JPH07501808A

JPH07501808A - ヒトトロンボスポンジンの１型繰返体からのヘパリン−およびスルファチド結合ペプチド

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Publication number: JPH07501808A
Application number: JP5510371A
Authority: JP
Inventors: ロバーツ　ディビッド　ディ; ガオ　ネングア; クルツチッシュ　ヘンリー　シー
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1992-12-07
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: CA2125043A1; AU674503B2; DE69231065D1; AU3239893A; CA2125043C; JP3646808B2; US5357041A; EP0620825A1; ATE193022T1; EP0620825B1; WO1993011156A1; DE69231065T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトトロンポスボンジンのｌ型繰返体からのヘパリン−およびスルファチド結合本発明は、ヘパリンおよびスルファチド（スルホリピド）を含む硫化複合糖質と結合する、ヒト内皮細胞トロンボスボンジンの三つのｌ型繰返体からのペプチドに関する。

発明の背景ヘパリン結合は、多くの細胞成長因子、細胞付着分子、および血液凝固カスケードに含まれるある種の酵素の活性に決定力がある。それらの相互作用を抑制する薬剤か血栓防止のための数多くの用途に見出だされている。ヘパリン類縁体か抗腫瘍および抗転移活性を有するということが示されている。

ヘパリンと結合するペプチドは多くのヘパリン結合タンパク質から同定若しくは単離されている〔たとえば、カーディン等（Ｃａｒｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）、［動脈硬化Ｊ　（ＡｒＬｅ−ＢｏｓｃＩｅｒａｓＩｓ）　、Ｖｏｌ、９、第２１− ３２頁（１９８９）参照］。付着分子から同定されたヘパリン結合ペプチドの例としては、ｌｖ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンか挙げられる。

それらは全て、多くのヘパリン結合タンパク質の比較により決定された共通配列に合致する塩基性アミノ酸のクラスターを有する〔カーディン等（Ｃａｒｄｉｎ　ｅＬ　ａｔ、）　、上記参照〕。カーディン等のペプチドおよびこの技術領域において記載されている他のペプチドの結合定数は一般に１０’〜１０１である。

マラリア冠状スポロゾイトタンパク質からのペプチドに関する仲介細胞付着が開示されている（リツ手等（Ｒｉｃｈ　ｅＬ　ａｔ、）、「科学Ｊ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖｏｌ、　２４９：１５７４−１５７７、（１９９０）］。そりようなペプチドは、ヘパリンと結合しないという不ぼ１益を被っており、その付■活性は、ヘパリンとの結合に活性がない、　Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩＹ配列に帰せられていた。トロンポスポンノンからのペプチドが開示されている〔プラテル等（Ｐｒａｙｅｒ　ｅＬ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（ＪＣｅｌＩＢｉｏｌ、）、Ｖｏｌ、１１２　、第１０３１−１０４０頁（１９９２）］　、ブラテルの配列は、重大な欠点を有している。何故なら、それらはヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と高い親和性で結合するには不十分であるからである。

従って、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と高い親和性で結合する、非常に効力のあるペプチドが、現在の技術において必要である。ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と、付着分子、成長因子、細胞またはヘパリン−依存性酵素との相互作用を抑制するのにも有用な、そのようなペプチドか特にＺ・要とされている。

したかって、本発明の目的は、上記した先行技術の問題屯を克服することである。

本発明の更なる目的は、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と高い親和性で結合し、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と、付着分子、成長因子、細胞またはヘパリン−依存性酵素との相互作用を抑制するのに有用な配列を有する、非常に効力のあるペプチドを提供することである。

更に本発明の目的は、当業界において公知のタンパク質（ペプチド）の結合定数よりも予測しえない程度に優れた結合定数を有するペプチドを提供することである。

更に本発明の目的は、ヘパリンまたは関連する硫化ラクトコンツユゲートとの高い結合親和性を有し、かつ、活性部位に効率的に到達させるため、より有用な医薬製剤に配合される。電荷かないペプチド（本質的に中性のペプチド）を提供することである。

本発明の更に他の目的は、非常に少量のペプチドを効率的に投与し、それにより毒性の危険性およびペプチｉ・に対する免疫応答の発生を減するために、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質との結合に高い効力を有するペプチドを提供することである。

図面の簡単な説明第１図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質と結合するＩＩＪ− トロンポスボンジンの抑制を図示したグラフである。

第２図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質と結合する１ｆｆＩ ■−トロンポスボンジンの抑制を図示したグラフである。

第３図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質と結合するＩＪ−ラミニンの抑制を示したグラフである。

第４図は、トロンポスボンノンペプチドによる硫化複合糖質と結合するＩｔｓ　Ｉ−ラミニンの抑制を示したグラフである。

第５図は、トロンポスボンジンペプチドによりＡ　２０５Ｂメラノーマ細胞と結合する、　１′１−ラミニンの抑制を表わすグラフである。

第６図は、ヘパリンおよびトロンポスボンジンペプチド配列番号１　（１０Ｓｔ！Ｑ　Ｎ。

・ｌ）によりＡ　２０５８メラノーマ細胞と結合する１ｆｆＪ　）、ロンポスボンジンの抑制を表わすグラフである。

第７図は、抗−トロンボスボンノン抗体Ａ４．１のトロンポスボンジンペプチドとの結合を表わすグラフである。

第８図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質（スルファチド）と結合するＩＩＪ、−トロンポスボッジンの抑制を表わすグラフである。

第９図は、トロンポスボンノンペプチドによる硫化複合糖質（ヘパリン−ＢＳＡ）と結合する１２５１−　トロンポスボンノンの抑制を表わすグラフである。

第１０図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質（ヘパリン−ＢＳＡ）と結合するｌｌＩ　ｌ−ラミニンの抑制を表わすグラフである。

第１１図は、ヘパリンアガロースに対するトロンポスボンジン〔配列番号１９（１０ＳＥＱ　ＮＯ：１９））の第２の１型繰返体からのペプチドの結合を示すグラフである。

第１２図は、トロンポスボンジンペプチドによる、Ａ　２０５８メラノーマ細胞と結合する１２′Ｉ−ラミニンまたは＋２Ｊ　）ロンボスボンジンの抑制を示す棒グラフである。

第１３図は、ヘパリンおよびトロンポスボンジンペプチド２４６〔配列番号＋９（１０ＳＥＱ　ＮＯ：Ｉ９）］によりＡ　２０５８メラノーマ細胞と結合する１ ″５Ｉ−ラミニンの抑制を示す棒グラフである。

第１４図は、対照ペプチドおよび１６種のトロンポスボンジンペプチドとのＡ　２０５８メラノーマ細胞の付着の程度を示す棒グラフである。

第１５図は、４種のトロンポスボンジンペプチドに対するＡ　２０５８メラノーマ細胞の濃度依存性を示すグラフである。

第１６図は、ヘパリン結合ペプチドによるトロンポスボンジンペプチドに対するメラノーマ細胞付着の抑制を表わす棒グラフである。

好ましい実施態様についての記載本発明は、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質に対し高い結合親和力を有し、ヘパリン結合定数か１０７〜１０′１モルの範囲であるペプチドを提供する。好ましいペプチドは、４〜５のアミノ酸残基の副配列を有するペプチドであり、この副配列は実質的に電荷を有さないものである。上記した並びに以下の本明細書において使用される「関連する硫化複合糖質」という語は、ヘパリンと同等の結合特性を有する硫化複合糖質として定義される。本発明におけるより好ましいペプチドは、−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−の配列を有するものであり、ここでＸａａはＰｒｏ、Ｇｌｕ。

Ａｌａ、ＨｉｓおよびＳｅｒから成る群より選択されるアミノ酸である。本発明に於ける更に好ましいペプチドは、−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−の配列を有するものである。ここでＸａａは上記で定義したものであり、さらに−８１ −８２−Ｘ−０３−または−Ｂｌ−Ｘ−８２−Ｙ−８３−から成る式から選択される配列を有するものであり、ここてＸおよびＹはそれぞれいずれかのアミノ酸であり、ＢＬ　８２およびＢ３はそれぞれＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｌｓから成る群より選択されるものである。

本発明の特に好ましい実施岬様において、上記した本発明のペプチドは、配列番号１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１）、配列番号２　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　２）　、配列番号３　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：３）、配列番号＋４（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１４）および配列番号１９（ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ・１９）から成る群よりそれぞれ選択される配列を有するペプチドである。

本発明における配列を有するさらに好ましいペプチドは、該ペプチドがアミノ末端Ｎ−アセチルおよびカルボキシ−末端アミドから成るように変性されたものである。

本発明は、又、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質に対し高い結合親和力を有し、実質的に電荷かない、有効量のペプチドを含む医薬組成物に関し、その組成物は医薬的に許容可能な賦形剤または担体を含有する。

更により好ましい本発明の医薬組成物は、組成物が、有効量の配列番号１　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋１）、配列番号２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）　、配列番号３　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　３）　、配列番号１４（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：Ｉ４）および配列番号１９（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９）から成る群よりそれぞれ選択される配列を有するペプチドと、医薬的に許容可能な賦形剤または担体との組み合わせから成るものである。

本発明は、ヘパリン結合定数か１０’〜１０’　１モルの範囲のペプチドを有効量使用するヘパリンまたは関連する硫化複合糖質との結合方法を提供する。

更により好ましい方法は、ペプチドが配列番号１　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：Ｉ）、配列番号２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）、配列番号３　（ＳＥＱ　！Ｄ　ＮＯ：３）　、配列番号１４（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４）および配列番号＋９　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　１９）から成る群より選択される配列を有するものであ上記のように、本発明は、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質に対し高い結合親和力を有し、実質的に電荷かないペプチドの一族を提供する。本発明は又、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と、付着分子、成長因子、細胞またはヘパリン−依存性酵素との相互作用を抑制するための、それらのペプチドの用途に関する。さらに詳しくは、本発明の好ましいペプチドは、配列番号１　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌ）、配列番号２　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２）　、配列番号３　（ＳＥＱ　ＩＩＩ　Ｎｏ：　３）、配列番号＋４　（ＳＥＱｌｏ　ＮＯ：Ｉ４）および配列番号＋９（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：Ｉ９）から成る群より選択される配列を宵するものであり、これは、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と高い親和力で結合する関連するペプチドの一族を表わす。

本発明のペプチドは、付着糖タンパク質トロンポスボンジンおよび上記のものから得られる。本発明のペプチドは、その配列か第１表および第２表に示されている。その配ｊ＋ｌは公知の方法により製造され得る。そのような方法には、限定されないが、ヘクターに挿入されたペプチドのＤＮＡ解析から、ペプチド製造装置により、または付着糖タンパク質トロンポスポンジンから配列を単離することによるものか含まれる。固相合成法も使用する　ことかできる。それらのペプチドは、多くの、タンパク質に結合するヘパリンに存在する共通配列に適合する塩基性アミノ酸のクラスターを欠いており、さらに塩基性アミノ酸の共通配列を有するタンパク質よりも約１０〜１００倍高い結合定数を有している。本系列のペプチドの結合定数は、約１０’〜１０６１モルである。更に、本発明によるペプチドの一族の中で好ましいペプチドに存在する好ましい副配列（４又は５のアミノ酸残基を有する）が実質的に電気的な電荷を有しないことは、それらのペプチドをそれらが活性を示す部位に効率的に到達させるという点で、医薬を調製するのに有益である。足場依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　）の培養で付着ペプチドとして使用することを含めて、電荷が欠如していることを必要としないある種の応用においては、本発明で開示されたペプチドの塩基性アミノ酸配列〔たとえば、配列番号１９（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９））による変性は、活性を増大させ、かつ、他の硫化複合糖類よりもヘパリンに対するペプチドの特異性を増大させる。

本系列のペプチドの更なる利点は、それらが高い活性を有するので、従来技術のペプチドよりも非常に少ない量を投与すればよく、従って、毒性の危険およびペプチドに対する免疫応答の発生を減少させることである。

ヒトトロンボスポンジンの３種の１型繰返体領域からのペプチドは固相合成法により調製された。ヘパリンの結合特異性を決定するために使用されるペプチドは、以下の第１表および第２表並びに配列表に記載した。

本発明によるペプチド、医薬組成物および本発明による製法は、以下の一般的工程を用いて実証される。

ペプチドは、固相分析において、ヘパリン−ウシ血清アルブミン複合体またはスルファチドと結合するラミニンまたはトロンポスボンジンの抑制剤として、実質的にザブレネツキー等（ＺａｂｒｅｎｅＬｚｋｙ　ｅＬ　ａｌ、）、キャンサー・リサーチ［ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　、ＶＯｌ、　５Ｑ　、第５９３７−５９４２頁（＋９９０））に記載された工程に従って試験される。

簡単には、ヘパリン−Ｂ　Ｓ　Ａ　（０，２ｕ　ｇ／ｗｅｌｌ）を５０ｕｌのデルベソコＰＢＳ中で３７℃に２時間保持することにより、塩化ポリビニルミクロタイタープレートウェルに吸着させる。このウェルを空にし、ｐＨ７で１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１　ｍＭのＣａＣＩｔ、０．１ｍＭの微小成分を含有する５０ｍＭ１−リスで満たし、このウェルを空にし、そして３０μｌの種々の濃度の同じ緩衝液で希釈した有効に抑制するペプチドまたは緩衝液のみ並びに３０μｌのＩＩＩ　■で標識化したラミニンまたはトロンポスボンジン（０，２μｌ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに加えた。４℃で２時間後、ウェルを０．１５ＭのＮａＣ１で６回洗浄し、プレートから切断し、そして結合物の放射活性を測定した。

　スルファチドに結合したラミニンおよびトロンボプラスチンは、ポリ塩化ビニルミクロタイタープレート上の塩化ホスファチジル／コレステロール単層に固定した糖脂質により、固相分析法を用いて定量した。

ラミニンまたはトロンポスボンジン結合の抑制を研究するために、ウェルはトロンポスポンジン分析またはラミニン分析のために、２００ｎＨのスルファチドで又は６００ｎＨに５０ｎＨのホスファチジルコリンおよび３０ｎＨのコレステロールを添加した混合物でコートされたペプチドは、遊離リガンドから別に結合する油による遠心分離を用いて、トロンポスボンジンと結合するメラノーマまたは内皮細胞の抑制剤としても試験した。

■型繰遮体からの数種のペプチドは、ヘパリンおよびスルファチド（第１図および第２図）に結合するトロンポスボンジンの抑制について試験した。選択したペプチドは、リッチ（Ｒｉｃｈ）および共同研究者により付着モチーフとして同定されたＶＴＣＧ配列〔配列番号５　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　５））に隣接しているが、共通配列に結合する予測されるヘパリンに必要とされる塩基性アミノ酸のクラスターが欠如している。驚くべきことに、ＶＴＣＧ配列に対するアミノ末端の配列のみが活性であった〔配列番号１　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　１）、配列番号２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）、および配列番号３　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　３））。３種全ての繰返体からのドデカペプチドは、！、。値が６〜１００μＭのもの〔配列番号１（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：ｌ）、配列番号２　（Ｓ［ｌＱ　１０　Ｎｏ　・２）及び配列番号３　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ＋　３））と結合するヘパリンおよびスルファチドを抑制した。それぞれの活性ペプチドに隣接するフランキングペプチドは不活性であった〔配列番号ｅ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６）、配列番号７　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　７）及びび配列番号８（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　８））。繰返体２からのペプチド〔配列番号２　Ｃ３ＥＱ　１０　Ｎｏ：　２））は、繰返体３〔配列番号３　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３））に続くことが最も多く、次いで繰返体１　〔配列番号１　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　Ｉ））である。　３種の繰返体は、■、。値が１０〜２０８Ｍの間であるヘパリンへの結合の抑制剤として同等である。ヘパリン結合についての予測される共通配列を含むトロンポスボンジンのドメインと結合するアミノ末端ヘパリンからの２種のペプチドもまた、ヘパリンに対するトロンポスボンジンの結合を抑制したが、！、。値が１００μＭより大きいＩ型ペプチドよりも非常に弱かった。それらのペプチドは、しかしながら、スルファチドとの結合を抑制しなかった。

多くの活性ペプチドは２〜３しか、または、全く塩基性アミノ酸を含んでいないので、ペプチドは、硫化複合糖質よりもむしろトロンポスボンジンとの結合により抑制される可能性が考えられる。この可能性を調べるために、ペプチドは、ヘパリンまたはスルファチド（第３図および第４図）と結合するラミニンの抑制剤として試験をした。同じペプチドが、両方の基質と結合するのを抑制し、ペプチドの活性がタンパク質に対するよりも硫化複合糖質の方に特異的であるということを示している。

第２の！型繰遮体からの最も活性のペプチドの部分を含有する数種のペプチドは、ヘパリン結合のための活性配列をさらに決定するために合成された。ＶＴＣＧ〔配列番号５　（ｓＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ：　５））は不活性であったが、コノ配列のＣ３ｖＴＣＧ〔配列番号４　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　４））を含むより大きいペプチドは活性であった。しかしながら、このベプチＶは溶液中において、速やかにジスルフィドオリゴマーを形成し、その抑制曲線は、不均質の結合またはペプチドの凝集に対し副次的な人工的抑制を示唆する他の活性ペプチドよりも非常に緩やかなものであった。Ｃ３ＴＶ（配列番号９　Ｃ３ＥＱ　１０　Ｎｏ：　９）］　もまた不活性であったが、二つの残基を添加した５ＳＣ３ＶＴ　［配列番号１３（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３））　ハ弱イ抑制ヲ生シタ。

第二繰返体の左側部分からの８個のアミノ酸ペプチド（配列番号１４（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

：１４））は、最初の二つのアミノ酸のみが欠如している１０個のアミノ酸ペプチド〔配列番号１Ｂ（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６））と同様に、活性であった。

配列番号１４（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１４）の二つのＴｒｐ残基を＾１ａ残基で置換する〔配列番号１７（Ｓｔ！Ｑ　１０　ＮＯ：１７））と活性が失われた。

それ故、配列番号１４（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１４）のＴｒｐ残基は高い親和性の結合に要求される。

トロンポスボンジンまたはラミニンと結合する腫瘍細胞へのペプチドの影響を調べた。第２および第３の繰返体からのペプチドは、ラミニンがＡ　２０５８メラノ−マ細胞へ結合するのを強く抑制した（第５図）。ヘパリンに対する結合およびスルファチドの結合において観察されたように、第１の繰返体からのペプチドはより弱いものであった。

トロンポスボンジンのＡ　２０５８メラノーマ細胞への結合は、第１の繰返体からのペプチド１８４〔配列番号１　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　Ｉ）〕により抑制された。抑制は用量に依存し、トロンポスボンジンかヘパリンまたはスルファチドと結合するのを抑制するのと同等の濃度で起こった。メラノーマ細胞へ結合するトロンポスボンジンの一部はヘパリンにより抑制され得る（第６図）。ヘパリンの存在下にペプチ白８〔配列番号１　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１））を添加するとトロンポスボンジンの結合をさらに抑制することはなく、このことは、ペプチドによる抑制が、メラノーマ細胞でのトロンポスボンジンについてのヘパリン抵抗性タンパク質受容体よりも硫化複合糖質との競合によることを示している。

データは、トロンポスボンジンのＩ型繰遮体からのペプチドの一族が、ラミニンおよびトロンポスボンジンが硫化複合糖質へ結合することを抑制することができる、強力なヘパリンおよびスルファチド結合ペプチドであることを示している。

このペプチドはまた、ヒトメラノーマ細胞とのラミニンおよびトロンポスボンジンとのヘパリン依存性相互作用の抑制剤であることを示している。実験は、それらのペプチドが、他の付着タンパク質、成長因子および凝集酵素を含むヘパリン依存性タンパク質の一般的な抑制剤であることを決定するために進行中である。

以下の第１表および第２表は、上記に記載し、図面中において言及する単一文字形態での配列を表わす。表はそれらの配列を指定されたペプチド数または省略形で示し、対応する配列表の指定番号をも含んでいる。配列は、本願明細書の添付した配列表中に３文字のペプチドコードで記載した。

第１図〜第６図の詳細な説明第１図〜第６図は上記した一般的実験方法を用いて得られたデータを示す。第１図〜第６図にそのデータが示されているペプチドの構造（配列）は第１表および第２表並びに巻末に添付された配列表に示されている。

第１図は、トロンポスボンノンペプチドによる、硫化複合糖質と１２６１−トロンポスボンジンとの結合抑制を図示したグラフである。ミクロタイタープレートウウェルをスルファチドで被１し、ペプチドの配列番号１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１）、配列番号２　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２）、配列番号３　（ＳＥＱ　ＩＩＩ　Ｎｏ：　３）、配列番号４　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　４）、配列番号５　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ・５）、配列番号ｅ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６）、配列番号７　（ＳＥｏ　１０　Ｎ。

７）、および配列番号８　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８）の濃度を増加させながら、これらの存在下、０．２μｇ／ｍｅの標識化トロンポスボンジンと共にインキュベート（保温）した。図の上部に、種々の濃度で試験を行ったそれぞれのペプチドを表わす記号（シンボル）を示した。結合は、抑制剤不存在下での対照結合の百分率として示した。

第２図は、トロンポスボンノンペプチドによる硫化複合糖質と結合する＋２８　 ■＝ニトロンポスボンジン抑制を図示したグラフである。ミクロタイタープレートウウェルをヘパリノーＢＳＡスルファチドて被覆し、ペプチドの配列番号＋　（ＳＥｏｌｏ　ＮＯ：　Ｉ）、配列番号２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　２）、配列番号３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３）、配列番号４　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　４）、配列番号ｓ　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　５）、配列番号６　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：６）配列番号７　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７）、および配列番号８　（ＳＥＱ　Ｉｌｌ　Ｎｏ：　８）の濃度を増加させながら、゛これらの存在下、０．２μｇ　／　ｍ　ｅの標識化トロンポスボンジンと共にインキュベートした。図の上部に、グラフ上に種々の濃度で示した、試験を行ったそれぞれのペプチドを表わすシンボルを記載した。結合は、抑制剤不げ注下での対照結合の百分率として示した。

第３図は、トロンポスボンノンペプチドによる硫化複合糖質と結合す１２８１− ラミニンの抑制を示したグラフである。ミクロタイタープレートウウェルを上記したように、第１図と同様にしてスルファチドで被覆した。ノンポルおよびペプチド番号で表示した特別のペプチドによる抑制を、第１図の説明において記載したのと同様にして決定した。

第４図は、トロンポスボンノンペプチドによる硫化複合糖質と結合する１″′！ −ラミニンの抑制を示したグラフである。ミクロタイタープレートウウェルを上記したように、第２図と同様にしてヘパリン−Ｉｔ　Ｓ　Ａスルファチドで被覆した。

ノンポルおよびペプチド番号で表示した特別のペプチドによる抑制を、第２図の説明において記載したのと同様にして決定した。

第５図は、トロンポスボンノンペプチドによりΔ２０５８メラノーマ細胞と結合する１２５Ｉ−ラミニンの抑制を表わすグラフである。メラノーマ細胞（０，２ｒｒｌ中ｌＸｌ０’）を０２μｇ　／　ｍ　ｅの標識化ラミニン単独と共に、または、トロンポスボンジンからの第１、第２および第３の繰返体である、配列番号Ｉ　Ｃ３Ｅ０１０　Ｎｏ：　Ｉ）、配列番号２　（ｓＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）、または配列番号３　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋　３）からのペプチドを１ｍｆｆ当たり２００マイクログラムの存在下で、インキュベートシた。細胞を油により遠心分離して結合ラミニンから遊離ラミニンを分離し、次いで、γカウンターにより細胞ベレットの放射能を定量した。結果を、ペプチドの存在下で定量した対照結合に対する百分率として表わした。それは、３回の定量値上標準偏差の平均値である。

第６図は、ヘパリンおよびトロンボスボンジンペブチト配列番号１　（ＩＤ　ＳＥＱ　Ｎ。

：］）によりＡ　２０５Ｂメラノーマ細胞と結合する１２５Ｉ−トロンポスボンジンの抑制を表わすグラフである。メラノーマ細胞（０，２ｍｎ中３ＸＩＯ′セル）を０．２μｇ／ｍｌの障識化トロンポスボッジン中独と共に、または、ヘパリンまたは配列番号１　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　ｌ）による配列を有するペプチド若しくは２１４の抑制剤の組み合わせの存在下、それらの濃度を増加させながら、インキュベートした。結果を、抑制剤の不存在下で対照結合に対する百分率として表わした。そｈは、３回の定量値の平均値である。

トロンポスボンジンは、先に記載したように〔ロバーツ等（Ｒｏｂ：ｒｔｓ　ｅＬ　ａｌ、）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０．９４０５−９４１１（１９８５）］　、）Ｏンビン刺激ヒト血小板から精製した。トロンポスボンジンの組み替えヘパリン結合フラグメントである残基ｌ−１７５（２８ｋＤ）　、および組み替えアポリポタンパク質Ｅは、バイオテクノロジー・ンエネラル・レホボノト・イスラエル（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＧｅｎｅｒａｌ　Ｌｔｄ、　ＲｅｈｏｖｏｔＩｓｒａｅりから得た。工：ノゲルプレス・ホルム・スワーム・トウーマー（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｌｈ　Ｈｏ１ｍ　Ｓｗａｒｍ　ｔｕｍｏｒ）により精製されたマウスラミニンはドクター・ランス・すオツタ（叶、　Ｌａｎｃｅ　ＬｉｏＬｔａ　５Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）から提Ｉｎされた。トロンポスボンジンに対するモノクローナル抗体はドクター・ウィリアム・フレツイア−（叶、　Ｗｉ！ｌｉａ＋ｓ　Ｆｒａｚｉｅｒ、　Ｗａｓｂｉｎｇｌｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｘ）から提供さ■ た。トロンボスポンジ／、そのフラグメント、アポリポタンパク質ＥＳＢＳＡ− ペプチド複合体、およびラミニンは前記した〔ロバーツ等（ＲｏｂｅｒＬｓ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｖ　２６０．９４０５−９４１１　（１９８５）］ようにヨードゲノンｌｏｄｏｇｅｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて沃素化した。ヘパリン−ＢＳＡ複合体は、実質的に上記のように〔フナハン等（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ　ｅＬ　ａｌ、）、Ａｎａｌ、　１ｌｉｏｃｈｅｉｅ、　１２６．４１４−４２１　（１９８２）］　、ＮａＢＨ３ＣＮの存在下で還元性エマネーションにより還元性末端をＢＳＡとすることにより、ウシ肺ヘパリン（Ｔｈｅ　Ｕｐｊｏｈｎ　Ｃｏ、）のカップリングにより調製された。ウシ脳スルファチドはスペルコ（Ｓｕｐｅ　１ｃｏ）およびジパルミトイルホスファチジルコリンから得られ、コレステロールはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。

ペプチダーゼは、第１表に示したように、ヒトトロンポスボンジンの３種のｌ型繰返体の部分に相当するものから合成した。合成はペプチド合成について当業界で認められている方法を用いて行った。この研究に使用したペプチドは、バイオサーチ９６００型ペプチド合成装置ＣＢｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　０６００　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｘｅｒ）により、標準メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成プロトコルおよびｔ−Ｂｏｃ化学を用いて合成した。ペプチドは逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて分析した。ペプチド溶液は希Ｎａ０ｔｌを添加することにより中和し、溶液で一２０℃で貯蔵した。

ペプチドは、それらの７ステイン残基により、５ＰＤＰを用いてＢＳＡと結合した〔ダニロフ等（Ｄａｎｉｌｏｖ　ｅｔ　ａｔ、）、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１８２．１８６−１９６　（＋９８９））　。

付着分析：ヒトメラノーマセルラインＡ２０５８　（１−グロ等（Ｔｏｄａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　、　７７．５２５８−５２６２　（１９８０））を、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地において、３７℃ で５％の二酸化炭素を含む雰囲気下、単層培養にて維持した。付着分析のために、細胞はトリプシンを用いて除去し、１０’セル／ａＴ＋２で継代しそして５〜７０間で収穫した。トロンポスボンジン被覆プラスチッヘの付着および展開を前記した〔ロバーツ等（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅＬ　ａｌ、）、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０４、＋３１−１３９　（１９８７））ようにして決定した。抑制は、Ｉｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（脂肪酸なし）シグマ（Ｓｉｇｍａ）を含有し、ｐＨ７，３の、重炭酸塩を含有しない０．４ｄのＲＰＭ１１６４０培地に希釈した抑制剤を、タンパク質またはペプチドで被覆したポリスチレンディスクを有する２４−ウェル皿のウェルに加えて測定した。

メラノーマ細胞は、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水で２０分間、３７℃でインキュベートすることにより、収穫した。細胞は遠心分囃し、生存率（通常９９％以上）をトリバンブルー排除により評価した。細胞は培地に再懸濁させ、回復させるために懸濁液中に１時間放置した。１００μｌの培地に懸濁したメラノーマ細胞（２×１０１１）をそれぞれのウェルに加え、湿った雰囲気中において３７℃で５０〜７５分間、付着のために放置した。付着および展開は顕微鏡により判定した。

スルファチドおよびヘパリン結合・スルファチドまたはヘパリンに結合するラミニン、アポリポタンパク質、およびトロンポスボンジンを、先に記載（８，２２）シたように固相分析を用いて定量した。スルファチド（ｒロンボスボンジン結合のために０．２μｇ／ウェル、ラミニン結合のために０．６μｇ／ウェル）を、ポリ塩化ビニル製ミクロタイタープレート上の、５０ｎＨのホスファチジルコリンおよび３０ｎＨのコレステロールの混合物中に固定した。ヘパリン−ＢＳＡ（０，２μｇ／ウェル）を、デュルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳにより３７°Ｃで２時間インキュベートすることにより、ポリ塩化ビニル製ミクロタイタープレートウェルに吸着させた。

ウェルをからにし、ｐＨ７，８で、１５０　ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ　！、０．０２５％のＮａＮ５、および１％のＢＳＡを含有する５０ｍＭのトリスで満たした。３０分後に、このウェルをり）らにし、そして同一の緩衝液で希釈した３０μｌの種々の濃度の、潜在的抑制ペプチドまたは緩衝液単独、および３０μｐの１２ｓｌ　ｉｌｌ識化ラミニンまたはトロンポスボンジン（０，２μ ｇ　／　ｍ　ｌ　）をそれぞれのウェルに加えた。４℃で３時間経過後、これらのウェルを０．１５ＭのＮａＣｌで６回洗浄し、プレートから切り離し、そして結合した放射能を計測した。

ペプチドに対する抗体の結合細胞に対する１８１−トロンポスボンジンまたはラミニンの結合の抑制：Ａ　２０５８メラノーマ細胞を上記したようにして収穫し、Ｉｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するデュルベノコ（Ｄｕ　ｌｌ＋ｅｃｃｏ）のＰＢＳ中に懸濁した。０．２ｍ　ｌ！の最終容積で、２　Ｘ　１０’個の細胞を潜在的抑制剤で１５分間予備インキュベートした。標識化したタンパク質を加え、回転テーブル上において２０ ℃で１時間、インキュベートした。

細胞墾濁液を、トリス［３ＳＡ＄１１１Ｍと予備インキュベートした、０．４ｍｌのポリプロピレンミクロフユージチューブ（ＰＧＣ）に移した。油〔ニオシル −５０（Ｎｙ。

５ｉｌ−５０）　、０．２　ｍ　ｌ　）を加え、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ミクロ遠心分離器Ｂ中、１００００　ｒ　ｐ　ｍで１分間遠心分離した。上層を除去し、そして油層を０．２ｍｌのトリスＢ５Ａ１１衝液で洗浄し、再遠心分離した。上澄みの液体を吸引し、チューブの底を切断し、計測した。

棒！モノクローナル抗体Ａ４．１は、プラスモジウムファルシ／ぐルムの環状スポロゾイトタンパク質を含む幾つかのタンパク質に保存されているｌ型繰返体を含有するトロンポスボンジン〔ブラタ−等（ＰｒａＬｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　＋１２　、！０３１−１０４０　（１９９０１〕の５０キロダルＩ・ン（ｋＤａ）の７ラグメントと結合する。環状スポロゾイトタンパク質からのペプチドと重複する抗体Ａ４．１のトロンボプラスチン抗体反応性の予備スクリーニングにおいて、我々は抗体Δ４．１が配列５ＩＳＴＥＷＳ　［エム・セグインおよびディー・ロバーツ（Ｍ、　Ｓｅｇｕｉｎ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ）、未公開の結果〕を含むペプチドと強固に結合することを見いだした。我々は、それ故、この配列（第１表）に対するトロンポスボンジン類縁体の３種のｌ型繰返体からペプチドを調製し、ＢＳＡ　（第１図）と複合させた後、それらの抗体Ａ４．１との結合を試験した。抗体Ａ４．１は第１の１型繰返体からのペプチド１８［配列番号１（ＳＥＱ　ＩＦ　Ｎｏ＋　１））と強固に結合１第２および第３の繰返体からのペプチド１８５および１８６〔配列番号２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）および配列番号３　（ＳＥＱ　１０　ｉｔｏ：　３）］とは弱く結合したが、活性配列に隣接するフランキング配列を含む一連のペプチドと番マ結合しなかった。直接プラスチックに被覆したペプチドを使用すると、抗体Ａ４゜１は第２の繰返体からのペプチド１８５〔配列番号２　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２））と最もよく結合し、第１および第３の繰返体からのペプチドとは殆ど結合しなかった（データは示していない）。したがって、抗体Ａ４．１はトロンポスボンジンのｌ型繰返体からの３種のドデカペプチド〔それぞれの鎖中に１２のアミノ酸」と特異的に結合するが、この結果からは抗体が３種の繰返体の間で区別し得るかどうかが明瞭ではない。

トロンポスボンジンの５Ｏ−５０ｋＤフラグメントとの細胞のけ着は硫化多糖〔ブラタ−等（Ｐｒａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、　１１２．１０３１−１０４０　（１９９１））により部分的に抑制されるので、ｌ型繰返体からの数種のペプチドをヘパリンおよびスルファチドと結合するトロンポスボンジンの抑制について試験した（第２Ａ図および第２Ｂ図）。この選択したペプチドは、リッチ（Ｒｉｃｈ）およびその共同研究者〔リッチ等（Ｒｉｃｈ　ｅＬ　ａｌｊ　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１５７４−１５７７　（１９９０））により付着モチーフとして同定されたＶＴＣＧ配列〔配列番号５　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　５））と隣接していたが、多くの場合、予測されたヘパリン結合の共通配合に必要である塩基性アミノ酸のクラスターが欠如していた。驚くべきことに、ＶＴＣＧ配列に対する配列アミノ末端は最も活性であった。３種全ての繰返体〔配列番号１（ｓｊｏ　１０　Ｎｏ：　１）、配列番号２　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　２）および配列番号３０（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３０））からのドデカペプチドは、■、。値が６〜５０μＭの範囲であるヘパリンおよびスルファチドの両者とのトロンポスボンジンの結合を抑制した。第３の繰返体からのペプチド〔配列番号３　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ＋　３）］は最も活性なヘパリン結合の抑制剤であり、次いで第２および第１　（配列番号１　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：ｌ）　）の繰返体である。抑制の順序はスルファチドに結合するトロンポスボンジンについて異なっていたが、第２の繰返体ペプチド９　〔配列番号２　（ＳＦｏ　１０　Ｎｏ＋　２）］力罎も強力な抑制剤であつｔこ（第２Ｂ図）。

トロンポスボンジンのアミノ末端ヘパリン結合ドメインからの２種のペプチド、それらはヘパリン結合についての共通配列の、残基２３〜３２および７７〜８３をそれぞれ含んでいる（第１表）、を試験した。前者のペプチドのみか、トロンポスボンジンのヘパリンへの結合を抑制し、その■、。値が６０ＭＭであった。

それらのペプチドは、しかしながら、トロンポスボンノンのスルファチドへの結合を抑制しなかった。

最も活性のペプチドは２〜３しか、或いは全く、塩基性アミノ酸を含有して０ないので、ペプチドは、硫化複合糖質に対するよりも、トロンポスボンジンのヘパリン結合部位に対して結合することにより抑制されるという可能性が存在した。

この仮説を検証するために、ペプチドをヘパリンまたはスルファチドに対し結合するラミニンおよびアポリポタンパク質Ｅの抑制剤として試験した（第２Ｃ図および第２表）。同じべ′デチドが、両方の基質に対して結合するタンパク質および抑制されたラミニンの両者の抑制剤として活性であった。同しペプチドが３種の関連がないタンパク質のヘパリン結合部位に特異的に結合することが可能であることは、とても起こりそうにないので、ペプチドの活性はタンパク質よりもむしろ硫化複合糖質に対する結合による。ラミニンまたはトロンポスボンジンに対しペプチドが結合しないことか、標識化されたトロンポスボンジンまたはラミニンがプラスチックに直接固定されたまたはｌｌＳｉｌ合体としてのペプチドが結合しなかったことにより確認された（結果は示さず）。

第２のｌ型繰返体からの最も活性な配列の部分を含む数種のペプチドを合成し、ヘパリン結合についての活性配列をさらに明確にするために、トロンポスボンジンおよびラミニン結合の抑制剤として試験をした（第１表および第２表）。ＶＴＣＧは不活性であったか、この配列を含むより大きいペプチドのＣ３ＶＴＣＧは活性であった。しかしながら、逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析によれば、このペプチドは溶液中において急速にンスルフィトオリゴマーを形成した。抑制曲線は他の活性ペプチドについてのらのよりも、より浅いものでなければならず（第２Ｃ図）、異種結合を示唆するか、或いはその抑制かペプチ）・の凝集による人工物であろう。このペプチドの類縁物は、最初のンステインかセリンに置換されている５ＳＶＴＣＧであり、Ｃ３ＶＴＣＧよりも２倍活性か小さいトロンポスボンジンのスルファチドに対する結合を除いて、非常に弱い抑制剤である。Ｃ３ＶＴもまた、不活性であるか、アミノ末端に２個の残基を添加した５ＳＣ３ＶＴはトロンポスボンジンの結合に弱い抑制を生した。

第２のｌ型繰返体の活性配列から派生した数種のより小さいペプチドもまた強力な抑制剤であった（第１表および第２表）。殻初の８個の残基、５ＨＷＳＰＷＳＳを含むペプチドは、トロンポスボンジンの結合を抑制することについて、完全なドデカペプチドよりもより活性であった。ドデカペプチドの最初の２個のアミノ酸を欠いているデカペプチドもまた、強力な抑制剤であったが、しかし、中央の８個の残基から成るペプチドは非常に活性か弱かった。他の２種の１型繰返体中の配列を比較することにより、結合のための最小の共通配列は：５ＸＷＳＰＷＸＳと定義されるであろう。２１［１のＴｒｐ残基および第２番目のＳｅｒ残基は完全に係わっている。結合中のトリプトファンの機能を試験するために、Ｔｒｐ残基がＡｌａで置換された５ＨＡＳＰＡＳＳであるオクタペプチドを合成した。このペプチドは、トロンポスボンジンの自然の配列である、５ＨＷＰＷＳＳよりも、活性が１００倍以上小さいものであった。したがって、２個のＴｒｐ残基のうちの少なくとも一つが、活性には不可欠である。

第３の繰返体中のＶＴＣＧ配列の右側および第２の繰返体の活性配列の左側の共通配列へ結合する想像上のヘパリンは、活性のために、又試験をした（第１表オヨび第２表）、ＶＴＣＧＹを含み、ｌ３ＢＸＢモチーフ　（ＶＴＣＧＧＧＶＯＫＲ３ＲＬ）をとおして拡張するペプチドは、不活性であった。第２の繰返体（ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ）（配列番号１９（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９）ｌに対し隣接するＢＢＸＢモチーフを添加すると、しかしながら、ヘパリンに結合するトロンポスボンジンまたはラミニンの抑制について、拡大された活性は、約３倍であったか、しかし、両方のタンパク質かスルファチドに結合するのを抑制する活性をかなり減少させた。

ヘパリン結合活性中の第３番目のＴｒｐ残基、保存されたＳｅｒ残基、およびＴｒｐ残基の間の空隙の役割について、■型共通配列の合成類縁体を用いて試験を行った（以下の第３表参照ン。第３のＴｒｐ残基を添加〔ペプチド２５６．配列番号２２（ＳＥＱ　！Ｄ　ＮＯ：２２））すると、ラミニン結合の活性が増大するが、トロンポスボンジンに対する活性が若干減少する。３個の残基て離された２個の必要とされるＴｒｐの距離は、２ＨのＴｒｐ残基の間の両方の残基を除去すると活性が失われる〔配列番号２３（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２３））ことから、最適活性に臨界的であり、Ｔｒｐ残基間に１個の残基ノミノｗ４縁体〔ペプチド２５８、配列番号２４（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２４））は、ラミニン結合を抑制することのみ活性であった。距離を４個の残基〔ペプチド２６０、配列番号２６（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２６）］または６個の残基〔ペプチド２５９、配列番号２７（ＳＢＱ　１０　Ｎ。

２７）］に増加すると、同様に活性が失われた。関係するＳｅｒ残基を置換すると、゛同様に活性が失われた〔ペプチド２６１、配列番号２７（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：２７））。それ故、３個の残基で介在された少なくとも２個のＴｒｐ残基が強い活性には必要である。

第１の介在残基はＳｅ＋てなければならないか、第２の介在残基は関係しない。

活性ペプチドのヘパリンに対する結合を直接示すために、第２の繰返体がらのペプチドである２４６〔配列番号＋９（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９））をヘパリン親ｆＵ性カラム（第３図）に適用した。このペプチドはトリス緩衝液に適用し、ＮａＣｌ２：ｌ配で０．１３〜０゜１６ＭのＮａＣｌで３回の実験で溶出した時に、定員的に結合した。微小の結合していないピークは、ペプチドではない汚染物質である。

ｌ型繰返体からのペプチドは、Ａ　２０５８メラノーマ細胞へのトロンポスボンジンおよびラミニンの結合を著しく抑制した（第４図）。ペブチ（・の活性についての順序は、それぞれのタンパク質のヘパリンへの結合において観察されたものと同一であった。拡張された第２の繰返体［２４６、配列番号１９（ＳＥＱ　Ｉ：）　ＮＯ：ｌ９））を含むペプチドは、最も活性であり、４０Ｍｇ／ｍｉ’ でトロンポスボンジンの結合を９０９６を超えて抑制した。使用した濃度において、３種全てのｌ型繰返体からのドデカペプチドによるメラノーマ細胞に対する結合の抑制は部分的であった。追加の実験において（データは示さず）、抑制は用量に依存し、タンパク質がヘパリンに結合するのを抑制するのに必要な量に相当する濃度で起こった。しかしながら、完全な抑制はドデカペプチドでは証明できなかった。何故なら、結合は高い１度において増大したからである（結果は示さず）。

ヘパリンはへ２０５８メラノーマ細胞に対するトロンポスボンジンおよびラミニンの両者の結合を抑制した（第４図）。トロンポスボンジンの結合は、約９０％抑制されたか、ラミニン結合の約５０９０は過剰のヘパリンにより抑制されることに対し妨害している。Ａ２０５８メラノーマ細胞に幻するラミニンの結合は、部分的にヘパリン依存性であることを先に示した〔タロボレッティ等（Ｔａｒｏｂｏｌ、Ｊｔｉ　ｅＬ　ａｌ、）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ　、２６５　、＋２２５３−１２２５８（１９９０）　）　、ヘパリンの存在ＦにＩμｇ／ｍＣのペプチド２４６を添加すると、ラミニンの結合をさらに抑制しなかったく第５図）か、これはペプチドによる抑制か、メラノーマ細胞のラミニンについてのヘパリン−抵抗性タンパク質受容体に対するよりも、硫化複合糖質に対する結合に対し競合的であるということを示している。ｌＯμｇ　／　ｍ　１のペプチドにおいて、ラミニン結合の抑制はｌ＼バリンの添加により部分的に反対になり、恐らくヘパリンがペプチドへ結合することによると考えられる。

ペプチドの幾つかは、プラスチックに吸着された場合、メラノーマ細胞の付着を強力に促進する（第６図）。付着分析での活性は、ペプチドのヘパリンまたはスルファチドに対するトロンポスボンジンの結合を抑制する能力に合致する。ベプチ自８５［配列番号２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）］は１８４〔配列番号１　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１））または１８６〔配列番号３　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３））よりも、両者の分析において、より活性であった。１８５〔配列番号４　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：４）　）の活性なサブフラグメントもまた細胞付着を促進した。ＶＴＣＧを含むペプチドは、Ｃ３ＶＴＣＧ　［配列番号４　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　４））を除き、上記した背景において、細胞付着を非常に促進するものはなかった。ヘパリン結合の抑制についてすでに観察したように、Ｃ３ＶＴＣＧ（配列番号４　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　４）］の最初のＣｙｓ残基をＳｅｒで置換することにより、メラノーマ細胞の付着を促進する活性は損なわれる〔配列番号２　（ＳＢｏ　１０　Ｎ。

、２）〕。トトロンボスポンジのアミノ末端ドメインからの２種のペプチドは、メラノーマ細胞の付着を促進しなかった。

ペプチドに対する付着は、用量依存性であった（第７図）。第２の繰返体（２４６）からの拡張されたペプチドは最も活性であり、そして１０８２７口１１において、メラノーマ細胞の広範囲な拡散を促進した。Ｔｒｐ残基は、そのオクタペプチドをＡｌａで置換したものが不活性であるので、付着に必要であった。

トロンポスボンジンおよびアポリポタンパク質Ｅの１８ｋＤの組み替えヘパリン −結合フラグメントはＡ　２０５Ｂメラノーマ細胞のペプチドに対する付着を抑制した（第７図）。抑制はトロンポスボンジンフラグメントによるよりも、アポリポタンパク質Ｅによるほうが大きくなった。この活性の順序は、ヘパリンについてのアポリポタンパク質ＥＣ）より大きい親和性に対応している。両方のタンパク質がヘパリン硫酸に結合するので、この結果は、メラノーマ細胞のヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合することにより細胞付着を促進することを示唆する。

本発明は、現在知られているヘパリン結合の共通配列を欠如しているトロンポスボンジンのｌ型繰返体からの、強力なヘパリン結合ペプチドの新しいクラスを定義する。本願データは、１型繰返体からのペプチドが、３種のヘパリン結合タンパク質と硫化複合糖質との相互作用を抑制することができる、強力なヘパリンおよびスルファチド結合ペプチドであることを証明している。それらのペプチドは、ヘパリン−依存性付着タンパク質、成長因子および凝集酵素の一般的抑制剤であろう。ヘパリンへの結合を抑制するペプチドは、プラスチックに固定された場合に、メラノーマ細胞の付着を強力に促進する。ペプチドはまた、ヒトメラノーマ細胞とラミニンおよびトロンポスボンジンの幾つかのヘパリン−依存性相互作用を抑制する。トロンポスボンジンのアミノ末端ドメインにおける推定されたヘパリン結合配列は、最近同定されたトロンポスボンジンについての第２の遺伝子に合致していないが〔ボーンスタイン等（ＢｏｒｎｓＬｅｉｎ　ｅＬ　ａｌ、）、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｔ２６６．１２８２１−１２８２４９１９９１））　、本発明において同定されたｌ型繰返体からのヘパリン結合配列は合致している。

主要な抑制活性は、一般に塩基性アミノ酸を欠いているが２個の対応するＴｒｐ残基および１個の対応するＳｅｒ残基を含んでいる、それぞれの１型繰返体中のオクタペプチドに存する。Ａｌａでの置換は、Ｔｒｐ残基およびＳｅｒ残基の少なくとも一つがヘパリンまたはスルファチド結合に並びにメラノーマ細胞付着の促進に必須であることを証明しティる。５ＳＣ３ＶＴ　（配列番号１３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３））　（７）弱い活性およびＷＳＰＷＳＳＣ３ＶＴ　（配列番号１６（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１６）Ｉ　ノｗｓ　ｐｗｓＳＣ３［配列番号＋５（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１５）］に対する増大された活性は第２の活性配列が存在するかもしれないことを示唆している。しかしながら、テトラペプチドのＣ３ＶＴ　（配列番号９　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　９））まタハ先ニ記載したＶＴＣＧ〔配列番号５　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　５）］は不活性である。ペプチドのＣ３ＶＴＣＧ　（配列番号４　（ＳＥＱｌｏ　Ｎｏ：　４））は活性である。その活性はジスルフィドで仲介された重合を必要とするかもしれないが、しかし、重合を防止するために最初のＣｙｓをＳｅｒに置換することは殆どの活性を除去することになる。２つの副部位（サブサイト）が存在するかどうか、或いはペプチドの活性の相違がペプチド中の単一の活性配列の構造における変異によるものであるかどうかということを決定することが残されている。ＶＴＣＧ　（配列番号５　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋５）　）が、トロンポスボンジンのタンパク質受容体に結合するｌ型繰返体における有効な付着配列であることが提案されている〔リンチ等（Ｒｉｃｈ　ｅＬ　ａｌ、）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１５７４−１５７７（＋９９０）；ブラタ−等（Ｐｒａｔｅｒ　ｅＬ　ａｌ、）　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、＋１２．１０３１−１０４０　（＋９９１））　、この配列はヘパリンと結合しないか、関連するペプチドのＣ３ＶＴＣＧ　［配列番号４　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：４）〕はトトロンボスポンジがヘパリンに結合するのを抑制する。何故なら、Ｃ３ＶＴＣＧ　（配列番号４　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４））はラミニンおよびアポリポタンパク質Ｅの結合を阻止するが、しかしながら、このペプチドは、ＶＴＣＧ　（配列番号５（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　５）］配列を認識する有効なタンパク質受容体と結合するトロンポスボンジンの特異的プローブとしては有用ではない。

５ｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｘ−３ｅｒの最小の共通配列が、最も活性なペプチドの配列と比較することにより誘導された。この配列に絶対的に合致するアミノ酸残基は２個のトリプトファンと最初のＴｒｐに続くセリンである。２個Ｄ　Ｔｒｐ残基の少なくとも一つが、両方の残基とアラニンを置換すると活性を喪失するので、活性に必須である。したが２）で、先に定義された塩基性アミノ酸残基のクラスターを含むヘパリン結合ペプチド〔カーディン等（Ｃａｒｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ９．２ｌ −３２（１９８９）；ジャクジン等（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ、）、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、７１　、４８１−５３９、（１９９１））に対し、トリプトファンが１型繰返体に結合するヘパリンの主要な決定因子である。トリプトファンは抗トロンビンＩＩ＋に結合するヘパリンに関係している（ブラックバーン等（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ　ｅＬ　ａｌ、）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣＩ＋ｅｔ　２５９．９３９−９４１　（１９８４））。Ｔｒｐ　４９の化学的変性がヘパリンの結合および抗トロンビンＩ１１によるトロンビンのヘパリン−増強抑制を阻止した。トリプトファンは結晶学的分析により抗炎水化物モノクローナル抗体に結合する炭水化物中に直接包含されることが示されており〔サイグラ−等（Ｃｙｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２５２．１４２−４４５　、（１９９１）〕、さらにファン・デル・ワールス相互作用および水素結合により炭水化物と相互作用することか示されている。トリプトファンの類縁物であるセロトニンは、また、シアリルオリゴ糖と特異的に結合することが報告されている〔ストルジオン等（ＳＬｕｒｇｅｏｎ　ｅＬ　ａｔ、）　、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１０３．２１３−２１９　（１９８２））　。分光学的および結晶学的分析を含め、ヘパリンとトロンポスボンジンペプチドの相互作用の更なる特性解析がトリプトファンの結合における役割を決定するためにおよび相当するセリンを含め他のアミノ酸の寄与を調べるために必要とされるであろう。

ヘパリンはラミニンおよびトロンポスボンジンと結合するスルファチドと競合するけれども、■型ＩＩｆＡ体ペプチドはヘパリンとスルファチドの結合活性の間の幾つかの相違を表わす。先に決定したトロンポスボンジンのアミノ末端ドメインからのヘパリン−結合共通配列は、ヘパリン結合を弱く抑制するう第２のｌ型繰返体中の同様の配列は、トリプトファン−含有ヘパリン結合配列と共に含まれている場合、ヘパリン結合の抑制を増大する。ヘパリンと結合するモチーフのＢＢＸＢ（＾ＳＸ−＾５ｘ−Ｘａａ−Ａｓｘ）を含むペプチドは、しかしながら、全ての場合にスルファチドと相互作用しなかった。実際、第２の繰返体に基本配列を加えると、スルファチド結合分析において活性が低下した。ｌ型繰返体の同族体を共有するタンパク質によりスルファチド結合を仲介することを提案された〔ホルト等（ＨｏｌＬ　ｅｔａｌ、）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｎ、　２６４．１２１３８−１２１４０　（１９８９））　、　ＶＴＣＧ　Ｃ配列番号５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５））と結合するヘパリン結合モチーフは、トロンポスボンジンのヘパリンまたはサルファチ：４への結合を抑制せず、ラミニンのヘパリンに対する結合のみを弱く抑制した。それらの発見は、我々の先の報告である、ラミニンのＡ鎮の変性した３０ｋＤのフラグメント中のヘパリン結合共通配列がヘパリンには十分であるが、スルファチド結合にはそうではないというものと合致する〔タラボレッチ等（ＴａｒａｂｏｌｅｔＬｉ　ｅＬ　ａｌ。）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｏ、　２６５．１２２５３−１２２５８　（＋９９０））B トロンポスボンジンは２つの有効なヘパリン結合部位を有している。直接結合および抗体抑制の両者は、アミノ末端ドメインが細胞の硫化複合糖質とのいくつかの相互作用を含むことを示している。本願での結果に基づき、ｌ型繰返体は虚力なヘパリン結合配列を有している。それらの配列を含むトロンポスボンジンの５０〜７０ｋＤのフラグメントのメラノーマ細胞との相互作用は、部分的にヘパリン依存性である〔ブラタ−等（ＰｒａＬｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　、１１２．１０３１−１０４０　（＋９９１））。しかしながら、同一の配列を含むより大きい１４０ｋＤのフラグメントは、ヘパリン、スルファチドまたはヘパリン硫酸と結合しない〔ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４８．６７８５−６７９３（１９８８）　；カエスベルグ等（Ｋａｅｓｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｔ、）A Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８３　、９９４−１００１［９８９））　、したがって、配列はこのフラグメントにおいて神秘的である。配列が完全なタンパク質において神秘的であるかどうかは未だ確率することができない。今日まで、しかしながら、完全なトロンポスボンジンと硫化複合糖質との全ての報告されている相互作用は、アミノ末端ドメインと結合する抗体Ａ２．５に対し導受性があるとされている。

第７〜１６図については、既に簡単に述べたが、以下に詳細に記載する。

第７図は、抗−トロンボスボンジン抗体Ａ４．１のトロンポスボンジンペプチドとの結合を表わすグラフである。ＢＳＡと複合したトロンポスボンジン■型繰遮体ペプチドに対する抗−トロンボスボンジン抗体Ａ４．１の結合は、材料と方法において記載したようにして決定された。結合した放射能は、ペプチド−ＢＳＡＩ合体の添加した量の関数として存在する：（１８４）　；（１８５）　；（１８６）　；１Ｂ７；（２０３）　；（２０４）　：（２０５）　；および　（２０（ｉ）［それぞれ、配列番号１（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１）〜配列番号８　（ＳＥＱ　ＩＩＩ　Ｎｏ：　８））。

第８図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質（スルファチド）と結合するＩ［Ｈ−トロンポスボンジンの抑制を表わすグラフである。ミクロタイタープレートウェルをスルファチドで被覆し、ペプチド：　１８４　：　１８５　；　１８６　；１Ｂ７　、２０３　；　２０４　、２０５　、２０６　（それぞれ、配列番号！　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　１）〜配列番号８　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　８））の増大する濃度の存在下に０．２μｇ／ｍｌの標識化トロンポスボンジンと共にインキュベートした。ペプチドの構造は第１表に示した。結合は、抑制剤の不存在下に対照結合の百分率として示した。

第９図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質（ヘパリン−ＢＳＡ）と結合する１１８１−トロンポスボンジンの抑制を表わすグラフである。ミクロタイタープレートウェルをヘパリン−ＢＳＡで被覆し、ペプチド：　１８４　：　１８５　。

１８６　；１８７　；２０３　；２０４　：２ｏｓ　；２０６　（それぞれ、配列番号１　（ＳＩＩＩｏ　１０　ＰＩＯ：　１）〜配列番号８　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　８））の増大する濃度の存在下に０．２μｇ　／　ｍ　ｌの標識化トロンポスボンジンと共にインキュベートした。ペプチドの構造は第１表に示した。結合は、抑制剤の不存在下に対照結合の百分率として示した。

第１０図は、トロンポスボンジンペプチドによる硫化複合糖質（ヘパリン−ＢＳＡ）と結合する＋２Ｊ−ラミニンの抑制を表わすグラフである。ミクロタイタープレートウェルをヘパリン−ＢＳＡて被覆し、ペプチド：　１８４　；　１８５　；　１Ｂ６　、１８７　；２０３　；２０４　．２０５．２０６　［それぞれ、配列番号１　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１　）〜配列番号８　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８）３の増大する濃度の存在下に０．２μｇ　／　ｍ　１の標識化ラミニンと共にインキュベートシた。ペプチドの構造は第１表および第２表に示した。結合は、抑制剤の不存在下に対照結合の百分率として示した。

第１１図は、ヘパリンアガロースに対するトロンポスボンジン〔配列番号１９（１０ＳＥＱ　Ｎｏ：　１９）　）の第２の■型繰近体からのペプチドの結合を示すグラフである。

ペプチド２４６　（ＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ、ｔｏｏ　ｐｇ）を、ｐＨ７，４で２０ｍＭのトリス緩衝液中、０．７％７ｃｍのヘパリン・アガロースカラムに入れ、０．５ＭのＮａＣＩまでの勾配で、同一の緩衝液中、ｏ、７ｍ１１分の流速で溶出した。

吸光度は２８０ｎｍで測定した。ＮａＣＩ４１度は電導度により決定した。

第１２図は、トロンポスポンジンペプチドによるＡ　２０５８メラノーマ細胞と結合するＩＩＩ　■−ラミニンまたは１ｆＪ−トロンポスポンジンの抑制を示す棒グラフである。メラノーマ細胞（０，２ｍｊ！中、２Ｘ１０”個）を０．２Ｍｇ／ｍＩ！の標識化ラミニン若しくはトロンポスポンジンのみ、またはトロンポスポンジン（１８６）　の第１の（１８４、配列番号１　（１０５ＥＱ　Ｎｏ：　１））　、第２の（１８５、配列番号２　（１０ＳＥＱ　Ｎｏ：　２））および２４６〔配列番号１９（１０５ＥＱ　ＮＯ：　１９）　）の、または第３の■ 型繰近体からのペプチドｌＯμｇ　／　ｍ　ｎまたは１Ｍｇ／ｍｌのヘパリンの存在下でインキュベートした。細胞を油をとおして遠心分離し、結合したものを遊離ラミニンから分離し、細胞ペレットの放射能をγカウンターで定量した。結果を、ペプチドの不存在下で定量した対照結合の百分率として表わし、それは３回の定量の平均上標準偏差（ＳＤ）である。

第１３図は、ヘパリンおよびトロンポスポンジンペプチド２４６〔配列番号１９（１０３ＥＱＮＯ：ｌ　９）］によりＡ　２０５Ｂメラノーマ細胞と結合する１２５１−ラミニンの抑制を示す棒グラフである。メラノーマ細胞（０，２ｍｉ’ 中、２ＸｌＯ’細胞）を０．２Ｍｇ／ｍｌの標識化ラミニンのみと共に、または０．１Ｍｇ　／　ｍ　ｌのヘパリン若しくは１またはｌＯμｇ／ｍｎのペプチド２４６若しくはそれら二つの抑制剤の組み合わせの存在下でインキュベートした。結果を、ペプチドの不存在下で定量した対照結合の百分率として表わし、それは３回の定量の平均±ＳＤである。

第１４図は、対照ペプチドおよび１６種のトロンポスポンジンペプチドとのＡ　２０５８メラノーマ細胞の付着の程度を示す棒グラフである。Ａ　２０５Ｂメラノーマ細胞のトロンポスポンジンペプチドへの付着。細菌学的ポリスチレンを２００μｇ　／　ｍ　１の記載したペプチドで被覆した。１０３／ｍｍ２のＡ　２０５８メラノーマ細胞を加え、３７℃で６０分間インキュベートした。付着を微視的に定量し、平均±ＳＤ、ｎ＝６で示した。

第１５図は、４種のトロンポスポンジンペプチドに対するＡ　２０５８メラノーマ細胞の濃度依存性を示すグラフである。微視的に定量した付着は適用した細胞（平均±ＳＤ、ｎ−６）の、記載した濃度のペプチド：　１８５　、２３９　、２４４または２４６（それぞれ配列番号２　（１０３ＥＱ　Ｎｏ：　２）、配列番号１４（１０ＳＥＱ　ＮＯ：１４）、配列番号１７（ＩＤ　ＳＥＱ　ＮＯ：１７）、または配列番号１９（１０ＳＥＱ　ＮＯ：１９）］で被覆したプラスチックディスクに対する百分率として示した。非特異的付着は１．９±０．９％であった。

第１６図は、ヘパリン結合ペプチドによるトロンポスポンジンペプチドに対するメラノーマ細胞付着の抑制を表わす棒グラフである。ＲＰＭＩ培地または記載した濃度の１８ｋＤトロンポスボンジンフラグメント（固体環）、２８ｋＤ）ロンポスポンジンフラグメント（灰色環）、またはアポリポプロティンＥ（帯状環）を含有する培地中において、メラノーマ細胞（１ｘ　１０”／　ｍｍ”　）を放置し、２００μｇ／ｍｌｌのペプチド１８５（配列番号２　（１０３ＥＱ　Ｎｏ：　２））で被覆したポリスチレンディスクに付着させた。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝６として示した。

本発明の別の態様において、本発明のペプチドは、適当な基質に直接または適当な担体ポリマー若しくはタンパク質に接合した後に固定してもよい。適当な基質、担体ポリマーおよび担体タンパク質は当業界の当業者に公知のものである。

そのような固定化した組成物は、付着の促進および足場依存性細胞の成長に有用である。特に好ましいものは、固定されたペプチドがペプチド２４６〔配列番号１９（１０Ｓ［ｌＱ　Ｎｏ：　１９）である態様である。

特別の態様についての前記した記載は、一般的概念から離れることなく、現在の知識、容易な変更および／または特別の態様のような種々の応用への適合を適用することにより、他者が成し得る発明の一般的な性質を十分に表わすであろうし、それ故、そのような適合は開示した態様と同等の意味および範囲内に包含されることが意図されている。ここで用いられている言い回しまたは文言は記載のためのみであり、限定するものではない。

原　配　列　表（１）一般的情報（ｉ）　出願人：デビツト・ディー・ロバーツ等（ｉｉ）　発明の名称、メラノーマ細胞付着促進ヒトトロンポスポンジンのＩ型繰返体からのヘパリン−およびスルファチド−結合ペプチド（ｉ　ｉ　ｉ）　配列の数；２７（ｉｖ）　応答住所：（Ａ）住所二ロウエ、プライス、レジランク・アンド・ベラカー（Ｂ）ストリート：スート３００．９９カナール・センター・プラザ（Ｃ）市：アレクサンドリア（０）州、バージニア（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号：２２３１４（Ｖ）（＾）媒体種類：フロンピー・ディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ　ｐｃコンパチブル（Ｃ）動作システム：　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェア：（ｖｉ）　現在の出願データ・（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願臼・（Ｃ）分類二（ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人情報・（＾）氏名：ロバート・エル・プライス（Ｂ）登録番号：　２２．６８５（Ｃ）参照／整理番号ニア１７−１１１（ｉｘ）　通信情報・（Ａ）電話・７０３６８４１１１１（２）配列番号・ｌについての情報（１）　配列の特徴：（Ａ）長さ２１２個のアミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：配列番号：１Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒ１　５　ｔ。

（３）配列番号＝２についての情報：（１）　配列の特徴。

（Ａ）長さ２１２個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号：２Ｓｅｒ　旧ｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃ）Ｉ９Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＴＩ＋ｒ（４）配列番号・３についての情報。

（１）　配列の特徴：（Ａ）長さ＝１２個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状　゛（１１）　分子の型・ペプチド（ｘｉ）　配列の記載、配列番号　３Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　丁ｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ（５）配列番号＝４についての情報：（１）　配列の特徴・（Ａ）長さ＝６個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）　ζボロジー：直鎖状（１１）　分子の型、ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：配列番号：４Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｖ（６）配列番号　５についての情報。

（１）　配列の特徴：（Ａ）長さ、４個のアミノ酸（Ｂ）型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー　ａｕｉ状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｌ）　配列の記載・配列番号＝５Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ（７）配列番号・６についての１ｎ報（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）長さ：１０個のアミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）Ｐボロン一、ａＭ状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｌ）　配列の記載　配列番号二〇Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇｌ　５　１０（８）配列番号ニアについての１ｎ報：（１）　配列の特徴（＾）Ｐ、さ：１０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸ＣＤ）　；−ポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）　分子の型：ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：配列番号；７Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇｌ　５　１０（９ン配列番号二８についての情報：（１）　配列の特徴（Ａ）長さ＝ＩＯ個のアミノ酸（Ｂ）型；アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）　分子の型・ペプチド（ｘｉ）　配列の記載・配列番号＝８Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　＾「ｇ（１０）配列番号：９についての情報・（１）　配列の特徴：（Ａ）長さ２４個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｌ）　配列の記載、配列番号・９Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ（１１）配列番号、１０についての情報：（１）　配列の特徴：（Ａ）長さ：４Ｍのアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒｌ　５　１０（１８）配列番号＝１７についての情報＝（ｉ）　配列の特徴（Ａ）長さ、８個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｉ）　配列の記載・配列番号：１７Ｓｅｒ　１ｌｉｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（１９）配列番号、１８についての情報：（ｉ）　配列の特徴・（Ａ）長さ＝１３個のアミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）　分子の型・ペプチド（ｘｉ）　配列の記載・配列番号、１８Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ（２０）配列番号＋１９についての情報。

（ｉ）　配列の特徴・（Ａ）長さ＝１６個のアミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉｉ）　分子の型・ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号：１９Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　ｌ１ｉｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｅｒ　Ｓｅ■ ＋　５　１０　１５（２１）配列番号＝２０についての情報：（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）長さ、７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎮状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号：２０＾ｒｇ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ（２２）配列番号＝２１についての情報：（ｉ）　配列の特徴：（＾）長さ＝ＩＯ個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）　！−ポロジー：直鎖状（ｉｔ）　分子の型二ペプチド（ｘｉ）　配列の記載；配列番号：２１＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ（２３）配列番号：２２についての情報：（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）長さ；１１個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）　分子の型、ペプチド（ｘｉ）　配列の記載・配列番号：２２Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　５ｅｒ（２４）配列番号：２３についての情報：（ｉ）　配列、の特徴：（Ａ）長さ二〇個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｉｉ）　分子の型：ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号＝２３Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２５）配列番号＝２４についての情報：（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）長さ＝７個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）　分子の型：ペプチド（ｘｌ）　配列の記載：配列番号＝２４Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２６）配列番号二２５についての情報：（＋）　配列の特徴：（Ａ）長さ：　１１１１のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）　分子の型；ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号＝２５Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　５ｅｒ（２７）配列番号＝２６についての情報：（１）　配列の特徴：（Ａ）長さ・９個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）　ｐポロジー・直鎮状（ｉｉ）　分子の型：ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号：２６Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｒｌｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ（２８）配列番号＝２７についての情報：（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）長さ７８個のアミノ酸ＣＢ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１１）　分子の型：ペプチド（ｘｉ）　配列の記載：配列番号＝２７Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　’ｒｒｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　ＳｅｒＩＮ）ＩＩＢＩＴＯＲ５（ｕ１４）Ｆｉｇｕｒｅ　２ −・−１８４−・ロー　１８５　−一ム・−１８６Δ　１８７　奮　２０５　０２０６Ｆｉｇｕｒｅ　３ −・−１８４−０−１８５−ム−１８６・・・Δ　１８７−　２０３　ロ　２０４　マ　２０５ＩＮ）ＩＩＢＩＴＯＲ５（ｕＭＩＦｉｇｕｒｅ　４ −・−１８４・−〇−１８５−一轟−−１８６Δ　１８７Ｆｉｇｕｒｅ　５（２００ｕｇ／而）Ｆｉｇｕｒｅ　７ −・−１８４−０−１１３５−＾−１８６、−Δ、、１８７０　２０３　？　２０４　Ｗ　２０５　＠　２０６０．００＋　０．０１　０．１　１　１０ＰＥＰＴＩＤＥ−ＢＳＡ　Ｃ０ＮＪｔｌＣＡＴＥ　（ｕｇ）Ｆｉｇｕｒｅ　８ −・−１８４−０−１８５−・轟−−１８６・　轟・・・　１８７”　２０３　ｏ　２０４　マ　２０５　７　２０６Ｆｉｇｕｒｅ　９ＰＥＰＴＩＣＩＥ　ｌｕｌｌＦｉｇｕｒｅ　ＩＩＥＬＵＴＩＯＮ　ＴＩＭＥ　（ｍｉｎ）特表平７−５０１８０８　（１４）国際調査報告、　Ｉｉ＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９２／１０４９６、、、−自Ａ＋ＰＣ丁／ＬＩ５９２／１０４９６フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　５／１０３Ｃ１２Ｎ　５１０６（７２）発明者　クルツチッシュ　ヘンリー　シーアメリカ合衆国、エム　ディ　２０８１７．ベセスダ　デボール　ドライブ　９７０４Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】１．４個より多いアミノ酸残基を有し、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質に対する高い親和性を有するペプチドであって、実質的に電荷のないことを特徴とする上記のペプチド。２．４個より多いアミノ酸残基を有し、ヘパリンまたは関連する硫化複合糖質に対する高い親和性を有するペプチドであって、１０７〜ｌ０５／モルの範囲のヘパリン結合定数を有することを特徴とするペプチド。３．配列−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐから成る請求項２記載のペプチド。但し、Ｘａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ＨｉｓおよびＳｅｒから成る群より選択されるアミノ酸である。４．−Ｂ１−Ｂ２−Ｘ−Ｂ３−または−Ｂ１−Ｘ−Ｂ２−Ｙ−Ｂ３−から成る式から選択される更なる配列を有する請求項３記載のペプチド。但し、ＸおよびＹはそれぞれいずれかのアミノ酸残基であり、Ｂ１、Ｈ２およびＢ３はそれぞれＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから成る群より選択されるものである、５．配列番号１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）、配列番号３（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３）、配列番号１４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）および配列番号１９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）から成る群より選択される配列を有する請求項１記載のペプチド。６．更に、アミノ末端Ｎ−アセチルおよびカルボキシ−末端アミドを有する請求項２記載のペプチド。７．治療に有効量の、請求項１記載のペプチドおよび医薬的に許容可能な賦形剤または担体から成る医薬組成物。８．治療に有効量の、請求項２記載のペプチドおよび医薬的に許容可能な賦形剤または担体から成る医薬組成物。９．ペプチドが、配列番号１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）、配列番号３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）、配列番号１４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）および配列番号１９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）から成る群より選択される配列を有するペプチドである請求項８記載の医薬組成物。１０．ペプチドが適当な担体ポリマーまたはタンパク質と任意に接合し、該ペプチド、または適当な担体ポリマーまたはタンパク質と接合したペプチドが、適当な基質と結合している請求項２記載のペプチド。１１．ペプチドが、配列番号１９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）による配列を有するペプチドである請求項１０記載の組成物。１２．対象物中のヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と結合する方法であって、該対象物を有効量の請求項１記載のペプチドで処理することを特徴とする方法。１３．対象物中のヘパリンまたは関連する硫化複合糖質と結合する方法であって、該対象物を有効量の請求項２記載のペプチドで処理することを特徴とする方法。１４．ペプチドが、配列番号１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、配列番号２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）、配列番号３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）、配列番号１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）および配列番号１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）から成る群より選択される配列を有するペプチドである請求項１３記載の方法。１５．足場依存性細胞の付着および成長を促進する方法であって、請求項２記載のペプチドを適当なポリマーまたはタンパク質と任意に接合し、該ペプチドまたは該接合ペプチドを適当な基質に結合し、該結合ペプチドまたは接合ペプチドを立場依存性細胞、または複数の立場依存性細胞と接触させ、さらに該基質および該細胞を、該細胞の成長に必要とされる栄養分の存在下にインキュベートすることを特徴とする方法。１６．ペプチドが配列番号１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）による配列を有するペプチドである請求項１５記載の方法。