DE68926051T2

DE68926051T2 - Polypeptid-polymer-konjugate mit wundheilender wirkung

Info

Publication number: DE68926051T2
Application number: DE68926051T
Authority: DE
Inventors: Marianne Pickett; Michael Pierschbacher; James Polarek; Erkki Ruoslahti
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1996-08-29
Anticipated expiration: 2009-12-21
Also published as: EP0449973A1; FI912858A0; CA2006060A1; AU628910B2; DE68926051D1; NO179505B; US5955578A; DK116691A; ATE135584T1; NO912397D0; NO179505C; NO912397L; EP0449973B1; JPH04503951A; KR910700063A; WO1990006767A1; DK116691D0; AU4828590A; ES2084688T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die mit biologisch abbaubaren Polymeren konjugiert sind, und Verfahren zur Verwendung der Konjugate zur Förderung der Wundheilung bei Säugern, einschließlich Menschen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die langsame Heilung oder das Ausbleiben der Heilung von sowohl Hautwunden, wie Dekubitalgeschwüren, schweren Verbrennungen und Diabetesgeschwüren, als auch von Augenläsionen wie trokkenem Auge und Homhautgeschwür ist ein schwerwiegendes medizinisches Problem, das Millionen von Individuen betrifft und bei vielen Patienten zu starken Schmerzen oder zum Tode führt. Selbst die Heilung von Operationswunden ist ein Problem, insbesondere bei alternden und diabetischen Individuen. Obgleich Wunden hinsichtlich ihrer Ursache, der Morphologie und des betroffenen Gewebes sehr unterschiedlich sein können, unterliegen sie einem gemeinsamen Heilungsmechanismus. Jeder Reparaturmechanismus erfordert letzten Endes, daß die korrekte Zelltype in ausreichender Anzahl in die Wunde migriert, um einen Effekt aufzuweisen: Makrophagen in Wunden mit Zelltrümmern, Fibroblasten zur Bildung von neuem Kollagen und anderen extrazellulären Matrixkomponenten in Wunden, bei denen die extrazelluläre Matrix geschädigt wurde, kapillare Endothelzellen zur Bereitstellung der Blutversorgung und Epithelzellen für die endgültige Abdekkung der Wunde.
Die unverwundete Haut verdankt vieles ihrer Struktur und Stärke den Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix. Diese Matrix enthält mehrere Proteine, von denen bekannt ist, daß sie die Anheftung einer großen Vielzahl von Zellen unterstützt. Diese Proteine schließen Fibronektin, Vitronektin, Thrombospondin, Kollagene und Laminin ein. Obgleich Fibronektin in relativ geringen Konzentrationen in unverwundeter Haut gefunden wird, kommt es relativ kurz nach einer Verwundung zu einer Ablagerung von Plasmafibronektin. Wenn Gewebe geschädigt wird, muß die extrazelluläre Matrix ersetzt werden, um ein Gewebsgerüst zuschaffen, damit die Zellanheftung und -migration unterstützt wird.
Zusätzlich zur Bereitstellung eines Gewebsgerüsts können extrazelluläre Matrizes ebenfalls die zelluläre Proliferation und Differenzierung steuern. Eine extrazelluläre Matrix kann daher die Heilung eines Gewebes so steuern, daß die korrekte Gewebegeometrie wiederhergestellt wird. Im Falle des Aufbringens auf Wunden führt exogenes Fibronektin zu einer gesteigerten Wundheilung, einer epithelialen Migration und einer Ablagerung von Kollagen. Es existieren jedoch eine Reihe von Gesichtspunkten einschließlich der Kosten, der Verfügbarkeit und Instabilität, aufgrund derer Fibronektin oder andere extrazelluläre Matrixproteine für eine derartige Behandlung nicht so ideal sind. Zudem können extrazelluläre Matrixproteine, sofern sie aus Blut abgeleitete Produkte sind, Vektoren für infektiöse Krankheiten sein.
Außer der Behandlung mit Fibronektin sind ebenfalls Versuche zur Förderung der Heilung unternommen worden durch Bereitstellung von Zellwachstumsfaktoren wie dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) oder dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). Derartige Faktoren werden bei der Behandlung von Wunden zweifellos geeignet sein, da sie jedoch die korrekte Geometrie des neuen Gewebes nicht herbeiführen können, können sie zu einem übermäßig vaskularisierten Gewebe und einer anormalen Heilung führen.
Es ist nunmehr erkannt worden, daß die Bindungsdomäne von Fibronektin und anderen Adhäsionsproteinen in der Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-X (in Übereinstimmung mit den gebräuchlichen Einbuchstaben-Abkürzungen für die Aminosäuren ebenfalls bezeichnet mit RGD-X) lokalisiert ist, in der X zahlreiche Aminosäuren oder Substituenten bezeichnen kann, so daß das Peptid eine die Zelladhäsion fördernde Aktivität aufweist. Arg-Gly-Asp enthaltende Peptide sowie deren Verwendung sind beispielsweise in den folgenden erteilten US-Patenten und anhängigen Patentanmeldungen offenbart: Patent-Nr. 4 578 079 und 4 614 517; Aktenzeichen 744 981 und 738 078. Ausgehend von diesen Entdeckungen hat man bei der Generierung von vielfältigen Arg-Gly-Asp enthaltenden Peptiden mit vielfältigen Spezifitäten für bestimmte Zelloberflächenrezeptoren Fortschritte erzielt.
Es besteht daher ein Bedarf an einem wirksamen Mittel zur Förderung der Zellmigration und der Anheftung im Bereich einer Wunde. Vorzugsweise sollte ein derartiges Mittel kostengünstig und steril sein sowie über eine langdauernde Stabilität und Wirksamkeit verfügen. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und stellt gleichermaßen damit zusammenhängende Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Durch die vorliegende Erfindung werden Arg-Gly-Asp enthaltende Peptide und Peptid/Polymer-Konjugate, die zur Förderung einer raschen Heilung von Wunden geeignet sind, und Verfahren zur Herstellung einer synthetischen extrazellulären Substitutionsmatrix (Peptid/Polymer-Konjugate) für die Wundheilung be reitgestellt. Nach einer Ausführungsform umfaßt das Konjugat ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz Y-Gly-Asp enthält, in der Y Arg oder D-Arg ist, angefügt an ein biologisch abbaubares Polymer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Heparin, Heparansulfat, Polylactase und Polyglykolsäure.
Nach einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Konjugation des Peptids an biologisch abbaubare Polymere bereitgestellt. Nach einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer synthetischen extrazellulären Substitutionsmatrix, welche Y-Gly-Asp enthaltende Peptidkonjugate umfaßt, zur Behandlung von Wunden. Die erfindungsgemäßen synthetischen Matrizes werden verwendet zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Figur 1 zeigt die Zunahme der Wundstärke unter Verwendung des Konjugats Hyaluronat und R&sub6;GDSPK in einem 10-tägigen Test im Vergleich zur Kontrolle.
In der Figur 2 sind die Ergebnisse der Figur 1 als Prozentwerte der Kontrolle dargestellt.
Die Figur 3 zeigt die Ergebnisse des zweiten Experiments zur Wundstärke unter Verwendung des Konjugats Hyaluronat- G(dR)&sub5;G&sub3;(dR)GDSPASSK.
In der Figur 4 sind die Daten der Figur 3 als Prozentwerte der Kontrollwunden dargestellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die extrazelluläre Matrix der Dermis von Säugern enthält mehrere Proteine, von denen bekannt ist, daß sie die Anheftung unterstützen und die Migration und Differenzierung einer großen Vielzahl von Zellen fördern einschließlich Fibronektin, Vitronektin, Kollagenen und Laminin. Wenn die Dermis geschnitten, verbrannt oder abgeschürft wird, kann die extrazelluläre Matrix abgetrennt oder verloren werden. Diese Matrix muß ersetzt werden, bevor die Wunde durch zelluläre Migration und Replikation repariert werden kann, da die Zellen die Matrix an ihrer Stelle benötigen, bevor die Zellmigration und Heilung einsetzen kann.
Bei der natürlichen Wundheilung wird das Gewebe ersetzt durch die Migration von Zellen und deren Synthese von extrazellulärer Matrix. Dieser Vorgang ist zeitaufwendig und erfordert bis zu seiner Vollendung häufig mehr als ein Jahr und führt zu einer Narbenbildung und zu einem Gewebe, welches schwächer ist als das umgebende, unverletzte Gewebe.
Durch die vorliegende Erfindung werden stabile "synthetische Matrizes" bereitgestellt, die verwendet werden können, um die Heilung vieler verschiedener Wunden zu unterstützen, indem die Zellen mit einer Anheftungsbasis für die Zellmigration ausgestattet werden.
Die "synthetische Matrix" umfaßt ein Konjugat eines biologisch abbaubaren Polymers und einer Peptidsequenz, die dermale Zellen während der Migration als Bindungsstelle nutzen können. Vorzugsweise enthält das Peptid die Sequenz Arg-Gly-Asp oder D- Arg-Gly-Asp.
Erfindungsgemäß wird eine synthetische extrazelluläre Substitutionsmatrix zur Wundheilung bereitgestellt, umfassend: (a) ein synthetisches Peptid, welches die Aminosäuresequenz Y-Gly- Asp enthält, in der Y R oder dR ist, wobei das Peptid eine die Zellanheftung fördernde Aktivität aufweist, und (b) ein biologisch abbaubares Polymer, welches an das Peptid gebunden ist, ohne die Affinität zur Zellbindung im wesentlichen zu reduzieren, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Heparin, Heparansulfat, Polyacetat und Polyglykolsäure, wobei die Matrix die Zellanheftung und die Migration in dieselbe fördert und nicht ein fester Träger ist.
Im Falle von dermalen Wunden liegen diese beiden Komponenten vorzugsweise in der Form eines viskosen Halbgels vor, welches das Peptid gekoppelt an eine hydratisierte Matrix umfaßt. Das Halbgel wird im Bereich der Matrixschädigung direkt in die Wunde plaziert. Die Wunde wird ansonsten auf herkömmliche Weise behandelt. Als Halbgel neigt das Konjugat nicht dazu, von dem Wundbereich wegzumigrieren, was entweder auf physikalische Effekte wie der Bewegung des Patienten oder auf die Absorption durch das patienteneigene System zurückzuführen ist. Das Konjugat wirkt als eine temporäre Sustitutionsmatrix, durch die die Zellmigration in die Wunde gefördert und die Heilung beschleunigt werden. Bei der Heilung der Wunde wird das Konjugat langsam durch die migrierenden Zellen abgebaut und durch eine natürliche Substitutionsmatrix ersetzt, wie in Beispiel VI nachgewiesen wird. Für andere Anwendungsbereiche, wie einer durch den Zustand eines trockenen Auges oder durch andere Umstände bedingten Hornhautabschürfung, ist ein Konjugat bevorzugt, welches aus einem Y-Gly-Asp-Peptid und einem damit verknüpften Chondroitinsulfat besteht. Dieses Konjugat bindet an die exponierte Kollagenmatrix der Dermis, wodurch Anheftungsstellen für Homhautepithelzellen geschaffen werden. Ein derartiges Material kann in flüssiger Form wie als Augentropfen bereitgestellt werden.
Die folgenden üblichen Abkürzungen werden vorliegend zur Identifizierung von Aminosäureresten verwendet. Aminosäure Abkürzung unter Verwendung von drei Buchstaben Ein-Buchstaben-Symbol Alanin Arginin D-Arginin Asparagin Asparaginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin nme bezieht sich auf eine N-Methylgruppe.
Ein Teil der bevorzugten erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen ist von derjenigen von Fibronektin abgeleitet. Fibronektin ist ein natürlich vorkommendes Protein, welches in geringer Anzahl in unbeschädigter Dermis und in höherer Anzahl in beschädigter Dermis vorhanden ist. Es ist gezeigt worden, daß Fibronektin ein wichtiger Faktor bei der Heilung ist, da es für migrierende Zellen, die zum Ersatz von Zellen auftauchen, die während der Verletzung verlorengingen, eine Bindungsstelle schafft. Die zur Zellbindung erforderliche Aminosäuresequenz von Fibronektin ist Arg-Gly-Asp-X, wobei X Serin ist. X kann jedoch andere Aminosäuren oder Substituenten bezeichnen, durch die das Peptid eine die Zellanheftung fördernde Aktivität erhält. (Pierschbacher und Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5985-5988 (1984)). Bei einer Reihe von anderen adhäsiven Proteinen einschließlich Vitronektin, Kollagen, Fibrin und Tenascin ist Arg-Gly-Asp ebenfalls eine die Zellanheftung fördernde Sequenz. Synthetische Peptide, die die Sequenz enthalten, sind in der Lage, die Zellanheftung zu fördern, wenn sie als unlösliches Substrat gegeben werden, sowie die Zellanheftung an Fibronektin oder andere adhäsive Proteine zu inhibieren, wenn sie in Lösung vorliegen. Mehrere Rezeptoren für diese Peptidsequenz sind in zahlreichen Zelltypen identifiziert worden (Pytela et al., Cell 40:191-198 (1985); Ruoslahti und Pierschbacher, Science 238:491-497 (1987)). In Abhängigkeit des anzuheftenden Zelltyps können die Arg-Gly-Asp-X-Sequenzen modifiziert werden, um bevorzugt an einzelne Rezeptoren zu binden, und können demgemäß individuelle Zelltypen ansprechen (Pierschbacher und Ruoslahti, J. Biol. Chem. 262:14080-14085 (1987)). Zusätzlich enthalten die meisten extrazellulären Matrixproteine eine basische "Heparin-bindende" Region, durch die die Adhäsion gesteigert zu werden scheint. Diese Qualität kann durch Polyarginin, Polylysin oder Polyornithin oder andere basische Reste nachgeahmt werden. Ferner kann das Peptid linear oder cyclisch sein. Es ist beabsichtigt, daß die anhängenden Ansprüche sämtliche dieser Additionen und Substituenten einschließen.
Demgemäß schließen Polypeptide, die in Kombination mit einem biologisch abbaubaren Polymer zur Förderung der Wundheilung geeignet sind, in den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die folgenden ein:
bei denen R die Aminosäure Arginin (Arg), dR die Aminosäure D- Arginin (D-Arg), G die Aminosäure Glycin (Gly), D die Aminosäure Asparaginsäure (Asp), 5 die Aminosäure Serin (Ser), P die Aminosäure Prolin (Pro), K die Aminosäure Lysin (Lys), A die Aminosäure Alanin (Ala) und nMe eine N-Methylgruppe sind.
Diese Peptide sind synthetisch, relativ leicht herzustellen (verglichen mit z.B. Fibronektin) und brauchen nicht aus Blut extrahiert zu werden. Zusätzlich erlaubt die kleinere Größe der Peptide (verglichen mit z.B. Fibronektin) viel mehr Bindungsstellen zur Anheftung an ein gegebenes Volumen eines biologisch abbaubaren Polymers. Diese Peptide sind zudem in Lösung sehr viel stabiler als Fibronektin. Insbesondere liefert D-Arg eine Proteaseresistenz. Zudem können die Peptide, da sie keine Spezies-spezifischen immunologischen Determinanten aufweisen, sowohl beim Tier als auch beim Menschen angewendet werden. Vorzugsweise enthalten derartige Peptide mindestens eine Gruppe von mindestens 3 Aminosäuren, ausgewählt aus den D- oder L-Formen von Arg, Lys oder Ornithin an der N-terminalen Seite der Arg- Gly-Asp-Sequenz.
Das biologisch abbaubare Polymer wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Heparin, Heparansulfat, Polyacetat und Polyglykolsäure.
Ein bevorzugtes biologisch abbaubares Polymer der Erfindung ist Hyaluronsäure. Hyaluronsäure besteht aus alternierenden Resten von D-Glukuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin. Das Polymer wird in der dermalen Matrix gefunden und ist bei vielen Anbietern in reiner Form erhältlich. Da es ein wasserlösliches Polymer ist, kann es Gele oder viskose Lösungen bilden. Die Polymere können vernetzt sein, um ihre physikalischen Eigenschaften zu stabilisieren.
Ein alternativ bevorzugtes biologisch abbaubares Polymer ist Chondroitinsulfat, welches aufgrund seiner Fähigkeit, in spezifischer Weise an exponierte Kollagen/Matrix zu binden, besonders für ophthalmische Anwendungsbereiche geeignet ist. Derartige Konjugate bilden stabile Lösungen, welche in flüssiger Form wie in Form von Augentropfen bereitgestellt werden können. Andere Polymere, die vorteilhafterweise verwendet werden können, schließen Heparin, Heparansulfat, Dextran, Polyacetat und Polyglykolsäure ein. Zusätzlich könnten diese Materialien im dermalen Anwendungsgebiet eingesetzt werden, indem sie zur Bildung eines Gels vernetzt werden, oder durch Ausbildung maschenartiger Strukturen.
Die beiden Komponenten des Wundheilungskonjugats können nach einer Reihe von Verfahren verknüpft werden. Vorzugsweise werden sie unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), einem Vernetzungs-/Kopplungsmittel, verbunden. Andere Vernetzungs-/Kopplungsreagenzien wie Dicyclohexylcarbomid (DDC), Glutaraldehyd, Bromcyan oder N-Hydroxysuccinimid können ebenfalls eingesetzt werden. Andere im Stand der Technik bekannte Verfahren können alternativ angewendet werden.
Ein Peptid-Hyaluronsäure-Konjugat bildet ein Halbgel, dessen Viskosität durch Zugabe von unkonjugiertem Hyaluronat oder durch Veränderung des Ausmaßes an Peptidkonjugat verändert werden kann. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von Peptid zu Polymer 0,2 - 0,3 : 1, obgleich andere Bereiche ebenfalls anwendbar sind. Das Halbgel kann direkt in eine Wunde plaziert werden, um die Heilung durch Bereitstellung einer künstlichen biologisch abbaubaren Matrix zu unterstützen. Wachstumsfaktoren, wie der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) oder der platelet-derived growth factor (PDGF) können zusammen mit dem Konjugat eingesetzt werden, um die Heilung weiter zu fördern. In alternativen Ausführungsformen kann das Konjugat zur Beschichtung einer biologisch abbaubaren Masche oder einem anderen implantierten Material verwendet werden, oder es kann selbst zu Folien oder anderen Strukturen geformt oder als stabile Lösung bereitgestellt werden. Derartige Konjugate können bei jeglichen Wunden eingesetzt werden, bei denen Körpergewebe geschnitten, abgeschürft oder in anderer Weise geschädigt sind. Derartige Wunden schließen chronische Hautgeschwüre, Verbrennungen, Hornhautverletzungen und Inzisionen ein. Die Regeneration von Gewebe (wie von Knorpel-, Knochen- oder Nervengewebe) kann durch Applizieren des Konjugats ebenfalls gefördert werden.
Die folgenden Beispiele dienen der detaillierteren Veranschaulichung von erfindungsgemäßen Aspekten, sollen den Schutzbereich derselben jedoch nicht einschränken.

BEISPIEL I

PEPTIDSYNTHESE

Das Peptid G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K wurde synthetisiert unter Verwendung eines automatisierten Peptidsynthetisiergerätes (Modell 430A; Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) nach den Anweisungen des Herstellers. Nach Abspaltung vom Harz mit Hydrogenfluorid wurden die Peptide in kaltem Ethylether gewaschen und aus der Lösung in Trifluoracetat mit eiskaltem Ether präzipitiert. Die Peptide wurden anschließend in destilliertem Wasser wieder gelöst und lyophilisiert. Die Peptide wurden ferner gereinigt mittels HPLC unter Anwendung einer Waters Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule (3 x 30 cm; 10 µm Packung, Waters Assoc., Milford, MA). Mit demselben Verfahren können andere Peptide hergestellt werden.
Für größere Volumina kann das Peptid alternativ anhand des folgenden Verfahrens hergestellt werden. Ungefähr 30 g t-Boc-Lysin-Polystyrolharz (enthaltend ungefähr 19,5 mM t-Boc-Lysin) wurden ausgewogen und in ein gläsernes Gefäß zur Peptidsynthese überführt. Das Gewicht des Harzes kann in Abhängigkeit der gewünschten Menge an erwünschtem Produkt erhöht oder verringert werden. Die folgenden Aminosäuren mit den angegebenen Schutzgruppen wurden zur Herstellung des Peptids verwendet:
1-Serin (Benzyl, bzl)
1-Alanin
1-Prolin
1-Asparaginsäure (o-Cyclohexyl; OcHx)
Glycin
d-Arginin (p-Toluolsulfonyl; tos)
Jede Aminosäure wurde in einer solchen Menge ausgewogen, daß zwischen dieser und derjenigen an t-Boc-Lysin auf molarer Ebene ein vierfaches Verhältnis bestand, und sie wurde in einzelne, 500 ml fassende Erlenmeyer-Kolben aus Glas überführt.
Jede Aminosäure (mit Ausnahme des t-Boc-Lysin-Polystyrolharzes) wurde gelöst und durch Zugabe von 1 M Hydroxybenzotriazol in N-Methylpyrrolidon aktiviert. Hydroxybenzotriazol wurde in einem solchen Volumen zugegeben, um gegenüber der Aminosäure eine äquimolare Konzentration zu erhalten. Die Aktivierung einer jeden Aminosäure (mit Ausnahme des t-Boc-Lysin-Polystyrolharzes) wurde abgeschlossen durch Zugabe eines Volumens an 1 M Dicyclohexylcarbodiimid in N-Methylpyrrolidon, um gegenüber der gelösten Aminosäure eine äquimolare Konzentration an Dicyclohexylcarbodiimid zu schaffen. Die Materialien wurden mindestens Minuten lang inkubiert, um eine vollständige Aktivierung zu erlauben. Jede Aminosäure wurde in den Hobt-aktiven Ester überführt. Die aktivierten Aminosäuren wurden zur Entfernung jeglichen unlöslichen Materials durch Whatman #1-Filterpapier filtriert.
Um die t-Boc-Schutzgruppen vom Aminoterminus der N-terminalen Aminosäure zu entfernen, wurde das t-Boc-Aminosäure-Polystyrolharz gequollen und anschließend dreimal 5 Minuten lang mit Dichlormethan (ungefähr 12 ml/g Harz) gewaschen. Nach jedem Waschen wurde die Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Nach dem Quellen und Waschen wurde das Harz angesäuert, indem es 2 Minuten lang mit 50 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan (ungefähr 6 ml/g Harz) gewaschen wurde. Die Flüssigkeit wurde aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Eine Entschützung des t-Boc- Aminosäure-Polystyrolharzes wurde vollendet durch Zugabe eines zusätzlichen Volumens an 50 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan (ungefähr 12 ml/g Harz) und durch ungefähr 30-minütige oder längere Inkubation des Materials.
Nach dem Entschützen wurde die Trifluoressigsäure in Dichlormethan aus dem Reaktionsgefäß entfernt, und das entschützte Aminosäure-Polystyrolharz wurde zweimal mit Dichlormethan gewaschen (ungefähr 12 ml/g Harz). Das entschützte Aminosäure-Polystyrolharz wurde zweimal mit Dichlormethanisopropanol (50 % Vol./Vol., ungefähr 12 ml/g Harz) gewaschen, und die Waschvolumina wurden verworfen. Das Harz wurde anschließend zweimal mit Dichlormethan gewaschen (ungefähr 12 ml/g Harz).
Das angesäuerte, entschützte Aminosäure-Polystyrolharz wurde neutralisiert durch dreimaliges Waschen mit 10 mM Diisopropylethylamin in Dichlormethan (ungefähr 12 ml/g Harz). Die Waschvolumina der Neutralisation wurden nach jedem Zyklus verworfen. Das neutralisierte Aminosäure-Polystyrolharz wurde dreimal mit Dichlormethan (ungefähr 12 ml/g Harz) und dreimal mit N- Methylpyrrolidon (ungefähr 12 ml/g Harz) gewaschen. Die Waschvolumina wurden nach jedem Zyklus verworfen.
Die geeignete, aktivierte Aminosäure wurde dem das Aminosäure-Polystyrolharz enthaltenden Reaktionsgefäß in einer solchen Menge zugegeben, daß das molare Verhältnis zwischen aktivierter Aminosäure und entschützter, mit dem Harz verknüpfter Aminosäure 4 : 1 betrug. Die geeignete Aminosäure wurde entsprechend der erwünschten Peptidsequenz ausgewählt. Das Material wurde 30 Minuten lang oder länger vermischt, damit die Kopplungsreaktion vollständig ablaufen konnte. Die Reaktion wurde aufgezeichnet unter Nutzbarmachung der Ninhydrin-Reaktivität. Das die gekoppelten Aminosäuren enthaltende Harz wurde zweimal mit N-Methylpyrrolidon (ungefähr 12 ml/g Harz) und zweimal mit Dichlormethan (ungefähr 12 ml/g Harz) gewaschen. Jedes Waschvolumen wurde nach Vollendung des Zyklus verworfen.
Das Verfahren beginnend mit der Ansäuerung und der Entschützung des t-Boc-Aminosäure-Polystyrolharzes bis zu dieser Stufe wurde für jede nachfolgende, an die Peptidkette anzufügende Aminosäure wiederholt. Die zur Herstellung des Peptids befolgte Aminosäuresequenz wird nachfolgend dargestellt: Zyklus Aminosäure Resultierendes Peptid t-Boc-Lysin-Harz Ausgangsmaterial l-Serin (blz) l-Alanin l-Prolin l-Serin (blz) l-Asparaginsäure (Ochx) Glycin d-Arginin (tos) Glycin d-Arginin
Nach Vollendung sämtlicher Kopplungsstufen für das Peptid wurde das Harz zweimal in Dichlormethan gewaschen (ungefähr 12 ml/g Harz je Waschgang). Das Harz wurde gesammelt und durch Spülen mit Argongas getrocknet. Das getrocknete Harz wird einer Desikkation unterzogen und bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.
Das getrocknete und gewogene Harz wurde in ein gläsernes Reaktionsgefäß geeigneter Größe überführt, welches einen Rührstab enthielt. Unter Rühren wurde dem Harz Anisol in einem Volumen von 1 ml/g Peptidharz zugegeben. Dem Anisol und das Peptidharz enthaltenden Reaktionsgefäß wurde Pentamethylbenzol in einer Menge zugegeben, die 50 mg Pentamethylbenzol pro Gramm Peptidharz entspricht. Der Inhalt des Gefäßes wurde auf ungefähr -70 ºC abgekühlt. Anschließend wurde in das Reaktionsgefäß Hydrogenfluorid kondensiert in einem Volumen von 10 ml/g Peptidharz. Die Temperatur des Reaktionsgefäßes wurde langsam unter Rühren auf ungefähr -15 ºC angehoben und in jedem Fall 60 Minuten lang oder länger unterhalb von 0 ºC gehalten. Nach Vollendung der Spaltung und der Entfernung der Schutzgruppen wurde sämtliches Hydrogenfluorid aus dem Reaktionsgefäß durch Spülen mit Stickstoffgas für eine Zeitdauer von ungefähr 1 Stunde evaporiert, während der Inhalt des Gefäßes unter rührenden Bedingungen bei der Temperatur von unterhalb 0 ºC gehalten wurde.
Das abgespaltene Peptid wurde löslich gemacht in HPLC-tauglichem Wasser und Ethylether (wasserfrei) in einem ungefähren Verhältnis von Wasser zu Ether von 1 : 1,5, und es wurde durch einen mit einer Glasfritte versehenen Trichter filtriert, um das unlösliche Harz von dem freien Peptid zu entfernen. Nach der Filtration wurde die das abgespaltene Peptid enthaltende wäßrige Phase gesammelt und zwei zusätzliche Male mit Ethylether (wasserfrei) reextrahiert. Der pH-Wert der löslichen wäßrigen Peptidlösung wurde mit 2 M Ammoniumbicarbonat auf 6,5 - 7,5 eingestellt. Die neutralisierte Lösung wurde rollschichtgefroren und lyophilisiert, um das rohe Peptid zurückzugewinnen.
Zur Reinigung des synthetischen Peptids wurde eine Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RPHPLC) angewendet. Diese Vorgehensweise nutzt die Hydrophobizität der Peptidsequenz. Das Peptid wurde auf die Säule geladen, wobei ein wäßriges polares Lösungsmittel zur Sicherstellung der Säulenbindung verwendet wurde. Das Peptid wurde in effektiver Weise gereinigt durch Austauschen des polaren wäßrigen Lösungsmittels durch ein nicht-polares organisches Lösungsmittel, wobei hierfür ein linearer Gradient angewendet wurde.
Ungefähr 6 g an rohem, lyophilisiertem Peptid wurden in ungefähr 100 ml HPLC-Wasser enthaltend 0,05 % TFA (Puffer A) gelöst und durch Whatman #1-Filterpapier in einen Glaskolben filtriert. Die wäßrige Lösung von rohem Peptid wurde bei einer ungefähren Fließrate von 30 ml/Minute auf eine 30 cm lange radiale C-18-Drucksäule geladen, die zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Nach dem Laden des rohen Peptids wurde die Säule mit ungefähr 50 ml Puffer A bei einer ungefähren Fließrate von 30 ml/Minute gespült, um die Bindung des Peptids an die Säule sicherzustellen. Das Peptid wurde eluiert durch Steigerung des Acetonitril-zu-Wasser-Gradienten von 0 bis 20 % über eine 50-minütige Zeitdauer. Der Reinigung schloß sich eine Überwachung der Absorption bei 210 nm an. Die Peptidpeaks wurden manuell bei 12 - 15 Minuten und bei 34 - 38 Minuten gesammelt. Dieses Material besaß nach Bestimmung durch Peak-Integration eine Reinheit von ungefähr 80 %. Das halbgereinigte Peptid wurde rollschichtgefroren, lyophilisiert und in einem Desikkator bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Das halbgereinigte Peptid wurde gelöst in Puffer A in einem ungefähren Volumen von 100 ml/900 mg Peptid und durch ein Whatman #1-Filterpapier in ein silikonisiertes Glasgefäß von geeigneter Größe filtriert. Die wäßrige Lösung an halbgereinigtem Peptid wurde mit einer Fließrate von ungefähr 30 ml/Minute auf eine zwei Zoll x 30 cm große, zuvor equilibrierte Säule in einer Menge geladen, die 1 g partiell gereinigtem Peptid pro 350 g C- 18-Harz entspricht. Die Säule enthielt 350 g 15 µ C-18-Harz. Die Säulengröße basierte auf der zu ladenden Peptidmenge. Für Reinigungen größeren Ausmaßes wurde eine Säule von vier Zoll x 60 cm verwendet. Nach dem Laden des halbgereinigten Peptids auf die Säule wurde die Säule mit ungefähr 50 - 100 ml Puffer A bei einer ungefähren Fließrate von 30 ml/Minute gespült, um die Peptidbindung an die Säule sicherzustellen. Das Peptid wurde eluiert durch Steigerung des Acetonitril-zu-Wasser-Gradienten von 0 bis 7 % über eine 20-minütige Zeitdauer unter Anwendung einer Fließrate von ungefähr 30 ml/Minute. Die isokratische Elution bei einer Konzentration an Acetonitril von 7 % dauerte für ungefähr 60 Minuten an, und bei diesem Zeitpunkt wurde das Peptid eluiert. Die Fraktionen wurden in Intervallen von 0,3 Minuten gesammelt. Die reinen Fraktionen wurden nach analytischer HPLC-Analyse vereinigt und lyophilisiert. Jeder Pool wurde als Charge betrachtet. 1 % einer jeden Charge an gereinigtem Peptid wurde untersucht, vereinigt und durch die Umkehrphasen-C-18-HPLC analysiert. Die vereinigten Proben müssen ein Reinheitsprofil von mehr als 95 % aufweisen, und die Unreinheit darf nicht größer als 1 % sein. Das reine Peptid wurde anschließend mit einem eigenen Standard als Verfahrenskontrolle koeluiert. Die vereinigten Peptidchargen wurden in HPLC-Wasser gelöst und durch ein Whatman #1-Filterpapier filtriert. Die Ausbeute der Synthese wurde berechnet. Die große Mischung an vereinigtem Peptid wurde gefroren, lyophilisiert, gewogen und in einem Desikkator bei Raumtemperatur bis zur endgültigen Herstellung des Produkts aufbewahrt.
Das gereinigte Peptid wurde unter Anwendung von quantitativer Aminosäureanalyse (Tabelle II), aminoterminaler Sequenzanalyse (Tabelle III) und durch Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen (FAB-MS) analysiert. Sämtliche Ergebnisse stimmten mit der erwarteten Struktur des Peptids überein. Das molekulare Ion aus vier (FAB-MS) Analysen war 1913,2 + 0,5 und damit dem theoretischen Wert von 1913,5 sehr nahe. TABELLE II AMINOTERMINALE SEQUENZANALYSE DES PEPTIDS NACH BEISPIEL I ZYKLUS REST NANOMOL TABELLE III AMINOSÄURE-ANALYSE DES PEPTIDS NACH BEISPIEL I Aminosäure Reste/Mol (N=6) Pro Nachweisbar

BEISPIEL II

HERSTELLUNG EINES PEPTID/HYALURONSÄURE-KONJUGATS

Konjugate wurden hergestellt durch Vermischen einer Lösung von Hyaluronsäure (bakteriell abgeleitet; Genzyme, Boston, MA), in Phosphat-gepufferter Sahne gepuffert, mit dem Kopplungsmittel 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid in einer Konzentration von 0,07 M für 30 Minuten. Nach dieser Zeitdauer wurde das Peptid des Beispiels I in einer dem Hyaluronat ver gleichbaren Menge zugegeben. Diese Mischung wurde über Nacht geschüttelt, wonach das Produkt durch Dialyse und Fällung mit 3 Volumina an Aceton oder Ethanol gereinigt wurde. Typische Präparationen bestanden aus einem Konjugat, welches zwischen 20 und 30 Gew.-% Peptid enthielt. Die Zugabe von steriler Phosphatgepufferter Sahne führt zu klaren Lösungen, deren Viskosität durch Zugabe von ungekoppeltem Hyaluronat eingestellt werden kann.
Um freies Peptid von Konjugat zu trennen, erfolgte eine Dialyse unter Anwendung üblicher Dialysemembranen mit einem nominalen Molekularsiebeffekt von 8 - 14 000. 100 ml Probe (mit einer Anfangskonzentration an HA und Peptid von 4 mg/ml) wurden dialysiert gegen 2 l Phosphat-gepufferte Sahne, pH-Wert 7,4, wobei der Puffer dreimal täglich ausgetauscht wurde und die Dialyse insgesamt 50 Stunden lang andauerte. Das Peptid wurde analysiert mittels herkömmlichem Protein-Assay (BCA-Assay, Pierce Chemical, Rockford, IL), und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Harnstoff (EDU) wurde analysiert unter Anwendung von Aminosäureanalyse.
Wie in Tabelle IV dargestellt ist, wurde ein niedermolekulares Nebenerzeugnis (EDU) des Kopplungsverfahrens vom Konjugat mittels Dialyse entfernt, während das Peptid in Assoziation mit dem Konjugat verbleibt. Man beachte, daß die dargestellten Bedingungen zu einer Duplikation des normalen Kopplungsverfahrens führen. Die Menge an verbleibendem Peptid betrug 20 - 30 % des Ausgangsmaterials. Da mit gleichen Mengen begonnen wurde, betrug das Peptid 20 - 30 % der Menge an Hyaluronat im Endprodukt. TABELLE IV DIALYSERATE Zeit EDU(mg/ml) Pedtid (mg/ml)

BEISPIEL III

HERSTELLUNG EINES CHONDROITINSULFAT-KONJUGATS

Das Peptid aus Beispiel I wurde mit Chondromtinsulfat konjugiert, indem Chondroitinsulfat (Hepar Industries, Inc., Franklin, OH) bei 100 mg/ml in Wasser mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) bei 70 mM 30 Minuten lang vermischt wurde, und anschließend die Zugabe des Peptids des Beispiels I mit 10 mg/ml erfolgte und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Die Konjugate wurden anschließend durch Zugabe von NaCl auf 1 % und von 3 Volumina an Aceton gefällt, wonach 5 Minuten lang bei 2000 x G zentrifugiert wurde. Das Konjugat wurde anschließend unter Vakuum getrocknet und in Phosphat-gepufferter Sahne bei 100 mg/ml resuspendiert. Der typische Peptideinbau betrug 74 mg Peptid/g Konjugat. Das Chondroitinsulfat-Konjugat führte nach Bestimmung gemiß Darlegung im Beispiel IV zu einer Anheftung von 700 bis 1000 Zellen/mg Konjugat.

BEISPIEL IV

HERSTELLUNG VON PEPTID-KONJUGATEN MIT VIELFÄLTIGEN BIOPOLYMEREN

Das in Beispiel I hergestellte Peptid wurde unter Anwendung des Bromcyan-Aktivierungsverfahrens mit Kartoffelstärke wie folgt konjugiert: 25 mg CNBR wurden in 20 ml H&sub2;O gelöst. Der pH- Wert wurde schnell mit 1N NaOH auf pH-Wert 11 angehoben, wonach 500 mg Kartoffelstärke (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) zugegeben wurden. Der pH-Wert wurde für 31 6 oder 12 Minuten (durch Zugabe von zusätzlicher NaOH und unter konstantem Rühren) auf 11 gehalten, wonach die Stärke auf Filterpapier (Whatman Nr. 2) gesammelt und mit kaltem Wasser und Aceton gewaschen wurde. 200 mg dieser aktivierten Proben wurden 10 ml Kopplungspuffer zugegeben (0,2 M Natriumbicarbonat, pH-Wert 9,5) enthaltend mg des Peptids YAVTGRGDSPASSKPISNYRTELLDKPSQM, und es wurde über Nacht im Kalten gerührt. Am Morgen wurden die Konjugate auf Whatman #2-Filterpapier gesammelt, gewaschen mit Kopplungspuffer, 0,01N HCl, 1 M NaCl, und graduiertem Wasser/Aceton (80 %, 60 %, 40 %, 20 %) und schließlich Aceton. Der Peptideinbau wurde anhand des Ninhydrin-Assays analysiert. Die Ausbeute betrug ungefähr 10 mg eingebautes Peptid/g Stärke.
Alternativ wurde das Peptid mit Kartoffelstärke konjugiert durch Anwendung der Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid (DDC). 0,2 g Kartoffelstärke wurden in 6 ml Dioxan suspendiert, es wurden 100 µg DCC zugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten lang geschüttelt. Die Stärke wurde anschließend auf einem Glasfrittenfilter gesammelt und mit Dioxan gewaschen. Nach Trocknung an der Luft wurde sie 8 ml 1M Na&sub2;CO&sub3;, pH-Wert 10, zugegeben. Es wurden 1,2 mg Peptid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 4 ºC geschüttelt. Am Morgen wurden die Konjugate durch Filtration gesammelt, gewaschen mit Wasser, 1M NaCl, Wasser und graduiertem Aceton/Wasser wie zuvor. Der Peptideinbau wurde mittels Ninhydrin analysiert. Typische Ausbeuten betrugen 3 bis 4 mg eingebautes Peptidig Kartoffelstärke.
Das Peptid wurde ebenfalls nach dem obigen Dicyclohexylcarbodiimid-Aktivierungsverfahren unter Verwendung von 40 µg DDC anstelle von 100 µg DDC mit Agarose (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) konjugiert.
Ein nach dem Verfahren gemäß Beispiel I hergestelltes Peptid wurde nach einer Modifikation des Verfahrens von Pierschbacher und Ruoslahti (Nature 309:30-33 (1984), worauf hiermit Bezug genommen wird) mit Sepharose konjugiert. 50 mg Sepharose in 7,5 ml 1M Na&sub2;CO&sub3; wurden 10 Minuten lang mit 20 mg CNBr aktiviert. Nach Sammlung und Waschen wurden die Proben in 5 ml 1M Na&sub2;CO&sub3; resuspendiert und mit 1 mg des Peptids GRGDSPK über Nacht im Kaltem geschüttelt. Die Konjugate wurden anschließend wie zuvor gesammelt und gewaschen, und der Peptideinbau wurde mittels BCA-Proteinassay (Pierce Chemical Co.) unter Verwendung von Peptid als Standard analysiert. Der Einbau betrug im Bereich von 5 mg/ml Kügelchen.
Diese Konjugate wurden hinsichtlich der Zellanheftung untersucht, indem sie auf Gewebekulturkunststoff immobilisiert wurden, welcher mit 100 µg/ml Kaninchen-Immunglobulin G beschichtet war. Dies erfolgte durch Zugabe des Konjugats zu der Vertiefung, gefolgt von der Zugabe von konzentriertem 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), um das Konjugat an die Proteinbeschichtung zu koppeln. Nach 4 Stunden wurden die Vertiefungen gewaschen, und es wurden Zellen (normale Rattennierenzellen mit 2 x 10&sup5;/ml) zugegeben und es wurde 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Nach der Fixierung und der Färbung wurde die Zellanheftung analysiert.
Sämtliche Konjugate zeigten eine Peptid-abhängige Zellanheftung; im Fall des Biopolymers allein gab es nur eine geringe oder keine Zellanheftung, während bei dem Peptid/Biopolymer- Konjugat eine signifikante Zellanheftung beobachtet wurde. Die Kartoffelstärke-Konjugate führten zu einer Bindung von ungefähr 150 Zellen/ml konjugiertem Stärkegel.

BEISPIEL V

MESSUNG DER WUNDSTÄRKE UND -HEILUNG NACH NACH BEHANDLUNG MIT PEPTID/HYALURONAT-KONJUGATEN

Ausgewachsene, männliche Ratten der Spezies Wistar Furth (175-250 g) wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Der dorsale Bereich der Ratten wurde sorgfältig rasiert, und jedes Tier wurde für einen operativen Eingriff vorbereitet und gesichert. Unter sterilen Bedingungen erfolgten auf dem dorsalen Bereich Einschnitte vollständiger Dicke in die Haut in einer Länge von jeweils 1,5 cm. Jeder Schnitt wurde mit 0,05 - 0,10 ml einer Blindprobe des mit Hyaluronat konjugierten Peptids RRRRRRGDSPK oder mit 0,05 - 0,10 ml humanem Fibronektin (3 mg/ml in PBS, Collaborative Research, Bedford, MA) oder mit Ratten-Fibronektin (2 mg/ml in PBS, Telios Pharmaceuticals, Inc., San Diego, CA) behandelt oder als Kontrolle unbehandelt gelassen. Nach der Behandlung wurden die Schnitte verschlossen unter Anwendung üblicher 4-0 Nylon-Nähte zur Plazierung von 5 bis 7 unterbrochenen Nähten. Die Ratten wurden zur Erholung und Beobachtung wieder in ihre Käfige gebracht. An den Tagen 2 bis 7 und 10 nach der Operation wurden sechs Tiere wie oben beschrieben anästhesiert und durch eine intrakardiale Injektion von 0,5 cc T-61 eingeschläfert.
Nach dem Einschläfern wurde der Ratte das Fell entfernt, und es erfolgte die Präparation von 5 ml breiten und 2 cm langen halbierenden Hautstreifen. Histologisches Probenmaterial von der Haut in der Nähe des Zugstärke-Streifens wurden ebenfalls entnommen, um die Zugstärke zu messen, wobei ein Ende des Streifens unter Verwendung eines 1 mm Michel Clippers (Militex Instruments Co.), welcher an einem Grass model FTO3C Kraft-Verschiebungs- Wandler (force displacement transducer) befestigt wurde. Das andere Ende des Streifens wurde geklammert unter Verwendung einer leichtgewichtigen Gesäßklammer, welche unter Verwendung eines über eine Rolle geführten Baumwollfadens mit einer Harvard Model 901 Druck/Zieh-Infusionspumpe (Harvard Instruments, Millis, Mass.) verbunden war. Der Wandler (Transducer) wurde zur Aufzeichnung der Ergebnisse an einen Grass Polygraph (Model 7D) angeschlossen. Nach der Kalibrierung wurde die Pumpe angeschaltet, um in einer Rate von 64 mm/min zu ziehen. Die Menge an Kraft, die erforderlich war, um die Haut an der Inzision abzuziehen, wurde mit dem Polygraph aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt. Wie diese Figuren zeigen, wurde die Wundstärke durch Verwendung des Konjugats für die Tage 3 bis 7 nach der Inzision gesteigert, wobei der maximale Effekt am Tag 5 beobachtet wurde, an dem die mit dem Konjugat behandelten Wunden 211 % der Stärke von unbehandelten Wunden erreichten.

BEISPIEL VI

UNTERSUCHUNG DER PEPTID/HYALURONAT-KONJUGATE IM IMPLANTATIONSMODELL EINES POLYVINYLALKOHOL-SCHWAMMES

Die Peptid/Hyaluronat-Konjugate wurden untersucht unter Anwendung des Verfahrens von Davidson et al., J. Cell Biol. 100:1219-1227 (1985), worauf hiermit Bezug genommen wird. Dieses Modell beinhaltet die Implantation von inerten PVA-Schwämmen, die mit den Konjugaten oder mit Kontrollmaterialien beladen sind, unter die Haut von Ratten. Die Schwämme wurden von den Tieren 4 bis 10 Tage nach Implantation entfernt und hinsichtlich der Anzahl und des Typs an eingewachsenen Zellen sowie des Kollagengehalts, der Blutgefäßbildung (Angiogenese) und der Entzündungsantwort wie auch hinsichtlich der Persistenz des Konjugats in der Wunde analysiert. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten:
A. Schwämme, die nach dem Verfahren gemäß Beispiel II mit Hyaluronat konjugiertes Peptid R&sub6;GDSPK enthielten, führten zu frühen Zeitpunkten zu einer erhöhten Angiogenese, Kollagensekretion und Fibroblastenmigration, wobei der Effekt zu späteren Zeitpunkten abnahm, so daß der Schwamm am Ende des Experiments den Kontrollschwämmen ähnlich erschien, abgesehen davon, daß in die mit Hyaluronat/Peptid-Konjugaten beladene Schwämme kontinuierlich mehr Kollagen eingelagert wurde.
B. Die Hyaluronat-Konjugate verschwanden langsam aus dem Schwamm, wobei 14 Tage nach der Implantation bemerkenswert wenig an Konjugat vorhanden war.

BEISPIEL VII

UNTERSUCHUNG DER PEPTID/HYALURONAT-KONJUGATE BEI DERMALEN INZISIONEN DER RATTE

Die Verfahren des Beispiels V wurden angewendet um zu untersuchen, ob die Konjugate unter Beteiligung des Peptids G(dR)&sub5;G&sub3;(dR)GDSPASSK (von dem gefunden wurde, daß es in in vitro-Assays des von Pierschbacher et al. beschriebenen Typs, Natl. Acad.Sci. 80:1224-1227, (1983), eine höhere Aktivität aufwies als das in Beispiel V untersuchte RGDSPK-Peptid-Konjugat) in vitro ebenfalls überlegene Aktivität aufwiesen. Wie den Figuren 3 und 4 entnommen werden kann, zeigten Konjugate mit diesem Peptid eine frühere Aktivität (die am Tag 2 160 % der Kontrolle erreichte) und eine persistente Aktivität (die bis zum Tag 10 aufrechterhaltene Aktivität war größer als die Kontrolle).
Eine Mischung aus Hyaluronat und Peptid (gebildet durch Mischung gleicher Mengen an Hyaluronsäure und Peptid) wurde unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens in einem Wundstärke-Modell untersucht. Am 4. Tag, dem Zeitpunkt der maximalen Aktivität des Konjugats, betrug die Aktivität der Mischung 100,8 % der Kontrolle, während diejenige des Konjugats 125 % der Kontrolle betrug. Aus den Daten ist ersichtlich, daß die Mischung keine wundheilende Aktivität zeigte.

BEISPIEL VIII

BEHANDLUNG DES SYNDROMS DES TROCKENEN AUGES MIT CHONDROITINSULFAT/PEPTID-KONJUGATEN

Der Zustand des trockenen Auges wurde bei sechs Katzen am Tage Null durch Exzision der Tränenkänale und der Blinzelmembranen der Augen induziert. Die Katzen wurden in vier Gruppen unterteilt und wie folgt behandelt:
Die Gruppe 1 wurde zweimal täglich vom Tag 17 bis zum Tag 34 mit zwei Tropfen humanem Fibronektin, 3 mg/ml, und vom Tag 34 bis 43 dreimal täglich mit zwei Tropfen behandelt. Die Gruppe 2 wurde zweimal täglich vom Tag 17 bis 34 mit zwei Tropfen Chrondroitinsulfat/Peptid-Konjugat, G(dR)&sub5;G&sub3;(dR)GDSPASSK 100 mg/ml, und vom Tag 34 bis 43 dreimal täglich mit zwei Tropfen behandelt. Die Gruppe 3 wurde behandelt mit Phosphat-gepufferter Sahne, zwei Tropfen, zweimal täglich wurde die Gruppe 4 behandelt.
Die Augen wurden untersucht durch Abdruck(Impressions-)zytologie, bei der ein Abdruck der Oberfläche des Auges genommen wird durch Plazierung eines Polymers auf die Augenoberfläche, und die Zellen, die an der Oberfläche anhaften, werden mikroskopisch untersucht, und durch Färbung der Augen mit Diodeosin, einem Rettich-Farbstoff, durch den die freigelegte Matrix und die darunterliegenden epithelialen Basalzellen selektiv angefärbt werden, nicht jedoch das ungeschädigte Homhautepithel.
Die Katzen der Gruppen 1 und 2, die mit Fibronektin oder dem Peptid-Konjugat behandelt wurden, zeigten eine deutliche Reduzierung des Zustandes des trockenen Auges. Die Katzen, die mit Phosphat-gepufferter Sahne allein behandelt worden waren, wie auch unbehandelte Katzen zeigten keinerlei Veränderung des Zustandes des Auges über den aufgezeigten Zeitrahmen.

BEISPIEL IX

BEHANDLUNG VON EPIDERMALEN WUNDEN

Drei junge, in spezifischer Weise pathogenfreie (SPF) Schweine mit Körpergewichten zwischen 20 und 25 kg wurden zwei Wochen vor dem Experiment konditioniert. Die Tiere erhielten Wasser und eine Grunddiät ohne Antibiotika (Purina Control Factor) ad libitum und wurden individuell in unseren Tierein richtungen (in Übereinstimmung mit den Vorschriften der American Associaton for Accreditation of Laboratory Animal Care [AAALAC]) unter kontrollierter Temperatur (19 ºC bis 21 ºC) und Hell/Dunkel-Wechsel (12 Std./12 Std. HD) gehalten.
Die Versuchstiere wurden mit herkömmlichen Tierklammern geklammert. Die Haut auf dem Rücken und auf beiden Seiten des Tieres wurden für die Verwundung vorbereitet durch Waschen mit einer nicht-antibiotischen Seife (Neutrogena ).
Am Tag der Verwundung (Tag 0) wurden die Schweine anästhesiert mit Ketamin (I.M.) und durch Inhalation einer Kombination aus Halothan, Sauerstoff und Distickstoffoxid. Fünf in spezieller Weise ausgestaltete zylindrische Metallstäbe mit einem Gewicht von jeweils 358 g wurden in einem kochenden Wasserbad auf 100 ºC erhitzt. Ein Stab wurde aus dem Wasserbad entnommen und vor der Aufbringung auf die Hautoberflächen trocken gewischt, um eine Dampfverbrennung der Haut durch Wassertropfen zu verhindern. Die Metallstange wurde in einer vertikalen Position 6 Sekunden lang mit sämtlichem durch den gesamten Druck der Schwerkraft auf die Haut gedrückt, um eine Verbrennungswunde mit einem Durchmesser von 8,5 mm und einer Tiefe von 0,6 mm zu erhielten. Unmittelbar nach der Verbrennung wurde die oberste Schicht der Brandblase mittels eines sterilen Spatels entfernt. Die Verbrennungswunden wurden in einer jeweiligen Entfernung von ungefähr 2 cm zugefügt. Als Kontrolle wurde Hyaluronsäure allein verwen det. Nach dem Verfahren gemäß Beispiel II wurde ein Peptid/Hyaluronsäure-Konjugat hergestellt (bakteriell abgeleitet; Genzyme). Die Wunden wurden mit oder ohne Tegaderm (3M; St. Paul, MN), einem die Luftzirkulation verhindernden, Okklusionsverband verbunden.
Die Wunden von drei Tieren wurden in drei Behandlungsgruppen unterteilt und wie folgt behandelt: Tier Der Luft ausgesetzt Peptid-Konjugat/Tegaderm Tegaderm Hyaluronsäure/Tegaderm
Im Bereich der vorderen zwei Drittel eines jeden Tieres wurden ungefähr 110 bis 120 Verbrennungswunden erzeugt. Das hintere. Drittel des Tieres wurde aufgrund anatomischer Unterschiede ausgespart, durch die hintere Verbrennungen schneller heilen.
Die Verbrennungswunden wurden unmittelbar nach der Verwundung einmal mit ausreichend Material zur Abdeckung der Wunde behandelt (ungefähr 0,1 ml). Das Peptid-Konjugat und Hyaluronat (Vehikel) wurden mit dem Tegaderm-Verband okkludiert. Die Tiere wurden mit adhäsiven Coban -Bandagen (Johnson und Johnson, New Brunswick, NJ) eingewickelt, um sicherzustellen, daß die Verbände an ihrem Platz blieben. Die Verbände wurden während des gesamten Experiments an ihre Stelle belassen.
An den Tagen 7 bis 15 wurden fünf Brandwunden von jeder Behandlungsgruppe operativ unter Verwendung des Elektrokeratoms (0,6 mm Tiefe) exzisiert. Jegliches Probenmaterial, welches exzisiert, aber nicht intakt war, wurde verworfen. Die exzisierten Brandwunden und die umgebende normale Haut wurden 24 Stunden lang bei 37 ºC in 0,5M NaBr inkubiert (Figur 4). Nach der Inkubation wurde das Untersuchungsmaterial in epidermale und dermale Schichten getrennt. Die Epidermis wurde anschließend makroskopisch auf Defekte im Bereich der Brandwunden untersucht. Eine Epithelialisierung wurde als vollständig betrachtet, wenn kein Defekt vorhanden war (geheilt), wohingegen jeglicher Defekt im Bereich der Verbrennung anzeigt, daß die Heilung unvollständig ist. Die epidermale Schicht wurde für eine permanente Aufzeichnung auf eine Pappe plaziert.
Die Anzahl an geheilten (epithelialisierten) Wunden wurde geteilt durch die Gesamtzahl an täglich entnommenen Wunden und mit 100 multipliziert, wie in Tabelle I dargestellt ist.
Am Tage 9 nach der Verwundung waren die mit Peptid/Hyaluronat-Konjugat behandelten Wunden zu 90 % epithelialisiert im Vergleich zu 0 %, 10 % und 70 % der der Luft ausgesetzten, mit Hyaluronat bzw. Kontroll-behandelten Wunden, was darauf hinweist, daß davon das Peptid/Hyaluronat-Konjugat die Wundheilung fördert. TABELLE 1 DER EFFEKT VON TELIO-DERM AUF DIE HEILUNG VON VERBRENNUNGEN ZWEITEN GRADES Behandlung Tage nach Verwundung Der Luft ausgesetzt Hyaluronat Peptid-Konjugat Tegaderm Die Daten sind dargestellt als Anzahl von geheilten Wunden gegenüber der Anzahl von aufgenommenen Wunden. () Prozent an epitheliallsierten Wunden.
Obgleich die Erfindung unter Bezugnahme auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte davon ausgegangen werden, daß vielfältige Modifikationen von dem Fachmann durchgeführt werden können, ohne den erfinderischen Gedanken zu verlassen. Demgemäß wird die Erfindung in den folgenden Ansprüchen dargelegt.

Claims

1. Synthetische extrazelluläre Substitutionsmatrix für die Wundheilung, umfassend:

a. ein synthetisches Peptid, welches die Aminosäuresequenz Y-Gly-Asp enthält, in der Y R oder dR ist, wobei das Peptid eine die Zellanheftung fördernde Aktivität aufweist, und

b. ein biologisch abbaubares Polymer, welches an das Peptid gebunden ist, ohne die Affinität zur Zellbindung im wesentlichen zu reduzieren, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Heparin, Heparansulfat, Polylactat und Polyglycolsäure,

wobei die Matrix die Zellanheftung und die Migration in dieselbe fördert und nicht ein fester Träger ist.

2. Matrix nach Anspruch 1, bei der das synthetische Peptid ferner mindestens eine Gruppe von mindestens drei identifizierten aufeinanderfolgenden Aminosäuren ausgewählt aus K, dK, R, dR, Ornithin oder D-Ornithin umfaßt.

3. Matrix nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Peptid an seinem C-Terminus die Aminosäure Lysin (K) aufweist.

4. Matrix nach Anspruch 1, bei der das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: G R G D S P K R R R R R R G D S P K G (dR) G D S P A S S K, nMeg (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K, G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K, und Peptiden, die irgendeine der obigen Sequenzen enthalten.

5. Matrix nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei der das biologisch abbaubare Polymer Hyaluronsäure umfaßt.

6. Matrix nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei der das biologisch abbaubare Polymer Chondroitinsulfat umfaßt.

7. Matrix nach Anspruch 1, bei der das synthetische Peptid G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K ist und bei der das biologisch abbaubare Polymer Hyaluronsäure ist.

8. Matrix nach Anspruch 1, bei der das synthetische Peptid G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K ist und bei der das biologisch abbaubare Polymer Chondroitinsulfat ist.

9. Matrix nach den Ansprüchen 1 bis 8, ferner umfassend ein Vernetzungsmittel.

10. Matrix nach Anspruch 9, bei dem das Vernetzungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), Dicyclohexylcarbodiimid, Glutaraldehyd, Bromcyan und N-Hydroxysuccinimid.

11. Verfahren zur Herstellung der synthetischen extrazellulären Substitutionsmatrix gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 eines Y- Gly-Asp enthaltenden synthetischen Peptids, bei dem Y R oder dR ist, und einem biologisch abbaubaren Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronat, Chondroitinsulfat, Heparin, Heparansulfat, Polylactat und Polyglykolsäure, umfassend die Schritte der Bindung von Aminosäureketten oder -termini des Peptids an eine Carboxylgruppe des biologisch abbaubaren Polymers mit Hilfe eines Vernetzungs- /Kopplungsmittels.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Vernetzungs-/Kopplungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), Dicyclohexylcarbodiimid, Glutaraldehyd, Bromcyan und N-Hydroxysuccinimid.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem das Peptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: G R G D S P K, R R R R R R G D S P K, G (dR) G D S P A S S K, nMeG (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K, G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K, und Peptiden, die irgendeine der obigen Sequenzen enthalten.

14. Synthetisches Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

nMeG (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K, und

G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K.

15. Verwendung einer synthetischen extrazellulären Substitutionsmatrix gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden.

16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Wunden schwere Verbrennungen, Hauttransplantatspenderstellen, Dekubitalgeschwüre, Diabetesgeschwüre, operative Schnitte oder keloidbildende Wunden sind.

17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, bei der das synthetische Peptid G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K ist und bei der das biologisch abbaubare Polymer Hyaluronsäure ist.

18. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, bei der das synthetische Peptid G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K ist und bei der das biologisch abbaubare Polymer Chondroitinsulfat ist.