WO2002066500A2 - ANTAGONISTEN FÜR Α4β7-INTEGRIN - Google Patents

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WO2002066500A2
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Horst Kessler
Bernhard Holzmann
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Wilex Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to new, effective and selective -7 ⁇ -? 7 Integrin antagonists that inhibit cell adhesion to the mucosal addressin cell adhesion molecule I-1 (MAdCAM-1).
  • the new integrin antagonists can be used as therapeutic agents for the prevention and treatment of diseases associated with a disruption caused by ⁇ r ⁇ -? 7 integrin-mediated cell adhesion to AdCAM-1 are associated.
  • Integrins are heterodimeric transmembrane glycoproteins consisting of an a and a ⁇ subunit. They are involved in cell-cell and cell-matrix interactions (Hynes, Cell 69 (1 992), 1 1 -25). At present, 15 different a and ⁇ subunits are known, from which, according to current knowledge, at least 23 different integrin receptors can be formed (Eble, integrin-ligand interaction, Springer-Verlag Heidelberg (1 997) 1-40). The family of integrins shows significant differences in their biological functions and ligand specificities.
  • the group of ⁇ r 4 integrins is formed from ⁇ ⁇ integrin and ⁇ ⁇ integrin. Both receptors are expressed on most types of leukocytes and mediate both cell-cell and cell-matrix interactions as leukocyte receptors.
  • the most important endogenous ligands for 7 4 - integrins are the vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and fibronectin (Fn) (Hemler, Annu. Rev. Immunol. 8 (1 990), 365-400; Postigo et al., J Immunol.
  • MAdCAM-1 which binds only to ⁇ ⁇ integrins under physiological conditions (Berlin et al., Cell 74 (1 993), 1 85 - 1 95; Kilger and Holzmann, J. Mol. Med. 73 (1,995), 347-354).
  • MAdCAM-1 belongs to the immunoglobulin superfamily (IgSF) and has three immunoglobulin (Ig) domains. A carbohydrate-rich mucin-like domain is inserted between the second and third Ig domains. The binding of MAdCAM-1 is mainly mediated by the first N-terminal Ig domain, but sequences from the second Ig domain are also involved.
  • MAdCAM-1 is the most important counterreceptor for ⁇ ⁇ integrins on mucosal endothelial cells (Strauch et al., Int. Immunol. 6 (1 994), 236 -
  • Lymphoma cells on endothelial venules from Peyer's spots are mediated by a-integrins (Holzmann et al., Cell 56 (1 989), 37-46;
  • Antibodies block the recruitment of lymphocytes in the inflamed intestinal tissue and significantly the course of inflammatory
  • Peptide integrin inhibitors are known.
  • US-A-6,037,324 discloses dipeptides as inhibitors of integrin-MAdCAM-1 interactions.
  • WO97 / 25351 discloses peptide residues with on the N- and C-
  • Terminus bound groups as mimotopes of the conserved MAdCAM-1 amino acid motif LDTSL.
  • WO98 / 06248 describes humanized immunoglobulins with high specificity for integrins which have an antigen-binding region of non-human origin and at least part of an immunoglobulin of human origin.
  • US-A-5.51 0.332 discloses peptides with a length of 4-13 amino acids comprising the LDV domain of the CS1 peptide, which inhibit the binding of ⁇ ⁇ integrins to VCAM-1 or fibronectin.
  • US-A-6,087,330 discloses cyclic peptides with 5-13 amino acids derived from the CS1 peptide which selectively inhibit the binding of ⁇ integrins to VCAM-1, fibronectin or invasin. Inhibitors of the binding of or ⁇ -integrin to its receptors, for example VCAM-1, are also disclosed in US-A-6,096,773. A method for identifying ⁇ ⁇ antagonists is described in WO00 / 30681.
  • the object underlying the present invention was to provide new antagonists of ⁇ ⁇ -V integrins, which in particular have a high selectivity for MAdCAM-1. This task is solved by providing new cyclic peptides.
  • the present invention thus relates to cyclic peptide compounds having a structure of the formulas (la) or (Ib): c (X, - D - X 2 - X 3 - X 4 - X 5 ) (la) c (X, - D - X 3 - X 3 - X 4 - X 5 ) (Ib) wherein XT is an amino acid residue with a leucine or isoleucine side chain, which - if it has an optically active center - is in the L configuration, D is an amino acid residue with an asparagine side chain which - if it has an optically active center - is in the L configuration, X 2 is an amino acid residue with an aliphatic and optionally hydroxylated side chain which - if it has an optically active center - is in the L configuration is present, X 3 is an amino acid residue with an aliphatic and optionally hydroxylated or acidic or with an aromatic side chain, which
  • X 4 is an amino acid residue with any side chain which - if it has an optically active center - is in the D configuration and
  • X 5 is an amino acid residue with any side chain, which - if it has an optically active center - is in the L configuration.
  • cyclic peptide compounds according to the invention have a surprisingly high and selective inhibitory effect on the interaction of ⁇ -integrin with its receptor, in particular MAdCAM-1.
  • the monomeric building blocks of the peptide compounds according to the invention are amino acids, preferably ⁇ -aminocarboxylic acids.
  • amino acids for example ⁇ -aminocarboxylic acids, aza-amino acids (derivatives of n-aminocarboxylic acids in which the ⁇ -CH group is replaced by an N atom, can also be acidified ) or / and peptoid amino acids (derivatives of ⁇ r-aminocarboxylic acids, in which the amino acid side group is not bound to the ⁇ -C atom but to the amino group).
  • the amino acid building blocks XD, X 2 , X 3 and X 5 are - if they have an optically active center - preferably in the L configuration.
  • the module X 4 is - if it has an optically active center - preferably in the D configuration.
  • those having a structure of the formula (Ia) are particularly preferred.
  • the preferred meanings of the monomeric building blocks in the peptide compounds are as follows:
  • X. is an amino acid residue with a leucine or isoleucine side chain, preferably with a leucine side chain.
  • XT is particularly preferably ⁇ -aminocarboxylic acid L-leucine.
  • D is an amino acid residue with an asparagine side chain, particularly preferably the ⁇ -aminocarboxylic acid L-aspartic acid.
  • X 2 is an amino acid residue with an aliphatic and optionally hydroxylated side chain, which preferably has 1 -3 C atoms, in particular 2 C atoms, preferably with a threonine or valine side chain.
  • Aminocarboxylic acids L-threonine and L-valine selected.
  • X 3 is an amino acid residue with an aliphatic and optionally hydroxylated or acidic, for example having 1-4 C atoms, or with an aromatic side chain, preferably with an alanine, aspartic acid, phenylalanine or phenylglycine
  • X 3 is particularly preferably an a-
  • Aminocarboxylic acid selected from L-alanine, L-aspartic acid, L-
  • X 4 is an amino acid residue with an arbitrary side chain, which advantageously has an optically active center which is in D-
  • X 4 can be a ⁇ -
  • Aminocarboxylic acid residues can be selected from D-proline, D-phenylalanine and any other D- ⁇ -aminocarboxylic acid residues.
  • X 5 can be any amino acid residue per se, amino acid residues with an aromatic side chain, such as a phenylalanine,
  • Tyrosine histide in, benzoylphenylalanine (Bpa) - or
  • Tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid (Tic) side chain are preferred.
  • X 5 can also have other meanings such as methionine or arginine.
  • X 5 is particularly preferably a ⁇ -aminocarboxylic acid selected from L-phenylalanine, L-tyrosine, L-
  • peptide compounds according to the invention are given below: c (LDT / V / F / Phg-A / DpA) c (LDT / V / F / Phg-A / DpF) c (LDT / V / F / Phg -A / DpH) c (LDT / V / F / Phg-A / DpY) c (LDT / V / F / Phg-A / DpM) c (LDT / V / F / Phg-A / Dp-Bpa) c (LDT / V / F / Phg-A / Dp-Tic)
  • Suitable derivatives are, in particular, those compounds which are modified on reactive groups in the side chain, for example on hydroxyl, amino or carboxylic acid groups. Examples of such a modification are an acylation, for example an acetylation of amino groups and / or an amidation or esterification of carboxylic acid groups.
  • R 1 can denote hydrogen.
  • R 1 can also mean an alkyl radical, for example a C to C 3 alkyl radical such as methyl or ethyl, in particular methyl, since N-alkylation of the amide bond can often have a strong influence on the activity (see, for example, Levian-Teitelbaum et al., Biopolymers 28 (1,989), 51-64).
  • R 1 in peptoid amino acid derivatives can also contain the actual amino acid side chain.
  • the peptidic compounds of the invention are cyclic compounds, wherein in structure (la), the blocks X and X ⁇ 5, and - in structure (Ib) - the blocks X and X 4 are bridged to each other. This bridging is preferably carried out via the N- and C-terminus of the peptide.
  • the cyclization in the compounds (Ia) is particularly preferably carried out via a peptide bond between the amino group of X ⁇ and the carboxy group of X 5 and in the case of the compounds (Ib) via a peptide bond between the amino group of X- and the carboxy group of X 4 .
  • the peptide compounds according to the invention can be obtained by chemical synthesis, as explained in the examples.
  • the compounds can be present in isolated form or, if appropriate, coupled to macromolecular carrier substances, for example dextran or polypeptides.
  • the coupling to carrier substances can take place via spacers and / or amino acid side chains, for example via X 4 .
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition which contains at least one peptide compound as defined above, optionally together with pharmaceutically customary excipients, auxiliaries or diluents.
  • the peptide compounds according to the invention are used for the production of a 3 r integrin inhibitors, which are also suitable for the diagnosis, prevention and / or control of associated diseases, for example inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis, but also autoimmune diseases, in particular asthma, type I diabetes and rheumatoid arthritis, and food allergies. (Kilger, G., Holzmann, J., J. Mol. Med. 1 995, 73, 347 ff.). Further areas of application are radiation and radiation therapy-related gastrointestinal tract damage.
  • tumors with aJ3 7 integrin involvement such as non-Hodgkin's lymphoma, lymphoblastic T-cell lymphoma and MALT lymphomas are particularly preferred Areas of application of the compounds according to the invention.
  • the compounds according to the invention are particularly preferably used for the selective inhibition of the interaction of ⁇ ⁇ -integrin with MAdCAM-1, with particular preference being given to using compounds for this purpose which are at least about the interaction between a ⁇ -integrin and MAdCAM-1 Factor 2 have higher inhibitory effects than with regard to the interaction between aJ3 7 - integrin and VCAM-1.
  • Yet another object of the invention is a method for inhibiting ⁇ ⁇ -integrin, wherein an effective dose of a peptide compound according to the invention is introduced into a biological system containing ⁇ ⁇ -integrin, for example a cell or an organism.
  • the method according to the invention also includes the administration of the active ingredient to a subject in need, in particular a human patient.
  • compositions according to the invention can be in any form, for example as tablets, as coated tablets or in the form of solutions or suspensions in aqueous or non-aqueous solvents.
  • the peptide compounds are preferably administered orally or parenterally in a liquid or solid form.
  • water is preferably used as the carrier medium, which optionally contains stabilizers, solubilizers and / or buffers which are usually used for injection solutions.
  • stabilizers are, for example, tartrate or borate buffer, ethanol, dimethyl sulfoxide, complexing agents such as EDTA, polymers such as liquid polyethylene glycol, etc.
  • solid carriers such as starch, lactose, mannitol, methyl cellulose, talc, finely divided Silicon oxide, high molecular fatty acids such as stearic acid, gelatin, agar, calcium phosphate, magnesium stearate, animal or vegetable fats or solid high molecular polymers such as polyethylene glycols can be used.
  • the formulations for oral administration may also contain flavorings and sweeteners.
  • the peptide compounds according to the invention can also be present in complexes, e.g. with cyclodextrins such as ⁇ , ß or y - cyclodextrin.
  • the dose administered depends on the age, state of health and weight of the patient, the type and severity of the disease, the type of treatment, the frequency of administration and the type of effect desired.
  • the daily dose of the active compound is usually 0.01 to 50 mg / kg body weight. Usually, 0.1, 40 and preferably 0.5 to 20 mg / kg / day in one or more doses are sufficient to achieve the desired effects.
  • Linear peptides were prepared using Merrifield solid phase peptide synthesis on a trityl chloride (Trt) resin (Rapp-Polymer, Tübingen, Germany) using Fmoc amino acid derivatives (Fields and Noble, Int. J. Pept. Prod. Res. 35 (1 990), 1 61 - 21 4).
  • Trt trityl chloride
  • the Fmoc-protected amino acids were treated with O- (1 -H-benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (Richelieu, Biotechnologies, Montreal, Canada), 1-hydroxybenzotriazole (Novabiochem, Läufelfingen, Switzerland) and diisopropylethylamine as base in N-methylpyrrolidone as solvent.
  • the fully protected linear amino acids were cleaved from the resin using a mixture of dichloromethane, trifluoroethanol and acetic acid (8: 1: 1).
  • the cyclization of the linear sequences was carried out at high dilution in dimethylformamide (approximately 1.25 ⁇ 10 -3 M) by means of in situ activation using diphenylphosphoric acidate using sodium bicarbonate as the solid base (Brady et al., Peptides'83: Structures and Function, 8th Ann. Pept. Symp .; Pierce Chemical Company, Illinois, USA (1983), 127-130).
  • the protecting groups were split off by treatment with 90% trifluoroacetic acid, 6% triisopropylsilane and 4% water. After purification by reverse phase HPLC, peptides with a purity> 98% were obtained.
  • the peptides were characterized by ESI mass spectroscopy and 1 D, 2D 1 H, 13 C-NMR spectroscopy (Kessler and Seip: NMR of peptides. In: Two-Dimensional NMR Spectroscopy: Applications for Chemists and Biochemists; Croasmun, Carlson, ed. VCH Publishers: New York (1 994), 61 9-654). 1 .2 line adhesion test
  • CHO cells transfected with MAdCAM-1 (2-3 x 10 4 / well) were placed in 96-well plates and cultured for 24 h. Confluent cell monolayers were washed once with phosphate-buffered saline (PBS) and then with adhesion test buffer (24 mM Tris, pH 7.4, 1 37 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 2 mM glucose and 1% bovine serum albumin) , For adhesion tests with MAdCAM immunoglobulin, the 96 perforated plates were coated with mule anti-human IgG (0.5 ⁇ g in 1 00 ⁇ ⁇ PBS / hole) at 4 ° C. overnight.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • adhesion test buffer 24 mM Tris, pH 7.4, 1 37 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 2 mM glucose and 1% bovine serum albumin
  • the plates were washed with adhesion test buffer (Click's RPMI, 1% bovine serum albumin, 1.0 mM Ca 2+ , 1.0 mM Mg 2+ ) and incubated with 100 ng MAdCAM immunoglobulin for 30 min at room temperature. After washing, the plates were blocked with adhesion test buffer for 1 h at 37 ° C. Alternatively, the plates were coated for 1 6 h at 4 ° C. with 400 ng / hole VCAM-1 or 2 ⁇ g / hole cleaned laminin in 50 mM carbonate buffer pH 9.4.
  • lymphoma cells 38-57 lymphoma cells (Strauch et al. (1,994) Supra; Hu et al., (1,992) Supra), Jurkat lymphoma cells or human peripheral blood lymphocytes were treated with 1 2 g / mL of the dye for 30 min at 37 ° C H33342 (Calbiochem, La Jolla, California) marked in cell adhesion buffer and washed with PBS containing 1 mM EDTA and then washed again with PBS. The cells (8 x 10 5 cells / mL) were resuspended in cell adhesion buffer with 1.0 mM Ca 2+ and 1.0 mM Mg 2+ .
  • the cyclic peptides were preincubated with the cells at a final concentration of 1 mg / mL for 10 min at 37 ° C. This was followed by a 30-minute adhesion of the cells at 37 ° C. Non-adherent cells were removed by centrifugation at 50 g for 10 min. The adhesion tests were evaluated quantitatively by fluorimetry using a Cytofluor 2300 device (Millipore, Bedford, Massachussets). 2 results
  • each amino acid residue in P10 was systematically optimized.
  • the biological activity was determined by inhibiting the adhesion of 38-7 lymphoma cells to an immobilized MAdCAM-lg fusion protein.
  • the coating of plates with the MAdCAM-lg protein results in a higher ligand density and causes more stringent conditions for the selection of biologically active compounds. Inhibition of 38 - /?
  • amino acids at positions 4 to 6 of P10 were also varied systematically. Alanine at position 6 was replaced by acidic (aspartic acid, glutamic acid), basic ( Arginine) or aromatic (phenylalanine, tyrosine, histidine) residues as well as threonine and methionine, the non-natural hydrophobic amino acids benzoylphenylalanine (Bpa), cyclohexylglycine (Chg) and tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid (Tic) were also used.
  • D-proline (P1 8) at position 5 with D-phenylalanine (P35) had no effect on the inhibitory effect.
  • D-amino acid is not directly involved in the binding to the integrin receptor. Their function appears to consist solely in inducing the active comformation of the pharmacophoric residues. Therefore this position is free for further manipulation, e.g. for coupling to carrier substances, marking groups such as fluorescent dyes or for dimerization or multimerization.
  • cyclic hexapeptide P10 cyclo (LDTApA), which is an inhibitor of the MAdCAM-1 / ⁇ ⁇ integrin interaction.
  • the active confirmation of compound P10 consists of 2 opposite ⁇ turns with the D-proline at position i + 1 of a ß - turn and the aspartic acid at position i + 1 of a ß ⁇ and / or ß ⁇ - turn.
  • a systematic exchange of the amino acid residues while maintaining the backbone structure resulted in several cyclic hexapeptides with improved activity (P25, P28 to P30).
  • cyclic peptides, salts and addition compounds identified according to the invention, as well as peptide compounds derived therefrom, are suitable as therapeutic agents for the treatment or prevention of ⁇ -integrin-associated diseases.
  • cyclic peptides could also be identified as active. These are the peptides DG403 c (L-D-F-D-p-F) and DG404-2 c (L-D-Phg-D-p-F), where Phg can be in the D or / and L configuration.
  • Cell adhesion is expressed as% of the medium control.
  • the peptides were used in a concentration of 1 mg / ml.
  • the data represent the mean of two independent experiments.
  • Cell adhesion is expressed as% of the medium control.
  • the peptides were used at 1 mg / ml.
  • the data represent the mean ⁇ standard deviation of at least three independent experiments.
  • Cell adhesion is expressed as% of the medium control.
  • the peptides were used at 1 mg / ml.
  • the data represent the mean +
  • Cell adhesion is given as a percentage of medium control.
  • the peptides were used at 1 mg / ml.
  • the data represent the mean + standard deviation of at least three independent experiments. A nt, not tested

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue, wirksame uns selektive α4β7-Integrin Antagonisten, die die Zelladhäsion an das mukosale Adressin-Zelladhäsionsmolekühl-1(MAdCAM-1) hemmen. Die neuen Integrin-Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der durch α4β7-Integrin vermittelten Zelladhäsion an MAdCAM-1 assoziiert sind.

Description

Antagonisten für cr^-lntegrin
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue, wirksame und selektive -7ψ-?7-lntegrin Antagonisten, die die Zelladhäsion an das mukosale Adressin- ZelladhäsionsmoleküI-1 (MAdCAM-1 ) hemmen. Die neuen Integrin- Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der durch αrφ-?7-lntegrin vermittelten Zelladhäsion an AdCAM-1 assoziiert sind.
Integrine sind heterodimere Transmembranglykoproteine, die aus einer a- und einer ^-Untereinheit bestehen. Sie sind an Zeil-Zeil- und Zell-Matrix- Wechselwirkungen beteiligt (Hynes, Cell 69 ( 1 992), 1 1 -25) . Gegenwärtig sind 1 5 unterschiedliche a- und ^-Untereinheiten bekannt, aus denen nach heutigem Kenntnisstand mindestens 23 unterschiedliche Integrinrezeptoren gebildet werden können (Eble, Integrin-Ligand Interaction, Springer- Verlag Heidelberg ( 1 997) 1 - 40). Die Familie der Integrine zeigt erhebliche Unterschiede in ihren biologischen Funktionen und Ligandenspezifitäten.
Die Gruppe der αr4-Integrine wird aus σ^-Integrin und σ^-lntegrin gebildet. Beide Rezeptoren werden auf den meisten Typen von Leukocyten exprimiert und vermitteln als Leukocytenrezeptoren sowohl Zeil-Zeil- als Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Die wichtigsten endogenen Liganden für 74- Integrine sind das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1 ) und Fibronektin (Fn) (Hemler, Annu. Rev. Immunol. 8 (1 990), 365 - 400; Postigo et al., J. Immunol. 1 51 ( 1 993), 2471 - 2483) sowie MAdCAM-1 , das unter physiologischen Bedingungen ausschließlich an σ^-lntegrine bindet (Berlin et al., Cell 74 (1 993), 1 85 - 1 95; Kilger und Holzmann, J. Mol. Med. 73 ( 1 995), 347 - 354). MAdCAM-1 gehört wie VCAM-1 zur Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und besitzt drei Immunglobulin (Ig) Domänen. Eine kohlenhydratreiche mucinartige Domäne ist zwischen der zweiten und dritten Ig-Domäne inseriert. Die Bindung von
Figure imgf000003_0001
an MAdCAM-1 wird hauptsächlich durch die erste N-terminale Ig-Domäne vermittelt, es sind jedoch auch Sequenzen aus der zweiten Ig-Domäne beteiligt. Durch Peptidepitop-Kartierung und ortsspezifische Mutagenese bei MAdCAM-1 konnte das Leu-Asp-Thr-Motiv aus der N-terminalen Ig-Domäne als notwendig für die Bindung an α^-lntegrine identifiziert werden (Shroff et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6 ( 1 996), 2495 - 2500; Briskin et al., J. Immunol. 1 56 (1 996), 71 9 - 726; Viney et al., J. Immunol. 1 57 (1 996), 2488 - 2497).
MAdCAM-1 ist der wichtigste Gegenrezeptor für σ^-lntegrine auf mukosalen Endothelzellen (Strauch et al., Int. Immunol. 6 (1 994), 236 -
275). Die organspezifische Adhäsion normaler Lymphocyten und
Lymphomzellen an endotheliale Venulen von Peyer's-Flecken wird durch a - Integrine vermittelt (Holzmann et al., Cell 56 (1 989), 37 - 46;
Holzmann und Weissmann, EMBO 8 (1 989), 1 735 - 1 741 ; Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 ( 1 992), 8254 - 8288) . Im Maus-Modell konnte gezeigt werden, dass /?7-lntegrin und/oder MAdCAM-1 spezifische
Antikörper die Rekrutierung von Lymphocyten im entzündeten Darmgewebe blockieren und signifikant den Verlauf von entzündlichen
Darmerkrankungen lindern (Picarella et al., J. Immunol. 1 58 (1 997), 2099 - 20106) . Weiterhin können Antikörper gegen ?7-Integrine Mäuse vor der
Ausbildung von Insulin-abhängigem Diabetes schützen (Yang et al.,
Diabetes 46 ( 1 997), 1 542 - 1 574).
Peptidische Integrin-Inhibitoren sind bekannt. US-A-6,037,324 offenbart Dipeptide als Inhibitoren von Integrin-MAdCAM-1 -Wechselwirkungen.
WO97/25351 offenbart peptidische Substanden mit an den N- und C-
Terminus gebundenen Gruppen als Mimotope des konservierten Aminosäuremotivs LDTSL von MAdCAM-1 . WO98/06248 beschreibt humanisierte Immunglobuline mit hoher Spezifität für Integrine, welche eine Antigen bindende Region von nichthumanem Ursprung und mindestens einen Teil eines Immunglobulins von humanem Ursprung aufweisen. US-A- 5,51 0,332 offenbart Peptide mit einer Länge von 4 - 1 3 Aminosäuren umfassend die LDV-Domäne des CS1 -Peptids, welche die Bindung von σ^-lntegrinen an VCAM-1 oder Fibronektin hemmen. US-A-6,087,330 offenbart zyklische Peptide mit 5 - 13 Aminosäuren abgeleitet vom CS1 - Peptid, welche die Bindung von ^-lntegrinen an VCAM-1 , Fibronektin oder Invasin selektiv hemmen. Inhibitoren der Bindung von or^-lntegrin an seine Rezeptoren, z.B. VCAM-1 , werden auch in US-A-6,096,773 offenbart. Ein Verfahren zur Identifizierung von σ^-Antagonisten wird in WO00/30681 beschrieben.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, neue Antagonisten von α^-VIntegrinen bereitzustellen, die insbesondere eine hohe Selektivität für MAdCAM-1 besitzen. Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung neuer zyklischer Peptide gelöst.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit zyklische peptidische Verbindungen mit einer Struktur der Formeln (la) oder (Ib): c (X, - D - X2 - X3 - X4 - X5) (la) c (X, - D - X3 - X3 - X4 - X5) (Ib) worin XT ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt, D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt, X2 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt, X3 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X4 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D-Konfiguration vorliegt und
X5 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen zyklischen peptidischen Verbindungen, deren Salze und Derivate eine überraschend hohe und selektive inhibitorische Wirkung auf die Wechselwirkung von ^-lntegrin mit seinem Rezeptor, insbesondere MAdCAM-1 zeigen.
Die monomeren Bausteine der erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind Aminosäuren, vorzugsweise σ-Aminocarbonsäuren. Es können jedoch auch andere Aminosäuren, beispielsweise ß- Ami n oca rb o n s äu re n , Aza-Ami n o säu ren ( D e rivate vo n a- Aminocarbonsäuren, bei denen die σ-CH-Gruppe durch ein N-Atom ersetzt ist) oder/und Peptoid-Aminosäuren (Derivate von αr-Aminocarbonsäuren, bei denen die Aminosäureseitengruppe nicht an das σ-C-Atom sondern an die Aminogruppe gebunden ist) verwendet werden.
Die Aminosäure-Bausteine X D, X2, X3 und X5 liegen - sofern sie ein optisch aktives Zentrum aufweisen - vorzugsweise in der L-Konfiguration vor. Der Baustein X4 liegt hingegen - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - vorzugsweise in der D-Konfiguration vor. Von den erfindungsgemäßen Verbindungen sind solche mit einer Struktur der Formel (la) besonders bevorzugt. Die bevorzugten Bedeutungen der monomeren .Bausteine in den peptidischen Verbindungen sind wie folgt:
X., ist ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette, vorzugsweise mit einer Leucin-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist XT die σ-Aminocarbonsäure L-Leucin.
D ist ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette, besonders bevorzugt die σ-Aminocarbonsäure L-Asparaginsäure.
X2 ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette, die vorzugsweise 1 -3 C-Atome, insbesondere 2 C-Atome aufweist, vorzugsweise mit einer Threonin- oder Valin-Seitenkette. Besonders bevorzugt wird X2 aus den a-
Aminocarbonsäuren L-Threonin und L-Valin ausgewählt.
X3 ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren, die beispielsweise 1 - 4 C-Atome aufweist, oder mit einer aromatischen Seitenkette, vorzugsweise mit einer Alanin-, Asparaginsäure-, Phenylalanin- oder Phenylglycin
(Phg)-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X3 eine a-
Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Alanin, L-Asparaginsäure, L-
Phenylalanin und D- oder/und L-Phenylglycin (Phg) . X4 ist ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette, die günstigerweise ein optisches aktives Zentrum aufweist, das in D-
Konfiguration vorliegt. Beispielsweise kann X4 ein σ-
Aminocarbonsäurerest ausgewählt aus D-Prolin, D-Phenylalanin und anderen beliebigen D-σ-Aminocarbonsäureresten sein. X5 kann an sich beliebiger Aminosäurerest sein, wobei Aminosäurereste mit einer aromatischen Seitenkette, wie etwa einer Phenylalanin-,
Tyrosin-, Histid in-, Benzoylphenylalanin ( Bpa) - oder
Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic)- Seitenkette bevorzugt sind. Andererseits kann X5 auch andere Bedeutungen wie etwa Methionin oder Arginin aufweisen. Besonders bevorzugt ist X5 eine σ-Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-
Histidin, L-Bpa, L-Tic, L-Methionin oder L-Arginin. Besonders bevorzugte konkrete Beispiele für erfindungsgemäße peptidische Verbindungen sind im folgenden angegeben: c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)
Bei diesen Verbindungen bedeutet "p" D-Prolin.
Neben Peptiden der Strukturformeln (la) und (Ib) sind auch pharmazeutisch verträgliche Salze und Derivate davon als
Figure imgf000007_0001
geeignet. Als Derivate kommen dabei insbesondere solche Verbindungen in Betracht, die an reaktiven Gruppen der Seitenkette, z.B an Hydroxyl-, Amino- oder Carbonsäuregruppen, modifiziert sind. Beispiele für eine solche Modifizierung sind eine Acylierung, z.B. eine Acetylierung von Aminogruppen oder/und eine Amidierung oder Veresterung von Carbonsäuregruppen.
Die Bausteine der erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind über Säure-Amid-Bindungen -CONR1- oder -NR1CO- verknüpft, d.h. die Peptidsequenzrichtung kann umgekehrt werden (Retropeptide). R1 kann wie in nativen Polypeptiden Wasserstoff bedeuten. Andererseits kann R1 jedoch auch eine Alkylrest, z.B. ein C, bis C3 - Alkylrest wie etwa Methyl oder Ethyl insbesondere Methyl bedeuten, da durch eine N-Alkylierung der Amidbindung oftmals eine starke Aktivitätsbeeinflussung bewirkt werden kann (vgl. z.B. Levian-Teitelbaum et al., Biopolymers 28 (1 989), 51 - 64). Darüber hinaus kann - wie bereits ausgeführt - R1 bei Peptoid- Aminosäurederivaten auch die eigentliche Aminosäuren-Seitenkette enthalten. Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind zyklische Verbindungen, worin bei Struktur (la) die Bausteine X^ und X5 und - bei Struktur (Ib) - die Bausteine X und X4 miteinander verbrückt sind. Diese Verbrückung erfolgt vorzugsweise über N- und C-Terminus des Peptids. Die Zyklisierung bei den Verbindungen (la) erfolgt besonders bevorzugt über eine Peptidbindung zwischen der Aminogruppe von X^ und der Carboxygruppe von X5 und bei den Verbindungen (Ib) über eine Peptidbindung zwischen der Aminogruppe von X- und der Carboxygruppe von X4.
Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind durch chemische Synthese, wie in den Beispielen erläutert, erhältlich. Die Verbindungen können in isolierter Form oder gegebenenfalls gekoppelt an makromolekulare Trägersubstanzen, z.B. Dextran oder Polypeptide vorliegen. Die Kopplung an Trägersubstanzen kann über Spacer oder/und Aminosäure-Seitenketten, z.B. über X4, erfolgen.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens eine peptidische Verbindung wie zuvor definiert, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- oder Verdünnungsmitteln enthält. Insbesondere werden die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen zur Herstellung von a 3r Integrin-Inhibitoren verwendet, die sich auch zur Diagnose, Prävention oder/und Bekämpfung von mit
Figure imgf000008_0001
assoziierten Krankheiten, z.B. chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, aber auch Autoimmunerkrankungen, insbesondere Asthma, Typ-I Diabetes und rheumatoider Arthritis sowie Nahrungsmittelallergien eignen. (Kilger,G., Holzmann, J., J. Mol. Med. 1 995, 73, 347 ff.). Weitere Anwendungsgebiete stellen strahlungs- und strahlentherapiebedingte Magen-Darm-Trakt-Schädigungen dar. Zusätzlich sind Tumore mit aJ37- Integrin-Beteiligung wie z.B. Non Hodgkin Lymphom, lymphoblastisches T- Zell Lymphom sowie MALT-Lymphome besonders bevorzugte Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen Verbindungen. Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur selektiven Inhibierung der Wechselwirkung von σ^-lntegrin mit MAdCAM-1 verwendet, wobei für diesen Zweck besonders bevorzugt solche Verbindungen eingesetzt werden, die bezüglich der Wechselwirkung zwischen a η- Integrin und MAdCAM-1 eine mindestens um den Faktor 2 höhere Hemmwirkung als bezüglich der Wechselwirkung zwischen aJ37- lntegrin und VCAM-1 haben.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung von σ^-lntegrin, wobei man eine erfindungsgemäße peptidische Verbindung in einer wirksamen Dosis in ein σ^-lntegrin enthaltendes biologisches System, beispielsweise eine Zelle oder einen Organismus einbringt. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch die Verabreichung des Wirkstoffs an ein bedürftiges Subjekt, insbesondere einen menschlichen Patienten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, als beschichtete Tabletten oder in Form von Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmitteln. Die peptidischen Verbindungen werden vorzugsweise oral oder parenteral in einer flüssigen oder festen Form verabreicht. Bei Verabreichung in flüssiger Form wird Wasser vorzugsweise als Trägermedium verwendet, das gegebenenfalls Stabilisatoren, Löslichkeitsvermittler und/oder Puffer enthält, die üblicherweise für Injektionslösungen verwendet werden. Solche Zusatzstoffe sind beispielsweise Tartrat- oder Boratpuffer, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Komplexierungsmittel wie etwa EDTA, Polymere wie etwa flüssiges Polyethylenglycol, etc.
Bei Verabreichung in fester Form können feste Trägersubstanzen wie etwa Stärke, Lactose, Mannitol, Methylcellulose, Talkum, hochdisperses Siliciumoxid, hochmolekulare Fettsäuren wie etwa Stearinsäure, Gelatine, Agar, Caiciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische oder pflanzliche Fette oder feste hochmolekulare Polymere wie etwa Polyethylenglykole eingesetzt werden. Weiterhin können die Formulierungen zur oralen Applikation, sofern gewünscht, auch Aroma- und Süßstoffe enthalten.
Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen können auch in Komplexen vorliegen, z.B. mit Cyclodextrinen wie etwa σ, ß oder y - Cyclodextrin.
Für therapeutische Anwendungen hängt die verabreichte Dosis vom Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, von der Art und der Schwere der Erkrankung, von der Art der Behandlung, von der Häufigkeit der Verabreichung und der Art der gewünschten Wirkung ab. Die tägliche Dosis der aktiven Verbindung ist üblicherweise 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht. Normalerweise sind 0, 1 bis 40 und vorzugsweise 0,5 bis 20 mg/kg/Tag in einer oder mehreren Dosen ausreichend, um die gewünschten Wirkungen zu erzielen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die im nachfolgenden beschriebenen Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigt:
Figur 1 die Bindung von 38- ?7 Lymphomzellen (aß-j) und Jurkat-Zellen ( ^) nach Inkubation mit zyklischen Peptiden an immobilisiertes VCAM-1 und MAdCAM- 1 . Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben. Beispiele
Beispiel 1
1 . Material und Methoden 1.1 Peptidsynthese
Lineare Peptide wurden unter Verwendung der Festphasen-Peptidsynthese nach Merrifield an einem Tritylchlorid (Trt)-Harz (Rapp-Polymere, Tübingen, Deutschland) unter Verwendung von Fmoc-Aminosäurederivaten (Fields und Noble, Int. J. Pept. Prod. Res. 35 (1 990), 1 61 - 21 4) hergestellt. Die Fmoc-geschützten Aminosäuren wurden mit O-( 1 -H-Benzotriazol-1 -yl)- N,N,N',N'-TetramethyluroniumtetrafIuoroborat (Richelieu, Biotechnologies, Montreal, Kanada), 1 -Hydroxybenzotriazol (Novabiochem, Läufelfingen, Schweiz) und Diisopropylethylamin als Base in N-Methylpyrrolidon als Lösungsmittel durchgeführt. Die vollständig geschützten linearen Aminosäuren wurden vom Harz unter Verwendung einer Mischung aus Dichlormethan, Trifluorethanol und Essigsäure (8: 1 : 1 ) abgespalten. Die Zyklisierung der linearen Sequenzen erfolgte bei hoher Verdünnung in Dimethylformamid (cirka 1 ,25 x 1 0~3 M) mittels in situ Aktivierung unter Verwendung von Diphenylphosphorazidat unter Verwendung von Natriumbicarbonat als fester Base (Brady et al., Peptides'83: Structures and Function, 8th Ann. Pept. Symp.; Pierce Chemical Company, Illinois, USA (1983), 127 - 130). Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte durch Behandlung mit 90% Trifluoressigsäure, 6% Triisopropylsilan und 4% Wasser. Nach Aufreinigung durch Reverse Phase-HPLC wurden Peptide mit einer Reinheit > 98% erhalten. Die Peptide wurden durch ESI- Massenspektroskopie und 1 D, 2D1 H, 13C-NMR Spektroskopie charakterisiert (Kessler und Seip: NMR of peptides. In: Two-Dimensional NMR Spectroscopy: Applications for Chemists and Biochemists; Croasmun, Carlson, Hrsg. VCH Publishers: New York (1 994), 61 9 - 654). 1 .2 Zeiladhäsionstest
Mit MAdCAM-1 transfizierte CHO-Zellen (2-3 x 104/Loch) wurden in 96- Lochplatten gegeben und für 24 h kultiviert. Konfluente Zell-Monoschichten wurden einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend mit Adhäsionstest-Puffer (24 mM Tris, pH 7,4, 1 37 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 2 mM Glucose und 1 % Rinderserumalbumin) gewaschen. Für Adhäsionstests mit MAdCAM-lmmunglobulin wurden die 96 Lochplatten mit Maultier-Anti-Human IgG (0,5 μg in 1 00 μ\ PBS/Loch) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit Adhäsionstest-Puffer (Click's RPMI, 1 % Rinderserumalbumin, 1 ,0 mM Ca2 +, 1 ,0 mM Mg2 +) gewaschen und mit 100 ng MAdCAM-lmmunglobulin für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die Platten mit Adhäsionstest-Puffer für 1 h bei 37 °C blockiert. Alternativ wurden die Platten für 1 6 h bei 4°C mit 400 ng/Loch VCAM-1 oder 2 μg/Loch gereinigtem Laminin in 50 mM Carbonatpuffer pH 9,4 beschichtet.
38-57 Lymphomzellen (Strauch et al. ( 1 994) Supra; Hu et al., ( 1 992) Supra), Jurkat-Lymphomzellen oder humane periphere Blutlymphocyten wurden für 30 min bei 37°C mit 1 2 g/mL des Farbstoffs H33342 (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien) in Zelladhäsionspuffer markiert und mit PBS enthaltend 1 mM EDTA und anschließend nochmals mit PBS gewaschen. Die Zellen (8 x 105 Zellen/mL) wurden in Zelladhäsionspuffer mit 1 ,0 mM Ca2+ und 1 ,0 mM Mg2+ resuspendiert. Die zyklischen Peptide wurden mit den Zellen bei einer Endkonzentration von 1 mg/mL für 10 min bei 37 °C vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine 30-minütige Adhäsion der Zellen bei 37 °C. Nicht adhärente Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 50 g entfernt. Die Adhäsionstests wurden quantitativ durch Fluorimetrie unter Verwendung eines Cytofluor 2300 Gerätes (Millipore, Bedford, Massachussets) ausgewertet. 2. Ergebnisse
2.1 Ermittlung einer Leitstruktur
Zunächst wurden 5 zyklische Pentapeptide mit der Sequenz cyclo(L-D-T-A- A) synthetisiert, worin jeweils eine Aminosäure in D-Konfirmation vorliegt. An Stelle von D-Alanin wurde jedoch D-Prolin verwendet. Auf diese Weise wurden die zyklischen Pentapeptide P1 bis P5 (Tabelle 1 ) erhalten. Anschließend wurde dieselbe Methode für das Hexapeptid cyclo(L-D-T-A-A- A) verwendet, wobei die 6 Verbindungen P6 bis P1 1 (Tabelle 1 ) erhalten wurden. Die zyklischen Peptide wurden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Adhäsion von a 3-,- Integrin exprimierenden 38- ?7 Lymphomzellen an stabil mit MAdCAM-1 transfizierten CHO-Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Nur die 2 Hexapeptide P10 und P1 1 zeigten eine wirksame Hemmung der Bindung von σ^-lntegrinen an MAdCAM-1 . Die Verbidung P10 zeigte eine höhere Aktivität als P1 1 . Die lineare Vorstufe des zyklischen Hexapeptids P10 H2N-L-D-T-A-p-A-OH zeigte keine Aktivität selbst bei einer hohen Konzentration von 2 mg/ml.
Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die zyklische Peptidstruktur P10 (entsprechend der peptidischen Verbindung la) als Leitstruktur für weitere Optimierungen verwendet.
2.2 Optimierung der Leitstruktur
Nach Ermittlung der Leitstruktur wurde systematisch jeder Aminosäurerest in P10 optimiert. In diesen Experimenten wurde die biologische Aktivität durch Hemmung der Adhäsion von 38- ?7 Lymphomzellen an ein immobilisiertes MAdCAM-lg Fusionsprotein bestimmt. Verglichen mit CHO- MAdCAM-1 Transfektanten als Substrat ergibt die Beschichtung von Platten mit dem MAdCAM-lg Protein eine höhere Ligandendichte und bewirkt stringentere Bedingungen für die Selektion nach biologisch aktiven Verbindungen. Die Hemmung der 38-/?7 Zelladhäsion an MAdCAM-lg mit 1 mg/ml des Inhibitors P10 war daher weniger wirksam als die Hemmung der Bindung an CHO-MAdCAM-1 (38% restliche Adhäsion für MAdCAM-lg gegenüber 7% für CHO-MAdCAM Zellen; vgl. Tabellen 1 und 2).
Innerhalb des LDT-Motivs von Peptid P1 0 wurden Modifikationen unter Verwendung funktionell verwandter Aminosäuren durchgeführt. Leucin (P10 und P1 8) wurde durch Valin (P13), Isoleucin (P14), Phenylalanin (P20), D- und L-Phenylglycin (P21 und P22) und auch durch Glycin (P1 2) ersetzt. Threonin (P10 und P1 8) wurde durch Glycin (P1 5), Serin (P1 6) und Valin (P1 7 und P1 9) ersetzt. Die Substitution von Leucin durch Glycin (P1 2), Valin (P1 3), Phenylalanin (P20) oder D- und L-Phenylglycin (P21 und P22) führte zu inaktiven Verbindungen. Bei Ersetzen von Leucin durch Isoleucin (P1 4) konnte noch Aktivität nachgewiesen werden. Auch bei Austausch von Threonin durch Valin (P1 7 und P1 9) blieb die Aktivität erhalten, während bei Glycin (P1 5) und Serin (P1 6) keine Aktivität gefunden wurde (Tabelle 2) .
Die Aminosäuren an den Positionen 4 bis 6 von P10 (cyclo(L -D2-T3-A4-pδ- A6) wurden ebenfalls systematisch variiert. Alanin an Position 6 wurde durch saure (Asparaginsäure, Glutaminsäure), basische (Arginin) oder aromatische (Phenylalanin, Tyrosin, Histidin) Reste sowie durch Threonin und Methionin ersetzt. Weiterhin wurden die nicht-natürlichen hydrophoben Aminosäuren Benzoylphenylalanin (Bpa), Cyclohexylglycin (Chg) und Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic) verwendet.
Der Austausch von Alanin an Position 6 durch Asparaginsäure (P23) und Glutaminsäure (P24) führte zu einem Aktivitätsverlust. Im Einklang mit diesem Befund steht auch die geringe inhibitorische Wirkung der Peptide P37, P38 und P42 bis P45. Im Gegensatz dazu konnte durch Ersetzen von Alanin durch aromatischen Aminosäurereste Phenylalanin (P25 und P28), Tyrosin (P30), Histidin (P29), Bpa (P32) oder Tic (P34) die Aktivtät stark erhöht werden. Auch Verbindungen mit Methionin (P31 ) und Arginin (P26) zeigten eine erhöhte Aktivität. Peptide, die Threonin (P27) und Chg (P33) an Position 6 enthalten, zeigen eine ähnliche Aktivität wie die Ausgangsmoleküle.
Das Ersetzen von D-Prolin (P1 8) an Postition 5 durch D-Phenylalanin (P35) hatte einen keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung. Offensichtlich ist die D-Aminosäure nicht direkt an der Bindung an den Integrin-Rezeptor beteiligt. Ihre Funktion scheint ausschließlich darin zu bestehen, die aktive Komformation der pharmakophoren Reste zu induzieren. Daher ist diese Position frei zur weiteren Manipulation, z.B. zur Kopplung an Trägersubstanzen, Markierungsgruppen wie Fluoreszenzfarbstoffe oder zur Di- oder Multimerisierung.
Das Ersetzen von Alanin an Position 4 durch Asparaginsäure führte zu keiner Beeinträchtigung der inhibitorischen Wirkungen der Verbindungen (P10 bis P1 8, P1 7 bis P1 9 und P25 bis P28) . Das Vorhandensein von Lysin (P39 bis P41 ) führte jedoch zu einer erheblichen Verringerung der Aktivität.
2.3 Selektivität für σ^-lntegrin
Neben der biologischen Aktivität ist auch die Selektivität eine wichtige Eigenschaft bei der Entwicklung von pharmakologischen Wirkstoffen. Zunächst wurde daher der Einfluss der Peptide P28 bis P31 auf die Bindung von humanen peripheren Blutlymphocyten (PBL) an Laminin untersucht. Diese Wechselwirkung wird hauptsächlich durch das Integrin a vermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die getesteten Verbindungen keinen Einfluss auf die a abhängige PBL-Adhäsion an Laminin zeigten (Tabelle 3). Kontrollexperimente zeigten, dass die Bindung PBL an MAdCAM-lg durch diese Verbindungen stark gehemmt wurde. Zur weiteren Bestimmung der Selektivität wurde die Fähigkeit der Peptide zur Hemmung der Bindung von α^-lntegrin und des strukturell verwandten σ^-lntegrins an VCAM-1 untersucht. Die durch σ^- Integrin vermittelte Adhäsion wurde unter Verwendung von Jurkat-Lymphomzellen (aß^ x , σ-J- ) getestet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass σψ-?7/VCAM-1 Wechselwirkungen auch durch Peptide P25 und P28 bis P31 inhibiert wurden, allerdings mit erheblich geringerer Stärke als die σ^-Bindung an MAdCAM-1 . Im Gegensatz dazu hatten die untersuchten zyklischen Peptide keinen Einfluss auf die Adhäsion von σ^-lntegrin an VCAM-1 (P25, P28 und P31 ) oder sie zeigten nur eine sehr geringe inhibitorische Wirksamkeit (P29 und P30). Die inhibitorische Wirksamkeit von P28 bis P30 für die a<ß vermittelte Zelladhäsion an VCAM-1 war jedoch erheblich geringer als die diejenige für die aJ37/MAdCAM-l Wechselwirkung. Das negative Kontrollpeptid P46 hatte keinerlei inhibitorische Wirksamkeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und Figur 1 zusammengefasst.
3. Schlussfolgerungen
Die Verwendung von zyklischen Peptiden führte zur Identifizierung des zyklischen Hexapeptids P10 cyclo(L-D-T-A-p-A), welches ein Inhibitor der MAdCAM-l /σ^-Integrin-Wechselwirkung ist. Die aktive Komfirmation der Verbindung P10 besteht aus 2 gegenüberliegenden ^-Kehren mit dem D- Prolin an der Position i + 1 einer ß - Kehre und der Asparaginsäure an der Position i + 1 einer ß\ und/oder ß\\ - Kehre. Ein systematischer Austausch der Aminosäurereste unter Beibehalt der Rückgratstruktur ergab mehrere zyklische Hexapeptide mit verbesserter Aktivität (P25, P28 bis P30). Die hohe Selektivität dieser Peptide zeigte sich durch ihre starke Hemmung der σ^/MAdCAM-l Wechselwirkung ohne signifikante Hemmung der σ^/VCAM Wechselwirkung. Die erfindungsgemäß identifizierten zyklischen Peptide, Salze und Additionsverbindungen sowie davon abgeleitete peptidische Verbindungen sind als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung oder Prävention von α^- Integrin assoziierten Krankheiten geeignet.
Beispiel 2
Neben den im Beispiel 1 angegegenen zyklischen Peptiden konnten noch weitere zyklische Peptide als aktiv identifiert werden. Es sind dies die Peptide DG403 c(L-D-F-D-p-F) und DG404-2 c(L-D-Phg-D-p-F), wobei Phg in D- oder/und L-Konfiguration vorliegen kann.
Die biologische Aktivität dieser Peptide ist in Tabelle 5 gezeigt. Es ist zu erkennen, dass die Peptide eine hohe und selektive inhibitorische Wirkung auf die σ^/MAdCAM-Wechselwirkung besitzen.
Tabelle 1
Wirkung zyklischer Peptide auf die Bindung von 38-/?7 Lymphomzellen an CHO-MAdCAM-1 Zellen
Verbindung Adhäsion {%)
P1 cyclo(l-D-T-A-A) 100
P2 cyclo(L-d-T-A-A) 137
P3 cyclo(L-D-t-A-A) 85
P4 cyclo(L-D-T-p-A) 89
P5 cyclo(L-D-T-A-p) 74
P6 cyclo(l-D-T-A-A-A) 63
P7 cyclo(L-d-T-A-A-A) 85
P8 cyclo(L-D-t-A-A-A) n.t.*
P9 cyclo(L-D-T-p-A-A) 111
P10 cyclo(L-D-T-A-p-A) 7
P11 cyclo(L-D-T-A-A-p) 30
Die Zelladhäsion ist als % der Mediumkontrolle angegeben. Die Peptide wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml eingesetzt. Die Daten stellen den Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten dar.
*n.t. nicht getestet (Peptid P8 war nicht löslich) Tabelle 2
Wirkung zyklischer Peptide auf die Bindung von 38J?7 Lymphomzellen an MADcAM-lg
Verbindung Adhäsion (%)
P12 cyclo(G-D-T-A-p-A) 105 ± 5
P13 cyclo(V-D-T-A-p-A 97 + 10
P14 cyclo(l-D-T-A-p-A) 64 ± 35
P15 cyclo(L-D-G-A-p-A) 91 ± 17
P16 cyclo(L-D-S-A-p-A) 90 ± 7
P17 cyclo(L-D-V-A-p-A) 50 ± 23
P18 cyclo(L-D-T-D-p-A) 47 ± 5
P19 cyclo(L-D-V-D-p-A) 40 ± 7
P20 cyclo(F-D-T-D-p-A) 102 ± 8
P21 cyclo(Phg-D-T-D-p-A) 98 ± 9
P22 cyclo(phg-D-T-D-p-A) 1 14 ± 20
P23 cyclo(L-D-T-A-p-D) 1 1 5 ± 13
P24 cyclo(L-D-T-A-p-E) 65 ± 4
P25 cyclo(L-D-T-A-p-F) 7 ± 3
P26 cyclo(L-D-T-A-p-R) 26 + 3
P27 cyclo(L-D-T-A-p-T) 49 + 24
P28 cyclo(L-D-T-D-p-F) 3 ± 4
P29 cyclo(L-D-T-D-p-H) 9 ± 10
P30 cyclo(L-D-T-D-p-Y) 3 + 4
P31 cyclo(L-D-T-D-p-M) 1 5 ± 17
P32 cyclo(L-D-T-D-p-Bpa) 10 ± 1
P33 cyclo(L-D-T-D-p-Chg) 58 ± 2
P34 cyclo(L-D-T-Dp-Tic) 9 + 1
P35 cyclo(L-D-T-D-f-A) 63 ± 16 P36 cyclo(L-D-T-D-f-F) 56 + 54
P37 cydo(L-D-T-A-d-D) 99 + 6
P38 cyclo(L-D-T-A-f-D) 86 ± 12
P39 cyclo(L-D-T-K-p-F) 85 ± 21 P40 cyclo(L-D-T-K-p-D) 102 ± 4
P41 cyclo(L-D-T-K-p-Y) 81 + 4
P42 cyclo(L-D-T-M-p-D) 83+ 14
P43 cyclo(L-D-T-W-p-D) 87 ± 14
P44 cyclo(L-D-T-Y-p-D) 76 + 25 P45 cyclo(L-D-T-F-p-D) 100 + 10
Die Zelladhäsion ist als % der Mediumkontrolle angegeben. Die Peptide wurden mit 1 mg/ml eingesetzt. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar.
Tabelle 3
Adhäsion von PBL-Zellen an Laminin in Gegenwart zyklischer Peptide
Verbindung Adhäsion (%)
P28 cyclo(L-D-T-D-p-F) 95 + 21
P29 cyclo(L-D-T-D-p-H) 1 14 + 1 6
P30 cyclo(L-D-T-D-p-Y) 1 1 1 + 1 5
P31 cyclo(L-D-T-D-p-M) 102 + 16
Die Zelladhäsion ist als % der Mediumkontrolle angegeben. Die Peptide wurden mit 1 mg/ml eingesetzt. Die Daten stellen den Mittelwert +
Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar.
Tabelle 4
Spezifische Wirkung von zyklischen Peptiden auf die a η- und σ^- Integrin vermittelte Zelladhäsion an MAdCAM-lg und VCAM- 1
α-/?7/MAdCA α^/VCAM σ^JVCA Verbindung Adhäsion(%) Adhäsion(%) Adhäsion(%)
P25 cyclo(L-D-T-A-p-F) 7 ± 3 36 + 7 109 ± 20
P28 cyclo(L-D-T-D-p-F) 3 ± 4 38 + 20 72 + 10
P29 cyclo(L-D-T-D-p-H) 9 ± 10 27 ± 14 74 ± 16
P30 cyclo(L-D-T-D-p-Y) 3 + 4 37 + 13 78 + 3 P31 cyclo(L-d-T-D-p-M) 15 ± 17 36 ± 12 108 + 18
P46 cyclo(N-E-h-F-G) 00 + 0 93 ± 19 n.t.a
Die Zelladhäsion ist als prozentualer Wert der Mediumkontrolle angegeben. Die Peptide wurden mit 1 mg/ml eingesetzt. Die Daten stellen den Mittelwert + Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. an.t., nicht getestet
Tabelle 5
Verbindung Zelladhäsion Zelladhäsion Zelladhäsion cr^-Zellen σ^-Zellen a,ßΛ -Zellen an MAdCAM an VCA an VCAM
kein Inhibitor 100% 100% 1 00%
DG403 27 + 7 n.d. 82 + 25
DG402-2 14 + 8 89 ± 2 84 + 30

Claims

Ansprüche
1 . Peptidische Verbindungen mit einer Struktur der Formeln (la) oder (lb): c (X, - D - X2 - X3 - X4 - X5) (la) c (X, - D - X3 - X3 - X4 - X5) (Ib) worin
X, ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin- Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt, D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist ist - in L-
Konfiguration vorliegt, X2 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt, X3 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt, X4 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D-
Konfiguration vorliegt, X5 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-
Konfiguration vorliegt.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Struktur der Formel (la) aufweisen.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass X-, ein Aminosäurerest mit einer Leucin-Seitenkette ist.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass X2 ein Aminosäurerest mit einer Threonin- oder Valin- Seitenkette ist.
5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass X3 ein Aminosäurerest mit einer Alanin-, Asparaginsäure-, Phenylalanin- oder Phenylglycin (Phg)- Seitenkette ist.
6. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X4 ein Aminosäurerest mit einer Prolin- oder Phenylalanin- Seitenkette ist.
7. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass X5 ein Aminosäurerest mit einer aromatischen Seitenkette ist.
8. Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass X5 ein Aminosäurerest mit einer Phenylalanin-, Tyrosin-, Histidin-, Bpa- oder Tic-Seitenkette ist.
9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass X5 ein Aminosäurerest mit einer Methionin- oder Arginin- Seitenkette ist.
1 0. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis.9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste jeweils unabhängig aus a-
Aminocarbonsäureresten, ?-Aminocarbonsäureresten, Aza- Aminosäureresten und Peptoid-Aminosäureresten ausgewählt sind.
1 1 . Verbindungen nach Anspruch 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste aus σ-Aminocarbonsäureresten ausgewählt sind.
1 2. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 ausgewählt aus: c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa) c (L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2 gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Verdünnungsmitteln enthält.
14. Verwendung einer peptidischen Verbrückung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2 zur Herstellung eines σψ-?7-lnhibitors.
1 5. Verwendung nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Inhibitors, der für die Wechselwirkung zwischen σ^-lntegrinen und MAdCAM-1 selektiv ist.
6. Verwendung nach Anspruch 14 oder 1 5 zur Inhibierung von aßη- Integrin vermittelten Zeil-Zeil- oder Zell-Matrix-Wirkungen.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 4 bis 1 6 zur Diagnose, Prävention oder/und Therapie von Erkrankungen, die mit a 37-
Integrinen assoziiert sind.
8. Verfahren zur Inhibierung von σ^-lntegrinen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine peptidische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2 in einer wirksamen Dosis in ein σ^-lntegrin enthaltendes biologisches System einbringt.
9. Verfahren zur Diagnose, Prävention oder/und Therapie von Erkrankungen, die mit
Figure imgf000027_0001
assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass man eine peptidische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2 in einer wirksamen Dosis an ein bedürftiges Subjekt, z.B. einen Patienten, verabreicht.
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