ES2245052T3 - Anticuerpos de recombinacion multivalentes destinados para el tratamiento de infecciones debidas al rinovirus humano (hrv). - Google Patents
Anticuerpos de recombinacion multivalentes destinados para el tratamiento de infecciones debidas al rinovirus humano (hrv).Info
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Abstract
Un anticuerpo recombinante multivalente contra ICAM-1 que tiene tres o más dominios de unión antígeno para ICAM-1, donde dicho anticuerpo tiene una constante de afinidad aparente por ICAM-1 no inferior a 108 M-1.
Description
Anticuerpos de recombinación multivalentes
destinados para el tratamiento de infecciones debidas al rinovirus
humano (HRV).
Esta invención se relaciona con anticuerpos
recombinantes multivalentes de alta afinidad, con péptidos
multivalentes y con su uso en la prevención y el tratamiento de
infecciones víricas y enfermedades relacionadas.
Los rinovirus humanos (RVH) están entre los
patógenos humanos que aparecen con mayor frecuencia. Los RVH son
responsables de la mayoría de los casos del resfriado común
(Stanway, G., 1994, "Rhino viruses", en: Webster, R.G. (eds.),
Encyclopedia of Virology, New York: Academic Press, pp.
1253-1259; Sperber, S.J. y Hayden, F.G., 1988,
Antimicrob. Agents Chemother. 32: 409-419).
Además, los RVH son una causa importante de infección del tracto
respiratorio superior y de otitis media, es decir, de infección del
oído (Arola, M. y col., 1990, Pedia 86:
848-855).
La otitis media aguda (OMA) recurrente es una
enfermedad infecciosa prevalente entre los niños pequeños y tiene
como resultado más de 8 millones de visitas pediátricas cada año.
Teele y col., 1989, J. Infect. Dis. 160:
83-94, vieron que el 62% de los niños de un año de
edad han tenido al menos un episodio de OMA y un 17% han tenido
tres o más. A la edad de tres años, más del 80% de los niños han
experimentado otitis media y más del 40% han tenido tres o más
episodios. Los costes del tratamiento anual para la OMA han sido
estimados en más de \textdollar3,5 billones en los Estados Unidos
(Stool, S.E. y Field, M.J., 1989, Pediatr. Infect. Dis. J.
8: S1 1-14).
Se han descrito al menos 115 serotipos distintos
del RVH (Uncapher y col., 1991, Virology 180:
814-817). Debido al gran número de serotipos de RVH,
un sujeto humano alcanza poca protección inmunológica por exposición
previa a uno o varios serotipos heterólogos. La heterogeneidad
genética del RVH explica la alta incidencia de la infección por
rinovirus.
Los fármacos comercialmente disponibles sólo
tratan los síntomas del resfriado común y de la OMA. No pueden
prevenir las infecciones rinovíricas. Los profilácticos para el
resfriado común son deseables, especialmente para niños pequeños,
quienes son los más susceptibles al resfriado común y a las
infecciones del oído.
La presente invención se relaciona con la
generación de anticuerpos recombinantes multivalentes de alta
afinidad y con péptidos multivalentes que se unen a los receptores
celulares para rinovirus, y especialmente para el RVH.
Concretamente, se dirige a anticuerpos recombinantes multivalentes y
a péptidos multivalentes contra los sitios de unión al RVH en
moléculas ICAM-1 humanas. Esta invención se
relaciona también con métodos de utilización de estos anticuerpos y
péptidos para bloquear los receptores y prevenir y tratar las
infecciones por RVH y las enfermedades y condiciones patológicas
asociadas, incluyendo, aunque sin limitación, el resfriado común, la
otitis media, el asma, la bronquitis y la sinusitis.
Un "rinovirus humano" concuerda con la
definición que se da en Hamparian y col., 1987, Virology
159: 191-192, e incluye específicamente todos los
serotipos humanos de rinovirus catalogados en Hamparian y col.,
1987, Virology 159: 191-192, y serotipos
adicionales de RVH que han sido identificados y serán identificados
con posterioridad.
Un "anticuerpo recombinante" en esta
invención contiene el dominio variable de cadena pesada (V_{H}) y
el dominio variable de cadena ligera (V_{L}) de un anticuerpo
unidos entre sí en una sola cadena. El anticuerpo recombinante
reconoce específicamente un receptor celular para RVH, incluyendo,
aunque sin limitación, el receptor mayor ICAM-1, y
reduce o previene la unión de RVH a células huésped humanas.
Un "anticuerpo recombinante multivalente" en
esta invención incluye cualquier configuración multimérica de dos o
más, y especialmente de tres o más, anticuerpos recombinantes.
Concretamente, incluye anticuerpos recombinantes trivalentes,
tetravalentes y pentavalentes. Se pueden copular múltiples dominios
de unión a antígeno a un soporte polimérico inerte, incluyendo,
aunque sin limitación, nitrocelulosa, PVDF, DEAE, aminodextrano y
polímeros lipídicos. El anticuerpo multivalente contiene múltiples
unidades polimerizadas a través de sus dominios de polimerización.
Cada unidad contiene un fragmento Fv y un dominio de polimerización
unidos entre sí (preferiblemente expresados como un polipéptido de
una sola cadena). Los dominios de polimerización son capaces de
unirse entre sí en virtud de contener uno o más fragmentos
peptídicos que tienen afinidad por otros fragmentos peptídicos de la
misma, o substancialmente la misma, secuencia de aminoácidos. El
dominio de polimerización determina la configuración del complejo
proteico multimérico (por ejemplo, como dímero, trímero, tetrámero,
pentámero u otros). Como ejemplos de dominios de polimerización, se
incluyen, aunque sin limitación, dominios de enrollamiento
enrollados, tales como los descritos y definidos en Lupas y col.,
1991, Science 252: 1162-1164, y secuencias
alfa-helicoidales, tales como las descritas en
Eisenberg, D. y col. (1986), Protein 1:
16-22; Ho y DeGrado (1987), J. A. Chem. Soc.
109: 6751-6758; Regan y DeGrado (1988),
Science 241: 976-978, y Hill y col. (1990),
Science 249: 543-546. Un dominio de
polimerización puede ser un péptido natural o puede ser diseñado y
sintetizado artificialmente. Un dominio de polimerización natural
puede ser modificado para generar otros dominios de polimerización
(véanse, por ejemplo, los métodos descritos en Harbury y col.,
Science 262: 1401-1407, 1993). El dominio de
enrollamiento enrollado puede proceder de la región de cremallera de
la leucina del factor de transcripción GCN4, del dominio de
tetramerización de p53 o de los residuos
N-terminales (aa 20-80) de la
proteína de la matriz oligomérica del cartílago (es decir,
"COMP"). Las secuencias alfa-helicoidales
pueden contener hélices sencillas o
hélice-giro-hélice, según se resume
en Plückthun y Pack (1997), Immunotechnology 3:
83-105. Los sitios de unión a antígeno o los
fragmentos scFv reconocen los receptores celulares para rinovirus,
incluyendo, aunque sin limitación, ICAM-1, el
receptor de LDL y su proteína relacionada \alphaMR/LRP. Reconocen
los sitios de unión a rinovirus sobre ICAM-1. Los
sitios de unión a antígeno o los fragmentos scFv de un anticuerpo
recombinante multivalente pueden reconocer el mismo blanco (por
ejemplo, ICAM-1 o LDLR) o dos o más blancos
diferentes (por ejemplo, algunos reconocen ICAM-1,
mientras que otros reconocen LDLR).
Un "péptido multivalente" incluye cualquier
configuración multimérica de dos o más, y especialmente de tres o
más, péptidos. Concretamente, incluye péptidos bivalentes,
trivalentes, tetravalentes y pentavalentes. Se pueden copular
múltiples dominios de unión a antígeno a un soporte polimérico
inerte, incluyendo, aunque sin limitación, nitrocelulosa, PVDF,
DEAE, aminodextrano y polímeros lipídicos. Los péptidos
multivalentes están en forma de repeticiones en tándem en las que
los péptidos se unen directamente o a través de secuencias de
conexión (por ejemplo, por tecnología del ADN recombinante). El
péptido multivalente puede contener múltiples unidades
polimerizadas a través de sus dominios de polimerización. Cada
unidad contiene un solo péptido (o péptidos en repeticiones en
tándem) y un dominio de polimerización unidos entre sí
(preferiblemente expresados como un polipéptido de una sola cadena).
Los dominios de polimerización son capaces de unirse entre sí en
virtud de contener uno o más fragmentos peptídicos que tienen
afinidad por otros fragmentos peptídicos de la misma o
substancialmente la misma secuencia de aminoácidos. El dominio de
polimerización determina la configuración del complejo proteico
multimérico (por ejemplo, como dímero, trímero, tetrámero, pentámero
u otros). Como ejemplos de dominios de polimerización, se incluyen,
aunque sin limitación, dominios de enrollamiento enrollados, tales
como los descritos y definidos en Lupas y col., 1991,
Science 252: 1162-1164, y secuencias
alfa-helicoidales, tales como las descritas en
Eisenberg, D. y col. (1986), Protein 1:
16-22; Ho y DeGrado (1987), J. A. Chem. Soc.
109: 6751-6758; Regan y DeGrado (1988),
Science 241: 976-978, y Hill y col. (1990),
Science 249: 543-546. Un dominio de
polimerización puede ser un péptido natural o puede ser diseñado y
sintetizado artificialmente. Un dominio de polimerización natural
puede ser modificado para generar otros dominios de polimerización
(véanse, por ejemplo, los métodos descritos en Harbury y col.,
Science 262: 1401-1407, 1993). El dominio de
enrollamiento enrollado puede proceder de la región de cremallera de
la leucina del factor de transcripción GCN4, del dominio de
tetramerización de p53 o de los residuos
N-terminales (aa 20-80) de la
proteína de la matriz oligomérica del cartílago. Las secuencias
alfa-helicoidales pueden contener hélices sencillas
o hélice-giro-hélice, según se
resume en Plückthun y Pack (1997), Immunotechnology 3:
83-105.
El RVH se une a ICAM-1 en cuatro
regiones. En realizaciones preferidas, los péptidos multivalentes se
unen a tres o más (preferiblemente cuatro o más) aminoácidos en las
siguientes regiones del ICAM-1 humano. Se hace
referencia a éstas a continuación como las secuencias diana o
péptidos diana:
- Diana Nº 1: Residuos 1-5: QTSVS
- Diana Nº 2: Residuos 24-29: SCDQPK
- Diana Nº 3: Residuos 40-49: KELLLPGNNR
- Diana Nº 4: Residuos 70-77: PDGQSTAK
Los anticuerpos recombinantes y péptidos
multivalentes de esta invención se unen a receptores para rinovirus
con alta afinidad. En una realización preferida, tienen una
constante de afinidad aparente para los receptores celulares no
inferior a 10^{8} M^{-1}. Pueden tener una constante de
afinidad aparente para los receptores celulares no inferior a
10^{9}M^{- 1}. Pueden tener una constante de afinidad aparente
para los receptores celulares no inferior a 10^{10}M^{-1}.
Por "constante de afinidad aparente", se
entiende la razón [Ab-Ag]/[Ab][Ag] cuando la
reacción de unión anticuerpo-antígeno alcanza el
equilibrio. [Ab-Ag], [Ab] y [Ag] son las
concentraciones del complejo anticuerpo-antígeno,
del anticuerpo libre y del antígeno libre, respectivamente. La
constante de afinidad aparente de los péptidos multivalentes es
medida del mismo modo que en el caso de los anticuerpos.
Esta invención se relaciona también con
formulaciones que contienen una cantidad farmacéuticamente activa de
un anticuerpo recombinante multivalente antes mencionado y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Por "farmacéuticamente aceptable", se
entiende la capacidad para prevenir, tratar, reducir o curar una
infección por rinovirus o uno o más síntomas clínicos de la
infección por rinovirus.
En una realización preferida, la composición
consiste en un anticuerpo que tiene afinidad de unión por
ICAM-1 y preferiblemente un anticuerpo recombinante
multivalente (mvAb) que tiene afinidad de unión por
ICAM-1.
Una composición consiste en un primer mvAb que
tiene afinidad de unión por ICAM-1 y un segundo mvAb
que tiene afinidad de unión por LDLR.
Una composición puede incluir péptidos
(preferiblemente péptidos multivalentes) que tienen afinidad de
unión por dos o más (o tres o más) regiones de unión a RVH en
ICAM-1.
Una composición puede incluir péptidos
multivalentes que tienen afinidad de unión por no más de dos
regiones de unión a RVH en ICAM-1.
Los anticuerpos recombinantes multivalentes y los
péptidos multivalentes antes identificados pueden ser usados para
prevenir y tratar las infecciones por rinovirus y las enfermedades o
condiciones patológicas asociadas en mamíferos, especialmente en
humanos, incluyendo, aunque sin limitación, el resfriado común, la
otitis media, la bronquitis y la sinusitis. Además, los anticuerpos
recombinantes y péptidos multivalentes contra ICAM-1
pueden ser también usados para prevenir la infección de otros virus
que se sabe se unen a ICAM-1, tales como el virus
Coxsackie A. Más aún, los anticuerpos recombinantes multivalentes
contra ICAM-1 pueden ser administrados
intravenosamente para bloquear la interacción entre
LFA-1 e ICAM-1 como una forma de
controlar la respuesta inmunológica relacionada con la
inflamación.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes gracias a la siguiente descripción detallada de la
invención y a las reivindicaciones.
Los RVH infectan el tracto respiratorio superior
humano por unión a, e introducción después en, las células
epiteliales que revisten la cavidad nasal y la nasofaringe. La
unión está mediada por una interacción específica entre viriones de
RVH y los receptores de la superficie de las células
epiteliales.
En base a su selección de receptores celulares,
los RVH se agrupan en dos familias (excepto para
RVH-87): el grupo mayor y el grupo menor (Uncapher y
col., 1991, Virology 180: 814-817). El grupo
mayor contiene al menos 91 serotipos, todos los cuales reconocen un
receptor identificado como la molécula de adhesión intercelular 1
(ICAM-1) (Greve y col., 1989, Cell 56:
839-847; Staunton y col., 1989, Cell 56:
849-853; Tomassini, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 4907-4911). El grupo menor contiene
aproximadamente 10 serotipos y su receptor celular es el receptor
de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y una proteína relacionada,
receptor de alfa-macroglobulina/proteína
relacionada con LDLR (\alphaMR/LRP) (Hofer y col., 1994, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 1839-1842).
ICAM-1 es un miembro de la
familia de supergenes de inmunoglobulinas y contiene cinco dominios
de tipo inmunoglobulina homólogos definidos por los aminoácidos
1-88, 89-185,
186-284, 285-385 y
386-453 (Staunton y col., 1988, Cell 52:
925-933). ICAM-1 es también el
ligando de la superficie celular para el antígeno-I
asociado a la función de los linfocitos (LFA-1). Se
ha detectado una forma soluble de ICAM-1 en suero
humano normal (Rothlein y col., 1991, J. Immunol. 147:
3788-3793). La expresión de ICAM-1
es regulada crecientemente por citokinas inflamatorias en
leucocitos activados, endotelio y epitelio. Otras dos moléculas
homólogas, ICAM-2 e ICAM-3, tienen
distribuciones celulares similares a las de ICAM-1
y se unen también a LFA-1.
ICAM-1 tiene sitios de unión
distintos para rinovirus y LFA-1 (Staunton y col.,
1990, Cell 61: 243-254). El sitio de unión a
rinovirus ha sido mapeado en el dominio de tipo Ig
N-terminal (aminoácidos 1-88)
(Staunton y col., 1990, Cell 61: 243-254;
McClelland y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
7993-7997).
La porción extracelular de la molécula de
ICAM-1 tiene cinco dominios de tipo inmunoglobulina
(D1-D5). D1 contiene el sitio de unión primario para
rinovirus, así como el sitio de unión para su ligando natural, es
decir, el antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos
(LFA-1). Distintos residuos de aminoácidos están
implicados en la unión de ICAM-1 a RVH y
LFA-1. Los sitios de contacto con RVH en D1
incluyen los residuos 1, 2, 24-29,
40-49 y 70-77 (Staunton y col.
(1988), Cell 52: 925-933; Staunton y col.
(1990), Cell 11: 243-254; McClelland y col.
(1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
7993-7997; Lineberg y col. (1990), J. Virol.
64: 2582-2587, y Olson y col. (1993), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 507-511).
La estructura tridimensional de la porción
D1-D2 de la molécula ICAM-1 ha sido
revelada por Casasnovas y col. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95: 4134-4139, y Bella y col. (1998),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4140-4145. El
extremo de la molécula de ICAM-1 tiene tres bucles:
BC (aa 23-29), DE (aa 43-48) y FG
(aa 69-72). Los tres bucles penetran profundamente
en el cañón que hay sobre la superficie del RVH. Los anticuerpos o
péptidos que se unen a estas regiones de la molécula de
ICAM-1 pueden enmascarar el sitio de unión a RVH y
evitar que el RVH se una a ICAM-1.
Mientras que un solo péptido puede no tener la
afinidad requerida para evitar la interacción entre RVH e
ICAM-1, se pueden usar péptidos multivalentes que
se unen a las regiones de unión a RVH de la molécula de
ICAM-1 humana para prevenir la infección por RVH en
humanos y evitar y tratar el resfriado común. Se ha visto que la
multivalencia puede aumentar la afinidad de un péptido 105 veces
(Terskiskh y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
1663-1668).
La función fisiológica de LDLR es unirse a la LDL
plasmática, una proteína transportadora del colesterol, iniciar la
internalización de la LDL y suministrar colesterol a las células
(Daniel y col., 1983, J. Biol. Chem. 258: 4606). Los
receptores de LDL sobre la superficie de las células epiteliales
nasales son probablemente de poca importancia para las funciones
fisiológicas normales de estas células de la mucosa, ya que la
mucosa nasal normalmente no tiene acceso a la LDL plasmática.
Una estrategia para prevenir la infección por RVH
es administrar ICAM-1 y LDLR solubles como señuelos
para enmascarar los sitios de unión a receptores del RVH (Patentes
EE.UU. Nº de Serie 5.589.453, 5.674.982 y 5.603.932). Las formas
solubles de ICAM-1 (sICAM-1) han
mostrado inhibir la unión virus-receptor y
disminuir la infectividad del virus (Marlin y col., 1990,
Nature 344: 70-72; Greve y col., 1991, J.
Virol. 65: 6015-23). La pulverización nasal con
ICAM-1 soluble ha mostrado proteger a chimpancés
contra la inoculación de RVH (Huguenel y col., 1997, American J.
Resp. Critical Care Med. 155(4):
1206-10). Sin embargo, la protección dada por
sICAM-1 es muy breve (aproximadamente 30 minutos),
ya que la interacción entre sICAM-1 y RVH es débil
y el mecanismo de aclaramiento mucociliar elimina las moléculas de
sICAM-1 bastante rápidamente (Arruda y col., 1992,
Antimicrobial Agents and Chermotherapy 36:
1186-91; Illum, 1991, Trend in Biotech. 9:
284-289). Dichos inconvenientes limitan el uso de
sICAM-1 como profiláctico contra las infecciones
por RVH.
Otra estrategia para prevenir la infección por
RVH es bloquear el sitio de unión a RVH sobre ICAM-1
con un anticuerpo monoclonal (mAb) (Lineberger y col., 1990, J.
Virol. 64: 2582-2587). Se ha visto que un
anticuerpo monoclonal contra ICAM-1, 1A6,
permanecía unido a la molécula ICAM-1 durante dos
días en un cultivo celular y que la asociación soportaba múltiples
lavados (Colonno y col., 1989, en Molecular Aspects of
Picornavirus Infection and Detection (Semler B.L. y Ehrenfeld
E., eds.), pp. 169-178, American Society for
Microbiology, Washington, D.C.). No se observaron efectos adversos
sobre las funciones celulares cuando se cultivó un exceso de 1.000
veces el anticuerpo contra ICAM-1 con células HeLa
(Colonno y col., 1986, J. Virol., 57: 7-12).
Además, la administración intranasal del anticuerpo
ICAM-1 en chimpancés durante hasta un año no
produjo toxicidad local o sistémica detectable (Hayden y col., 1988,
Antiviral Res. 9: 233-247). El mismo grupo
también mostró que la administración de 1A6 (1 mg/sujeto en 10
aplicaciones, -3 a +36 horas) retrasó la aparición de resfriados
por rinovirus en voluntarios humanos en hasta 2 días.
Sin embargo, 1A6 no redujo las tasas de infección
o enfermedad globales (Hayden y col., 1988, Antiviral Res. 9:
233-247). Casasnovas y col., 1985, J. Bio.
Chem. 270: 13216-24 mostraron que las razones de
disociación eran similares entre mAbs/ICAM-1 y
RVH/ICAM-1 (1,67x10^{-3}s^{-1}, lo que se
traduce en un t_{1/2} de enlace receptor-ligando
de 6,9 minutos).
Se ha clonado un anticuerpo de una sola cadena a
partir de 1A6 y se ha visto que es capaz de bloquear la infección
por RVH de células cultivadas, aunque con una eficacia menor que la
del mAb original (Condra y col., 1990, J. Bio. Chem., 265:
2292-95).
Esta invención incluye la apreciación del
Solicitante de que el efecto profiláctico de 1A6 y su
correspondiente mAb de cadena sencilla está limitado por su
afinidad funcional (avidez) por ICAM-1. Es
imperativo reducir la velocidad de disociación del complejo
receptor-anticuerpo (medida por Kd) con objeto de
aumentar la avidez de los anticuerpos por los receptores celulares
para RVH.
Ciertas proteínas nativas aumentan su afinidad
por ligandos a través de complejos multiméricos. Por ejemplo, aunque
las moléculas individuales de IgG se unen al factor del complemento
C1q con una baja afinidad (100 mM), las mismas moléculas de IgG en
grupos se unen a C1q con afinidades mucho mayores (aproximadamente
1 mM y 3 nM, respectivamente, para dímeros y tetrámeros de IgG,
Male y col., 1987, en Advanced Immunology, eds. Male, D.,
Champion, B. y Cooke, A. (Gower Medical, Londres), pp.
2.1-2.13).
Dentro del alcance de esta invención, el
Solicitante prepara anticuerpos recombinantes multivalentes contra
receptores celulares de rinovirus con objeto de utilizar la
multivalencia para conseguir una alta afinidad por los receptores y
de estabilizar la asociación entre los anticuerpos y los receptores
reduciendo la velocidad de disociación. Un anticuerpo recombinante
con cuatro (tetravalente) o cinco (pentavalente) sitios de unión
tendrá una avidez mucho mayor por su diana que un anticuerpo
monoclonal (bivalente) o un anticuerpo de una sola cadena
(monovalente). Dichos anticuerpos recombinantes multivalentes contra
ICAM-1 y LDLR son mucho más efectivos en la
prevención de la infección por RVH que los anticuerpos monoclonales
y los anticuerpos de una sola cadena. De igual modo, un péptido
pentavalente tiene una avidez 0 106 veces superior a la de un
péptido sencillo y podrá bloquear los sitios de unión a RVH sobre
ICAM-1 mucho más eficazmente.
Se puede producir un anticuerpo recombinante
multivalente (mvAb) uniendo el dominio de unión a antígeno de un
anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fv de una sola cadena (scFv))
con un dominio proteico que se polimeriza automáticamente,
incluyendo, aunque sin limitación, las secuencias de enrollamiento
enrollado y las secuencias alfa-helicoidales de las
proteínas. El dominio de unión a antígeno y el dominio
polimerizante pueden conectarse a través de un enlace sintético.
Los anticuerpos recombinantes pueden también ser multimerizados por
adsorción o copulación química a un soporte hecho de una variedad
de polímeros inertes, incluyendo, aunque sin limitación,
nitrocelulosa, PVDF, DEAE, aminodextrano y polímeros peptídicos. Un
anticuerpo recombinante multivalente (mvAb) constituido por dominios
proteicos de enrollamiento enrollado o dominios
alfa-helicoidales puede polimerizarse además por
copulación a polímeros inertes para preparar un complejo molecular
de mayor avidez. Se pueden producir péptidos multivalentes de un
modo similar al de los anticuerpos multivalentes substituyendo el
fragmento scFv por un péptido sencillo o una repetición de péptidos
en tándem.
Se han identificado dominios de enrollamiento
enrollado en más de 200 proteínas en el GenBank (Lupas y col.,
1991, Science 252: 1162-1164), incluyendo los
factores de transcripción de la cremallera de leucina y la proteína
de la matriz oligomérica del cartílago (COMP). Las proteínas de
enrollamiento enrollado tienen una repetición característica de
siete residuos y las siete posiciones son designadas como a a g
(a.b.c.d.e.f.g)_{n}, con residuos hidrofóbicos en las
posiciones a y d y residuos polares generalmente en
cualquier otro sitio.
Los métodos descritos y expuestos en las
siguientes referencias pueden ser usados para los fines de esta
invención en la producción de anticuerpos recombinantes
tetraméricos y pentaméricos.
Harbury y col., 1993, Science 262:
1607-1407, prepararon complejos triméricos y
tetraméricos estables por cambios simultáneos en las posiciones a y
d de la repetición de siete residuos en el dominio de cremallera de
leucina de un factor de transcripción GCN4 (una secuencia de
enrollamiento enrollado). Además, se formó un complejo de hélice
tetramérica paralelo cuando se cambiaron los residuos hidrofóbicos
de la posición a a leucina y se cambiaron los residuos de leucina
de la posición d a isoleucina.
Pack y col., 1995, J. Mol. Biol. 246:
28-34, produjeron un minianticuerpo tetravalente
contra la fosforilcolina en el periplasma de E. coli uniendo
un fragmento Fv de cadena sencilla de anticuerpo de unión a
fosforilcolina al dominio de cremallera de leucina modificado de
GCN4. Este minianticuerpo tetravalente exhibía una mayor avidez que
la de la construcción bivalente.
Rheinnecker y col., 1996, J. Immunol. 157:
2989-2997, produjeron un minianticuerpo tetravalente
contra un antígeno de carbohidrato asociado a tumores Lewis Y
uniendo el fragmento scFv con el dominio de tetramerización del
factor de transcripción humano p53 (aminoácidos 319 a 360). La
multivalencia redujo la velocidad de disociación del complejo
antígeno-anticuerpo en más de dos órdenes de
magnitud.
La proteína de matriz oligomérica de cartílago
(COMP) es una glicoproteína pentamérica de la familia de la
trombospondina que se encuentra en cartílago y tendón. Se consigue
la autoasociación de COMP por formación de un haz
\alpha-helicoidal de cinco hebras que incluye 64
residuos N-terminales (del aminoácido 20 al 83). El
complejo es además estabilizado por los enlaces disulfuro
intercatenarios entre las cisteínas 68 y 71 (Efimov y col., 1996,
Proteins 24: 259-262).
Para aumentar la afinidad de un péptido sintético
por su ligando, Terskish y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94: 1663-1668, prepararon una molécula de
unión multivalente pentamérica uniendo el péptido con el dominio del
montaje de enrollamiento enrollado del COMP (residuos
26-80). Este homopentámero exhibe una avidez por su
ligando a un nivel que es 2x10^{5} veces mayor que el del péptido
original.
Por lo tanto, se puede generar un anticuerpo
recombinante pentavalente o un péptido pentavalente por unión del
fragmento scFv o de un péptido con el dominio de enrollamiento
enrollado de COMP.
Se cultivan, purifican y estudian los rinovirus
como se ha descrito con anterioridad (Abraham, G. y col., 1984,
J. Virol. 51: 340; Greve y col., 1989, Cell 56:
839-847; Patente EE.UU. 5.603.932). Son placas
purificadas y aisladas de lisados de células HeLa infectadas por
precipitación con polietilenglicol y centrifugación en gradiente de
sacarosa. La pureza de la preparación vírica es valorada por
análisis de SDS-PAGE y microscopía electrónica. Se
cuantifica la infectividad por un ensayo de dilución limitante como
describe Minor, P.D., Growth, assay and purification of
picornavirus, en Virology: A Practical Approach, B.W.J.
Mahy, ed. (Oxford: IRL Press), pp. 25-41.
Concretamente, se escogen HRV14, HRV3, HRV2 y
HRV49 para este estudio y todos ellos pueden ser obtenidos de la
American Tissue Culture Collection. HRV14 y HRV3 se unen al
receptor mayor ICAM-1, mientras que HRV2 y HRV49 se
unen al receptor menor LDLR.
Se usan células HeLa para inmunizar ratones
BALB/c, ya que tanto ICAM-1 como el receptor de LDL
se expresan en su superficie. El procedimiento está descrito en la
Patente EE.UU. 5.674.982. Alternativamente, se pueden usar
polipéptidos que contienen el dominio de unión a rinovirus de
ICAM-1 o LDLR para inmunizar ratones.
\newpage
Resumiendo, se inyectan 10^{7} células HeLa en
0,5 ml de solución salina tamponada con fosfatos (PBS) en la cavidad
peritoneal de los ratones BALB/c tres veces a intervalos de tres
semanas. Dos semanas después, se sangran los ratones y se estudian
los sueros en cuanto a su capacidad para proteger las células HeLa
frente a la infección por HRV14 y HRV2. Se da un refuerzo a los
ratones positivos con una inyección final de 10^{7} células HeLa.
Tres días después, se fusionan las células esplénicas con células
de mieloma para producir hibridomas. Se puede hacer a través de
técnicas bien conocidas, tales como las descritas en la Patente
EE.UU. 4.196.265 o en Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.
Se rastrea entonces el hibridoma como se describe
en la Patente EE.UU. 5.674.982. Resumiendo, se incuban 100 ml de
sobrenadante de cada clon de hibridoma con 3x10^{4} células HeLa
en placas de 96 pocillos durante 1 h a 37ºC; se lavan entonces las
células con PBS y se añade una cantidad suficiente de HRV14 ó HRV2
para obtener un efecto citopático completo en 24-36
h. Los pocillos que están protegidos frente a la infección
(positivos) son puntuados a las 36 h. El correspondiente hibridoma
positivo sufre varias operaciones de clonación por diluciones
limitantes en placas de 96 pocillos hasta que todos los pocillos
que contienen hibridoma son positivos.
El ICAM-1 y el LDLR usados para
producir anticuerpos en esta invención pueden tener origen en
cualquier especie, en la medida en que el anticuerpo producido sea
capaz de reducir la unión de RVH a sus células huésped humanas.
Se clonan fragmentos Fv de una sola cadena contra
ICAM-1 y LDLR a partir de hibridomas contra cada
antígeno.
Una forma (una forma preferida) de clonación de
los fragmentos VH y VL es amplificarlos por reacción en cadena de
polimerasa ("PCR") a partir de un hibridoma dirigido contra
ICAM-1 o LDLR. Alternativamente, se puede clonar el
fragmento Fab del anticuerpo deseado a partir de una librería de
inmunoglobulinas combinatoria en fago \lambda en batea usando el
ICAM-1 y el LDLR purificados como antígenos (Kang y
col., 1991, Methods 2: 111-118; Barbas y
Lerner, 1991, Methods 2: 119-124). Se pueden
conectar los polipéptidos de VH y VL mediante un conector sintético
para formar un fragmento Fv de una sola cadena (scFv), o se puede
dimerizar un fragmento scFv con otro para formar dianticuerpos
(Holliger y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
6444-6448) o anticuerpos recombinantes quelantes
(CRAbs) (Neri y col., 1995, J. Mol. Biol. 246:
367-373).
Se pueden modificar las secuencias de aminoácidos
de los dominios VH y VL en base al anticuerpo original para aumentar
la afinidad por los antígenos o mejorar el rendimiento de
producción en E. coli o levaduras. El origen del anticuerpo
puede ser de cualquier mamífero, incluyendo, aunque sin limitación,
humano, ratón, rata y conejo Cuando se aísla el anticuerpo original
de una especie no humana, se pueden humanizar los dominios VH y VL
del anticuerpo, tal como mediante la utilización de los métodos de
la Patente EE.UU. 5.530.101.
Se aísla el ARN total de cada hibridoma y se
convierte en ADNc por transcriptasa inversa AMV. Se amplifican los
genes VH y VL por PCR usando diferentes combinaciones de cebadores
degenerados en el kit Ig-Primer (Novagen, WI) según
el protocolo del fabricante, o usando los cebadores descritos en
Larrick y Fry, 1991, Methods 2: 106-110. Se
clonan los fragmentos VH y VL resultantes en un vector de clonación
TA (Invitrogen, CA) y se secuencian. Se comparan las secuencias de
múltiples clones y se usan las secuencias consenso para construir
los fragmentos scFv. Se unen los genes VH y VL por un conector
artificial (GGGGS)_{3} para formar el fragmento scFv
[VH-[GGGGS]_{3}-VL] como en Batra y col.,
1990, y se subclona el fragmento scFv en un vector pBlueScript
(Stratagene, CA). También se describen métodos de producción de
fragmentos svFv en las Patentes EE.UU. 5.571.894 y 5.608.039.
Se puede humanizar la secuencia de scFv clonada
para hacerla menos inmunogénica o no inmunogénica para un hospedador
humano. La humanización de un anticuerpo puede ser llevada a cabo
como se describe en la Patente EE.UU. 5.530.101. Las secuencias de
los fragmentos scFv pueden ser también modificadas para aumentar el
rendimiento de producción, manteniendo al mismo tiempo su
especificidad antigénica, tal como cambiando los codones genéticos o
incluyendo una secuencia de señal, como se describe en la Patente
EE.UU. 5.648.237.
Se resumen métodos de producción de anticuerpos
recombinantesmultivalentes en Plückthun y Pack (1997),
Immunotechnology 3: 83-105, aquí incorporada
como referencia.
Se prefiere un anticuerpo recombinante
pentavalente. Se unen los fragmentos scFv con el dominio de
pentamerización de COMP por medio de una región de bisagra para dar
lugar al siguiente fragmento:
scFv-bisa-gra[(PQ)_{2}PK(PQ)_{4}PKPQPK(PE)_{2}]-Dominio
de pentamerización (COMP aa 28-72).
Se amplifica el dominio de pentamerización de
COMP a partir del plásmido p3b-COMP (Efimov y col.,
1994, FEBS Letters 341: 54-58) por PCR
(Tomschy y col., 1996, EMBO J. 14:
3507-3514). Se puede modificar la secuencia de
aminoácidos de este dominio de COMP para aumentar la estabilidad
del complejo. Por ejemplo, se pueden cambiar la
Lys-29 y la Ala-30 a residuos de
cisteína (Terskish y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94: 1663-
1668).
1668).
Existen numerosas secuencias conocidas para los
expertos en la técnica como adecuadas para la región de bisagra. Por
lo tanto, la que aparece así es sólo un ejemplo. El dominio de
pentamerización de COMP puede unirse con la bisagra y scFv por PCR
y ligación usando técnicas de biología molecular estándar. Se
subclona todo el fragmento en el vector pTrc/His (Invitrogen, CA)
para generar un plásmido de expresión en bacterias
pTrc/scFv-COMP.
Se expresa la proteína scFv-comp
en E. coli como se describe en Terskiskh y col., 1997,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1663-1668.
Resumiendo, se cultiva E. coli transformada con el plásmido
pTrc/scFv-COMP hasta que la DO_{600} = 0,5 y se
añade entonces
isopropil-b-D-tiogalactósido
1 mM para inducir la síntesis de proteínas, seguido de 4 h de
incubación a 30ºC. Se recogen las bacterias por centrifugación y se
lisan por tres operaciones de congelación/descongelación. Se
purifica la proteína del anticuerpo recombinante a partir del
lisado bacteriano mediante una columna de níquel (Qiagen).
La función biológica de los anticuerpos
recombinantes multivalentes (mvAb) es entonces examinada por el
ensayo de unión a receptores y el ensayo de protección de células
descritos a continuación.
- 1.
- Se puede preparar la proteína del receptor mayor de RVH ICAM-1 a partir de células HeLa como se describe en la Patente EE.UU. 5.589.453. Se puede purificar el receptor menor LDLR a partir de células HeLa como se describe en la Patente EE.UU. 5.603.932 o en Schneider y col., 1985, Methods Enzymology 109: 405-417. Alternativamente, se puede expresar el fragmento de LDLR soluble y purificarlo a partir de células de insecto Sf9 como se describe en Marlovits y col. (1998), FASEB 12: 695-703.
- 2.
- Preparación de los serotipos 14 y 2 (HRV14 y HRV2) del rinovirus humano marcados con ^{35}S-metionina.
Se lleva a cabo el procedimiento según se
describe en la Patente EE.UU. 5.603.932. Resumiendo, se infectan
cuatro monocapas de células HeLa en placas de Petri de 165 cm^{2}
con una MDI (multiplicidad de infección) de 40 con HRV14 y HRV2
durante 1 h a 34ºC en medio MEM libre de metionina (Gibco) con un
2% de suero de ternera fetal dializado. Se lavan entonces las
células dos veces con PBS y se incuban a 34ºC en medio fresco.
Después de 3 h, se añade 1 mCi de
^{35}S-metionina (Amersham) a cada monocapa y se
continúa incubando durante 24 h. Se aclara entonces el medio de las
células infectadas por centrifugación durante 30 minutos a 4.500xg.
Se centrifuga el sobrenadante de la centrifugación durante 2 h a
140.000xg. Se resuspende la pella de virus en Tris/EDTA y se
purifica además sobre un gradiente de sacarosa del
10-30%. Se analizan las fracciones individuales del
gradiente mediante un gel de SDS-PAGE al 12%. Se
combinan las fracciones puras de virus y se guardan en presencia de
seroalbúmina bovina ("BSA") al 1% a 4ºC.
Para demostrar que los anticuerpos recombinantes
multivalentes (mvAb) pueden bloquear la unión de RVH a
ICAM-1 y LDLR, se usan varias cantidades de mvAb en
este ensayo para inhibir la unión de ^{35}S HRV14 y ^{35}S HRV2
a ICAM-1 y LDLR previamente inmovilizados. Este
ensayo se basa en el ensayo de unión en solución descrito en la
Patente EE.UU. 5.674.982, con modificaciones menores. Se diluye
ICAM-1 o LDLR purificado en tampón Tris/NaCl y se
deja que se adsorba en las paredes de una placa de microtitulación.
Se bloquea entonces cada pocillo de la placa de microtitulación con
10 mg/ml de BSA y se lava luego con PBS. Se diluyen mvAbs
específicos con Triton X-100 al 0,1%/1 mg/ml de
BSA/Tris/NaCl, se añaden a cada pocillo
pre-revestido con ICAM-1 o con LDLR
y se deja incubar durante 1 h a 37ºC. El mismo tampón sin mvAb es el
control positivo. Se elimina entonces el mvAb no unido por lavado
con PBS. Se añaden aproximadamente 20.000 cpm de ^{35}S HRV14 (a
placas pre-revestidas de ICAM-1) y
^{35}S HRV2 (a placas pre-revestidas de LDLR) a
cada pocillo tratado con mvAb y se deja incubar durante 1 h a 37ºC.
Se lavan las placas y se determina la radiactividad unida. Se
espera menos radiactividad en los pocillos tratados con el mvAb. Se
puede conseguir la inhibición total de la unión de ^{35}S RVH si
se usa suficiente mvAb para bloquear por completo el
ICAM-1 y el LDLR
pre-depositados.
Se usa el ensayo descrito en Colonno y col.,
1986, J. Virol. 57: 7-12, para demostrar que
el mvAb contra ICAM-1 y LDLR puede proteger las
células huésped de la infección por RVH.
Se plaquean células HeLa en placas de 48 pocillos
(Costar) a 1,5x10^{5} células por pocillo y se incuban durante la
noche para generar monocapas confluentes. Se tratan monocapas por
duplicado con diversas cantidades de cada mvAb y se incuban durante
1 h a 37ºC. Se aplican entonces HRV14, HRV3, HRV2 y HRV49 a cada
pocillo a una MDI de 0,1 a 1 y se deja incubar durante la noche a
37ºC. Al día siguiente, se comprueba la monocapa en cuanto al efecto
citopático con un microscopio óptico. Se usan los pocillos sin
tratamiento de mvAbs, pero infectados por el RVH, como controles.
Se espera menos efecto citopático en las células tratadas con
mvAb.
Algunos virus distintos del RVH, como el virus
Coxsakie A, infectan también células huésped humanas a través de
ICAM-1. Por lo tanto, los mvAbs contra
ICAM-1 pueden ofrecer también protección contra la
infección por estos virus. Dicho efecto protector de los mvAbs
puede ser demostrado por el ensayo de protección de células antes
descrito usando la cantidad mínima de virus necesaria para obtener
un efecto citopático en 24 a 48 horas.
Vaughan y col. (1996), Nature
Biotechnology 14: 309-314, han aislado con éxito
varios anticuerpos humanos de una sola cadena con altas afinidades a
partir de una librería de exhibición de fagos que contiene un
repertorio de fragmentos scFv humanos. Se pueden aislar scFvs
humanos contra ICAM-1 y LDLR usando una estrategia
similar.
- i)
- Se lleva a cabo la construcción de la librería humana de scFv como se describe en Vaughan y col. (1996), Nature Biotechnology 14: 309-314.
Se diluye ICAM-1 o LDLR humano a
una concentración de 20 \mug/ml y se usa para revestir inmunotubos
(Maxisorb, Nunc) incubando durante 1 h a 4ºC. Se saturan los sitios
de unión que quedan con seroalbúmina bovina ("BSA"). Se incuba
primeramente una porción de la librería humana de scFv amplificada
(10^{13} fagos) durante 2 h a 4ºC en inmunotubos
pre-revestidos con 1 mg/ml de BSA. Se transfieren
los fagos no unidos a BSA a los inmunotubos
pre-revestidos con ICAM-1 o LDLR
humano. Después de incubar durante la noche a 4ºC, se eliminan los
fagos no unidos lavando 10 veces con tampón PBS que contiene un 0,5%
de Tween 20. Se eluyen los fagos con tampón de glicina 0,1 M, pH
2,2, que contiene 1 mg/ml de BSA. Se realizan cuatro operaciones
adicionales en inmunotubos revestidos con 5 \mug/ml de proteínas.
Los protocolos de batea están también descritos en Griffiths y col.
(1993), EMBO J. 12: 725-734, y Hodits y col.
(1995), J. Bio. Chem. 270: 24078-24085, y
Welply, J.K. y col. (1996), Proteins 26:
262-270.
Alternativamente, se establecerán fibroblastos de
ratón NIH3T3, que expresan ICAM-1 humano o LDLR
humano y se utilizarán para el procedimiento de batea.
Concretamente, se incuba primeramente una porción de la librería
humana de scFv con células NIH3T3 parentales y se transfieren los
fagos no unidos a células
NIH3T3-ICAM-1 o a células
NIH3T3-LDLR. Tras la incubación, se eliminan los
fagos no unidos por lavado y se amplifican los fagos unidos
infectando E. coli TG-1. Se realizan al
menos dos operaciones más del procedimiento de batea.
Se aíslan los fagos de unión a
ICAM-1 o LDLR de colonias resistentes a ampicilina
simples de E. coli TG-1 infectada (supresora)
usando el fago ayudante VCSM 13 (Stratagene) y se usan los fagos
para infectar la E. coli HB2151 (no supresora). Se usan
colonias resistentes a ampicilina simples para inocular 200 \mul
de caldo de cultivo en placas de microtitulación y se induce la
expresión de fragmentos scFv solubles por adición de
isopropil-b-D-tiogalactopiranósido
1 mM al cultivo (Griffiths, A.D. y col. (1993), EMBO J. 12:
725-734, y Hodits y col. (1995), J. Biol.
Chem. 270: 24078-24085, y Welply y col. (1996),
Proteins 26: 262-270). Se centrifugan las
bacterias para obtener una pella, se recogen los sobrenadantes que
contienen scFv, se esterilizan por filtración y se añaden a células
HeLa en ensayos de protección de células como se ha descrito
previamente. Se seleccionan los clones que dan lugar a scFv que
puede proteger las células HeLa de los efectos citopáticos causados
por la infección por RVH y se amplifican las regiones codificantes
de scFv por reacciones en cadena de polimerasa a partir de colonias
simples (Nissim y col. (1994), EMBO J. 13:
692-698). Se usan los genes scFv humanos clonados
para construir anticuerpos recombinantes multivalentes.
Alternativamente, se pueden administrar
partículas de fagos que llevan scFv contra los sitios de unión a RVH
sobre ICAM-1 o LDLR a un humano directamente en
pulverizaciones nasales como forma de prevenir y/o tratar el
resfriado común.
Se construyen librerías peptídicas aleatorias en
el vector fágico fUSE5 como se ha descrito previamente (Scott, J.K.
y Smith, G.P. (1990), Science 249: 386-390).
La construcción y la amplificación de las librerías están también
descritas con detalle en Smith, G.P. (1992), Cloning in fUSE
vectors, 10 de Febrero de 1992, ed. Division of Biological
Sciences, University of Missouri, CO., y en Smith, G.P. y Scott,
J.K. (1993), Methods Enzymol. 217:
228-257.
Los péptidos que se unen a las secuencias diana
en el ICAM-1 humano son seleccionados por el
procedimiento de batea:
Se sintetiza cada uno de los péptidos diana
mediante un sintetizador, se diluye en PBS a una concentración de 20
mg/ml y se usa para revestir pocillos de 3,5 cm incubando durante 1
h a 4ºC. Se saturan los sitios de unión restantes con seroalbúmina
bovina (BSA). Se incuba primeramente una porción de la librería
peptídica aleatoria amplificada durante 2 h a 4ºC en un pocillo de
3,5 cm pre-revestido con 1 mg/ml de BSA en PBS y
MnCl_{2} 1 mM. Se transfieren los fagos no unidos a la BSA a un
pocillo similar pre-revestido con un péptido diana.
Tras incubar durante 1 h a 4ºC, se eliminan los fagos no unidos
lavando 10 veces con tampón PBS que contiene un 0,5% de Tween 20.
Se eluye el fago unido con tampón de glicina 0,1 M, pH 2,2, que
contiene 1 mg/ml de BSA y 0,1 mg/ml de rojo de fenol. Se amplifican
los fagos usando la bacteria K91kan y se purifican parcialmente por
precipitación con polietilenglicol (Smith, G.P. (1992), Cloning in
fUSE vectors, 10 de Febrero de 1992, ed. Division of Biological
Sciences, University of Missouri, CO., y en Smith, G.P. y Scott,
J.K. (1993), Methods Enzymol. 217: 228-257.
Se repite el procedimiento de batea dos veces más.
Se determinan entonces las secuencias llevadas
por el fago seleccionado usando el kit Sequenase (United States
Biochemical) con el cebador
5'-CCCTCATAGTTAAGCGTAACG-3'
(Koivunen, E. y col., J. Bio. Chem. 268:
20205-20210).
Según la teoría de reconocimiento molecular,
péptidos con perfiles hidropáticos opuestos se unen entre sí. Un
ejemplo es que un par de péptidos codificados por las hebras
sentido y antisentido de ADN se unen entre sí específicamente
(véase Blalock, J.E. (1990), TIBTECH 8:
140-144) y se les conoce como péptidos
complementarios.
Los péptidos complementarios a las secuencias
diana en el ICAM-1 humano están codificados por la
hebra antisentido del gen del ICAM-1 humano en
orientación 5'-3' o 3'-5'. Por lo
tanto, para cada péptido diana, existen dos secuencias
complementarias y ambas tienen afinidad específica por el péptido
diana. Las secuencias de los péptidos complementarios para cada
secuencia diana en el ICAM- 1 humano están indicadas en lo que
sigue:
- Diana Nº 1: VCRHR y GHRCL
- Diana Nº 2: LGLVTG y RTLVGF
- Diana Nº 3: PVVPRQEQLL y FLNEDGPLLA
- Diana Nº 4: FSCSLPIR y GIPVSCRF
Estos péptidos complementarios (y sus homólogos)
y péptidos que los contienen pueden tener la capacidad de unirse a
la molécula de ICAM-1 humano en las secuencias
diana. Se puede mejorar la afinidad de un péptido complementario a
su secuencia diana optimizando la secuencia peptídica por un
programa informático o seleccionando péptidos a partir de una
librería de péptidos complementarios a la diana, como se describe
en la Solicitud Provisional Nº de Serie 60/083046.
Una forma de producir un péptido multivalente es
unir múltiples copias de un solo péptido o múltiples copias de
diferentes péptidos en repeticiones en tándem para crear moléculas
con las siguientes estructuras:
[péptido A-(ligante)-]_{n} (n \geq 2) o
[péptido A-(ligante)-péptido
B-(ligante)-]_{n} (n \geq 2)
Un ligante puede tener una longitud variable y
estar compuesto de cualesquiera residuos de aminoácidos. Una forma
alternativa de producir un péptido multivalente es unir un solo
péptido o una repetición en tándem de péptidos con una secuencia de
polimerización derivada de una proteína de enrollamiento enrollado.
Estas moléculas tienen las siguientes estructuras:
péptido A - - (bisagra) - - secuencia
de polimerización - - marcaje de purificación o [péptido
A-(ligante)-]_{n}-secuencia de
polimerización-marcaje de purificación.
Se prefiere un péptido pentavalente. Se puede
construir del mismo modo que el anticuerpo recombinante pentavalente
antes descrito. Una vez se conoce la secuencia nucleotídica
codificante de un péptido, los expertos en la técnica podrán
construir un gen de péptido multivalente como se ha descrito
anteriormente.
La caracterización y producción del péptido
multivalente son llevadas a cabo del mismo modo que los anticuerpos
recombinantes multivalentes.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
ser administrados a un hospedador solos o en una composición
farmacéutica que incluye el compuesto activo y un vehículo o
excipiente.
Según esta invención, los anticuerpos
recombinantes multivalentes antes mencionados pueden ser
administrados a un sujeto para reducir o inhibir la infección por
rinovirus. Los anticuerpos son útiles como profilaxis o medio para
tratar trastornos tales como el resfriado común y la OMA. Las
composiciones farmacéuticas de la invención contienen los
anticuerpos en asociación con un material vehiculizante compatible
farmacéuticamente aceptable.
Se pueden encontrar técnicas para la formulación
y la administración en Remington's Pharmaceutical Sciences,
18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Se puede utilizar
cualquier material vehiculizante convencional para administración
tópica. Se pueden usar vehículos o excipientes para facilitar la
administración del compuesto, por ejemplo, para aumentar la
solubilidad del compuesto. Más aún, las preparaciones farmacéuticas
pueden contener otros agentes farmacéuticamente activos. Se pueden
añadir aditivos adicionales, tales como conservantes,
estabilizantes, agentes emulsores, tampones y similares, según las
prácticas aceptadas de la composición farmacéutica.
Se puede utilizar cualquier composición
convencional utilizada para aplicación al epitelio nasal según esta
invención. Los anticuerpos antes mencionados son preferiblemente
preparados como pulverizaciones, ungüentos, tinturas, cremas,
geles, soluciones, lociones, suspensiones y similares. Las
preparaciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden
contener adyuvantes, tales como conservantes, estabilizantes,
agentes humectantes, emulsores, sales para variar la presión
osmótica y/o tampones. Pueden prepararse mezclando el componente
activo antes mencionado (es decir, una cantidad farmacéuticamente
efectiva de un anticuerpo recombinante multivalente) con vehículos
sólidos o líquidos no tóxicos y terapéuticamente inertes usados
habitualmente en dichas preparaciones.
Preferiblemente, las soluciones tópicas están
contenidas en una botella presurizada unida a una bomba manual y los
mvAbs o el péptido multivalente son administrados a la mucosa nasal
y nasofaríngea como aerosoles.
Claims (7)
1. Un anticuerpo recombinante multivalente contra
ICAM-1 que tiene tres o más dominios de unión
antígeno para ICAM-1, donde dicho anticuerpo tiene
una constante de afinidad aparente por ICAM-1 no
inferior a 10^{8} M^{-1}.
2. El anticuerpo recombinante multivalente de la
reivindicación 1 que tiene cuatro o más dominios de unión a antígeno
para ICAM-1.
3. El anticuerpo recombinante multivalente de la
reivindicación 1 que tiene cinco o más dominios de unión a antígeno
para ICAM-1.
4. El anticuerpo recombinante multivalente de la
reivindicación 1, que tiene tres o más fragmentos Fv de cadena
sencilla contra ICAM-1, donde cada uno de dichos
fragmentos Fv de cadena sencilla se une a un dominio de
polimerización.
5. Una formulación tópica para prevenir la
infección por rinovirus, consistente en:
una cantidad farmacéuticamente efectiva de un
anticuerpo recombinante multivalente de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Uso de un anticuerpo recombinante multivalente
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un
medicamento para prevenir el resfriado común en un hospedador y
cuyo anticuerpo es para administración al epitelio nasal de dicho
hospedador.
7. Uso de un anticuerpo recombinante multivalente
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un
medicamento para prevenir la otitis media aguda en un hospedador y
cuyo anticuerpo es para administración al epitelio nasal de dicho
hospedador.
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