JP3836865B2 - 三量体化ポリペプチド、その製造及び使用 - Google Patents
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Description
X−N−Y
(式中、Nはコレクチンネック領域ペプチド、あるいはその変異体又は誘導体、あるいは三量体を形成し得る、コレクチンネック領域と同一の又は同様のアミノ酸パターン及び/又は疎水性プロフィールを有するアミノ酸の配列であり;Xは存在しないか又は1つ又はそれ以上のアミノ酸であり;Yは存在しないか又は1つ又はそれ以上のアミノ酸である。X及びYがともに存在しない場合、ポリペプチドは本質的にNで構成される。X及び/又はYは1つ又はそれ以上の異種アミノ酸を包含し、そのいずれもが誘導化できるか、あるいは化学的部分の付着に関して「キメラ修飾可能」である)にしたがってアミノ酸で本質的に構成される非天然ポリペプチドを提供する。
考えられる別の方法は、グルタミン酸残基のγ−カルボキシアミド基と第一アミンとの間のアシル転移反応を触媒するトランスグルタミナーゼを用いることである(E. Bendixen et al., J. Biol. Chem. 268 21962-21967, 1993; K. N. Lee et al., Biochem. Biophys. Acta 1202 1-6 1993; T. Kanaji et al., J. Biol. Chem. 268 11565-11572 1993 )。したがって、この酵素はペプチドからのアミノ酸残基をペプチドリシンエプシロンアミノ基を介してグルタミン残基中へ、又はペプチドグルタミン基を介してリシン基中ヘ導入し得た。本酵素はさらに、第一アミンを用いてグルタミン残基の誘導化を触媒し得た。
位 置 - - abcdefgabcdefgabcdefgabcdef
ヒトSP−D - VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK
ウシSP−D - VNALRQRVGILEGQLQRLQNAFSQYKK
ラットSP−D - - SAALRQQMEALNGKLQRLEAAFSRYKK
ウシコングルチニン VNALKQRVTILDGHLRRFQNAFSQYKK
ウシコレクチン43 VDTLRQRMRNLEGEVQRLQNIVTQYRK
VASLRQQVEALQGQ-VASLRQQVEALQGQVQGLQAAFSQYKK
の別のコピーを付加することによりさらに増強される。
一実施態様では、本発明の核酸を宿主細胞のゲノム(例えば染色体)中に組み込む。組込みは、標準技法にしたがって、ゲノムを用いて組換えを促す配列の含入により促進される。
発現後、ポリペプチドは三量体化されるか又は三量体化が可能になる。これは、単離の前後である。
コラーゲン三重らせんの播種方法は、このようなポリペプチドを三量体化させるか又は三量体化を可能にすることを包含する。それは先ず、そのコード化ヌクレオチドからの発現によるポリペプチドの産生を包含する。本発明は、このような核酸、ポリペプチドが発現される発現ベクターを含めたこのような核酸を包含するベクター、及びこのようなベクター又は核酸でトランスフェクトされる宿主細胞を提供する。ポリペプチドの産生は、ポリペプチドが発現される条件下でポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞を増殖させることを含む。クローニング及び発現等のための系は、上記で考察されている。
本明細書中で実験により立証されたように、ネック領域ペプチドを用いてネック領域のどちらかの末端で明瞭な特性を保有する1つ又はそれ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを生成し得るし、ヘテロ三量体化を用いて、これらの特性を、ネック領域を含有する別々に生成されたポリペプチド中の他のドメインにより保有されるものと併合し得る。
(i)受容体のための、ペプチド−配位子、特に低親和性結合(例えば、ニューロペプチド、インターロイキン)。
(ii)抗原。
(iii)活性化時に反応性である化学的化合物、例えば近接した場合に特異的に又は一般的にタンパク質のようなあらゆる分子と反応する光活性化可能な化学的架橋剤。ネック領域ペプチドは、未知の受容体に対する特異性を有する配位子を保有する三量体の一部である。受容体との特異的結合後、架橋剤はUV活性化され、配位子−受容体複合体に隣接する分子だけが架橋され、したがって同定される。
(iv)有機化合物、例えばカフェイン、モルヒネ(例えば研究、診断又は治療的使用のための)。
(v)特に薬剤研究における有力な阻害剤のスクリーニングのための低親和性結合ドメイン。
(vi)pH、CaCl2 濃度又は診断及び研究に関連したその他のもの。
(vii)炭化水素結合ドメイン。
(viii)例えばレクチンに関する結合及び/又は研究のための炭化水素。
(ix)脂質含有構造(これらは、例えば活性分子を含有するリポソーム中への取込みのためにN末端にあり、三量体化ポリペプチドはネック領域の末端、例えばC末端に特異性指示ドメインを有する)。
(xiii)共有結合三量体を生成するために、システイン残基を配列のどちらかの末端又は両端に付加し得る。システインを含有する正しい配列は、FACITコラーゲンから得られる。このうちのいくつかは、コラーゲン構造の直後でジスルフィドを介して三量体に結合され、したがってそれらの配列の1つをネック領域のN末端に転移させ得る。これは、全体的形状に影響を与えずにペプチド三量体の安定性をさらに増大するための使用である。
本文に記載した文献はすべて、参照により本明細書中に含まれる。
コレクチンネック領域の三量体化
図1(a)は、ヒトSP−Dの構造を示す。168bpDNA断片は、7つのGly−Xaa−Yaaトリプレット及びC型レクチンドメインへと続くネック領域の35の非コラーゲン様残基をコードした。それはpGEX−2T細菌発現ベクター中でクローニングされ〔9〕、挿入物の正しい配向は制限消化により確認された。グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/ネック領域ペプチド融合タンパク質の高レベルの発現は、IPTGによる誘導の6時間後に得られた。親和性精製融合タンパク質のトロンビン消化は、N末端に付加的Gly−Ser−Proトリプレットを、C末端にGly−Ile−Pro−His−Arg−Aspを有し、pGex−2T中に存在するポリリンカーを示す2つのポリペプチド、即ちグルタチオン−S−トランスフェラーゼ及びネック領域ペプチドを生じた。培養1リットル当たり組換え体ペプチド14mgを3工程精製手順で精製した。ペプチドは、800 mM NaClでHighLoad-Sカラムから単一ピーク中に溶離した。ペプチドの純度は、SDS−PAGE分析、残基1〜46のN末端配列、及びレーザー脱着質量分光(データは示さず)により確証した。
ネック領域ペプチドのN末端との融合によるヒトSP−DのN末端ドメインの三量体化
緩衝液Nru1中の4単位のNru1(New England Biolabs )で、次いで緩衝液J中の5単位のSma1(Promega )で、25℃で4時間、制限酵素消化によりプラスミドを含有する元のcDNA 10μg からヒトSP−Dのコラーゲン領域をコードするDNA配列を取り出し、456bp断片を切り出して、この融合ペプチドのための発現プラスミドを生成した。マジックminiprepDNA精製樹脂(Promega )を用いて残りのプラスミドを精製し、再結紮して、大腸菌のBL21菌株のコンピテント細胞中で形質転換させた。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、SP−DのN末端ドメインのN末端にBamH1制限酵素部位を生成した。その結果生じたPCR生成物をBamH1及びBal1で切断して、84アミノ酸(N末端ドメインの28及びネック領域の56。2つのドメイン間の7トリプレットコラーゲンリンカーを含む)をコードする開放読取り枠を生じた。ポリペプチドを、図7に示したグルタチオン−S−トランスフェラーゼ−N末端−ネック領域融合タンパク質として生成した。
ネック領域のC末端に位置するヒトSP−DのC型レクチンドメインの三量体化
これらの試験の他に、非融合ポリペプチドを生成するタンパク質発現系を用いて、ネック領域ペプチドの三量体化特徴のさらに正確な図を示した。
コラーゲン三重らせん生成の核形成
2つのDNA構築物を作って、グルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を生成した(実施例1参照)。57のトリプレットを有するネック領域ペプチド(図12)及びヒトSP−DのN末端非コラーゲン残基、並びにヒトSP−D由来のネック領域ペプチドを含有しない48のGly−Xaa−Yaaトリプレットは、ネック領域ペプチドを伴わずにグルタチオン−S−トランスフェラーゼと直接融合した。実施例1に略記したプロトコールを用いて、両融合タンパク質を生成し、精製した。
観察された三重らせんの安定性の増大におけるヒトSP−DのN末端非コラーゲン領域の関与を実験した。コラーゲン配列のN末端の天然二重コイルがマクロファージフカベンジャー受容体中に観察されるので、タンパク質工学的処理技術を用いて、短ペプチド配列をネック領域ペプチドのコラーゲン領域N末端のN末端に付着させる。これは、合成されたオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応、及び既にネック領域をコードするDNAを保有するその後のpGEX−2Tベクター中の融合タンパク質併合部位への結紮の使用を包含する(実施例1参照)。
ネック領域ペプチドを用いて三量体化する場合のSP−DのC型レクチンドメインの結合の増大
ヒトSP−Dタンパク質をコードするcDNAを含有するpBluescriptプラスミドを制限酵素Sma1及びEcoR1、並びにMsc1及びEcoR1で消化して、それぞれ532bp及び364bpのDNA断片を生じた。両断片をpGex−2T発現ベクター中でサブクローニングし、制限酵素Sma1及びEcoR1で線状化した。この指向性クローニング操作により、2つの発現プラスミド、即ちpGex−2T−ネック−レクチン及びpGex−2T−レクチンが生成した。これらを大腸菌BL21株中で形質転換させた。IPTGを用いてタンパク質発現を誘導し、クローンを同定して予測サイズの、即ちpGex−2T−ネック−レクチンに関しては43 kDa及びpGex−2T−レクチンに関しては37 kDaの組換え体タンパク質を産生させ(図15)、これらを用いて上記のように融合タンパク質を含有するグルタチオン−S−トランスフェラーゼの大規模生産を開始した。
一本鎖抗体の三量体化
ハイブリドーマ細胞株OX35〔15〕から調製される全RNAをcDNA−PCR〔16〕のための鋳型として用いて、ハイブリドーマ細胞が分泌する抗CD4モノクローナル抗体のL及びH鎖の可変部をコードするDNAを生成した。400 bp長の両断片をpBluescript SKベクター(Stratagene)中でクローニングし、次いで半硬質リンカーペプチド(GGGGS)3 をコードする合成DNA断片を用いて併合し、VL 及びHL ドメインの対が確実に正しくなるようにした〔17〕。DNAのジデオキシシーケンシングにより、構築物の配列を確証した。
Claims (24)
- コレクチンのネック領域であり、かつ、三量体を形成し得るアミノ酸の配列を含む非天然ポリペプチドであって、当該アミノ酸の配列がヒト、コレクチンSP-D、アミノ酸配列:
VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK
のネック領域である、前記ポリペプチド。 - 非ペプチド部分と連結された、請求項1に記載のポリペプチド。
- コレクチンC型レクチン・ドメインを含む、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸。
- ベクターである、請求項4に記載の核酸。
- 請求項4又は5に記載の核酸を含有する宿主細胞。
- 前記コーディング配列が前記ポリペプチドの発現のための調節配列に作用可能な状態で連結されている、請求項4又は5に記載の核酸。
- 請求項7に記載の核酸を含有する宿主細胞。
- 前記のコードされたポリペプチドの、請求項4に記載の核酸からの発現を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法。
- 前記ポリペプチドの発現のための条件下、請求項8に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項9又は10に記載の方法によるその発現後にポリペプチドを含む三量体を形成することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む三量体の製造方法。
- 前記三量体がホモ三量体である、請求項11に記載の方法。
- 前記三量体がヘテロ三量体である、請求項11に記載の方法。
- 請求項9又は10に記載の方法によるポリペプチドの発現後にそのポリペプチドを単離することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項14に記載の方法によるポリペプチドの単離後にそのポリペプチドを含む三量体を形成することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む三量体の製造方法。
- 前記三量体がホモ三量体である、請求項15に記載の方法。
- 前記三量体がヘテロ三量体である、請求項15に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む三量体。
- ホモ三量体である、請求項18に記載の三量体。
- ヘテロ三量体である、請求項18に記載の三量体。
- コラーゲン三重らせんの形成方法であって、非天然ポリペプチドを提供し、ここで、各ポリペプチドが、三量体を形成することができる、ヒトコレクチンSP-D、アミノ酸配列:
VASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK
のネック領域である、アミノ酸の配列のN末端側に一連のコラーゲン・トリプレットを含み、そして上記ポリペプチドとして三量体を形成させる、ことを含む方法。 - 前記アミノ酸の配列が前記ポリペプチドのC末端にある、請求項21に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、そのコーディング核酸からの発現により提供される、請求項21又は22に記載の方法。
- 前記三量体が、三量体化後に単離される、請求項23に記載の方法。
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