JPS61181396A - 精製蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、遺伝子工学的手法によりて造成される蛋白質
を精製されたものとして得る方法に関する。さらに具体
的には、本発明は、組換えＤＮＡ技術によりて所望外来
性蛋白質を産生ずるように形質転換されたダラム廃性微
生物を培養したのち、この微生物から所望外来性蛋白質
を回収・＃製する方法に関するものである。

先行技術 現在までに１天然のあるーは人工的に合成された蛋白質
やペプチドを精製する方法は種々開発されてｂる。例え
ばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ
ーある込はこれらを種々組合せた方法等〔放置「生化学
実験横座／タン生 バク質の化学工」日本踊学会編、東京化学同人刊（／９
１２　）参照〕があり、精製する蛋白質ある偽はペプチ
ドの性質にあわせて適宜選択され使用されている。

一方、ここ数年来、遺伝子工学の発展はめざましく、こ
の手法を利用して有用蛋白質あるいはペプチドを製造す
る方法が確立されつつぁシ、既に多数の提案がなされて
いる（特開昭５１１−／７≠３％、同Ｓｇ−／１０４０
０．同５ｒ−ｉｔｉｉ７ｙｔ、同１ｇ−／７０７９Ｌ同
５♂−／　７４Ｌ３りｔ１同Ｅｌｆ−２／９／タタ号各
公報等）。

このような遺伝子工学的手法による蛋白質あるいはペプ
チドの製造方法は、一般に、微生物（大腸菌、枯草菌ま
たは酵母菌等）に所望外来性蛋白質あるいはペプチドを
コードする遺伝子を組込んで形質転換体を造成し、これ
を培養したのち、所望蛋白質を回収することよシなるも
のである。ここで形質転換体を培養すると−うことは、
宿主微生物体内（以下微生物を単に「菌」と記すことも
ある）で所望蛋白質あるいはペプチドを宿主菌本来の蛋
白質と融合した形で発現させるか（例えば特開昭ｊ４Ｌ
−タコ６りぶ号公報参照。以下この方法を「雑種蛋白法
」という）、あるいは所望蛋白質のみを発現させる（以
下、この方法を「直接発現法」という）　（Ｎａｔｕｒ
ｅ、　ｍｌ　ｊ４’４！　（／り７り）〕ということで
ある。

ところで、このような遺伝子工学的手法によって産生さ
れた蛋白質あるいはペプチドを精製する場合は、従来の
天然のある込は人工的に合成された蛋白質やペプチドの
精製方決をこのまま適用することができない。何故なら
ば、雑種蛋白法によれば、産生された所望蛋白質には余
分な蛋白質ないしアミノ酸が付着しているので、このま
までは等電点、分子量、各種溶媒に対する溶解度、立体
構造等の化学的性質の相違や、菌体内生体内条件の違い
による夾雑蛋白やペプチド成分の相違があるからである
。なお、従来の＋［法を応用すべく臭化シアン処理（５
ａｉｓｎａｓ　、ヱｑ、　ｔｏｚｇ　（ｉり７７）〕や
トリプシン消化法（Ｎａｔｕｒｅ　、　２１！！、弘ｒ
ｔ＜１ｙｒｏ）〕るが、ｂずれの処理方法も特定のアミ
ノ酸部分で切断（臭化シアン処理はメチオニンのＣ端側
で、トリプシン消化はリジンやアルギニンのＣ端側で、
各り切れる）されるので所望蛋白質にこれらのアミノ酸
が含まれる場合には応用できなり０一方、直接発現法に
よれば、上記雑種蛋白法と異なりで天然と同様の蛋白質
を得ることができるものの、物質によってはＮ末端に余
分なアミノ酸（メチオニン）が付着してＡる場合（例え
ば５ｖ４ｔｏｔ抗原（Ｎｕｃｌｅｌａ　　Ａｃ１ｄａ　
　Ｒ＠ａ、、　Ｌ　弘０３７（／り１０））、β−グロ
ビン（Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｅｔ、　
ＵＳＡ、　７６　。

！タタＡ（／り７り）〕等）もあって、前記と同様の問
題点があるからである。

さらにまた、前記遺伝子工学的手法によシ製造した蛋白
質のＩ／ｆＩ製は、通常、宿主菌（形質転換体）を培養
し、ついで適当な時期に宿主菌を破壊したのち、菌体が
本来産生じている雑多な物質の中から所望蛋白質を抽出
精製していたため、多大な労力が必要であるうえ、精製
困難な物質もあった。

その上、菌体内で産生された所望蛋白質は菌にとっては
異種蛋白質であるから、このような蛋白質は菌自体のペ
プチダーゼ（プロテアーゼ）ニよって水解される可能性
もあｉ）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−８ａ
ｉ、　ＵＳＡ、　　７９、ｔｒｓｏ−／ｅ３３（／ｙｒ
２）　’ｌ　、その蛋白質の迅速な回収方法の確立が望
まれていた。

一つの解決策 ごく最近になって、これらの諸問題に対処すべく、本発
明者らの共同研究者らによりて「蛋白質の製造法」（特
願昭！ターｌ！り７０３号）（以下、先願発明■とい５
）が提案された。

この先願発明■による蛋白質の製造法は、下記の工程か
らなるものである。

（１）所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を含む遺伝子を
用意すること。

（２）　　シグナルペプチドをコードする遺伝子であり
て、その遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質
の構造遺伝子を結合させ得るもの、を含み、かつ予定し
た宿主細胞内で増殖可能なベクターを用意すること。

（３）所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を含む遺伝子と
上記ベクターとを用いて、予定した宿主細胞内で増殖可
能な組換体ＤＮＡをｉ！１４製すること。

（４）この組換体ＤＮＡを用いて宿主細胞の形質転換を
行なりて、形質転換体を調製すること。

（５）　　この形質転換体を培養して、産生された所望
の外来性蛋白質を回収すること。

この先願発明■の方法を一興体例によって説明すれば以
下の通シになる。まず、プラスミドとして、アルカリ性
ホスファターゼ由来のプロモーターをコードする遺伝子
およびシグナルペプチドをコードする遺伝子（以下、シ
グナル配列ということがある）をＪｉ４Ｖ＝ｔ、、かつ
、このシグナル自己タリの直後に所望外来性蛋白質をコ
ードする遺伝子の結合が可能なプラスミドｐＴＡ／ｊｕ
りを造成する。

ついで、ｐＴＡ／ｊλりに外来性蛋白質をコードする遺
伝子〔例えばヒト上皮細胞成長因子（ｈＵＧ／ＥＧＦ、
以下単にｈＵＧと記す）〕を組込んでキメラプラスミド
（ｈＵＧの構造遺伝子を組込んだものｐＴＡ／九ｔ〕を
造成し、このプラスミドを用いて微生物の形質転換を行
う。そして、このようなプラスミドによって形質転換さ
れた微生物を培養すれば、まず、宿主細胞内で外来性蛋
白質が発現され、ついで、この蛋白質はシグナル配列の
作用で菌体外に分泌される。ここで「菌体外に分泌され
る」というのは、宿主菌が大腸菌のようなダラム陰性菌
においては、蛋白質が菌体内からペリプラズム（細胞膜
と外膜との空間）に移行することを意味する。そして、
上記先願発明■では蛋白質が菌体外に分泌されるときに
シグナル配列は膜酵素シグナル・ペプチダーゼによりて
氷解されるので、シグナル配列の直後に結合していた蛋
白質が余分なアミノ酸を伴うことなく完全な成熟蛋白質
として菌体外に分泌されるのである。

したがって、このような先願発明■によれば、形質転換
された微生物は所望蛋白質を効率よく菌体外へ分泌する
ことができるので、上記諸問題を解決することができた
。しかしながら、先願発明■では、菌体の工業レベルの
大量培養およびその大−瞼培養された雌体よシ所望蛋白
質の抽出・精製方法は確立されていなかりた。

その後、この二つの問題のうち菌体の工業レベルの大量
培養方法が、先願発明■とは別の本発明者らの共同研究
者らによって二つ提案された（特願昭ｊターλ７りｊｒ
ｔおよび同！ター２７りｓｒ’ｙ号）このうち、後者が
時間およびコストの点で前者より好ましい（以下、後者
を先願発明■とする）。

この先願発明■による微生物の培養法は、アルカリ性ホ
スファターゼ由来のプロモーターを具備するプラスミド
の咳プロモーターの制御下に外来性蛋白質をコードする
遺伝子を組込んで造成したキメラプラスミドによって形
質転換した微生物を、微生物の増殖過程において対数増
殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘導
がおこるに必要な量の無機燐な含有する培地での培養に
付すことからなるものである。

このような先願発明■および先願発明■を組合せること
によって、所望蛋白質を産生ずるように形質転換された
微生物に効率よくかつ大：ｉｔＫ蛋白質を産生させる方
法が確立された。しかしながら、前記の二つの問題の他
方、すなわちこのように量産化させた蛋白質を回収し、
さらに精製すること、Ｋついては適当な方法が確立され
ていなりのが現状である。従って、先願発明■および■
と組合せるべく、量産化された蛋白質の回収・精製方法
の確立が望まれていた。

発明の概要 要旨 本発明は、上記の点に解決を与えることを目的とし、組
換えＤＮＡ技術によシ形質転換された菌体に所望蛋白質
を効率よくかつ大量に産生される方法（先願発明■と先
願発明■とを組合せた方法）に、従来から知られている
クロマトグラフィー法を巧みに組合せた系を導入するこ
とにより所望蛋白質を効率よく回収・精製するという方
法を完成して上記問題点を解決するに至った。

従って、本発明による精製蛋白質の装造法は、下記の工
程よシなること、を特徴とするものである。

Ａ、　　（（）シグナルペプチドをコードする遺伝子で
あってその遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白
質の構造遺伝子を結合させ得るもの、を含み、かつ予定
した宿主細胞内で増殖可能なベクターに、所望外来性蛋
白質をコードする遺伝子を組込み、（ロ）この組換体に
よってダラム陰性微生物を形質転換させ、０→得られる
形質転換された微生物を、微生物の増殖過程において対
数増殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の
誘導がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地での培
養に付したのち、これを集め、（ニ）ついでこの微生物
をオスモティック・ショック法によって処理することに
より所望外来性蛋白質を含む画分な回収すること。

Ｂ１回収された所望蛋白質を含む画分をイオン交換クロ
マトグラフィーに付したのち、所望外来性蛋白質画分を
回収すること。

Ｃ９上記で回収された所望外来性蛋白質を含む画分をさ
らに高速液体クロマトグラフィーに付したのち、所望外
来性蛋白質画分を回収すること。

効果 このように、本発明は、先願発明■と先願発明■とを組
合せた方法のうち、シグナル配列〔蛋白質・核酸・酵素
、鼾、Ｊｆｔ〜３９μ（／り？ｌ）〕　の機能を巧みに
利用して所望蛋白質をペリプラズムに分泌するように形
質転換されたダラム陰性菌（先頭発明■）を大量培養（
先願発明■）したのちの、所望蛋白質を回収・ｆｌｌｆ
［する方法に関するものである。

従って、本発明の蛋白質の精製法によれば、前記問題点
を回避して先願発明■および■に生得の利点を含めて下
記の利点を享受することができる。

（イ）所望蛋白質の精製が簡単である。

従来の遺伝子工学的手法によって産生させた蛋白質の精
製法によれば、形質転換された宿主菌の生育を行い、適
当な時期に宿主菌を破壊したのち、菌が本来持っている
雑多の物質中から所望蛋白質の回収・精製を行っていた
ので、多大な労力が必要であり、また精製困難な物質も
あった。

これに対して本兄明は、先願発明■を利用してペリプラ
ズムに余分なアミノ酸が付着していたＡ型で所望蛋白質
が蓄積するように形質転換された微生物を造成し、つい
でこの形質転換体を先願発明■に係る方法で大証培養す
ることによって菌体中のペリプラズムに所望蛋白質を効
率よく分泌蓄積させたのち、所望蛋白質をオスモティッ
ク・ショック法（Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　
２４１０．３６１１（／りＡｓ）　）によって容易ＫＭ
体外に放出させて所望外来性蛋白質を含む画分（以下「
オスモティック上清）として得、この画分をイオン交換
クロマトグラフィーおよび高速液クロマトグラフイーに
付すことによ）精製された所望蛋白質を得るものである
。。

従って、先願発明■と■との組合せによって効率よくか
つ大量にペリプラズムに分泌された天然製蛋白質であっ
て、容易に菌体外に放出されオスモティック上清として
回収されたものは、上清の構成成分が判りているうえ、
この画分には他の余分な夾雑蛋白も少ない等の点から、
これにつづくクロマトグラフィーによって容易に所望蛋
白質として精製することができる。

（ロ）精製コストを低減することができる。

従来からの遺伝子工学的手法により産生された蛋白質を
ｆｌｌｓｔする場合は、一般に前処理（すなわち上記し
たように菌体を破壊する操作と、これにつぐ所望蛋白質
の回収操作を含む工程）が必要であシ、特に菌体な破壊
後の雑多な物質の中から所望物質を得るには、予めクロ
マトグラフィー等によって所望画分を部分子＃製する必
要があった。これに対し本発明は、上記したように菌体
を破壊することなく所望蛋白質を含む画分（オスモティ
ック上清）を得ることができるので前処理を必要とせず
、上清をイオン交換クロマトグラフィーに付すだけで所
望蛋白質を含む画分の濃縮および所望蛋白質の部分子＃
製が可能となシ、さらにつづく高速液体りロマトグラフ
ィー忙よって短時間で完全に所望蛋白質を精製すること
ができる。

従って、前処理工程を要せず、また操作が容易なイオン
交換クロマトグラフィーおよび試料を迅速に処理できる
扁速液体クロマトグラフィーに付すだけで所望蛋白質が
精製されるので、労力を省くことができ、かつｆＲ製期
間を短縮することも可能なので、所望蛋白質の精製コス
トを低減することができる。

発明の詳細な説明 本発明による蛋白質の＃Ｉ製法は、前記の工程Ａ〜Ｃの
結合からなるものである。

工程Ａ−オスモティック上清の調製 この工程は、形質転換体の造成および培養ならびに所望
外来性蛋白質の取得に係るものである。

具体的には、先願発明■に係るベクターであってこれに
所望外米性蛋白質をコードする遺伝子を組込んだものに
よυグラム陰性菌を形質転換して形質転換体を得、つい
でこれを培養（先願発明■）したのち、雌体をオスモテ
ィック・ショック法による処理に付すことによシ、所望
外来性蛋白質を含む画分（オスモティック上清）を得る
。

／、形質転換体の造成 本発明に用いる形質転換体の造成は、組換えＤＮＡ技術
の分野における公知の常法に従って行うことができる。

すなわち、所望外来性蛋白質をコードする遺伝子を組込
んだベクター（先願発明■に開示されたもの）を造成し
、このベクターを用いて公知の常法（例えばクシュナー
法（ＧｏｎｓｔｌｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　、　　／
２７ｇ、／７（／り７ｇ）〕　　に従って微生物を形質
転換したのち、所望形質転換体を取得〔通常は形質転換
体に移入されたプラスミドのマーカー（アンピシリン耐
性、テトラサイクリン耐性等）を利用して所望形質転換
体を選択する〕する、という方法によって行うことがで
きる。

（１）ベクター 先願発明■のベクター、すなわち「シグナルペプチドを
コードする遺伝子であってその遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を結合させ得るもの
、を含み、かつ予足した宿主細胞内で増殖可能なベクタ
ーＪとは、例えばｐＴＡ　／ｊ２タ　（先願発明■）で
ある。ここでｐＴＡｌ！２りは、ｐＴＡｊｉλり（ｐ￥
に２ｒＪ　（Ｅ−ｃｏｌｔ　　Ｋ／２Ｃ６００（ｐＹＫ
２１３　）として倣工研に寄託（微工研条薔第ｊｊ４号
）〕をもとにしてこれを特願昭５ざ一／≠０７弘♂号の
明細書に記載の方法に従って造成したもの）とｐＨ８／
（このプラスミドは、ｐＢＲＪｕｊ　［：Ｅ、ａｏｌｌ
に／２Ｃ４００（ｐＢＲｊｕｕ）として微工研に寄託（
微工研条を第２３！号）〕を匍」限酵素１ｃｏＲＩおよ
びＨｌｎｄｍで消化し、このＥｃ　ｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ
　ＩＩＩ部分を下記の合成リンカ−（１）と置換したも
の（特開昭！ターフ／ｚ９コ号公報参照））とから造成
したものである。このプラストの造成繰作は慣用のもの
であって、その詳細は先願発明■の明細書を参照された
込。

Ｅ　ａｏＲＩ　　　　Ｈｐａｌ　　　　　Ｓｍａｌ　　
　　　Ｈ１ｎｄｍここで破線は制限酵素切断部位を示し
、ＥａｏＲＩ等はその切断を行５制限酵素の名称を示す
。

このｐＴＡ／ｊλりは下記の塩基配列（ｎ）からなるＤ
ＮＡ部分を含むので、シグナルペプチド遺伝子ドする遺
伝子（以下、シグナルペプチド遺伝子ということがある
）の直後に外来蛋白質をコードする遺伝子の結合が可能
である。

配列（ＩＩ）はシグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡ部分（
１）とその下流側に結合されたＤＮＡ部分（２ンとから
なってｂるが、本発明でいう「シグナルペプチドをコー
ドする遺伝子であってその遺伝子の下流側末端直後に所
望の外来性蛋白質の構造遺伝子を結合させ得るもの」と
は、このようなりＮＡ部分を含むものである。なお、本
発明においてＤＮＡに関して［下流側Ｊとい５ときは、
！′→３′鎖（ｅ鎖）を上に３′←ｊ′鎖（ｅ鎖）を下
に表示したとき伝子の一部を示すものであって、Ａ％Ｇ
１ＣおよびＴはそれぞれアデニン、グアニン、シトシン
およびチミンを示し、（前記のＩも同様）Ｌｙａ、Ａｌ
ａおよびＴｒｐはそれぞれリジン、アラニ／およびトリ
プトファンを示す。この二本鎖ＤＮＡの区域（１）はシ
グナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡ部分であシ、区域（３）
は制限酵素Ｈ１ｎｄ　ＩＩＩの認識部位であシ、破線は
Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ切断部位である。区域（２）は、シグ
ナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡの下流側の直後に結合され
たＤＮＡ部分である。

本発明の好ましい具体例は、シグナル・ペプチド遺伝子
ＤＮＡがアルカリ性フォスファターゼ由来であるもので
ある。このＤＮＡは、下流側末端のアラニンのコドンが
ＧＣＣである。

一方、上記塩基配列（ＩＩ）は、アルカリ性フォスファ
ターゼ由来の遺伝子ＤＮＡの部分（１）の下流側末端の
アラニンのコドンＧＣＣをＧＣＴに、さらに続く塩基Ｃ
をＴに改変したものに相当する。アラニンのコドンには
縮重があるから、改変後のＧＣＴもアラニンのコドンで
あシ、従って上記（ｎ）のＤＮＡ部分（１）は依然とし
てアルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル・ペプチ
ドをコードする遺伝子に対応するＤＮＡである。

ところで、アルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル
・ペプチド遺伝子ＤＮＡは、その下流側末端のアラニン
のコドンの上流側にリジンのコドンＡＡＡおよび下流側
にアルギニンのコドンＣＧＧを有する。

従って、アルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル・
ペプチド遺伝子ＤＮＡが本来有していた下流末端のアラ
ごｌのコドンＧＣＣをＧＣＴに改変し、さらにアラニン
に続く塩基ＣをＴＫ改変したことによりそ、この末端の
塩基対と、上流側のび塩基対および下流側のｌ塩基対と
で制限酵素Ｈ１ｎｄ　ｍの認識部位（３）ＡＡＧＣＴＴ
が現出して騒る。すなわち、シグナル・ペプチド遺伝子
ＤＮＡには、少なくとも該末端の塩基対を構成員の少な
くとも一部とする制限酵１ｇ認識部位が創出されている
訳である。

ｐＴＡ／ｊコタの上記（ＩＩ）の具体例では、Ｈ１ｎｄ
■の認識部位（３）内の切断部位は破線で示した通シで
あって、その位置はシグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡと
その下流側直後に結合されていることあるべきＤＮＡ部
分（上記ｐＴＡｊコタに係る塩基配列（ｎ）では、既に
結合されている区域（２））との間に存在している（切
断部位の位置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味す
る）。制限ｅ＃素切断部位がこのような位置に存在する
ことは、本発明において最も好ましいことである。何故
ならば、この切断部位はそれを利用して外来遺伝子（に
対応するＤＮＡ）をこのシグナル・ペプチドをコードす
る遺伝子（に対応するＤＮＡ）Ｋ直結するためのもので
あシ、一方この雑積遺伝子が発現して生じる雑褌ないし
融合蛋白はシグナル・ペプチドとそれに続く蛋白との間
でシグナル・ペプチダーゼによって切断されるのである
から、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダーゼ切断
位置とがこのように一致していれば、上記ｐＴＡ／ｊλ
りの例でいえば外来遺伝子（この例では、Ｔｒｐのコド
ンＴＧＧで始まっている）のｅ鎖のよ′−側にＡＧＣＴ
を補なりておくだけで、Ｈｌｎｄ　ｍ消化後のシグナル
・ペプチド遺伝子の釉層末端との間の結合が可能だから
である。なお、外来性遺伝子のｅ鎖の３′−側にも塩基
を補なうことを厭わなければ、制限酵素切断部位が上流
側に存在してもよいことは込うまでもなく、そのような
切断部位の存在するベクターもまた本発明に用いられる
ベクターの範囲内である。

「シグナル・ペプチドをコードする遺伝子」は、一般に
シグナル・ペプチドの咳類に応じて各種の塩基配列のも
のがある。シグナル・配列の具体例をいくつか挙げれば
、β◆ラクタマーゼのもの（Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃ１ｄ、　Ｓａｌ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、７！、　
Ｊ７Ｊ７　（ｌｙｙｒ　）　：ｌ、リボ蛋白のもの（：
　ｔｂｔｄ％ｙａ、／　００４１（／り７７））、アル
カリ性フォスファターゼのもの（Ｅｕｒ、　　Ｊ、　Ｂ
ｌｏｃｈａ、　、ＩＬ％ｕり（ｌり７り）〕等がある。

シグナル・ペプチドについては、「蛋白質・核酸・酵素
」臨時増刊号（「遺伝子操作」）、第−巻、第弘号、第
３ｒぶ一３２弘頁、を参照することができる。しかしな
がら、本発明で使用する好まし込シグナル配列は、アル
カリ性フォスファターゼの塩基配列のもの、特にアルカ
リ性フォスファターゼ由来のもの、である。このよ５な
シグナル配列全具備する上記プラスミドであれば、先願
発明■（後記）の培養方法を利用することにより前記し
たような利点が得られるからである。

上記（ｎ）　Ｋ示した本発明に用いるプラスミド（ベク
ター）が具備するＤＮＡ遺伝子の一具体例は、アルカリ
性フォスファターゼ由来のＤＮＡを改変してつくったも
のであるから、シグナル・ペプチド遺伝子ＤＮＡの部分
（１）の下流側末端直後にアルカリ性フォスファターゼ
由来のＤＮＡ部分（２）が結合している。本発明による
ＤＮＡ遺伝子の他の具体例は、このＤＮＡ部分（２）が
外来蛋白をコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分であ
るものである。

制限酵素切断部位を等大した目的からいって、ＤＮＡ部
分（２）が外来性遺伝子出来のものである具体例の方が
本発明の趣旨に泊りた具体例であるということができる
。

この後者の具体例の範鴫に属する本発明に用いるプラス
ミドが具備するＤＮＡ遺伝子の一例は、シグナル・ペプ
チド遺伝子ＤＮＡ部分が天然物由来の部分と合成された
部分とからなるものであめ。

すなわち、制限酵素切断部位よシ上流側が天然物由来の
部分であシ、下流側が合成されたものである。この場合
の下流側の合成された部分は上記（ＩＯしたような切断
部位の位置の場合にはｅ鎖の≠塩基（ＡＧＣＴ）である
が、切断位置がこれよシ上流側に存在すれば○鎖にも合
成部分が必要となることは−うまでもない。

（２）外来性蛋白質をコードする遺伝子上記プラスミド
に組込む所望外来性蛋白質をコードする遺伝子としては
、ホルモン、免疫関連物質、神経ペプチドおよび酵素等
のものが考えられる。これらの構造遺伝子の調製方法と
しては、天然の染色体ＤＮＡよシ取得する方法や、ある
いは人工的に合成する方法等が考えられ、実際の構造遺
伝子の調製方法については種々の放蓄や文献を参照する
ことができる（前記先願発明■等）。

（３）形質転換 このようなプラスミド（ベクター）に所望外来性蛋白質
をコードする遺伝子を組込んだのち、このキメラプラス
ミドによって形質転換しうる微生物は、その菌体内で上
記プラスミドが増殖し得るものであればよく、具体的に
は大腸菌がある。なかでも大腸菌に１２株が比較的よく
利用されておシ、本発明の実施例においてその変異株Ｅ
、ａｏｌｉ　Ｋ／λＹＫ！３７（微工研菌寄第７り４ｃ
／号）を使用している。

本発明において使用したこのような形質転換体の好まし
論具体例は、プラスミドｐＴＡ／ｊコタ（前記）Ｋ人工
的に合成したｈＵＧの構造遺伝子を組込んでキメラプラ
スミドｐＴＡ／ｊコ一を造成し、ａｏｌｉ　Ｋ／ＪＹＫ
ｊＪ７（ｐＴＡ／ｊＪＪ）、）。

形質転換体造成についての詳細は後記実施例を参照され
たい。

２、微生物の培養 本発明において、上記のようＫして形質転換された微生
物の培養法は、公知の常法に従って行うこともできるが
、前記ｐＴＡ／ｊＪりのようなプラスミドを用いて込る
本発明の場合は、先願発明■を利用するのが好まし論。

とｂ５のは、前記したような利点を得ることができるか
らである。ここテ、先頭発明■とは、アルカリ性ホスフ
ァターゼ由来のプロモーターを具備するプラスミド（例
えばｐＴＡ／ｒＪＰ）に所望蛋白質をコードする遺伝子
を組込んでなるキメラプラスミド（例えばｈＵＧ構造遺
伝子が組込まれたｐＴＡ／よλ、２）Ｋよりて形質転換
されたような微生物を対象とするものであシ、そしてこ
こでの培養方法の特徴は、形質転換された微生物が保持
してｂるプラスミドの性質（無機燐量に依存して蛋白質
合成能に誘導がかかったシ、かからなかったシする〔前
記Ｂｌｏｃｈ＠ｍＢｌｏｐｈｙａ　、　Ａａｔａ、、　
Ｎａｔｕｒｅ　）　）を巧みに利用して、単−の培養系
において微生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白質
の誘導とをおこなわせるということである。すなわち、
先願発明■による微生物の培養方法は、上記形質転換さ
れた微生物の培養を「微生物の増殖過程において対数増
殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘導
がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地で行う」も
の、である。

このような培養方法は、下記の通シである。

／）培養法 微生物の培養法は、形質転換された微生物を単細胞純粋
分離培養し、ついで前培養に付したのち（以上は微生物
を培養する場合の公知の常法であシ、多数の文献や放香
を参照することができる。

例えば、放香「微生物学実験法」（講談社刊）、「微生
物実験法」（共立出版刊）、「細菌学実習提要」（丸善
刊）等がある。）、単一の培養系においてその培養を行
うことからなるものである。

この単一の培養系は通気攪拌培養の範鴫に属するもので
あって、具体的には、培養系において菌を接種したのち
培地に無菌空気（必要に応じて純酸素を混入したもの）
を導入し、これを物理的に攪拌しつつ、ｐＨ１温度、溶
存酸素濃度等を、培養する微生物の生育条件に適合させ
て好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる
。

このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアップが可能であること
はいうまでもない〔放置「生物化学工学」（上）、（下
）巻（東京大学出版会）参照〕 コ）培地 培地組成は、ＬＢ培地（トリプトン、酵母エキス、Ｎａ
Ｃ１）　　を基本培地とし、必要に応じて他の成分（例
えばＭｇ５ｏ１１・７Ｈ２０、抗生物質等）を添加した
ものでありて、さらに形質転換された微生物の増殖過程
の対数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能
の誘導を起すに必要充分量の無機燐を含有するものよシ
構成される。また、必要に応じて添加する抗生物質とし
て、本発明の具体例ではＥ、　ｃｏｌＩ　Ｋ　／２　Ｙ
　Ｋよ３７（ｐＴＡ／Ｊ−，１）を培養する場合はアン
ピシリンを添加している。

この本発明の具体例において形質転換体が保持している
プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を具備していて
、形質転換体はアンピシリン耐性となっているから、培
養中で各々プラスミドが脱落した菌（耐性がない）は培
地中のアンピシリンによって成育が抑制されるので、プ
ラスミドを保持している宿主園のみが成育することＫな
る。このように、培地への抗生物質の添加は、宿主菌の
生育上の便宜を図るための一手段である。

３）培養条件 （１）培養温度 培養温度は、使用する微生物の増殖または生育が可能で
、かつ、産生物が安定である温度であればよい。通常用
いる大Ｂ！ｋｍおよび本発明に使用した大腸菌の場合は
、３７℃が好ましい。

（２）　　培養時間 培養時間は、所望物質の産生量が最大となる時間が好ま
しい。本発明の一具体例では、約７０〜１１時間を採用
している。このような培養時間の検討は、培地中のグル
コースおよび無機燐の定量。

０ＤＧ６６の測定、生菌数の測定、産生物質の定量を指
標として行うことができる。グルコースの定量ハクルコ
ースオキシダーゼ法にューグルコスメット「フジサワ」
のキットを利用。）により、生菌数はＥ、ｃｏｌｔ　Ｋ
／２Ｙ　Ｋ　１３７　（ｐＴＡ　１！２２　）の場合に
ついていえばアンピシリンを含むＬ−培地（１４バクト
ドリプトン、ｏ、ｒ＜酵母エキス、０．！４ＮａＣＩ　
、　０．１４グルコース）の寒天上に生育するコロニー
数を測定することにより、無機燐の定量はモリブデンブ
ルー法（工場排水試験方法：ＪＩｓ　　Ｋ　　０１０２
）に従りて行い、また、産物ｈＵＧの定量は菌体をオス
モティック・シ璽ツク法〔前記Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ］によって処理後、この溶液を遠心して上清をラジオ
レセプターアッセイ（ＲＲＡ）法（Ｊ、Ｂｉｏｌ’、　
Ｃｈｅｍ、、コ！７．３ｏｔ３（ｌりｒ２）〕によ°っ
て分析することにより行った（ｈＵＧ定量の詳細は先願
発明■の明細書参照）。

（３）培地のｐＨ ｐＨは微生物の生育可能な範囲であればよく、用いられ
る微生物によって適宜好ましいｐＨを設定すればよい。

大腸菌を用いる場合には、大腸菌の生育可能なｐＨは通
常ａ、ｔ−ｒ、ｒであシ、このうちｐ　Ｈ７，０−ｒ、
０の間が特に好ましい。

（４）消泡剤 培養中発泡の著しいときは、消泡剤（高級アルの存在量
によって微生物の蛋白質合成能を制御するのであるから
、無機燐を含有しないものであることが肝要である。そ
のよ５な消泡剤の具体例とシテハ、アンチホーム−ＡＦ
−エマルジ１ン（半片化学）がある。

（５）溶存酸素（ＤＯ） 溶存酸素とは、液相中に溶解している分子状酸素のこと
をいう。

一般に通気攪拌培養に際しては、ＤＯが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、一方ＤＯがｌｐｐｍ以下になっ
ても同様に増殖が阻害されるということが知られている
。従って、ＤＯ量を微生物生育の阻害因子とならないよ
うに制御することが好ましい。本発明の一具体例の場合
はＤＯコントロール装置（オリエンタル電気■ＦＣ−μ
型）によ＃）ＤＯ量をμｐｐｍに保持している。

このよ５な培養の具体例については、後記の実験例を参
照されたい。

３、オスモティック上清の調製 オスモティック上清の調製は、上記のようにして微生物
のペリプラズムに蓄積させた蛋白質をオスモティックー
クコツク法〔前記Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｓｍ　〕によ
って蛋白質を含む画分として得ることからなるものであ
る。すなわち、まず、上記方法で培養された形質転換体
を集菌したのち、この菌体なオスモティック・ショック
法による高濃度シ冒糖液〔２０噛シユークロース、３ｏ
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨｒ、Ｏ）、１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸〕に懸濁させたのち、集菌し、さらにこ
の菌体を冷水に懸濁後、水溶中で放置することによって
所望蛋白質を含む画分を菌体外に放出させ、さらに遠心
して上清回収（オスモティック上清）する（詳細は、後
記実施例を参照されたい）。

工程Ｂ／Ｃ−クロマトグラフイ一 工程ＢおよびＣは１本発明に係る工程のうち、上記で得
られた上清画分より所望物質を精製する過程である。す
なわち、上清をまずイオン交換りａマドグラフィー（工
程Ｂ）に付して所望の蛋白質画分をある程度精製して濃
縮された画分を得て。

ついでこの画分を高速液体クロマトグラフィーに付すこ
とにより精製された所望蛋白質画分を得る（工程Ｃ）。

ここで、イオン交換クロマトグラフィーは、大量に得ら
れた上清を濃縮しかつ所望蛋白質を粗精製するという工
程であり、精製手段として高速液体クロマトグラフィー
を行う上では前処理（前記）がふつ５は必要であるとこ
ろから、この工程Ｂは高速液体クロマトグラフィーの前
処理にも相当する工程である。従って、本発明では、工
程Ｂでイオン交換クロマトグラフィーに付し。

つづく工程Ｃで高速液体クロマトグラフィーに付さなけ
ればならないのである。

ｌ、　イオン交換クロマトグラフィー この工程は、上記所望蛋白質を含む画分（上清〕から所
望蛋白質画分を分離・濃縮することを目的とするもので
ある。すなわち、上記工程Ａで調製されたオスモティッ
ク上清をイオン交換カラムに付して所望蛋白質画分をカ
ラムに吸着〔所望蛋白質画分は、溶媒のｐＨに応じてカ
チオン、アニオンあるいは両性イオンに解離し、この溶
液（試料）は、イオン交換カラムに付されると樹脂（カ
ラムの充てん剤）の表面にあるイオン交換基に結合する
〕させ、ついで所望蛋白質を溶出〔所望画分と他の画分
とのカラム中でのイオン交換基との結合の強さの差によ
る移動速度を利用する。各成分の分離能をよくするため
に勾配溶離法（ｇｒａｄｉｅｎｔ　　ｅｌｕｔｔｏｎ　
）を用いるのが通例である。〕させることによシ所望蛋
白質画分を回収する。

このようなイオン交換クロマトグラフィーな用いた蛋白
質の分離・精製方法は公知であシ、種々の放香や文献等
を参照することができる（例えば前記［生化学実験講座
ｌタンパク質の化学ＩＪ）。

すなわち、ここで用いるイオン交換樹脂は、精製しよう
とする蛋白質の安定性や溶解性（蛋白質が失活や沈殿を
起すことのないｐＨやイオン強度等）、また１等電点等
によって適宜選択する必要がある。例えば、生理活性を
有する蛋白質（ｈＵＧ、インターフェロン、成長ホルモ
ン等〕を精製する場合のイオン交換樹脂としては、解離
基としてジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）を有する基
材（粗縁維性セルロース、繊維性セルロース、微顆粒性
セルロース、セファデックス〕が考えられる。そして、
これら樹脂は種々市販されておシ、精製する物質に合っ
たものを容易に人手することができる。このような樹脂
の市販品の具体例としてｈＵＧを精製する場合は、ＤＥ
ＡＥ−セルロース■ＤＥ−ｊコ（ワットマン）やＤｇＡ
Ｅ　−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ■（東洋１達）がある。また
、カラムサイズ、カラム温度や溶出液、溶出速度等の溶
出条件は、精製する物質によって適宜変更するのが好ま
しい。なお、目的とする所望蛋白質の画分は、溶出した
各画分の吸光度および生理活性を測定しこれらのピーク
が重った画分を回収することにより得ることができる。

本発明の一具体例としてｈＵＧのイオン交換クロマトグ
ラフィーは、試料をイオン交換カラム（樹脂はＤＥＡＥ
　ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ■）に付したのち。

カラムを酢酸系の溶媒で洗浄し、ついで酢酸系の溶媒で
溶出を行うことによシ所望蛋白画分を分取することから
なるものである。なお、このよ５な所望蛋白画分は、各
溶出画分の２１０　ｎｍにおける吸光度、および活性（
ラジオリセプターアッセイ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、２！７．３０１！　　（／ＰＩコ）　〕に従って行
った〕を測定することによ多眼光度のピークと活性のピ
ークとが一致した画分を分取したものである（操作の詳
細は後記実施例を参照されたい）。

λ、高速液体クロマトグラフィー（工程Ｃ）本工程は、
前工程Ｂで分取された所望蛋白画分を完全に精製するた
めのものである。このクロマトグラフィーは、疎水性充
てん剤と水系の溶離液を用いる逆相高速液体クロマトグ
ラフィーであることが望ましい。

このような高速液体クロマトグラフィー自体は公知であ
って１種々の放香や文献、例えば（り化学増刊ｉｏｘ　
「タンパク軍・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー
Ｊ　（／９ｒｌＡ）　、東京化学同人刊。

（１１）放置「りａマドグラフィー分離システム」（１
９ｔ／）丸善刊等を参照することができる。また。

このようにして得られた所望蛋白質の精製度の確認は、
高速液体クロマトグラフィーや電気泳動等の手段によっ
て行う（後記参考例参照）のが一般的である。そして、
さらにここで得られた蛋白質の物理化学的性質（アミノ
酸組成、−次構造、二次構造等）を調べればなおさらよ
い（後記参考例参照）。

本発明の場合は、このようなりロマトグラフイーの一具
体例として、まず工程Ｂで得られた粗精製ｈＵＧ画分を
凍結乾燥し、ついでこれを溶媒（アセトニトリル、酢酸
を含む水溶液）に溶解したのち逆相系の高速液体クロマ
）／ラフ（ＨＬＣｒｏ３ｏ）に付すことＫよシ精製され
たｈＵＧ画分を、常法によシ凍結乾燥したのち、酢酸塩
として得ている（詳細は後記実施例を参照されたい）。

実施例 °工程Ａ：オスモティック上清の調製 １、形質転換体の造成 下記の方法に従って、形質転換体ＩＥ、　ｃｏｌｔ　Ｋ
／２Ｙ　Ｋ　！３７　（ｐＴＡ　／　１２２　）　　を
造成した。

ｐＴＡ　　／ｊコタ（造成の詳細は特願昭３９−／Ｊ−
２７０３号の明細書参照）！μＩを、ＳＯμｊの緩衝液
〔１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｍ　−ＨＣ
Ｉ　）（ｐＨ７，！　）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．３
０ｒｎＭ　ＮａＣ１）中でμ単位の制限酵素ａｔｎａｍ
［：タカラフ（以下Ｂｉｎｄ　ｍ　）を用いて３７℃で
１時間加水分解した。

ついで、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を、３
０ｐｌの反応液（４７，ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、
（ｐＨ１３）、＃ｊｍＭ　　硫酸アンモニウム〔以下（
ＮＨｌｌ）２８０％　）　、乙、７ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸酢酸塩下ＥＤＴＡ）　、　０．ＡｔｒｎＭずつ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄｃｒｐ　、ＴＴＰ　）中でｌ単位の’ｌ’４（−ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて１．７７℃で７３分間処理した
。ついで、エタノール沈殿によって得られた沈殿物を、
ＳＯμｊの反応液（６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ
ｒ、０　）、　６ｍＭ　ＮａＣｌ２　、　ｌｊＯｍＭ　
ＮａＣｌ　）中でｌ単位の制限酵素Ｓａｌ　Ｉ　Ｃタカ
ラフ（以下、Ｓａｌ　Ｉと記す）を用いて３７℃で１時
間加水分解した。反応終了後、アガロースゲル電気泳動
によって、３り０ＯｂｐのＤＮＡ断片（第１図中■）を
得た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＵＧ　（ｐＢＲ３２コ（Ｅ
。

ｃａｌｆ　　Ｋ／ココ　６００　＜　ｐＢＲＪココ〉と
して寄託済みく微工研条寄第２３！号＞）をＥｃｏＲＩ
および５ａｌＩで消化したものに人工的に合成したｈＵ
Ｇ構造遺伝子をＥｃｏＲＩおよび３ａｌ　Ｉで消化した
断片を組みこんだもの〕ｊμＩを、　ＳＯμｊの反応液
Ｃ１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，！　）　
、５０ｍＭ　ＮａＣｌ　、！；ＯｍＭ　ＭｇＣｌ２　］
中でｌ単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（タカラ〕を用い
て、７７℃で１時間加水分解したのち。

上記と同様にＴ４Ｚ　　ＤＮＡポリメラーゼ処理を行い
、さらＫＳａｌＩ処理を行ったのち、アガロースゲル電
気泳動によって１６０ｂｐのＤＮＡ断片（第１図中■）
を得た。

上記で調製した二つのＤＮＡ断片（第１図中■および■
）を、　３０μｊの反応液（２１）ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−
ＨＣｌ　（ｐＨ７、ｊ　）　、／（７ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．１０ｒｎＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、ＯＪｍＭＡＴＰ）中で３０
０単位のＴ４’ＤＮＡリガーゼ〔タカラ〕を用いて／＜
４”Ｃで／Ａ時間反応させた。

反応終了後、これで大腸菌に／２ＹＫ！３７を形質転換
（クシュナーの方法（Ｇｅｎ＠ｔｉｃ　Ｅｉｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ　。

／９７１．／７　（１９７１ｒ〕））　　させ、目的の
プラスミド〔以下、ＰＴＡ　１１２コ〕　（第７図中■
）を含有する形質転換株（Ｅ、　ｃａｌｌ　Ｋ／！ＹＫ
ｒＪ７　（ｐＴＡ１１２コ）〕を得た。

２、形質転換体の培養 上記形質転換された微生物Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｋ／コＹＫ
！３７　（ｐＴＡ　１１２２　）を以下のよりにして培
養した。単細胞純粋分離したＥ、　ｃｏｉｌ　Ｋ１２Ｙ
　Ｋ　１３７　（ｐＴＡ　／１２２　）−白金耳をリッ
トル当りトリプトン１０１１．酵母エキス１１．Ｎｅ、
Ｃ１ｊｌ、アンピシリン３ダからなる培地１００　ｔｎ
ｌに接種し、２００−容の坂ロコルベンで３７℃で一夜
振盪培養を行った。

次Ｋ、この培養液全量（１ａｃｅｄ　）をとり、リット
ル当シダルコース３０．９、トリプトンＪＩ、酵母エキ
ス１０１　、Ｍｇ５ＯＩＩ・７Ｈ２０／、０．９　、　
　およびアンピシリン：ｗ１９よシなる培地Ｊリットル
に接種し、３０リツトル容のジャーファーメンタ−で培
養した。

培養温度は３７℃１通気量は０．！　ｖｖｍ　（７７７
ｍはｌｖｏｌｕｍｅ　−ｖｏｌｕｍｅ−ｍｉｎｕｔｓの
ことで、１分間あたシ培養液ｌす゛ットルに対して７リ
ツトルの空気が導入されることを意味するものである。

）、ｐＨは≠Ｎ　ＮａＯＨおよび参Ｎ　ＭＣＩで乙コに
調整しておき、溶存酸素（Ｄｏ）濃度はＤｏコントロー
ル装置によシ攪拌速度を変化させて４’　ｐｐｍ付近に
保持した。培養は、グルコースおよび無機燐の定量。

生菌数の測定、ｈＵＧの産生量の測定を経時的に行うこ
とによｉ、ｈｔｒａの産生量が最大となるまで行りた。

３、オスモティック上清の調製 まず、上記培養液（にリットル）を連続遠心機５ＣＲａ
Ｂ（日立）Ｋよりテ遠心（ｔａ、ｔｏｏ　ｐ　）して菌
体（湿重量≦７２．／　＃　）を得た。ついで、この菌
体なオスモティック−シ嘗ツク法に付すため反応液ｉｏ
リットルの高濃度シ１糖液（Ｊ４シ、−クロース、ＪＯ
ｒｎＭ　Ｔ　ｒｉｍ　−ＨＣＩ　（ｐＨ１，０）、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ）　　に懸濁させた。室温でｉｏ分間放置
したのち、上記と同様に遠心して菌体を回収した。

ついで、この菌体な２Ｋｇの氷が入った４ｔ’Ｃの水（
ｒリットル）に懸濁させ、そして１０分間放置後。

上記と同様の遠心操作を行い、上清を回収して、イオン
交換りαマドに付する試料（オスモティック上清）とし
た。

工程Ｂ：イオン交換クロマトグラフィー上記オスモティ
ック上清を上記と同様の連続遠心操作に付して上清りＪ
４ＡＯｔｘｌを得て、これを試料としてイオン交換クロ
マトグラフィーを以下のよ５にして行った。

１、　イオン交換カラムの調整 カラム（直径３．２ｃｍ×長さ４０りＫ樹脂（ＤＥＡＥ
−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ■６１０　Ｍ　）を充てんし、Ｊ
ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化し
た。

２、　イオン交換カラムクロマトｊラフイー上記試料を
イオン交換カラム（カラム温度参℃）ｋ付すことｋより
カラムＫｈＵＧを吸着させ、ついで２０ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝ｍ　（ｐＨｔ、。

）２３００ｍｌでカラムを洗浄した。吸着されたｈＵＧ
の溶出は−２１）ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６
，０）　／！００ｔｎｌと２ｒＯｍＭ酢酸アンモニウム
緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）　１１００１１とのリニアグラ
ジェント（流速２ｙｄ１分）で行った。そのときのイオ
ン交換カラムクロマトダラムは、第２図に示す通りであ
る。同図中○は、各画分の吸光度（２１０ｎｍ　）を示
し、・は、各画分のラジオリセプターアッセイ（ＲＲＡ
）法による活性の強さ〔結合阻害率（憾）として表示し
たもの〕を示す。

ｈＵＧ画分として、各画分の吸光度のピークとＲＲＡ法
により測定された活性ピークとが重なっている部分を二
つ回収した。一つは分画数３／〜ＡＯ番目までの画分（
第２図中ｈＵＧ−Ｉ。以下、「ｈＵＧ−ＩＪという）で
あり、他の一つは分画数り７〜ｌＯｔ番目までの画分（
第２図中ｈＵＧ　−ＩＩ。

以下−「ｈＵＧ−ｍｌとい５〕である。

ここで、ＲＲＡ法は以下のよ５ｋして行ったものである
。

すなわち、ｈＵＧのＲＲＡはヒト鼻咽腔上皮癌細胞由来
のＫＢ細胞（ＡＴＣＣ隘ＣＣＬ／７）を用い、Ａ、キン
グ（Ｋｉｎｇ　）らの方法ＣＪ、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈａｍ、、　２！７　、３０！Ｊ　（／りｒ２）〕を
参考にして行った。すなわち、まず１００　ｍｌの７ラ
スコを用いＤＭＥ培地中で単層培養した。次に培地を除
き０，０！鴫のＫＤＴＡを含むリン酸平衡化塩溶液（Ｐ
ＢＳ）を用いて細胞をはがし細胞懸濁液を調製した。

その後、２０ｍＭ　Ｈｏｐ＠ｓ　（ｐＨ７，４’　）を
含むＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（）ＩＢＳＳ）で２回細胞
を洗浄した。

細胞をＢｉｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｄ　Ｍ　
Ｅ培地・２ｏｍＭＨａｐ＠ｓ　（ｐＨ７，４’　）　・
０．！！　１１／ｌ　ＮａＨＣｏ、５　・１００μＩ／
ｒｔｔｌ　　ストレプトマイシン）に懸濁後、細胞数を
計算して３０万〜侵万／　０，２　ｍｌＢｉｎｄｉｎｇ
　５ｏｌｕｔｉｏｎとなる様調製し、チューブに０．２
−ずつ分注した。

種々の濃度のｈＵＧおよび”Ｉ−ｍＥＧＦ　　（マウス
ＥＧＦ）を含む試料液０．２−をチーープに加えて、３
７℃で１時間インキュベートした。ついで。

細胞を氷冷したＨＢＳＳでコ回洗浄後、ガンマーカウン
メー〔アロ力Ａ　ＲＣ３００（アロカ株式会社〕〕で細
胞に結合している１２５Ｉ−ｍＥＧＦの放射活性を計測
した。これを結合阻害率（嗟）に換算したものは第２図
に示した通りである。

なお、ここで得られたｈＵＧ−ｎは、ｈＵＧ−■が上皮
細胞成長因子を構成している５３個のアミノ酸からなる
（後記）に対し、Ｃ末端から二つのアミノ酸（ロイシン
およびアルギニン）が欠落したものであったので、以下
の工程には使用しなかった。

工程Ｃ：高速液体クロマトグラフィー 上記工程Ｂで得られた画分ｈＵＧ−Ｉを下記の操作に付
すことによシ、これらの画分を精製した。

すなわち１画分ｈＵＧ−Ｉを凍結乾燥したのち、これを
ｉｏ＜アセトニトリルおよび２幅酢酸を含有する溶液Ａ
Ｏｍｌに溶解した。ついでこの溶液を遠心し、上清約Ａ
Ｏｍｌを得て、これを高速液体クロマトグラフィーに付
した。ここで高速液体クロマトグラフィーの諸条件は以
下の通シである。

高速液体クロマトグラフ：　ＨＣＬ　１０３　Ｄシステ
ム（東洋ｉ達） カラムサイズ：直径７．ｒｔｍ×長さ３０α力ラム温度
１ｊ’ｃ 流速：コｄ／分 溶離液および溶離条件： Ａ液（ＩＯ４アセトニトリル、２４酢酸）Ｂ液（１０４
アセトニトリル、２４酢酸〕溶離は、下表のようなＡ液
とＢ液濃度によるグラジェントで行りた。

検出波長：吸光度２１ｒＯｎｍ そのときのｈＵＧ−Ｉの溶出パターンは、第３図に示す
通シである。なお、同図中保持時間１７．２３分が精製
されたｈＵＧ−Ｉのピークである。

以上の本発明の工程により精製されたｈＵＧ量。

蛋白量、比活性および収率は、第１表に示す通シである
。

第１表 ｋ　ＲＲＡ法（特願昭５９−　／　Ｊ−２７０３の明細
書に記載の方法）によって計算した。

＊＊色素結合法（Ｂ１．Ｏ・ＲＡＤプａティノ・アクセ
イキットを用いて行う）により行った。

参考例 純度の検定 精製したｈＵＧの純度の検定は、常法であるポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体クロマトグラ
フィーで行った。これらの結果より、純度はタタ憾以上
であることがわかった。七のときの電気泳動の結果は第
≠図に、高速液体クロマトグラフィーの結果は第！図に
示す通シであった。なお、第≠図中（イ）は電気泳動の
ゲルを模写したものであシ、矢印（φ〕がｈＵＧのバン
ドを示し、また（口）はデンシトメトリーである。

アミノ酸組成の分析 上記ｈＵＧのアミノ酸組成の分析は、前記実施例で得ら
れた画分の一部をとり、この画分を公知の常法に従って
処理したのち、アミノ酸分析機〔ＨＬＣ−Ｊ’ｔ２ｊＡ
Ａ（東洋曹達）〕で行った。得られた結果は、第２表に
示す通りであった。この結第λ表 ☆シスチンとして定量した。

一次構造および二次構造の決定 一次構造の決定は、Ｊ、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ、、　２
ｊ＆　。

７タタ０−７タタ７（／りｒ／）　　に従って行った。

すなわち、気相プｄティンシークエンサー（アプライド
・パイオシステムズ社）を用い、試料（ｈＵＧ６０μＩ
　（１０ｎ　ｍｏｌ　）を水（１００μｌ）に溶かした
もの〕をエドマン分解することにより、アミノ末端側か
ら逐次アミノ酸残基なアニリノチアゾリノン誘導体とし
て遊離させ、ついでこれを７工ニルチオヒダントイン誘
導体（ＰＴＨアミノ酸）に変換した。そして、このＰＴ
Ｈアミノ酸を逆相の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）により同定した。ここまでの操作で半シスチンに
相当するｔ個所を除いて（シスチンを含むペプタイドを
そのままシークエンサーＫかけると半シスチンのところ
はブランクになる：第を図参照）Ｎ末端からｊ３番目ま
で固定した。

次に半シスチンを同定するために、試料（上記）をブロ
モシアン処理後、還元カルボキシメチル化（ＣＭ化）し
て、二つのフラグメント（ＣＭＩおよびＣＭｎ）を得た
〔前記生化学実験講座参照〕。ついで、この二つのフラ
グメントのアミノ酸配列を各々ＨＰＬＣで分析すると、
半シスチンはすべてＳ−カルボキシメチルシスティンと
して検出された。以上の結果は、第６図に示す通シであ
る。同図中、Ａｓｎ、Ｓｅｔ等は各々アスパラギン、セ
リン等のアミノ酸を示す当該分野で通常用いられている
略記法である。略記されたアミノ酸配列上のｉ、ｒ、ｉ
ｏ等の数字はｈＵＧのＮ末端からＣ末端までのアミノ酸
の配列番号を示すものである。

また、右向きの矢印（７）は直接分析されたＰＴＩ’１
アミノ酸を示し、もう一つの矢印（７）はＣＭ化処理を
した後のＰＴＩ（アミノ酸の同定結果を示すものである
。また、図中、ＣＭＩおよびＣＭｎはブロモシアン処理
後、ＣＭ化して得られた画分な示すものである。なお、
同図中Ｃ末端から４番目までの左向きの矢印（＼−）は
、カルボキシペプチダーゼＷ（ＣＰＷ）を用いて試料を
加水分解し。

遊離したアミノ酸を経時的に分析分析した結果を示すも
のである（Ｃ末端分析：ＣＰＷ／に対しｈＵＧ＆の割合
で反応させ、経時的にアミノ酸分析をくり返して、遊離
したアミノ酸を同定するもの）。

以上よシ、ｈＵＧの一次構造は、第を図で示されるもの
であると確認された。

次に二次構造は、まず、試料（ｈ　Ｕ　Ｇ　１７参μＩ
を１００μｌのピリジン／アセテート緩衝液（ｐＨｊ、
ｊ）に溶解したもの）をサーモライシンで消化しく　Ｊ
、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、、　７Ｑ、　６り７（／り７３）〕
たのち、逆相ＨＰＬＣでフラグメントを分取した。つい
で常法によりアミノ酸分析をした結果、シスチンを含む
フラグメントを三つ得た。ついで、これら各々の７ラグ
メントを過ギ酸酸化することによってＳ−８架橋を切断
した。そして、逆相ＨＰＬＣによシシステイン酸を含む
フラグメントを分取し、それぞれについて常法によジア
ミノ酸分析およびアミノ酸配列分析を行った（結果は第
７図参照）。

その結果、Ｓ−Ｓ架橋の位置はＮ末端側から４番目とＪ
番目（同７図中（１））、ｌ仏番目と３ｊ番目（第７図
中（ＩＩ））、および３３番目とＱ番目（第７図中〔■
〕〕であることがわかった。以上の一次構造および二次
構造の同定結果は、ｌり７ｊ年にグレゴリ−が提唱（Ｎ
ａｔｕｒｅ　、　２１７　、３２１　（／り７ｊ）〕シ
たｈＵＧの構造と一致するものである。

関連微生物の菌学的性質および受託番号本発明において
開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下記の
通りである。

受託年月日 （１）昭和ｓｔ年を月２日 （２）昭和ｓｔｒ年参月３０日 （３）昭和３４年を月２日 （４）　　昭和５９年１７月７４Ａ日 ＊　通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託
番号 菌学的性質 （１）　　Ｂ、ｃｏＨＫ／２Ｃ６００ この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず。

通性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子
を含まず、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子
組替えに関与するヌクレアーゼをコードするｒ＠ｅＢｃ
遺伝子に欠陥を有するものである。栄養要求性としては
、トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必
要とする。また。

分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。

なお、本菌に関する文献は以下の通りである。

（イ）　Ｇ＠ｎ＠ｔ１ｃｍ　、　７９　、　　ｕｌｌＯ
（／り！４Ａ）（ロ）　　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２／７
　、１１１０　　（１９ぶｒ〕（２）　　　Ｅ、ｃｏｌ
Ｉ　Ｋ／ココ　　６００　　（ｐＹＫ　２１３　）この
菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等
の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず、サ
プレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関与
するヌクレアーゼをコードするｒ＠ｃＢｃ遺伝子に欠陥
を有するものである。栄養要求性としては、トレオニン
とロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする。ｐ
ｈｏ　Ａ遺伝子のプロモーター−オペレーメー領域ｐＡ
ＣＹ　Ｃ１７７由来の複製開始領域およびｐ　Ｂ　Ｒ３
２２のｂ１ｍ遺伝子から構成されたプラスミドｐ　Ｙ　
Ｋ　２！１３を含み、アンピシリンに対して耐性を示す
。また、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するもの
である。

なお、プラスミドｐＹＫコ！ｒ３由来の形質を除けば、
この菌株の菌学的性質はその親株Ｅ、　ｃａｌｌ　Ｋ１
２ｃ　ｔｏｏのそれと同じである。

（３）　　Ｋ、ｃｏｌｌＫ／ｊｃＪＯＱ（ｐＢＲＪココ
）この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌
気性等の大腸菌属の一般属性を有する他。

Ｅ因子を含まず、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、
遺伝子組替えに関与するヌクレアーゼをコードするｒ＠
ｃＢ　Ｃ遺伝子に欠陥を有するものである。栄養要求性
としては、トレオニンとロイシンをその最小培地上での
増殖に必要とする。また。

薬剤耐性プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２コを含む。なお、プ
ラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３，ｌＪｔに関してはＧ＠ｎ・、シ
、り！（ｌり７７）、大腸菌ＫＩ２Ｃ６００）Ｉｃ関し
ては上記Ｎａｔｕｒ・を参照することができる。ｐ　Ｂ
　Ｒ３２２由来の形質を除けば、Ｅ、　ｅｏｌｉ　Ｋ／
ココ　６００　（ｐＢＲＪ２２）の菌学的性質は親株の
それと同じである。

（４）　　　Ｅ、ｅｏｌｉ　Ｋ　／２　Ｙ　Ｋ　　！３
７大腸菌に／ユＹ　Ｋ　に’！７は、公知法であるとこ
ろの大腸菌に７１株（Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｒｅｖｉ＠ｗｓ　、芒、ｌ〜ｓａ　（ＨＩＤ　）　）
の誘導体大腸菌Ｋｌｘｎｕ／ＣＧｏｎｅ、Ｊ、　　タｒ
（ｌり７７）、　ＢＬｏｃｈ＠ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔｓ　、、　Ｊｊｊ−１２１１３（／　ＰＩ　／　
）　）なさらに改変したものであり、下記の性質を示し
、他の性質についてはに／コＲＲ／のそれと異なるとこ
ろのない菌株である。

（ｒ＊ａ　Ａ／、　ＰｈｏＡｒ、ｐｒｏ”）

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＴＡ／ｊｕ！造成の７０−チャ
ートである。 第２図は、イオン交換カラムクロマトグラフィーのクロ
マトグラムおよびＲＲＡ法の結果を示すグラフである。 第３図は、高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラ
ムを模写した図である。 第弘図はポリアクリルアミドゲル−ディスク電気泳動の
結果を示すものでありて、第μ図（イ）は電気泳動のゲ
ルを模写した説明図であり、第μ図（ロ）はデンジメト
リーの図である。 第を図は、分析用高速液体クロマトグラフィーのクロマ
トグラムを模写した因のである。 第を図は、ｈＵＧの一次構造を決定したときのアミノ酸
配列の決定手順および決定されたアミノ酸配列を示す説
明図である。 第７図は、ｈＵＧの二次構造を決定したときのＳ−Ｓ結
合の位置およびその付近のアミノ酸配列を示す説明図で
ある。 出願人代理人　　猪　股　　　　清 ｊＨＩｎｄ　［［ｊ％化　　　　　　　　　　　　↓Ｅ
ｃｏ　ＲＩ消化第７図 〔■〕〔旧　　　　　［１［］ 手続補正書動刻 昭和６０年６月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程Ａ〜Ｃよりなることを特徴とする、精製
   蛋白質の製造法。 Ａ、（イ）シグナルペプチドをコードする遺伝子であっ
   てその遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の
   構造遺伝子を結合させ得るもの、を含み、かつ予定した
   宿主細胞内で増殖可能なベクターに、所望外来性蛋白質
   をコードする遺伝子を組込み、（ロ）この組換体によっ
   てグラム陰性微生物を形質転換させ、（ハ）得られる形
   質転換された微生物を、微生物の増殖過程において対数
   増殖期の後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
   導がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地での培養
   に付したのち、これを集め、（ニ）ついでこの微生物を
   オスモティック・ショック法によって処理することによ
   り所望外来性蛋白質を含む画分を回収すること。 Ｂ、回収された所望蛋白質を含む画分をイオン交換クロ
   マトグラフィーに付したのち、所望外来性蛋白質画分を
   回収すること。 Ｃ、上記で回収された所望外来性蛋白質を含む画分をさ
   らに高速液体クロマトグラフィーに付したのち、所望外
   来性蛋白質画分を回収すること。 ２、所望外来性蛋白質がヒト上皮細胞成長因子である、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。