jene Oberfläche. Ein Verfahren, das nützlich ist, um Zellen an ein Substrat für die Zellkultur anzuheften, umfasst, ein Peptid dieser Erfindung an ein Substrat zu binden und das Substrat mit der Zelle zu kontaktieren. Das Beschichten des Substrats mit dem Peptid vermeidet die Verwendung von Fibronectin im Medium, was besser definierte Bedingungen für die Kultur wie auch bessere Reproduzierbarkeit gewährleistet.
Beispielsweise sind Cytodex-Partikel (Pharmacia, Piscataway, NJ) mit Gelatine überzogen. Dies ermöglicht es, die gleiche Anzahl von anhaftenden Zellen in einem viel kleineren Volumen von Medium zu züchten, als dies in Schalen möglich wäre. Die Aktivität dieser Körnchen ist im allgemeinen von der Verwendung von Fibronectin im Züchtungsmedium abhängig. Dementsprechend wird erwartet, dass die Peptide dieser Erfindung eine verbesserte, chemisch-definierte Beschichtung für solche Zwecke erzeugen. Andere Oberflächen oder Materialien können beschichtet werden, um die Anheftung zu verbessern, wie Glas, Kunststoff, Agarose, synthetische Harze oder langkettige Polysaccharide. (Siehe z. B. Glass et al., Mat. Res. Soc. Symp Proc., 252: 331-337 (1992) und Pierschbacher et al., U.S. -Patent Nr. 5,120,829). Darüber hinaus erlauben die verbesserten Affinitäten der hier bereitgestellten Peptide die Verwendung von geringeren Mengen des Peptids für die Beschichtung, was folglich die Wirtschaftlichkeit verbessert. Diese Erfindung stellt ferner Vorrichtungen bereit, die ein Peptid dieser Erfindung angeheftet an die Oberfläche eines Substrats umfassen. In einer Ausführungsform ist das Substrat eine Zellkulturschale.
Die Peptide dieser Erfindung sind auch als Beschichtungen auf Oberflächen von implantierbaren Prothesen, wie Blutgefäßprothesen oder Gefäßtransplantaten, wo sie Zellen anziehen und anheften, nützlich. So stellt diese Erfindung eine Vorrichtung bereit, die ein Peptid dieser Erfindung angeheftet an die Oberfläche einer implantierbaren Prothese aufweist. Diese implantierbaren Vorrichtungen sind im allgemeinen aus Nitrocellulose- oder Polyesterfasern, insbesondere Dacron (Polyethylenterephthalat)-Fasern gewebt oder gestrickt. Dementsprechend stellt diese Erfindung Verfahren bereit, die zum Anziehen von Zellen an die Oberfläche einer implantierbaren Prothese nützlich sind, die umfassen, ein Peptid dieser Erfindung an die Oberfläche der implantierbaren Prothese anzuheften. Ein weiteres Verfahren umfasst, die Prothese in ein Individuum zu implantieren. So ist es wünschenswert, Fibroblasten an künstliche Gewebepatches und Endothelzzellen an Gefäßtransplantate anzuziehen.
Die Peptide dieser Erfindung sind auch nützlich in Patchgrafts oder ähnlichem, um die Wundheilung zu unterstützen. Dementsprechend stellt diese Erfindung Patchgrafts bereit, die ein Peptid dieser Erfindung, das an das αV-Integrin bindet, angeheftet an eine Trägermatrix aufweisen. Die Matrix kann ein biologisch abbaubares Molekül, wie Collagen, ein Glycosaminoglycan oder ein Proteoglycan, umfassen. Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat sind zwei derartige Materialien. Diese Erfindung stellt ferner Methoden bereit, die zur Förderung der Wundheilung nützlich sind, die umfassen, ein Patchgraft dieser Erfindung auf eine Wunde aufzubringen.
RGD-enthaltende Adhäsionspeptide sind auf diese Weise in klinischen Versuchen eingesetzt worden. Siehe beispielsweise Polarek et al., Wounds: A Compendium of Clinical Research and Practice, 6: 46-53 (1994). Die Integrin-Selektivitäten und Affinitäten der Peptide dieser Erfindung werden in diesem Verfahren auch Vorteile hinsichtlich der Zelltypselektivität und Wirtschaftlichkeit bereitgestellen.
Viele physiologische Ereignisse umfassen eine durch Integrine vermittelte Zellbindung. Folglich sind Peptide, die die Integrin-vermittelte Bindung inhibieren, in Therapien, die darauf gerichtet sind, diese Ereignisse zu regulieren, nützlich und sind tatsächlich für diesen Zweck verwendet worden. Beispielsweise wird die Bindung von Plättchen an Fibrinogen durch das αIIbβ&sub3;-Integrin vermittelt. Auf RGD basierende antithrombotische Verbindungen, die an dieses Integrin binden und die Bindung von Plättchen an Fibrinogen verhindern, befinden sich gegenwärtig in klinischen Versuchen. Siehe z. B. Tschopp et al., Coronary Artery Disease, 4: 809-817 (1993).
Da die Peptide dieser Erfindung an bestimmte Integrine binden, kompetitieren sie in vivo mit RGD enthaltenden Molekülen hinsichtlich der Bindung an Integrine. Werden sie an ein Individuum verabreicht, sind sie nützlich, um das Binden von Integrin-tragenden Zellen an ihre Zielmoleküle in vivo zu verhindern. Diese Erfindung stellt Verfahren bereit, die nützlich sind, um das Binden von Integrin-tragenden Molekülen an RGD-enthaltende Moleküle zu inhibieren, was umfasst, an ein Individuum ein Peptid dieser Erfindung in einer Menge, die wirksam ist, um die Bindung zu inhibieren, zu verabreichen. Insbesondere zieht diese Erfindung in diesen Verfahren die Verwendung von Peptiden mit hoher Bindungsaffinität oder von Peptiden, die für ein oder mehrere Integrine spezifisch sind, in Betracht.
Osteoporose einschließt die Anlagerung von Knochen-abbauenden Osteoklasten an Knochen ein. Die Anlagerung von Osteoklasten an Knochen wird durch αVβ&sub3;-Integrin vermittelt. Siehe z. B. Nesbitt et al., J. Biol. Chem., 268: 16737-45 (1993). Es werden gegenwärtig Behandlungen für Osteoporose entwickelt, die von der Fähigkeit von RGD-Peptiden abhängen, diese Anheftung zu verhindern. Fisher et al., Endocrinology, 132: 1411-1413 (1993). Dementsprechend stellt diese Erfindung Methoden bereit, die zum Inhibieren der Anheftung von Osteoklasten an Knochen nützlich sind und die einschließen, an ein Individuum ein Peptid dieser Erfindung, das an αVβ&sub3;-Integrin bindet, zu verabreichen.
Angiogenese, die Bildung von neuen Blutgefäßen, schließt die Migration von Endothelzellen ein, die von den αVβ&sub3;-Integrinen abhängig ist. Siehe z. B. Brooks et al., Science, 264: 569-571 (1994). Es werden gegenwärtig Behandlungen für Tumore, die auf der Prävention der Angiogenese basieren, entwickelt. Dementsprechend stellt diese Erfindung Verfahren bereit, die zum Inhibieren der Angiogenese nützlich sind und die einschließen, einem Indivduum ein Peptid dieser Erfindung, das an αVβ&sub3;-Integrin bindet, zu verabreichen.
RGD-Peptide inhibieren die Tumormetastasierung. (Siehe z. B. Humphries et al., Cancer Biology, 4: 293-299 (1993)); Hardan et al., Int. J. Cancer, 55: 1023-1028 (1993); Komazawa et al., Carbohyd. Res., 21: 299-307 (1993). Dementsprechend stellt diese Erfindung Verfahren bereit, die zum Inhibieren der Metastasierung von Tumoren, die Integrine exprimieren, nützlich sind und die einschließen, einem Indivduum ein Peptid dieser Erfindung, das an jene Integrine bindet, zu verabreichen. Insbesondere ist das Verfahren auf Tumore gerichtet, die die αVβ&sub3;-Integrine exprimieren.
Neointimale Hyperplasie ist durch die Migration von glatten Muskelzellen aus dem Medium in die Neointima gekennzeichnet. Die Erkrankung ist inhibiert worden, indem αVβ&sub3;-Integrin mit einem RGD-Peptid blockiert worden ist. Siehe z. B. Choi et al., J. Vasc. Surg., S. 125-134 (Januar 1994). Dementsprechend stellt diese Erfindung Verfahren bereit, die zum Inhibieren der Migration von glatten Muskelzellen nützlich sind und die einschließen, einem Individuum ein Peptid der Erfindung, das an αVβ&sub3;-Integrin bindet, zu verabreichen.
Wie hier verwendet, ist ein Individuum ein Vertebrat und insbesondere ein Säugetier, einschließlich eines Menschen.
Die Verabreichung der Peptide in den Verfahren dieser Erfindung muss in einer Menge erfolgen, die wirksam ist, dass das Peptid an Zellen, die das Zielintegrin tragen, bindet. Eine wirksame Menge eines Peptids kann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann, wie in Fig. 1 gezeigt, eine wirksame Menge des beanspruchten Peptids bestimmt werden, indem ein Assay verwendet wird, um die Konzentration zu identifizieren, die erforderlich ist, um die Zellanheftung zu inhibieren.
Allgemein werden die Peptide dieser Erfindung dem Individuum in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht. Pharmazeutisch annehmbare Träger sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt und schließen wässrige Lösungen, wie physiologisch gepufferte Kochsalzlösung, oder andere Lösemittel oder Vehikel, wie Glykole, Glycerol, Öle, wie Olivenöl, oder injizierbare organische Ester ein. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann physiologisch annehmbare Verbindungen enthalten, die beispielsweise wirksam sind, um das Peptid der Erfindung zu stabilisieren oder die Absorption des Peptids zu erhöhen. Solche physiologisch annehmbaren Verbindungen schließen beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Sucrose oder Dextrane, Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Glutathion, Komplexbildner bzw. Chelatbildner, Proteine mit niedrigem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren oder Excipientien ein. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird wissen, dass die Auswahl eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, der eine physiologisch annehmbare Verbindung umfasst, beispielsweise von der Verabreichungsroute des Integrin-bindenden Peptids und von den jeweiligen physikalisch-chemischen Eigenschaften des speziellen Peptids abhängt.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird wissen, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid der Erfindung enthält, an ein Individuum über verschiedene Routen abhängig von dem speziellen pathologischen Zustand verabreicht werden kann. Wenn beispielsweise die Behandlung lokalisiert erfolgt, wie um die Heilung einer Wunde zu induzieren, kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid der Erfindung gekoppelt an einen geeigneten Träger, wie Hyaluronsäure, umfasst, in der geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Formulierung verabreicht werden und topisch verabreicht werden. Siehe z. B. Polarek et al., Wounds: A Compendium of Clinical Research and Practice, 6: 46-53 (1994). Wo eine Behandlung systemisch erfolgt, beispielsweise aufgrund der Anwesenheit eines Krebses in dem Patienten, kann die Zusammensetzung alternativ parenteral, wie intravenös, intramuskulär, subkutan, intraorbital, intrakapsulär, intraperitoneal oder intracisternal, verabreicht werden.
Die gesamte wirksame Menge eines Peptids der Erfindung kann einem Patienten als einzelne Dosis, entweder als Bolus oder durch Infusion über eine relativ kurze Zeitspanne, verabreicht werden oder kann unter Verwendung eines anteilsweisen Behandlungsprotokolls, in dem die Mehrzahl von Dosen über eine längere Zeitspanne hinweg verabreicht wird, verabreicht werden. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird wissen, dass die Konzentration eines Peptids der Erfindung, die benötigt wird, um eine wirksame Dosis in einem Patienten zu erreichen, von vielen Faktoren abhängt, einschließlich des Alters und der allgemeinen Gesundheit des Patienten wie auch der Verabreichungsroute und der Anzahl von Behandlungen, die verabreicht werden sollen. Angesichts dieser Faktoren wird der Fachmann die Dosis so anpassen, dass eine wirksame Dosis für eine bestimmte Verwendung bereitgestellt wird.
Die Erfindung wird jetzt detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.

BEISPIEL I

ISOLIERUNG VON VITRONECTIN UND INTEGRINEN

Vitronectin wurde aus menschlichem Plasma gereinigt, wie in Yatohgo et al. Cell Struct. Funct., 13: 281-292 (1988) beschrieben. Fibronectin aus menschlichem Plasma stammte von Finnish Red Cross. Peptide wurden an einer Synthetisiervorrichtung, Modell 430A, von Applied Biosystems (Foster City, CA) durch Standard-Merrifield-Festphasensyntheseprotokolle und tert.-Butoxycarboylchemie synthetisiert. Peptide wurden nach Freisetzung von dem Harz durch Oxidieren mit 0,01 M K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] in 1 mM NH&sub4;OAc, pH 8, über Nacht bei 25ºC cyclisiert. Nach Entfernen des überschüssigen H&sub2;O durch Rotationsverdampfung wurden die Peptide lyophilisiert und schließlich durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Eine Stammlösung des ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Peptids wurde in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 100 mM hergestellt und wurde in TBS oder Kulturmedium vor einer Verwendung verdünnt. Dimethylsulfoxid allein wurde als Kontrolle in alle Phagen- und Zellanheftungsexperimente aufgenommen. Andere Peptide, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden (in) wässrigen Puffern in einer Konzentration von 5 mM gelöst.
Die αVβ&sub3;-, αVβ&sub5;- und α&sub5;β&sub1;-Integrine wurden aus menschlichen Placentaextrakten, die in TBS-Puffer, der 0,1 M Octylglucosid, Proteinaseinhibitoren und zweiwertige Kationen enthielt, hergestellt worden waren, isoliert (Pytela et al., Methods Enzymol., 144: 475-489 (1987). Die αVβ&sub3;- und α&sub5;β&sub1;-Integrine wurden in Puffer, der 1 mM MnCl&sub2; und 1 mM CaCl&sub2; enthielt, extrahiert und durch Affinitätschromatographie an an Sepharose gekoppeltem GRGDSPK-Peptid [SEQ ID NO: 22] (Pytela et al., Methods Enzymol., 144: 475-489 (1987)) bzw. GAC*RRETAWAC*GA [SEQ ID NO: 6]-Peptid (Koivunen et al., J. Cell. Biol., 124: 373-380 (1994)) isoliert. Das αVβ&sub5;-Integrin wurde aus mit 1 mM CaCl&sub2; hergestellten Extrakten unter Verwendung von Affinitätschromatographie mit Vitronectin isoliert. Es wurde gezeigt, dass das durch die GRGDSPK [SEQ ID NO: 22]-Peptid-Säule gebundene Integrin hauptsächlich αVβ&sub3; war, da die Bindung von markiertem Vitronectin an dieses Integrin durch den spezifischen Antikörper LM609 (Cheresh und Spiro, J. Biol. Chem., 262: 17703-11 (1987)) blockiert wurde. Zusätzlich wurde die Hauptmenge der Phagen-bindenden Aktivität in der αVβ&sub3;-Präparation in Mikrolitervertiefungen, die mit Antikörpern gegen die αV- oder β&sub3;-Untereinheiten beschichtet waren, eingefangen, wie zuvor beschrieben (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993). Das αIIbβ&sub3;-Integrin wurde aus Plättchen, deren Haltbarkeitsdatum abgelaufen war, isoliert (Pytela et al., Science, 231: 1559-1562 (1986)).

BEISPIEL II

FIBRONECTIN-BINDUNGSASSAY

Polyklonale Antikörper gegen die cytoplasmatischen Schwänze der α&sub5;-, αV- und β&sub3;-Untereinheiten wurden durch Immunisieren von Kaninchen mit den beschriebenen synthetischen Peptiden gemäß den von Freed et al., EMBO J., 8: 2955-2965 (1989); von Giancotti et al., Cell, 60: 849-859 (1990); und von Vogel et al., J. Cell Biol., 121: 461-459 (1993) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die immunisierenden Peptide wurden verwendet, um die Antikörper unter Verwendung von Verfahren, die in diesem Fachgebiet wohl bekannt sind, (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) unter Ausnutzung von deren Affinität zu reinigen.
Das α&sub5;β&sub1;-Intergrin wurde an mit α&sub5;-spezifischen Antikörpern beschichtete Vertiefungen gebunden, indem 300 ul eines Placentaextrakts pro Vertiefung in TBS-Puffer, der 0,1 M Octylglucosid, 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2; und Proteinaseinhibitoren enthielt, über Nacht bei 4ºC inkubiert wurden (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-20210 (1993). Alternativ wurde das α&sub5;β&sub1;-Integrin direkt als Beschichtung auf Kunststoff aufgebracht, wie oben beschrieben. Die Vertiefungen wurden mit TBS, das 0,1% NP-40 enthielt, ausgiebig gewaschen. ¹²&sup5;I-markiertes Fibronectin (100000 cpm pro Vertiefung) wurden in Gegenwart von kompetitierenden Peptiden 1 h bei 25ºC in einem 100 ul-Volumen von TBS, das 0,1% NP-40 und 1 mM MnCl&sub2; enthielt, inkubiert, wie von Koivunen et al., J. Biol. Chem. 268: 20205-20210 (1993), beschrieben. Nach wiederholtem Waschen wurde die gebundene Radioaktivität mittels eines Gamma-Zählers quantifiziert.

BEISPIEL III

SYNTHESE VON CYCLISCHEN UND LINEAREN PEPTIDEN

Die cyclischen Peptide GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6] (*CRRETAWAC*) [SEQ ID NO: 12] und GA*CRGDC*LGA [SEQ ID NO: 5] (*CRGDC*) [SEQ ID NO: 37] wurden unter Verwendung einer Synthetisiervorrichtung, Modell 430A, von Applied Biosystems (Foster City, CA) synthetisiert und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Aliquots der cyclischen Peptide wurden durch Reduktion und Alkylierung linearisiert. Kurz zusammengefasst, wurden 5 mg Peptid 1 h bei 37ºC in 0,1 M Tris-Puffer (pH 8), der 8 M Harnstoff und einen 100-fachen molaren Überschuss von Dithiothreitol enthielt, inkubiert. Ein 200-facher molarer Überschuss von Iodacetamid wurde zugesetzt und die Inkubation 30 min im Dunkeln fortgesetzt. Das Peptid wurde ausgiebig gegen Wasser unter Verwendung einer Membran mit 500 Da-Molekulargewichtsausschluss dialysiert. Die Rückgewinnung des Peptids nach der Dialyse war 43%, wie durch UV-Absorption bestimmt wurde.

BEISPIEL IV

KONSTRUKTION UND VERWENDUNG VON PHAGEN-DISPLAY-BIBLIOTHEKEN

Peptidbibliotheken wurden in fuse 5-Vektor (Scott und Smith, Science 249: 386-390 (1990)) konstruiert, wie zuvor beschrieben (Koivunen et al., J. Cell Biol., 124: 373-380 (1994). Die CX&sub5;C-, CX&sub6;C-, CX&sub7;C- bzw. CX&sub9;- [jeweils SEQ ID NOS: 39-42]-Bibliotheken wurden unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden, die Kernsequenzen TGT(NNK)&sub5;TGT, TGT(NNK)&sub6;TGT, TGT(NNK)&sub7;TGT bzw. TGT(NNK)&sub9; [jeweils SEQ ID NOS: 43-46] (N = äquimolare Mischung von A, C, G, T; K = G oder T) enthielten, hergestellt. Die Oligonukleotide wurden durch PCR-Amplifizierung mit 5 Cyclen doppelsträngig gemacht, gereinigt und an den N-Terminus von Gen pIII des fuse 5-Vektors ligiert. MC1061-Zellen wurden mit den CX&sub5;C-, CX&sub6;C-, CX&sub7;C- bzw. CX&sub9;-Vektoren unter Verwendung von 16, 60, 263 bzw. 250 Elektroporationen transfiziert. Die Bakterien wurden 24 h in Gegenwart von 20 ug/ml Tetracyclin kultiviert und Phagen aus dem Überstand durch zweimalige Präzipitation mit Polyethylenglykol gesammelt. Die Phagenpellets wurden zu ungefähr 10¹³ transduzierenden Einheiten (TU) /ml in TBS-Puffer, der 0,02% NaN&sub3; enthielt, gelöst und bei 4ºC gelagert. Die Ausbeuten der CX&sub5;C-, CX&sub6;C-, CX&sub7;C- bzw. CX&sub9;-Primärbibliotheken waren 3,5 · 10&sup8;, 1,1 · 10&sup9;, 4,5 · 10&sup5; bzw. 3,5 · 10&sup8; Klone.
Eine Mischung von Phagen, die 7 · 10¹&sup0;, 2,5 · 10¹¹, 2,5 · 10¹¹ bzw. 4 · 10¹¹ TU aus jeder der CX&sub5;C-, CX&sub6;C-, CX&sub7;C- bzw. CX&sub9;- Bibliotheken enthielt, wurde mit Integrinen gescreent, die als Beschichtung auf Mikrolitervertiefungen aufgebracht worden waren, im wesentlichen wie es beschrieben worden ist (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993)). In dem ersten Panning waren die Integrine in einer Menge von 5 ug pro Vertiefung als Beschichtung aufgebracht und der Bibliothekspool wurde 4 h bei 25ºC in TBS-Puffer, der 1% Rinderserumalbumin und 1 mM MnCl&sub2; (α&sub5;β&sub1;, αVβ&sub3;), 1 mM MgCl&sub2; (αIIbβ&sub3;) oder 1 mM CaCl&sub2; (αVβ&sub5;) enthielt, inkubiert. Phagen, die nach ausgiebigem Waschen gebunden blieben, wurden mit einem Glycinpuffer, H 2,2, eluiert. Jegliche fest bindenden Phagen, die möglicherweise an die Vertiefungen gebunden blieben, wurden eingefangen, indem mit konzentrierten K91kan-Bakterien (Smith et al., Methods Enzymol., 217: 228-257 (1993)) 2 h bei 37ºC inkubiert wurde. Die Bakterien wurden mit dem Eluat niedrigen pHs gemischt und die Phagen wurden amplifiziert. In den nachfolgenden Pannings waren die Integrine in geringeren Konzentrationen (100, 10 und 1 ng pro Vertiefung) als Beschichtung aufgebracht, um Phagensequenzen mit hoher Affinität zu selektieren. Die Phagen wurden ausgehend von zufällig ausgewählten Klonen sequenziert, wie beschrieben (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993)):
Die Bindung von individuellen klonierten Phagen an Integrine wurde in Mikrolitervertiefungen untersucht, wie in Koivunen et al., J. Cell. Biol., 124: 373-380 (1994) beschrieben. Phagen, die an α&sub5;β&sub1; und αVβ&sub3; banden, wurden in TBS-Puffer, der 1% BSA (Rinderserumalbumin) und 1 mM MnCl&sub2; enthielt, untersucht und Phagen, die an αVβ&sub5; banden, wurden in Gegenwart von 1 mM CaCl&sub2; untersucht. Phagen, die gebunden waren, wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, F-Pilus-positive K91kan-Bakterien zu infizieren, bestimmt. Bakterien wurden über Nacht in Mikrolitervertiefungen in Gegenwart von Tetracyclin gezüchtet und die die Bakterienvermehrung anzeigende Absorption wurde bei 600 nm mit einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt.

BEISPIEL V

ZELLANHEFTUNGSASSAY

Dieses Beispiel zeigt die Integrin-bindende Spezifität der Peptide der Erfindung.
Zelllinien, die unterschiedliche Integrine exprimieren, wurden verwendet, um die Peptidinhibition der Integrinfunktion zu untersuchen. Eine menschliche Melanomzelllinie, C8161, eine Fibroblastenzelllinie, WI-38, und eine Osteosarcomzelllinie, MG-63 (beschrieben von Seftor et al., Canc. Res., 53: 3411-3415 (1993); Vogel et al., J. Biol. Chem., 265: 5934-5937 (1990); bzw. Pytela et al. (1985), a.a.O., von denen jede in dieser Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) heften sich an Fibronectin durch das α&sub5;β&sub1;-Integrin an, wie dies auch B2/α27, eine mit menschlichem α&sub5; transfizierte CHO-Zellinie, tut. B2/C1, die CHO-Ausgangskontrollzelllinie (Bauer et al., J. Cell. Biol. 116: 477-487 (1992), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird), heftet sich über αVβ&sub5; an. Die CHO-Zellen C11 und NIH 3T3 exprimieren die endogenen α&sub5;β&sub1;-Integrine aus dem chinesischen Hamser bzw. der Maus. Die menschlichen Melanomzellen A375-M heften sich an Fibronectin sowohl durch α&sub5;β&sub1;- als auch α&sub4;β&sub1;-Integrine an (Mould et al., J. Biol. Chem. 265: 4020-4024 (1990), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird). Die CHO-Zelllinie B2/v7 exprimiert das αVβ&sub1;-Integrin (Zhang et al., J. Cell. Biol. 122: 235-242 (1993), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird). Die Vitronectin-bindenden Integrine αVβ&sub1; und αVβ&sub3; wurden unter Verwendung der Zelllinie HT-29 bzw. IMR-90 untersucht. (Koivunen et al., J. Biol. Chem. 268: 20205-20210 (1993)).
Zelllinien, die Fibronectin-bindende Integrine exprimieren, wurden verwendet, um Peptidaktivitäten gegen diese Integrine in dem Zellanheftungsassay zu bestimmen, der von Ruoslahti et al., Meth. Enzymol., 144: 803-831 (1982), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben worden ist. Fibronectin aus menschlichem Plasma wurde iodiert, wie von Morla und Ruoslahti, J. Cell Biol., 118: 421-429 (1992), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Vitronectin wurde von Telios Pharmaceuticals (San Diego, CA) erhalten. In unterschiedlichen Experimenten wurden Mikrolitervertiefungen entweder mit verschiedenen Konzentrationen von Fibronectin oder Vitronectin oder mit einer Konzentration, die zu 50 bis 70%- der maximalen Anheftung für jeden Zelltyp führte (B2/α27, 2 ug/ml; B2/v7, 4 ug/ml; HT29, 8 ug/ml; IMR90, 1 ug/ml), beschichtet. Peptid wurde als Beschichtung auf Kunststoff aufgebracht, indem bei 37ºC 2 h in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,25% Glutaraldehyd enthielt, um das Peptid zu vernetzen, inkubiert wurde. Freie Bindungsstellen auf dem Kunststoff wurden unter Verwendung von BSA (Rinderserumalbumin) blockiert. Man ließ ungefähr 1 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung sich 1 h in Gegenwart oder Abwesenheit von kompetitierenden Peptiden anheften. Gebundene Zellen wurden durch Anfärben mit 0,1% Amidoschwarz quantifiziert.

BEISPIEL VI (Vergleichsbeispiel)

BESTIMMUNG VON RELATIVEN BINDUNGSAFFINITÄTEN VON PEPTIDEN

Relative Affinitäten der CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12]- und CRGDC [SEQ ID NO: 37]-Peptide wurden durch Inhibition der Bindung von Peptid-präsentierenden Phagen an α&sub5;β&sub1;-Integrin bestimmt. Peptid-präsentierende Phagen wurden konstruiert, wie von Scott und Smith, Science 249: 386-390 (1990), und in Beispiel IV beschrieben. Mikrotiterplatten wurden mit verschiedenen Integrinen beschichtet, wie von Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993) und in Beispiel 11 beschrieben.
Das Binden von CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12]-enthaltenden Peptidliganden an α&sub5;β&sub1;-Integrin wurde, wie folgt, ausgeführt. RRETAWA [SEQ ID NO: 8]-präsentierende Phagen wurden 1 h in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen der cyclischen Peptide, die CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] enthielten und CRGDC [SEQ ID NO: 37] enthielten, in Mikrolitervertiefungen, die mit dem α&sub5;β&sub1;- Integrin beschichtet waren, inkubiert. Die Bindung wurde quantifiziert, indem K91kan-Bakterien direkt den Vertiefungen zugesetzt wurden und die Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur gezüchtet wurden (Smith und Scott, Meth. Enzymol., 217: 228- 257 (1993), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird).
Fig. 4 zeigt die Inhibition von RRETAWA [SEQ ID NO: 8]- präsentierenden Phagen, die an α&sub5;β&sub1;-Integrin binden, durch CRGDC [SEQ ID NO: 37] und CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12]. Das CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12]-Motiv inhibierte mindestens 10-fach effizienter als die Peptide, die CRGDC [SEQ ID NO: 37] enthielten. Ein Kontrollpeptid GRGESP [SEQ ID NO: 23] hatte keine Wirkung.
Zusätzliche Peptidmotive wurden, wie folgt, getestet. ELRGDGW [SEQ ID NO: 4]-präsentierende Phagen wurden zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der cyclischen Peptide, die CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] enthielten und CRGDC [SEQ ID NO: 37] enthielten, in mit dem α&sub5;β&sub1;-Integrin beschichtete Mikrolitervertiefungen gegeben, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und die Bindung an die Vertiefungen quantifiziert. Wie in Fig. 2 gezeigt, inhibieren CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] und CRGDC [SEQ ID NO: 37] die Bindung von ELRGDGW [SEQ ID NO: 4]-präsentierenden Phagen an α&sub5;β&sub1;-Integrin in ungefähr dem gleichen Ausmaß.
Die Fähigkeit von CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] und CRGDC [SEQ ID NO: 37] enthaltenden Peptide, die Bindung von CRGDCL [SEQ ID NO: 7]-präsentierenden Phagen an die mit αVβ&sub3;-Integrin beschichteten Mikrovertiefungen zu inhibieren, wurde ebenfalls untersucht. CRGDCL [SEQ ID NO: 7]-präsentierende Phagen wurden einer Vertiefung zugesetzt und es wurde entweder cyclisches GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6] oder cyclisches GACRGDCLGA [SEQ ID NO: 5] zugesetzt, so das sie um die Bindung kompetitieren konnten. Die Bindung wurde quantifiziert, wie oben beschrieben. Wie in Fig. 3 gezeigt, war das GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6]- Peptid unwirksam, die Bindung von CRGDCL [SEQ ID NO: 7]- präsentierenden Phagen an αVβ&sub3; zu inhibieren, wohingegen das GACRGDCLGA [SEQ ID NO: 5]-Peptid die Bindung vollständig inhibierte.

BEISPIEL VII (Vergleichsbeispiel)

SPEZIFITÄT VON RRETAWA FÜR α&sub5;β&sub1; BEI DER ZELLANHEFTUNG UND BEI DER INHIBIERUNG DER FIBRONECTINBINDUNG

Die obigen Ergebnisse zeigten, dass das RRETAWA [SEQ ID NO: 8]- Motiv hohe relative Bindungsaffinität und -selektivität für α&sub5;β&sub1; zeigte. Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde das RRETAWA [SEQ ID NO: 8]-enthaltende Peptid CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] in zusätzlichen Bindungsassays und in Zellanheftungsassays weiter getestet. Die verwendeten Verfahren sind identisch mit jenen, die oben beschrieben wurden.
Zu Beginn wurde CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] auf seine Fähigkeit, die Bindung von Fibronectin, das der natürliche Ligand für α&sub5;β&sub1; ist, zu inhibieren, hin getestet. Kurz zusammengefasst, wurde ¹²&sup5;I-Fibronectin 1 h in Gegenwart von kompetitierenden Peptiden in Mikrolitervertiefungen, die mit α&sub5;β&sub1; beschichtet waren, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen gewaschen und gebundene Radioaktivität wurde mittels eines Gamma-Zählers bestimmt. Wie in Fig. 1 gezeigt, inhibiert das cyclische CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12]-Peptid die Fibronectinbindung ebenso gut wie das cyclische CRGDC [SEQ ID NO: 37]-Peptid.
Die Inhibition der Zellanheftung, die entweder durch Fibronectin- oder Vitronectin bindende Integrine vermittelt wird, wurde ausgeführt, um die Peptidspezifität in einem biologisch relevanten System zu bestimmen. Die Assays und Zelllinien wurden ausgeführt, wie oben beschrieben. Die Fig. 5 und 6 zeigen die Ergebnisse der durch die Fibronectin bindenden Integrine α&sub5;β&sub1; und αVß&sub1; vermittelten Zellanheftung. Fig. 7 zeigt die Zellanheftung, die durch das Vitronectin bindende Integrin αVβ&sub5;, vermittelt wird.
Die Zellanheftungsinhibitionsassays bestätigen, dass das RRETAWA [SEQ ID NO: 8]-Peptid wirkungsvoller ist, die Bindung an α&sub5;β&sub1; zu inhibieren, als das cyclische CRGDCL [SEQ ID NO: 7]- Peptid (Fig. 5). Die IC&sub5;&sub0; der durch CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] inhibierten α&sub5;β&sub1; vermittelten Zellanheftung an Fibronectin war 3 · 10&supmin;&sup5; M. Das Peptid inhibierte auch die Zellanheftung an ein 110 kDa-Fragment von Fibronectin, das die Zellanheftungsdomäne enthält. Reduktion und Alkylierung der Disulfidbindung verringerten die Aktivität des Peptids um das ungefähr 50- fache. Das Kontrollpeptid GRGESP [SEQ ID NO: 23] hatte keine Auswirkung auf die Bindung (Fig. 5).
Die Ergebnisse in Fig. 5 wurden unter Verwendung von B2/α27- Zellen erhalten, die die menschliche α&sub5;-Untereinheit exprimieren, die ausgehend von einer transfizierten cDNA exprimiert wird. Jedoch wurden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung der menschlichen Zelllinien C8161, MG-63 und WI-38, die allesamt α&sub5;β&sub1; exprimieren, erhalten. Die Anheftung von A375-M-Zellen wurde nur teilweise durch CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] inhibiert, wahrscheinlich da diese Zelllinie andere Fibronectin-bindende Integrine, wie α&sub4;β&sub1;, exprimiert (Mould et al. (1990), a.a.0.). Jedoch konnte CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] die Anheftung von CHO- C11-Zellen oder Maus-NIH-3T3-Zellen an Fibronectin nicht blockieren, was anzeigt, dass das Peptid speziesspezifisch sein könnte.
Wenn es gegen ein anderes Fibronectin-bindendes Integrin, αVβ&sub1;, getestet wurde, war das RRETAWA [SEQ ID NO: 8]-Peptid mehr als 100-mal weniger aktiv als das cyclische RGD-Peptid und ungefähr 40-mal weniger aktiv als ein anderes untersuchtes Integrinbindendes Peptid, CELRGDGWC [SEQ ID NO: 24] (Fig. 6). Schließlich wies das RRETAWA [SEQ ID NO: 8] enthaltende Peptid bei allen getesteten Konzentrationen im wesentlichen keine Aktivität auf, wenn es gegenüber der αVβ&sub5;-Zellanheftung an Vitronectin getestet wurde. In Verbindung mit den oben diskutierten Bindungsdaten zeigen diese Ergebnisse, dass das GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6]-Peptid hohe Aktivität und Selektivität für das α&sub5;β&sub1;-Integrin zeigt.
Zusätzlich zu der Inhibition der Zellanheftung an natürliche Liganden wurden Anheftungs- und Inhibitionsassays unter Verwendung des GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6]-Peptids als Substrat ausgeführt. Die Mikrolitervertiefungen wurden mit GACRRETAWACGA [SEQ ID NO: 6] unter Verwendung von Glutaraldehyd, wie oben beschrieben, beschichtet. Kurz zusammengefasst, wurde Peptid als Beschichtung auf Kunststoff aufgebracht, indem 2 h bei 37ºC in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,25% Glutaraldehyd enthält, inkubiert wurde, um das Peptid zu vernetzen, und freie Bindungsstellen auf dem Kunststoff wurden unter Verwendung von BSA (Rinderserumalbumin) blockiert. Die Vertiefungen wurden dann mit BSA (Rinderserumalbumin) gesättigt, gefolgt von der Zugabe von 50000 B2/α27- oder B2/C1-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit des angegebenen Inhibitors. Die B2/α27-Zellen exprimieren α&sub5;β&sub1;, wohingegen die B2/C1 dies nicht tun. Gebundene Zellen wurden durch Anfärben mit 0,1% Amidoschwarz quantifiziert.
Wie in Fig. 8 gezeigt, förderte das RRETAWA [SEQ ID NO: 8]- enthaltende Peptid die α&sub5;β&sub1;-vermittelte Anheftung (vergleiche die B2/α27-Anheftung mit den B2/C1). Diese Anheftung wurde durch das RRETAWA [SEQ ID NO: 8] enthaltende Peptid (1 mM) wie auch durch CRGDC [SEQ ID NO: 37] (1 mM) und durch EDTA (10 mM) inhibiert. Die αVβ&sub1;-exprimierenden B2/v7-Zellen banden ebenfalls an das Peptid, jedoch war eine Peptidbeschichtungskonzentration von 1 mg/ml erforderlich, um eine signifikante Anheftung zu erzeugen. Zelllinien, die diese Integrine nicht exprimieren oder ein nicht-menschliches α&sub5;β&sub1;-Integrin exprimieren, banden an immobilisiertes CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] nicht.

BEISPIEL VIII (Vergleichsbeispiel)

CRX&sub1;ETX&sub2;WX&sub3;C-PEPTIDE, DIE VON DEM α&sub5;β&sub1;-INTEGRIN ERKANNT WERDEN

Es wurde festgestellt, dass beide Peptide CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] und CRSETYWKC [SEQ ID NO: 25] selektiv das α&sub5;β&sub1;-Integrin binden. Dementsprechend wurde eine Bibliothek von Peptiden, die das beiden gemeinsame Motiv, X&sub4;CRX&sub1;ETX&sub2;WX&sub3;C [SEQ ID NO: 26] aufwiesen, auf eine ähnliche Weise zu den anderen hier beschriebenen Bibliotheken erzeugt und hinsichtlich einer Bindung an das α&sub5;β&sub1;-Integrin getestet. Zweite und dritte Pannings erlaubten die Identifizierung von vielen Peptiden, die für das α&sub5;β&sub1;-Integrin selektiv waren. Siehe Tabelle 1. Eine große Anzahl von diesen enthielt das Motiv CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12], was anzeigt, dass das Motiv die Bindungsfähigkeit sogar bei Einbau verschiedener unterschiedlicher Aminosäuren in exocyclischen Positionen beibehält.

BEISPIEL IX (Vergleichsbeispiel)

RGD UND VERWANDTE PEPTIDE, DIE VON DEM α&sub5;β&sub1;-INTEGRIN ERKANNT WERDEN

Ein Pool der Bibliotheken, die Peptide unterschiedlicher Länge exprimieren, wurde zuerst mit dem α&sub5;β&sub1;-Integrin gescreent. Insgesamt wurden 40 unterschiedliche Sequenzen erhalten, von denen 2, 20 und 18 von den CX&sub5;C-, CX&sub6;C- bzw. CX&sub9;- [SEQ ID NOS: 39, 40 bzw. 42]-Bibliotheken abgeleitet waren (Tabelle 2). Bei Erhöhung der Stringenz des Pannings wurde verstärkt ein Glycinrest an der Position C-terminal zu der RGD-Sequenz festgestellt, wie dies bereits früher festgestellt worden war (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993); Koivunen et al., J. Cell Biol., 124: 373-380 (1994)). Der nächste Rest C-terminal zu Glycin war Tryptophan, Phenylalanin oder eine andere hydrophobe Aminosäure. Die dritte Position C-terminal von RGD wurde ebenfalls häufig durch eine große hydrophobe Aminosäure besetzt. Die am häufigsten vorkommende Sequenz war das CX&sub6;C-Peptid CRGDGWMC [SEQ ID NO: 27], das zehnmal gefunden wurde. Die CX&sub5;C-Sequenz CRGDGWC [SEQ ID NO: 13] wurde achtmal gefunden.
Alle Sequenzen, die von der CX&sub9;-Bibliothek abgeleitet worden waren, enthielten ein anderes Cystein in dem X&sub9;-Abschnitt [alle SEQ ID NO: 42]. In den RGD enthaltenden Peptiden variierte die Lage des zweiten Cysteins und umfasste CX&sub3;CX&sub4;, CX&sub5;CX&sub3;, CX&sub6;CX&sub2;, CX&sub7;CX und CX&sub8;C. Die CX&sub3;CX&sub4;-Sequenz enthielt die CRGDCL [SEQ ID NO: 7]-Sequenz, die wir früher unter Verwendung einer linearen X&sub6;-Bibliothek isoliert hatten (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993)).
Das α&sub5;β&sub1;-bindende Motiv NGR (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993); Koivunen et al., J. Cell Biol., 124: 373- 380 (1994)) wurde in zwei Klonen gefunden. Die Peptide hatten eine CX&sub8;C-Struktur und wiesen Ähnlichkeiten zu der NGRAHA [SEQ ID NO: 28]-Sequenz, die ursprünglich aus der X&sub6;-Bibliothek isoliert worden war, auf (Koivunen et al., J. Biol. Chem., 268: 20205-10 (1993)). Acht CX&sub8;C-Sequenzen, die von der CX&sub9;- Bibliothek abgeleitet worden waren, fehlten die RGD- oder NRG- Motive und wurden nicht weiter untersucht.

BEISPIEL X

SEQUENZEN, DIE DURCH DIE β&sub3;-INTEGRINE SELEKTIERT WERDEN

Eine Hauptanzahl (42 von 50) der Phagensequenzen, die durch das αVβ&sub3;-Integrin selektiert wurden, enthielten die RGD-Sequenz (Tabelle 3). Die meisten von diesen stammten aus der CX&sub7;C- Bibliothek. Zwei Sequenzen waren von der CX&sub9;-Bibliothek abgeleitet und hatten eine CX&sub8;C-Struktur. Im Gegensatz zu den α&sub5;β&sub1;-bindenden Sequenzen war der üblichste Rest C-terminal zu der RGD-Sequenz Serin, aber diese Position wurde auch von vielen anderen Resten, wie Threonin, Alanin oder einer basischen Aminosäure eingenommen. Der nächste Rest in Richtung des C-Terminus war üblicherweise eine große hydrophobe Aminosäure, wie Phenylalanin, aber mehrere andere Aminosäuren wurden ebenfalls an dieser Position gefunden, sogar nach Hochaffinitätsselektion.
Vier Klone wiesen offensichtliche RGD-Homologe auf, bei denen der kleine Glycinrest durch Leucin (3 Klone) oder Serin (1 Klon) substituiert war. Dies umfasst die Peptide CARRLDAPC [SEQ ID NO: 19] und CPSRLDSPC [SEQ ID NO: 20]. Schließlich wurden vier Phagensequenzen isoliert, die das RGD-Motiv nicht enthielten. Die Sequenzen waren hydrophob und zeigten keine klare Homologie zu irgendeiner Sequenz in Vitronectin (Suzuki et al., EMBO J. 4: 2519-2524 (1985)).
Ein Panning mit dem αIIbβ&sub3;-Integrin lieferte Sequenzen, die eine gewisse Ähnlichkeit zu jenen zeigten, die durch αVβ&sub3; selektiert worden waren. Die Sequenzen konnten in zwei Gruppen eingeteilt werden, jene, die das RGD-Motiv enthielten, und jene, die Variationen enthielten, wo der Glycin- oder Argininrest von RGD ersetzt war (Tabelle 4). Das Glycin war durch recht unterschiedliche Aminosäuren, wie Serin, Threonin, Leucin, Alanin, Glutamin, Histidin und Methionin, substituiert, und einigen Sequenzen fehlte das Glycin, so dass sie nur RD aufwiesen. Das KGD-Homolog wurde unter den 35 erhaltenen Sequenzen in einem Phagenklon gefunden.
Die RGD-enthaltenden Sequenzen, die durch αIIbβ&sub3; favorisiert wurden, unterschieden sich von jenen, die durch α&sub5;β&sub1; und αVβ&sub3; selektiert wurden, indem aromatische Reste Trp, Phe oder Tyr an einer Position unmittelbar C-terminal zu der RGD-Sequenz häufiger vorkamen. Zusätzlich enthielten mehrere Sequenzen eine oder zwei basische Reste ausserhalb der RGD-Sequenz.

BEISPIEL XI

SEQUENZEN, DIE DURCH DAS αVβ&sub5;-INTEGRIN SELEKTIERT WERDEN

Die meisten der RGD enthaltenden Sequenzen, die an das αVβ&sub5;- Integrin gebunden waren, stammten aus den CX&sub7;C- und CX&sub9;- Bibliotheken (Tabelle 5). Darüber hinaus hatten alle 18 CX&sub9;- Peptide, die erhalten worden waren, eine CX&sub8;C-Struktur. Die Peptidbindung von αVβ&sub5; war ähnlich zu jener von αVβ&sub3;, indem der Rest C-terminal zu RGD oftmals Serin oder Threonin war und die folgende Position Phenylalanin war. Die RGDSF [SEQ ID NO: 31]- oder RGDTF [SEQ ID NO: 32]-Sequenzen traten in 13 von 39 bestimmten RGD-Sequenzen auf. Es gab keine Anreicherung einer bestimmten Aminosäure in den Positionen N-terminal zu der RGD- Sequenz. Die durch die anderen drei Integrine selektierten Sequenzen zeigten ebenfalls kein Vorherrschen einer bestimmten Aminosäure an diesen Positionen.
Eine Suche für Sequenzen hoher Affinität ergab vier Sequenzen mit dem CRGDC [SEQ ID NO: 37]-Motiv, jede aus der CX&sub7;C-Bibliothek. Diese Sequenzen enthielten zwei zusätzliche Cysteine, was die Anwesenheit von zwei Disulfidbindungen nahelegt. Drei dieser Sequenzen hatten die Struktur CXCRGDCXC [SEQ ID NO: 15] und eine CRGDCCXXC [SEQ ID NO: 33].
Das αVβ&sub5;-Integrin selektierte auch nicht-RGD-Sequenzen, alle aus der CX&sub9;-Bibliothek, die zwei oder drei basische Reste aufwiesen und oftmals auch einen Glutaminrest enthielten. Fünf dieser Sequenzen hatten eine CX&sub8;C-Struktur und eine CX&sub7;CX, aber anderen Fünf fehlte das zweite Cystein. Diese Sequenzen wurden nur nach dem zweiten Panning, nicht aber nach nachfolgenden Pannings gefunden, und die Phagen banden schwach an das Integrin.

BEISPIEL XII

UNTERSUCHUNGEN MIT SYNTHETISCHEN PEPTIDEN IM PHAGENBINDUNGSASSAY

Um zu testen, ob die RGDGW [SEQ ID NO: 9]-Sequenz eine hohe Affinität für α&sub5;β&sub1; hat, wie von den Phagen nahegelegt worden war, synthetisierten wir das cyclische Peptid A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34]. Dieses Peptid, das von der CX&sub5;C-Bibliothek abgeleitet ist, wurde gewählt, da der das Peptid exprimierende Phage unter den besten Bindungspartnern des Integrins war und konsistent höhere Avidität zeigte als Phagen, die die zuvor identifizierten aktiven Bindungssequenzen RRETAWA [SEQ ID NO: 8] und CRGDCL [SEQ ID NO: 7] exprimierten. Das A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34]-Peptid war fünfmal aktiver beim Inhibieren der Bindung von RGD-präsentierenden Phagen an α&sub5;ß&sub1; das *CRGDC* [SEQ ID NO: 37]-Peptid (Fig. 9). Wir synthetisierten auch ein Peptid gemäß einem der RLD-enthaltenden Phagen. Eines der RGD- Homologen, die in dieser Studie gefunden worden waren, das Peptid A*CPSRLDSPC*G [SEQ ID NO: 35], das durch das αVβ&sub3;-Integrin aus der CX&sub7;C-Bibliothek selektiert worden war, band an αVβ&sub3;, nicht aber an α&sub5;β&sub1;. Damit konsistent zeigte das synthetische Peptid A*CPSRLDSPC*G [SEQ ID NO: 35] keine Inhibition der RGD-Phagen-Bindung an α&sub5;β&sub1; (Fig. 9).
Das ACDCRGDCFCG-Peptid [SEQ ID NO: 10] war eines der Peptide mit offensichtlich zwei Sulfidbindungen, die stark an das αVβ&sub5;-Integrin gebunden wurden. Phagenanheftungsexperimente zeigten an, dass die diese s Peptid exprimierenden Phagen präferentiell an das αVβ&sub5;-Integrin banden. Da wir nicht wissen, welche Cysteine miteinander in den Phagen eine Bindung eingehen, wurde kein Versuch unternommen, die Bildung von Disulfidbindungen in dem synthetischen Peptid zu kontrollieren. Eine. Oxidation nach der Freisetzung des Peptids von dem Syntheseharz ergab in der HPLC einen Hauptpeak, der signifikant früher eluierte als das separat der Chromatographie unterworfene nicht-oxidierte Peptid. Dies legt eine homogene Disulfidbindungsbildung des Peptids nahe. Eine Disulfidbindung wird möglicherweise zwischen den Cysteinen, die die RGD-Sequenz flankieren, gebildet, da das *CRGDC* [SEQ ID NO: 37]-Peptid aktiv ist. Eine zweite Disulfidbrücke würde sich dann zwischen den CX&sub7;C-Cysteinen bilden, obwohl wir die Möglichkeit einer Mischung verschiedener Bindungen nicht ausschließen können. Die Massenspektrometrie bestätigte, dass das Peptid tatsächlich zwei Disulfidbindungen enthält.
Das cyclisierte ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Peptid war zehnmal wirkungsvoller als das eine einzelne Disulfidbindung enthaltende Peptid *CRGDC* [SEQ ID NO: 37], die Bindung des RGDenthaltenden Phagen an αVβ&sub5; zu inhibieren (Fig. 10). Die Phagenbindung an αVβ&sub3; wurde durch das ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Peptid fünfmal besser inhibiert als durch *CRGDC* [SEQ ID NO: 37], was anzeigt, dass das ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]- Peptid an beide dieser αV-Integrine bindet. Dimethylsulfoxidlösemittel wurde als Kontrolle aufgenommen und hatte in Konzentrationen bis zu 1% keine Wirkung auf die Phagenbindung.
Weitere Phagenbindungsexperimente zeigten, dass das RLDenthaltende Peptid A*CPSRLDSPC*G [SEQ ID. NO: 35] partielle Selektivität gegenüber dem αVβ&sub3;-Integrin aufweist, dass aber dessen Affinität gering war. In αVβ&sub3;- und αVβ&sub5;-Bindungsassays hatte das Peptid eine 100-fach bzw. 1000-fach geringere Aktivität als *CRGDC* [SEQ ID NO: 37]. Die geringe Affinität könnte zum Teil auf der Neigung des Peptids, bei neutralem pH zu präzipitieren, beruhen.

BEISPIEL XIII

INHIBITION DER ZELLANHEFTUNG MIT SYNTHETISCHEN PEPTIDEN

Zellanheftungsexperimente bestätigten die hohen Affinitäten der RGDGW [SEQ ID NO: 9]- und doppelte Disulfidbindungen enthaltenden Peptide, die aus den Phagenassays gefolgert worden waren. Das A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34]-Peptid war ein starker Inhibitor der α&sub5;β&sub1;-vermittelten Zellanheftung an Fibronectin. A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34] inhibierte die Anheftung von B2/a27-Zellen, die sich an Fibronectin über das α&sub5;β&sub1;-Integrin, gebildet aus menschlichem α&sub5; und CHO-β&sub1;, mit einer IC&sub5;&sub0; von 6 uM anheften; es war siebenmal wirkungsvoller als die *CRGDC* [SEQ ID NO: 37]- (Fig. 11) oder *CRRETAWAC* [SEQ ID NO. 12]- Peptide. Ähnliche Ergebnisse wurden mit MG 63-Zellen erhalten, wo A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34] bei einer IC&sub5;&sub0; von 10 mM inhibierte und viermal wirkungsvoller als *CRRETAWAC* [SEQ ID NO: 12] war. Im Vergleich zu dem linearen Standardpeptid GRGDSP [SEQ ID NO: 21] zeigte A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34] eine ungefähr 50-fache Verbesserung der Aktivität. Bemerkenswerterweise hatte das eine doppelte Disulfidbindung enthaltende ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Peptid eine signifikant verringerte Aktivität gegenüber α&sub5;β&sub1; im Vergleich zu dem kleineren *CRGDC* [SEQ ID NO: 37]-Peptid und war nur geringfügig besser als das lineare GRGDSP [SEQ ID NO: 21]-Peptid. Wie stellten auch ein anderes synthetisches RGDGW-enthaltendes [SEQ ID NO: 9] Peptid, GAC*ELRGDGWC*GA [SEQ ID NO: 36], her, das von der CX&sub7;C [SEQ ID NO: 41]-Bibliothek abgeleitet war (Koivunen et al., J. Cell Biol., 124: 373-380 (1994)). Dieses CX&sub7;C-Peptid war zehnmal weniger aktiv als das kürzere CX&sub5;C [SEQ ID NO: 39]-Peptid.
Das ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Peptid war ein hochgradig wirkungsvoller Inhibitor der αVβ&sub5;-vermittelten Zellanheftung an Vitronectin (Fig. 12). Bei HT-29-Zellen inhibierte das Peptid bei einer IC&sub5;&sub0; von 0,6 uM und hatte eine 40-fach höhere Affinität als die eine einzelne Disulfidbindung enthaltenden Peptide *CRGDC* [SEQ ID NO: 37] und A*CRGDGWC*G [SEQ ID NO: 34]. Ähnliche Ergebnisse wurden mit UCLA-P3-Zellen erhalten, wo ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 19] (IC&sub5;&sub0; = 0,6 mM) eine 20-fache Verstärkung der Aktivität bezogen auf *CRGDC* [SEQ ID NO: 37] zeigte. Dimethylsulfoxid hatte in Konzentrationen, die jenen, die mit dem Peptid zugesetzt wurden, entsprachen, keine Wirkung auf die Zelladhäsion.
Das ACDCRGDCFCG [SEQ ID NO: 10]-Peptid hatte auch eine höhere Affinität für das αVβ&sub3;-Lntegrin als die eine einzelne Disulfidbindung enthaltenden Peptide. Bei einer IC&sub5;&sub0; von 0,2 uM war das Peptid ein 20-fach wirkungsvollerer Inhibitor der Anheftung von IMR-90-Zellen an Vitronectin als *CRGDC* [SEQ ID NO: 37] (Fig. 13). Das RLD-enthaltende cyclische Peptid A*CPSRLDSPC*G [SEQ ID NO: 35] zeigte inhibitorische Aktivität nur bei Konzentrationen über 1 mM.

BEISPIEL XIV

ISOLIERUNG DES α&sub5;β&sub1;-INTEGRINS DURCH PEPTIDAFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE

Adhäsive Peptide oder Adhäsionspeptide sind nützliche Werkzeuge für die Rezeptorreinigung. Beispielsweise kann das lineare Peptid GRGDSPK [SEQ ID NO: 22], gekoppelt an Sepharose, für die Affinitätsreinigung von αVβ&sub3; oder des Plättchenrezeptors αIIbβ&sub3; verwendet werden (Pytela et al., Methods Enzymol., 144: 475-489 (1987)). Obwohl die Peptidsequenz sich von Fibronectin ableitet, bindet das Fibronectinrezeptor-α&sub5;β&sub1;-Integrin an diese Säule mutmaßlich deshalb nicht, weil die Affinität dieser Wechselwirkung ohne zusätzliche Rezeptorkontakte, die in dem natürlichen Liganden vorkommen, zu gering ist. Dies war die erste Demonstration, dass differentielle Affinität für ein Peptid verwendet werden kann, um selektiv ein Integrin zu isolieren.
Das cyclische Peptid GA*CRRETAWAC*GA [SEQ ID NO: 6] bindet spezifisch mit hoher Affinität an α&sub5;β&sub1;. Eine Anwendung dieses Peptids bei der Reinigung von α&sub5;β&sub1; aus menschlichem Placentagewebe durch ein Verfahren, das auf der Vorgehensweise für die Reinigung des Vitronectinrezeptors durch Affinität für das Peptid GRGDSPL [SEQ ID NO: 22] basiert, wird hier beschrieben. Tatsächlich können GRGDSPK [SEQ ID NO: 22]- und GA*CRRETAWAC*GA-Peptid [SEQ ID NO: 6]-Säulen in Tandemanordnung betrieben werden, um gleichzeitig sowohl α&sub5;β&sub1; als auch αvβ&sub3; aus dem gleichen Ausgangsmaterial zu reinigen.
Das α&sub5;β&sub1;-Affinitätsharz wird hergestellt, indem 75 mg GA*CRR- ETAWAC*GA [SEQ ID NO: 6]-Peptid an 5 ml Bromcyan-aktivierte 4B- Sepharose gemäß den Instruktionen des Herstellers (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gekoppelt werden. Das Peptidharz wird in eine Säule von 1 cm Durchmesser gepackt und äquilibriert [in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) mit 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2; und 100 mM Octyl-β-D-glucopyranosid (Calbiochem, La Jolla, CA)]. Das Gewebe wird dreimal durch Zugabe von 400 ml eiskalter TBS, die Proteinaseinhibitoren (1 mM PMSF, 0,5 ug/ml Leupeptin, 0,5 u/ml Pepstatin) enthielt, und 10 minütige Zentrifugation bei 10000 UpM gewaschen. Das gewaschene Gewebe wird mit einem minimalen Volumen (200 ml) eiskaltem Extraktionspuffer [TBS, die 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2;, 100 mM Octyl-β-D-glucopyranosid und Proteinaseinhibitoren enthält] gemischt und 4 h inkubiert. Nach Zentrifugation für 20 min bei 10000 g werden die Überstände vereinigt und über die Peptidsäule, die zuvor in TBS, die 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2; und 100 mM Octyl-β-D-glucopyranosid enthält, äquilibriert worden ist, geleitet. Die Säule wird dann mit 200 ml Waschpuffer [TBS, die 1 mM CaCl&sub2;, 25 mM Octyl-β-D-glucopyranosid und Proteinaseinhibitoren enthält] gewaschen. Für die meisten Zwecke ist eine weitergehende Reinigung nicht erforderlich. Nach einer Dialyse in TBS, die 1 mM MnCl&sub2; und 0,02% NaN&sub3; enthält, kann das Integrin bei 4ºC mindestens einen Monat gelagert werden oder Aliquots können mit flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und bei 80ºC gelagert werden. Die Endausbeute von 100 ug, die durch dieses Verfahren erhalten wird, ist vergleichbar mit anderen Reinigungsverfahren (Pytela et al., Methods Enzymol., 144: 475-489 (1987)]. Die Peptidsäule kann durch Waschen mit 100 ml 8 M Harnstoff, 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, gefolgt von ausgiebigem Waschen mit Lagerungspuffer [TBS, die 0,02% NaN&sub3; enthält] regeneriert werden.
Der Vorteil einer Verwendung von Peptiden gegenüber natürlichen Liganden für die Affinitätsreinigung von Integrinen besteht in den geringeren Kosten und dem Potential für eine bessere Reinigung, das aus der Eliminierung anderer Bindungsstellen resultiert, wie jenen, die potentiell in den Typ III-Wiederholungseinheiten ("repeat units") des zuvor für die Reinigung verwendeten Fibronectin-Fragments vorhanden sind. Auf Integrin- Antikörpern basierende Affinitätsreinigungen sind ebenfalls verwendet worden (Koivunen et al., J. Cell. Biol., 124: 373-380 (1994)), sie sind aber auch teuer und selektieren im allgemeinen nicht gegen inaktivierte Integrine. Nowlin et al., J. Biol. Chem., 268: 20352-59 (1993), beschrieben unlängst ein cyclisches Pentapeptid RCD (ThioP)C [SEQ ID NO: 29], das β&sub4;β&sub1; und α&sub5;β&sub1; mit hoher Affinität bindet, und zeigten, dass es verwendet werden konnte, um diese beiden Integrine zu reinigen. Im Gegensatz dazu scheint das cyclische Peptid CRRETAWAC [SEQ ID NO: 12] für α&sub5;β&sub1; selektiv zu sein. Die Nützlichkeit von adhäsiven Peptiden oder Adhäsionspeptiden für die Reinigung von Integrinen wird wahrscheinlich zunehmen, wenn Peptide mit neuen Spezifitäten entdeckt werden. Tabelle 1. Phasensequenzen, die durch das α&sub5;β&sub1;-Integrin gebunden werden.
Es sind zwei Phagensequenzen gezeigt, die das RXET-Motiv enthalten, das ursprünglich aus der CX&sub7;C-Bibliothek isoliert worden ist. Basierend auf den gemeinsamen Resten in diesen Sequenzen wurde eine Bibliothek, die XCRXETXWXC-Peptide präsentiert, konstruiert, wo X eine variable Aminosäure ist. Die Bibliothek wurde mit dem als Beschichtung auf Kunststoff aufgebrachten α&sub5;β&sub1;-Integrin mit unterschiedlichen Konzentrationen durchmustert und zufällig ausgewählte Klone wurden nach der zweiten und dritten Panning-Runde sequenziert. Tabelle 2. Phagensequenzen, die durch das α&sub5;β&sub1;-Integrin gebunden werden.
Eine Mischung der CX&sub5;C-, CX&sub6;C- und CX&sub9;-Peptide exprimierenden Bibliotheken wurde mit α&sub5;β&sub1; gescreent. Die Sequenzen stammen von zufällig ausgewählten Klonen nach dem zweiten, dritten und vierten Panning. Die Anzahl von Klonen, die das gleiche Peptid kodieren, ist in Klammern gezeigt. Die RGD- und NGR-Motive sind in Fettdruck gezeigt. Tabelle 3. Phagensequenzen, die durch das αVβ&sub3;-Integrin gebunden werden.
Ein Pool der CX&sub5;C-, CX&sub6;-, CX&sub7;C- und CX&sub9;-Bibliotheken wurde mit dem Integrin durchmustert und zufällig gepickte Klone wurden sequenziert. Die RGD-Motive sind in Fettdruck gezeigt und die RGD-Homologen sind unterstrichen. Tabelle 4. Phagensequenzen, die durch αIIbβ&sub3;-Integrin selektiert werden.
Eine Mischung der CX&sub5;C-, CX&sub6;C- und CX&sub7;C-Bibliotheken wurde mit dem als Beschichtung auf Kunststoff aufgebrachten Integrin einem Panning unterzogen, wie in Material und Methoden beschrieben. Das RGD-Motiv ist in Fettdruck gezeigt und dessen Homologe sind unterstrichen. Tabelle 5. Phagensequenzen, die durch das αVβ&sub5;-Integrin gebunden werden.
Es wurde ein Pool der CX&sub5;C-, CX&sub6;C-, CX&sub7;C- und CX&sub9;-Bibliotheken verwendet. Das RGD-Motiv ist in Fettdruck gezeigt. Die basischen Reste und Glutamine in den CX&sub9;-nicht-RGD-Peptiden sind unterstrichen.
Obwohl die Erfindung detailliert unter Bezugnahme auf die obigen Beispiele beschrieben worden ist, versteht es sich, dass verschiedene Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne von dem Geist der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend wir die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: La Jolla Cancer Reserach Foundation
(ii) Titel der Erfindung: NEUE INTEGRIN-BINDENDE PEPTIDE
(iii) Anzahl der Sequenzen: 46
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Campbell and Flores
(B) STRASSE: 4370 La Jolla Village Drive, Suite 700
(C) ORT: San Diego
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) POSTLEITZAHL: 92122
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DERZEITIGE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENR:
(B) ANMELDETAG: 22. November 1994
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) PRIORITÄTSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/158,001
(B) ANMELDETAG: 24. November 1993
(viii) INFORMATIONEN ZUM ANWALT:
(A) NAME: Hook, Gregory R.
(B) REGISTERNUMMER: 38,701
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: FP-LA 1220
(ix) KOMMUNIKATIONSDATEN:
(A) TELEFONNR: (619) 535-9001
(B) TELEFAXNR: (619) 535-8949
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 5
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung = "Xaa = eine Aminosäure mit hydrophober, aromatischer Seitenkette." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 1
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = Rest, der in der Lage ist, eine Ringschluss-Bindung zu bilden."
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 3
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = Rest, der in der Lage ist, eine Ringschluss-Bindung zu bilden."
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 7
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = Rest, der in der Lage ist, eine Ringschluss-Bindung zu bilden."
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 9
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = Rest, der in der Lage ist, eine Ringschluss-Bindung zu bilden."
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 2
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = 1 bis 5 Aminosäuren."
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 8
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = 1 bis 5 Aminosäuren." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 4
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = (ThioP)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 6
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "Xaa = hydrophobe, aromatische Aminosäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 40:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: beide (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: repeat-region
(B) LAGE: 4..18
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "N = äquimolare Mischung von A, C, G, T; K = G oder T."
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
TGTNNKNNKN NKNNKNNKTG T 21
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: repeat-region
(B) LAGE: 4..21
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "N = äquimolare Mischung von A, C, G, T; K = G oder T."
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
TGTNNKNNKN NKNNKNNKNN KTGT 24
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: repeat region
(B) LAGE: 4..24
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "N = äquimolare Mischung von A, C, G, T; K = G oder T."
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
TGTNNKNNKN NKNNKNNKNN KNNKTGT 27
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: repeat-region
(B) LAGE: 4..30
(C) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung: "N = äquimolare Mischung von A, C, G, T; K = G oder T."
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
TGTNNKNNKN NKNNKNNKNN KNNKNNKNNK 30

Claims

1. Peptid, das an ein Integrin bindet und die Sequenz X&sub1;X&sub2;X&sub3;RGDX&sub4;X&sub5;X&sub6; (SEQ ID NO: 3) enthält, wobei X&sub1;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub6; an der Bildung von zwei Brücken beteiligt sind und X&sub2; und X&sub5; 1 bis 5 Aminosäuren sind und wobei das Peptid an αvβ&sub3; oder αvβ&sub5; bindet.

2. Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid an αvβ&sub3; und αvβ&sub5; bindet.

3. Peptid nach Anspruch 1, wobei die zwei Brücken, die durch X&sub1;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub6; gebildet werden, Disulfidbrücken, Peptidbindungen oder Lactambindungen sind.

4. Peptid nach Anspruch 1, wobei die Sequenz X&sub1;X&sub2;X&sub3;RGDX&sub4;X&sub5;X&sub6; (SEQ ID NO: 3) CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15), CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 16), CDCRGDCLC (SEQ ID NO: 17) oder CLCRGDCIC (SEQ ID NO: 18) ist.

5. Verfahren zur Isolierung eines αv-enthaltenden Integrins aus einer Probenmischung, bei dem man die Probenmischung mit einem Peptid nach Anspruch 1 unter ionischen Bedingungen kontaktiert, um das Binden des Integrins an das Peptid zu ermöglichen, und bei dem man das Integrin vom Peptid trennt.

6. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Anheftung von Zellen an ein Substrat, das das Binden des Peptids an ein Substrat und das Inkontaktbringen des Substrats mit den Zellen umfaßt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, bei dem das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.

8. Vorrichtung, die ein Peptid nach Anspruch 1 umfaßt, das an eine Oberfläche eines Substrats angeheftet ist.

9. Vorrichtung, die ein Peptid nach Anspruch 1 umfaßt, das an eine Oberfläche eines implantierbaren Prosthetikums angeheftet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei das implantierbare Prosthetikum ein prosthetisches Blutgefäß oder ein vaskuläres Transplantat ist.

11. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer medizinischen Vorrichtung zur Anziehung von Zellen an die Oberfläche eines implantierbaren Prosthetikums, die das Anheften des Peptids an die Oberfläche des implantierbaren Prosthetikums umfaßt.

12. Hauttransplantat, das ein Peptid nach Anspruch 1 umfaßt, das an eine Trägermatrix angeheftet ist.

13. Hauttransplantat nach Anspruch 12, wobei die Trägermatrix Kollagen, Glycosaminoglycan oder Proteoglycan umfaßt.

14. Hauttransplantat nach Anspruch 12, wobei das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.

15. Hauttransplantat nach Anspruch 14, wobei die Trägermatrix Kollagen, Glycosaminoglycan oder Proteoglycan umfaßt.

16. Verwendung eines Hauttransplantats nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Wundheilung.

17. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Anlagerung von Osteoklasten an Knochen.

18. Verwendung nach Anspruch 17, bei der das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.

19. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Angiogenese.

20. Verwendung nach Anspruch 19, bei der das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.

21. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Metastasierung eines Tumors, der αvβ&sub3; und αvβ&sub5; Integrine exprimiert.

22. Verwendung nach Anspruch 21, bei der das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.

23. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Migration glatter Muskelzellen.

24. Verwendung nach Anspruch 23, bei der das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.

25. Verfahren zum Anheften von Zellen an ein Substrat in vitro, das das Binden eines Peptids nach Anspruch 1 an ein Substrat und das Inkontaktbringen des Substrats mit den Zellen umfaßt.

26. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid umfaßt, das an ein Integrin bindet und die Sequenz X&sub1;X&sub2;X&sub3;RGDX&sub4;X&sub5;X&sub6; (SEQ ID NO: 3) enthält, wobei X&sub1;, X&sub3;, X&sub4; und X&sub6; an der Bildung von zwei Brücken beteiligt sind und X&sub2; und X&sub5; 1 bis 5 Aminosäuren sind und wobei das Peptid an αvβ&sub3; oder αvβ&sub5; bindet.

27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, bei der das Peptid an αvβ&sub3; und αvβ&sub5; bindet.

28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, bei der das Peptid CX&sub2;CRGDCX&sub5;C (SEQ ID NO: 15) ist.