Antagonisten für cr4-lntegrine
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue, wirksame und selektive α4-lntegrin Antagonisten, die die Zelladhäsion an Zeiladhäsionsmoleküle hemmen. Die neuen Integrin-Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der durch σ4-lntegrine vermittelten Zelladhäsion assoziiert sind.
Integrine sind heterodimere Transmembranglykoproteine, die aus einer a- und einer ^-Untereinheit bestehen. Sie sind an Zeil-Zeil- und Zell-Matrix- Wechselwirkungen beteiligt (Hynes, Cell 69 ( 1 992), 1 1 -25) . Gegenwärtig sind 1 5 unterschiedliche a- und ^-Untereinheiten bekannt, aus denen nach heutigem Kenntnisstand mindestens 28 unterschiedliche Integrinrezeptoren gebildet werden können (Eble, lntegrin-Ligand Interaction, Springer-Verlag Heidelberg ( 1 997) 1 - 40). Die Familie der Integrine zeigt erhebliche Unterschiede in ihren biologischen Funktionen und Ligandenspezifitäten.
Die Gruppe der α
4-lntegrine wird aus u.a.
gebildet. Beide Rezeptoren werden auf den meisten Typen von Leukocyten exprimiert und vermitteln als Leukocytenrezeptoren sowohl Zeil-Zeil- als Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Die wichtigsten endogenen Liganden für σ
4- Integrine sind das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1 ) und Fibronektin (Fn) (Hemler, Annu. Rev. Immunol. 8 ( 1 990), 365 - 400; Postigo et al., J. Immunol. 1 51 (1 993), 2471 - 2483) sowie das mukosale Adressin-Zelladhäsionsmolekül-1 (MAdCAM-1 ), das unter physiologischen Bedingungen ausschließlich an σ^-lntegrine bindet (Berlin et al., Cell 74 ( 1 993), 1 85 - 1 95; Kilger und Holzmann, J. Mol. Med. 73 ( 1 995), 347 - 354).
MAdCAM-1 gehört wie VCAM-1 zur Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und besitzt drei Immunglobulin (Ig) Domänen. Eine kohlenhydratreiche mucinartige Domäne ist zwischen der zweiten und dritten Ig-Domäne inseriert. Die Bindung von α^-Integrinen an MAdCAM-1 wird hauptsächlich durch die erste N-terminale Ig-Domäne vermittelt, es sind jedoch auch Sequenzen aus der zweiten Ig-Domäne beteiligt. Durch Peptidepitop-Kartierung und ortsspezifische Mutagenese bei MAdCAM-1 konnte das Leu-Asp-Thr-Motiv aus der N-terminalen Ig-Domäne als notwendig für die Bindung an α^-lntegrine identifiziert werden (Shroff et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6 (1 996), 2495 - 2500; Briskin et al., J. Immunol. 1 56 (1996), 71 9 - 726; Viney et al., J. Immunol. 1 57 (1996), 2488 - 2497).
MAdCAM-1 ist der wichtigste Gegenrezeptor für a η- Integrine auf mukosalen Endothelzellen (Strauch et al., Int. Immunol. 6 (1 994), 236 -
275). Die organspezifische Adhäsion normaler Lymphocyten und
Lymphomzellen an endotheliale Venulen von Peyerschen Plaques wird durch σ^-lntegrine vermittelt (Holzmann et al., Cell 56 (1 989), 37 - 46;
Holzmann und Weissmann, EMBO 8 ( 1 989), 1 735 - 1 741 ; Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 ( 1 992), 8254 - 8288). Im Maus-Modell konnte gezeigt werden, dass /?7-lntegrin und/oder MAdCAM-1 spezifische
Antikörper die Rekrutierung von Lymphocyten im entzündeten Darmgewebe blockieren und signifikant den Verlauf von entzündlichen
Darmerkrankungen lindern (Picarella et al., J. Immunol. 1 58 ( 1 997), 2099 - 20106). Weiterhin können Antikörper gegen ?7-lntegrine Mäuse vor der
Ausbildung von Insulin-abhängigem Diabetes schützen (Yang et al.,
Diabetes 46 ( 1 997), 1 542 - 1 574).
Peptidische Integrin-Inhibitoren sind bekannt. US-A-6,037,324 offenbart Dipeptide als Inhibitoren von lntegrin-MAdCAM-1 -Wechselwirkungen.
WO97/25351 offenbart peptidische Substanden mit an den N- und C-
Terminus gebundenen Gruppen als Mimotope des konservierten
Aminosäuremotivs LDTSL von MAdCAM-1 . WO98/06248 beschreibt humanisierte Immunglobuline mit hoher Spezifität für Integrine, welche eine Antigen bindende Region von nichthumanem Ursprung und mindestens einen Teil eines Immunglobulins von humanem Ursprung aufweisen. US-A- 5,510,332 offenbart Peptide mit einer Länge von 4 - 13 Aminosäuren umfassend die LDV-Domäne des CS1 -Peptids, welche die Bindung von σ^-lntegrinen an VCAM-1 oder Fibronektin hemmen. US-A-6,087,330 offenbart zyklische Peptide mit 5 - 1 3 Aminosäuren abgeleitet vom CS1 - Peptid, welche die Bindung von ^-lntegrinen an VCAM-1 , Fibronektin oder Invasin selektiv hemmen. Inhibitoren der Bindung von aJ3 - Integrin an seine Rezeptoren, z.B. VCAM-1 , werden auch in US-A-6,096,773 offenbart. Ein Verfahren zur Identifizierung von σ^-Antagonisten wird in WO00/30681 beschrieben.
In DE 1 01 07 707.6 werden neue selektive cr^-Integrin-Antagonisten offenbart, die die Zelladhäsion an MAdCAM-1 hemmen. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um zyklische Peptidderivate.
Die vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, neue Antagonisten von 4-lntegrinen, insbesondere σ^-lntegrinen bereitzustellen, die sowohl eine hohe Aktivität als auch eine hohe Stabilität unter physiologischen Bedingungen aufweisen. Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung der neuen Verbindungen mit einer Struktur der Formel (I) gelöst:
CH(CH3)2
I
X1 - CR1R2 - N - CH - CR1 R2 - NH - CH - A - X2
CH, - CO,R6
worin
X1 die Gruppe -Ar1 (R3)n bedeutet,
X2 die Gruppe -Ar2(R )m bedeutet, A eine Bindung oder eine Linkergruppe mit einer
Kettenlänge bis zu 3 Atomen bedeutet, R1 und R2 jeweils unabhängig bei jedem Auftreten zusammen
Sauerstoff oder Schwefel bedeuten oder einer von R1 und R2 Wasserstoff ist und der andere aus Wasserstoff, Hydroxy und Halogen ausgewählt ist, n eine ganze Zahl von 0-6 bedeutet,
R3 und R4 jeweils unabhängig einen organischen Rest, umfassend bis zu 4 C-Atome und gegebenenfalls ein oder mehrere
Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel oder/und Stickstoff, oder einen Rest, ausgewählt aus
NH2, NO2, CN, OH, Halogen oder COOH, bedeuten, m eine ganze Zahl von 0-3 bedeutet,
Ar1 ein N-heteroaromatisches Ringsystem oder ein mit einer
Aminogruppe substituiertes aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem bedeutet,
Ar2 ein aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem bedeutet, R6 Wasserstoff oder einen organischen Rest mit 1 bis 1 2
C-Atomen bedeutet, in Form von isolierten Enantiomeren oder Diastereomeren oder
Gemischen von mehreren Enantiomeren oder Diastereomeren, wobei die Verbindungen gegebenenfalls in Form von Salzen vorliegen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Salze, insbesondere deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren oder Basen, eine überraschend hohe und teilweise auch selektive inhibitorische Wirkung auf die Wechselwirkung von σ4-
Integrinen mit deren Rezeptoren, insbesondere MAdCAM-1 , zeigen. Besonders überraschend ist, dass einzelne isolierte Diastereomere und Enantiomere eine hohe Selektivität für bestimmte Wechselwirkungen aufweisen.
Bei den Verbindungen der Formel (I) stellt die Grupe Ar1 vorzugsweise ein N-heterozylisches aromatisches Ringsystem dar, wobei ein N-Atom, vorzugsweise in o-Stellung, zur Verknüpfungsgruppe steht. Besonders bevorzugt ist das N-heteroaromatische Ringsystem eine Isochinolin-Gruppe. Ar1 kann gegebenenfalls durch einen oder mehrere Reste R3 substituiert sein. Ein bevorzugtes Beispiel für Ar1 ist daher eine Gruppe mit einer Struktur der Formel (II):
wobei R3 und n die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen.
Andererseits kann Ar1 auch ein aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem umfassen, das mit einer primären oder/und sekundären Aminogruppe substituiert ist. Beispiele für derartige Gruppen haben die Struktur der Formeln (III) oder (IV):
oder
worin R
3 und n die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen und R
5 einen organischen Rest umfassend bis zu 14 C-Atomen und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel oder/und Stickstoff darstellt. Besonders bevorzugt wird NHR
5 aus Benzylamino-, Phenylalanin- oder Glycingruppen ausgewählt, die gegebenenfalls noch eine oder mehrere Gruppen R
3 tragen.
Die Gruppe Ar2 in der Verbindung (I) stellt ein aromatisches oder heteroaromatisches mono- oder polyzyklisches Ringsystem dar. Besonders bevorzugt ist Ar2 ein monozyklisches aromatisches Ringsystem, insbesondere Phenyl. Ar2 kann durch einen oder mehrere Reste R4 substituiert sein. Vorzugsweise trägt Ar2 0, 1 oder 2 Substituenten. Wenn Ar2 ein Phenylrest ist, befinden sich die Substituenten vorzugsweise in der m- oder/und p-Position bezüglich der Verknüpfungsstelle an das Grundgerüst der Verbindung (I) .
Die Substituenten R3 und R4 an den aromatischen Ringsystemen Ar1 und Ar2 können jeweils unabhängig organische Reste mit bis zu 4 C-Atomen, z.B. Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylreste sein, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff, enthalten können. Weiterhin können R3 und R4 auch aus anderen Gruppen, z.B. NH2, NO2, CN, OH, Halogen (z.B. F, Br, Cl oder l) oder COOH, ausgewählt sein. Bevorzugte Beispiele für R3 und R4 sind C C3 Alkyl, insbesondere Methyl oder Ethyl, NO2 und COOH.
Die Gruppe A in Verbindung (I) kann eine Bindung oder eine Linkergruppe mit einer Kettenlänge von vorzugsweise 1 , 2 oder 3 Atomen bedeuten.
Bevorzugte Verbindungen umfassen die Teilstrukturen
CH(CH3)2
CH2
X1 - C - NH - CH - CH2 - NH
O oder
CH(CH3)2
CH,
X1 - CH2 - NH - CH - CH2 - NH
also Strukturen, in denen CR1 R2 für C = O oder/und für CH2 steht.
Besonders bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäßen σ4-lntegrin- Inhibitoren sind die in den Tabellen 1 bis 4 gezeigten Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind durch chemische Synthese, wie in den Beispielen erläutert, erhältlich. Die Verbindungen können in isolierter Form oder gegebenenfalls gekoppelt an makromolekulare Trägersubstanzen, z.B. Dextran oder Polypeptid-e vorliegen. Die Kopplung an Trägersubstanzen kann über Spacer oder/und Aminosäure-Seitenketten erfolgen.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens eine Verbindung wie zuvor definiert, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- oder Verdünnungsmitteln enthält. Insbesondere werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von 4-lntegrin-, insbesondere von a 3 Integrin-Inhibitoren verwendet, die sich auch zur Diagnose, Prävention oder/und Bekämpfung von mit 4, insbesondere von mit aJ37 assoziierten Krankheiten, z.B. chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus
Crohn und Colitis ulcerosa, aber auch Autoimmunerkrankungen, insbesondere Asthma, Typ-I Diabetes und rheumatoider Arthritis sowie Nahrungsmittelallergien eignen. (KiIger,G., Holzmann, J., J. Mol. Med. 1 995, 73, 347 ff.). Weitere Anwendungsgebiete stellen strahlungs- und strahlentherapiebedingte Magen-Darm-Trakt-Schädigungen dar. Zusätzlich sind Tumore mit σ4-Beteiligung wie z.B. Non Hodgkin Lymphom, lymphoblastisches T-Zell Lymphom sowie MALT-Lymphome besonders bevorzugte Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen Verbindungen. Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur selektiven Inhibierung der Wechselwirkung von α4-lntegrinen mit Zelladhäsionsmolekülen, insbesondere von σ^-lntegrinen mit MAdCAM-1 , verwendet, wobei für diesen Zweck besonders bevorzugt solche Verbindungen eingesetzt werden, die bezüglich der Wechselwirkung zwischen σ^-lntegrin und MAdCAM-1 eine mindestens um den Faktor 2 höhere Hemmwirkung als bezüglich der Wechselwirkung zwischen aJ37- Integrin und VCAM-1 haben.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung von σ4-lntegrinen, wobei man eine erfindungsgemäße Verbindung in einer wirksamen Dosis in ein 4-lntegrin enthaltendes biologisches System, beispielsweise eine Zelle oder einen Organismus einbringt. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch die Verabreichung des Wirkstoffs an ein bedürftiges Subjekt, insbesondere einen menschlichen Patienten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, als beschichtete Tabletten oder in Form von Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder nicntwässrigen Lösungsmitteln. Die Verbindungen werden vorzugsweise oral oder parenteral in einer flüssigen oder festen Form verabreicht. Bei Verabreichung in flüssiger Form wird Wasser vorzugsweise als Trägermedium verwendet, das gegebenenfalls Stabilisatoren,
Löslichkeitsvermittler und/oder Puffer enthält, die üblicherweise für Injektionslösungen verwendet werden. Solche Zusatzstoffe sind beispielsweise Tartrat- oder Boratpuffer, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Komplexierungsmittel wie etwa EDTA, Polymere wie etwa flüssiges Polyethylenglycol, etc.
Bei Verabreichung in fester Form können feste Trägersubstanzen wie etwa Stärke, Lactose, Mannitol, Methylcellulose, Talkum, hochdisperses Siliciumoxid, hochmolekulare Fettsäuren wie etwa Stearinsäure, Gelatine, Agar, Caiciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische oder pflanzliche Fette oder feste hochmolekulare Polymere wie etwa Polyethylenglykole eingesetzt werden. Weiterhin können die Formulierungen zur oralen Applikation, sofern gewünscht, auch Aroma- und Süßstoffe enthalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Komplexen vorliegen, z.B. mit Cyclodextrinen wie etwa a, ß oder y -Cyclodextrin.
Für therapeutische Anwendungen hängt die verabreichte Dosis vom Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, von der Art und der Schwere der Erkrankung, von der Art der Behandlung, von der Häufigkeit der Verabreichung und der Art der gewünschten Wirkung ab. Die tägliche Dosis der aktiven Verbindung ist üblicherweise 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht. Normalerweise sind 0, 1 bis 40 und vorzugsweise 0,5 bis 20 mg/kg/Tag in einer oder mehreren Dosen ausreichend, um die gewünschten Wirkungen zu erzielen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die im nachfolgenden beschriebenen Beispiele erläutert werden.
Beispiele
1 . Materialien und allgemeine Arbeitstechniken
Die UV-Absorption wurde entweder mit einem Perkin-Elmer UV/VIS Spektrometer Lambda 10 oder mit einem Varian Carey 100 Bio bestimmt. IR-Messungen wurden an einem Gerät der Firma Perkin-Elmer durchgeführt. Die Massenspektren wurden durch Laser-Desorption (MALDI), Chemische Ionisation (Cl) oder Electrospray Ionisation (ESI) erhalten. HPLC-ESI-MS Massenspektren wurden mit einem Gerät der Firma Finnigan vom Typ LCQ in Kombination mit dem HPLC-System Hewlett Packard HP 1 100 (Säulenmaterial Nucleosil 100 5C18) durchgeführt. Die ESI-Spektren werden in der Form „X (Y) [M + Z\" angegeben, wobei die Molekülmasse X mit der Intensität Y % detektiert wurde. X entspricht dabei dem Anlagerungsprodukt aus dem untersuchten Molekül mit dem Molekulargewicht M und dem Kation Z+.
Die Schmelzpunkte wurden an einer Apparatur nach Dr. Tottoli, Büchi 510, bestimmt und sind nicht korrigiert.
HPLC-Trennungen wurden mittels /?eι erse -P/7ase-Chromatographie an Geräten der Firmen Beckmann (System Gold, Hochdruckpumpenmodul 1 26, UV-Detektor 1 66) oder Pharmacia Biotech (Äkta Basic 1 0/1 00, Autosampier A-900) durchgeführt. Die UV-Detektion erfolgte meist bei 220 nm. Es wurden folgende Säulen verwendet: YMC-Pack ODS-A (250 x 20 mm, S-5
1 2 nm und 250 x 4,6 mm, S-5 μm, 1 2 nm). Als Eluent dienten Laufmittelgemische aus Acetonitril und Wasser mit jeweils 0, 1 % Trifluoressigsäure (TFA) im Gradientenbetrieb.
Dünnschichtchromatographische Kontrollen (DC-Kontrolle) und Rf-Wert-Bestimmungen wurden mit Merck DC Kieselgel 60 F-254 Aluminium-Folien durchgeführt. Die Detektion erfolgte durch UV-Absorption
bei 254 nm und/oder durch 5%ige ethanolische Ninhydrinlösung und/oder ein wässriges Cer-(IV)-sulfat/Molybdänsäurebad (Lösung aus 6,25 g Phosphormolybdänsäurehydrat, 2,5 g Cer-(IV)-sulfat und 1 5 ml Schwefelsäure in 235 ml Wasser) und jeweils anschließender Wärmebehandlung.
Alle technischen Lösungsmittel wurden vor Gebrauch destilliert und bei Bedarf nach den gängigen Verfahren absolutiert.
Die eingesetzten Reagenzien stammten von den Firmen E. Merck, Fluka, Sigma, Aldrich und entsprachen der Qualität „zur Synthese" oder „per analysis" und wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet. Das Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (TCP-Harz) wurde von der Firma PepChem (Tübingen) und das TentaGel-Harz von der Firma Rapp Polymere bezogen. Die Harze Rink-Amid, MBHA und Wang stammten von der Firma Novabiochem. Die Aminosäuren, falls diese nicht selbst synthetisiert wurden, HOBt und Fmoc-Cl kamen von den Firmen Alexis, Advanced Chemtech, Bachern, Neosystem, Novabiochem oder Senn. Aminosäuren und Palladium/Aktivkohle waren Stiftungen der Firma Degussa-Hüls.
Säulenchromatographische Trennungen wurden mit Kieselgel 60 bzw. 40 (63-200 μm bzw. 40-63 μm) der Firma Merck und 1 ,0-1 ,4 bar Überdruck durchgeführt. Die Rohsubstanzen wurden für gewöhnlich auf Kieselgel 60 (63-200 μm) aufgezogen.
Sämtliche luft- oder hydrolyseempfindliche Reaktionen wurden in ausgeheizten Glasgeräten unter einer Argonatmosphäre (99,996 %) durchgeführt. Das Entfernen des Luftsauerstoffs aus Reagenzien erfolgte durch Behandlung der Probe im Ultraschallbad mit anschließendem Durchleiten von Argon.
Die Peptidsynthese wurde entweder manuell oder auf einem Multisynthec Syro Il-Synthesizer ausgeführt. Manuelle Peptidkupplungen wurden bei größeren Ansätzen in Schüttelgefäßen aus Glas (sogenannte „Enten") durchgeführt. Bei kleinen Harzmengen erfolgten die Kupplungen in den handelsüblichen 2 ml, 5 ml oder 10 ml Einmalspritzen der Firma Becton-Dickinson . Die hierfür nötigen PE-Fritten stammten von der Firma Vetter Labortechnik.
Reaktionen an fester Phase wurden ebenfalls in 2 ml, 5 ml, 1 0 ml oder 20 ml Einmalspritzen der Firma Becton-Dickinson durchgeführt. Die hierfür nötigen PE-Fritten stammten von der Firma Vetter Labortechnik. Die Durchmischung der Harzsuspension erfolgte durch Rotation der Kunststoffspritzen. Typischerweise wurde 1 ml gequollenes Harz dreimal mit je 5 ml Lösungsmittel für 5 min gewaschen. Um bei Festphasenreaktionen sowohl die Reaktionsäquivalente als auch die Ausbeute berechnen zu können, wurde entweder die UV-spektroskopisch bestimmte, gravimetrisch bestimmte oder die vom Hersteller angegebene Belegung verwendet.
Bei luft- und feuchtigkeitsempfindlichen Reaktionen wurden die Reaktionslösungen unter absoluten Bedingungen in einem mit Septum verschlossenen Spitzkolben vorgelegt. Mittels einer Kanüle wurden sie anschließend in eine mit Harz befüllte Kunststoffspritze überführt. Festphasenreaktionen bei höheren Temperaturen führte man in ScΛoft-Druckflaschen durch. Hierbei wurde ein Papiertuch mit dem verwendeten Lösungsmittel angefeuchtet und mit der Spritze in die Flasche gelegt. Mit Hilfe eines temperierbaren Trockenschranks wurde das Reaktionsgefäß auf die gewünschte Temperatur erwärmt. Ferner verwendete man auch kombinierte Heiz- und Schüttelapparaturen der Firma Advanced ChemTech. In diesen Fällen wurden die Reaktionen entweder in 2 ml bzw. 4 ml Schraubflaschen oder in kleinen Glasapparaturen mit Rückflusskühler durchgeführt.
Bei lichtempfindlichen Reaktionen wurde sowohl während der Reaktionsdurchführung als auch bei der Lagerung direkte Lichteinstrahlung vermieden . Dazu umhüllte man sämtliche Reaktions- und Aufbewahrungsgefäße mit Alu-Folie.
Die log P-Werte wurden nach Crippen et al. (J. Chem. Comput. Sei. 27 (1 987), 21 ) oder nach Broto (Eur. Med. Chem. - Chim. Theor. 1 9 ( 1 984)) mit dem Computerprogramm CS ChemDraw Pro (CambridgeSoft) bestimmt.
Alle 1H-NMR und 13C-NMR Spektren wurden mit den Geräten AC250, DMX500 und DMX600 der Firma Bruker aufgenommen. Das Prozessieren der NMR-Daten erfolgte an Bruker Aspekt. 1000 (AC250) bzw. Silicon Graphics Indy-, O2- und Octane-Arbeitsstationen bzw. auf Origin-Servern. Die chemischen Verschiebungen (δ) sind relativ zu Tetramethylsilan in parts per million (ppm) angegeben. Als interner Standard wurde entweder Tetramethylsilan oder der Lösungsmittelpeak verwendet: DMSO-d5: 2,49 ppm (1 H-NMR) und 39,5 ppm (13C-NMR); CHCI3: 7,24 ppm (1H-NMR) und 77,0 ppm (13C-NMR).
Sämtliche Experimente zur Zuordnung der Protonen- und Kohlenstoffresonanzen sowie zur Strukturbestimmung wurden an den Hochfeldgeräten DMX 500 und DMX 600 durchgeführt. Dabei wurden Proben, mit DMSO als Lösungsmittel, durch mehrmaliges Einfrieren in flüssigen Stickstoff und anschließendem Auftauen im Hochvakuum von gelöstem Sauerstoff befreit. Die Probenröhrchen wurden unter Vakuum abgeschmolzen. Die Standardmesstemperatur betrug bei den zweidimensionalen Experimenten 300 ° K. Die verwendeten Pulsprogramme stammen entweder von Bruker oder wurden von Arbeitskreismitgliedern selbst geschrieben. In Abhängigkeit von den spektroskopischen Eigenschaften der Proben wurden die Sendefrequenzen SFO1 sowie die spektrale Breiten (SW) der Experimente in beide Dimensionen angepasst. Die 90 ° Pulslängen sowie die sich daraus ergebenden Pulse und delays
wurden für jede Messreihe neu bestimmt. Um Wasserstoffbrücken- gebundende NH-Protonen zu ermitteln, wurde bei den Cyclopeptiden eine Temperaturreihe aufgenommen. Dazu wurden 1 H-Spektren bei 305 ° K, 31 0 ° K, 31 5 ° K, 320 ° K und 325 ° K aufgenommen.
Die Adhäsionsassays führte man in 96iger Mikrotiterplatten der Firma Corning durch. rhVCAM-1 stammte von R&D Systems. MAdCAM wurde aus dem Überstand transfizierter 293T-Zellen gewonnen. Der Maultier-A anti-human IgG wurde von Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. hergestellt. Der Fluoreszenzfarbstoff H33342 wurde von der Firma Calbiochem bezogen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Cytofluor 2300 der Firma Millipore gemessen. Zur einheitlichen Durchführung der Adhäsionsassays mussten die Verbindungen in DMSO gelöst. Die Stammlösungen hatten eine Konzentration von 1 mg/10 /I und wurden bei -20 ° C aufbewahrt.
2. Synthesevorschriften
2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften
2.1.1 Lösungssynthese von Phenylamid-Derivaten
Zu einer eisgekühlten Lösung aus Carbonsäure-Derivat (5,0 mmol), Anilin-Derivat (5,0 mmol) und 1 -Hydroxybenzotriazol (HOBt) *H2O (0,76 g, 6,5 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (THF) (10 ml) wird langsam
Λ -Ethyl-Λ,Λ '-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDCI) *HCl (1 , 1 5 g, 6,5 mmol) und Λ/-Methylmorpholin (NMM) (1 ,32 ml, 1 2,0 mmol) hinzugefügt. Durch weitere Zugabe von NMM wird der pH-Wert auf 7-8 eingestellt. Man entfernt das Eisbad und lässt die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) rühren. Nach dem Entfernen des Lösungsmittel im Vakuum, wird der Rückstand in Essigsäureethylester (20 ml) gelöst und mit H2O ( 1 x 20 ml), wässriger HCI-Lösung (pH 3, 2 x 20 ml), 5%iger,
wässriger NaHCO3-Lösung (2 x 20 ml) und H2O ( 1 x 20 ml) gewaschen. Anschließend wird die organische Phase über MgSO4 getrocknet und bis zur Trockne eingeengt.
2.1.2 Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe
Das Harz ( 1 g) wird für 5 min mit 10 ml Dimethylformamid (DMF) gequollen. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgt mit 20%iger Piperidin/DMF Lösung (2 x 10 ml, 1 5 min). Das Harz wird anschließend mit DMF (5 x 1 0 ml, je 3 min) gewaschen.
2.1.3 Kupplungen mit O-( 1 H - Benzotrϊazol- 1 -yl ) -N , IM , N \ N \ - tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU)/HOBt
Das harzgebundene, freie Amin wird mit N-Methylpyrrolidon (NMP) (3 x je 3 min) gewaschen und anschließend mit einer 0, 1 -0,25 M Lösung aus Fmoc-geschützter Aminosäure (3 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung), TBTU (3 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung), HOBtΗ2O (3 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung) und Diisopropylethylamin (DIPEA) (9 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung) in NMP versetzt. Die Kupplungsdauer beträgt 60 min. Das Harz wird anschließend mit NMP (5 x je 3 min) gewaschen.
2.1 .4 Kupplungen mit O-{ 7-Azabenzotriazol- 1
- tetramethyluronium-hexafiuorophosphat (HATU)/ 1 -Hydroxy-7- azabenzotriazol (HOAt)
Das harzgebundene, freie Amin wird mit NMP (3 x je 3 min) gewaschen und anschließend mit einer 0, 1 -0,25 M Lösung aus Fmoc-geschützter . Aminosäure (3 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung), HATU (3 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung), HOAt (3 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung) und syττ7-Collidin (30 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung)
in NMP versetzt. Die Kupplungsdauer beträgt 60 min. Das Harz wird anschließend mit NMP (5 x je 3 min) gewaschen.
2.1.5 Kupplungen mit /V,/V'-Diisopropylcarbodiimid (DIC)
Das harzgebundene, freie Amin wird mit NMP (3 x je 3 min) gewaschen und anschließend mit einer 0, 1 M Lösung der entsprechenden Säurekomponente (10 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung) und DIC ( 1 5 Äquiv. bezogen auf die Harzbelegung) in NMP versetzt. Die Kupplungsdauer beträgt 4 h. Das Harz wird anschließend mit NMP (5 x je 3 min) gewaschen.
2.1.6 Festphasensynthese linearer Peptide mit Fmoc/tBu- Schutzgruppenkombination
Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe der harzgebundenen Aminosäure und die Kupplung einer weiteren Fmoc-Aminosäure erfolgt nach folgendem Schema:
Wird die Synthese an einer Stelle unterbrochen, so wäscht man das Harz mit DMF (5 x 10 ml, je 3 min), CH
2CI
2 (5x 10 ml, je 3 min) und trocknet es im Vakuum. Vor der Abspaltung des Peptids vom Harz wird die letzte Fmoc-Schutzgruppe analog der Schritte 1-3 des Fließschemas entfernt.
2.1.7 Abspaltung seitenkettengeschützter Peptide vom TCP-Harz
Das Harz (0,6 g) wird zunächst mit CH2CI2 (3x10 ml, je 5 min) gewaschen und dann 1 h mit einem 8:1:1 Gemisch aus CH2CI2: Trifluorethanol (TFE):HOAc (10 ml) versetzt. Man wäscht das Harz wird mit einem 8:1:1 Gemisch aus CH2CI2:TFE:HOAc (3 x 10 ml, je 5 min). Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum eingeengt und der Rückstand dreimal mit Toluol koevaporiert. Abschließend lyophilisiert man das vollgeschützte Peptid aus ter .-Butanol.
2.1.8 Abspaltung vollständig entschützter Verbindungen vom Wang-Harz
Das Harz (0,6 g) wird zunächst mit CH2CI2 (3x 10 ml, je 5 min) gewaschen und dann mit einem 95:2,5:2,5 Gemisch aus TFA:Triisopropylsiian (TIPS):H2O (10 ml) für 1 h versetzt. Das Harz wird mit einem 95:5 Gemisch TFA:H2O gewaschen (3x 10 ml, je 5 min). Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum eingeengt und der Rückstand dreimal mit Toluol koevaporiert.
2.1.9 Synthese von 2-(2-Nitro-phenylamino)-3-alkyl/aryl- propionsäure-Derivaten an der Festphase
Das harzgebundene Fluor-Nitro-Benzoesäurederivat wird zunächst mit DMF (3 x je 5 min) gewaschen und anschließend mit einer 1M Lösung aus dem Natrium-Salz einer Aminosäure (50 Äquiv.) in DMF:H2O (2:1) versetzt. Man läßt die Harzsuspension ü.N. bei 60 °C schütteln. Danach wird das Harz mit DMF (3 x je 5 min), CH2CI2 (3 x je 5 min) gewaschen und im Vakuum
getrocknet. Wird hingegen ein Amin als Nukleophil verwendet, so setzt man eine 1 M Lösung des Amins (50 Äquiv.) in DMF ein.
2.1.10 Reduktive Alkylierung an der Festphase nach Krchnak et al. (Mol. Diversity 1 (1995), 149-164)
Das freie, harzgebundene Amin wird mit trockenem DMF (3 x je 5 min) und Trimethylorthoformiat (TMOF) (3 x je 5 min) gewaschen und anschließend mit einer 0,17 M Lösung aus dem entsprechenden Aldehyd (5 Äquiv.) in TMOF versetzt. Nach 5 h wäscht man das Harz mit CH2CI2 (3 x je 5 min) und füllt eine 0,1 M Suspension Natriumtriacetoxyborhydrid (5 Äquiv.) in CH2CI2 in die Spritze ein. Nach 16 h wird das Harz mit DMF (3 x je 5 min) und CH2CI2 (3 x je 5 min) gewaschen. Das Trocknen des Harzes erfolgt im Hochvakuum.
2.2 Synthetisierte Verbindungen
2.2.1 Verbindungen (399)
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentylamino}-3-/7-tolyl- propionsäure (399)
Fmoc-(3-Amino-3- -toIyl-propionsäure)-TCP-Harz (213,1 mg, approx.0,6 mmol/g, 127,9 /mol) ergab nach den Vorschriften 2.1.2, 2.1.10, 2.1.4 und 2.1.8 HPLC-Reinigung und Lyophilisieren das TFA-Salz von 399 (399-1: 22,8 mg, 33 %, 399-2: 20,3 mg, 29 %) als farblosen Feststoff. C26H31N3O3*TFA: 433,54*114,02 g/mol; Log P: 4.19
399-1: 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,19 (br. s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,86 (d, 1H, J= 9,6 Hz), 8,59 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,22 (d,
1H, J = 8,3 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,38
(d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,19 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 4,50-4,44 (m, 1H),
4,43-4,36 (m, 1H), 3,11-3,02 (m, 2H), 2,86-2,80 (m, 1H), 2,76-2,69 (m, 1H), 2,27 (s, 3H), 1,66-1,47 (m, 2H), 1,33-1,26 (m, 2H), 0,86 (t, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 22,69 ESI-MS: m/z 905,5 (32) [2M + K+], 889,9 (23) [2M + Na+], 456,3 (46)[M + Na+], 434,3 (82) [M + H+].
399-2: 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,58 (br. s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,91 (d, 1 H, J, = 9,6 Hz), 8,61 (s, 1 H), 8,27 (d, 1 H, J = 8,3 Hz), 8,22 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,41 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 7,26 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 4,68-4,61 (m, 1H), 4,53-4,43 (m, 1H), 3,13 (dd, 2H, J = 16,5, 5,2 Hz), 3,00-2,89 (m, 3H), 2,32 (s, 3H), 1,64-1,54 (m, 1H), 1,53-1,45 (m, 1H), 1,32-1,17 (m, 1H), 0,85 (dd, 6H, J = 12,2, 6,5 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 22,84 ESI-MS: m/z 905,2 (53) [2M + K+], 889,1 (45) [2M + Na+], 456,1 (100) [M + Na+], 434,1 (77) [M + H+].
2.2.2 Verbindungen (300), (512) und (513)
Fmoc-Asp(tBu)-Thr(tBu)-Wang-Harz (0,345 mmol/g) bzw. Fmoc-Leu-Asp(tBu)-Thr(tBu)-Wang-Harz (0,372 mmol/g) ergab nach 2.1.2, 2.1.5, 2.1.9 und 2.1.8 Lyophilisieren und HPLC-Reinigung folgende gelbe Feststoffe als TFA-Salze:
2-({1-[5-(Benzylamino)-2-nitrophenyI]carboxamido}-3-methylbutyl)carbox- amido]-2-carboxyethyl}-carboxamido)-3-hydroxybutansäure (300):
Ausbeute: 71 %; C28H35N5O10*TFA: 601,61*114,02 g/mol; Log P: n.d.
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,45 (br. s, 2H), 9,20 (t, 1H, 5,7 Hz), 8,94 (d, 1H, J = 8,3), 8,67 (d, 1H, 2,6 Hz), 8,41 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,10 (dd, 1H, J = 9,6, 2,6 Hz), 7,44 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,37-7,25 (m, 4H), 6,77 (d, 1H, J = 9,1 Hz), 4,88 (br. s, 1H), 4,71-4,65 (m, 1H), 4,58-4,49 (m, 3H), 4,18-4,09 (m, 2H), 2,76 (dd, 1H, J = 16,5, 5,7 Hz),
2,54 (dd, 1 H, J = 16,5, 7,8 Hz), 1 ,78-1 ,54 (m, 3H), 1 ,02 (d, 3H, 6,5 Hz), 0,90 (dd, 6H, J = 13,9, 6,5 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 24,46 ESI-MS: m/z () [2M + K+], () [2M + Na+], () [M + Na+], 602,0 () [M + H+].
2-[(2-Carboxy-1-{[1-({5-[{1-carboxy-2-phenylethyl)amino]-2-nitrophenyl}- carboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}ethyl)carboxamido]-3- hydroxybutansäure (512-1):
Ausbeute 52 %; C30H37N5O12*TFA:659,64*114,02 g/mol; Log P: n.d.
HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 17,98; ESI-MS: m/z 660,1 [M + H+].
2-[(1-{[1-({2-amino-5-[(carboxymethyl)amino]phenyl}carboxamido)-3- methylbutyl]carboxamido}-2-carboxyethyI)carboxamido]-3- hydroxybutansäure (512-2):
C23H33N5O10*TFA:539, 54*114,02 g/mol; Log P: n.d.
2-[(2-Carboxy-1-{[1-({4-[(1-carboxy-2-phenylethyl)amino]-3-nitrophenyl}- carboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}ethyl)carboxamido]-3-hydroxy- butansäure (513-1):
Ausbeute 40 %; C30H37N5O12*TFA:659,64*114,02 g/mol; Log P: n.d. HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 21,09
2-[(2-Carboxy-1-{[1-({4-[(carboxymethyl)amino]-3-nitrophenyl}- carboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}ethyl)carboxamido]-3-hydroxy- butansäure (513-2):
Ausbeute 22 %; C23H31N5O12*TFA:569,52*114,02 g/mol; Log P: n.d. ESI-MS: m/z 570,1 [M + H+].
2-[(1 -{[1 -({3-Amino-4-[(carboxymethyl)amino]phenyl}-carboxamido)-3- methylbutyl]carboxamido}-2-carboxyethyl)carboxamido]-3-hydroxybutans äure (512-3):
Ausbeute 32 %; C23H33N5O10*TFA:539, 54* 1 14,02 g/mol; Log P: n.d. HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 1 6,60.
2.2.3 Verbindungen 351
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}-Λ - phenyl-bernsteinsäureamid-Derivate (351 ):
Die Sequenz lsochinolin-3-carbonsäure-Leu-Asp(tBu)-OH (494,2 mg, 1 ,08 mmol) wurde nach 2.1 .2, 2.1 .3 und 2.1 .7 am TCP-Harz synthetisiert. Die lyophilisierte Verbindung wurde in trockenem THF (2, 1 6 ml) gelöst und man fügte HOBt*H2O (21 5, 1 mg, 1 ,40 mmol, 1 ,3 Äquiv.) hinzu. Jeweils 0,54 ml dieser Lösung (0,27 mmol) wurde unter Ausschluß von Luftfeuchtigkeit zu den entsprechenden Anilin-Derivaten (0,27 mmol) zugetropft. Die auf 0 ° C abgekühlten Lösungen wurden mit EDCI *HCI (67,3 mg, 0,351 mmol, 1 ,3 Äquiv.) und NMM (71 ,3 μ\, 0,648 mmol, 1 ,85 Äquiv.) versetzt und mit NMM auf pH 7-8 eingestellt. Gemäß 2.1 .1 wurde das Eisbad entfernt und die Lösungen über Nacht bei RT gerührt. Aufgrund der kleinen Mengen wurde auf eine weiteren Aufarbeitung verzichtet. Der Rückstand wurde nach 2.1 .8 entschützt und mittels HPLC aufgereinigt. Man erhielt die farblosen TFA-Salze der folgenden Verbindungen:
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}-Λ/- phenyl-bernsteinsäureamid (351 -1 ):
Ausbeute: 23 %; C26H28N405*TFA:476,52* 1 14,02 g/mol; Log P: 2,06
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,32 (br. s, 1H), 9,91 (s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,84 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,80 (d, 1H, J = 8,2), 8,58 (s, 1H), 8,26 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,20 (d, 1H, 8,8 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,67 (d, 2H, J = 7,7 Hz), 7,32 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 7,06 (t, 1 H, J = 7,7 Hz), 4,80-4,74 (m, 1 H), 4,71 (m, 1 H), 2,79 (dd, 1 H, J = 16,5, 5,5 Hz), 2,61 (dd, 1H, J = 16,5, 8,8 Hz), 1,74-1,59 (m, 3H), 0,93 (t, 6H, J = 6,0 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = min; ESI-MS: m/z 477,1 (43) [M + H+].
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}- - phenyl-bernsteinsäureamid (351-2):
Ausbeute: 13 %; C26H28N4O5*TFA:476,52*114,02 g/mol; Log P: 2,060
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,39 (br. s, 1H), 9,94 (s, 1H), 9,42 (s, 1H), 8,82 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,63 (d, 1H, J = 7,7), 8,59 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,21 (d, 1H, 8,2 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,62 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,31 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 7,06 (t, 1H, J = 7,1 Hz), 4,77-4,66 (m, 2H), 2,79 (dd, 1H, J = 16,5, 6,0 Hz), 2,62 (dd, 1H, J = 16,5, 8,2 Hz), 1,73-1,59 (m, 3H), 0,92 (dd, 6H, J = 8,2, 5,5 Hz); ESI-MS: m/z 477 ',1 (33) [M + H+].
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}-Λ-o- tolyl-bernsteinsäureamid (351-3):
Ausbeute: 13 %; C27H30N4O5*TFA:490,55*114,02 g/mol; Log P: 2,55
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,39 (br. s, 1H), 9,41 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 8,87 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,76 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 8,53 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,18 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,89 (t, 1H, 7,7 Hz), 7,83 (t, 1H, 7,7 Hz), 7,38 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,20-7,12 (m, 2H), 7,07 (t, 1H, J = 7,1 Hz), 4,84-4,78 (m, 1H), 4,75-4,69 (m, 1H), 2,82 (dd, 1H,
J = 16,5, 6,0 Hz), 2,65 (dd, 1H, J = 16,5, 8,2 Hz), 2,13 (s, 3H), 1,77-1,60 (m, 3H), 0,93 (t, 6H, J = 6,6 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 23,68 min; ESI-MS: m/z 491,0 (44) [M + H+].
3-{2-[(IsochinoIin-3-carbonyl)-amäno]-4-methyI-pentanoylamino}-/\Λo- tolyl-bernsteinsäureamid (351-4):
Ausbeute: 8 %; C27H30N4O5*TFA:490,55*114,02 g/mol; Log P: 2,55 1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,39 (br. s, 1H), 9,42 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 8,83 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,67 (d, 1H, J = 7,1 Hz), 8,57 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,20 (d, 1H, 8,2 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,39 (d, 1H, 7,7 Hz), 7,20 (d, 1H, J = 7,1 Hz), 7,15 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,08 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 4,82-4,76 (m, 1H), 4,75-4,69 (m, 1H), 2,82 (dd, 1H, J = 16,5, 6,0 Hz), 2,65 (dd, 1H, J = 16,5, 7,1 Hz), 2,16 (s, 3H), 1,77-1,60 (m, 3H), 0,92 (dd, 6H, J = 7,1, 6,0 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 23,98 min; ESI-MS: m/z 491,0 (15) [M + H+].
3-{2-[{lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}-yV-/77- tolyl-bernsteinsäureamid (351-5):
Ausbeute: 15 %; C27H30N4O5*TFA:490,55*114,02 g/mol; Log P: 2,55
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,38 (br. s, 1H), 9,79 (s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,85 (d, 1H, J= 8,2 Hz), 8,79 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 8,57 (s, 1H), 8,27 (d, 1 H, J, = 8,2 Hz), 8,19 (d, 1 H, J = 7,7 Hz), 7,90 (t, 1 H, J = 7,7 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,1 Hz), 7,51-7,44 (m, 2H), 7,22-7,16 (m, 1H), 6,88 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 4,78-4,63 (m, 2H), 2,79 (dd, 1 H, J = 16,5, 5,5 Hz), 2,61 (dd, 1H, J = 16,5, 8,8 Hz), 2,27 (s, 3H), 1,74-1,59 (m, 3H), 0,96-0,89 (m, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 24,91 min; ESI-MS: m/z 491,0 (34) [M + H+].
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}-/V-/?- tolyl-bernsteinsäureamid (351-6):
Ausbeute: 12 %; C27H30N4O5*TFA:490,55*114,02 g/mol; Log P: 2,55
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,36 (br. s, 1H), 9,81 (s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,84 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,78 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,57 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 8,21 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,55 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,12 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 4,79-4,73 (m, 1H), 4,70-4,64 (m, 1H), 2,78 (dd, 1H, J = 16,5, 5,5 Hz), 2,60 (dd, 1H, J = 16,5, 8,2 Hz), 2,25 (s, 3H), 1,74-1,59 (m, 3H), 0,93 (t, 6H, J = 6,0 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,67 min.
3-{2-[(lsochinolin-3-carbonyl)-amino]-4-methyl-pentanoylamino}-y\/-/j- tolyl-bernsteinsäureamid (351-7):
Ausbeute: 7 %; C27H30N4O5*TFA:490,55*114,02 g/mol; Log P: 2,55
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,37 (br. s, 1H), 9,83 (s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,82 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,61 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 8,58 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 8,21 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,83 (t, 1 H, J = 7,7 Hz), 7,50 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,11 (d, 2H, 8,2 Hz), 4,76-4,65 (m, 2H), 2,77 (dd, 1H, J = 16,5, 6,0 Hz), 2,60 (dd, 1H, J = 16,5, 8,2 Hz), 2,25 (s, 3H), 1,73-1,58 (m, 3H), 0,92 (dd, 6H, J = 8,2, 6,0 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,82 min; ESI-MS: m/z 491,1 (28) [M + H+].
2.2.4 Verbindungen 386, 181, 187, 188, 189
Die Synthese wurde an einem vollautomatischen Syntheserobotor SyRo II durchgeführt. Mit den entsprechenden Fmoc-Aminosäuren belegtes
TCP-Harz bzw. Wang-Harz ergab nach 2.1 .2, 2.1 .3, 2.1 .6 und 2.1 .8 HPLC-Reinigung und Lyophilisieren folgende Verbindungen als TFA-Salze:
386-1 H C25H27N304 433.50 434.2 3.11 n.d.
386-2 H C25H27N304 433.50 3.11 n.d.
188-1 4-C3H7 C28H33N30 475.58 476.1 27.68 4.34 38%
188-2 4-C3H7 C28H33N304 475.58 476.1 28.43 4.34 43%
189-3 3-N02 C25H26N406 478.50 479.1 24.70 n.d. 42%
189-4 3-N02 C25H26N406 478.50 479.1 25.17 n.d. 39%;
189-1 2-N02 C25H26N406 478.50 479.1 24.44 n.d. 58%
189-2 2-N02 C25H26N406 478.50 479.1 25.10 n.d. 56%
189-5 4-N02 C25H26N406 478.50 24.71 n.d. 47%
189-6 4-N02 C25H26N406 478.50 25.33 n.d. 41% '
374-1 4-COOH C26H27N306 477.51 478.1 20.95 2.67 17%, ;
374-2 4-COOH C2fiH27N306 477.51 478.1 21.14 2.67 4%
3-{[1-(3-lsochinoIylcarboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}-3-(2- methylphenyDpropionsäure (181-1):
Ausbeute: 44 %; C26H29N3O4*TFA:447,53* 1 14,02 g/mol; Log P: 3,60
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,27 (br. s, 1 H), 9,37 (s, 1 H), 8,74 (d, 1 H, J = 8,3 Hz), 8,66 (d, 1 H, J = 8,7 Hz), 8,55 (s, 1 H), 8,25 (d, 1 H, J = 7,8 Hz), 8, 19 (d, 1 H, J = 8,3 Hz), 7,88 (t, 1 H, J = 7,4 Hz), 7,81 (t, 1 H, J = 7,8 Hz), 7,36 (d, 1 H, J = 7,8 Hz), 7,20-7,09 (m, 3H), 5,44-5,37 (m, 1 H), 4,71 -4,63 (m, 1 H), 2,65 (d, 2H, J = 7,4 Hz), 2,35 (s, 3H), 1 ,69-1 ,55 (m, 3H), 0,97-0,89 (m, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,21 min.
3-{[1-(3-lsochinolylcarboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}-3-{2- methylphenyDpropionsäure (181-2):
Ausbeute: 49 %; C26H29N3O4*TFA:447,53*114,02 g/mol; Log P: 3,60
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,28 (br. s, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,82 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,69 (d, 1H, J = 9,1 Hz), 8,58 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 8,21 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,31 (d, 1 H, J = 7,4 Hz), 7,20-7,10 (m, 3H), 5,44-5,37 (m, 1H), 4,73-4,66 (m, 1H), 2,73-2,61 (m, 2H), 2,36 (s, 3H), 1,61-1,44 (m, 3H), 0,87 (dd, 6H, J = 13,0, 5,7 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,86 min.
3-{[1-(3-lsochinolylcarboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}-3-(3- methylphenyUpropionsäure (181-3):
Ausbeute: 31 %; C26H29N3O4*TFA:447,53*114,02 g/mol; Log P: 3,60
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,31 (br, s, 1H), 9,38 (s, 1H), 8,71 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,68 (d, 1H, J = 9,1 Hz), 8,56 (s, 1H), 8,25 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,19 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,88 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,82 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,21-7,11 (m, 3H), 7,03 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 5,17 (q, 1H, J = 7,8 Hz), 4,72-4,64 (m, 1H), 2,79 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 2,70-2,67 (m, 1H), 2,26 (s, 3H), 1,73-1,56 (m, 3H), 0,97-0,90 (m, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,35 min.
3-{[1-(3-lsochinolylcarboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}-3-(3- methylphenyDpropionsäure (181-4):
Ausbeute: 31 %; C26H29N3O4*TFA:447,53*114,02 g/mol; Log P: 3,60
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,25 (br, s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,76 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 8,73 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 8,59 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 8,21 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,3 Hz), 7,20 (t, 1H, J = 7,3 Hz), 7,14-7,08 (m, 2H), 7,04 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 5,18 (q, 1H, J = 7,7 Hz), 4,73-4,67 (m, 1H), 2,75-2,64 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 1,65-1,48 (m, 3H), 0,88 (t, 6H, J = 6,0 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,91 min.
3-{[1-{3-lsochinolylcarboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}-3-(4- methylphenyUpropionsäure (181-5):
Ausbeute: ?? %; C26H29N3O4*TFA:447,53*114,02 g/mol; Log P: 3,60
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,16 (br, s, 1H), 9,37 (s, 1H), 8,68 (t, 2H, J = 9,3 Hz), 8,54 (s, 1H), 8,24 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,18 (d, 1H, 8,3 Hz), 7,89-7,85 (m, 1H), 7,83-7,78 (m, 1H), 7,19-7,10 (m, 3H), 7,01 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 5,16 (q, 1H, J = 15,1, 7,8 Hz), 4,70-4,63 (m, 1H), 2,70-2,65 (m, 2H), 2,24 (s, 3H), 1,69-1,55 (m, 3H), 0,94-0,89 (m, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 24,38 min.
3-{[1-(3-lsochinolylcarboxamido)-3-methylbutyl]carboxamido}-3-(4- methylphenyUpropionsäure (181-6):
Ausbeute: ?? %; C26H29N3O4*TFA:447,53*114,02 g/mol; Log P: 3,60
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,18 (br, s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,76 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,73 (d, 1H, J = 9,1 Hz), 8,59 (s, 1H), 8,27 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,21 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,90 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,83 (t, 1H, J = 7,0 Hz), 7,20 (t; 1H, J = 7,4 Hz), 7,13-7,08 (m, 2H), 7,04 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 5,21-5,14 (m, 1H), 4,73-4,67 (m, 1H), 2,74-2,63 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 1,65-1,49 (m, 3H), 0,91-0,86 (m, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 25,03 min.
3-(4-Ethylphenyl)-3-{[1-(3-IsochuinolyIcarboxamido)-3-methylbutyl]carbox- amido-propionsäure (187-1):
Ausbeute: 35 %; C27H31N3O4*TFA:461 ,55*114,02 g/mol; Log P: 4,01
11H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,16 (br, s, 1H), 9,36 (s, 1H), 8,70-8,65 (m, 2H), 8,54 (s, 1H), 8,24 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 8,18 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,90-7,85 (m, 1H), 7,83-7,78 (m, 1H), 7,23 (d, 2H, J = 7,0 Hz), 7,12 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 5,20-5,13 (m, 1H), 4,70-4,62 (m, 1H), 2,71-2,64 (m, 2H), 2,55-2,50 (m, 2H), 1,69-1,54 (m, 3H), 1,14-1,09 (m, 3H), 0,94-0,89 (m, 6H); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 26,71 min;
3-(4-Ethylphenyl)-3-{[1-(3-lsochinolylcarboxamido)-3-methylbutyl]carbox- amido-propionsäure (187-2):
Ausbeute: 31 %; C27H3lN3O4*TFA:461, 55*114,02 g/mol; Log P: 4,01
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 12,23 (br, s, 1H), 9,39 (s, 1H), 8,73 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,71 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,58 (s, 1H), 8,25 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,91-7,86 (m, 1H), 7,84-7,80 (m, 1H), 7,21 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,14 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 5,17 (q, 1H), 4,72-4,66 (m,1 H), 2,75-2,62 (m, 2H), 2,55 (q, 2H, J = 7,6 Hz), 1 ,63-1 ,46 (m, 3H), 1,14 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 0,87 (dd, 6H, J = 14,2, 5,7 Hz); HPLC (5-80 % in 30 min) Rt = 27,45 min.
3. Biologische Evaluation
3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften für Adhäsionsassays mit σ4-lntegrin-exprimierenden Zellen
Adhäsionspuffer
Der Adhäsionspuffer besteht aus Click 's RPMI Medium, 1 %
Rinderserumalbumin (BSA), 1 ,0 mM MgCI2 und 1 ,0 mM CaCI2
Tris Buffer Saline (TBS-Puffer) für Mn2+-Stimulation
Der 1 x TBS-Puffer besteht aus Tris ( 14 mM), NaCI (1 37 mM) und KCl (2,7 mM), Glucose (2 mM) und Mn2 + ( 1 mM) .
Medium für 38C1 3ßr und 38C1 3ß7-Zellen Click 's RPMI-Medium (2,5 l) werden mit FCS (35 ml), Glutamin (5 ml) und ß-Mercaptoethanol (1000 X, 0.5 ml) versetzt.
Medium für Jurkat-Zellen
Click 's RPMI-Medium (2,5 I) werden mit fetalem Kälberserum (FCS) (35 ml) und Glutamin (5 ml) versetzt.
38C1 3ß7-Zellen
B Zell-Lymphom aus der C3H/He Maus, infiziert mit Lß7SN Virus und mit
G41 8 selektiert (Strauch et. al, Hu et. al) .
38C1 3ßr und 38C1 3ß7-ZeIlen in Kultur
Täglich wird ca. 2/3 der Zellösung abgesaugt und wieder mit neuem Medium aufgefüllt. Die Zellkulturen werden in einem Wärmeschrank bei 37 ° C aufbewahrt.
Beschichtung der Mikrotiterplatten mit VCAM
Es wird eine Stammlösung von rekombinantem humanem (rh) VCAM (75 μ\, 0,5 μglμX) mit PBS ( 1 2,5 ml) verdünnt und auf eine 96-Loch Mikrotiterplatte aufgetragen (0,3 μg rhVCAM in 100 /I PBS pro Loch). Die Mikrotiterplatte wird über Nacht bei 4 ° C inkubiert.
Beschichtung der Mikrotiterplatten mit MAdCAM-1
Es wird eine Maultier-Anti-Human IgG-Stammlösung (48 μl, 1 ,3 //g/μl) mit PBS ( 1 2,5 ml) verdünnt und auf eine 96-Loch Mikrotiterplatte aufgetragen (0,5 μg Maultier-Anti-Human IgG in 100 μ\ PBS pro Loch). Die Mikrotiterplatte wird über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Anschließend wäscht man die Platte mit Adhäsionspuffer (1 x 1 00 /l/Loch) und inkubiert sie 30 min bei RT mit MAdCAM-Überstand (je nach Konzentration des MAdCAM-Überstands 100-1 50 l/Loch).
3.2 Zellbasierter Adhäsionsassay für cr4-lntegrin-exprimierende Zellen
Es wurden folgende Adhäsionsassays durchgeführt: 38C1 3ß7-ZeIlen auf MAdCAM-beschichteten Platten, 38C1 3ß7-Zellen auf VCAM-beschichteten Platten und Jurkat-Zellen auf VCAM-beschichteten Platten.
Vorbereitung der Mikrotiterplatten:
Die mit VCAM oder MAdCAM beschichteten Mikrotiterplatten wurden mit Adhäsionspuffer gewaschen ( 1 x 1 00 l/Loch) und anschließend mit Adhäsionspuffer für 1 h bei RT blockiert.
Vorbereitung der Zellen:
Die entsprechende Zellsuspension ( 1 2,5 ml) wurde 3 min bei 1 500 Upm zentrifugiert, mit PBS ( 1 x 5 ml) gewaschen und abermals 3 min bei 1 500 Upm zentrifugiert. Man resuspendierte die Zellen in Adhäsionspuffer (3 ml) und inkubierte die Zellsuspension 30 min bei 37 ° C mit einem Fluoreszenzfarbstoff (H33342, 6 μ\). Die Zellsuspension wurde 3 min bei
1 500 Upm zentrifugiert, mit PBS/1 mM EDTA (5 ml) gewaschen, bei 1 500 Upm für 3 min zentrifugiert und in PBS ( 10 ml) resuspendiert. Nach dem Zählen der Zellen wurden diese abermals 3 min bei 1 500 Upm zentrifugiert und in einer entsprechenden Menge Adhäsionspuffer gelöst (ca. 8 * 1 05 Zellen/ml) .
Durchführung des Adhäsionsassays:
Die Zellsuspension (350 μ\, ca. 8* 105 Zellen/ml) wurde mit der entsprechenden Substanz (3,5 μ\ aus der Stammlösung, 1 mg/1 O μl DMSO) 1 0 min bei 37 ° C inkubiert und anschließend auf die Platte aufgetragen (3 x je 100 μ\). Man zentrifugierte die Mikrotiterplatten für 1 0 min bei 1 5 g und analysierte sie im Fluorimeter. Die Mikrotiterplatten wurden 30 min bei 37 " C im Brutschrank inkubiert, in ein PBS-Bad eingetaucht und mit einer Klebefolie die einzelnen Löcher abgeklebt. Die Mikrotiterplatte wurde invers 1 0 min bei 50 g zentrifugiert. Von der invertierten Platte zog man die Klebefolie ab und drückte sie auf einem Zellstoffpapier aus. Die immer noch invertierte Mikrotiterplatte wurde mit einer Pasteur-Pipette ausgesaugt. Die Mikrotiterplatte wurde nun wieder umgedreht, mit Adhäsionspuffer befüllt ( 1 00 μl/Loch) und im Fluorimeter vermessen. Die Auswertung erfolgte mit Micosoft Excel".
3.3 Resultate
Die Inhibierung der Zelladhäsion an entsprechende Liganden ist in den nachfolgenden Tabellen 1 bis 4 gezeigt. Die Messwerte sind auf die Adhäsion von Zellen bezogen, die nicht mit einem Antagonisten vorinkubiert wurden (entsprechend 100 % Zelladhäsion).
Tabelle 1 zeigt die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen 300, 51 2-1 , 51 2-2, 51 3-1 , 513-2 und 513-3. Interessanterweise zeigt
Verbindung 300 sowohl eine effektive Inhibierung von σ4ß7/MAdCAM-1 als auch von σ4ß.,/VCAM-1 Wechselwirkungen. Im Vergleich dazu zeigt
Verbindung 512-1 eine selektive Inhibierung der σ4ß7/MAdCAM-1 Wechselwirkung.
Tabelle 2 zeigt die biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen 518, 351-1, 351-2, 351-4, 351-5, 351-6 und 351-7.
Die Verbindungen sind in der Lage, die σ4ß7/MAdCAM-1 und teilweise auch die σ4ß7/VCAM-1 Wechselwirkungen zu inhibieren. Verbindung 351-5 wurde als Diastereomeren-Gemisch getestet, da eine Qiastereomeren- Auftrennung mittels HPLC nicht möglich war. Somit stellt der Messwert einen Mittelwert aus den biologischen Aktivitäten der jeweiligen Diastereomeren dar.
Tabelle 3 zeigt die biologische Aktivität der Verbindungen 386-1, 386-2, 181-1, 181-2, 181-3, 181-4, 181-5, 181-6, 187-1,187-2, 189-1, 189-2, 189-3, 189-4, 189-5, 189-6, 374-1 und 374-2.
Die Verbindungen 386-1 und 374-2 weisen eine deutliche Selektivität für die σ4ß7/MÄdCAM-1 Wechselwirkung auf.
Tabelle 4 zeigt die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen 399-1 und 399-2. 399-1 kann die cr4ß7/MAdCAM-1 Wechselwirkung vollständig und die σ4ß7/VCAM-1 Wechselwirkung teilweise inhibieren. Unter den Testbedingungen kann 399-1 die α^J VCAM-l Wechselwirkung nicht inhibieren. Dem gegenüber weist das andere Diastereomer 399-2 keine Selektivität bezüglich der verwendeten Testsysteme auf und kann die σ4ß7/MAdCAM-1, α4ß7/VCAM-1 und σ^/VCAM-l Wechselwirkung inhibieren.
Tabelle 1
Tabelle 2
Zelladhäsion [%]
Struktur Verbindung α4ß7/ α4ß7/ 4ß7/ α4ßl/ M-CAM M-CAM VCAM VCAM verdünnt
351-1 R=H 74 ±22 117 ±3 104 ±6 n.d.
351-2 R=H 43 ±12 79 ± 14 102 ±7 n.d.
351-3 R=2-CH3 92 ± 23 116 ±9 103 ±7 n.d.
351-4 R=2-CH3 24 ±10 92 ± 22 101 ±3 n.d.
351-5 R=3-CH
3 47 ± 7 86 ±10 89 ±19 86 ±25
351-6 R=4-CH3 53 ± 24 93 ±18 101 ±6 22 ± 8
351-? R=4-CH3 26 ±7 51 ±37 98 ±13 25 ±19
Tabelle 3
Zelladhäsion [%]
Struktur Verbindung 4ß7/ 4ß7/ 4ßl/ MAdCAM-1 VCAM-1 VCAM-1
386-1 R=H 21 ±2 80 ±23 99 ±3
386-2 R=H 26 ±9 37 ±20 80 ±27
181-1 R=2-CH3 60 ±26 79 ±21 n.d.
181-2 R=2-CH3 19±4 27 ±6 n.d.
. 181-3 R=3-CH3 44 ±1 66 ±15 n.d.
181-4 R=3-CH3 15±5 12±4 n.d.
181-5 R=4-CH3 47 ±8 65 ±5 n.d.
189-2 R=2-NO2 23 ±7 42 ±22 n.d.
189-3 R=3-NO2 9±6 16 ±5 n.d.
189-4 R=3-NO2 n.d. n.d. n.d.
189-5 R=4-NO2 72 ±22 73 ±14 n.d.
189-6 R=4-NO2 20 ±8 13 + 10 n.d.
374-1 R=4-COOH 65 ±10 88 ±3 86 ±15
374-2 R=4-COOH 23 ±4 96 ±7 78 ±25
Tabelle 4
Hemmung der Zelladhäsion (%'
Verbindung 4ß7/ α4ß7/ α4ß1/ α4ß7/ MAdCAM VCAM-1 VCAM-1 MadCAM wprHnnnt
399-2 11±3 18±6 19±5 29±11
399-1 10±4 41 ±0 71±14 16±7