DE69231065T2

DE69231065T2 - Heparin-und sulfatid-bindende peptide vom typ 1 der wiederkehrenden sequenzen vom menschlichen thrombospondin

Info

Publication number: DE69231065T2
Application number: DE69231065T
Authority: DE
Inventors: Nenghua Guo; C. Krutzsch; D. Roberts
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-07
Publication date: 2000-11-02
Anticipated expiration: 2012-12-08
Also published as: CA2125043A1; JPH07501808A; US5357041A; CA2125043C; ATE193022T1; EP0620825B1; AU674503B2; AU3239893A; EP0620825A1; JP3646808B2; DE69231065D1; WO1993011156A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide aus den drei Typ- I-Repeats von Thrombospondin aus humanen Endothelzellen, die an sulfatierte Glykokonjugate, umfassend Heparin und Sulfatide, binden.

Hintergrund der Erfindung

Heparinbindung bzw. Bindung an Heparin ist für Aktivitäten in vielen Zellwachstumsfaktoren, Zellhaftmolekülen bzw. Zellanheftungsmolekülen und bestimmten an der Blutgerinnungskaskade beteiligten Enzymen entscheidend. Mittel zur Hemmung dieser Wechselwirkungen wurden in zahlreichen Fällen zur Verhinderung von Thrombose verwendet. Für Heparinanaloga wurden Antitumor- und Antimetastasenaktivitäten aufgezeigt.
An Heparin bindende Peptide wurden ausgehend von vielen Heparinbindungsproteinen identifiziert oder aus diesen isoliert (s. beispielsweise Cardin et al., Arteriosclerosis, Band 9, S. 21-32 (1989)). Ausgehend von Haftmolekülen identifizierte Beispiele von Heparinbindungspeptiden umfassen Typ-IV-Collagen, Laminin und Fibronectin. Alle besitzen Cluster aus basischen Aminosäuren, die zu durch Vergleich vieler Heparinbindungsproteine (s. Cardin et al., a.a.O.) festgelegten Konsensussequenzen passen. Die Bindungskonstanten der Peptide von Cardin et al. und sonstiger auf diesem Fachgebiet beschriebener Peptide liegen im allgemeinen Bereich von 10&sup4; bis 10³ molar&supmin;¹.
Von Peptiden aus dem Protein von Malaria-Circumsporozoiten wurden offenbart, daß sie eine Zellhaftung vermitteln (Rich et al., Science, Band 249: 1574-1577 (1990)). Diese Peptide kranken an den Nachteilen, daß sie Heparin nicht binden, und die Haftaktivität wurde einer Sequenz Val-Thr-Cys-Gly, die bezüglich Heparinbindung inaktiv ist, zugeschrieben. Peptide von Thrombospondin wurden bereits offenbart (Prater et al., J. Cell Biol., Band 112, S. 1031-1040 (1992)). Die Sequenzen von Prater weisen einen deutlichen Nachteil auf, da sie unzureichend sind, um Heparin oder verwandte sulfatierte Glykokonjugate mit hoher Affinität zu binden.
Daher besteht derzeit auf dem einschlägigen Fachgebiet ein Bedarf nach hochwirksamen Peptiden, die an Heparin oder verwandte sulfatierte Glykokonjugate mit hoher Affinität binden. Es besteht insbesondere ein Bedarf nach solchen Peptiden, die sich auch zur Verhinderung einer Wechselwirkung von Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten mit Haftmolekülen, Wachstumsfaktoren, Zellen oder heparinabhängigen Enzymen eignen.
Die EP-A-443 404 bezieht sich auf spezielle Fragmente und Analoga von humanem Thrombospondin zusammen mit dem Einsatz dieser Verbindungen zur Hemmung von Tumormetastasierung und Wundheilung. Dieses Dokument lehrt, daß zumindest ein Teil von C(S,N)(V,T)(T,S)C(G,S), insbesondere die Subsequenz CSVTCG erforderlich ist. Die Sequenzen der EP-A-443 404 werden nicht als solche mit einer Heparinbindungsaktivität beschrieben.

Aufgabe der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher eine Behebung der im vorhergehenden beschriebenen Schwierigkeiten des Standes der Technik.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung hochwirksamer Peptide mit mit hoher Affinität an Heparin oder verwandte sulfatierte Glykokonjugate bindenden Sequenzen, die sich zur Verhinderung einer Wechselwirkung von Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten mit Haftmolekülen, Wachstumsfaktoren, Zellen oder heparinabhängigen Enzymen eignen.
Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von Peptiden mit Bindungskonstanten, die gegenüber auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Bindungskonstanten von Proteinen (Peptiden) unerwartet höher liegen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Peptiden, die eine hohe Bindungsaffinität zu Heparin oder verwandten sulfatierten Lactokonjugaten besitzen und die keine Ladung aufweisen (im wesentlichen neutrale Peptide), um vorteilhaftere pharmazeutische Mittel für eine effiziente Abgabe an die Wirkstellen zuzubereiten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Peptiden mit hoher Wirksamkeit bezüglich einer Bindung mit Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten, um viel kleinere Mengen an Peptid wirksam verabreichen zu können und dadurch die Gefahr einer Toxizität und des Hervorrufens von Immunreaktionen gegen die Peptide zu verringern.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 erläutert in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide.
Fig. 2 erläutert in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide.
Fig. 3 zeigt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide.
Fig. 4 zeigt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von 125I-Laminin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide.
Fig. 5 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an A2058-Melanomzellen durch Thrombospondinpeptide an.
Fig. 6 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an A2058-Melanomzellen durch Heparin und Thrombospondinpeptid ID SEQ NO: 1 an.
Fig. 7 gibt in einem Diagramm die Bindung von Anti-Thrombospondin-Antikörper A4.1 an Thrombospondinpeptide an.
Fig. 8 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate (Sulfatid) durch Thrombospondinpeptide an.
Fig. 9 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate (Heparin- BSA) durch Thrombospondinpeptide an.
Fig. 10 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an sulfatierte Glykokonjugate (Heparin-BSA) durch Thrombospondinpeptide an.
Fig. 11 zeigt in einem Diagramm die Bindung eines Peptids aus dem zweiten Typ-I-Repeat von Thrombospondin (SEQ ID NO: 19) an Heparinagarose.
Fig. 12 erläutert in einem Histogramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin oder ¹²&sup5;I-Thrombospondin an A2058-Melanomzellen durch Thrombospondinpeptide.
Fig. 13 erläutert in einem Histogramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Lamiriin an A2058-Melanomzellen durch Heparin und Thrombospondinpeptid 246 (SEQ ID NO: 19).
Fig. 14 zeigt in einem Histogramm den Grad der Haftung von A2058-Melanomzellen an einem Kontrollpeptid und 16 Thrombospondinpeptiden.
Fig. 15 zeigt in einem Diagramm die Konzentrationsabhängigkeit für die Haftung von A2058-Melanomzellen an 4 Thrombospondinpeptiden.
Fig. 16 gibt in einem Histogramm die Hemmung der Haftung von Melanomzellen an Thrombospondinpeptiden durch Heparinbindungspeptide an.
Die vorliegende Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen festgelegt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Peptids mit einer hoher Bindungsaffinität gegenüber Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten, d. h. einer Heparinbindungskonstante im Bereich von 10&sup7; bis 10&sup5; molar&supmin;¹. Bevorzugt sind Peptide mit einer Subsequenz von vier oder fünf Aminosäureresten, wobei die Subsequenz im wesentlichen keine Ladung aufweist. Der im vorhergehenden und im folgenden in der Anmeldung verwendete Ausdruck "verwandte sulfatierte Glykokonjugate" wird als sulfatierte Glykokonjugate, die zu Heparin ähnliche Bindungseigenschaften besitzen, festgelegt. Zweckmäßig ist ein erfindungsgemäßes Peptid mit einer Sequenz -Trp-Ser-Xaa-Trp-, wobei -Xaa- eine aus der Gruppe Pro, Glu, Ala, His und Ser ausgewählte Aminosäure ist. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Peptid mit einer Sequenz -Trp-Ser-Xaa-Trp-, mit Xaa gemäß der Festlegung der obigen Beschreibung, und ferner mit einer aus den Formeln -B1-B2-X-Y-B3- oder -B1-X-B2-Y-B3- ausgewählten Sequenz, wobei X und Y unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure sind und B1, B2 und B3 unabhängig voneinander aus der Gruppe Lys, Arg und His ausgewählt sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das im vorhergehenden beschriebene erfindungsgemäße Peptid ein Peptid mit einer Sequenz, die in unabhängiger Weise aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 19 ausgewählt ist.
Ferner ist ein Peptid mit einer erfindungsgemäßen Sequenz bevorzugt, wobei das Peptid so modifiziert ist, daß es ein aminoterminales N-Acetyl und ein carboxylterminales Amid umfaßt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Peptids mit einer hoher Bindungsaffinität gegenüber Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten und im wesentlichen ohne Ladung umfaßt und auch ein pharmazeutisch akzeptables Streckmittel oder einen entsprechenden Träger umfaßt.
Noch stärker bevorzugt ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, bei der die Zusammensetzung eine wirksame Menge eines Peptids mit einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 19, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Streckmittel oder Träger umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Bindung von Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten unter Verwendung einer wirksamen Menge eines Peptids mit einer Heparinbindungskonstante im Bereich von 10&sup7; bis 10&sup5; molar&supmin;¹.
Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem das Peptid eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 19, besitzt.

Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung

Wie im vorhergehenden beschrieben wird durch die vorliegende Erfindung eine Familie von Peptiden mit hoher Bindungsaffinität gegenüber Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten und im wesentlichen ohne eine Ladung bereitgestellt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Peptide zur Verhinderung einer Wechselwirkung von Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten mit Haftmolekülen, Wachstumsfaktoren, Zellen oder heparinabhängigen Enzymen. Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes bevorzugtes Peptid ein Peptid mit einer aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 19 ausgewählten Sequenz, das eine Familie verwandter Peptide, die an Heparin oder verwandte sulfatierte Glykokonjugate mit hoher Affinität binden, darstellt.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden aus dem Haftglykoprotein Thrombospondin erhalten und sind im vorhergehenden beschrieben. Die erfindungsgemäßen Peptide, deren Sequenzen in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind, und das Sequenzprotokoll können nach auf dem einschlägigen Fachgebiet anerkannten Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Maschinen zur Herstellung von Peptiden aus für das Peptid codierender DNA, die in einen Vektor insertiert wird, oder durch Isolieren der Sequenz aus dem Haftglykoprotein Thrombospondin. Festphasensyntheseverfahren können ebenfalls eingesetzt werden. Diesen Peptiden fehlen die Cluster aus basischen Aminosäuren, die mit den in vielen Heparinbindungsproteinen vorhandenen Konsensussequenzen übereinstimmen, und sie besitzen ferner Bindungskonstanten mit gegenüber den Proteinen mit den Konsensussequenzen der basischen Aminosäuren etwa 10- bis 100- fach höheren Werten. Die Bindungskonstanten der vorliegenden Familie von Peptiden betragen etwa 10&sup7; -10&sup5; molar&supmin;¹. Des weiteren ist das praktische Fehlen einer elektrischen Ladung für eine bevorzugte Subsequenz (mit vier oder fünf Aminosäureresten), die in bevorzugten Peptiden innerhalb der erfindungsgemäßen Peptidfamilie vorliegt, vorteilhaft bei der Zubereitung pharmazeutischer Mittel auf der Basis dieser Peptide für eine wirksame Abgabe an ihre Wirkstellen. Für bestimmte Anwendungen, bei denen das Fehlen von Ladung nicht erforderlich ist, einschließlich der Verwendung als Haftpeptid zur Kultivierung verankerungsabhängiger Zellen, kann eine Modifikation des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Peptids mit basischen Aminosäuresequenzen (beispielsweise wie in der SEQ ID NO: 19) die Aktivität und die Spezifität des Peptids bezüglich Heparin gegenüber sonstigen sulfatierten Glykokonjugaten erhöhen.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Peptidfamilie besteht darin, daß ihre höhere Wirksamkeit die Verabreichung viel geringerer Peptidmengen als den für die Peptide des Standes der Technik erforderlichen gestattet und dadurch die Gefahr einer Toxizität und Hervorrufung von Immunreaktionen gegen die Peptide verringert.
Peptide aus den drei Typ-I-Repeatregionen von humanem Thrombospondin wurden durch Festphasensynthese hergestellt. Die zur Festlegung einer Heparinbindungsspezifität verwendeten Peptide sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 und dem dieser Anmeldung beigefügten Sequenzprotokoll aufgelistet.
Die erfindungsgemäßen Peptide, die pharmazeutischen Zusammensetzungen und die erfindungsgemäßen Verfahren können unter Verwendung der folgenden allgemeinen Verfahren verifiziert werden.
Die Peptide wurden als Inhibitoren der Bindung von Laminin oder Thrombospondin an ein Heparin-Rinderserumalbumin-Konjugat oder an ein Sulfatid in einem Festphasentest im wesentlichen gemäß dem in Zabrenetzky et al., Cancer Res., Band 50, S. 5937-5942 (1990) beschriebenen Verfahren getestet.
Kurz gesagt wurde Heparin-BSA (0,2 ug/Vertiefung) auf Polyvinylchlorid-Mikrotiterplattenvertiefungen durch Inkubation in 50 ul Dulbecco-PBS während 2 h bei 37ºC absorbiert. Die Vertiefungen wurden geleert und mit 50 mM Tris, pH-Wert 7,8, mit 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM min gefüllt. Die Vertiefungen wurden geleert und jede Vertiefung wurde mit 30 ul potentiell hemmender Peptide in unterschiedlichen Konzentrationen, verdünnt im gleichen Puffer, oder mit Puffer allein und 30 ul ¹²&sup5;I-markiertem Laminin oder Thrombospondin (0,2 ug/ml) versetzt. Nach 2 h bei 4º wurden die Vertiefungen sechsmal mit 0,15 M NaCl gewaschen, aus der Platte geschnitten und es wurde die gebundene Radioaktivität gezählt.
Die Bindung von Laminin und Thrombospondin an Sulfatid wurde unter Verwendung eines Festphasentests bestimmt, wobei das Glykolipid in einer Phosphatidylcholin/Cholesterin-Monoschicht auf Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten immobilisiert war.
Für Untersuchungen der Hemmung der Bindung von Laminin oder Thrombospondin wurden Vertiefungen mit 200 ng Sulfatid für Thrombospondintests oder 600 ng für Laminintests, gemischt mit 50 ng Phosphatidylcholin und 30 ng Cholesterin, beschichtet. Die Peptide wurden auch als Inhibitoren der Bindung von Melanom- oder Endothelzellen an Thrombospondin unter Einsatz einer Zentrifugation über Öl zur Trennung des gebundenen vom freien Liganden getestet.
Mehrere Peptide aus den Typ-I-Repeats wurden bezüglich Hemmung der Bindung von Thrombospondin an Heparin und Sulfatid getestet (Fig. 1 und 2). Die gewählten Peptide flankierten die VTCG-Sequenz (SEQ ID NO: 5), die von Rich und Mitarbeitern als Haftmotiv identifiziert wurden, es fehlten ihnen jedoch die für die vorausgesagte Konsensussequenz der Heparinbindung benötigten Cluster aus basischen Aminosäuren. Uberraschenderweise waren lediglich die zur VTCG-Sequenz aminoterminalen Sequenzen aktiv (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3). Dodecapeptide aus allen drei Repeats hemmten die Heparin- und Sulfatidbindung mit I&sub5;&sub0;-Werten von 6- 100 uM (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3). Flankierende, an die einzelnen aktiven Peptide angrenzende Peptide waren inaktiv (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8). Dem Peptid aus Repeat 2 (SEQ ID NO: 2) folgte am stärksten Repeat 3 (SEQ ID NO: 3), dann Repeat 1 (SEQ ID NO: 1).
Die drei Repeatpeptide waren vergleichbare Inhibitoren der Bindung an Heparin mit I&sub5;&sub0;-Werten zwischen 10 und 20 uM. Zwei Peptide aus der aminoterminalen Heparinbindungsdomäne von Thrombospondin, die die vorausgesagten Konsensussequenzen für die Heparinbindung enthielten, hemmten ebenfalls die Bindung von Thrombospondin an Heparin, waren jedoch viel schwächer als die Typ-I-Repeatpeptide mit I&sub5;&sub0;-Werten von mehr als 100 uM. Diese Peptide hemmten jedoch die Bindung an Sulfatid nicht.
Da die am stärksten aktiven Peptide wenig oder keine basischen Aminosäuren enthielten, wurde die Möglichkeit erwogen, daß die Peptide eher durch Bindung an Thrombospondin als an die sulfatierten Glykokonjugate hemmten. Zur Prüfung dieser Möglichkeit wurden die Peptide als Inhibitoren der Bindung von Laminin an Heparin oder Sulfatid getestet (Fig. 3 und 4). Die gleichen Peptide hemmten die Bindung von Laminin an beide Substrate, was belegt, daß die Aktivität der Peptide eher für die sulfatierten Glykokonjugate als das Protein spezifisch war.
Mehrere Peptide, die Teile des am stärksten aktiven Peptids aus dem zweiten Typ-I-Repeat enthielten, wurden synthetisiert, um die aktive Sequenz für die Heparinbindung weiter festzulegen. VTCG (SEQ ID NO: 5) war inaktiv, obwohl ein diese Sequenz enthaltendes, größeres Peptid, CSVTCG (SEQ ID NO: 4), aktiv war. Dieses Peptid bildete jedoch in Lösung rasch Disulfidoligomere und die Hemmkurve war viel flacher als bei den sonstigen aktiven Peptiden, was eine heterogene Bindung oder als Artefakt erzeugte Hemmung infolge einer Aggregation des Peptids nahelegt. CSVT (SEQ ID NO: 9) war ebenfalls inaktiv, jedoch erzeugte eine Addition von zwei Resten unter Bildung von SSCSVT (SEQ ID NO: 13) eine schwache Hemmung. Ein Peptid aus acht Aminosäuren aus dem linken Teil des zweiten Repeats war aktiv (SEQ ID NO: 14), so wie auch ein Peptid aus zehn Aminosäuren, dem lediglich die ersten zwei Aminosäuren fehlten (SEQ ID NO: 16). Eine Substitution der zwei Trp-Reste in SEQ ID NO: 14 durch Ala-Reste (SEQ ID NO: 17) vernichtete die Aktivität. Deshalb sind die Trp-Reste von SEQ ID NO: 14 für eine Bindung mit hoher Affinität erforderlich.
Die Wirkungen von Peptiden auf die Bindung von Tumorzellen an Thrombospondin oder Laminin wurden untersucht. Peptide aus dem zweiten und dritten Repeat hemmten deutlich die Bindung von Laminin an A2058-Melanomzellen (Fig. 5). Wie für die Bindung an Heparin und die Sulfatidbindung beobachtet wurde, war das Peptid aus dem ersten Repeat schwächer.
Die Bindung von Thrombospondin an A2058-Melanomzellen wurde durch Peptid 184 (SEQ ID NO: 1) aus dem ersten Repeat gehemmt (Fig. 6). Die Hemmung war dosisabhängig und erfolgte bei vergleichbaren Konzentrationen wie bei der Hemmung der Thrombospondinbindung an Heparin oder Sulfatide. Ein Teil der Thrombospondinbindung an Melanomzellen kann durch Heparin nicht gehemmt werden (Fig. 6). Die Zugabe von Peptid 184 (SEQ ID NO: 1) in Gegenwart von Heparin führte zu keiner weiteren Hemmung der Bindung von Thrombospondin, was anzeigt, daß die Hemmung durch das Peptid eher konkurrierend mit einem sulfatierten Glykokonjugat als einem heparinresistenten Proteinrezeptor für Thrombospondin auf den Melanomzellen erfolgte.
Die Daten zeigen, daß eine Familie von Peptiden aus den Typ- I-Repeats von Thrombospondin wirksame Heparin- und Sulfatidbindungspeptide sind, die eine Bindung von Laminin und Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate hemmen können. Die Peptide erweisen sich auch als Inhibitoren der heparinabhängigen Wechselwirkungen von Laminin und Thrombospondin mit humanen Melanomzellen. Derzeit werden Versuche unternommen, um zu bestimmen, ob diese Peptide allgemeine Inhibitoren heparinabhängiger Proteine einschließlich sonstiger Haftproteine, Wachstumsfaktoren und Koagulationsenzyme sind.
Die folgenden Tabellen 1 und 2 führen in einem Einbuchstabenformat die Sequenzen auf, die im vorhergehenden diskutiert wurden und auf die in den Abbildungen Bezug genommen wird. Die Tabellen listen diese Sequenzen mit einer Kennzeichnungspeptidnummer oder -abkürzung auf und schließen eine entsprechende Sequenzprotokoll-Identifizierungsnummer ein. Die Sequenzen sind im Dreibuchstabenpeptidcode im dieser Anmeldung beigefügten Sequenzprotokoll angegeben.

Detaillierte Beschreibung von Fig. 1-6

Fig. 1-6 illustrieren Daten, die unter Verwendung der genannten allgemeinen Versuchsverfahren erhalten wurden. Die Strukturen (Sequenzen) der Peptide, deren Daten in Fig. 1-6 dargestellt sind, sind in den Tabellen 1 und 2 und durch das dieser Anmeldung beigefügte Sequenzprotokoll angegeben.
Fig. 1 erläutert in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Sulfatid überzogen und mit 0,2 ug/ml markiertem Thrombospondin in Gegenwart zunehmender Konzentrationen der Peptide: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 inkubiert. Über der Figur sind die Symbole für die einzelnen getesteten Peptide, die bei verschiedenen Konzentrationen im Diagramm gezeigt sind, aufgelistet. Die Bindung ist als Prozent der Kontrollbindung in Abwesenheit eines Inhibitors angegeben. Tabelle 1. Hemmung der Bindung von 125I-Thrombospondin an Heparin oder Sulfatid durch synthetische Peptide. Tabelle 2. Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin oder Apolipoprotein E an Heparin oder Sulfatid durch synthetische Peptide aus den Typ-I-Repeats von Thrombospondin.
Fig. 2 erläutert in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Heparin-BSA-Sulfatid überzogen und mit 0,2 ug/ml markiertem Thrombospondin in Gegenwart zunehmender Konzentration der Peptide: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 inkubiert. Über der Figur sind die Symbole für die einzelnen Peptide, die bei verschiedenen Konzentrationen im Diagramm gezeigt sind, angegeben. Die Bindung ist als Prozent der Kontrollbindung in Abwesenheit eines Inhibitors dargestellt.
Fig. 3 zeigt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Sulfatid wie in Fig. 1 wie im vorhergehenden beschrieben überzogen. Die Hemmung aufgrund der speziellen Peptide, die durch Symbole und Peptidnummern angegeben sind, wurde ebenfalls wie in Fig. 1 beschrieben bestimmt.
Fig. 4 zeigt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an sulfatierte Glykokonjugate durch Thrombospondinpeptide. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden wie im vorhergehenden in Fig. 2 beschrieben mit Heparin-BSA überzogen. Die Hemmung aufgrund der speziellen Peptide, die durch Symbole und Peptidnummern angegeben sind, wurde ebenfalls wie in Fig. 2 beschrieben bestimmt.
Fig. 5 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an A0058-Melanomzellen durch Thrombospondinpeptide an. Melanomzellen (1 · 10&sup5; in 0,2 ml) wurden mit 0,2 ug/ml markiertem Laminin allein oder in Gegenwart von 200 ug/ml der Peptide SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, welches die ersten, zweiten und dritten Repeats von Thrombospondin sind, inkubiert. Die Zellen wurden zur Trennung des freien Laminins von dem gebundenen Laminin über Öl zentrifugiert und anschließend wurde die Radioaktivität im Zellpellet durch einen Gammazähler quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der in Gegenwart (Anmerkung des Übersetzers: Abwesenheit) von Peptid bestimmten Kontrollbindung angegeben und der Mittelwert dreier Bestimmungen ± der Standardabweichung.
Fig. 6 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an A2058-Melanomzellen durch Heparin und Thrombospondinpeptid SEQ ID NO: 1 an. Melanomzellen (3 · 10&sup5; Zellen in 0,2 ml) wurden mit 0,2 ug/ml markiertem Thrombospondin allein oder in Gegenwart steigender Konzentrationen von Heparin oder Peptid mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder einer Kombination der zwei Inhibitoren inkubiert. Die Ergebnisse sind als Prozent der Kontrollbindung in Abwesenheit von Inhibitor angegeben und sind der Mittelwert einer Dreifachbestimmung.

Detailliertes experimentelles Vorgehen

Materialien: Thrombospondin wurde aus thrombinstimulierten humanen Plättchen gemäß einer früheren Beschreibung gereinigt (Roberts et al., J. Biol. Chem. 260, 9405-9411 (1985)). Rekombinante Heparinbindungsfragmente von Thrombospondin, die Reste 1-175 (28kD) und rekombinantes Apolipoprotein E wurden von Biotechnology General, Ltd., Rehovot, Israel geliefert. Aus dem Engelbreth Holm Swarm-Tumor durch Reinigung erhaltenes Mäuselaminin wurde von Dr. Lance Liotta, National Cancer Institute, bereitgestellt. Monoklonale Antikörper zu Thrombospondin wurden von Dr. William Frazier (Washington University, St. Louis) bereitgestellt. Thrombospondin, dessen Fragmente, Apolipoprotein E, BSA-Peptid-Konjugate und Laminin wurden mittels lodogen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wie bereits beschrieben (Roberts et al., J. Biol. Chem. 260, 9405-9411 (1985)) iodiert. Heparin-BSA-Konjugat wurde durch Kopplung von Rinderlungenheparin (The Upjohn Co.) über den reduzierenden Terminus an BSA durch reduktive Emanation in Gegenwart von NaBH&sub3;CN im wesentlichen in einer beschriebenen Weise (Funahashi et al., Anal. Biochem. 126, 414-421 (1982)) hergestellt. Rinderhirnsulfatid wurde von Supelco und Dipalmitoylphosphatidylcholin und Cholesterin wurden von Sigma erhalten.
Peptide wurden entsprechend Teilen der drei Typ-I-Repeats von humanem Thrombospondin wie in Tabelle 1 angegeben synthetisiert. Die Synthese erfolgte nach auf dem einschlägigen Fachgebiet geläufigen Verfahren zur Peptidsynthese. Die in dieser Untersuchung verwendeten Peptide wurden auf einem Peptidsynthesizer Biosearch Modell 9600 unter Verwendung von Standard-Merrifield-Festphasensyntheseprotokollen und t-Boc- Chemie synthetisiert. Die Peptide wurden durch Umkehrphasen- HPLC-Chromatographie analysiert. Die Peptidlösungen wurden durch Zugabe von verdünnter NaOH neutralisiert und in Lösung bei -20º gelagert. Die Peptide wurden über ihre Cysteinreste an BSA unter Verwendung von SPDP gekoppelt (Danilov et al., Exp. Cell Res. 182, 186-196 (1989)).
Hafttests: Die humane Melanomzellinie A2058 (Todaro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5258-5262 (1980)) wurde durch Monoschichtkultur bei 37º mit 5% Kohlendioxid in RPMI-1640- Medium mit 10% Rinderfötusserum aufrechterhalten. Für Anheftungstests wurden Zellen unter Verwendung von Trypsin entfernt, mit 104 Zellen/cm² vorbeigeführt und zwischen dem fünften und siebten Tag geerntet. Das Anheften und Ausbreiten auf thrombospondinbeschichtetem Kunststoff wurde nach einer bekannten Beschreibung bestimmt (Roberts et al., J. Cell Biol. 104, 131-139 (1987)). Die Hemmung wurde durch Zugabe des Inhibitors, der in 0,4 ml bicarbonatfreiem RPMI- 1640-Medium mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (fettsäurefrei, Sigma), pH-Wert 7,3, verdünnt war, zu Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, die mit Proteinen oder Peptiden überzogene Polystyrolscheiben enthielten, bestimmt. Die Melanomzellen wurden durch Inkubation mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 2,5 mM EDTA während 20 min bei 37º geerntet. Die Zellen wurden zentrifugiert und ihre Lebensfähigkeit (routinemäßig > 99%) wurde durch Trypanblauausschluß getestet. Die Zellen wurden in Medium resuspendiert und sich in der Suspension 1 h lang erholen gelassen. In jede Vertiefung wurden in 100 ul Medium suspendierte Melanomzellen (2 · 105) gegeben und 50-75 min lang bei 37º in einer Feuchtatmosphäre anheften gelassen. Das Anheften und Ausbreiten wurde mikroskopisch bestimmt.
Sulfatid- und Heparinbindung: Die Bindung von Laminin, Apolipoprotein E und Thrombospondin an Sulfatid oder Heparin wurde unter Verwendung eines Festphasentests gemäß einer vorherigen Beschreibung (8,22) bestimmt. Sulfatid (0,2 ug/Vertiefung für die Bindung von Thrombospondin, 0,6 ug/Vertiefung für die Bindung von Laminin) wurde in einem Gemisch von 50 ng Phosphatidylcholin und 30 ng Cholesterin auf Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten immobilisiert. Heparin-BSA (0,2 ug/Vertiefung) wurde auf Polyvinylchlorid-Mikrotiterplattenvertiefungen durch Inkubation von 50 ul Dulbecco-PBS während 2 h bei 37º absorbiert. Die Vertiefungen wurden geleert und mit 50 mM Tris, pH-Wert 7, 8, mit 150 mM NaCl, 1 mM CaCl&sub2;, 0,025% NaN3 und 1% BSA gefüllt. Nach 30 min wurden die Vertiefungen geleert und jede Vertiefung wurde mit 30 ul unterschiedlicher Konzentrationen potentieller hemmender Peptide, die im gleichen Puffer verdünnt waren, oder Puffer allein und 30 ul von ¹²&sup5;I-markiertem Laminin oder Thrombospondin (0,2 ug/ml) versetzt. Nach 3 h bei 4º wurden die Vertiefungen sechsmal mit 0,15 M NaCl gewaschen, aus der Platte geschnitten und es wurde die gebundene Radioaktivität gezählt.

Antikörperbindung an Peptide:

Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;-I-Thrombospondin oder Laminin an Zellen:

A2058-Melanomzellen wurden gemäß der vorherigen Beschreibung geerntet und in Dulbecco-PBS mit 1 mg/ml BSA suspendiert. In einem Endvolumen von 0,2 ml wurden 2 · 10&sup5; Zellen 15 min lang mit potentiellen Inhibitoren vorinkubiert. Markiertes Protein wurde zugegeben und das Ganze wurde auf einem Drehteller 1 h lang bei 20º inkubiert. Die Zellsuspension wurde in mit Tris-BSA-Puffer vorinkubierte 0,4-ml-Polypropylenmikrozentrifugenröhrchen (PGC) übertragen. Es wurde Öl (Nyosil-50, 0,2 ml) zugegeben und 1 min lang bei 10.000 min-1 in einer Beckman-Mikrozentrifuge B zentrifugiert. Die obere Phase wurde entfernt und die Ölschicht wurde mit 0,2 ml Tris-BSA-Puffer gewaschen und erneut zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgezogen und der Bodensatz des Röhrchens wurde gewonnen und gezählt.

Ergebnisse

Der monoklonale Antikörper A4.1 bindet an ein 50-kDa-Fragment von Thrombospondin (Prater et al., J. Cell Biol. 112, 1031-1040 (1991)), das die in mehreren Proteinen einschließlich des Circumsporozoitenproteins von Plasmodium falciparum konservierten Typ-I-Repeats enthält. In einer Vordurchmusterung der Thrombospondin-Antikörperreaktivität von Antikörper A4.1 mit überlappenden Peptiden aus dem Circumsporozoitenprotein fanden wir heraus, daß der Antikörper A4.1 stark an Peptide band, die die Sequenz SISTEWS enthielten (M. Seguin und D. Roberts, unveröffentlichte Ergebnisse). Wir stellten daher zu dieser Sequenz homologe Peptide aus den drei Typ-I- Repeats von Thrombospondin her (Tabelle 1) und testeten ihre Bindung an Antikörper A4.1 nach Konjugation mit BSA (Fig. 1). Der Antikörper A4.1 band stark an das Peptid 184 (SEQ ID NO: 1) aus dem ersten Typ-I-Repeat und er band schwach an die Peptide 185 und 186 (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3) aus dem zweiten und dritten Repeat, jedoch nicht an eine Reihe von Peptiden, die zu den aktiven Sequenzen benachbarte flankierende Sequenzen enthielten. Unter Verwendung von direkt auf Kunststoff aufgetragenen Peptiden band der Antikörper A4.1 am besten an das Peptid 185 (SEQ ID NO: 2) aus dem zweiten Repeat und weniger an die Peptide aus dem ersten und dritten Repeat (Daten nicht angegeben). Der Antikörper A4.1 bindet daher spezifisch an drei Dodecapeptide (12 Aminosäuren in jeder Kette) aus den Typ-I-Repeats von Thrombospondin, obwohl aus den vorliegenden Ergebnissen nicht klar ist, ob der Antikörper zwischen den drei Repeats unterscheidet.
Da das Anheften von Zellen an dem 50-50-kD-Fragment von Thrombospondin durch sulfatierte Polysaccharide partiell gehemmt wird (Prater et al., J. Cell Biol. 112, 1031-1040 (1991)), wurden mehrere Peptide aus den Typ-I-Repeats bezüglich Hemmung der Bindung von Thrombospondin an Heparin und Sulfatid getestet (Fig. 2A und 2B). Die gewählten Peptide flankierten die VTCG-Sequenz (SEQ ID NO: 5), die von Rich und Mitarbeitern als Haftmotiv identifiziert wurde (Rich et al., Science 249, 1574-1577 (1990)), in den meisten Fällen fehlten jedoch die für die vorhergesagte Konsensussequenz der Heparinbindung benötigten Cluster basischer Aminosäuren. Überraschenderweise waren die zur VTCG-Sequenz aminoterminalen Sequenzen am aktivsten. Dodecapeptide aus allen drei Repeats (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3) hemmten die Bindung von Thrombospondin an sowohl Heparin als auch Sulfatid mit I&sub5;&sub0;-Werten im Bereich von 6-50 uM. Das Peptid aus dem dritten Repeat (SEQ ID NO: 3) war der aktivste Inhibitor der Heparinbindung, gefolgt vom zweiten und ersten (SEQ ID NO: 1) Repeat. Die Hemmungsreihenfolge war für die Bindung von Thrombospondin an Sulfatid verschieden, wobei das Peptid des zweiten Repeats (SEQ ID NO: 2) der am stärksten wirksame Inhibitor war (Fig. 2B). Zwei Peptide aus der aminoterminalen Heparinbindungsdomäne von Thrombospondin wurden getestet, wobei diese Konsensussequenzen für die Heparinbindung, die Reste 23-32 bzw. 77-83 (Tabelle 1), enthalten. Lediglich das erstere Peptid hemmte die Bindung von Thrombospondin an Heparin mit einem I&sub5;&sub0;-Wert von 60 uM. Diese Peptide hemmten jedoch die Bindung von Thrombospondin an Sulfatid nicht.
Da die am stärksten aktiven Peptide wenig oder keine basischen Aminosäuren enthielten, bestand die Möglichkeit, daß die Peptide eher durch Binden an eine Heparinbindungsstelle auf Thrombospondin als an die sulfatierten Glykokonjugate hemmten. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden die Peptide als Inhibitoren der Bindung von Laminin und Apolipoprotein E an Heparin oder Sulfatid getestet (Fig. 2C und Tabelle 2). Eben diese Peptide waren als Inhibitoren beider Proteine aktiv und sie hemmten die Bindung von Laminin an beide Substrate. Da es höchst unwahrscheinlich ist, daß die gleichen Peptide spezifisch an Heparinbindungsstellen auf drei nicht miteinander verwandten Proteinen binden können, beruht die Aktivität der Peptide eher auf der Bindung an die sulfatierten Glykokonjugate als das Protein. Das Fehlen einer Bindung der Peptide an Laminin oder Thrombospondin wurde dadurch bestätigt, daß es nicht gelang, markiertes Thrombospondin oder Laminin an die direkt auf Kunststoff oder als BSA-Konjugate immobilisierten Peptide zu binden (Ergebnisse nicht angegeben).
Mehrere Peptide, die Teile aus der am stärksten aktiven Sequenz aus dem zweiten Typ-I-Repeat enthielten, wurden synthetisiert und als Inhibitoren der Bindung von Thrombospondin und Laminin getestet, um die aktive Sequenz für die Heparinbindung weiter festzulegen (Tabellen 1 und 2). VTCG war inaktiv, obwohl ein größeres, diese Sequenz enthaltendes Peptid, CSVTCG, aktiv war. Dieses Peptid bildete jedoch in Lösung rasch Disulfidoligomere, basierend auf Umkehrphasen- HPLC-Analyse. Die Hemmkurve war sehr viel flacher als diejenigen für die anderen aktiven Peptide (Fig. 2C), was eine heterogene Bindung oder eine Hemmung als Artefakt aufgrund der Aggregation des Peptids nahelegt. Ein Analogon dieses Peptids, bei dem das erste Cystein durch ein Serin ersetzt war, SSVTCG, war ein sehr schwacher Inhibitor, mit Ausnahme der Bindung von Thrombospondin an Sulfatid, wobei es zweifach weniger aktiv war als CSVTCG. CSVT war ebenfalls inaktiv, jedoch ergab das Hinzufügen von zwei Resten am Aminoterminus unter Bildung von SSCSVT eine schwache Hemmung der Bindung von Thrombospondin.
Mehrere kleinere Peptide, die aus der aktiven Sequenz des zweiten Typ-I-Repeats abgeleitet waren, waren ebenfalls wirksame Inhibitoren (Tabellen 1 und 2). Das Peptid mit den ersten acht Resten, SHWSPWSS, war bezüglich einer Hemmung der Bindung von Thrombospondin aktiver als das intakte Dodecapeptid. Ein Decapeptid, dem die ersten zwei Aminosäuren des Dodecapeptids fehlten, war ebenfalls ein wirksamer Inhibitor, jedoch war ein die acht mittleren Reste umfassendes Peptid viel weniger aktiv. Durch Vergleich mit den Sequenzen in den anderen zwei Typ-I-Repeats kann eine minimale Konsensussequenz für die Bindung festgelegt werden: SXWSPWXS. Die zwei Trp-Reste und der zweite Ser-Rest waren vollständig konserviert. Um die Funktion von Tryptophan bei der Bindung zu testen, wurde ein Octapeptid, SHASPASS, synthetisiert, bei dem die Trp-Reste durch Ala substituiert waren. Dieses Peptid war mehr als 100-fach weniger aktiv als die natürliche Sequenz in Thrombospondin, SHWSPWSS. Daher ist mindestens einer der beiden Trp-Reste für die Aktivität essentiell.
Die vermutliche Heparinbindung-Konsensussequenz rechts der VTCG-Sequenz im dritten Repeat und eine ähnliche Sequenz links der aktiven Sequenz im zweiten Repeat wurden ebenfalls bezüglich Aktivität getestet (Tabellen 1 und 2). Ein Peptid, das VTCGY enthielt und sich über das BBXB-Motiv erstreckte (VTCGGGVOKRSRL), war inaktiv. Das Hinzufügen des flankierenden BBXB-Motivs an den zweiten Repeat (KRFKQDGGWSHWSPWSS) (SEQ ID NO: 19) verstärkte jedoch die Aktivität bezüglich der Hemmung der Bindung von Thrombospondin oder Laminin an Heparin auf das nahezu Dreifache, verringerte aber die Aktivität bezüglich einer Hemmung der Bindung beider Proteine an Sulfatid deutlich.
Die Rolle des dritten Trp-Rests, des konservierten Ser-Rests und des Abstands zwischen den Trp-Resten in der Heparinbindungsaktivität wurde unter Verwendung synthetischer Analoga der Typ-I-Konsensussequenz geprüft (siehe die folgende Tabelle 3). Das Hinzufügen eines dritten Trp-Rests (Peptid 256, SEQ ID NO: 22) erhöhte die Aktivität bezüglich der Bindung von Laminin, verringerte jedoch leicht die Aktivität bezüglich Thrombospondin. Der Abstand der zwei erforderlichen, drei Reste voneinander entfernten Trp-Reste war für eine optimale Aktivität entscheidend, da eine Entfernung der beiden Reste zwischen den zwei Trp-Resten die Aktivität beseitigte (Peptid 257, SEQ ID NO: 23) und das Analogon mit lediglich einem Rest zwischen den Trp-Resten (Peptid 258,SEQ ID NO: 24) nur bezüglich einer Hemmung der Bindung von Laminin aktiv war. Eine Erhöhung des Abstands auf vier Reste (Peptid 260, SEQ ID NO: 26) oder sechs Reste (Peptid 259,SEQ ID NO: 25) beseitigte ebenfalls die Aktivität. Die Substitution des konservierten Ser-Rests verursachte ebenfalls einen Aktivitätsverlust (Peptid 261, SEQ ID NO: 27). Deshalb sind mindestens zwei Trp-Reste im Abstand von drei Resten für eine starke Aktivität erforderlich. Der erste Abstandsrest muß Ser sein, doch ist der zweite Abstandsrest nicht konserviert.
Zum direkten Nachweis der Bindung der aktiven Peptide an Heparin wurde das Peptid aus dem zweiten Repeat, 246 (SEQ ID NO: 19), auf eine Heparinaffinitätssäule appliziert (Fig. 3).
Das Peptid wurde quantitativ gebunden, wenn es in Trispuffer appliziert und auf einem NaCl-Gradienten in drei Experimenten mit 0,13 bis 0,16 M NaCl eluiert wurde. Der kleine nichtgebundene Peak ist eine Nichtpeptid-Verunreinigung.
Peptide aus den Typ-I-Repeats hemmten die Bindung von Thrombospondin und Laminin an A2058-Melanomzellen deutlich (Fig. 4). Die Reihenfolge der Aktivitäten der Peptide war die gleiche wie die bezüglich der Bindung der jeweiligen Proteine an Heparin beobachtete. Das Peptid mit dem erweiterten zweiten Repeat (246 (SEQ ID NO: 19)) war am aktivsten, wobei es die Bindung von Thrombospondin bei 10 ug/ml zu mehr als 90% hemmte. Bei den verwendeten Konzentrationen war die Hemmung der Bindung an Melanomzellen durch die Dodecapeptide aus allen drei Typ-I-Repeats partiell. In zusätzlichen Experimenten (Daten nicht angegeben) war die Hemmung dosisabhängig und erfolgte bei vergleichbaren Konzentrationen, wie sie zur Hemmung der Bindung der Proteine an Heparin benötigt wurden. Eine vollständige Hemmung konnte jedoch für die Dodecapeptide nicht nachgewiesen werden, da die Bindung durch höhere Konzentrationen verstärkt wurde (Ergebnisse nicht angegeben).
Heparin hemmte die Bindung von sowohl Thrombospondin als auch Laminin an die A2058-Melanomzellen (Fig. 4). Die Bindung von Thrombospondin wurde zu etwa 90% gehemmt, jedoch waren etwa 50% der Lamininbindung gegenüber einer Hemmung durch überschüssiges Heparin beständig. Die Bindung von Laminin an A2058-Melanomzellen wurde bereits als partiell heparinabhängig angegeben (Taroboletti et al., J. Biol. Chem. 265, 12253-12258 (1990)). Die Zugabe von 1 ug/ml Peptid 246 in Gegenwart von Heparin führte zu keiner weiteren Hemmung der Bindung von Laminin (Fig. 5), was belegt, daß die Hemmung durch das Peptid eher aufgrund einer konkurrierenden Bindung an ein sulfatiertes Glykokonjugat als an einen heparinbeständigen Proteinrezeptor für Laminin auf den Melanomzellen erfolgte. Bei 10 ug/ml Peptid wurde die Hemmung der Lamininbindung partiell durch die Zugabe von Heparin umgekehrt, vermutlich aufgrund der Bindung des Heparins an das Peptid.
Mehrere der Peptide förderten bei Absorption auf Kunststoff das Anheften von Melanomzellen stark (Fig. 6). Die Aktivität im Hafttest war mit der Fähigkeit der Peptide zur Hemmung der Bindung von Thrombospondin an Heparin oder Sulfatid konsistent. Peptid 185 (SEQ ID NO: 2) war in beiden Tests aktiver als 184 (SEQ ID NO: 1) oder 186 (SEQ ID NO: 3). Die aktiven Subfragmente von 185 (SEQ ID NO: 4) förderten ebenfalls die Zellhaftung. Keines der Peptide mit VTCG förderte eine deutliche Zellhaftung über dem Rauschen mit Ausnahme von CSVTCG (SEQ ID NO: 4). Wie bei der Hemmung der Heparinbindung beobachtet, brachte die Substitution des ersten Cys-Rests in CSVTCG (SEQ ID NO: 4) durch Ser die Aktivität bezüglich Förderung der Haftung von Melanomzellen (SEQ ID NO: 2) zum Erliegen. Die zwei Peptide aus der aminoterminalen Domäne von Thrombospondin förderten das Anheften von Melanomzellen nicht.
Das Anheften an die Peptide war dosisabhängig (Fig. 7). Das ausgedehnte Peptid aus dem zweiten Repeat (246) war am aktivsten und förderte bei 10 ug/ml ein intensives Ausbreiten von Melanomzellen. Trp-Reste waren zum Anheften erforderlich, da das Ala-Ersetzungen enthaltende Octapeptid inaktiv war.
Ein rekombinantes 18-kD-Heparinbindungsfragment von Thrombospondin und Apolipoprotein E hemmten das Anheften von A2058- Melanomzellen an die Peptide (Fig. 7). Die Hemmung war durch Apolipoprotein E größer als durch das Thrombospondinfragment. Diese Aktivitätsreihenfolge ist mit der größeren Affinität von Apolipoprotein E bezüglich Heparin konsistent. Da beide Proteine an Heparinsulfat binden, legt dieses Ergebnis nahe, daß die Peptide das Anheften von Zellen durch Binden an Heparinsulfatproteoglycane auf den Melanomzellen fördern.
Die vorliegende Erfindung legt eine neue Klasse wirksamer Heparinbindungspeptide aus den Typ-I-Repeatsequenzen von Thrombospondin, denen die derzeit bekannten Heparinbindung- Konsensussequenzen fehlen, fest. Die vorliegenden Daten zeigen, daß Peptide aus den Typ-I-Repeats wirksame Heparin- und Sulfatidbindungspeptide sind, die Wechselwirkungen von drei Heparinbindungsproteinen mit sulfatierten Glykokonjugaten hemmen können. Diese Peptide können allgemeine Inhibitoren von heparinabhängigen Haftproteinen, Wachstumsfaktoren und Koagulationsenzymen sein. Die Peptide, die eine Bindung an Heparin hemmen, fördern bei Immobilisierung auf Kunststoff stark das Anheften von Melanomzellen. Die Peptide hemmen auch einig heparinabhängige Wechselwirkungen von Lamino und Thrombospondin mit humanen Melanomzellen. Obwohl vermutete Heparinbindungssequenzen in der aminoterminalen Domäne von Thrombospondin in dem vor kurzem identifizierten zweiten Gen für Thrombospondin nicht konserviert sind (Bornstein et al., J. Biol. Chem. 266, 12821-12824 (1991)), sind die hier identifizierten Heparinbindungssequenzen aus den Typ-I-Repeats konserviert.
Die primäre Hemmaktivität befindet sich in einer Octapeptidsequenz in jedem Typ-I-Repeat, dem allgemein basische Aminosäuren fehlen, der jedoch zwei konservierte Trp-Reste und einen konservierten Ser-Rest enthält. Die Substitution mit Ala belegt, daß mindestens einer der Trp-Reste und der Ser- Rest für die Heparin- oder Sulfatidbindung und die Förderung des Anheftens von Melanomzellen essentiell sind. Die schwache Aktivität von SSCSVT (SEQ ID NO: 13) und die verstärkte Aktivität von WSPWSSCSVT (SEQ ID NO: 16) gegenüber WSPWSSCS (SEQ ID NO: 15) legt nahe, daß eine zweite aktive Sequenz vorliegen kann. Die Tetrapeptide CSVT (SEQ ID NO: 9) oder das bereits beschriebene VTCG (SEQ ID NO: 5) sind jedoch inaktiv.
Das Peptid CSVTCG (SEQ ID NO: 4) ist aktiv. Seine Aktivität erfordert jedoch möglicherweise eine Disulfid-vermittelte Polymerisation, da die Substitution des ersten Cys mit Ser zur Verhinderung einer Polymerisation den größten Teil der Aktivität entfernt. Es bleibt zu bestimmen, ob zwei Subbereiche vorliegen oder ob die Aktivitätsunterschiede der Peptide auf einer Variation der Konformation einer einzigen aktiven Sequenz in den Peptiden beruhen. VTCG (SEQ ID NO: 5) wird als potentielle Haftsequenz in den Typ-I-Repeats vorgeschlagen, wobei sie an Proteinrezeptoren für Thrombospondin bindet (Rich et al., Science 249, 1574-1577 (1990); Prater et al., J. Cell Biol. 112, 1031-1040 (1991)). Diese Sequenz bindet Heparin nicht, doch hemmt das verwandte Peptid CSVTCG (SEQ ID NO: 4) die Bindung von Thrombospondin an Heparin. Da CSVTCG (SEQ ID NO: 4) auch die Bindung von Laminin und Apolipoprotein E hemmt, eignet sich dieses Peptid jedoch nicht als spezifische Sonde der Bindung von Thrombospondin an potentielle Proteinrezeptoren, die die VTCG (SEQ ID NO: 5)-Sequenz erkennen.
Eine minimale Konsensussequenz Ser-X-Trp-Ser-Pro-Trp-X-Ser wurde durch Vergleich der Sequenzen der am stärksten aktiven Peptide abgeleitet. Die in dieser Sequenz absolut konservierten Aminosäurereste sind die zwei Tryptopharie und das auf das erste Trp folgende Serin. Zumindest einer der zwei Trp-Reste ist für die Aktivität essentiell, da die Substitution beider Reste durch Alanin die Aktivität zum Erliegen brachte. Daher ist im Gegensatz zu früher festgelegten Heparinbindungspeptiden, die Cluster von basischen Aminosäureresten enthalten (Cardin et al., Arteriosclerosis 9, 21-32 (1989); Jackson et al., Physiol. Rev. 71, 481-539 (1991)), Tryptophan eine Hauptdeterminante der Bindung von Heparin an die Typ-I-Repeats. Tryptophan ist bereits an der Bindung von Heparin an Antithrombin III beteiligt (Blackburn et al., J. Biol. Chem. 259, 939-941 (1984)). Eine chemische Modifikation von Trp 49 blockierte die Bindung von Heparin und die durch Heparin verstärkte Hemmung von Thrombin durch Antithrombin III. Durch kristallographische Analyse wurde gezeigt, daß Tryptophan direkt an der Bindung von Kohlehydrat an einen monoklonalen Anti-Kohlehydrat-Antikörper beteiligt ist (Cygler et al., Science 252, 442-445 (1991)) und mit Kohlehydraten über von-der-Waals-Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen wechselwirkt. Über ein Analogon von Tryptophan, Serotonin, wurde ebenfalls berichtet, daß es spezifisch an Sialyloligosaccharide bindet (Sturgeon et al., Carbohydr. Res. 103, 213-219 (1982)). Eine weitere Charakterisierung der Wechselwirkungen der Thrombospondinpeptide mit Heparin, umfassend spektroskopische und kristallographische Analyse, ist zur Bestimmung der Rolle von Tryptophan bei der Bindung und zur Prüfung des Beitrags anderer Aminosäuren, einschließlich des konservierten Serins, notwendig.
Obwohl Heparin mit der Bindung von Sulfatid an Laminin und Thrombospondin konkurriert, zeigen die Typ-I-Repeatpeptide einige Unterschiede zwischen den Heparin- und Sulfatidbindungsaktivitäten. Die bereits festgelegten Heparin-Konsensussequenzen aus der aminoterminalen Domäne von Thrombospondin hemmen die Heparinbindung schwach. Eine ähnliche Sequenz im zweiten Typ-I-Repeat verstärkt die Hemmung der Heparinbindung, wenn sie die Tryptophan enthaltende Heparinbindungssequenz mit umfaßt. Peptiden, die das Heparinbindungsmotiv BBXB (Asx-Asx-Xäa-Axs) enthielten, gelang es jedoch in allen Fällen nicht, mit Sulfatid zu wechselwirken. In der Tat verringerte das Hinzufügen der basischen Sequenz in dem zweiten Repeat die Aktivität in Sulfatidbindungstests. Ein Heparinbindungsmotiv in Verbindung mit VTCG (SEQ ID NO: 5), von dem vorgeschlagen wurde, daß es eine Sulfatidbindung durch Proteine mit gemeinsamen Typ-I-Repeat-Homologien vermittelt (Holt et al., J. Biol. Chem. 264, 12138-12140 (1989)), hemmte die Bindung von Thrombospondin an Heparin oder Sulfatid nicht und es hemmte die Bindung von Laminin lediglich an Heparin schwach. Diese Ergebnisse sind mit unserem früheren Bericht konsistent, daß Heparinbindung- Konsensussequenzen in einem denaturierten 30-kD-Fragment der A-Kette von Laminin für eine Heparin-, jedoch nicht für eine Sulfatidbindung ausreichend sind (Taraboletti et al., J. Biol. Chem. 265, 12253-12258 (1990)).
Thrombospondin enthält zwei potentielle Heparinbindungsbereiche. Sowohl die direkte Bindung als auch die Antikörperhemmung belegen, daß die aminoterminale Domäne an einigen Wechselwirkungen mit sulfatierten Glykokonjugaten auf Zellen beteiligt ist. Auf den vorliegenden Ergebnissen beruhend enthalten die Typ-I-Repeats starke Heparinbindungssequenzen. Die Wechselwirkung des 50-70-kD-Fragments von Thrombospondin, das diese Sequenzen enthält, mit Melanomzellen ist partiell heparinabhängig (Prater et al., J. Cell Biol. 112, 1031-1040 (1991)). Das größere, die gleichen Sequenzen enthaltende 140-kD-Fragment bindet jedoch an Heparin, Sulfatid oder Heparinsulfat nicht (Roberts, Cancer Res. 48, 6785-6793 (1988); Kaesberg et al., J. Clin. Invest. 83, 994-1001 (1989)). Die Sequenzen sind in diesem Fragment daher verborgen. Es kann noch nicht ermittelt werden, ob die Sequenz im intakten Protein verborgen ist. Bisher waren jedoch alle berichteten Wechselwirkungen von intaktem Thrombospondin mit sulfatierten Glykokonjugaten gegenüber Antikörper A2.5, der an die aminoterminale Domäne bindet, empfindlich.
Fig. 7-16, die im vorhergehenden kurz beschrieben wurden, werden nun im folgenden genau beschrieben. Fig. 7 gibt in einem Diagramm die Bindung von Anti-Thrombospondin-Antikörper A4.1 an Thrombospondinpeptide an. Die Bindung von Anti- Thrombospondin-Antikörper A4.1 (5 gg/ml) an mit BSA konjugierte Thrombospondin-Typ-I-Repeatpeptide wurde wie bei "Materialien und Verfahren" beschrieben bestimmt. Die gebundene Radioaktivität wird als Funktion der Masse des zugesetzten Peptid-BSA-Konjugats (184); (185); (186); (187); (203) (204); (205) und (206) (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 8) angegeben.
Fig. 8 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate (Sulfatid) durch Thrombospondinpeptide an. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Sulfatid überzogen und mit 0,2 ug/ml markiertem Thrombospondin in Gegenwart zunehmender Konzentrationen der Peptide 184; 185; , 186; 187; 203; 204; 205; 206 (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 8) inkubiert. Die Strukturen der Peptide sind in Tabelle 1 angegeben. Die Bindung wird als Prozentsatz der Kontrollbindung in Abwesenheit von Inhibitor angegeben.
Fig. 9 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Thrombospondin an sulfatierte Glykokonjugate (Heparin- BSA) durch Thrombospondinpeptide an. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Heparin-BSA überzogen und mit 0,2 ug/ml markiertem Thrombospondin in Gegenwart zunehmender Konzentrationen der Peptide 184; 185; 186; 187; 203; 204; 205; 206 (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 8) inkubiert. Die Strukturen der Peptide sind in Tabelle 1 angegeben. Die Bindung wird als Prozentsatz der Kontrollbindung in Abwesenheit von Inhibitor angegeben.
Fig. 10 gibt in einem Diagramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an sulfatierte Glykokonjugate (Heparin-BSA) durch Thrombospondinpeptide an. Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Heparin-BSA überzogen und mit 0,2 ug/ml markiertem Laminin in Gegenwart zunehmender Konzentrationen der Peptide 184, 185, 186, 187, 203, 204, 205 und 206 (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 8) inkubiert. Die Strukturen der Peptide sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Die Bindung wird als Prozentsatz der Kontrollbindung in Abwesenheit von Inhibitor angegeben.
Fig. 11 zeigt in einem Diagramm die Bindung eines Peptids aus dem zweiten Typ-I-Repeat von Thrombospondin an Heparinagarose. Das Peptid 246 (KRFKQDGGWSHWSPWSS, 100 ug) wurde auf eine Heparinagarosesäule von 0,7 · 7 cm in 20 mM Tris puffer (pH-Wert 7,4) appliziert und mit einer Strömungsrate von 0,7 ml/min mit einem Gradienten bis zu 0,5 M NaCl im gleichen Puffer eluiert. Die Extinktion wurde bei 280 mm registriert. Die NaCl-Konzentration wurde mittels der Leitfähigkeit bestimmt.
Fig. 12 illustriert in einem Histogramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin oder ¹²&sup5;I-Thrombospondin an A2058- Melanomzellen durch Thrombospondinpeptide. Melanomzellen (2 · 10&sup5; in 0,2 ml) wurden mit 0,2 ug/ml markiertem Laminin oder Thrombospondin allein oder in Gegenwart von 10 ug/ml von Peptiden aus dem ersten (184, SEQ ID NO: 1), zweiten (185, SEQ ID NO: 2, und 246, SEQ ID NO: 19) oder dritten Typ- I-Repeat von Thrombospondin (186) oder 1 ug/ml Heparin inkubiert. Die Zellen wurden über Öl zur Abtrennung von gebundenem von freiem Laminin zentrifugiert und die Radioaktivität im Zellpellet wurde in einem Gammazähler quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der in Abwesenheit von Peptid bestimmten Kontrollbindung und als Mittelwert von drei Bestimmungen ± Standardabweichung angegeben.
Fig. 13 illustriert in einem Histogramm die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-Laminin an A2058-Melanomzellen durch Heparin und Thrombospondinpeptid 246 (SEQ ID NO: 19). Melanomzellen (2 · 10&sup5; Zellen in 0,2 ml) wurden mit 0,2 ug/ml markiertem Laminin allein oder in Gegenwart von 0,1 ug/ml Heparin oder 1 oder 10 ug/ml Peptid 246 oder einer Kombination der zwei Inhibitoren inkubiert. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Kontrollbindung in Abwesenheit von Inhibitor und als Mittelwert von drei Bestimmungen ± Standardabweichung angegeben.
Fig. 14 zeigt in einem Histogramm das Ausmaß des Haftens von A2058-Melanomzellen an einem Kontrollpeptid und 16 Thrombospondinpeptiden. Haftung von A2058-Melanomzellen an Thrombo spondinpeptiden. Bakteriologisches Polystyrol wurde mit den angegebenen Peptiden mit 200 ug/ml überzogen. A2058-Melanomzellen, 103/mm², wurden zugegeben, und 60 min lang bei 37º inkubiert. Die Haftung wurde mikroskopisch bestimmt und als Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6, angegeben.
Fig. 15 zeigt in einem Diagramm die Konzentrationsabhängigkeit für die Haftung von A2058-Melanomzellen an vier Thrombospondinpeptiden. Die mikroskopisch bestimmte Haftung wird als Prozentsatz der applizierten Zellen (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6) auf Kunststoffscheiben, die mit den angegebenen Konzentrationen der Peptide 185, 239, 244 oder 246 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17 bzw. SEQ ID NO: 19) überzogen sind, angegeben. Die unspezifische Haftung betrug 1,9 ± 0,9%.
Fig. 16 gibt in einem Histogramm die Hemmung der Haftung von Melanomzellen an Thrombospondinpeptiden durch Heparinbindungspeptide an. Melanomzellen (1 · 10³/mm²) in RPMI-Medium oder Medium, das die angegebenen Konzentrationen des 18-kD- Thrombospondinfragments (volle Balken), 28-kD-Thrombospondinfragments (graue Balken) oder von Apolipoprotein E (gestreifte Balken) enthielt, wurden sich auf Polystyrolscheiben, die mit 200 ug/ml Peptid 185 (SEQ ID NO: 2) überzogen waren, anheften gelassen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6, angegeben.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Peptide auf einem geeigneten Substrat entweder direkt oder nach Konjugation mit einem geeigneten Trägerpolymer oder -protein immobilisiert werden. Geeignete Substrate, Trägerpolymere und Trägerproteine sind einem Fachmann üblicher Erfahrung auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Solche immobilisierten Zusammensetzungen sind zur Förderung von Haftung und Wachstum verankerungsabhängiger Zellen geeignet. Besonders bevorzugt ist eine Aus führungsform, bei der das immobilisierte Peptid Peptid 246 (SEQ ID NO: 19) ist.
Die vorstehende Beschreibung der speziellen Ausführungsformen legt die allgemeine Natur der Erfindung so vollständig dar, daß andere durch Anwendung des derzeitigen Wissensstandes solche spezielle Ausführungsformen ohne weiteres modifizieren und/oder für bestimmte Anwendungen anpassen können, ohne vom Ausgangskonzept abzuweichen, und daher sollen solche Anpassungen innerhalb des Umfangs der Bedeutung und des Bereichs von Äquivalenten einer beschriebenen Ausführungsform liegen. Selbstverständlich dient die hier verwendete Phraseologie oder Terminologie lediglich zur Beschreibung und nicht zur Beschränkung.

Rohsequenzprotokoll

Patentanmeldung

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Angaben:
(i) Anmelder: David D. Roberts et al.
(ii) Bezeichnung der Erfindung: Heparin- und Sulfatidbindende Peptide aus den Typ-I-Repeats von humanem Thrombospondin fördern die Melanomzellenhaftung
(iii) Anzahl der Sequenzen: 27
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Lowe, Price, LeBlanc & Becker
(B) Straße: Suite 300, 99 Canal Center Plaza
(C) Stadt: Alexandria
(D) Staat: Virginia
(E) Land: USA
(F) Zip: 22314
(v) (A) Datenträger: Diskette
(B) Computer: IBM-PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software:
(vi) Anmeldungsdaten:
(A) Nummer der Anmeldung:
(B) Datum der Einreichung:
(C) Klassifikation:
(viii) Angaben zu Anwalt/Agent:
(A) Name: Robert L. Price
(B) Registriernummer: 22685
(C) Referenz/Aktennummer: 717-111
(ix) Angaben zur Telekommunikation:
(A) Telephon: 703 684 1111
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
(3) Angaben zu SEQ ID NO: 2:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:
(4) Angaben zu SEQ ID NO: 3:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3:
(5) Angaben zu SEQ ID NO: 4:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4:
(6) Angaben zu SEQ ID NO: 5:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 4 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5:
(7) Angaben zu SEQ ID NO: 6:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6:
(8) Angaben zu SEQ ID NO: 7:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 7:
(9) Angaben zu SEQ ID NO: 8:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 8:
(10) Angaben zu SEQ ID NO: 9:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 4 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 9:
(11) Angaben zu SEQ ID NO: 10:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 4 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 10:
(12) Angaben zu SEQ ID NO: 11:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 4 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 11:
(13) Angaben zu SEQ ID NO: 12:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 12:
(14) Angaben zu SEQ ID NO: 13:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 13:
(15) Angaben zu SEQ ID NO: 14:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 14:
(16) Angaben zu SEQ ID NO: 15:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 15:
(17) Angaben zu SEQ ID NO: 16:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 16:
(18) Angaben zu SEQ ID NO: 17:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 17:
(19) Angaben zu SEQ ID NO: 18:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 13 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 18:
(20) Angaben zu SEQ ID NO: 19:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 19:
(21) Angaben zu SEQ ID NO: 20:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 20:
(22) Angaben zu SEQ ID NO: 21:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 10 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 21:
(23) Angaben zu SEQ ID NO: 22:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 22:
(24) Angaben zu SEQ ID NO: 23:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 23:
(25) Angaben zu SEQ ID NO: 24:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 24:
(26) Angaben zu SEQ ID NO: 25:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 25:
(27) Angaben zu SEQ ID NO: 26:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 26:
(28) Angaben zu SEQ ID NO: 27:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 27:

Claims

1. Peptid, welches aus 4 bis 17 Aminosäureresten besteht und eine Bindungaffinität zu Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Heparinbindungskonstante im Bereich von 10&sup7; bis 10&sup5; molar&supmin;¹ aufweist, und ferner daß das Peptid die Sequenz -Trp-Ser-Xaa-Trp mit Xaagleich einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Pro, Glu, Ala, His und Ser, umfaßt.

2. Peptid nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Peptid um eine Sequenz handelt, die aus folgenden Sequenzen ausgewählt ist:

SEQ ID Nr. 1:

SEQ ID Nr. 2:

SEQ ID Nr. 3:

SEQ ID Nr. 14:

SEQ ID Nr. 19:

3. Peptid nach Anspruch 1, welches ferner einen aminoterminalen N-Acetylrest und einen carboxyterminalen Amidrest aufweist.

4. Arzneimittelzubereitung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Peptids nach Ansprüchen 1, 2 oder 3 sowie ein(en) pharmazeutisch akzeptables (akzeptablen) Streckmittel oder Träger.

5. Peptid nach Anspruch 1, gegebenenfalls konjugiert mit einem geeigneten Trägerpolymer oder -protein, wobei das Peptid oder das mit einem geeigneten Trägerpolymer oder -protein konjugierte Peptid an ein geeignetes Substrat gebunden ist.

6. Peptid nach Anspruch 5, wobei das Substrat aus Polyvinylchlorid, Polystyrol oder einem anderen Kunststoffmaterial besteht.

7. Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung in der Medizin.

8. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Bindung von Heparin oder verwandten sulfatierten Glykokonjugaten.

9. In-vitro-Verfahren zur Förderung der Haftung und des Wachstums von verankerungsabhängigen Zellen, umfassend eine optionale Konjugation eines Peptids nach Anspruch 1 mit einem geeigneten Polymer oder Protein, eine Bindung des Peptids oder des konjugierten Peptids an ein geeignetes Substrat, ein Inkontaktbringen des gebundenen Peptids oder konjugierten Peptids mit einer verankerungsabhängigen Zelle oder verankerungsabhängigen Zellen und eine Inkubation des Substrats und der Zellen in Gegenwart der für das Wachstum der Zellen erforderlichen notwendigen Nährstoffe.

10. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Förderung der Haftung und des Wachstums verankerungsabhängiger Zellen, umfassend eine optionale Konjugation des Peptids mit einem geeigneten Polymer oder Protein, eine Bindung des Peptids oder konjugierten Peptids an ein geeignetes Substrat, ein Inkontaktbringen des gebundenen Peptids oder konjugierten Peptids mit einer verankerungsabhängigen Zelle oder verankerungsabhängigen Zellen und eine Inkubation des Substrats und der Zellen in Gegenwart der für das Wachstum der Zellen erforderlichen notwendigen Nährstoffe.