DE69822467T2

DE69822467T2 - Entzündungshemmende peptide des c-reaktiven proteins

Info

Publication number: DE69822467T2
Application number: DE69822467T
Authority: DE
Inventors: Matityahu Fridkin; J. Eran YAVIN
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1997-06-29
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: US7182945B2; IL133769A; US6528618B1; WO1999000418A1; DE69822467D1; ES2218836T3; EP0996633B1; ATE261990T1; IL121191A0; EP0996633A1; AU7929198A; US20030152564A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Peptide, die von der primären Sequenz des Akutphasen-Reaktanten, dem C-reaktiven Protein (CRP) abgeleitet sind, genauer ein Peptid, das den Positionen 62–71 von CRP entspricht und Derivate davon, wobei die Peptide in vitro die Enzym-Aktivitäten der menschlichen Leukozyten-Elastase (hLE) und/oder des menschlichen Leukocyten-Cathepsins G (hCG) hemmen, zwei starker Serin-Proteasen, die mit Gewebeschädigung in Verbindung stehen, der im Verlauf verschiedener chronischer entzündlicher Zustände auftritt. Die Erfindung betrifft des Weiteren entzündungshemmende Arzneimittel, die die von CRP abgeleiteten Peptide umfassen.
Abkürzungen
Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung verwendet: CRP, C-reaktives Protein, hLE, menschliche Leukocyten-Elastase; hCG, menschliches Leukocyten-Cathepsin G; MeOSuc-AAPV-NA, Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-Nitroanilid; Suc-AAPF-NA, Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-Nitroanilid.
Hintergrund der Erfindung
C-reaktives Protein (CRP) ist ein Plasmaprotein, das während seiner dramatischen Anhäufung im Blutfluss während der entzündlichen Reaktion als Hauptreaktionspartner klassifiziert wurde. Innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums (24–48 h) nach der Gewebeverletzung oder bestimmter traumatischer Vorkommnisse kann die CRP-Blutkonzentration auf das 1000-fache des normalen Werts auf bis zu 1 mg/ml (Ballue und Kushner, 1992) ansteigen.
CRP besteht aus fünf identischen Untereinheiten, die jeweils 206 Aminosäuren enthalten, die durch eine einzelne Disulfidbindung verbunden sind und die nicht-kovalent in ein zyklisches Pentamer, das Pentraxin genannt wird, aggregieren. Die genaue biochemische Funktion von CRP als Gesamteinheit ist noch nicht entschlüsselt. Es wurde gezeigt, dass CRP in vitro an spezifische Rezeptoren auf menschlichen Neutrophilen (K_d ~ 5 × 10^–8 M), Monocyten (K_d ~ 10^–7 M) und anderen Zellen, die mit Entzündungen in Verbindung stehen, binden (Ballue und Kushner, 1992).
In den Laboren der vorliegenden Erfinder und ihrer Mitarbeiter wurde herausgefunden, dass nach der Bindung an Neutrophile, CRP nacheinander von einer membrangebundenen neutralen Serin-Protease, die charakterisiert wurde (Shephard et al., 1992) und durch lysosomal abgeleitete Enzyme abgebaut wird, um verschiedene Peptide mit niedrigem Molekulargewicht zu erhalten. Mehrere dieser Peptide wurden identifiziert, synthetisiert und es wurde gezeigt, dass sie mögliche entzündungshemmende Mittel sind, die die neutrophile Phagocytose, die Degranulierung und die Bildung des Superoxid-Ions (O₂ ^–) hemmen ((Shephard et al., 1990, Yavin et al., 1995). Das Superoxid-Ion ist die Stamm-Verbindung verschiedener abbauender Mittlersubstanzen, von denen angenommen wird, dass sie bei Gewebeverletzungen, die mit Entzündungen in Verbindung stehen, eine zentrale Rolle spielen (Ballue und Kushner, 1992).
Die hervorstechendsten der Peptide, die von Shephard et al., 1990 und Yavin et al., 1995, offenbart wurden, wurden von innerhalb der Primärsequenz von CRP wie folgt abgeleitet: Asp₇₀-Ile-Gly-Tyr-Ser₇₄, Lys₂₀₁-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro₂₀₆, Leu₈₃-Phe-Glu-Val-Pro-Glu-Val-Thr₉₀, Vah₇₇-Gly-Gly-Ser-Glu-Ile₈₂ (Shephard et al., 1990) und Asn₁₆₀-Met-Trp-Asp-Phe-Val₁₆₅, Gln₂₀₃-Leu-Trp-Pro₂₀₆, Ser₁₈-Tyr-Val-Ser-Leu-Lys₂₃ (Yavin et al., 1995). Es wurde von den Autoren gezeigt, dass diese Peptide verschiedene neutrophile Funktionen hemmen, was anzeigt, dass sie in der Lage sind, während der Akutphasenreaktion die Superoxidproduktion durch Neutrophile in vivo als Teil eines komplexen, schützenden Mechanismus zu regulieren. Wie jedoch in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/28182 derselben Anmelder offenbart, fehlt vielen dieser Peptide eine hLE hemmende Fähigkeit.
Menschliche Leukocyten-Elastase (hLE) und menschliches Leukocyten-Cathepsin G (hCG) sind die beiden fähigsten neutralen Serin-Proteasen, die in den azurophilen Granula von Neutrophilen, die beim intrazellulären Abbau von Proteinen beteiligt sind, gefunden wurden und spielen bei der Phagocytose und der Abwehr von eindringenden Organismen eine wichtige Rolle. In der extrazellulären Umgebung ist hLE in der Lage, verschiedene Bindegewebsproteine einschließlich stark quervernetztem Elastin abzubauen, wohingegen hCG beim Abbau von Proteoglycanen und Kollagenen sehr wirksam ist und es wurde gezeigt, dass es die elastolytische Fähigkeit von hLE erhöht (Groutas, 1987).
Die Freisetzung von Enzymen durch aktivierte Neutrophile in das extrazelluläre Medium wird normalerweise durch verschiedene starke Inhibitoren kontrolliert. Die spezifischsten natürlichen Inhibitoren, α₁-Proteasehemmer (α₁-P₁) und α-Antichymotrypsin (ACT) werden gegen hLE beziehungsweise hCG gerichtet (Groutas, 1987). Unausgewogenheiten in der Menge der Gewebeproteasen, wie hLE und hCG und ihre Hemmer, ermöglichen es, dass hLE und hCG Bindegewebe angreifen und sind bei der schweren und dauerhaften Gewebeschädigung, die mit dem Lungenemphysem einhergeht (Groutas, 1987), rheumatischer Arthritis (Gallin et al., 1988), cystischer Fibrose (Jackson et al., 1984) und verschiedenen anderen entzündlichen Zuständen angezeigt. Hauptsächliche Forschungsbemühungen wurden basierend auf einer großen Variablität von organischen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht auf die Entwicklung möglicher Hemmer für hLE und hCG, wie 3,3-Dialkylazetidin-2-one, vorgeschlagen als oral aktive β-Lactam-Hemmer von hLE (Finke et al., 1995), ausgerichtet (Edwards und Bernstein, 1994).
Es wurde berichtet, dass CRP als Gesamtprotein keine hemmende Wirkung auf hLE hat (Vachino et al., 1988). Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass eine spezifische Region innerhalb der Primärsequenz von CRP, welche das Kernpeptid Val₈₉-Thr-Val-Ala-Pro-Val-His-Ile₉₆ enthielt, in vitro die enzymatischen Aktivitäten von hLE und hCG in größerem Maße hemmt als Peptide mit ähnlichen Kettenlängen, die den aktiven Orten ihrer natürlichen Inhibitoren entsprechen (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/28182; Yavin et al., 1996). Es wurde herausgefunden, dass neue biologisch aktive CRP-abgeleitete Peptide, d. h. Peptide, die in Lage sind, die enzymatische Aktivität von hLE und/oder von hCG in vitro zu hemmen und die zuvor in der inneren hydrophoben Schleife, die CRP36-97 in jeder Untereinheit umfasst (siehe 1), verborgen waren, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung die enzymatischen Aktivitäten von hLE- und hCG-Enzymen signifikant hemmen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches CRP-abgeleitetes Peptid, das in der Lage ist, die enzymatische Aktivität von menschlicher Leukocyten-Elastase (hLE) und/oder menschlichem Cathepsin G (hCG) in vitro zu hemmen, wobei das Peptid ausgewählt ist aus:

(i) einem Kernpeptid, das den Positionen 62–71 der Sequenz von menschlichem C-reaktivem Protein (CRP) entspricht, mit der Formel: Glu₆₂-Ile-Leu-Ile-Phe-Trp-Ser-Lys-Asp-Ile₇₁

(ii) Austausch von Glu₆₂ durch Asp oder durch einen negativ geladenen Rest, der keine Aminosäure ist, abgeleitet von Bernstein-, Glutar- oder Adipinsäuren;
(iii) Austausch von jedem der Reste Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ oder Trp₆₇ durch einen natürlichen oder nicht-natürlichen hydrophoben Aminosäurerest;
(iv) Deletion von einem oder zwei Aminosäureresten, ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇;
(v) Austausch von 1–3 Aminosäureresten, ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ durch einen einzelnen nicht-natürlichen Aminosäurerest, der von 6-Amino-Kapronsäure abgeleitet ist;
(vi) Austausch von 2–4 Aminosäureresten, ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ durch einen einzelnen nicht-natürlichen Aminosäurerest, der von 8-Amino-Kapronsäure, 10-Aminodekansäure oder 12-Aminolaurinsäure abgeleitet ist;
(vii) Austausch von 3–5 Aminosäureresten, ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ durch eine Sequenz von identischen hydrophoben Aminosäureresten, oder durch einen einzelnen nicht-natürlichen Aminosäurerest, der von 10-Aminodekansäure oder 12-Aminolaurinsäure abgeleitet ist;
(viii) Austausch von Ser₆₈ durch einen natürlichen oder einen nicht-natürlichen Aminosäurerest, ausgewählt aus Thr, Cys, Ala und Homoserin;
(ix) Austausch von Lys₆₉ durch einen natürlichen oder einen nicht-natürlichen, positiv geladenen oder hydrophoben Aminosäurerest;
(x) Austausch von Asp₇₀ durch einen negativ geladenen oder einen polaren Aminosäurerest ausgewählt aus Glu, Asn oder Gln;
(xi) Austausch von Ile₇₁ durch einen natürlichen oder einen nicht-natürlichen hydrophoben Aminosäurerest;
(xii) Verlängerung eines Peptids (i) bis (xi) durch 1–5 ungeladene Aminosäurereste am N-Terminus und/oder am C-Terminus;
(xiii) Austausch jedes Aminosäurerests in einem Peptid (i) bis (xii) durch das entsprechende N-Alkylderivat, durch den entsprechenden D-Aminosäurerest oder durch ein anderes Isoster;
(xiv) einem C-terminalen Amid eines Peptids (i) bis (xiii); und
(xv) ein N-Acylderivat eines Peptids (i) bis (xiv).

Die Erfindung betrifft des Weiteren entzündungshemmende Arzneimittel, umfassend ein von CRP-abgeleitetes Peptid der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung ein Behandlungsverfahren einer entzündlichen Störung, z. B. rheumatischer Arthritis, Lungenemphysem, cystischer Fibrose, Bronchitis, Asthma, akutes Atemnotsyndrom und andere chronische entzündliche gewebszerstörende Zustände, was die Verabreichung einer wirksamen Menge eines CRP-abgeleiteten Peptids gemäß der Erfindung an einen Patienten, der dies benötigt, umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Primärsequenz von menschlichem C-reaktivem Protein (CRP) dar. Die beiden Cystein-Reste (an den Positionen 36 und 97), die die einzelne Disulfidbindung innerhalb von jeder Untereinheit umfassen, sind fett markiert.
2 stellt die Sequenzverbindung der von CRP abgeleiteten 15-mer Peptiden innerhalb der Region der Disulfidschleife der CRP36-97-Sequenz dar, die hierin als Peptide 1–10 bezeichnet sind.
3 stellt eine schematische Repräsentation von untergeordneten Stellen von hLE (und möglicherweise hCG) dar, die S₈-S₂' genannt werden und die mit einem Segment von Peptid 6 (Aminosäurereste Glu₆₂-Ile₇₁) interagieren. Die S₈-S_2'-Notation wird verwendet, um Unterorte auf der Oberfläche des Enzyms mit Hinblick auf die Aminosäuren im Peptid-Inhibitor (jeweils P₈-P_2') und die theoretische Spaltungsstelle auf dem Peptid an der Lys₆₉-Asp₇₀-Bindung (P₁-P₁' genannt) zu bezeichnen. Es wird gezeigt, dass sich die negative Seitenkette von Glu₆₂ von CRP innerhalb der positiv geladenen Tasche von hLE befindet, und die positive Seitenkette von Lys₆₉ sich innerhalb der hydrophoben Haupttasche von hLE befindet, die eine beträchtliche negative Ladung hat.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Reihe von synthetischen Peptiden zur Verfügung, die von den Positionen 62–71 der Sequenz von CRP abgeleitet sind und Arzneimittel, die sie umfassen und die durch Hemmung entweder der hLE- oder der hCG-Aktivität oder beider entzündungshemmend sind. Diese biologisch aktiven Peptide gemäß der Erfindung können verwendet werden, um hLE und/oder hCG zu hemmen und finden dadurch Verwendung bei der Kontrolle von Gewebeschädigungen, die mit chronischer Entzündung einhergehen.
Die hydrophobe Disulfidschleifen-Domäne von CRP enthält hydrophobe Aminosäuresequenzen, die durch das intakte Protein verborgen sind und viele der zuvor beschriebenen biologisch aktiven CRP-abgeleiteten Peptide stammen von dieser Region, die von einer Bindung von CRP an Neutrophile und nachfolgender Proteolyse herrühren. Eine Reihe von überlappenden Peptiden, die von innerhalb der hydrophoben Disulfidschleife von CRP (CRP 36-97) abgeleitet sind, hierin als Peptide 1–10 bezeichnet, wurden gemäß der Erfindung synthetisiert und werden in 2 gezeigt. Jedes aufeinanderfolgende Peptid, mit einer Länge von 15 Aminosäuren, überlappte mit einer Sequenz von 10 Aminosäuren mit jedem seiner benachbarten Peptide. Die hLE und hCG hemmenden Aktivitäten dieser Peptide wurden wie in den nachstehenden Beispielen 4 und 6 und in Tabelle 1 gezeigt, evaluiert.
Gemäß der Erfindung wurde herausgefunden, dass Peptid 6, entsprechend den Stellen 62–71 der CRP-Sequenz eine sowohl gegenüber hLE als auch gegen hCG einzigartige inhibitorische Aktivität besitzt, die bei submikromolaren Konzentrationen des Peptids beobachtet wurden. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass diese inhibitorische Aktivität um zwei Größenordnungen stärker ist als die Peptide, die die Sequenz Val₈₉-Thr-Val-Ala-Pro-Val-His-Ile₉₆, welche zuvor in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/28182 und Yavin et al., 1996 beschrieben wurden, enthält.
Die einzigartige inhibitorische Aktivität von Peptid 6 (CRP_62-76) wurde durch Synthetisieren und Untersuchen der hemmenden Wirkung von Analoga und Varianten davon, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste zugesetzt, entfernt oder durch natürliche oder nicht-natürliche Aminosäurereste ersetzt wurden, weiter untersucht (siehe Tabelle 2, Peptide 11–26).
Eine mögliche Art der Bindung von Peptid 6, bei dem die negative Ladung des Glu₆₂-Rests mit der positiven Tasche von hLE (und möglicherweise von hCG) interagiert (Yavin et al., 1997), wird schematisch in 3 dargestellt. Bei einer solchen angenommenen Bindungskonfiguration passt der Lys69-Rest von CRP mit den hydrophoben Aminosäuren Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ in die Haupt-negative hydrophobe Tasche von hLE, wobei der Abstand zwischen den beiden voneinander entfernt liegenden Taschen überbrückt wird und eine Interaktion mit der hydrophoben Oberfläche des Enzyms hergestellt wird.
Peptid 6 ist bemerkenswert resistent gegen Proteolyse, es bindet und hemmt sowohl hLE als auch hCG, aber es ist für eine proteolytische Inaktivierung durch sie nicht empfänglich. Die Stabilität der Peptidbindungen in Peptid 6 wurden durch Inkubieren des Peptids mit hLE und hCG und durch die Überwachung der Proteolyse durch Umkehrphasen-HPLC-Chromatographieanalyse evaluiert. Überraschenderweise wurden unter Verwendung der Abbaubedingungen, wie durch Yavin et al., 1996 beschrieben, sogar nach 12 Stunden der Inkubation des Peptids bei 37°C keine Spaltungsprodukte beobachtet.
Um die Signifikanz der Aminosäurereste an spezifischen Stellen mit Hinblick auf die hemmende Aktivität von Peptid 6 zu bestimmen, wurden kurze Peptide, die durch Entfernen von Aminosäureresten vom N- und/oder C-Terminus von Peptid 6 erhalten wurden (siehe Tabelle 2, Peptide 11–16) sorgfältig im Hinblick auf ihre hemmende Wirkung untersucht.
Der Rest Glu₆₂ ist der bevorzugte Aminosäurerest an dieser Stelle; ein dramatischer Verlust der hemmenden Aktivitäten von sowohl hLE als auch hCG wird beobachtet, wenn der N-Terminus Glu₆₂ entfernt wird (Peptid 11), was anzeigt, welche entscheidende Rolle dieser negativ geladene Rest spielt. Er kann jedoch durch eine andere negativ geladene Aminosäure wie Asp (Peptid 18) oder durch einen negativ geladenen Rest, der keine Aminosäure ist, wie einen Rest, der von Bernstein-, Glutar- oder Adipinsäuren abgeleitet ist, ersetzt werden. Die negative Ladung des Austausch-Rests sowie das Passen des Austausch-Rests in die positive Tasche des Enzyms sind für die hemmende Aktivität des Peptids wichtig.
Die hydrophoben Aminosäurereste Ile₆₃ und Leu₆₄ sind bei der Einrichtung von hydrophoben Wechselwirkungen, die für eine wirksame Bindung notwendig sind, entscheidend. Die Reste Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ von Peptid 6 können untereinander ausgetauscht oder ersetzt werden durch natürliche oder nicht-natürliche hydrophobe Aminosäurereste ausgewählt aus Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Nva, und Nle. Einer bis fünf dieser Aminosäurereste dieser Sequenz kann können durch eine Sequenz von identischen Aminosäureresten wie zuvor angemerkt substituiert werden, z. B. durch eine Sequenz von 4 oder 5 Ala-Resten oder durch einen nicht-natürlichen Aminosäurerest-Spacer, der von 6-Aminokapronsäure, 8-Aminokapronsäure, 10-Aminodecansäure, oder 12-Aminolaurinsäure abgeleitet ist, mit der Maßgabe dass die Gesamtlänge dieser Sequenz nicht signifikant verändert wird. Es können zum Beispiel 1–3 Aminosäurereste durch einen einzelnen Aminosäurerest substituiert werden, der von 6-Aminokapronsäure abgeleitet ist, 2–4 Aminosäurereste können durch einen einzelnen Aminosäurerest substituiert werden, der von 8-Aminokapronsäure oder von 10-Aminodecansäure abgeleitet ist, und 3–5 Aminosäurereste können durch eine Sequenz von 3–5 Ala-Resten oder durch einen einzelnen Aminosäurerest substituiert werden, der von 10-Aminodecansäure oder 12-Aminolaurinsäure abgeleitet ist. Kleinere Entfernungen (bis zu zwei Aminosäureresten) innerhalb von dieser hydrophoben Sequenz sind auch möglich, wobei noch immer die Bindung beider Ladungen in die jeweils passend geladenen Taschen auf der Oberfläche sowohl der hLE- als auch der hCG-Enzyme gewährleistet werden (3).
Der Rest Ser₆₈ erlaubt im Gegensatz zu Prolin, welches an der S₂-Stelle vieler Inhibitoren, einschließlich dem vorstehend beschriebenen von CRP abgeleiteten Kernpeptid Val₈₉-Thr-Val-Ala-Pro-Val-His-Ile₉₆ (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/28182; Yavin et al., 1996) beobachtet wurde, Flexibilität. Dieser Rest kann durch eine ähnliche kompakte Aminosäure wie Thr, Cys oder Ala oder durch ein nicht-natürliches Isoster wie Homoserin substituiert werden.
Peptid 6 ist gegenüber der Entfernung von Aminosäuren am C-Terminus weniger empfindlich. Die Entfernung der ersten drei endständigen Aminosäuren (Peptid 13) ergibt eine verringerte inhibitorische Aktivität gegenüber beiden Enzymen, jedoch weniger als der Aktivitätsverlust, der bei der Entfernung des einzelnen N-terminalen Aminosäurerests Glu₆₂ beobachtet wurde. Des Weiteren kann Peptid 6 die Entfernung von fünf C-terminalen Aminosäureresten (Peptid 14) tolerieren und noch eine signifikante hemmende Aktivität beibehalten, was anzeigt, dass die Wechselwirkung zwischen diesem Teil des Peptids mit beiden Enzymen im Vergleich mit den geladenen Aminosäuren und dem hydrophoben Abschnitt (Ile₆₃-Trp₆₇) weniger spezifisch ist.
Der Rest Lys₆₉ ist der an dieser Stelle bevorzugte Rest, er kann jedoch durch einen anderen positiv geladenen Aminosäurerest wie Arg, His, Homolysin, Ornithin (Orn) oder Diaminbutyrinsäure (DAB) oder durch eine hydrophobe Aminosäure wie Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Nva oder Nle ersetzt werden. Große Aminosäuren wie Phe, Tyr und His sind bevorzugte Aminosäurereste an dieser Stelle (P₁) bei den hCG-Hemmern (Yavin et al., 1997). Eine Modifikation von Lys₆₉ wie vorstehend beschrieben kann zu einer Spaltung der Peptidbindung durch beide Enyzme führen, so dass es ratsam ist, an dieser Stelle D-Aminosäuren zu verwenden.
Die Asp₇₀- und Ile₇₁-Reste sind wichtig, um eine starke Bindung mit den Oberflächen von sowohl hLE als auch hCG herzustellen. Für die Peptid-hemmende Aktivität gegenüber hLE und hCG ist ein negativ geladener Rest an der Stelle Asp₇₀ notwendig.
Der Rest Asp₇₀ ist der bevorzugte Rest an dieser Stelle, er kann jedoch durch einen negativ geladenen oder durch einen polaren Aminosäurerest wie Glu, Asn, oder Gln ersetzt werden. Eine Modifikation dieses Rests kann zu einer Spaltung der Peptidbindung durch beide Enzyme führen, in welchem Fall es ratsam ist, D-Aminosäuren oder bevorzugt N-Alkyl-Derivate des substituierenden Rests zu verwenden.
Der Rest Ile₇₁ ist der bevorzugte Rest an dieser Stelle, er kann jedoch durch einen großen hydrophoben Aminosäurerest wie Leu, Ile, Phe und Tyr oder durch ein Isoster wie Nva, Nle, Homoleucin, Homoisoleucin und Aminobutyrinsäure (ABU) ersetzt werden.
Die Verlängerung von Peptid 6 durch einen bis fünf nicht-geladene Aminosäurereste am N- und/oder C-Terminus beeinträchtigt seine hemmende Aktivität nicht, jedoch führt eine ausgedehntere Verlängerung, zum Beispiel durch Zusetzen von Aminosäureresten entsprechend der Sequenz von CRP sowohl am N- als auch am C-Terminus, wie in Peptid 17, zu einer Reduktion der hemmenden Aktivität gegenüber sowohl hLE als auch hCG. Dieser Aktvitätsrückgang kann von einer ungünstigen Konformation oder Faltung des 29-Aminosäuren-Peptids herrühren.
Die Reste Gly₇₂, Tyr₇₃, Ser₇₄, Phe₇₅, und Thr₇₆ können durch nicht-geladene Aminosäurereste ersetzt werden und sind bei der Einrichtung einer starken Hemmung weniger von Bedeutung.
Als allgemeine Regel sollten darüber hinaus zusätzlich geladene Aminosäuren an den spezifischen Stellen von Glu₆₂ und Lys₆₉ vermieden werden, damit nicht eine umfangreiche Falschanordnung des Peptidhemmers auf der Oberfläche des Enzyms verursacht wird (siehe 3).
Amide (CO-NH₂) des Carboxylendes der Peptide der Erfindung sind ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen und zeigen gegenüber hLE und hCG ebenso wie N-Acyl-Derivate des N-Endes eine hemmende Aktivität wie jene, die der Formel R-X-CO- entspricht, in der R ein substituiertes oder nicht-substituiertes Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl oder ein Aryl ist und X eine kovalente Bindung, O, NH oder NHCO ist. Beispiele für Acyl-Radikale sind Oktanoyl, Monomethoxysuccinyl, Acetaminokaproyl, Adamantyl-NH-CO- und, stärker bevorzugt, Carbobenzoxy (Benzyl-O-CO-), Naphthyl-NH-CO, und Fmoc (Fluorenylmethyl-O-CO-).
Die Peptide gemäß der Erfindung haben einen hLE-K_i, der geringer ist als etwa 8,0 μM, vorzugsweise 0,1–3,0 μM. Demnach sind bevorzugte CRP-abgeleitete Peptide gemäß der Erfindung die Peptide 6, 13, 18, 20–23 und 25–26.
Die Peptide der Erfindung sind durch Standardverfahren für die Synthese von Peptiden, zum Beispiel wie in den Beispielen, die im Folgenden gezeigt werden, hergestellt.
In einer anderen Hinsicht bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Arzneimittel, die ein Peptid der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die Zusammensetzungen werden durch wohlakzeptierte Verfahren zur Herstellung von Peptid-enthaltenden Arzneimitteln zur Anwendung in einer geeigneten Form, zum Beispiel oral, subkutan, intranasal und parenteral einschließlich intravenös, intramuskulär und intraperitoneal, entsprechend dem entzündlichen Zustand, der behandelt werden soll, hergestellt.
In einer weiteren Hinsicht bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung eines chronisch entzündlichen Zustands, der die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Peptids gemäß der Erfindung an einen Patienten, der dieses benötigt, umfasst. Beispiele für solche chronisch entzündlichen Zustände sind rheumatische Arthritis, Lungenemphysem, cystische Fibrose, Bronchitis, Asthma und akutes Atemnotsyndrom. Das entzündungshemmende Peptid wird in Übereinstimmung mit guter medizinischer Praxis verabreicht und dosiert, wobei der klinische Zustand des Patienten, die Stelle und das Verfahren der Verabreichung, der Zeitplan der Verabreichung und andere Faktoren in Betracht zu ziehen sind, die dem medizinischen Praktiker bekannt sind.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht-limitierenden Beispiele illustriert.
BEISPIELE
Material und Methoden
(i) Allgemeine Festphasen-Peptidsynthese: Peptide wurden durch die herkömmliche Festphasen-Peptidsynthese mit einem automatischen multiplen ABIMED AMS-422 Festphasen-Peptidsynthesegerät (Langenfeld, Deutschland) hergestellt. Das Fmoc-Verfahren (9-Fluorenyl-Methoxycarbonyl) wurde durch Peptidketten-Anordnung, nach den handelsüblichen Protokollen der Firma verwendet. In jedem Reaktionsgefäß wurden 12,5 μMol Wang-Harz verwendet, das die erste, kovalent gebundene Aminosäure, entsprechend dem N-Fmoc C-Terminus enthielt (typische Polymerladungen von 0,3–0,7 mMol/g Harz wurden verwendet). Eine Deprotektion von Fmoc wurde durch Verwendung von Doppelbehandlungen mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (DMF) erzielt, typischerweise 10–15 Min bei Raumtemperatur, abhängig von der Länge des Peptid und des Typs der Fmoc-geschützten Aminosäure, wie durch die Protokolle der Firma vorgegeben. Seitenketten-Schutzgruppen waren Tert.-butyloxycarbonyl (t.-Boc) für Lys, Diaminbutyrinsäure (DAB) und Trp; Trityl (Trt) für Asn, Cys, Gln, His und (D)-His; Tert.-butylester (O-t-But) für Asp und Glu; Tert.-butylether (t-But) für Ser, Thr und Tyr.
Eine Kopplung wurde in der Regel unter Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen mit 50 μMol (4 Äquivalenten) der entsprechenden N-Fmoc-geschützten Aminosäure, 50 μMol(4 Äquivalenten) PyBOP-Reagens (Benzotriazol-1-oxytris-pyrrolidinophosphonium-hexafluoro-phosphat) und 100 μMol (μÄquivalent) 4-Methyl-morpholin (NMM) erreicht, alle typischerweise 20–45 Min bei Raumtemperatur, abhängig von der Länge des Peptid und des Derivat-Typs der Aminosäure in DMF gelöst, wie durch die Protokolle der Firma vorgegeben.
Die Spaltung des Peptids von dem Polymer wurde durch in Reaktion bringen des Harzes mit Trifluoressigsäure/H₂O/Triethylsilan (TFA/H₂O/TES; 90/5/5; Gew./Vol.) über 1,5 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur erzielt. Bei der Spaltung von Peptiden, die Arg und Trp enthielten (Peptid 5) wurde das Spaltungsgemisch aus TFA/H₂O/Ethandiol/Thioanisol/Kresol (80/5/5/5/5-Gew./Vol.) zusammengesetzt. Die entsprechenden Lösungen, die die rohen ungeschützten Peptide enthielten wurden dann auf 4°C abgekühlt, mit eiskaltem Di-tert.-butylether (DTBE) gefällt und 15 Min bei 3000 UpM bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde gewaschen und 3-Mal mit DTBE zentrifugiert, in 30% Acetonitril in H₂O gelöst und lyophilisiert.
Alle geschützten Aminosäuren, Kopplungsreagenz und Polymere wurden von Nova Biochemicals (Laufelfingen, Schweiz) bezogen. Qualitäts-Syntheselösungsmittel wurden von Labscan (Dublin, Irland) bezogen.
(ii) Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC): Synthetische Peptide wurden unter Verwendung einer vorgepackten LiChroCart RP-18-Säule (250 × 10 mm, 7 μm Kügelchengröße) gereinigt, wobei ein binärer Gradient verwendet wurde, der aus 0,1% TFA in H₂O (Lösung A) und 0,1% TFA mit 25% H₂O in Acetonitril (Lösung B) gebildet wurde, die bei t = 0 Min B = 5% t = 5 Min B = 5% t = 60 Min B = 70% (Durchflussrate 5 ml/Min) eluiert wurde. Eine analytische RP-HPLC wurde unter Verwendung einer vorgepackten Lichospher-100 RP-18-Säule (4 × 250 mm, 5 μm Kügelchengröße) unter Verwendung desselben Puffersystems (Durchflussrate 0,8 ml/Min) durchgeführt. Alle Peptidtrennungen wurden unter Verwendung eines Flüssigchromatographiesystems von Spectra-Physics SP8800, das mit einem Absorptionsdetektor mit variabler Wellenlänge von Biosystems 757 ausgerüstet war, durchgeführt. Die Abflüsse der Säulen wurden durch UV-Absorption bei 220 nm überwacht und Chromatogramme wurden auf einem Chrome-Jet-Integrator aufgenommen. Nach der HPLC-Reinigung wurden die lyophilisierten Peptide (im Allgemeinen mit einer Reinheit von > 90% für Rohproben nach der Synthese wie im Folgenden beschrieben) auf > 97% aufgereinigt. Alle Lösungsmittel und HPLC-Säulen wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.
(iii) Zusammensetzungsanalyse der Aminosäuren: Gereinigte Peptidlösungen wurden rotoevaporiert (~ 40 μg Peptid in 40 μl Lösung mit 5 μg Norleucin als interner Standard für nicht-natürliche Aminosäuren), in 6 N HCl bei 110°C 22 Stunden unter Vakuum hydrolysiert und mit einem Aminosäure-Analysegerät von Dionex analysiert. Diese Quantifizierung wurde als Basis für die Bestimmung des gesamten Peptid-Ertrags verwendet. Mehrere der synthetisierten Peptide wurden durch Electrospray-Massen-Spektrometrie analysiert, was ihre erwarteten Molekulargewichte bestätigte.
(iv) Isolierung von hLE und hCG: Die Isolation von neutrophilen Enzymen basierte auf der zweistufigen Aprotinin-Sepharose-Affinitätschromatographie und der Carboxymethyl-Cellulose (CMC)-Ionenaustauschchromatographie (Heck et al., 1985). Neutrophile (1,4 Milliarden) wurden aus Gesamtblut, das von einem einzigen gesunden Laborspender erhalten wurde, durch Dextran-Sedimentation und Ficoll/Hypaque-Gradientenzentrifugationen wie anderswo beschrieben (Metcalf et al., 1986) isoliert. Die Enzymaktivität wurde mit MeOSuc-AAPV-NA für die hLE-Bestimmung und mit Suc-AAPF-NA für die hCG-Bestimmung (beide in 100 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4, der 0,05% des anionischen Tensids Brij-5 enthielt) getestet. Die Aktivitäten der einzelnen Enzym-Fraktionen waren zu 100% frei von Kreuzkontamination. Das schrittweise Elutionsprofil auf der CMC-Säule mit einem langen Elutionsschritt mit 0,45 M NaCl (20 Säulenvolumina) erbrachte die wirksame Trennung zwischen den beiden Enzymen. Die Fraktionen, die hLE und hCG enthielten, wurden jeweils gegen 0,1% Pyridiniumacetat, pH-Wert 5,3 dialysiert, in 20 Aliquots getrennt, lyophilisiert und bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Durch die anfänglichen Reaktionsraten und die bekannten Werte von K_cat (hLE = 54 μM, hCG = 2900 μM) und K_m (hLE = 13,3 sec^–1, hCG = 3,1 sec^–1) wurde die Enzymmenge auf ungefähr 15 μg/Aliquot für hLE und 12 μg/Aliquot für hCG geschätzt, wobei diese Werte durch aktive Titration des Orts mit einem α₁-Protease-Inhibitor und α-Antichymotrypsin bestätigt wurden.
(v) Inhibierungsversuche mit hLE: Peptide wurden in 100 mM Hepes-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,1% Brij-35 mit 10% DMSO gelöst, um Lösungen mit 300 μM zu erhalten, die verwendet wurden, um weitere Verdünnungen mit demselben Puffer fortzuführen, und Aliquots mit 80 μl wurden in Doppelproben Platten mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Das Substrat, 600 μM MeOSuc-AAPV-NA, in demselben Puffer mit 5% DMSO, wurde jeder Vertiefung zusätzlich zu den leeren Vertiefungen zugesetzt, und die Platte wurde in das Plattenlesegerät platziert, der auf 37 C (Dynateck MR-6000) äquilibriert war. Lyophilisierte Aliquots von hLE wurden in 1600 μl von 100 mM Hepes-Puffer ohne DMSO gelöst, und 80 μl der Enzymlösung wurde den Peptiden und dem Substrat zugesetzt, um die Reaktion zu starten. Das Kinetik-Programm las die Platte alle 2 Min 20 Min lang (mit einer Schüttelzeit von 3 Sek zwischen den Leseabschnitten) bei 405 nm und stellte die Ergebnisse sowie den Durchschnitt jeder Doppelprobe graphisch dar. Das Endvolumen betrug 240 μl und enthielt: 5% DMSO, 1–100 μM Peptid, 200 μM Substrat und 0,75 μg (~25 Pikomol) Enzym.
(vi) Inhibitionsversuche mit hCG: Ähnliche Bedingungen wie in den hLE-Inhibitionsversuchen wurden verwendet mit Ausnahme des Substrats: 80 μl von 1,80 mM Suc-AAPF-NA. Das Enzym wurde in 800 μl Puffer gelöst und die Reaktion wurde alle 6 Min 1 Stunde lang überwacht. Das Endvolumen betrug 240 μl und enthielt: 5% DMSO, 1–100 μM Peptid, 600 μM Substrat und 1,2 μg (etwa 40 Pikomol) Enzym.
(vii) Abbauprofile von Peptiden durch RP-HPLC: Verschiedene aktive Peptidhemmer wurden in calcium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 125 μg/259 μl gelöst, mit 0,25 Aliquots von hLE oder hCG in 250 μl PBS vermischt und bei 37°C inkubiert. Periodisch (bis zu 12 Stunden) wurden Proben von 100 μl aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Die Proben wurden mit 150 μl 0,1% TFA verdünnt, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und vor der HPLC-Analyse bei –20°C gelagert.
(viii) Berechnungen: Für hLE wird V dadurch bestimmt, dass es eine lineare Gleichung zu den ersten 6 Zeit-Punkten (10 Min) der Kinetikdaten unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate erfüllt. Ohne Ausnahme waren alle R²-Faktoren > 0,998. Verschiedene Inhibitor-Konzentrationen in den Doppelproben und zwei Kontrollvertiefungen wurden verwendet um eine lineare Gleichung zu den Graphen von Vol/V_i-1 gegen [I] für jeden Inhibitor unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate (8 Datenpunkte für jeden Inhibitor) zu erfüllen. Von der Berechnung des Fehlers im Verlauf der Gleichung wurde der relative Fehler für K_i abgeleitet: Ki = {Verlauf*(1 + [S]/Km)}–1 da Ki = [I]*{1 + [S]/Km)*(Vo/Vi–1)}–1.
Für hCG wird V dadurch bestimmt, dass es eine quadratische Gleichung zu den gesamten Kinetikdaten (60 Min) unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate und Berechnung von V zu t = 0 erfüllt. Ohne Ausnahme waren alle R²-Faktoren > 0,996. Zwei Inhibitorkonzentrationen in Doppelproben und zwei Kontrollvertiefungen wurden für jeden Inhibitor verwendet und K_i wurde auf eine ähnliche Weise wie bei hLE abgeleitet (6 Datenpunkte für jeden Inhibitor).
Beispiel 1: Synthese der Peptide 1–26
Bei der Synthese von Peptid 6, Glu₆₂-Ile-Leu-Ile-Phe-Trp-Ser-Lys-Asp-Ile-Gly-Tyr-Ser-Phe-Thr₇₆ wurde das Standard-Fmoc-Protokoll wie folgt verwendet: Peptid-Verlängerungszyklus

Schritt 1. Waschen mit DMF ×6

Schritt 2. Deprotektion: 20% Piperidin in DMF ×2

Schritt 3. Waschen mit DMF ×6

Schritt 4. Koppeln des Derivats ×2

Am Ende der Synthese

Schritt 1. Waschen mit DMF ×6

Schritt 2. Deprotektion: 20% Piperidin in DMF ×2

Schritt 3. Waschen mit DMF ×6

Schritt 4. Waschen mit CH₂Cl₂ ×6
Die Zeiten für Deprotektion, Kopplung und Waschen wurden durch das ABIMED-Computerprogramm berechnet. Das entstehende lysophilisierte Rohpeptid wurde durch präparative HPLC gereinigt, um etwa 15 mg lyophilisertes Peptid (weißes Pulver) zu erhalten, mit einer Reinheit von über 98%, wie durch seine analytische RP-HPLC bestimmt. Die Aminosäureanalyse bestätigte die erwartete Sequenz, Reinheit und den Ertrag des gereinigten Peptids (siehe Tabelle 3).
Die zusätzlichen Peptide 5, 11, 13, 14, 17, 18, 20–23, 25–26 der Erfindung und Vergleichspeptide 1–5, 7, 10, 12, 15, 16, 19 und 24 wurden auf eine ähnliche Weise unter Verwendung der geeigneten Aminosäurereste synthetisiert.
Die Sequenz der Peptide 1–26 und ihre Inhibitionskonstanten (K_i) von menschlichem hLE und menschlichem hCG sind in den Tabelle 1 und 2 gezeigt. Die Aminosäureanalyse derselben Peptide sind in Tabelle 3 gezeigt.
Beispiel 2: Synthese von C-terminalen Amiden der Peptide
Am C-Terminus amidierte Peptide (Peptid-NH₂) werden gemäß zuvor beschriebenen Verfahren (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/28182; Yavin et al., 1996) hergestellt. Das Standard-Harz wird durch einen festen Träger aus Rink-Amid [4-2'(4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxy-Harz], der die erste Aminosäure nicht enthält, ersetzt. Die Peptidsynthese wird auf eine identische Weise wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben fortgesetzt und durch die Spaltung von dem Polymer wird die am Carboxylende amidierte Form des Peptids erhalten.
Tabelle 1: Aminosäuresequenz von CRP-abgeleiteten Peptiden 1–10 und ihre Inhibitionskonstanten (Ki) von hLE und hCG
Jedes der Peptide 1–10 entspricht einem 15-Mer innerhalb der Sequenz von CRP36-96. Die tiefgestellten Nummern bezeichnen die Position jedes Peptids innerhalb der primären CRP-Sequenz.
w. i.; schwache Inhibition (> 200 μM). n. s. i.; keine signifikante Inhibition
Die Fehlerbereiche wurden für jeden Inhibitor, wie in Material und Methoden Abschnitt viii beschrieben, berechnet.
Tabelle 2: Aminosäuresequenz von CRP-abgeleiteten Peptiden und Analoga 6, 11–30 und ihre Inhibitionskonstanten (Ki) von hLE und hCG
Tabelle 2: (Forts.)
Die Peptide 11–26 sind Analoga und Varianten von Peptid 6 (CRP62-76). Die tiefgestellten Nummern bezeichnen die Position des Peptids innerhalb der primären CRP-Sequenz. Substituierte Aminosäuren sind unterstrichen.
w. i.; schwache Inhibition (> 200 μM). n. s. i.; keine signifikante Inhibition; - -; unbestimmt. Die Fehlerbereiche wurden für jeden Inhibitor, wie in Material und Methoden Abschnitt viii beschrieben, berechnet.
Beispiel 3: Synthese von N-Acyl-Peptiden
Am N-Terminus acylierte Peptide (R-CO-Peptide) werden gemäß zuvor beschriebenen Verfahren (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/28182; Yavin et al., 1996) hergestellt: Verschiedene organische Verbindungen, die ein freies Carbonsäuregemisch enthalten, werden für die Kopplung der Peptide an den exponierten N-Terminus als Endschritt der Festphasenpeptidsynthese vor der Peptid-Polymer-Spaltung und der Deprotektion verwendet. Beispiele für solche organischen Verbindungen sind: Mono-methyl-bernsteinsäure, CH₃OCO(CH₂)₂COOH, CH₃(CH₂)₆COOH und N-acetyl-amino-kapronsäure. PyBOP- und NMM-Kopplung wird verwendet wie im Abschnitt Material und Methoden (i) beschrieben, gefolgt von extensivem Spülen mit N-methyl-pyrrolidon (NMP) und CH₂Cl₂.
Beispiel 4: Synthese von N-terminalen Fmoc-Peptiden
Die Synthese von Fmoc-Peptiden wird wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die Endstufe der Fmoc-Deprotektion ausgelassen wird. Der Fmoc-Rest ist unter Bedingungen der Peptid-Polymer-Spaltung und der Seitenketten-Deprotektion stabil, wodurch N-terminale Fmoc-Peptide als Endprodukte der Synthese erzielt werden.
Beispiel 5: In-Vitro-Hemmung von hLE durch die Peptide der Erfindung
Die Fähigkeit von CRP-abgeleiteten Peptiden zur hLE-Hemmung wurde durch Inhibition der enzymatischen Spaltung von MeOSuc-AAPV-NA wie in Material und Methoden (Abschnitt v) beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, ist das CRP-abgeleitete Peptid 6 bei der Hemmung von hLE extrem stark. Eine Gesamthemmung wurde bei Konzentrationen überhalb von 50 μM beobachtet, und nur durch Verdünnen des Peptids in den Bereich von 1–10 μM wurde die Bestimmung eines K_i-Werts für Peptid 6 ermöglicht.
Im Gegensatz dazu zeigten von den anderen 9 Peptiden der Reihe 1–10, die von überlappenden Sequenzen innerhalb von CRP36-97 abgeleitet waren, nur die Peptide 5 und 10 eine hLE-inhibitorische Aktivität im Bereich von 50–100 μM, was noch zwei Größenordnungen weniger stark ist als Peptid 6, wohingegen die Peptide 1–4 und 7–9 inaktiv waren.
Die in Tabelle 2 gezeigten Peptide 11–16 stellen kurze Peptide dar, bei welchen 1–7 Aminosäurereste vom N- und/oder C-Terminus von Peptid 6 entfernt waren. Die dramatischste Wirkung auf Grund des Entfernens einer einzelnen Aminosäure wurde beobachtet, als der Glu₆₂-Rest entfernt wurde (Peptid 11), was in einer etwa 20-fachen Abnahme der hLE-Hemmung resultierte. Ein weiteres Entfernen der zwei aufeinanderfolgenden Aminosäurereste Ile₆₃ und Leu₆₄ hob die hemmende Aktivität vollständig auf (Peptid 12).
Die Entfernung von Aminosäureresten am C-Terminus von Peptid 6 war bei der Beeinträchtigung der hemmenden Aktivität des Peptids weniger wirksam. Das Entfernen der ersten drei Aminosäuren am C-Terminus von Peptid 6 (Peptid 13) ergab eine verringerte hLE-hemmende Aktivität, jedoch weniger als der Aktivitätsverlust, der bei der Entfernung des N-terminalen Rests Glu62 beobachtet wurde. Des Weiteren behält Peptid 14, dem die fünf C-terminalen Aminosäurereste von Peptid 6 fehlen, noch immer eine signifikante hemmende Aktivität.
Peptid 15, dem des Weiteren die Asp₇₀ und Ile₇₁-Reste fehlen, zeigte einen totalen Verlust der inhibitorischen Aktivität. Wie erwartet war auch Peptid 16, dem sowohl der C-Terminus als auch die entscheidenden N-terminalen Aminosäurereste fehlten, total inaktiv.
Peptid 17, das ein 29-meres Peptid ist (CRP55-83), und das die Aminosäuresequenz von Peptid 6 und zusätzliche Aminosäurereste entsprechend der CRP-Sequenz an seinem N- und C-Terminus enthält, hat eine reduzierte inhibitorische Aktivität, die sich aus einer ungünstigen Konformation oder Faltung seines längeren Peptids ergeben könnte. In Hinblick darauf bestätigt ein Vergleich zwischen Peptid 5 und Peptid 14, dass die zusätzliche Sequenz der Aminosäuren Lys₅₇-Arg-Gln-Asp-Asn₆₁, die dem N-Terminus von Peptid 14 zugesetzt wurden, die inhibitorische Fähigkeit drastisch um mehr als eine Größenordnung verringerte.
Um die Signifikanz eines spezifischen Aminosäurerests an einer bestimmten Position im Hinblick auf die inhibitorische Aktivität von Peptid 6 zu bewerten, wurden die Substitutions-Analogum-Peptide 18–26 untersucht. Peptid 18, in welchem Glu₆₂ durch die kleinere negativ geladene Aminosäure Asp ersetzt war, zeigt eine 10-Mal geringere inhibitorische Aktivität im Vergleich zu Peptid 6, was die Beobachtung unterstützt, dass die sterische Anordnung des negativ geladenen Rests an dieser Position von großer Wichtigkeit ist.
Peptid 19, in dem Ser₆₈ durch Pro ersetzt wurde, zeigte einen dramatischen Verlust von zwei Größenordnungen an inhibitorischer Aktivität (siehe Tabelle 2). Dieser Verlust könnte der Biegung, die durch den Aminosäurerest Pro in der Mitte des Peptids eingeführt wurde und die eine gute Anpassung zwischen dem benachbarten Lys₆₉ und der S₁-Tasche verhindert (3), zuzuschreiben sein.
Die Peptide 20 und 21, in welchen Lys₆₉ entweder durch Ornithin oder durch DAB substituiert war, behielten denselben Wert an inhibitorischer Aktivität wie Peptid 6 bei. Sowohl Ornithin als auch DAB sind kleine positiv geladene Reste, die in die ersetzte Lys₆₉-Position passen, ohne dass sie die Peptidstruktur und die Interaktion mit dem inhibierten Enzym beeinflussten.
Die Substitution von Asp₇₀ durch einen anderen negativ geladenen Aminosäurerest Glu (Peptid 23) ergab einen geringen Rückgang der inhibitorischen Aktivität, wohingegen eine Substitution durch Ala (Peptid 22), einem ungeladenen Aminosäurerest, an derselben Position die Wichtigkeit einer negativen Ladung an dieser Position unterstreicht.
Die umgekehrte Sequenz von Peptid 6 (Peptid 24) ist 30-Mal weniger aktiv gegenüber einer hLE-Hemmung, was die Wichtigkeit der genauen Bindungskonformation wie in 3 unterstreicht.
Bei den Peptiden 25 und 26 wurde der Lys₆₉-Rest durch kleine hydrophobe Aminosäuren (Ala beziehungsweise Val) ersetzt, um Inhibitoren zu erhalten, die etwas stärker sind als Peptid 14.
Beispiel 6: In-Vitro-Hemmung von hCG durch die Peptide der Erfindung
Die Fähigkeit von CRP-abgeleiteten Peptiden zur hCG-Hemmung wurde durch Hemmen der enzymatischen Spaltung von Suc-AAPF-NA, wie in Material und Methoden (Abschnitt vi) beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Es wurde gezeigt, dass das CRP-abgeleitete Peptid 6 bei der Hemmung von hCG extrem stark ist. Eine Gesamthemmung wurde bei Konzentrationen überhalb von 50 μM beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten von den anderen 9 Peptiden der Reihe 1–10, die von überlappenden Sequenzen innerhalb von CRP36-97 (2) abgeleitet waren, nur die Peptide 5 und 10 eine hCG-inhibitorische Aktivität im Bereich von 150–200 μM, was 600–800-Mal weniger stark ist als Peptid 6 wohingegen die Peptide 1–4 und 7–9 inaktiv waren.
Gemäß der Erfindung wurde gezeigt, dass Modifikationen des Kernpeptids 6, die bei den Peptiden 11–23 untersucht wurden, zu ähnlichen Wirkungen auf die hCG- sowie auf die hLE-hemmende Aktivität führten. Dieselben Schlussfolgerungen, die hinsichtlich der Signifikanz jedes Aminosäurerests an seiner jeweiligen Position mit Hinblick auf die hemmende Aktivität gegenüber hLE gezogen wurden, sprechen für die hemmende Aktivität gegenüber hCG.
Beispiel 7: Untersuchung der Resistenz von Peptid 6 gegen Proteolyse
Peptid 6 zeigt eine bemerkenswerte Resistenz gegenüber Proteolyse; es bindet und hemmt sowohl hLE als auch hCG, ist jedoch für eine proteolytische Inaktivierung durch sie nicht empfänglich. Die Stabilität der Peptidbindungen in Peptid 6 wurden durch Inkubieren des Peptids mit hLE und hCG und durch Überwachen des Abbauprofils des Peptid durch Umkehrphasen-HPLC untersucht. Kurz, Peptid 6 wurde in calcium- und magnesiumfreier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 50 μg/250 μl, gemischt mit 3 μg hLE oder hCG in 250 μl PBS gelöst und bei 37°C inkubiert. Periodisch, nach 1, 3, 8 und 12 Stunden Inkubation wurden Proben von 100 μl aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Die Proben wurden mit 150 μl 0,1% TFA verdünnt, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –20°C vor der HPLC-Analyse gelagert. Überraschenderweise wurden sogar nach 12 Stunden der Inkubation von Peptid 6 bei 37°C keine Spaltungsprodukte beobachtet.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, das zur in-vitro-Hemmung der Enzymaktivität von menschlicher Leukocyten-Elastase (hLE) und/oder von menschlichem Cathepsin G (hCG) fähig ist, wobei das Peptid ausgewählt wird aus: (i) einem Kernpeptid, entsprechend den Positionen 62–71 der Sequenz des menschlichen C-reaktiven Proteins (CRP) mit der Formel: Glu₆₂-Ile-Leu-Ile-Phe-Trp-Ser-Lys-Asp-Ile₇₁ oder Peptiden, resultierend aus der Modifikation davon, gekennzeichnet durch: (ii) Austausch von Glu₆₂ durch Asp oder durch einen negativ geladenen Rest, der keine Aminosäure ist, abgeleitet von Bernstein-, Glutar- oder Adipinsäure; (iii) Austausch von jedem der Reste Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ oder Trp₆₇ durch einen natürlichen oder nicht-natürlichen hydrophoben Aminosäurerest; (iv) Deletion von 1 oder 2 Aminosäureresten ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇; (v) Austausch von 1 bis 3 Aminosäureresten ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ durch einen einzelnen nicht-natürlichen Aminosäurerest, der von 6-Aminocapronsäure abgeleitet ist; (vi) Austausch von 2 bis 4 Aminosäureresten ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇ durch einen einzelnen nicht-natürlichen Aminosäurerest, der von 8-Aminocapronsäure oder 10-Aminodecansäure abgeleitet ist; (vii) Austausch von 3–5 Aminosäureresten ausgewählt aus Ile₆₃, Leu₆₄, Ile₆₅, Phe₆₆ und Trp₆₇, durch eine Abfolge von identischen hydrophoben Aminosäureresten oder durch einen einzelnen nicht-natürlichen Aminosäurerest, der von 10-Aminodecansäure oder 12-Aminolaurinsäure abgeleitet ist; (viii) Austausch von Ser₆₈ durch einen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäurerest ausgewählt aus Thr, Cys, Ala und Homoserin; (ix) Austausch von Lys₆₉ durch einen natürlichen oder nicht-natürlichen, positiv geladenen oder hydrophoben Aminosäurerest; (x) Austausch von Asp₇₀ durch einen negativ geladenen oder einen polaren Aminosäurerest ausgewählt aus Glu, Asn oder Gln; (xi) Austausch von Ile₇₁ durch einen natürlichen oder einen nicht-natürlichen hydrophoben Aminosäurerest; (xii) Verlängerung eines Peptids (i) bis (xi) durch 1–5 nicht geladene Aminosäurereste am N-Terminus und/oder am C-Terminus; (xiii) Austausch eines beliebigen Aminosäurerests in einem Peptid (i) bis (xii) durch das entsprechende N-Alkyl Derivat, einen D-Aminosäurerest oder durch ein anderes Isoster, wobei das Peptid mit dem Austauschen die Fähigkeit behält, hLE und/oder hCG zu hemmen; (xiv) einem C-terminalen Amid eines Peptids (i) bis (xiii); und (xv) einem N-Acyl-Derivat eines Peptids (i) bis (xiv).
Peptid nach Anspruch 1 (iii) oder (xi), wobei der hydrophobe Aminosäurerest ausgewählt wird aus Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Nva, Nle, Homoleucin, Homoisoleucin, und Aminobuttersäure.
Peptid nach Anspruch 1 (ix), wobei der positiv geladene Aminosäurerest ausgewählt wird aus Arg, His, Homolysin, Ornithin (Orn) und Diaminobuttersäure (DAB).
Peptid nach Anspruch 1 (vii) oder 1 (ix), wobei der hydrophobe Aminosäurerest ausgewählt wird aus Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Nva und Nle.
N-Acyl-Peptid nach Anspruch 1 (xv), wobei Acyl ein Rest R-X-CO- ist, worin R ein substituierter oder unsubstituierter Kohlenwasserstoff ist und X eine kovalente Bindung, O, NH oder NHCO ist.
N-Acyl-Peptid nach Anspruch 5, wobei der Acyl-Rest ausgewählt wird aus einer Octanoyl-, Monomethoxysuccinyl-, Carbobenzoxy(Benzyl-O-CO-)-, Acetylaminocaproyl-, Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl)-, Naphtyl-NH-CO- und Adamantyl-NH-CO-Gruppe.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ausgewählt aus den Sequenzen:
Arzneimittel, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüchen 1 bis 7 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von chronischen entzündlichen Zuständen.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der chronische entzündliche Zustand rheumatoide Arthritis, Lungenemphysem, cystische Fibrose, Bronchitis, Asthma, akutes Atemnotsyndrom und andere chronische entzündliche gewebezersetzende Zustände ist.