DE69011102T2 - Hydrophobe bindungsstelle für adhäsionspeptide. - Google Patents

Hydrophobe bindungsstelle für adhäsionspeptide.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft aktive Adhäsionspeptide, die eine RGD enthaltende, die Zellanheftung fördernde Bindungsstelle und eine hydrophobe Domäne zur Erleichterung ihrer Anheftung an ein festes Substrat umfassen.
  • Eine Vielzahl von Assays und Reinigungsverfahren erfordern, daß ein Ligand wie ein Peptid auf einem festen Träger immobilisiert wird. Im allgemeinen sind für diese Immobilisierung zwei Verfahren angewendet worden. Das Peptid kann auf die Oberfläche in Lösung aufgebracht werden, welche anschließend verdampft wird, wodurch das Peptid in getrockneter Form auf der Oberfläche verbleibt. Eine derartige, nicht-spezifische Anheftung ist für kleine Peptide unwirksam und lediglich bei Verfahren anwendbar, die keine hohe Konzentration des immobilisierten Peptids erfordern, da sich nachfolgend ein großer Teil in Gegenwart einer Lösung wieder löst. Darüber hinaus werden die Peptide aufgrund der nicht-spezifischen Anheftung in zufälligen und variablen Orientierungen angeheftet. Wenn die Präsentation einer bestimmten aktiven Stelle entscheidend ist, kann die Spezifität des gebundenen Peptids durch eine solche Varianz weiter verringert werden.
  • Bei dem häufiger angewendeten zweistufigen chemischen Kopplungsverfahren wird die feste Oberfläche zunächst in passiver Weise mit einem großen Protein wie einem Immunglobulin oder dem bovinen Serumalbumin beschichtet. Ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat oder Glutaraldehyd wird an das Protein angeheftet und zum Einfangen des Peptids aus der Lösung verwendet. Ein derartiges Verfahren wird trotz erheblichen Zeitbedarfs gegenwärtig angewendet, beispielsweise bei Zellkulturverfahren, die eine hohe Konzentration eines gebundenen Peptids erfordern.
  • Es ist nunmehr erkannt worden, daß viele Zell-Zell- und Zell- Matrix-Wechselwirkungen von einer Arginin-Glycin-Asparginsäure (Arg-Gly-Asp oder RGD)-Aminosäuredomäne vermittelt werden, die verschiedenen Adhäsionsproteinen gemeinsam ist. Diese Bindungsstelle wird von Rezeptoren erkannt. Synthetische Peptide, die eine derartige Domäne enthalten, können in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Beschichtung von Gewebekulturplatten oder Prothesen und der Immobilisierung zum Zwecke der Reinigung von Adhäsionsrezeptoren in einer Säule. Das Erreichen der Anheftung eines RGD enthaltenden Peptids an das feste Substrat bereitet dieselben Probleme, wie sie bei anderen Peptiden auftreten. Da die Adhäsionsdomäne klein ist, ist es zusätzlich wichtig, daß die Domäne für Liganden zugänglich ist, wie durch Verwendung einer Spacer-Gruppe, um eine Distanz zwischen dem Tripeptid und der zu beschichtenden Oberfläche zu schaffen. Darüber hinaus ist es im Falle der in vivo Verwendung der Beschichtung wie bei einer Prothese wichtig, daß die Beschichtungen in keiner Weise immunogen und zytotoxisch sind.
  • Es besteht daher ein Bedarf an einem schnellen und reproduzierbaren einstufigen Verfahren zur Anheftung von Peptiden wie RGD enthaltenden Peptiden an eine feste Oberfläche. Idealerweise sollte ein derartiges Verfahren leicht ausführbar und effizient sein. Zusätzlich sollte es vorzugsweise zu einer geeigneten Präsentation der entscheidenden Epitope wie der RGD-Domäne führen. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und bietet gleichermaßen damit zusammenhängende Vorteile.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Mit der Erfindung werden ein Verfahren zur Anheftung aktiver, RGD enthaltender Adhäsionspeptide an eine Oberfläche durch eine hydrophobe Domäne unter Beibehaltung ihrer Aktivität, sowie auf diese Weise angeheftete Peptide bereitgestellt. Die hydrophobe Domäne kann entweder hydrophobe Aminosäuren wie Leucin, Valin, Isoleucin oder Phenylalanin, oder Fettsäuren wie beispielsweise Myristinsäure, Palmitinsäure, Arachinsäure, oder andere Fettsäuren oder hydrophobe Reste enthalten. Zusätzlich können Spacer wie Aminosäuren zwischen der hydrophoben Domäne und der biologisch aktiven Domäne die Präsentation der biologisch aktiven Stelle verbessern. Spezifische Peptide der Erfindung schließen
  • GRGDSPASSKG&sub4;SRL&sub6;RNH&sub2;,
  • GRGDSPASSKS&sub3;RL&sub6;RNH&sub2;, und
  • GRGDSPASSKSSKRL&sub6;RNH&sub2; ein.
  • Gekoppelt an eine feste Oberfläche können derartige Peptide verwendet werden, um die Anwesenheit eines Liganden nachzuweisen, der komplementär gegenüber einer RGD enthaltenden Adhäsionsstelle ist.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von hydrophoben Anheftungsdomänen wie hydrophobe Aminosäuren oder Fettsäuren bei Peptiden mit einer RGD enthaltenden, die Zellanheftung fördernden Bindungsstelle zur Erleichterung der Anheftung des Peptids an feste Substrate. Derartige Verfahren der spezifischen Anheftung von synthetischen Peptiden unter Anwendung hydrophober Domänen sind geeignet zur Lokalisierung eines breiten Bereichs synthetischer Peptide mit diesen RGD enthaltenden Adhäsionsstellen auf einer Vielzahl von Oberflächen. Das Verfahren, mit welchem das herkömmliche zweistufige chemische Kopplungsverfahren umgangen wird, stellt ein schnelles und reproduzierbares Verfahren zur Präsentation der RGD-aktiven Stelle dar zur Bindung von sowohl mit spezifischen Rezeptoren als auch mit spezifischen Zelltypen. Darüber hinaus kann die Beschichtung relativ nicht- immunogen und nicht-zytotoxisch sein, insbesondere, wenn natürlich vorkommende Aminosäuren und Fettsäuren verwendet werden.
  • RGD ist bekannt dafür, daß es die Bindungsstelle verschiedener extrazellulärer Matrixproteine wie Fibronektin umfaßt. Auf ein Substrat aufgezogene, RGD enthaltende Peptide fördern die Zellanheftung. Alternativ inhibieren RGD enthaltende Peptide in löslicher Form die Anheftung oder fördern das Ablösen von Zellen von einem Substrat. Der Argininrest kann in der D- oder L-Konfiguration vorliegen. Vgl. US-Patente Nrn. 4 578 079, 4 616 517 und 4 792 525 sowie 738 078, auf die hiermit Bezug genommen wird.
  • Ein aktives Adhäsionspeptid wird hergestellt, das eine RGD enthaltende, die Zellanheftung fördernde Bindungsstelle und eine hydrophobe Anheftungsdomäne, vorzugsweise am Carboxyterminus der interessierenden biologisch aktiven Stelle umfaßt, wobei die Hydrophobizität zwischen denjenigen liegt, die durch die Aminosäuresequenzen L&sub4; und L&sub6; ausgedrückt werden, wobei das Adhäsionspeptid eine Beschichtung fester Oberflächen bildet, wenn es aus einer Lösung in eine wäßrige Umgebung überführt wird.
  • Die hydrophobe Domäne kann entweder multiple hydrophobe Aminosäurereste wie Leucin, Valin, Isoleucin oder Phenylalanin, oder Fettsäuren wie Myristat CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub2;COO&supmin;, Palmitat CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub4;COO&supmin;, Arachidat CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub8;COO&supmin;, etc., umfassen. Andere hydrophobe chemische Reste können ebenfalls eingesetzt werden, einschließlich nicht-natürliche oder nicht-biologische Aminosäuren und andere organische oder anorganische Verbindungen. Nach einer Ausführungsform umfaßt die hydrophobe Domäne multiple Leucinreste wie L&sub6;NH&sub2; oder L&sub4;NH&sub2;. Alternativ können Aminosäuresequenzen wie Phenylalanin, Isoleucin oder Valin verwendet werden.
  • Um eine zur Erleichterung der Anheftung ausreichende Hydrophobizität zu schaffen, muß die hydrophobe Anheftungsdomäne mindestens die Hydrophobizität der Sequenz L&sub4; besitzen. Der hier verwendete Begriff "hydrophobe Anheftungsdomäne" bezieht sich auf eine Domäne mit einer Hydrophobizität, die gegenüber der durch die Aminosäuresequenz L&sub4; ausgedrückte Hydrophobizität mindestens äquivalent ist.
  • Die Addition von Spacersequenzen von etwa zwei bis vier Aminosäuren zwischen der RGD enthaltenden, die Zellanheftung fördernden Bindungsstelle und der hydrophoben Domäne kann die Präsentation der RGD enthaltenden Adhäsionsstelle verbessern. Diese Spacer können Aminosäuren wie beispielsweise Glycin oder Serin sein. Vorzugsweise wird mehr als ein Rest verwendet, wie S&sub2;, S&sub3; oder G&sub4;. Zusätzlich können andere organische Verbindungen wie Zucker oder andere Kohlenstoff enthaltende, nicht-hydrophobe Reste verwendet werden.
  • Eine weniger spezifische Zellanheftung kann erreicht werden unter Verwendung bestimmter positiv geladener Aminosäuren, von denen bekannt ist, daß sie die Anheftung fördern, wie Arginin, Lysin, Homoarginin oder Ornithin als Anheftungsstelle in Kombination mit der hydrophoben Anheftungsdomäne. Beispielsweise ist sowohl für R&sub6;GL&sub6;NH&sub2; als auch für RL&sub6;RNH&sub2; gezeigt worden, daß sie eine gewisse, die Zellanheftung fördernde Aktivität aufweisen.
  • Wenn sich das Peptid in Lösung befindet, kann es zur Beschichtung von Oberflächen wie Gewebekulturvorrichtungen, prothetischen Implantaten, Säulen für die Zell- oder Rezeptorisolation und Oberflächen für ELISA-Verfahren eingesetzt werden. Die Oberflächen können hydrophob oder hydrophil sein. Die hydrophobe Domäne wird an derartigen Oberflächen spontan haften, wenn sie aus einer Lösung in eine wäßrige Umgebung überführt wird. Eine umfassendere Peptidbeschichtung kann erreicht werden durch Trocknung der Peptidlösung auf der Oberfläche. Geeignete Oberflächen schließen Millicell -CM, Immobilon , Polystyrol, Polycarbonat, Teflon (Polytetrafluorethylen), Silikon, Polyurethan, Polymilchsäure, Titan, Polyethylen, Gortex-expandiertes Polytetrafluorethylen, Zahndentin und -zement ein.
  • Wenn das Peptid eine die Zellanheftung fördernde Aktivität aufweist, liefert das Verfahren verbesserte Mittel für die Zellkultur unter serumfreien Bedingungen. Dieses Verfahren ist ebenfalls anwendbar für prothetische Vorrichtungen, bei denen es erwünscht ist, daß sie über Zellen verfügen, die an dem Implantat haften. Zusätzlich kann durch Reproduktion einer natürlichen extrazellulären Matrixbindungsstelle auf dem Substrat die Herstellung zellulärer Proteine gesteigert werden, die ein derartiges Substrat erfordern.
  • Im Falle der Kopplung an eine Oberfläche können die erfindungsgemäßen Peptide vorteilhaft zum Nachweisen oder Isolieren von Liganden verwendet werden, die gegenüber einer RGD enthaltenden Adhäsionsstelle komplementär sind. Derartige Liganden können einer großen Vielzahl von Typen angehören. Die Verwendung einer hydrophoben Anheftungsdomäne in Verbindung mit einer RGD-Bindungsstelle erleichtert das Nachweisen und Isolieren von Rezeptoren, die die RGD-Stelle erkennen. Die Anwesenheit des an die RGD enthaltende Adhäsionsstelle gebundenen Liganden kann mit Hilfe einer Vielzahl von Verfahren bestimmt werden, wie durch Verwendung eines markierten anti-Ligandantikörpers. Derartige Substanzen und Marker sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Die Verwendung natürlich vorkommender Aminosäuren oder Fettsäuren wird gegenüber anderen hydrophoben Resten bei der Beschichtung von Prothesen bevorzugt, die beim Menschen eingesetzt werden sollen, da sie relativ nicht-immunogen und nicht-toxisch sind.
  • Die folgenden Standardabkürzungen werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung zur Identifizierung der Aminosäurereste verwendet. Tabelle I Aminosäure Abkürzung mit drei Buchstaben Abkürzung mit einem Buchstaben Alanin Arginin D-Arginin Asparagin Asparginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin nMe bezieht sich auf eine n-Methylgruppe.
  • Sämtliche Aminosäuren liegen in der L-Konfiguration vor, sofern nichts anderes angegeben ist.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, aber nicht der Beschränkung der Erfindung.
    • Beispiel I Herstellung der Peptide
  • Die Peptide wurden hergestellt unter Verwendung eines automatischen Peptid-Synthesizers (Modell 430A, Applied Biosystems, Foster City, CA) nach den Anweisungen des Herstellers, und sie wurden gereinigt durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Biogel TSK SP-5-PW Kationenaustauschsäule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).
    • Beispiel II Anheftung von Peptiden
  • Die folgenden Peptide wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur spontanen Adhärenz an Kunststoffwände und der nachfolgenden Förderung einer Zellanheftung untersucht: XG(R)GDSPASSKL&sub2;NH&sub2;, XG(R)GDSPASSKL&sub4;NH&sub2;, XG(R)GDSPASSKL&sub6;NH&sub2;, XG(R)GDSPASSK&sub6;, XG(R)GDSPASSE&sub6;, bei denen X NH&sub2;, nMe, Acetyl oder eine andere Aminosäure bezeichnet. Die Peptide wurden gelöst in 70% EtOH in einer Ausgangskonzentration von 1 mg/ml. Anschließend wurden 200 ul doppelt in die ersten beiden Vertiefungen von Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen gegeben, die nicht für eine Gewebekultur behandelt worden waren. Die verbleibenden Vertiefungen enthielten 100 ul 70% EtOH. Nach Entnahme von 100 ul der 1 mg/ml Lösung aus den ersten beiden Vertiefungen wurde eine Reihenverdünnung durchgeführt bis zu 0,15 ug/Vertiefung für jedes Peptid. Man ließ die Platten über Nacht bei 37ºC in Gegenwart eines Exsikkators trocknen.
  • Am darauf folgenden Tag wurden die mit dem Peptid beschichten Platten für einen standardisierten Anheftungsassay gemäß Beispiel III verwendet, bei dem MG-63 Zellen eingesetzt wurden, die von einer Osteosarkom-Zellinie stammen, die bei der American Type Tissue Culture erhältlich ist.
    • Beispiel III Zellanheftungsassay
  • Die Platten wurden einmal mit PBS (150 mM NaCl/10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4) gewaschen. Die Platten wurden mit DMEM (0,1 ml/Vertiefung), das bovines Serumalbumin (BSA 2,5 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, eine Stunde lang inkubiert. 2 10&sup5; Zellen/ml (MG-63) wurden in DMEM und BSA (2,5 mg/ml) suspendiert. 100 ul der Zellsuspension wurden pro Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden eine Stunde lang bei 37ºC bei 7,5% CO&sub2;/92,5% Luft inkubiert. Anschließend wurden die Platten einmal mit PBS gewaschen. Die angehefteten Zellen wurden sodann mit 3% Paraformaldehyd fixiert und über Nacht mit 1% Toluidinblau in 10% Formaldehyd gefärbt. Am darauf folgenden Tag wurde die überschüssige Färbeflüssigkeit entfernt, und die Platten wurden mit H&sub2;O gewaschen. Anschließend wurden jeder Vertiefung 100 ul einer 1%igen Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung zugegeben. Im Anschluß wurde das Ausmaß der Zellanheftung gemessen durch Verwendung eines kinetischen Mikroplattenlesers (Molecular Devices) und Ermittlung der optischen Dichte bei 630 nm.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. XG(R)GDSPASSKL&sub6;NH&sub2; führte bis zu einer Konzentration von 3 ug/Vertiefung zu einer signifikanten Förderung der Zellanheftung. XG(R)GDSPASSKL&sub4;NH&sub2; führte lediglich in der höchsten Konzentration von 100 ug/Vertiefung zu einer marginalen Förderung der Zellanheftung. Die anderen Peptide nMeG(dR)GDSPASSKL&sub2;NH&sub2;, nMeG(dR)GDSPASSK&sub6; und nMeG(dR)GDSPASSE&sub6; führten zu keiner signifikanten Förderung der Zellanheftung (Tabelle II). Tabelle II ug/Vertiefung Peptid
  • Die Werte bezeichnen die maximale Bindung in Prozent.
    • Beispiel IV Phenylalanin als hydrophober Träger
  • Die hydrophobe Anheftung RGD enthaltender Peptide kann mit anderen hydrophoben Aminosäuren erreicht werden. Das folgende Peptid nMeG(dR)GDSPASSKRF&sub4;RNH&sub2; wurde in 70% EtOH gelöst und in einem Anheftungsassay gemäß Beispiel III eingesetzt. Dieser Versuch zeigte auch den Anstieg der Zellbindung durch Verwendung eines S&sub3;-Spacers an einem RF&sub6;RNH&sub2;-Ende. GRGESPS&sub8;L&sub6;NH&sub2; wurde als negative Kontrolle verwendet, da RGE dafür bekannt ist, daß es keine Zellbindungsaktivität aufweist. Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Tabelle III Phenylalanin als hydrophobe Domäne ug/Vertiefung
  • Die Werte bezeichnen die maximale Bindung in Prozent
    • Beispiel V Myristinsäure als hydrophober Träger
  • Fettsäuren können ebenfalls zur Förderung der hydrophoben Anheftung von RGD enthaltenden Peptiden verwendet werden. Myristinsäure wurde angeheftet an das Peptid nMeG(dR)GDSPASSK über die ε-Aminogruppe des Lysins. Die Zellanheftungsaktivität wurde in den Beispielen II und III bestimmt. Tabelle IV Myristinsäure
  • Die Werte bezeichnen die maximale Bindung in Prozent.
    • Beispiel VI
  • Die Zellanheftung kann ferner gefördert werden durch alleinige Verwendung einer positiven Ladung an einem hydrophoben Ende, wie bei dem Peptid R&sub6;GL&sub6;. Die Kunststoffvertiefungen wurden mit dem Peptid wie in Beispiel II beschichtet und in dem Assay des Beispiels III eingesetzt. Tabelle V ug/Vertiefung
  • Die Werte bezeichnen die maximale Bindung in Prozent.
    • Beispiel VII
  • Die Addition von Aminosäure-Spacern zwischen die hydrophobe Domäne in der RGD-Bindungsstelle verbessert die Präsentation des RGD-Peptids für die Zellbindung. Die Kunststoffvertiefungen wurden mit dem Peptid gemäß Beispiel II vier Stunden lang beschichtet. Tabelle VI Peptide ug/Vertiefung
  • Die Werte bezeichnen die maximale Bindung in Prozent.
    • Beispiel VIII
  • Phosphatidylcholin-Liposomen, in die Oberflächenrezeptoren eingeschlossen sind, wurden im wesentlichen hergestellt nach dem Verfahren von Mimms et al., Biochemistry, 20:833 (1981), worauf hiermit Bezug genommen wird. Der Vitronectin-Rezeptor und IIb/IIIa wurden aus der Plazenta isoliert nach dem Verfahren von Pytela, Meth. Enzym., 144:475 (1987), worauf hiermit Bezug genommen wird. Kurz gesagt wurden 50 ug Eidotter-Phosphatidylcholin (Sigma, St. Louis, MO) und [³H]Phosphatidylcholin (1-2 uCi, New England Nuclear, Boston, MA) zu 1 ml der geeigneten Rezeptorfraktionen gegeben (Konzentration des Rezeptors betrug 1- 20 ug/ml). Diese Lösung wurde anschließend gegen detergenzfreies PBS enthaltend 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; 24 Stunden lang bei 4ºC dialysiert. Hierdurch wurden Liposomen gebildet, die nach elektronenmikroskopischer Untersuchung einen mittleren Durchmesser von ungefähr 200 nm aufwiesen. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Titertek, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA) wurden bei Raumtemperatur über Nacht entweder mit dem hydrophoben Peptid (AC)GRGDSPASSKG&sub4;SRL&sub6;RNH&sub2;, den extrazellulären Matrixproteinen (Vitronectin (VN), Fibrinogen (FG)), oder mit bovinem Serumalbumin (BSA) beschichtet. Die Platten wurden mit 10% fettfreier Milch in PBS 6 Stunden lang bei 4ºC blockiert und mit kalter Tris-gepufferter Saline (TBS) gewaschen. Die Platten wurden 32 Stunden lang bei 4ºC mit den Rezeptor enthaltenden Liposomen inkubiert. Nach Waschen mit kalter TBS wurden die gebundenen Liposomen mit 1% SDS gelöst, und die freigesetzte Radioaktivität wurde in einem Beta-Zähler gemessen (Beckmann, Modell LS5000CE).
  • (AC)GRGDSPASSKG&sub4;SRL&sub6;RNH&sub2; (PepTite-2000 , Telios Pharmaceutials, Inc., La Jolla, CA) erwies sich in Liposomen-Rezeptorstudien als ein praktikables Substrat sowohl für den Vitronectin-Rezeptor (Tabelle VII) als auch für den IIb/IIIa-Rezeptor (Tabelle VIII). Wenn die RGD-Sequenz bei dem Peptid weggelassen wurde (Pept-), was zu der Sequenz GSPASSKRL&sub6;RNH&sub2; führte, ging die Vitronectin- und IIb/IIIa-Integrin-Rezeptorbindung verloren. Tabelle VII Vitronectin-Rezeptor-Liposomen-Assay Substrat Vitronectin PepTite-2000 Pept-
  • Die Werte bezeichnen cpm. Tabelle VIII IIb/IIIa-Rezeptor-Liposomen-Assay Substrat Fibrinogen PepTite-2000 Pept-
  • Obgleich die Erfindung unter Bezugnahme auf die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden ist, sollte davon ausgegangen werden, daß ein Durchschnittsfachmann vielfache Modifikationen unternehmen kann, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Dementsprechend wird die Erfindung lediglich durch die folgenden Patentansprüche beschränkt.

Claims (15)

1. Aktives Adhäsionspeptid, umfassend eine RGD enthaltende, die Zellanheftung fördernde Bindungsstelle und eine hydrophobe Anheftungsdomäne mit einer Hydrophobizität, die zwischen denjenigen liegt, die durch die Aminosäuresequenzen L&sub4; und L&sub6; ausgedrückt werden, wobei das Adhäsionspeptid eine Beschichtung fester Oberflächen bildet, wenn es aus einer Lösung in eine wäßrige Umgebung überführt wird.
2. Peptid nach Anspruch 1, bei dem die Aminosäuren der hydrophoben Domäne ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Valin.
3. Aktives Adhäsionspeptid nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend eine Spacer-Sequenz von etwa 2 bis 4 Aminosäuren zwischen der die Zellanheftung fördernden Bindungsstelle und der hydrophoben Domäne.
4. Peptid nach Anspruch 3, bei dem der Spacer Serin- oder Glycinreste umfaßt.
5. Verfahren zur Anheftung aktiver, RGD enthaltender Adhäsionspeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 an eine Oberfläche unter Erhalt ihrer Aktivität, umfassend die Schritte:
a) Schaffung einer Domäne auf dem Peptid mit einer Hydrophobizität, die zwischen denjenigen liegt, die durch die Aminosäuresequenzen L&sub4; und L&sub6; ausgedrückt werden, und
b) Ermöglichung der Anheftung des Peptids an eine Oberfläche.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Oberfläche zusammengesetzt ist aus Polystyrol, Polycarbonat, Teflon, Silikon, Polyurethan, Polymilchsäure, Titan, Polyethylen, expandiertem Polytetrafluorethylen, Polyglykolsäure, Zahndentin oder -zement.
7. Stoffzusammensetzung, umfassend ein aktives, RGD enthaltendes Adhäsionspeptid mit einer hydrophoben Domäne mit einer Hydrophobizität, die zwischen denjenigen liegt, die durch die Aminosäuresequenzen L&sub4; und L&sub6; ausgedrückt werden, adsorbiert an eine Oberfläche.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, bei der die Oberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Prothesen, Zahnimplantaten und Vorrichtungen für die Gewebekultur.
9. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines gegenüber einer RGD enthaltenden Adhäsionsstelle komplementären Liganden in einer Probe, umfassend:
a) Kontaktieren der Probe mit der Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, um eine Bindung zwischen irgendeinem in der Probe vorhandenen Liganden und der RGD enthaltenden Adhäsionsstelle zu erlauben, und
b) Bestimmung des Vorhandenseins des an die RGD enthaltende Adhäsionsstelle gebundenen komplementären Liganden.
10. Verfahren zur Förderung der Anheftung von Zellen an eine Oberfläche, umfassend die Schaffung der Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 7, und Ermöglichung der Anheftung der Zellen daran.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Oberfläche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Prothesen, Zahnimplantaten und Vorrichtungen für die Gewebekultur.
12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Oberfläche zusammengesetzt ist aus Polystyrol, Polycarbonat, Teflon, Silikon, Polyurethan, Polymilchsäure, Titan, Polyethylen, expandiertem Polytetrafluorethylen, Polyglykolsäure, Zahndentin oder -zement.
13. Peptid mit der Aminosäuresequenz X-GRGDSPASSKG&sub4;SRL&sub6;RNH&sub2;, in der X NH&sub2;, nME, Acetyl oder eine andere Aminosäure ist.
14. Peptid mit der Aminosäuresequenz X-GRGDSPASSKS&sub3;RL&sub6;RNH&sub2;, in der X NH&sub2;, nME, Acetyl oder eine andere Aminosäure ist.
15. Peptid mit der Aminosäuresequenz X-GRGDSPASSKSSKRL&sub6;RNH&sub2;, in der X NH&sub2;, nME, Acetyl oder eine andere Aminosäure ist.
DE69011102T 1989-03-20 1990-03-20 Hydrophobe bindungsstelle für adhäsionspeptide. Expired - Fee Related DE69011102T2 (de)

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