KR20170065783A

KR20170065783A - Ｃ형 간염 바이러스의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 c형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법

Info

Publication number: KR20170065783A
Application number: KR1020150171959A
Authority: KR
Inventors: 유은경; 이선희; 이찬미; 홍승기; 하건우
Original assignee: 주식회사 바이오노트
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2017-06-14
Also published as: KR101784455B1

Abstract

Ｃ형 간염 바이러스의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법에 관한 것이다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법{Fusion polypeptide comprising hydrophilic fragments of Hepatitis C virus, composition, kit and method for diagnosing Hepatitis C virus infection comprising the same}

최근 의학에 연관된 여러 기초 학문들이 발전을 거듭하면서 인류에게 질병을 일으킬 수 있는 여러 전염성 병원균이 속속 밝혀지고 있다. 그 중 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus: HCV)는 B형 간염바이러스와 더불어 국내뿐 아니라 세계적으로도 점점 문제가 되고 있다.

C형 간염 바이러스(HCV)에 감염되어 나타나는 C형 간염은 간에 염증이 발생하는 질환으로 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈액이 정상인의 상처 난 피부나 점막, 혈액을 통해 전염될 수 있다. C형 간염 바이러스의 감염은 대부분 감염 초기에 증상이 없으며 성인에게 감염된 경우 B형 간염 바이러스 감염과 달리 75% 이상에서 만성화된다. 국내 간경변증 환자의 약 12%, 간세포암 환자의 약 15%가 C형 간염 바이러스에 의해 질환이 발병되며 B형 간염 바이러스와 함께 만성간질환을 일으키는 주요 원인이다.

그러나 기존의 C형 간염 바이러스 진단 시약은 C형 간염 바이러스의 인체감염 후 검출하는데 상당한 시간이 소요되어 수혈을 위한 혈액 및 혈액 제재 등에 사용시 C형 간염 바이러스에 오염된 상태로 사용될 수 있다. 이에 대한 보완책으로 간염 분자 진단 등의 보조적 방법이 사용되고 있으나 이는 진단에 필요한 시약구입비 및 검색 시험자의 인건비, 기기 및 시설이 설치, 운영비 등의 제반 경비로 인하여 막대한 부담이 가중되고, 혈액 및 혈액 제재의 가격도 증가할 수밖에 없다.

따라서, 보다 간편하고 신속하게 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단이 요구되고 있다.

일 양상은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3(hepatitis C virus non-structural protein 3: HCV NS3)의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열인 3개 이상의 친수성 단편을 포함하는 분리된 융합 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 융합 폴리펩티드를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료를 상기 융합 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3(hepatitis C virus non-structural protein 3: HCV NS3)의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열인 3개 이상의 친수성 단편을 포함하는 분리된 융합 폴리펩티드를 제공한다.

상기 HCV NS3는 두 가지 구조 도메인, 예를 들면, 바이러스 단백질의 성숙에 속하는 활성화 세린 프로테아제 활성에 의해 부여된 N-말단 도메인, 및 바이러스성 게놈의 복제에서 역할을 하는 NTPase 활성과 관련된 헬리카아제(helicase) 활성을 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 HCV NS3는 헬리카아제 활성을 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 상기 헬리카아제 활성을 포함하는 C-말단 도메인은 NS3의 N-말단으로부터 150번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 160번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 170번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 180번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 185번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 160번 아미노산부터 620번 아미노산까지의 아미노산 서열, 또는 170번 아미노산부터 600번 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 HCV NS3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 HCV NS3의 헬리카제(helicase) 활성을 포함하는 C-말단 도메인일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "친수성 단편(hydrophilic fragment)"은 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 친수성을 갖는 일 영역을 의미할 수 있으며, 예를 들면, Kyte-Doolittle법(Kyte, J. and Doolittle, R. 1982,J. Mol. Bio. 157, 105-132)에 의해 결정될 수 있다. 상기 친수성 단편은 부분적으로 친수성을 갖고, 일부의 아미노산 잔기만이 물과 상호 작용할 수 있는 물질을 포함하는 것이며, 단편의 전체 부위가 친수성을 가질 필요는 없다. 예를 들면, 단편의 아미노산 서열에 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 세린, 트레오닌, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신 및 프롤린을 포함하는 극성 아미노산이 포함되어 있는 경우 그 단편은 친수성을 가질 수 있으며, 단편의 아미노산 서열에 소수성 아미노산이 포함되어 있어도 친수성을 잃지 않을 수 있다. 상기 단편이 소수성 아미노산으로 이루어진 영역이라 할지라도, 인접한 친수성 아미노산의 영향에 의해 친수성을 갖는 영역이 될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 친수성 단편은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 융합 폴리펩티드는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 적어도 3개의 친수성 단편 각각은 링커(예를 들면, 펩티드 링커)에 의해 연결된 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "링커(linker)"는 두 개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 친수성 단편)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미할 수 있다. 상기 링커는 생리학적 조건 또는 다른 표준 폴리펩티드 조건(예를 들면, 폴리펩티드 정제 조건, 폴리펩티드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합 파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지의 역할을 수행할 수도 있다. 상기 링커는 펩티드 링커, 예를 들면, 복수의 아미노산으로 구성된 링커일 수 있다. 상상기 링커는 예를 들어, 1 내지 100개, 2 내지 100개 또는 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 상기 펩티드 링커는 일 융합 단편의 C-말단 또는 다른 융합 단편의 N-말단에 연결되는 것일 수 있다. 한편, 상기 펩티드 링커는 상기 융합 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 펩티드 링커는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다. 상기 서열번호 15의 아미노산 서열은 서열번호 3의 친수성 단편, 서열번호 5의 친수성 단편, 및 서열번호 7의 친수성 단편을 포함하고, 각각의 친수성 단편은 서열번호 25의 아미노산 서열에 의해 연결된 것일 수 있다.

상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본래 단백질의 목적 기능 또는 특성, 예를 들면, 항원성을 실질적으로 변화시키지 않는 범위에서 적절하게 변형시킬 수 있다. 아미노산의 변형은 아미노산 잔기 치환체의 유사성, 예를 들면 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어지며, 이를 위해 아미노산의 소수성 인덱스(hodrophobic index)가 고려될 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 일부 아미노산의 치환, 결실, 부가 등일 수 있으며, 치환은 특히 보존적 치환일 수 있다. 용어 "보존적 치환"은 결과적인 분자의 생물학적 활성이 유의하게 변경시키지 않는 치환으로서, 치환되는 아미노산이 단백질의 3차 구조 또는 국부 전하 상태에 유의한 영향을 야기하지 않는 경우를 지칭한다. 분자 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환을 포함할 수 있다.

다른 양상은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3(hepatitis C virus non-structural protein 3: HCV NS3) 또는 그의 C-말단 도메인으로부터의 적어도 3개의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

HCV NSC 또는 그의 C-말단 도메인, 친수성 단편, 및 융합 폴리펩티드에 대해서는 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미할 수 있다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함할 수 있다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent condition) 하에서, 예를 들어, 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미할 수 있다.

또한, 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 80% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성 또는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 HCV NS3의 C-말단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 것일 수 있다. 또한 상기 친수성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 구성된 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 적어도 3개의 친수성 단편을 연결하기 위한 펩티드 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 펩티드 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열 구성된 것일 수 있다. 상기 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 각각의 뉴클레오티드 서열 사이에 서열번호 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 융합 폴리펩티드의 제조는 상기 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 당해 기술분야에 공지된 유전자 조작 기술 및 화학적 합성을 통해 수행될 수 있다. 상기 유전자 조작 기술은 복제가능한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 구축하여 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고, 숙주 세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 방법을 포함할 수 있다.

따라서, 일 양상은 전술한 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입시킨 재조합 발현 벡터를 구축하는 단계, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에서 발현된 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3 또는 그의 C-말단 도메인으로부터의 적어도 3개의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서, 숙주 세포 내에 도입되면 독립적으로 복제되어 벡터 및 내부에 삽입된 외래 DNA 등의 카피를 생산한다. 용어 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)"는 특정 단백질의 증폭을 목적으로 내부에 외래 DNA 단편을 삽입시킨 벡터로서, 상기 외래 DNA 단편은 전술된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 발현 또는 클로닝을 목적으로 한 벡터 시스템의 구축 방법은 공지되어 있다.

상기 벡터는 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 조절 서열을 포함할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 코딩 서열의 발현을 수행하는데 필요한 핵산 서열을 지칭하며, 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 상기 구성요소들이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 기능적 결합 관계에 의한 병치(juxtaposition)를 의미할 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 조절 서열 외에, 제한 효소 절단 부위, 약물 저항성 유전자와 같은 마커 유전자, 분비 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 제한효소 절단 부위는 제한효소에 의해 특이적으로 인식되어 절단되는 특정한 염기 서열을 지칭한다. 상기 절단 부위는 예를 들면, EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, SalI, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, Xho I과 같은 제한효소에 의해 특이적으로 인식되는 서열일 수 있다. 상기 마커 유전자는 선택 표지로서 기능하며, 암피실린, 게나마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 및 테트라사이클린과 같은 약물의 내성 유전자일 수 있다. 상기 분비 신호 서열 또는 리더 서열은, 합성된 단백질을 세포 구획 (예를 들면, 주변 세포질 공간(periplasmic space))으로 향하게 하거나 세포외 배지로 분비하도록 유도하는 서열로, 전술된 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 이와 같은 서열들은 도입되는 DNA, 숙주 세포의 종류, 배양 배지의 조건 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 숙주 세포는 전술된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시켜 생성될 수 있다.

상기 숙주 세포는 상기 재조합 벡터를 안정화하고 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 원핵 생물 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 원핵 생물은 단백질의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환될 수 있는 박테리아를 지칭한다.

재조합 발현 벡터의 숙주 세포로의 형질전환은 예를 들면, DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 스크래프 로딩(scrape loading) 및 감염(infection) 등에 의해 수행될 수 있다.

숙주 세포의 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지 및 배양조건을 사용하여 수행될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들면 LB 배지, Ham's F10 (Sigma), MEM (Minimal Essential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma)등이 이용될 수 있다. 필요한 경우, 호르몬 또는 기타 성장 인자, 염, 완충제, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코오스 등이 공지된 적합한 농도로 보충될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 선택된 숙주 세포에 따라 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

숙주 세포에 의해 발현된 융합 폴리펩티드는 분비 신호 펩티드에 의해 세포 외로 분비될 수 있으며, 이 경우 배양액 또는 배지로부터 이를 회수함으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 배양 상청액을 시판되는 단백질 필터를 사용하여 농축시켜 융합 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 그러나, 분비 신호 서열이 없이 발현된 경우, 상기 융합 폴리펩티드는 세포 내 페리플라즘 공간에 존재하므로 세포 용해물(cell lysate)로부터 직접 수득될 수 있다. 페리플라즘 공간으로 분비되는 융합 폴리펩티드를 단리시키는 공정은 공지되어 있으며, 일반적으로 미립자 파편(숙주 세포 또는 분해된 단편)을 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다.

선택적으로, 이러한 배양물로부터 수득된 융합 폴리펩티드를 당업계에 공지된 방법에 의해 추가적으로 정제할 수 있다. 예를 들면, 회수되는 융합 폴리펩티드에 따라, 상기 융합 폴리펩티드는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 분별 용해 (예를 들면, 암모늄 술페이트 침전)와 같은, 통상의 단백질 정제 기술을 사용할 수 있다.

다른 양상은 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3 또는 그의 C-말단 도메인으로부터의 적어도 3개의 친수성 단편을 포함하는 분리된 융합 폴리펩티드를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 HCV NSC 또는 그의 C-말단 도메인, 친수성 단편, 및 융합 폴리펩티드, 및 그를 제조하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포에 대해서는 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 용어 "C형 간염 바이러스 감염의 진단"은 개체가 현재 또는 이전에 C형 간염 바이러스에 감염이 되었는지를 결정하거나, 개체 중 C형 간염 바이러스에 대한 항체가 존재하는지를 결정하거나, 개체 중 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검출하거나, 개체 중 C형 간염 바이러스가 존재하는지 결정하거나, 개체 중 C형 간염 바이러스를 검출하는 것을 포함하는 의미일 수 있다. 또한 상기 C형 간염 바이러스 감염의 진단은 C형 간염 바이러스 감염에 의해 발병하는 질병, 예를 들면, 간염(예를 들면, C형 간염), 또는 림프종의 진단을 포함할 수 있다.

상기 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 단독 또는 다른 물질과 접합된 것일 수 있다. 상기 다른 물질은 검출가능한 신호를 발생하거나 발생시킬 수 있는 표지일 수 있다. 용어 "검출 가능한 표지(detectable label)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자로, 상기 검출 가능한 표지는 예를 들어, 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색물질, 형광물질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 또는 양자점 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 표지는 P³² 및 S³⁵와 같은 방사선동위원소, 화학발광 (chemiluminescent) 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자 및 다이와 같은 분광학적 마커, 및 자기 표지물을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 상기 융합 폴리펩티드 항원을 액체 중에서 포함하는 액체 조성물일 수 있다. 상기 액체는 상기 항원을 용해시킬 수 있고 유지시킬 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 물, 또는 PBS와 같은 버퍼 용액일 수 있다. 상기 조성물은 상기 항원을 안정하게 유지하는 물질을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 항체에 결합하는 물질 및/또는 제2 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표지되거나 표지되지 않은 물질, 항-인간 항체, 항-토끼 항체, 또는 항-마우스 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 ELISA 또는 면역형광 분석과 같은 항체를 이용한 분석 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 시료가 적용되는 부위인 검체 패드; 상기 검체 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고, C형 간염 바이러스 항체에 결합하는 물질이 이동가능하게 지지되어 있는 컨쥬게이트 패드; 상기 컨쥬게이트 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 상기 시료가 이동하는 크로마토그래피 막(membrane) 물질로서, C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3 또는 그의 C-말단 도메인으로부터의 적어도 3개의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드가 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질; 상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드; 및 상기 검체 패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체를 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료를 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3 또는 그의 C-말단 도메인으로부터의 적어도 3개의 친수성 단편을 포함하는 분리된 융합 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및

상기 융합 폴리펩티드와 상기 시료 중 C형 간염 바이러스 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스 진단에 대한 정보를 제공하기 위한 C형 간염 바이러스 항체를 검출하는 방법 또는 C형 간염 바이러스를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

상기 접촉시키는 단계는 액체 매질 중에서 정적 또는 동적으로 이루어질 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 상기한 바와 같은 키트 상에서 이루어지는 것일 수 있다.

상기 복합체의 존재를 검출하는 단계는 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 존재를 검출하는 단계는 복합체를 다시 분리하여 상기 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체의 수준을 측정하는 것, 또는 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 상기 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체의 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다. 상기 형성된 복합체의 수준을 직간접적으로 측정함으로써, 시료 중 포함된 항 HCV 항체를 검출하여 개체의 C형 간염 유무를 진단할 수 있다.

또한, 상기 방법은 복합체가 검출된 경우, 상기 개체는 C형 간염 바이러스 감염인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 C형 간염 바이러스 감염을 갖는 개체 중의 항체와 결합하는 것일 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드는 HCV NS3 또는 그의 C-말단 도메인으로부터의 하나의 친수성 단편 또는 두 개의 친수성 단편이 융합된 융합 폴리펩티드에 비해 현저한 항원성을 가져 C형 간염 바이러스 감염을 갖는 개체 중의 항체와 특이적 결합능을 갖는다. 따라서, 일 구체예에 따른 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 조성물 및 키트는 C형 간염 바이러스 감염의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법에 의하면, 보다 간편하고 정확하게 개체 내 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검출할 수 있는 효과가 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: HCV NS3 (hepatitis C virus non-structural protein 3)의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조 및 그의 항원성 및 안정성 평가

1. HCV NS3 의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 제조

(1.1) HCV NS3 의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 제조

HCV NS3의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제조하기 위해 한국형 HCV(isolate: C_59-12/ south korea)의 DNA를 주형 DNA로 사용하였고, 각각의 단편에 대한 발현 플라스미드를 제조하였다.

우선, 대조군 단편으로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCV NS3의 C-말단 도메인(이하 'NS3f1'이라 함)을 사용하였다.

HCV NS3의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제조하기 위해서, HCV NS3 유전자 내에 존재하는 친수성 단편 중 3개의 친수성 단편, 구체적으로 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 84번 아미노산을 갖는 단편(서열번호 3, 이하 'NS3f2'라 함), 93 내지 164번 아미노산을 갖는 단편(서열번호 5, 이하 'NS3f3'라 함), 261 내지 396번 아미노산을 갖는 단편(서열번호 7, 이하 'NS3f4'라 함), 및 그들의 조합을 사용하였다. 이하에서 상기 NS3f2 및 NS3f3의 융합 폴리펩티드(서열번호 9)를 'NS3f5', 상기 NS3f3 및 NS3f4의 융합 폴리펩티드(서열번호 11)를 'NS3f6', 상기 NS3f2 및 NS3f4의 융합 폴리펩티드(서열번호 13)를 'NS3f6', 및 상기 NS3f2, NS3f3, 및 NS3f4의 융합 폴리펩티드(서열번호 15)를 'NS3f8'이라 한다.

상기 각각의 단편을 합성하기 위해 하기 표 1에 나타낸 프라이머와 Taq 폴리머라아제를 사용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. PCR은 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 결합과 72℃에서 2분을 1 cycle 반응을 30회 반복하였으며, 사용된 올리고 프라이머의 농도는 각각 50 pmole이었다.

프라이머	서열번호
NS3f1 정방향 프라이머	서열번호 17
NS3f1 역방향 프라이머	서열번호 18
NS3f2 정방향 프라이머	서열번호 19
NS3f2 역방향 프라이머	서열번호 20
NS3f3 정방향 프라이머	서열번호 21
NS3f3 역방향 프라이머	서열번호 22
NS3f4 정방향 프라이머	서열번호 23
NS3f4 역방향 프라이머	서열번호 24

상기 NS3f5, NS3f6, NS3f7, 및 NS3f8의 융합 폴리펩티드 항원은 각각의 단편들 사이에 세린과 글리신 브릿지(서열번호 25의 아미노산 서열, 서열번호 26 내지 서열번호 30의 핵산 서열)를 추가하여 연결시켜, 항원 정제 후 접힘에 의해 각각의 단편이 엉키지 않도록 하였다.

각 합성 과정을 통해 증폭된 DNA 단편들을 각각 저융점 아가로즈(Low melting Agarose)젤 전기영동으로 분리하고 제한효소 BamHI (NEB #R0136S, USA), 및 SalI(NEB, #R0138S, USA)로 절단하였다. 또한, pGEX-4t 발현 플라스미드를 제한효소 BamHI (NEB #R0136S, USA), 및 SalI(NEB, #R0138S, USA)로 절단하였다. 다음에, 상기 DNA 단편들과 상기 플라스미드를 각각 라이게이션(ligation) 하여 재조합 발현 플라스미드 pHCV NS3f1 내지 NS3f8 DNA를 제조하였다.

(1.2) HCV NS3 의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제

상기 제조된 HCV NS3의 단편을 정제하기 위해, 상기 제조된 단백질 발현 플라스미드를 대장균 BL21 균주에 형질전환 하였다. 이렇게 형질 전환된 균주를 암피실린 50g/를 함유하는 LB배지(1% 박토트 립톤, 0.5% 효모액기스, 1% NaC1)에서 37 ℃로 배양하다가 흡광도(A600)가 0.5로 될 때 IPTG(isopropyl-thio-D-galactoside)를 1mM농도로 첨가하고 16시간 배양하였다. 각 시간별로 배양액을 취해 그 세포파쇄액을 SDS 폴라이크릴 아미드 젤 전기영동과 웨스턴 블로팅을 수행하였고, 그 결과, HCV NS3 단편이 발현되었음을 확인하였다.

이후에 상기 형질전환된 BL21 균주를 2L 배양 배지를 사용하여, 37 ℃의 발효기에서 2시간 정도 배양시킨 후 흡광도가 0.5(A600)일 때 IPTG를 3mM농도로 첨가하였다. 추가적으로 6시간 동안 더 배양하여 항원 단편의 발현을 유도하였으며, 배양이 끝난 후에 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 뒤 인산염 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척 후 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 파쇄된 균체 용액을 10,000g에서 30분간 원심분리 후 상층액의 가용성 단백질 부위만을 분리하였다. 이후, 항원이 함유된 상층액을 0.45 ㎛ 필터(Sartorius stedim, Ministart)로 여과시킨 후 항원이 함유된 상층액을 평형액(NaN3/sigma, PBS(NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄)/sigma, 이온수)과 1:1 비율로 혼합하였다. 다음으로 글루타티온 레진 컬럼(GE healthcare)에 항원을 전량 로딩한 후에, O.D₂₈₀=0.05 이하가 될 때까지 평형액으로 세척한 후 용출액(1M Tris(pH8.0)/sigma, L-Glutathione reduced/sigma(G6529-25G))으로 항원 단편을 회수하였다. 회수한 항원 단편은 BCA법(Pierce, USA)을 이용하여 정량하여 사용 전까지 -70 ℃ 에 보관하였다.

2. HCV NS3 의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 항원성 및 안정성 평가

(2.1) 항원성 평가

상기 정제된 8종의 항원 단편에 대한 항원성을 평가하기 위해, 효소연결면역흡광도분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 정제된 HCV NS3 항원 단편을 2.5 ug/ml의 농도로 96 웰 흡착 플레이트(Costar사)에 코팅하였다. 이후에, HCV mixed titer Accuset Performance Panel(0810-0175, Seracure) 검체를 10 ㎕/well의 용량으로 분주하고 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후 5회 세척하고 항 휴먼 IgG HRP 컨쥬게이트(A0170, sigma)를 100 ㎕/well의 용량으로 분주하고 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 30분 반응 후 5회 세척하고 기질액(tetramethylbenzidine, kem-en-tec)을 100 ㎕/well의 용량으로 분주하여 15분간 발색반응을 시키고 반응정지액(1N sulfuric acid, Junsei)을 100 ㎕/well의 용량을 첨가하였다. 반응을 정지시킨 후 판독기(sunrise, tecan)에서 450nm 파장으로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	NS3f1	NS3f2	NS3f3	NS3f4	NS3f5	NS3f6	NS3f7	NS3f8
판넬번호	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값
1	1.854	0.521	0.431	1.754	0.741	1.945	1.865	2.014
2	2.031	0.753	0.638	1.264	0.659	1.784	1.650	2.954
3	2.214	0.625	0.715	1.954	0.815	2.305	2.018	2.654
4	2.069	0.485	0.628	1.531	0.664	1.954	1.867	2.982
5	1.846	0.512	0.465	1.623	0.718	1.608	1.594	2.654
6	1.659	0.451	0.543	1.532	0.603	1.840	1.765	2.715
7	2.068	0.745	0.642	1.846	0.794	1.952	1.846	2.935
8	2.155	0.632	0.522	1.478	0.805	2.064	1.996	2.748
9	2.096	0.516	0.717	1.654	0.669	1.841	1.695	2.953
10	2.134	0.534	0.425	1.669	0.674	1.854	1.749	2.965
11	1.406	0.231	0.302	1.039	0.457	1.156	1.148	2.159
12	1.550	0.217	0.419	1.265	0.534	1.628	1.526	2.064
13	2.165	0.468	0.549	1.642	0.650	1.745	1.648	2.953
14	2.220	0.521	0.556	1.488	0.649	1.655	1.526	2.784
15	2.046	0.625	0.472	1.674	0.708	1.950	1.864	2.685
16	0.041	0.023	0.033	0.041	0.031	0.036	0.033	0.043

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 하나 또는 두 개의 친수성 단편을 포함하는 HCV NS3 항원은 대조군 대비 항원성이 높지 않았으나, 일 구체예에 따른 세 개의 HCV NS3 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 항원은 대조군 또는 하나 또는 두 개의 친수성 단편을 포함하는 HCV NS3 항원에 비해 항원성이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다.

(2.2) 안정성 평가

항원 단편의 안정성을 평가하기 위해 상기 NS3f8 항원과 대조군 항원 NS3f1 항원을 4 ℃, -20 ℃, -40 ℃에 12개월간 보관하였다. 이후에, 상기 실시예 (2.1)과 동일한 방법으로 항원성을 평가하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	NS3f1				NS3f8
	제조직후	12개월 보관			제조직후	12개월 보관
		4 ℃	-20 ℃	-40 ℃		4 ℃	-20 ℃	-40 ℃
판넬번호	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값	흡광도값
1	1.847	0.954	1.522	1.784	2.140	2.051	2.210	2.105
2	2.003	1.124	1.856	2.065	2.947	2.794	2.915	2.867
3	2.156	1.023	2.014	2.231	2.784	2.655	2.718	2.651
4	1.984	0.954	1.568	2.084	2.843	2.947	2.864	2.915
5	1.748	0.815	1.547	1.654	2.719	2.594	2.648	2.715
6	1.954	0.944	1.748	1.847	2.695	2.614	2.694	2.765
7	2.164	0.748	1.945	2.064	2.975	2.855	2.905	2.933
8	2.064	1.360	1.845	1.985	2.840	2.748	2.695	2.718
9	2.114	0.965	2.136	2.084	2.916	2.965	2.903	2.846
10	1.987	0.822	1.749	2.031	3.0<	2.849	2.914	3.0<
11	1.531	0.465	1.598	1.627	2.213	2.105	2.047	2.164
12	1.624	0.815	1.824	1.718	1.984	2.014	2.140	2.157
13	2.031	1.007	1.965	2.063	3.0<	2.894	2.966	3.0<
14	2.147	0.925	2.065	2.214	2.964	2.746	2.823	2.814
15	2.061	0.834	1.763	1.903	2.745	2.641	2.632	2.651
16	0.042	0.033	0.047	0.034	0.042	0.043	0.044	0.041

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 항원은 보관 온도에 상관없이 12개월 보관 후에 항원성이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있다. 이에 반해, 일 구체예에 따른 세 개의 HCV NS3 친수성 단편을 포함하는 융합 폴립펩티드 항원은 보관 온도에 상관없이 12개월 보관 후에 항원성이 거의 변화하지 않는 것을 확인할 수 있다.

상기의 결과로 일 구체예에 따른 융합 폴리펩티드 항원은 항원성 및 안정성이 뛰어나, C형 간염 바이러스의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> SBIinternational <120> Fusion polypeptide comprising hydrophilic fragments of Hepatitis C virus, composition, kit and method for diagnosing Hepatitis C virus infection comprising the same <130> PN112453 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 433 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 1 <400> 1 Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala 1 5 10 15 His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala 20 25 30 Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val 35 40 45 Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala Tyr Gly Thr 50 55 60 Asp Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro 65 70 75 80 Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser 85 90 95 Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp 100 105 110 Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr 115 120 125 Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser 130 135 140 Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Gly Leu Ser Asn Thr 145 150 155 160 Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Val Ile Lys 165 170 175 Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu 180 185 190 Leu Ala Ala Lys Leu Ser Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr 195 200 205 Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Ala Ser Gly Asp Val Val Val 210 215 220 Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser 225 230 235 240 Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu 245 250 255 Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val 260 265 270 Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile 275 280 285 Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser 290 295 300 Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ser Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu 305 310 315 320 Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro 325 330 335 Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe 340 345 350 Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln 355 360 365 Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys 370 375 380 Ala Arg Ser Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys 385 390 395 400 Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr 405 410 415 Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr 420 425 430 Lys <210> 2 <211> 1299 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 1 <400> 2 acagacaact cctccccccc ggcagtaccg cagacattcc aagtggccca tctacacgct 60 cccaccggca gtggcaagag caccaaagtg ccagctgcgt acgcagccca agggtacaag 120 gtactagtcc tgaacccgtc tgttgccgcg accttaggtt ttggggcgta tatgtccaag 180 gcatatggta ccgaccccaa tgtcagaact ggggtaagga ccatcaccac gggcagcccc 240 atcacgtact ccacctacgg caagttcctt gctgacggcg gttgctctgg gggcgcctac 300 gacatcataa tatgcgatga gtgccactca actgactcga ctaccatctt gggcatcggc 360 acagtcctgg accaagcgga gacggctgga gcgcggctcg tcgtgctcgc caccgctaca 420 cctccggggt cggtcaccgt gccacaccca aatatcgagg aagtgggcct gtccaatact 480 ggggagatcc ccttctatgg caaagccatc cccatcgagg tcatcaaggg gggaaggcat 540 ctcatcttct gccattccaa gaagaagtgt gacgagctcg ccgcgaagct gtcggccctc 600 ggaatcaatg ctgtagcata ttaccggggt cttgatgtgt ccgtcatacc ggctagcgga 660 gacgtcgttg tcgtggcaac agacgcccta atgacgggct tcaccggcga ctttgactca 720 gtcatcgact gtaacacatg tgtcacccag acagtcgatt tcagcttgga ccccaccttc 780 accattgaga cgacgaccgt gccccaagac gcggtgtcgc gctcgcagcg gcgaggcagg 840 actggtaggg gtagggcagg catctacagg tttgtgactc cgggagaacg gccctcgggc 900 atgttcgatt cctcggtcct gtgtgagtgt tatgactcgg gctgtgcttg gtacgaactc 960 acgcccgctg agacctcggt taggttgcgg gcatacctaa atacaccagg gctgcccgtc 1020 tgtcaggacc atctggagtt ctgggagagt gtcttcacag gcctcaccca catagatgcc 1080 cacttcttgt cccaaactaa gcaggcagga gacaacttcc cctacctggt agcataccaa 1140 gctacagtgt gcgccaggtc tcaggcccca cctccatcgt gggatcaaat gtggaagtgt 1200 ctcatacggc tcaagcccac actgcacggg ccaacgcccc tgctgtatag gctaggagcc 1260 gttcaaaatg aggtcaccct cacacacccc ataaccaaa 1299 <210> 3 <211> 85 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 2 <400> 3 Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val 1 5 10 15 Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro 20 25 30 Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser 35 40 45 Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Thr Asp Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser 65 70 75 80 Pro Ile Thr Tyr Ser 85 <210> 4 <211> 255 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 2 <400> 4 ttcacagaca actcctcccc cccggcagta ccgcagacat tccaagtggc ccatctacac 60 gctcccaccg gcagtggcaa gagcaccaaa gtgccagctg cgtacgcagc ccaagggtac 120 aaggtactag tcctgaaccc gtctgttgcc gcgaccttag gttttggggc gtatatgtcc 180 aaggcatatg gtaccgaccc caatgtcaga actggggtaa ggaccatcac cacgggcagc 240 cccatcacgt actcc 255 <210> 5 <211> 72 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 3 <400> 5 Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys 1 5 10 15 His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp 20 25 30 Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr 35 40 45 Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Gly 50 55 60 Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro 65 70 <210> 6 <211> 216 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 3 <400> 6 ggcggttgct ctgggggcgc ctacgacatc ataatatgcg atgagtgcca ctcaactgac 60 tcgactacca tcttgggcat cggcacagtc ctggaccaag cggagacggc tggagcgcgg 120 ctcgtcgtgc tcgccaccgc tacacctccg gggtcggtca ccgtgccaca cccaaatatc 180 gaggaagtgg gcctgtccaa tactggggag atcccc 216 <210> 7 <211> 136 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 4 <400> 7 Thr Ile Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln 1 5 10 15 Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile Tyr Arg Phe Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys 35 40 45 Glu Cys Tyr Asp Ser Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu 50 55 60 Thr Ser Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val 65 70 75 80 Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr 85 90 95 His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn 100 105 110 Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ser Gln 115 120 125 Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln 130 135 <210> 8 <211> 408 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 4 <400> 8 accattgaga cgacgaccgt gccccaagac gcggtgtcgc gctcgcagcg gcgaggcagg 60 actggtaggg gtagggcagg catctacagg tttgtgactc cgggagaacg gccctcgggc 120 atgttcgatt cctcggtcct gtgtgagtgt tatgactcgg gctgtgcttg gtacgaactc 180 acgcccgctg agacctcggt taggttgcgg gcatacctaa atacaccagg gctgcccgtc 240 tgtcaggacc atctggagtt ctgggagagt gtcttcacag gcctcaccca catagatgcc 300 cacttcttgt cccaaactaa gcaggcagga gacaacttcc cctacctggt agcataccaa 360 gctacagtgt gcgccaggtc tcaggcccca cctccatcgt gggatcaa 408 <210> 9 <211> 162 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 5 <400> 9 Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val 1 5 10 15 Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro 20 25 30 Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser 35 40 45 Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Thr Asp Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser 65 70 75 80 Pro Ile Thr Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Ser Gly Gly 85 90 95 Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly 115 120 125 Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr 130 135 140 Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Gly Leu Ser Asn Thr Gly Glu 145 150 155 160 Ile Pro <210> 10 <211> 486 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 5 <400> 10 ttcacagaca actcctcccc cccggcagta ccgcagacat tccaagtggc ccatctacac 60 gctcccaccg gcagtggcaa gagcaccaaa gtgccagctg cgtacgcagc ccaagggtac 120 aaggtactag tcctgaaccc gtctgttgcc gcgaccttag gttttggggc gtatatgtcc 180 aaggcatatg gtaccgaccc caatgtcaga actggggtaa ggaccatcac cacgggcagc 240 cccatcacgt actcctctgg agggggttcc ggcggttgct ctgggggcgc ctacgacatc 300 ataatatgcg atgagtgcca ctcaactgac tcgactacca tcttgggcat cggcacagtc 360 ctggaccaag cggagacggc tggagcgcgg ctcgtcgtgc tcgccaccgc tacacctccg 420 gggtcggtca ccgtgccaca cccaaatatc gaggaagtgg gcctgtccaa tactggggag 480 atcccc 486 <210> 11 <211> 213 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 6 <400> 11 Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys 1 5 10 15 His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp 20 25 30 Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr 35 40 45 Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Gly 50 55 60 Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Ser Gly Gly Gly Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80 Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly 85 90 95 Arg Thr Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly 100 105 110 Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 115 120 125 Asp Ser Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val 130 135 140 Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 145 150 155 160 His Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 165 170 175 Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr 180 185 190 Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ser Gln Ala Pro Pro 195 200 205 Pro Ser Trp Asp Gln 210 <210> 12 <211> 639 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 6 <400> 12 ggcggttgct ctgggggcgc ctacgacatc ataatatgcg atgagtgcca ctcaactgac 60 tcgactacca tcttgggcat cggcacagtc ctggaccaag cggagacggc tggagcgcgg 120 ctcgtcgtgc tcgccaccgc tacacctccg gggtcggtca ccgtgccaca cccaaatatc 180 gaggaagtgg gcctgtccaa tactggggag atcccctctg gagggggttc caccattgag 240 acgacgaccg tgccccaaga cgcggtgtcg cgctcgcagc ggcgaggcag gactggtagg 300 ggtagggcag gcatctacag gtttgtgact ccgggagaac ggccctcggg catgttcgat 360 tcctcggtcc tgtgtgagtg ttatgactcg ggctgtgctt ggtacgaact cacgcccgct 420 gagacctcgg ttaggttgcg ggcataccta aatacaccag ggctgcccgt ctgtcaggac 480 catctggagt tctgggagag tgtcttcaca ggcctcaccc acatagatgc ccacttcttg 540 tcccaaacta agcaggcagg agacaacttc ccctacctgg tagcatacca agctacagtg 600 tgcgccaggt ctcaggcccc acctccatcg tgggatcaa 639 <210> 13 <211> 226 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 7 <400> 13 Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val 1 5 10 15 Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro 20 25 30 Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser 35 40 45 Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Thr Asp Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser 65 70 75 80 Pro Ile Thr Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Ile Glu Thr Thr Thr 85 90 95 Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly 100 105 110 Arg Gly Arg Ala Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu Arg Pro 115 120 125 Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ser Gly 130 135 140 Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg Leu Arg 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu 165 170 175 Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe 180 185 190 Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala 195 200 205 Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ser Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp 210 215 220 Asp Gln 225 <210> 14 <211> 678 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 7 <400> 14 ttcacagaca actcctcccc cccggcagta ccgcagacat tccaagtggc ccatctacac 60 gctcccaccg gcagtggcaa gagcaccaaa gtgccagctg cgtacgcagc ccaagggtac 120 aaggtactag tcctgaaccc gtctgttgcc gcgaccttag gttttggggc gtatatgtcc 180 aaggcatatg gtaccgaccc caatgtcaga actggggtaa ggaccatcac cacgggcagc 240 cccatcacgt actcctctgg agggggttcc accattgaga cgacgaccgt gccccaagac 300 gcggtgtcgc gctcgcagcg gcgaggcagg actggtaggg gtagggcagg catctacagg 360 tttgtgactc cgggagaacg gccctcgggc atgttcgatt cctcggtcct gtgtgagtgt 420 tatgactcgg gctgtgcttg gtacgaactc acgcccgctg agacctcggt taggttgcgg 480 gcatacctaa atacaccagg gctgcccgtc tgtcaggacc atctggagtt ctgggagagt 540 gtcttcacag gcctcaccca catagatgcc cacttcttgt cccaaactaa gcaggcagga 600 gacaacttcc cctacctggt agcataccaa gctacagtgt gcgccaggtc tcaggcccca 660 cctccatcgt gggatcaa 678 <210> 15 <211> 303 <212> PRT <213> Hepatitis C virus fragment 8 <400> 15 Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val 1 5 10 15 Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro 20 25 30 Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser 35 40 45 Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala Tyr Gly 50 55 60 Thr Asp Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser 65 70 75 80 Pro Ile Thr Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Ser Gly Gly 85 90 95 Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly 115 120 125 Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr 130 135 140 Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Gly Leu Ser Asn Thr Gly Glu 145 150 155 160 Ile Pro Ser Gly Gly Gly Ser Thr Ile Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln 165 170 175 Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg 180 185 190 Ala Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met 195 200 205 Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ser Gly Cys Ala Trp 210 215 220 Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu 225 230 235 240 Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu 245 250 255 Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln 260 265 270 Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala 275 280 285 Thr Val Cys Ala Arg Ser Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln 290 295 300 <210> 16 <211> 909 <212> DNA <213> Hepatitis C virus fragment 8 <400> 16 ttcacagaca actcctcccc cccggcagta ccgcagacat tccaagtggc ccatctacac 60 gctcccaccg gcagtggcaa gagcaccaaa gtgccagctg cgtacgcagc ccaagggtac 120 aaggtactag tcctgaaccc gtctgttgcc gcgaccttag gttttggggc gtatatgtcc 180 aaggcatatg gtaccgaccc caatgtcaga actggggtaa ggaccatcac cacgggcagc 240 cccatcacgt actcctctgg agggggttcc ggcggttgct ctgggggcgc ctacgacatc 300 ataatatgcg atgagtgcca ctcaactgac tcgactacca tcttgggcat cggcacagtc 360 ctggaccaag cggagacggc tggagcgcgg ctcgtcgtgc tcgccaccgc tacacctccg 420 gggtcggtca ccgtgccaca cccaaatatc gaggaagtgg gcctgtccaa tactggggag 480 atcccctctg gagggggttc caccattgag acgacgaccg tgccccaaga cgcggtgtcg 540 cgctcgcagc ggcgaggcag gactggtagg ggtagggcag gcatctacag gtttgtgact 600 ccgggagaac ggccctcggg catgttcgat tcctcggtcc tgtgtgagtg ttatgactcg 660 ggctgtgctt ggtacgaact cacgcccgct gagacctcgg ttaggttgcg ggcataccta 720 aatacaccag ggctgcccgt ctgtcaggac catctggagt tctgggagag tgtcttcaca 780 ggcctcaccc acatagatgc ccacttcttg tcccaaacta agcaggcagg agacaacttc 840 ccctacctgg tagcatacca agctacagtg tgcgccaggt ctcaggcccc acctccatcg 900 tgggatcaa 909 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS3f1 forward primer <400> 17 ggatccacag acaactcctc cccc 24 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <223> linker <400> 26 tctggagggg gttcc 15 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 27 agcggggggg ggagc 15 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 28 agcggtggtg gcagt 15 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 29 tccgggggtg gttca 15 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 30 tcaggtggcg ggtcg 15

Claims

C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3(hepatitis C virus non-structural protein 3: HCV NS3)의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열인 3개 이상의 친수성 단편을 포함하는 분리된 융합 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 HCV NS3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 HCV NS3의 헬리카아제(helicase) 활성을 포함하는 C-말단 도메인인 것인 융합 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 친수성 단편은 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 것인 융합 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 적어도 3개의 친수성 단편 각각은 펩티드 링커에 의해 연결된 것인 융합 폴리펩티드.
청구항 4에 있어서, 상기 펩티드 링커는 2 내지 100개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드인 것인 융합 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 구성된 것인 융합 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 C형 간염 바이러스 감염을 갖는 개체 중의 항체와 결합하는 것인 융합 폴리펩티드.
청구항 1의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드를 포함하는 C형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 키트.
개체로부터 분리된 시료를 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
상기 융합 폴리펩티드와 상기 시료 중 C형 간염 바이러스 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 C형 간염 바이러스 진단에 대한 정보를 제공하기 위한 C형 간염 바이러스 항체를 검출하는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 시료는 개체의 혈액, 전혈, 혈청 또는 혈장인 것인 방법.