TWI554284B - 帕妥珠單抗（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）變體及其評估 - Google Patents

帕妥珠單抗（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）變體及其評估 Download PDF

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Description

帕妥珠單抗(PERTUZUMAB)變體及其評估
在37 CFR §1.53(b)下申請之本非臨時申請案主張2013年4月16日申請之美國臨時申請案序列號在35 USC §119(e)下之權益，該案以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本發明包含經由EFS-Web遞交之序列表且其以全文引用的方式併入本文中。2014年4月8日創建之該ASCII複本命名為P5584R1-WO_Seq_Listing.txt，且大小為31,363位元。
本發明係關於帕妥珠單抗(Pertuzumab)變體。特定言之，本發明係關於：一種帕妥珠單抗之一個或兩個輕鏈可變域中包含Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的不成對半胱胺酸變體、一種帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體、一種帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)、及一種帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)。本發明進一步揭示經單離之變體，包含該等變體之組合物、醫藥組合物及製作物品，以及製造及表徵該等變體及其組合物之方法。
帕妥珠單抗(PERJETA®)(亦稱為rhuMAb 2C4)為一種單株抗體(MAb)，其係被稱為「HER二聚合抑制劑」的一系列作用劑中的首型。藉由結合至HER2，其抑制HER2與其他HER受體之二聚合且因而抑制腫瘤生長。帕妥珠單抗於2012年6月8日接受美國食品與藥品管理 局(US FDA)核准用於治療HER2-陽性轉移性乳癌。
美國專利第7,862,817號(Adams等人)描述一種2C4抗體之人源化抗體，其被稱為人源化2C4版574或重組人源化單株抗體2C4(rhuMAb 2C4)。該抗體結合在人表皮生長因子受體2(HER2)胞外域(ECD)中之子域II。該rhuMAb 2C4抗體係在實驗室規模上製得且顯示結合HER2並抑制植入到小鼠中之MDA-175細胞(其在1+水平下表現HER2)及MCF7異種移植物之生長。亦參見Adams等人，Cancer Immunol.Immunother.55(6)：717-727(2006)。
美國專利第6,339,142號(Blank及Basey)描述一種包括抗-HER2抗體及一或多種其酸性變體之混合物的HER2抗體組合物，其中該(等)酸性變體之含量係小於約25%。人源化單株抗體4D5變體8(humMAb4D5-8或曲妥珠單抗(Trastuzumab))為示例性HER2抗體。
美國專利第7,560,111號、美國專利第7,879,325號及美國專利第8,241,630號(Kao等人)描述一種帕妥珠單抗(rhuMAb 2C4)之變體，其包括在該抗體之一條或兩條輕鏈上的胺基末端前導區延伸(VHS-)，所謂之「VHS-變體」。當使用埃爾曼分析法(Ellman’s analysis)在天然條件下測試參考材料(I期)、Lot S9802A(II期)及400L規模之製程開發材料的游離硫醇時，在所有測試材料中，游離硫醇水平係低於檢測的限值。在所測試之組合物中之帕妥珠單抗的1至2%係無岩藻糖基化(G0-F)，如藉由毛細管電泳(CE)測得。參見美國專利第7,560,111號(Kao等人)之表5。
WO 2009/099829(Harris等人)描述帕妥珠單抗之酸性變體，其包括：去醯胺基化變體、糖化變體、二硫鍵還原變體、非可還原變體及唾液酸化變體。該等變體根據揭示表徵如下：
CEX=陽離子交換。CE-SDS=利用十二烷基硫酸鈉之毛細管電泳。
在WO 2009/099829(Harris等人)中，用於表徵二硫鍵還原變體的實驗方法(完整抗體之非還原CE-SDS)評估還原之鏈間二硫鍵而非鏈內二硫鍵。
Zhang等人，Anal.Chem.84(16)：7112-7123(2012)報導一種重組抗體(mAb A)，其可變重域(VH域)中具有不成對半胱胺酸(Cys22及Cys96)。發現該等不成對半胱胺酸對該抗體與CD20之結合無顯著影響，且具有不成對半胱胺酸之mAb A在效力檢定(補體依賴性細胞毒性(CDC)檢定)中具完全活性。
WO 2009/009523(Kao等人)揭示在重組製備會結合CD20之奧瑞珠單抗(ocreclizumab)(rhuMAb 2H7)抗體期間鏈內二硫鍵還原之抑制。
Harris,R.Dev.Biol.(Basel,Switzerland)122：117-127(2005)揭示在奧馬珠單抗(omalizumab)(一種人源化抗-IgE抗體)之可變重(VH)域中之不成對半胱胺酸(Cys22及Cys96)。該不成對半胱胺酸形式具有顯著降低之效力。
本文的實驗資料係關於帕妥珠單抗之變體形式，其包括不成對半胱胺酸變體、無岩藻糖基化變體、低分子量種類(LMWS)及高分子量種類(HMWS)。用於識別、表徵及定量該等變體之方法在用於帕妥珠單抗醫藥組合物之製造及品質控制方法中是有價值的。
因此，在第一態樣中，本發明係關於一種包含帕妥珠單抗及其不成對半胱胺酸變體之組合物，其中該不成對半胱胺酸變體包括帕妥珠單抗之一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸。該不成對半胱胺酸變體包括異源二聚體變體(包括帕妥珠單抗之僅一個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸)及/或同源二聚體變體(包括帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸)。
該組合物視情況進一步包括帕妥珠單抗之一或多種其他變體，諸如無岩藻糖基化變體、低分子量種類(LMWS)變體、高分子量種類(HMWS)變體、糖化變體、二硫鍵還原變體、非可還原變體、去醯胺基化變體、唾液酸化變體、VHS-變體、C-端離胺酸變體、甲硫胺酸氧化變體、G1糖基化變體、G2糖基化變體及非糖基化重鏈變體。
本發明亦關於一種包含帕妥珠單抗及帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體之組合物，其中該無岩藻糖基化變體之含量為該組合物之0.9至4.1%。在一個實施例中，本發明亦關於一種包含帕妥珠單抗及帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體之組合物，其中該無岩藻糖基化變體之含量為大於該組合物之2%。根據該實施例，該無岩藻糖基化變體之含量係大於美國專利第7,560,111號、美國專利第7,879,325號及美國專利第8,241,630號(Kao等人)中所報導之彼等。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含帕妥珠單抗、帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)及帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)之混合物之組合物，其中LMWS之含量係1.6%及HMWS之含量係 1.7%。
本發明亦關於一種包含帕妥珠單抗、峰1及峰2之混合物的組合物，其中峰1之含量為0.5%及峰2之含量為1.0%，如藉由還原毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(R-CE-SDS)檢定所測得。
本發明之其他態樣係關於使用或包含本文之組合物的醫藥組合物、製作物品及治療癌症患者之方法。
在另一態樣中，本發明係關於一種評估帕妥珠單抗組合物之方法，其包括：(1)測量該組合物中之不成對半胱胺酸變體之含量，其中該不成對半胱胺酸變體包括帕妥珠單抗之一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸；及/或(2)測量該組合物中之無岩藻糖基化帕妥珠單抗之含量；及/或(3)測量該組合物中之帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)或高分子量種類(HMWS)之含量。
在又一態樣中，本發明係關於一種評估帕妥珠單抗組合物之生物活性的方法，其包括測量該組合物中之無岩藻糖基化帕妥珠單抗變體之含量以測定該組合物之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性，且證實無岩藻糖基化帕妥珠單抗之含量係在約0.9%至約4.1%之範圍內。
在另一態樣中，本發明係關於一種製造組合物之方法，其包括：(1)製備包含帕妥珠單抗及一或多種其變體之組合物，及(2)使因此製得之該組合物進行分析檢定以評估於其中之該(等)變體之含量，其中該(等)變體包括：(i)包括帕妥珠單抗之一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的不成對半胱胺酸變體；及/或(ii)帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體；及/或(iii)帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)；及/或(iv)帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)、及/或(v)帕妥珠單抗之峰1片段及/或(vi)帕妥珠單抗之峰2片段。
在另一態樣中，本發明係關於經單離之帕妥珠單抗變體，其中 該經單離之變體包括：(a)帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體，其中該變體為包含帕妥珠單抗之僅一個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的異源二聚體變體；及/或(b)帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體，其中該變體為包含帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的同源二聚體變體；及/或(c)帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體；及/或(d)帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)；及/或(e)帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)；及/或(f)帕妥珠單抗之峰1片段及/或(g)帕妥珠單抗之峰2片段。
在另一態樣中，本發明係關於一種評估帕妥珠單抗組合物之片段化的方法，其包括藉由還原毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(R-CE-SDS)檢定測量該組合物中之峰1及峰2之含量及證實該峰1之含量為5%及該峰2之含量為1.0%。
圖1提供HER2蛋白質結構、及其胞外域之子域I至IV的胺基酸序列(分別係SEQ ID No.1至4)之示意圖。
圖2A及2B繪示以下各者之胺基酸序列比對：鼠單株抗體2C4之可變輕(VL)(圖2A)及可變重(VH)(圖2B)域(分別係SEQ ID No.5及6)；變體574/帕妥珠單抗之VL及VH域(分別係SEQ ID No.7及8)，及人VL及VH一致框架(hum κ1，輕κ子組I；humIII，重子組III)(分別係SEQ ID No.9及10)。星號識別帕妥珠單抗與鼠單株抗體2C4之可變域之間或帕妥珠單抗與人框架之可變域之間的不同。互補決定區(CDR)係在括號中。
圖3A及3B顯示帕妥珠單抗輕鏈(圖3A；SEQ ID NO.11)及重鏈(圖3B；SEQ ID No.12)之胺基酸序列。CDR係加粗顯示。輕鏈及重鏈之計算分子量係23,526.22Da及49,216.56Da(呈還原形式之半胱胺酸)。碳水化合物部份係附接至重鏈之Asn 299。
圖4A及4B分別顯示曲妥珠單抗輕鏈(圖4A；SEQ ID NO.13)及重鏈(圖4B；SEQ ID NO.14)之胺基酸序列。輕鏈可變域及重鏈可變域之邊界係由箭頭指示。
圖5A及5B分別繪示帕妥珠單抗變體之輕鏈序列(圖5A；SEQ ID NO.15)及帕妥珠單抗變體之重鏈序列(圖5B；SEQ ID NO.16)。
圖6繪示(主要種類)帕妥珠單抗之結構，其包括其4個鏈間及12個鏈內二硫鍵，每個輕鏈可變(VL)域中包括Cys23/Cys88鏈內二硫鍵。所繪示的域為：VL=輕鏈可變域；VH=重鏈可變域；CL=輕鏈恆定域；CH1=重鏈恆定域1；CH2=重鏈恆定域2；CH3=重鏈恆定域3。
圖7顯示帕妥珠單抗之非還原(原始)胰蛋白酶肽圖譜。
圖8繪示還原及非還原帕妥珠單抗之胰蛋白酶肽圖譜(全刻度)。
圖9繪示還原及非還原帕妥珠單抗之胰蛋白酶肽圖譜(0至120分鐘)。
圖10繪示還原及非還原帕妥珠單抗之胰蛋白酶肽圖譜(120至204分鐘)。
圖11繪示木瓜蛋白酶消化之帕妥珠單抗的疏水相互作用層析(HIC)分析。
圖12繪示木瓜蛋白酶消化之帕妥珠單抗的HIC分析(放大圖)。
圖13繪示完整帕妥珠單抗的HIC分析。顯示包括以下之峰：富集游離硫醇之同源二聚體(在兩條輕鏈上的游離硫醇)、游離硫醇異源二聚體(在一條輕鏈上的游離硫醇)及野生型同源二聚體(主要種類抗體)。
圖14繪示帕妥珠單抗(批次anti2C4907-2)在抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)檢定中之活性。
圖15繪示G0-F水平對ADCC活性之影響。所測試之樣品為III期帕 妥珠單抗(G0-F=2.2%)及I期帕妥珠單抗(G0-F=0.8%)。
圖16繪示自帕妥珠單抗釋放之N連接之寡醣的毛細管電泳分析。
圖17繪示自帕妥珠單抗釋放之N連接之寡醣的毛細管電泳分析(放大圖)。註：G1寡醣具有兩個異構體形式(經標記之G1及G1’)，其中末端半乳糖殘基係附接至α1-6分支鏈或α1-3分支鏈。
圖18繪示針對帕妥珠單抗Fab及Fc(有限Lys-C消化)分離之反相-高效液相層析(RP-HPLC)。顯示然後經N-乙基馬來醯亞胺(NEM)處理之有限Lys-C消化之帕妥珠單抗及有限Lys-C消化之帕妥珠單抗。
圖19繪示證實帕妥珠單抗游離硫醇Fab在其輕鏈處含有游離Cys23及Cys88的肽圖譜。來自含有游離硫醇之Fab的L2肽經NEM標記，且因此在肽圖譜分析中偏移。
圖20示意性地繪示：主要種類或野生型IgG1(圖20A)、Cys23/Cys88異源二聚體變體(圖20B)及Cys23/Cys88同源二聚體變體(圖20C)。
圖21繪示使用本文中之實例4之檢定，帕妥珠單抗批次之G0-F%相對於ADCC活性。
圖22示意性地繪示帕妥珠單抗在HER2之異源二聚合結合位點之結合，藉此阻止與活化之EGFR或HER3之異源二聚合。
圖23比較曲妥珠單抗(其結合在HER2 ECD之近膜域附近之子域IV)及帕妥珠單抗(其結合HER2 ECD之子域II)之活性。
圖24A及24B繪示附接至IgG抗體之寡醣結構。
圖25繪示帕妥珠單抗的尺寸排除層析(SEC)分析(全刻度)。
圖26繪示帕妥珠單抗之SEC分析(放大刻度)。峰包括主峰(主要種類抗體)、高分子量種類(HMWS)及低分子量種類(LMWS)。
圖27繪示帕妥珠單抗樣品之尺寸排除-高效液相層析(SE-HPLC)分析。樣品A係代表性帕妥珠單抗藥品批次。樣品B係接受1.2 mlux 小時光暴露的帕妥珠單抗批次。樣品C係接受3.6 mlux小時光暴露的帕妥珠單抗批次。樣品D係接受在pH 3.2下之酸處理之帕妥珠單抗批次。樣品E係來自離子交換-HPLC(IE-HPLC)之經純化之鹼性變體。
圖28繪示分析型超速離心(AUC)沉降速度及SE-HPLC分析之索引詞圖。誤差線表示來自n=3次測定之兩個標準差。所有其他數據點表示單次測定。圓圈表示樣品具有低於AUC之檢測水平之HMWS水平。
圖29繪示非還原帕妥珠單抗之利用雷射誘導螢光(LIF)檢測之毛細管電泳十二烷基硫酸鈉分析(CE-SDS)。
圖30繪示非還原(NR)帕妥珠單抗的CE-SDS-LIF(放大圖)。
圖31A及31B繪示實例6之SE-HPLC層析圖：全刻度(圖31A)及放大刻度(圖31B)。
圖32A及32B繪示實例6之非還原CE-SDS(NR-CE-SDS)電泳圖：全刻度(圖32A)及放大刻度(圖32B)。
圖33A及33B繪示實例6之還原CE-SDS(R-CE-SDS)電泳圖：全刻度(圖33A)及放大刻度(圖33B)。
圖34提供經酸處理之樣品之NR-CE-SDS及R-CE-SDS電泳圖(放大刻度)之比較。
圖35繪示NR-CE-SDS與SE-HPLC之間之Fab定量的相關性。
I.定義
「成對半胱胺酸」在本文係指兩個在蛋白質諸如抗體中形成二硫鍵的半胱胺酸殘基。該等二硫鍵可為鏈間二硫鍵(例如在抗體之重鏈與輕鏈之間或在抗體之兩條重鏈之間的二硫鍵)或鏈內二硫鍵(例如，在抗體之輕鏈內或在抗體之重鏈內)。大多數IgG1抗體包括四個鏈間二硫鍵及12個鏈內二硫鍵。參見圖6。
「不成對半胱胺酸變體」為蛋白質(例如，抗體，諸如帕妥珠單 抗)之變體，其中一個或多個成對半胱胺酸不呈二硫鍵結合狀態。該等不成對半胱胺酸可無法成對以形成二硫鍵(例如當該蛋白質初始時折叠成其三級結構)或可能已經形成二硫鍵，但是其在隨後斷裂(例如，在製造期間或儲存時)。該等不成對半胱胺酸通常係稱為游離硫醇或游離巰基。在一個實施例中，該等不成對半胱胺酸係來自鏈內二硫鍵。在一個實施例中，該等不成對半胱胺酸係在抗體之輕鏈，例如輕鏈可變域中。在一個實施例中，該不成對半胱胺酸變體為Cys23/Cys88變體。
「Cys23/Cys88」不成對半胱胺酸變體缺乏在該抗體之一個或兩個輕鏈可變域中之在半胱胺酸殘基23及88處之分子內二硫鍵。參見本文之圖20(b)及(c)。
「同源二聚體變體」缺乏在該抗體之兩個輕鏈可變域中之Cys23/Cys88二硫鍵。參見本文之圖20(c)。
「異源二聚體變體」缺乏在抗體之一個輕鏈可變域中之僅一個Cys23/Cys88二硫鍵。參見本文之圖20(b)。
「無岩藻糖基化變體」為抗體之糖基化變體，其中附接至一條或兩條重鏈之殘基Asn299的寡醣結構之一者或兩者缺乏岩藻糖，例如在核心寡醣結構中缺乏Fucα(1->6)。
帕妥珠單抗之「低分子量種類」或「LMWS」包括帕妥珠單抗之片段，其具有小於主要種類或完整帕妥珠單抗之分子量(例如，其中完整帕妥珠單抗具有約145,197Da之分子量，僅測量其肽鏈)之分子量。可藉由尺寸排除高效液相層析(SE-HPLC)及/或利用十二烷基硫酸鈉之非還原毛細管電泳(CE-SDS)，例如如實例5中，檢測LMWS。在一個實施例中，該LMWS包括藉由CE-SDS所獲得之「峰6」(參見例如實例5)或由其所組成。
「高分子量種類」或「HMWS」包括帕妥珠單抗之製劑，其具有 大於主要種類或完整帕妥珠單抗之分子量(例如，其中完整帕妥珠單抗具有約145,197Da之分子量，僅測量其肽鏈)之分子量。可藉由尺寸排除高效液相層析(SE-HPLC)及/或利用十二烷基硫酸鈉之非還原毛細管電泳(CE-SDS)，例如如實例5中，檢測HMWS。
「峰1」在本文係指尺寸小於帕妥珠單抗輕鏈(LC)之帕妥珠單抗片段。峰1片段可藉由CE-SDS檢定，較佳藉由還原CE-SDS(R-CE-SDS)檢定，自主要種類帕妥珠單抗分離。參見例如本文之圖33B、表16及表18。較佳地，帕妥珠單抗組合物中之峰1之含量係0.5%。視情況，該R-CE-SDS檢定係如實例6中所述般進行且校正峰面積(CPA)提供組合物中之峰1%。
「峰2」在本文係指尺寸大於帕妥珠單抗輕鏈(LC)且小於帕妥珠單抗非糖基化重鏈(NGHC)之帕妥珠單抗片段。峰2可藉由CE-SDS，較佳藉由還原CE-SDS(R-CE-SDS)檢定，自主要種類帕妥珠單抗分離。峰2不包括峰3，峰3可在如本文之實例6中所解釋之R-CE-SDS檢定期間出現。參見例如，本文之圖33B、表16及表18。較佳地，帕妥珠單抗組合物中之峰2之含量係1.0%。視情況，該R-CE-SDS檢定係如實例6中所述般進行且校正峰面積(CPA)提供組合物中之峰2%。
「片段化」係指多肽鏈裂解，例如，帕妥珠單抗輕鏈及/或重鏈之裂解。其不包括例如NR-CE-SDS分析期間非共價締合多肽鏈之離解。
「分析檢定」係一種定性評估及/或定量測量組合物中之分析物(例如抗體變體)之存在或含量的檢定。接受該檢定之組合物可為經純化之組合物，包括醫藥組合物。
「Fab疏水相互作用層析檢定」或「Fab HIC檢定」包括(例如使用木瓜蛋白酶)使組合物中之抗體產生片段(例如Fab片段)及使因而產 生之抗體片段接受HIC以自主要種類帕妥珠單抗分離不成對半胱胺酸變體。一種示例性該檢定係揭示於本文之實例1中。
「HER受體」係一種受體蛋白質酪胺酸激酶，其屬於HER受體家族且包括EGFR、HER2、HER3及HER4受體。HER受體一般將包括胞外域，其可結合HER配位體及/或與另一HER受體分子二聚合；親脂性跨膜域；保守胞內酪胺酸激酶域；及帶有若干個可經磷酸化之酪胺酸殘基之羧基端訊號域。
措辭「HER2」係指描述於例如Semba等人，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)及Yamamoto等人，Nature 319：230-234(1986)中之人類HER2蛋白質(基因庫寄存編號X03363)。
在本文中，「HER2胞外域」或「HER2 ECD」係指固定至細胞膜或呈循環之在細胞外之HER2之域，包括其片段。HER2之胺基酸序列係示於圖1中。在一個實施例中，HER2之胞外域可包括四個域：「子域I」(胺基酸殘基自約1至195；SEQ ID NO：1)、「子域II」(胺基酸殘基自約196至319；SEQ ID NO：2)、「子域III」(胺基酸殘基自約320至488：SEQ ID NO：3)及「子域IV」(胺基酸殘基自約489至630；SEQ ID NO：4)(無信號肽之殘基編號)。參見Garrett等人，Mol.Cell.11：495-505(2003)、Cho等人，Nature 421：756-760(2003)、Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)及Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)，以及本文之圖1。
本文之「HER二聚體」係一種包含至少兩個HER受體之非共價締合之二聚體。該等複合物可在將表現兩種或更多種HER受體的細胞暴露於HER配位體時形成，並且可以藉由免疫沉澱來單離並藉由SDS-PAGE進行分析，如例如Sliwkowski等人，J.Biol.Chem.,269(20)：14661-14665(1994)中所述。其他蛋白質，諸如細胞因子受體亞單位(例如gp130)可以與該二聚體締合。較佳地，該HER二聚體包 括HER2。
本文中之「HER異源二聚體」係一種包含至少兩種不同的HER受體之非共價鍵締合之異源二聚體，諸如EGFR-HER2、HER2-HER3或HER2-HER4異源二聚體。
「HER激活」係指任何一種或多種HER受體的激活或磷酸化。通常，HER激活導致信號轉導(例如，由HER受體之胞內激酶結構域使HER受體或底物多肽中之酪胺酸殘基磷酸化所導致的信號轉導)。HER激活可藉由結合包含受關注之HER受體之HER二聚體的HER配位體來介導。結合HER二聚體之HER配位體可激活該二聚體中之一或多種HER受體的激酶結構域並且由此導致該一或多種HER受體之酪胺酸殘基之磷酸化及/或其他底物多肽，例如Akt或MAPK胞內激酶中之酪胺酸殘基之磷酸化。
非人類(例如囓齒類)抗體的「人源化」形式係包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人源化抗體係其中來自該受者的高變區之殘基被來自非人種類例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和力及能力的非人靈長類動物的高變區(供者抗體)的殘基所置換的人免疫球蛋白(受者抗體)。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基被相應的非人殘基置換。此外，人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發現之殘基。進行該等修飾以進一步改進抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、及通常兩個可變域，其中所有或基本上所有高變環對應於彼等非人免疫球蛋白及所有或基本上所有的FR係人免疫球蛋白序列之彼等。人源化抗體視情況還將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白之彼等。有關進一步細節，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。人源化 HER2抗體具體包括曲妥珠單抗及人源化2C4抗體，諸如如本文描述及定義之帕妥珠單抗。
本文中之「完整抗體」是指包含兩個抗原結合區及一個Fc區之抗體。較佳地，完整抗體具有功能性Fc區。在一個實施例中，「完整帕妥珠單抗」具有約145,197Da之分子量，僅測量其肽鏈。
當用在本文中時，術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變域中之殘基24至34(L1)、50至56(L2)及89至97(L3)及重鏈可變域中之31至35(H1)、50至65(H2)及95至102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或來自「高變環」之彼等殘基(例如輕鏈可變域中之殘基26至32(L1)、50至52(L2)及91至96(L3)及重鏈可變域中之26至32(H1)、53至55(H2)及96紙至101(H3)；Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。「框架區」或「FR」殘基係除如本文中所定義之高變區殘基之外的彼等可變域殘基。
本文中之術語「Fc區」用來定義免疫球蛋白重鏈的C-端區，其包括原始序列Fc區及變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能發生變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為從在位置Cys226之胺基酸殘基展開，或從Pro230展開，至其羧基末端。Fc區之C-端離胺酸(根據EU編號系統，殘基449)可被移除，例如，製備或純化抗體期間，或藉由重組工程改造編碼該抗體之重鏈的核酸而移除。因此，完整抗體之組合物可包含移除所有K449殘基之抗體群、沒有移除K449殘基之抗體群及具有含或不含K449殘基之抗體的混合物的抗體群。
除非另有說明，否則本文中免疫球蛋白重鏈中殘基之編號方式係EU索引之編號方式，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，其明確以引用之方式併入入本文。「如Kabat之EU索引」係指人IgG1 EU抗體的殘基編號。
「功能性Fc區」擁有原始序列Fc區之「效應子功能」。示例性「效應子功能」包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。該等效應子功能一般要求Fc區與結合域(例如抗體可變域)結合，並且可以使用多種檢定來評估。
「原始序列Fc區」包括與在自然界中發現之Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。原始序列人Fc區包括原始序列人IgG1 Fc區(非A及A同種異型)；原始序列人IgG2 Fc區；原始序列人IgG3 Fc區；及原始序列人IgG4 Fc區，以及天然存在的其變體。
「裸抗體」是指未結合異源分子，如細胞毒性部分或放射性標記物之抗體。
術語「主要種類抗體」或「野生型抗體」在本文係指組合物中之抗體胺基酸序列結構，其是在該組合物中數量上占主導的抗體分子。較佳地，主要種類抗體是HER2抗體，如結合HER2之子域II的抗體、比曲妥珠單抗更有效地抑制HER二聚合之抗體、及/或結合至HER2上之異源二聚合結合位點之抗體。在一個實施例中，該主要種類抗體係包括以下之抗體：CDR-H1(SEQ ID NO：17或23)、CDR-H2(SEQ ID NO：18)及CDR-H3(SEQ ID NO：19)，CDR-L1(SEQ ID NO：20)、CDR-L2(SEQ ID NO：21或24)及CDR-L3(SEQ ID NO：22)，分別在SEQ ID NO.7及8中之VL及VH胺基酸序列(參見圖2A至2B)及視情況可選之SEQ ID NO.11或15中之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO.12或16中之重鏈胺基酸序列(參見圖3A至3B及5A至5B)。在一個實施例中，該主要種類抗體是帕妥珠單抗。
「抑制HER二聚合」之抗體是一種抑制或干擾HER二聚體或異源二聚體之形成的抗體。在一個實施例中，該抗體在其異源二聚體結合位點結合HER2。本文中之最佳二聚合化抑制抗體是帕妥珠單抗。
HER2上之「異源二聚體結合位點」是指與EGFR、HER3或HER4形成二聚體時HER2之胞外域中會接觸EGFR、HER3或HER4之胞外域中之一個區或與其相互作用的一個區。發現該區在HER2之子域II(SEQ ID NO：2)中。Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)。
「結合至HER2之異源二聚體結合位點」的HER2抗體，結合至子域II(SEQ ID NO：2)中之殘基及視情況亦結合至HER2胞外域之其他域(如子域I及III(SEQ ID NO：1及3))中的殘基，並且可以在空間上阻礙(至少在一定程度上)HER2-EGFR、HER-HER3、或HER2-HER4異源二聚體的形成。Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)表徵了HER2-帕妥珠單抗的晶體結構，寄存在RCSB蛋白質資料庫(ID代碼1S78)，示出了結合至HER2之異源二聚體結合位點的示例性抗體。
「結合至HER2之子域II」的抗體，結合在HER2之子域II(SEQ ID NO：2)及視情況其他子域，如子域I及III(分別係SEQ ID NO：1及3)中之殘基。
對於本文之目的，互換使用之「帕妥珠單抗」及「rhuMAb 2C4」係指一種包含分別為SEQ ID NO：7及8中的可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)胺基酸序列的抗體。本文之圖22及23說明了帕妥珠單抗的示例性生物學功能。在帕妥珠單抗是完整抗體之情況下，它較佳包括IgG1抗體；在一個實施例中，其包括SEQ ID NO：11或15之輕鏈胺基酸序列，及SEQ ID NO：12或16之重鏈胺基酸序列。抗體係視情況藉由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞而製備。本文中之術語「帕妥珠單抗」及「rhuMAb 2C4」涵蓋具有美國採用名稱(USAN)或國際非專利名(INN)：帕妥珠單抗的該藥物之生物仿製藥或擬副本。
對於本文之目的，互換使用之「曲妥珠單抗」及「rhuMAb4D5」係指一種包含分別來自SEQ ID No：13及14內之可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)胺基酸序列的抗體(參見圖4A至4B)。在曲妥珠單抗是完整抗體之情況下，其較佳包括IgG1抗體；在一個實施例中，其包括SEQ ID NO：13之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：14之重鏈胺基酸序列。該抗體視情況係藉由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞而製備。本文之術語「曲妥珠單抗」及「rhuMAb4D5」涵蓋具有美國採用名稱(USAN)或國際非專利名(INN)：曲妥珠單抗的該藥物之生物仿製藥或擬副本。
本文中之胺基酸序列變體抗體是一種具有不同於主要種類抗體的胺基酸序列的抗體。通常，胺基酸序列變體將具有至少約70%與主要種類抗體之同源性，及較佳地，其將是至少約80%，更佳至少約90%與主要種類抗體之同源性。胺基酸序列變體具有在主要種類抗體之胺基酸序列中或臨近其的某些位置處之取代、缺失、及/或添加。本文之胺基酸序列變體的實例包括去醯胺基化抗體變體、在其一條或兩條輕鏈上具有胺基末端前導區延伸(例如VHS-)之抗體、在其一條或兩條重鏈上具有C-端離胺酸殘基之抗體等等，並且包括重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列變化的組合。
酸性變體是比主要種類抗體更具酸性之主要種類抗體的變體。酸性變體相對於主要種類抗體已經獲得負電荷或損失陽性電荷。該等酸性變體可以使用分離方法，如離子交換層析，即根據電荷分離蛋白質來解析。主要種類抗體的酸性變體在藉由陽離子交換層析分離時比主峰更早洗脫。
二硫鍵還原變體具有一個或多個化學還原為游離硫醇形式的鏈間二硫鍵連接的半胱胺酸。該變體可以藉由利用十二烷基硫酸鈉之非還原毛細管電泳(CE-SDS)進行監測，例如如WO 2009/099829(Harris等人)中所述。
在本文中，非可還原變體或「不完全還原變體」是不能藉由用還原劑如二硫蘇糖醇之處理被化學還原為重鏈及輕鏈的主要種類抗體之變體。該等變體可以藉由用還原劑處理組合物並使用評估蛋白質大小的方法，如利用十二烷基硫酸鈉之毛細管電泳(CE-SDS)，例如使用WO2009/099829(Harris等人)中所述之技術，評估所得組合物而進行評估。
本文中之糖基化變體抗體是具有一個或多個附接至其之碳水化合物部份之抗體，該等碳水化合物部份不同於附接至主要種類抗體的一個或多個碳水化合物部分。在一個實施例中，該糖基化變體具有附接至抗體的一條或兩條重鏈例如在重鏈之殘基299處之寡醣結構。在一個實施例中，主要種類抗體(例如帕妥珠單抗)包括G0寡醣作為附接至其Fc區的主要寡醣。附接至IgG1之示例性寡醣結構繪示在圖24A至24B中。本文中之糖基化變體之實例包括無岩藻糖基化變體、具有G1或G2寡醣結構而不是G0寡醣結構附接至其Fc區之抗體(「G1糖基化變體」或「G2糖基化變體」)、沒有碳水化合物附接至抗體之一條或兩條重鏈的抗體(「非糖基化重鏈變體」)、唾液酸化變體等，以及該等糖基化改變的組合。參見，例如美國專利7,560,111(Kao等人)。
在抗體具有Fc區之情況下，寡醣結構可以附接至該抗體之一條或兩條重鏈，例如在殘基299處。在一個實施例中，G0是主要的寡醣結構，而發現其他寡醣結構，如G0-F、G-1、Man5、Man6、G1-1、G1(1-6)、G1(1-3)及G2在組合物中之含量較少。
除非另有說明，否則本文中之G1寡醣結構包括G1(1-6)及G1(1-3)結構。
對於本文的目的，唾液酸化變體是主要種類抗體包含一個或多個附接至一條或兩條其重鏈的唾液酸化碳水化合物部分的變體。唾液酸化變體可藉由評估經或不經唾液酸酶處理的組合物(例如藉由離子 交換層析)而識別，例如如WO2009/099829中所述。
糖化變體是其中糖(例如葡萄糖)已經共價附接至例如一條或兩條其輕鏈的抗體。該加成可以藉由葡萄糖與蛋白質上之離胺酸殘基的反應(例如在細胞培養基)發生。糖化變體可以藉由還原抗體之質譜分析，評估重鏈或輕鏈質量的增加而識別。如WO 2009/099829(Harris等人)中所解釋，糖化變體亦可以藉由酸酯層析量化。
去醯胺基化抗體是其中其一個或多個天冬醯胺殘基已被衍生為例如天冬胺酸、琥珀醯亞胺或異天冬胺酸之抗體。去醯胺基化抗體的實例是帕妥珠單抗變體，其中在帕妥珠單抗之一條或兩條重鏈上之Asn-386及/或Asn-391被脫去醯胺基。參見例如WO2009/099829(Harris等人)。
胺基端前導區延伸變體在本文係指在主要種類抗體之任何一條或多條重鏈或輕鏈之胺基端處具有胺基末端前導區序列的一個或多個胺基酸殘基的該主要種類抗體。示例性胺基端前導區延伸包括存在於抗體變體之一條或兩條輕鏈上的三個胺基酸殘基VHS-或由其組成，本文中指定為「VHS-變體」。參見，美國專利7,560,111(Kao等人)。
「C-端離胺酸變體」是指在其重鏈的C-端處包括離胺酸(K)殘基的變體。參見美國專利7,560,111(Kao等人)。
「甲硫胺酸氧化變體」是指包含一個或多個氧化的甲硫胺酸殘基於其中，例如氧化之Met-254的變體。參見美國專利7,560,111(Kao等人)。
術語「癌症」是指特徵通常為不受調節之細胞生長的哺乳動物中之生理病症。本文中之癌症的實例包括乳癌(例如轉移性乳癌)、胃癌、卵巢癌、原發性腹膜癌及輸卵管癌。本文中之癌症的實例包括HER-2陽性癌及低HER3癌。
「展現HER表現、擴增或激活」的癌症或生物樣品是在診斷測試 中，表現(包括過度表現)HER受體、具有擴增之HER基因及/或以其他方式證實HER受體之激活或磷酸化的癌症或生物樣品。
「HER-2陽性」癌包括具有高於正常水平之HER2的癌細胞。HER-2陽性癌的實例包括HER-2陽性乳癌及HER2-陽性胃癌。用於識別HER2-陽性癌之方法包括：測量HER2蛋白質之檢定，如免疫組織化學檢定(IHC)、測量HER2編碼核酸之檢定，如原位雜交(ISH)，包括螢光原位雜交(FISH；參見1998年10月公開之WO98/45479)及顯色原位雜交(CISH；參見，例如Tanner等人，Am.J.Pathol.157(5)：1467-1472(2000)；Bella等人，J.Clin.Oncol.26：(5月20日增刊；摘要22147)(2008))、南方墨點法、或聚合酶鏈反應(PCR)技術，如定量實時PCR(qRT-PCR)；脫落抗原(例如HER2 ECD)檢定(參見，例如，1990年6月12日頒予之美國專利第4,933,294號及1995年3月28日頒予之美國專利5,401,638)；及體內檢定。視情況，HER-2陽性癌具有免疫組織化學(IHC)評分為2+或3+及/或原位雜交(ISH)擴增比2.0。
「低HER3」癌包括具有低於正常水平之HER3的癌細胞。低HER3癌之實例包括卵巢癌、原發性腹膜及輸卵管癌。參見，例如，美國專利第7,981,418號(Amler等人)。在一個實施例中，低HER3是基於HER3 mRNA表現水平(濃度比等於或低於2.81，如藉由在COBAS z480®儀器上之qRT-PCR所評估)測定。
「表位2C4」是與抗體2C4結合的HER2之胞外域中之區域。為了篩選基本上結合2C4表位之抗體，可以進行常規交叉阻斷檢定，如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane(1988)中所述的檢定。較佳地，該抗體阻斷約50%或更多之2C4結合至HER2。或者，可以進行表位圖譜法，以評估抗體是否基本上結合至HER2之2C4表位。表位2C4包括來自HER2之胞外域中之子域II(SEQ ID NO：2)的殘基。2C4及帕妥珠單抗在子域 I、II及III(分別係SEQ ID NO：1、2及3)之交界處結合HER2之胞外域。Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328(2004)。
「治療」是指治療性治療及預防性或防範性措施。彼等需要治療之個體包括已經患有癌症之彼等以及其中待預防癌症之彼等。因此，本文中待治療之患者可能已經被診斷為患有癌症或可能易染或易患癌症。
術語「有效量」是指藥物有效治療患者之癌症的量。藥物之有效量可減少癌細胞的數目；降低腫瘤大小；抑制(即一定程度上減緩及較佳停止)癌細胞浸潤至周圍器官中；抑制(即一定程度上減緩及較佳停止)腫瘤轉移；一定程度上抑制腫瘤生長；及/或一定程度上減輕與癌症相關的一種或多種症狀。在一定範圍，藥物可以阻止生長及/或殺死現有癌細胞，其可能是細胞生長抑制及/或細胞毒性的。有效量可以延長進展自由存活(例如藉由針對固體腫瘤之反應評估標準，RECIST或CA-125變化所測得)，導致客觀反應(包括部分反應PR或完全反應CR)，增加總存活時間，及/或改善癌症的一種或多種症狀(例如藉由FOSI評估)。
治療劑之「固定」或「平坦」劑量在本文係指被投與給人類患者，而不考慮該患者之體重(WT)或體表面積(BSA)的劑量。該固定或平坦劑量因此不作為mg/kg的劑量或mg/m2的劑量，而是作為治療劑的絕對量提供。
「容器」是指可以用來持有或容納醫藥組合物或組合物之物體。本文中之容器的實例包括小瓶、注射器、靜脈內袋等。
「靜脈內袋」或「IV袋」是可持有可以經由患者的靜脈投與的溶液的袋子。在一個實施例中，該溶液是鹽溶液(例如約0.9%或約0.45% NaCl)。視情況，該IV袋由聚烯烴或聚氯乙烯形成。
「小瓶」為適合持有液體或凍乾製劑的容器。在一個實施例 中，該小瓶是單次使用的小瓶，例如具有塞子的20毫升單次使用的小瓶。
「包裝插頁」是奉食品及藥物管理局(FDA)或其他監管機構之命必須放在每一處方藥之包裝內的傳單。傳單通常包括藥物之商標、其通用名稱及其作用機制；指出其適應症、禁忌症、警告、注意事項、不良反應及劑型；並包括推薦劑量、時間及投藥途徑的說明。
「醫藥組合物」是可以安全地投與給人類患者的包含醫藥上活性藥物(例如帕妥珠單抗及變體形式，如本文所揭示之彼等)及一或多種「醫藥上活性賦形劑」(例如緩沖劑、穩定劑、張力調節劑、防腐劑、表面活性劑等等)的組合物。該等組合物可以是例如液體或凍乾的。
「重組」蛋白質是已經藉由基因上修飾之宿主細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞所製備之蛋白質。
「製造規模」是指使用由FDA或其他監管機構批准之商業方法，以商業規模，例如以12000公升(L)或以上製備蛋白質藥物(例如抗體)。
「純化」是指一個或多個純化步驟，如蛋白質A層析、離子交換層析等。
「經單離之」變體係指已經藉由一或多種純化或分析程序自主要種類或野生型抗體分離之變體。可評估該等經單離之變體的生物活性及/或效力。
II.抗體組合物
(i)主要種類抗體
本文中之抗體組合物包括結合HER2之抗體(HER2抗體)、視情況可選之人源化HER2抗體。本文中之人源化抗體可包括例如併入人重鏈可變域中之非人高變區殘基及可進一步包括在選自由69H、71H及 73H(利用在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所闡述之可變域編號系統)組成之群之位置處的框架區(FR)取代。在一個實施例中，該人源化抗體包括在位置69H、71H及73H中之兩個或所有處之FR取代。
本文中受關注之示例性人源化抗體包括VH CDR殘基：-針對CDR-H1為GFTFTDYTMX(SEQ ID NO：17)，其中X較佳為D或S，例如GFTFTDYTMD(SEQ ID NO：23)；-針對CDR-H2為DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO：18)；及/或-針對CDR-H3為NLGPSFYFDY(SEQ ID NO：19)，視情況包括彼等CDR殘基之胺基酸修飾，例如其中該等修飾基本上維持或改進該抗體之親和力。例如，用於本發明方法中之抗體變體可具有在以上可變重鏈CDR序列中之約1至約7或約5個胺基酸取代。該等抗體變體可藉由親和力突變，例如如以下該製得。
例如除了上一段落中之彼等重鏈可變域CDR殘基以外，該人源化抗體亦可包括VL CDR殘基：-針對CDR-L1為KASQDVSIGVA(SEQ ID NO：20)；-針對CDR-L2為SASYX1X2X3，其中X1較佳係R或L，X2較佳係Y或E，及X3較佳係T或S(SEQ ID NO：21)，例如SASYRYT(SEQ ID NO：24)；及/或-針對CDR-L3為QQYYIYPYT(SEQ ID NO：22)。
該等人源化抗體視情況包含上述CDR殘基之胺基酸修飾，例如，其中該等修飾基本上維持或改進該抗體之親和力。例如，受關注之抗體變體可具有在以上可變輕鏈CDR序列中之約1至約7或約5個胺基酸 取代。該等抗體變體可藉由親和力突變而製備。
本發明亦設想結合HER2之親和力成熟抗體。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如，包含分別係SEQ ID NO：7及8之可變輕鏈及/或可變重鏈序列(即包含帕妥珠單抗之VL及/或VH)之抗體。親和力成熟的帕妥珠單抗變體較佳以優於鼠2C4或帕妥珠單抗之親和力(例如約2或約4倍至約100倍或約1000倍的改進親和力，例如使用HER2 ECD ELISA所評估)結合HER2受體。用於取代之示例性可變重鏈CDR殘基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99、或兩個或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個或七個該等殘基)的組合。用於改變之可變輕鏈CDR殘基的實例包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97或兩個或更多個(例如，兩至三個、四個、五個或至多約10個該等殘基)之組合。
設想各種形式之人源化抗體或親和力成熟抗體。例如，人源化抗體或親和力成熟抗體。或者，人源化抗體或親和力成熟抗體可以是完整抗體，如完整IgG1抗體。
較佳地，HER2抗體(主要種類HER2抗體及其抗體變體中任一者或兩者)是結合至HER2之子域II、比曲妥珠單抗更有效地抑制HER二聚合、及/或結合至HER2之異源二聚合結合位點的抗體。本文的主要種類抗體之較佳實施例是包含SEQ ID No.3及4之可變輕鏈及可變重鏈胺基酸序列，及最佳包含SEQ ID No.11或15之輕鏈胺基酸序列及SEQ ID No.12或16之重鏈胺基酸序列的抗體。
(ii)不成對半胱胺酸變體
本文之實例1及實例3描述帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體。用於單離、表徵及量化該等變體之分析檢定包括特異性評估鏈內二硫鍵(不同於鏈間二硫鍵)之檢定，例如，如本文中在實例1中之抗體片段(例如Fab片段)的疏水相互作用層析(HIC)分析、如在實例1中之完整 抗體的HIC、如在實例3中之差異標記之抗體的肽圖譜分析及/或如在實例3及在Zhang等人，Anal.Chem.84(16)：7112-7123(2012)中之反相高效液相層析(RP-HPLC)。
一般而言，帕妥珠單抗之主要形式包括同時在其兩個Fab域之兩個VL結構域中的Cys23與Cys88之間的二硫鍵。參見圖6。
本文中之一種不成對半胱胺酸變體異源二聚體變體在兩個Fab區中僅一個可變輕鏈(VL)結構域中缺乏Cys23/Cys88二硫鍵。參見圖20(b)。此被確定為主要不成對半胱胺酸變體。
本文中之另一不成對半胱胺酸變體同源二聚體變體在其兩個Fab區中均缺乏Cys23/Cys88二硫鍵。參見圖20(c)。
在一個實施例中，組合物中之不成對半胱胺酸變體(包括同源二聚體及異源二聚體變體)之含量為約25%，例如，藉由Fab疏水相互作用層析(HIC)所測定。
在一個實施例中，組合物中之同源二聚體變體的含量為4.9%，如藉由完整抗體之HIC而測定。
在一個實施例中，組合物中之異源二聚體變體的含量為約13%至約18%，例如，如藉由完整抗體之HIC而測定。
組合物視情況進一步包含一或多種如下所述之其他變體。
本發明亦係關於經單離之帕妥珠單抗的不成對半胱胺酸變體，其中該不成對半胱胺酸變體包括帕妥珠單抗之一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸。該等經單離之不成對半胱胺酸變體可包括異源二聚體變體及/或同源二聚體變體或由其組成。該等變體可以使用HIC或其他純化方法進行單離，並可以進行生物檢定，如效力檢定(使用HER2-陽性乳癌細胞)，如以下實例1所示。
(iii)無岩藻糖基化變體
本文之實例2及實例4描述帕妥珠單抗的無岩藻糖基化變體，並 演示如何基於組合物中之無岩藻糖基化帕妥珠單抗之百分比確定ADCC活性。
在一個實施例中，本發明係關於包含帕妥珠單抗及帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體的組合物，其中該無岩藻糖基化變體的含量為大於2%之該組合物。參見，例如，anti2C4907-2及以下表9中之運行1。
在一替代實施例中，本發明係關於包含帕妥珠單抗及帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體的組合物，其中該無岩藻糖基化變體的含量為0.9至4.1%之該組合物。無岩藻糖基化變體之該含量可例如使用經驗證之實例4中之CE-LIF檢定而量化。
視情況，該組合物進一步包含不成對半胱胺酸變體(異源二聚體及/或同源二聚體，如前一節中該)及/或以下將描述之其他變體。
(iv)LMWS及HMWS
本發明進一步係關於帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)及/或帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)，無論呈經單離之形式或呈包含該(等)變體及主要種類抗體之組合物形式。該LMWS及HMWS可使用各種技術，包括但不限於尺寸排除高效液相層析(SE-HPLC)及/或毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)進行單離、表徵及量化。
使用SE-HPLC檢定(例如如實例5中)，組合物中之主要種類帕妥珠單抗及HMWS或LMWS的含量可為：
主峰：約96%，例如，約96.7%，約97.3%，例如，約97.4%。
HMWS：約2%，例如，約1.7%；例如，約1.5%，例如約1.4%；例如約0.8%。
LMWS：約2%，例如，約1.6%，例如，約1.2%，例如約0.6%。
使用NR-CE-SDS檢定(例如如實例5中)，組合物中之主要種類帕 妥珠單抗及HMWS或LMWS的含量可以是：
主峰：約95%，例如，約96.0%，例如，約97.8%
HMWS：約1%，例如約0.6%。
LMWS：約4%，例如約3.4%。
例如，如藉由CE-SDS所測定，主峰或主要種類帕妥珠單抗(不包括LMWS及HMWS)之含量可為約95%至約99%，例如，約96.0%至約97.8%，例如95.3%至約97.3%主峰。
視情況，LMWS包括如藉由NR-CE-SDS所獲得之「峰6」(參見，例如實例5)或由其組成。該峰6可以被測定為約0.9%至約2.3%，例如約2%至約2.3%之該組合物。
(v)帕妥珠單抗之峰1及峰2片段
本發明進一步係關於帕妥珠單抗之峰1片段及/或峰2片段，其呈分離或單離形式或呈包含該(等)片段及主要種類抗體的組合物形式。峰1及峰2可以使用各種技術，包括(但不限於)尺寸排除高效液相層析(SE-HPLC)及/或毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)(包括R-CE-SDS及NR-CE-SDS)進行單離、表徵及量化。在一個實施例中，藉由R-CE-SDS分離及/或分析峰1及峰2，例如如實例5及6中所述且經校正峰面積(CPA)提供該組合物中之峰1或峰2%。
使用R-CE-SDS檢定(例如如實例5及6中)，組合物中之峰1的含量為5%(例如0.13%至0.41%之CPA)及組合物中之峰2的含量為1.0%(例如0.47%至0.74%之CPA)。
(vi)其他變體
本發明組合物視情況包括帕妥珠單抗之其他變體，如彼等描述於美國專利7,560,111(Kao等人)及/或WO 2009/099829(Harris等人)中者。
該等其他變體之實例包括但不限於，以下中之任一者或多者： 糖化變體、二硫鍵還原變體、非可還原變體、去醯胺基化變體、唾液酸化變體、VHS-變體、C-端離胺酸變體、甲硫胺酸氧化變體、無岩藻糖基化變體、G1糖基化變體、G2糖基化變體及非糖基化重鏈變體。
例如，該組合物可包括酸性變體(參見WO 2009/099829，Harris等人)，其中該組合物中之該等酸性變體可包括糖化變體、去醯胺基化變體、二硫鍵還原變體、唾液酸化變體及非可還原變體中之一者、二者、三者、四者或五者。較佳地，該組合物中之所有酸性變體的總量小於約25%。在一個實施例中，該糖化變體、去醯胺基化變體、二硫鍵還原變體、唾液酸化變體及非可還原變體構成該組合物中之酸性變體的至少約75至80%。
酸性變體可藉由多種方法進行評估，但是較佳地該等方法包括以下中之一者、兩者、三者、四者或五者：離子交換層析(IEC)，其中在IEC之前、之後及/或期間利用唾液酸酶處理該組合物(例如，以評估唾液酸化變體)、還原CE-SDS(例如以評估二硫鍵還原變體)、非還原CE-SDS(例如以評估非可還原變體)、酸酯層析(例如以評估糖化變體)及肽圖譜(例如以評估去醯胺基化變體)。
該組合物視情況包括胺基末端前導區延伸變體。較佳地，該胺基末端前導區延伸是在抗體變體之輕鏈上(例如在抗體變體之一條或兩條輕鏈上)。本文中之抗體變體可在任何一條或多條其重鏈或輕鏈上包括胺基末端前導區延伸。較佳地，該胺基末端前導區延伸是在抗體之一條或兩條輕鏈上。該胺基末端前導區延伸較佳包括VHS-(即VHS-變體)或由其組成。胺基末端前導區延伸在組合物中之存在可以藉由不同分析技術，包括但不限於N-端序列分析、電荷異質性之檢定(例如，陽離子交換層析或毛細管區帶電泳法)、質譜法等進行檢測。該組合物中之抗體變體的含量一般自構成用於檢測變體之任何檢定 (較佳陽離子交換分析)的檢測下限之含量至小於主要種類抗體之含量不等。通常，該組合物中之抗體分子的約20%或更少(例如約1%至約15%，例如5%至約15%，及較佳約8%至約12%)包括胺基末端前導區延伸。該等百分比含量較佳使用陽離子交換分析進行測定。
設想主要種類抗體及/或變體之進一步胺基酸序列變化，包括但不限於一條或兩條其重鏈上包含C-端離胺酸殘基的抗體(該抗體變體可以約1%至約20%的含量存在)、具有一個或多個氧化甲硫胺酸殘基之抗體(例如，包括氧化之Met-254之帕妥珠單抗)等。
而且，除了上述無岩藻糖基化變體及唾液酸化變體以外，主要種類抗體或變體可以包括其他糖基化變體，其非限制性實例包括包含附接至其Fc區之G1或G2寡醣結構之抗體、包含一條或兩條非糖基化重鏈之抗體等。
III.製造及分析方法
根據本發明之一個實施例，提供一種評估帕妥珠單抗組合物的方法，其包括以下中之一者、兩者、三者或四者：(1)測量該組合物中之不成對半胱胺酸變體之含量，其中該不成對半胱胺酸變體包括帕妥珠單抗之一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸；及/或(2)測量該組合物中之無岩藻糖基化帕妥珠單抗之含量；及/或(3)測量該組合物中之帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)之含量，及/或(4)測量該組合物中之帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)之含量。視情況，對包含帕妥珠單抗及其變體之組合物進行所有四個分析檢定。
本發明亦關於一種製備組合物的方法，其包括：(1)製備包含帕妥珠單抗及一或多種其變體之組合物，及(2)使因此製得之該組合物進行一或多種分析檢定以評估於其中之該(等)變體之含量。該(等)分析檢定可評估及量化以下中之任一者或多者之含量：(i)包含帕妥珠單 抗之一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的不成對半胱胺酸變體及/或(ii)包含帕妥珠單抗之僅一個輕鏈可變域中之Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的異源二聚體變體及/或(iii)包含帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中之Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的同源二聚體變體及/或(iv)帕妥珠單抗之無岩藻糖基化變體及/或(v)帕妥珠單抗之高分子量種類(HMWS)及/或(vi)帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)及/或(vii)帕妥珠單抗之峰1片段及/或(viii)帕妥珠單抗之峰2片段。因此，可以分析該等變體中之一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種或八種。
視情況，分析檢定評估、量化、或單離不成對半胱胺酸變體，包括異源二聚體及/或同源二聚體變體。例如，分析檢定可包括抗體片段(例如Fab片段)或完整抗體之疏水相互作用層析(HIC)(參見，例如實例1)、肽圖譜分析(參見，例如實例3)或反相高效液相層析(HPLC)(參見，例如實例3)。
在一個實施例中，該組合物中之不成對半胱胺酸變體(異源二聚體及/或同源二聚體變體)的含量為約25%，藉由Fab疏水相互作用層析(HIC)所測定。
在一個實施例中，該組合物中之同源二聚體變體的含量為4.9%，如藉由完整抗體之疏水相互作用層析(HIC)所測定。
在一個實施例中，該組合物中之異源二聚體變體的含量為約13%至約18%，如藉由完整抗體之疏水相互作用層析(HIC)所測定。
視情況，分析檢定評估、量化、或單離無岩藻糖基化變體。無岩藻糖基化的量可以用於測定或量化該組合物之生物活性，例如ADCC。
此外，該方法包括評估帕妥珠單抗組合物之生物活性，其包括測量該組合物中之無岩藻糖基化帕妥珠單抗變體之含量以測定該組合 物之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性，且證實無岩藻糖基化帕妥珠單抗之含量係在約0.9%至約4.1%之範圍內。例如，該方法包括使用毛細管電泳-雷射誘導螢光(CE-LIF)測量無岩藻糖基化帕妥珠單抗的含量。
視情況，用於評估無岩藻糖基化的分析檢定是毛細管電泳(CE)，其包括毛細管電泳-雷射誘導螢光(CE-LIF)，參見，以下實例2及4。無岩藻糖基化變體之含量視情況為約0.9至約4.1%之該組合物(例如如藉由實例4中之CE-LIF測得)。在一個實施例中，無岩藻糖基化變體的含量為大於2%之該組合物(例如如藉由實例4中之CE-LIF測得)。
視情況，分析檢定評估、量化、或單離帕妥珠單抗之低分子量種類(LMWS)及/或高分子量種類(HMWS)。示例性檢定包括SE-HPLC及/或CE-SDS(參見，例如，以下實例5)。
在一個實施例中，分析檢定包括SE-HPLC(例如如實例5中)，及因而所分析之組合物中之主要種類帕妥珠單抗、HMWS或LMWS測定為：
主峰：約96%，例如，約96.7%，約97.3%，例如，約97.4%。
HMWS：約2%，例如，約1.7%；例如，約1.5%，例如約1.4%；例如約0.8%。
LMWS：約2%，例如，約1.6%，例如，約1.2%，例如約0.6%。
在一個實施例中，該分析檢定包括CE-SDS(例如如實例5中)，及因而所分析之組合物中之主要種類帕妥珠單抗、HMWS或LMWS測定為：
主峰：約95%，例如，約96.0%，例如，約97.8%
HMWS：約1%，例如約0.6%。
LMWS：約4%，例如約3.4%。
在一個實施例中，組合物是藉由NR-CE-SDS進行評估，且主峰或主要種類帕妥珠單抗(不包括LMWS及HMWS)之含量實測為約95%至約99%，例如約96.0%至約97.8%，例如約95.3%至約97.3%之因而所分析之組合物。
在一個實施例中，組合物中之「峰6」的含量是藉由CE-SDS進行評估(參見，例如實例5)且峰6 LMWS之含量測定為約0.9%至約2.3%，例如約2%至約2.3%之因而所分析之組合物。
在一個實施例中，組合物中之峰1及/或峰2的含量是藉由R-CE-SDS進行評估(參見，例如實例5及6)，且峰1的含量測定為5%(例如0.13%至0.41% CPA)及峰2的含量測定為1.0%(例如0.47%至0.74% CPA)。
該方法視情況進一步包括組合經純化之組合物與一或多種醫藥上可接受之賦形劑，以製成醫藥組合物。此外，該醫藥組合物可以被放入與包裝插頁(例如具有處方資訊，指示其使用者使用該醫藥組合物來治療癌症)一起包裝之容器，從而製成製作物品。
IV.醫藥組合物
包含帕妥珠單抗及其變體之醫藥組合物係藉由混合具有所需純度之組合物與可選之醫藥上可接受的賦形劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版Osol,A.編輯(1980))而製備用於儲存，通常呈凍乾調配物或水溶液的形式。亦設想抗體晶體(參見美國專利申請案2002/0136719)。醫藥上可接受之賦形劑是在採用之劑量及濃度下對接受者無毒的，並且包括緩沖劑，如組胺酸乙酸鹽；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、榖胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精 胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子型界面活性劑，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
凍乾抗體調配物係描述於美國專利第6,267,958號、美國專利第6,685,940號及美國專利第6,821,515號中，其等明確地以引用的方式併入本文中。示例性曲妥珠單抗醫藥組合物是用於靜脈內(IV)投與之不含防腐劑之白色至淡黃色無菌凍乾粉末，其包括440mg曲妥珠單抗、400mg α,α-海藻糖二水合物、9.9mg L-組胺酸-HCl、6.4mg L-組胺酸及1.8mg聚山梨醇酯20。20mL含1.1%苄醇作為防腐劑之抑菌性注射用水(BWFI)復水，產生含有21mg/mL曲妥珠單抗，pH值約6.0的多劑量溶液。
用於治療用途的示例性帕妥珠單抗醫藥組合物包含30mg/mL帕妥珠單抗、20mM組胺酸乙酸鹽、120mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20，pH 6.0。替代帕妥珠單抗調配物包含25mg/mL帕妥珠單抗、10mM組胺酸-HCl緩衝液、240mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20，pH 6.0。
欲用於體內投與之醫藥組合物必須是無菌的。這可容易藉由經由無菌濾膜過濾來實現。
V.治療應用及用途
本文中之組合物可用於治療癌症，如HER-2陽性乳癌，例如，轉移性或局部復發性不可切除乳癌、或新發IV期疾病，定義為免疫組織化學(IHC)3+及/或螢光原位雜交(FISH)擴增比2.0。視情況，在群組中之患者尚未接受先前治療或在輔助治療後復發，具有在基線50%的左心室射血分數(LVEF)，及/或具有0或1之東部協作腫瘤組性能狀 態(ECOG PS)。
在一替代實施例中，該組合物可以用於治療早期HER2-陽性乳癌，例如，與曲妥珠單抗及化療組合，其中該化療包括基於蒽環類之化療，或基於卡鉑之化療。在一個實施例中，該化療包括基於蒽環類之化療，例如包括5-FU、表柔比星及環磷醯胺(FEC)。在一替代實施例中，該化療包括基於卡鉑之化療，例如包括紫杉烷類(例如多西紫杉醇)、卡鉑及HERCEPTIN®/曲妥珠單抗(例如TCH方案)。在一個實施例中，該組合物與基於蒽環類之化療或與基於卡鉑之化療同時投與，例如其中帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及化療係在3週的週期中投與，帕妥珠單抗、曲妥珠單抗及化療給藥係在每個週期的第1天投與。本文設想之早期HER2-陽性乳癌治療包括新輔助及輔助治療。
在另一個實施例中，該組合物可用於治療HER2-陽性胃癌，視情況與曲妥珠單抗及化療，如鉑(例如順鉑)及/或氟嘧啶(例如卡培他濱(capecitabine)及/或5-氟尿嘧啶(5-FU))組合。
在一替代實施例中，該組合物可用於治療HER2-陽性乳癌，視情況與曲妥珠單抗及長春瑞濱(vinorelbine)組合。根據該實施例之乳癌視情況為轉移性或局部晚期。視情況，患者先前未接受過轉移性設定中之全身非激素類抗癌療法。
在另一態樣中，該組合物用於治療患者之HER2-陽性乳癌，其包括投與該組合物、曲妥珠單抗及芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrazole)或來曲唑(letrozole))給該患者。根據該實施例，乳癌是晚期乳癌，包括激素受體-陽性乳癌如雌激素受體(ER)-陽性及/或孕激素受體(PgR)-陽性乳癌。視情況，患者先前未接受過轉移性設定中之全身非激素類抗癌療法。該治療方法視情況進一步包括投與誘導化療(例如，包括紫杉烷)給該患者。
在另一態樣中，該組合物用於治療低HER3癌，諸如卵巢癌、原 發性腹膜或輸卵管癌。參見例如，美國專利7,981,418(Amler等人)及美國專利公開案US-2006-0013819-A1(Kelsey,S.)。
該等抗體及化療治療係根據已知方法投與給人類患者。具體投藥時間表及調配物描述於本文之實例中。
根據本發明之一特定實施例，投與約840mg(負荷劑量)之帕妥珠單抗，然後是一或多個劑量之約420mg(維持劑量)之帕妥珠單抗。維持劑量較佳約每3週投與，總共至少兩個劑量，直至臨床進展性疾病或難以控制的毒性，例如，6至20個劑量。亦設想更長的治療期，包括更多個治療週期。
根據另一個特定實施例，在該癌症是胃癌之情況下，帕妥珠單抗係以所有治療週期840mg之劑量投與。
VI.製作物品
本文之製作物品的一個實施例包括包含本文之組合物或醫藥組合物的容器，例如小瓶、注射器、或靜脈內(IV)袋。視情況，該製作物品進一步包括根據本文上一節之具有描述如何使用該組合物之處方資訊的包裝插頁。
本發明的進一步細節藉由以下非限制性實例進行說明。在本說明書中所有引用的揭示內容明確地以引用的方式併入本文中。
實例1 帕妥珠單抗之Cys23/Cys88不成對半胱胺酸變體及其表徵
帕妥珠單抗是一種基於人IgG1(κ)框架之人源化單株抗體(MAb)。該重組抗體是藉由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生，並且包括兩條重鏈(各具有449個胺基酸殘基)及兩條輕鏈(各具有214個胺基酸殘基)以及鏈間及鏈內二硫鍵。帕妥珠單抗之輕鏈及重鏈序列分別示於圖3A及3B中。算得的完整帕妥珠單抗之分子質量是145,197Da(僅肽鏈，不含重鏈C-端離胺酸殘基)。
每條重鏈之CH2結構域亦具有在Asn299處之單一保守的糖基化位點。
帕妥珠單抗與曲妥珠單抗(HERCEPTIN®)的差異在於輕鏈(12個胺基酸差異)及重鏈(29個胺基酸差異)之互補決定區(CDR)，及其結合至人表皮生長因子受體2(p185HER2)上之不同表位的事實。帕妥珠單抗與人上皮細胞上之HER2受體之結合阻止HER2與HER受體家族之其他成員(包括EGFR、HER3、HER4)形成複合物且阻止形成HER2同源二聚體。藉由阻斷複合物形成，帕妥珠單抗抑制配位體引發之經由兩個主要信號途徑(絲裂原活化之蛋白質(MAP)激酶及磷酸肌醇3-激酶(PI3K))之細胞內信號傳導，從而分別抑制細胞增殖及存活。
該實例係關於帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體的識別及表徵：該Cys23/Cys88不成對半胱胺酸變體包含該抗體之一條或兩條輕鏈中之不成對半胱胺酸。
游離巰基是使用埃爾曼(Ellman)試劑進行測量，且顯示，每莫耳蛋白質中0.1至0.3莫耳的反應性游離巰基含量。疏水相互作用層析(HIC)分析及肽圖譜分析顯示不成對半胱胺酸殘基在一條或兩條輕鏈上之Cys23及Cys88處。使用木瓜蛋白酶HIC，在使用商業化製造方法製備的帕妥珠單抗材料中，發現在該等位點處含有游離巰基的該Fab變體之水平為12.7%至13.5%。完整抗體之HIC分析表明，兩種主要形式為78%至85%野生型帕妥珠單抗及13.4%至18.4%帕妥珠單抗異源二聚體(在一條臂上之不成對半胱胺酸對)。
材料及方法
測試之組合物 ：該實例描述了當前帕妥珠單抗參考標準批次anti2C4907-2及運行1(代表III期臨床材料)及五個III期/商業批次(運行3至7)之表徵，全部使用商業方法以12,000公升(L)規模製備。亦與先前參考標準批次anti2C4-900-1(其代表在I/II期臨床材料)進行比較。
測試之組合物係在20mM L-組胺酸乙酸鹽、120mM蔗糖及0.02%(重量/體積)聚山梨醇酯20中在pH 6.0下以30mg/mL於市售調配物調配之藥物批次。批次anti2C4-900-1係在早期臨床開發中以25mg/mL於10mM L-組胺酸鹽酸鹽、240mM蔗糖及0.02%(重量/體積)聚山梨醇酯20中在pH 6.0下調配。
藉由非還原肽圖譜分析及質譜的二硫鍵分析 ：為了使帕妥珠單抗在非還原條件下變性及使任何埋入之游離巰基烷基化，將含於調配緩衝液中之約0.5mg帕妥珠單抗與變性緩衝液(由8M GdHCl、10mM N-乙基馬來醯亞胺(NEM)、0.1M乙酸鈉組成，pH 5.0)混合，然後在37℃下培養3小時。使用NAP-5管柱，將該溶液的緩衝液更換成600μL 0.1M Tris、1mM CaCl2，pH 7.0。將乙腈(ACN)添加至每個樣品中，以達成10%的濃度。在37℃下，胰蛋白酶消化反應係在1：10(重量/重量)之酶對底物比下進行16小時。所得肽藉由RP-HPLC，使用下述針對亞硫酸解(sulfitolysis)胰蛋白酶圖譜之方法進行分離。
亞硫酸解胰蛋白酶肽圖譜 ：為了生成帕妥珠單抗肽圖譜，在還原及亞硫酸解半胱胺酸殘基後，利用胰蛋白酶消化該蛋白質。將帕妥珠單抗之等分試樣(1mg)添加至360mM Tris-HCl pH 8.6、6M鹽酸胍(GdHCl)、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、13mM亞硫酸鈉及38mM連四硫酸鈉用於還原及亞硫酸解半胱胺酸殘基。樣品於37℃下培養20分鐘。將經亞硫酸解之樣品裝載到PD-10管柱，並利用10mM Tris、0.1mM CaCl2，pH 8.3洗脫。在緩衝液交換後，添加20μL 10%辛基-B-葡糖苷溶液及20μL 1mg/mL胰蛋白酶。樣品於37℃下培養5小時。利用25μL 10%三氟乙酸(TFA)中止該消化反應。所得肽係藉由RP-HPLC，使用Zorbax 300SB-C8管柱(4.6mm×150mm)進行分離。該等肽在初始條件下保持5分鐘後，以在57分鐘內由0%至17%溶劑B，在149分鐘至32%溶劑B，在162分鐘至45%溶劑B，及在173分鐘至95% 溶劑B的線性梯度進行分離。在179分鐘時，在100%溶劑A下再調節該管柱25分鐘，總運行時間為204分鐘。溶劑A由0.1%TFA之水溶液組成且溶劑B由0.08%TFA之乙腈溶液組成。該管柱保持在37℃，並以0.5mL/min的流速洗脫。在214nm及280nm下監測洗脫曲線。胰蛋白酶肽之質量係藉由經分離之消化混合物的液相層析-質譜(LC-MS)分析，使用LTQ ORBITRAPTM質譜儀進行測定。
藉由埃爾曼氏分析之游離巰基含量 ：將帕妥珠單抗樣品緩衝液交換至反應緩衝液(100mM磷酸鉀、1mM EDTA、8M脲，pH 8)中並調節至導致游離硫醇濃度位於標準曲線範圍內之濃度。在反應緩衝液中製備二硫代硝基苯(DTNB)(10mM)之溶液及半胱胺酸的標準曲線(0與100μM之間的8個點)。在96孔板中，將165μL樣品或標準品添加至三次重複的孔中。藉由添加10μL DTNB開始該反應，然後培養30分鐘。培養後，使用SPECTRAMAX M2®板讀數器在412nm下測量吸光度。使用自標準曲線獲得的線性方程來計算游離硫醇的濃度。使用由分光光度計獲得之在280nm下的吸光度，測定該蛋白質之濃度。該游離硫醇記錄為每莫耳帕妥珠單抗之游離硫醇莫耳數。
木瓜蛋白酶HIC ：對於木瓜蛋白酶消化之帕妥珠單抗樣品，在利用羧肽酶B(CpB)移除C-端離胺酸後，利用木瓜蛋白酶消化該等樣品。藉由HIC，使用聚丙天冬醯胺管柱(4.6mm×100mm，1500Å，3μm)分離Fab及Fc結構域。溶劑A由1.6M硫酸銨、20mM磷酸鉀，pH 6.05組成及溶劑B由20mM磷酸鉀，pH 6.05組成。以從3至6分鐘從0%至18%溶劑B，在21分鐘至24%溶劑B之梯度分離分析物。該管柱以0.8mL/min的流速保持在25℃。在280nm下監測洗脫曲線。
完整抗體之HIC ：藉由HIC，使用聚丙天冬醯胺管柱(9.4mm×100mm，1500Å，3μm)分離完整帕妥珠單抗樣品。溶劑A由1.0M硫酸銨、20mM磷酸鉀，pH 6.05組成且溶劑B由20mM磷酸鉀，pH 6.05 組成。用12%溶劑B等度分離分析物達25分鐘。該管柱以2mL/min的流速保持在30℃。在280nm下監測洗脫曲線。
利用肽質量指紋法之SDS-PAGE ：藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析還原及非還原帕妥珠單抗樣品兩者。對於非還原樣品，藉由在SDS-PAGE樣品緩衝液之存在下在60±2℃下加熱5至10分鐘，利用碘乙醯胺使樣品(5μg)變性。在60℃±2℃下，在80mM二硫蘇糖醇(DTT)之存在下還原樣品15至20分鐘。在4%至20%聚丙烯醯胺梯度凝膠中分離經變性樣品並用SYPROTM Ruby染料染色，以獲得蛋白質條帶圖。與帕妥珠單抗樣品一起，分子量標準物及SYPROTM紅寶石染色靈敏度標準物(2ng/條帶及8ng/條帶牛血清白蛋白(BSA))包括在凝膠中。
肽質量指紋法是一種用於蛋白質識別之分析技術。用10μg市售參考標準批次anti2C4907-2及運行5裝載凝膠。藉由SDS-PAGE分離之所有條帶係藉由胰蛋白酶裂解為肽。利用BRUKERTM基質輔助雷射解吸/離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)，準確測量肽之絕對質量。肽質量列表用於藉由搜索蛋白質序列來識別蛋白質。藉由肽質量指紋法識別非還原及還原帕妥珠單抗兩者之所有觀測到的條帶。
藉由生物檢定之效力 ：帕妥珠單抗效力方法藉由測量其抑制表現HER2之人類乳癌細胞系增殖的能力，來評估帕妥珠單抗之效力。在一典型檢定中，利用乳癌細胞接種96孔微量滴定板並在濕潤的培養箱中培養。培養後，移除培養基及將不同濃度之帕妥珠單抗參考標準、檢定對照及樣品添加至該(等)板中。然後培養該(等)板，及用氧化還原染料ALAMARBLUE®間接量化活細胞的相對數。使用在530nm之激發及在590nm之發射測定螢光。ALAMARBLUE®是藍色的且在其氧化狀態非螢光，但是藉由細胞之細胞內環境被還原為粉紅色形式，其係強螢光(Page等人，Int.J.Oncol.3：473-476(1993))。顏色 及螢光的變化是正比於活細胞的數量。表示為相對螢光單位(RFU)的結果相對帕妥珠單抗濃度繪製曲線，及平行線路方案被用來估計帕妥珠單抗樣品相對於參考標準之抗增殖活性。
結果
二硫鍵之分配 ：帕妥珠單抗中有32個半胱胺酸，形成16個二硫鍵，其中四個為鏈間及12個為鏈內連接。然而，由於該分子之多聚體性質，僅九個不同的二硫鍵。利用胰蛋白酶消化該天然蛋白質，以達成所有二硫鍵連接之肽的釋放。帕妥珠單抗批次之層析圖顯示於圖7中。市售參考標準批次anti2C4907-2之消化物的反相LC-MS分析產生所有預期的二硫鍵連接之肽對(表2)。
註：等號(=)表示二硫鍵。
H=重鏈；L=輕鏈；LC-MS=高效液相層析質譜分析法，T=胰蛋白酶肽。
a 參考圖9及圖10。
b 單一同位素質量(MH+)。
c 推斷二硫鍵。T19H二聚體分配不包括Cys228=Cys228及 Cys231=Cys231二硫鍵之驗證。
d該二硫鍵連接之對的存在已經藉由使用不裂解T19L及T20L之替代酶Lys-C證實。
識別之肽藉由在還原二硫鍵時來自肽對之預期肽的識別而被進一步證實(圖8，放大圖在圖9及圖10中)。重鏈肽T19H之二聚體(T19H=T19H)被識別為含有兩個二硫鍵；推斷出Cys228=Cys228及Cys231=Cys231對之識別。藉由LC-MS檢測出一對二硫鍵，T18H=T20L，但洗脫接近空隙體積，及不可識別為紫外線(UV)層析圖上之明顯峰。該二硫化物對之存在係藉由Lys-C消化物之LC-MS分析進一步證實，其中觀察到肽T18H=T19L-T20L。未發現非預期的連接。如下所討論，一個二硫鍵是部分不成對的。
游離巰基分析 ：恰當折疊之帕妥珠單抗中之所有半胱胺酸殘基應涉及二硫鍵。使用埃爾曼氏檢定(Ellman,G.Arch.Biochem.Biophys.82：70-77(1959))，一種測量肽及蛋白質之游離巰基含量的方法，確定反應性未修飾的(游離)硫醇是否存在於帕妥珠單抗中。評估所有材料之游離硫醇(不成對半胱胺酸殘基)含量且結果匯總於表3。
註：游離硫醇水平係藉由埃爾曼檢定在8M脲的存在下測定。
在分析的所有批次中，觀測到約0.1至0.3莫耳游離硫醇/莫耳帕妥珠單抗。在不存在8M脲下，在所有測試的材料中游離硫醇水平均低於定量限值(QL；約0.1莫耳游離硫醇/莫耳蛋白質)，這表明帕妥珠單抗分子中存在之游離硫醇(即不成對半胱胺酸)被掩埋且無法在非變性條件下接近埃爾曼氏試劑。
在CpB及木瓜蛋白酶消化後，藉由HIC分析帕妥珠單抗材料，顯示Fc與Fab峰之間的額外峰，其被識別為在Cys23及Cys88處含有不成對半胱胺酸殘基之Fab變體(圖11及圖12，標記為游離硫醇Fab)。該識別藉由LC-MS胰蛋白酶肽圖譜證實，其中該樣品在還原及胰蛋白酶消化之前在NEM之存在下進行變性。使用木瓜蛋白酶HIC方法測量所有帕妥珠單抗批次之游離硫醇Fab變體之程度，且發現與使用當前方法是一致的(表4)。
註：不成對半胱胺酸Fab峰%係藉由不成對半胱胺酸Fab峰面積除以不成對半胱胺酸Fab+Fab之峰面積獲得。
*計算如下所述。
藉由木瓜蛋白酶HIC檢定，使用商業方法製備之材料的值範圍係12.7%至13.5%，而參考標準批次2C4-900-1(I/II期)之值是略低在 9.4%。
自木瓜蛋白酶HIC的Fab變體%轉換成估算的完整抗體變體% ：含有不成對半胱胺酸之Fab片段的相對量可用於計算不成對半胱胺酸變體之異源二聚體或同源二聚體形式的相對分佈。如果木瓜蛋白酶HIC檢定顯示，來自帕妥珠單抗之Fab片段的10%(或x%)在Cys23/Cys88處包含不成對半胱胺酸，則應該有10個含有不成對半胱胺酸之Fab片段自每50個帕妥珠單抗分子釋放，因為藉由木瓜蛋白酶消化50個抗體應產生100個Fab片段。假設此等10個Fab片段是來自10個不同的帕妥珠單抗分子，則含有1個具有Cys23/Cys88不成對半胱胺酸之Fab的帕妥珠單抗的相對量為約20%，即每50個帕妥珠單抗分子中有10個(或2x%)。更精確而言，如果考慮具有2個含有Cys23/Cys88不成對半胱胺酸之Fab的帕妥珠單抗之概率，則帕妥珠單抗異源二聚體不成對半胱胺酸變體的相對量應為2×10%×90%=18%(或2×x%的×[100-x]%)。此外，帕妥珠單抗同源二聚體不成對半胱胺酸變體的相對量應在10%×10%=1%(或x%×x%)。在該情況下，包含2個在任一個Fab上均不含不成對半胱胺酸之Fab之帕妥珠單抗的相對量應在90%×90%=81%(或[100-x]%×[100-x]%)。
另外，野生型同源二聚體(無不成對半胱胺酸)及異源二聚體(在一個Fab上含不成對半胱胺酸)可以藉由HIC直接量化。完整抗體之HIC將帕妥珠單抗分為兩個主要峰(圖13)，其等藉由LC-MS胰蛋白酶肽圖譜被識別為野生型同源二聚體(不含游離硫醇)及異源二聚體(在一個Fab上具有游離硫醇對)。較小前肩峰亦進行收集並藉由木瓜蛋白酶HIC表徵為主要的同源二聚體(在兩個Fab上之游離硫醇對，約40%)及具有Fc氧化之帕妥珠單抗。使用完整抗體之HIC，估計針對使用當前方法製備之材料，帕妥珠單抗含有約17%至18%之異源二聚體，及針對使用I/II期方法製備之材料，含有13%(表5)。不受限於任何一種理 論，可能的是，藉由商業方法(相對於I/II期方法)製備之不成對半胱胺酸變體的增量，可能源自蛋白質(即VL結構域)折疊率發生比硫醇氧化(二硫鍵形成)率更快，從而捕獲游離半胱胺酸於該變體中。
註：相對峰之百分比是藉由個別峰面積除以所有三個峰的總峰面積而得到。
因為藉由HIC觀測到在帕妥珠單抗之輕鏈上的Cys23/Cys88處之不成對半胱胺酸對，所以在抗增殖檢定中測試每個不成對半胱胺酸變體之純化餾分。純化含有不成對半胱胺酸之Fab並估計具有還原效力(估計效力~50%，相對於原始Fab)(表6)。
註：記錄之活性百分比係相對於原始Fab。
a估計效力值。劑量反應曲線是不平行的，並且下平段不收斂。
此外，三種完整形式(野生型同源二聚體、含有游離硫醇之異源二聚體及含有不成對半胱胺酸之同源二聚體)藉由HIC進行單離，且利 用抗增殖效力檢定進行測試。參見表7。
註：記錄之活性百分比係相對於帕妥珠單抗參考標準(批次anti2C4907-2)。
a 該餾分含有約40%含不成對半胱胺酸之同源二聚體及60%異源二聚體或野生型同源二聚體混合物。
此等資料表明帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體是存在於以商業規模製造之組合物中。該實例中之HIC方法(評估Fab片段或完整抗體)或以下實例3中之肽圖譜是可用於評估帕妥珠單抗組合物中之不成對半胱胺酸變體的存在及數量的檢定。
實例2 無岩藻糖基化帕妥珠單抗組合物及其表徵
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)是細胞介導之免疫力之一態樣，藉由免疫力，效應子細胞主動地裂解已結合抗原-特異性抗體之靶細胞。當利用HER2 3+細胞進行測試時，帕妥珠單抗展現ADCC活性，但當利用HER2 1+細胞觀測時，僅展現極小活性(圖14)。
在帕妥珠單抗I期及III期參考標準中之無岩藻糖基化水平係採用毛細管電泳測定。相比於I期參考標準，其具有較低之G0-F(0.8%)，帕妥珠單抗III期參考標準中之無岩藻糖基化材料之較高水平(G0-F=2.2%)與觀察到的較高ADCC活性相關(圖15)。亦製備並測試酶促去 糖基化帕妥珠單抗，且未顯示結合FcγRIIIa及無ADCC活性(表8)。
註：記錄之活性百分比係相對於帕妥珠單抗參考標準(批次anti2C4907-2)。
ADCC=抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。
此等資料顯示，測量G0-F(無岩藻糖基化)帕妥珠單抗是用於量化帕妥珠單抗之ADCC活性的有效手段。量化無岩藻糖基化之實驗係如下。
藉由毛細管電泳(CE)之寡醣分析 ：帕妥珠單抗樣品(250至500μg)係使用蛋白質A固相萃取親和力技術(PHYTIPSTM)及自動化液體處理系統進行純化。帕妥珠單抗樣品係使用12mM鹽酸(pH 2.0)自蛋白質A樹脂洗脫，並使用10μL 50mM琥珀酸鈉中和。在37℃下利用2.5U/mL PNGase F培養所得樣品15小時。藉由在95℃加熱該溶液5分鐘，使蛋白質沉澱並藉由離心移除。真空乾燥含有釋放之寡醣之上清溶液。在55℃下，於含氰基硼氫化鈉之15%乙酸溶液中，利用8-胺基芘-1,2,6-三磺酸(APTS)使釋放之聚醣衍生化2小時。衍生化多醣之分析均係利用配備有螢光檢測模組之毛細管電泳(CE)系統，使用氬離子雷射(488nm激發，520nm發射)及N-CHO塗佈之毛細管(50μm×50cm)進行。運行緩衝液為40mM ε-胺基-正己酸/乙酸，pH 4.5，0.2%羥丙基甲基纖維素(HPMC)。樣品藉由在0.5psi下之壓力注入毛細管。在20kV下進行分離，且毛細管溫度保持在20℃。
帕妥珠單抗含有在該分子之Fc部分之CH2結構域中的Asn299處的N連接之寡醣位點。在利用PNGase F處理後使用CE及利用APTS標 記，來確定每個批次之在該位點發現之中性寡醣的相對分佈。
來自釋放之衍生化寡醣之CE分析的電泳圖均示於圖16中，其中圖17為放大圖譜。所分析材料之帕妥珠單抗中之寡醣的相對含量匯總於表9。
註：由於四捨五入，總%可能不是精確地相加為100%。此外，小種類(<0.5%)可已包括在總峰面積%中，但在此表中沒有記錄。
a 兩種G1異構體之總和(參見圖17)。
具有G0結構之寡醣是所有材料中之主要種類(62%至75%)。相比目前參考標準批次anti2C4907-2及運行1(62%至64%)，G0糖型在運行3至7及先前參考標準批次2C4-900-1(70%至75%)稍更豐富。G1的糖型觀測為兩個峰，對應於在雙觸型結構之每一支鏈上具有末端半乳糖之兩種異構體。此等兩個峰之面積經合併，以確定G1糖型之相對含量。在G1及G2糖型分別約佔所有材料之釋放之寡醣的18%至29%及1%至3%。在電泳圖中亦觀測到因其他寡醣結構所產生之峰(所有存在佔3%或更低)。此等結構包括G0-F(缺少核岩藻糖之G0)、G0-GlcNAc(缺少一個GlcNAc之G0)、Man5及其他小糖型(Ma及Nashabeh Anal Chem 71：5185-92(1999))。帕妥珠單抗上之寡醣結構是與彼等發現之CHO-衍生之MAb(Ma及Nashabeh，同上)及天然存在之人免疫球 蛋白(Flynn等人，Mol Immunol 47：2074-82(2010))相一致。
實例3 評估不成對半胱胺酸變體的肽圖譜法及RP-HPLC
材料 ：該實驗中使用之材料及裝置包括：3-[N-嗎啉基]丙磺酸(MOPS，Sigma-Aldrich)、N-乙基馬來醯亞胺(d0-NEM；Thermo Scientific，Rockford,Il)、N-乙基馬來醯亞胺(d5-NEM；劍橋同位素實驗室，Andover,MA)、L-半胱胺酸(Sigma-Aldrich)、胰蛋白酶(Promega，Madison,WI)、三氟乙酸(TFA；Fisher,Fair Lawn,NJ)、乙腈(ACN，Burdick & Jackson,Muskegon,MI)。所有化學品及試劑在無進一步純化下如接收使用。
抗體之差異N-乙基馬來醯亞胺(NEM)標記 ：差異NEM標記方法使已經存在於抗體中之游離硫醇經d0-NEM標記及其餘二硫鍵橋被還原並經d5-NEM標記。對於初始d0-NEM標記，將100μL抗體(3mg/mL)與400μL含有6.25mM d0-NEM之變性緩衝液(7.5M GdnHCl，pH 5)輕柔地混合並在37℃下培養2小時。將20μL半胱胺酸(125mM)添加至該樣品並在37℃下培養15分鐘以滅活其餘之d0-NEM。為了還原抗體中之其餘二硫橋，將10μL TCEP(0.5M)添加至該樣品中並在37℃下培養30分鐘。然後將70μL d5-NEM(171mM)添加至該樣品中並在37℃下培養2小時，以標記藉由還原二硫橋產生之游離硫醇。0.5mL差異NEM標記樣品係使用NAP-5管柱進行緩衝液交換，並用0.6mL MOPS緩衝液(20mM MOPS，0.5mM TCEP，pH 7)洗脫。
抗體之肽圖譜分析 ：在37℃下，利用胰蛋白酶，以1：50(w/w)的胰蛋白酶：抗體比消化差異NEM標記之樣品2h。利用10%TFA中止消化。使用Agilent 1200 HPLC系統(Agilent,Palo Alto,CA)分離經胰蛋白酶消化之差異NEM標記之樣品。具有300Å孔徑大小之Jupiter C18管柱(250 x 2mm，5μm)(Phenomenex,Torrance,CA)用於樣品之層析 分離。注入體積為95μL，及柱溫為55℃。流動相A為0.1%TFA之水溶液及流動相B為含於90%乙腈中之0.08%TFA(體積/體積)。初始條件設定為100%流動相A，並保持樣品注入後的前3分鐘。在未來20分鐘內流動相B增加至10%，及然後再增加至40%直至160分鐘及至100%直至162分鐘，所有以線性梯度改變。保持流動相B在100%直至170分鐘。以100%流動相A再平衡管柱直至195分鐘。流速保持在0.28mL/min。
來自HPLC之流出液直接連接至在陽離子模式下操作之LTQ ORBITRAPTM質譜儀的電噴霧電離源。噴霧電壓為4.5kV，及毛細管溫度為300℃。以資料依賴性方式操作質譜儀以在MS與MS/MS模式之間自動切換。調查全掃描質譜圖是在FT-Orbitrap中自m/z 300至m/z 2000獲得，其中針對R=60,000之分辨率設置在m/z 400。五個最大強度離子在線性離子阱中使用碰撞誘導離解(CID)以35%之標準化碰撞能量及30ms之激活時間及2.5m/z單位之單離寬度進行片段化。動態排除(DE)函數被啟用，以減少資料冗餘，並允許選擇低強度離子用於資料依賴性MS/MS掃描。動態排除參數如下：30秒之重複持續時間、500之排除列表尺寸、90秒之排除持續時間、0.76之低排除質量寬度，1.56之高排除質量寬度及2次重複次數。使用XCALIBURTM軟體進行資料分析。
使用上述方法分析當前帕妥珠單抗參考標準批次anti2C4907-2。吾人發現，10.9%之T2L肽(由胰蛋白酶消化產生且含有Cys23)，及8.3%之T7L肽(由胰蛋白酶消化產生且含有Cys88)經d0-NEM標記。因為在該實驗中僅不成對半胱胺酸經d0-NEM標記，該等結果表明，在anti2C4907-2中之Cys23及Cys88的約10%不是由二硫鍵連接的(即10%不成對半胱胺酸變體)。使用類似於上述之計算方法，以將不成對半胱胺酸Fab變體百分比轉換為不成對半胱胺酸完整變體百分比，據估計，在anti2C4907-2中之帕妥珠單抗分子的18%是異源二聚體不成對 半胱胺酸變體，帕妥珠單抗分子的1%是同源二聚體不成對半胱胺酸變體，及81%是野生型同源二聚體形式(無不成對半胱胺酸)。該等結果大致與無論Fab片段或完整帕妥珠單抗之HIC分析結果一致。
有限內切酶Lys-C消化以產生Fab ：藉由有限Lys-C消化程序產生MAb A之Fab片段。簡言之，將MAb A(1mg/mL)與Lys-C酶以1：400之比例在100mM的Tris(pH 7.6)中混合，然後將混合物在37℃下培養30分鐘。利用NEMin pH 5.5、350mM乙酸鈉及8M鹽酸胍標記該反應混合物。利用下文所述之RP-HPLC法分析消化物。
RP-HPLC條件 ：在配備有二元梯度泵、自動進樣器、恆溫柱隔室及二極體陣列檢測器之AGILENT 1200TM HPLC系統(Palo Alto,CA,USA)上進行RP-HPLC分析。該系統包括Pursuit 3二苯基反相管柱(150 x 4.6mm，3μm，Varian，Lake Forest,CA,USA)，其在75℃及以1ml/min運行。使用在280nm之吸光度監測分離。流動相由0.1%TFA的水溶液(流動相A)及含於ACN中之0.09%TFA(流動相B)組成。該38分鐘方法開始於三分鐘梯度由32%至36%流動相B，接著18分鐘線性梯度至42%流動相B。以95%流動相B洗滌該管柱5分鐘，及以32%流動相B平衡10分鐘。
藉由有限Lys-C消化產生之游離硫醇Fab的RP-HPLC分析(圖18)表明游離硫醇Fab為13%左右，與實例1中之HIC一致。NEM標記之游離硫醇Fab變得更加疏水，因而相比游離硫醇Fab在其後洗脫(圖18)，並進一步證實游離硫醇之存在。亦參見圖19，其中肽圖譜證實游離硫醇Fab。
實例4 藉由CE-LIF之無岩藻糖基化定量
該實例描述完全經驗證之毛細管電泳-雷射誘導螢光(CE-LIF)檢定以定量無岩藻糖基化帕妥珠單抗變體。對上文實例2中所揭示之方 法的修改包括：無機械樣品製備、無蛋白質A純化步驟確保樣品之間的一致的蛋白質濃度及改變電泳參數(緩衝賦形劑濃度)。
在該檢定中，帕妥珠單抗樣品用調配物緩衝液稀釋至10mg/mL，及緩衝液交換成肽-N-聚醣酶F(PNGase F)消化緩衝液。然後利用PNGase F的酶促釋放天冬醯胺連接之寡醣。經釋放之聚醣其後利用8-胺基芘-1,3,6-三磺酸(APTS，一種帶負電荷的螢光團)衍生。APTS為所有聚醣提供三個負電荷，從而允許其快速電泳分析。含有過量的衍生劑及APTS-聚醣共軛物之混合物藉由使用降低電滲流之經塗佈之毛細管的CE進行分析。利用雷射誘導螢光系統，使用具有488nm之激發波長及520nm之發射帶通濾波器之氬離子雷射監測該分離。
使用該檢定，關係圖示於圖21中。使用關係圖(%ADCC=30.133+12.439x，其中x=%G0-F)及40至135%之ADCC範圍，帕妥珠單抗之最終規格對應於0.9至4.1%G0-F。
因此，使用該經驗證之CE-LIF檢定，可評估帕妥珠單抗組合物以證實就ADCC而言之生物活性是在所需的範圍(40至135%ADCC活性=0.9至4.1%G0-F)內。
實例5 帕妥珠單抗高分子量種類(HMWS)、低分子量種類(LMWS)及其表徵
帕妥珠單抗係藉由SE-HPLC及CE-SDS進行分析，以確定高分子量種類(HMWS)(一般為二聚體)及低分子量種類(LMWS)之含量。在稀釋後，HMWS沒有差別，此表明該等聚集體是不可解離的。就HMWS定量而言，在分析型超速離心(AUC)與SE-HPLC結果之間存在良好一致性，此表明沒有尺寸排除層析丟失或低估主要HMWS之證據。
材料及方法
測試之帕妥珠單抗組合物 ：該實例描述當前帕妥珠單抗參考標 準批次anti2C4907-2及代表III期臨床材料之運行1及五個III期/商業批次(運行3至7)之表徵，全部以12000公升(L)規模使用商業方法製得。
單離之HMWS ：為了製備用於生物表徵之代表性HMWS，將來自運行3之帕妥珠單抗批次注入使用製備型SE-HPLC管柱(TSK G3000SW，21.5mm×600mm)之製備型HPLC系統並以4.5mL/min的與上述相同之等梯度流動相洗脫。高分子量種類係所收集之餾分，及隨後緩衝液交換成調配物緩衝液。藉由後續SE-HPLC分析顯示HMWS為70%純，剩下的主要是主峰。亦收集主峰並顯示為100%純。
單離之LMWS ：為了製備經單離之LMWS，利用木瓜蛋白酶消化來自運行3之批次編號及利用如上之製備型HPLC進行餾分收集。藉由完整ESI-MS分析，證明主要的形式為Fc及Fab。藉由後續SE-HPLC分析顯示LMWS為99%純。經單離之Fab變體亦使用木瓜蛋白酶處理而製得並藉由製備型IE-HPLC收集。藉由後續SE-HPLC分析顯示該Fab變體為100%純。
SE-HPLC ：利用流動相(0.2M磷酸鉀，pH 6.2，0.25M氯化鉀)將帕妥珠單抗之等分試樣稀釋至10mg/mL。在等度洗脫之TSK G3000SWXL管柱(7.8mm×300mm)上分離樣品。流速為0.5mL/min，及柱溫為室溫。在280nm下監測洗脫曲線。對於藉由多角度光散射(MALS)之檢測，使用兩個依序內聯連接至WYATT DAWN HELEOTMMALS檢測器(使用658nm雷射，17個檢測器)及WYATT OPTILABTM雷克斯折射率檢測器之管柱，分離帕妥珠單抗樣品。
CE-SDS ：利用5羧基四甲基羅丹明琥珀醯亞胺酯(一種螢光染料)使每個帕妥珠單抗批次衍生。使用NAP-5管柱移除游離染料後，非還原樣品係藉由添加40mM的碘乙醯胺並在70℃下加熱5分鐘而製備。對於還原樣品之分析，將衍生之帕妥珠單抗與十二烷基混合硫酸鈉(SDS)及1M DTT混合至1%SDS(體積/體積)的最終濃度。然後將樣品 在70℃下加熱20分鐘。於使用整個分析中保持在20℃之50μm內徑×31.2cm溶凝石英毛細管之CE系統上分析所製備之樣品。樣品藉由在10kV下電動注射40秒而引入毛細管。於15kV之恆定電壓下以逆極性(陰性至陽性)模式，使用CE-SDS運行緩衝液作為篩分介質，進行分離。在488nm下操作之氬離子雷射用於螢光激發，其中在560nm處監測所得發射信號。
結果與討論
SE-HPLC提供關於天然蛋白質之分子大小分佈之定量資訊。帕妥珠單抗批次之SE-HPLC圖示於圖25中，及該圖之放大圖示於圖26中。尺寸排除峰之相對峰面積分佈列於表10。
註：由於四捨五入，故總百分比可能不是精確地相加至100%。
HMWS=高分子量種類；LMWS=低分子量種類。
a自參考標準anti2C4907-2獲得之值。
主峰中洗脫之帕妥珠單抗的比例在所有材料中為99%以上。高分子量種類(HMWS)之含量範圍為0.1%至0.2%，而低分子量種類(LMWS)為0.1%。所有批次顯示類似的層析圖。包括二聚體及更多碳數之聚集物之經純化之HMWS餾分，被證明具有相對於參考標準批次anti2C4907-2之46%效力。
對保持於30℃下之純凈樣品及經稀釋樣品進行SE-HPLC，以檢查帕妥珠單抗HMWS之可能因稀釋及/或在高室溫下長時間暴露所導致之快及慢-離解聚集。在經稀釋及/或加熱之參考標準批次anti2C4907-2中之HMWS含量相比對照未見下降。
在參考標準批次anti2C4907-2上進行之結合MALS之SE-HPLC分離證實了SE-HPLC主峰為單體，具有約150kDa之分子量。
使用沉降速度模式之AUC來表徵存在於帕妥珠單抗樣品中之HMWS。沉降速度是一種獨立於尺寸排除層析之技術，其在不存在固體管柱基質下測量樣品中之HMWS的水平。對具有漸增之HMWS水平的帕妥珠單抗樣品進行AUC，以藉由比較藉由沉降速度所測定之聚集物之水平及種類與彼等藉由SE-HPLC所測定者來確定SE-HPLC是否能夠一致地檢測所有主要帕妥珠單抗HMWS。範圍自0.2%至7.2%總HMWS(藉由SE-HPLC測定)之五個樣品係藉由沉降速度表徵及在表11及圖27中標記為A至E。
此等樣品由代表性帕妥珠單抗藥品批次(標記為A)及四個富集HMWS之樣品組成。選擇富集HMWS之樣品為廣泛降解機制之代表(光暴露、酸性pH暴露及經純化之IE-HPLC鹼性變體)。
SE-HPLC顯示針對樣品A、B、C及E之一個主HMWS峰以及針對樣品D之兩個HMWS峰(圖27)。對於樣品A、B、C及E，AUC僅顯示一個HMWS峰，其沉降係數係約9.1S。在樣品D中，AUC顯示兩個HMWS峰，其沉降係數係約9.1S及10.8S。藉由AUC檢測之HMWS是與SE-HPLC結果一致；該兩種方法均顯示一種主要降解產物，以及樣品D中較少水平之較大HMWS。
此等樣品來自兩種方法之定量結果的比較示於表11。
註1：樣品A是由代表性帕妥珠單抗藥品批次組成，樣品B是由接受1.2 mlux小時光暴露之帕妥珠單抗批次組成，樣品C是由接受3.6 mlux小時光暴露之帕妥珠單抗批次組成，樣品D是由接受在pH 3.2下之酸處理之帕妥珠單抗批次組成，及樣品E是由來自IE-HPLC之經純化之鹼性變體組成。
註2：參見圖27，對應SE-HPLC層析圖。
AUC=分析型超速離心；HMWS=高分子量種類；RSD=相對標準偏差；SE-HPLC=尺寸排除高效液相層析。
a樣品A及B具有低於AUC技術之定量限值的HMWS水平。
對於樣品C、D及E，藉由該兩種技術測得之HMWS百分比具良好一致性。樣品A及B中存在之HMWS之低水平阻礙藉由AUC準確定量該等種類，AUC具有3.7%之定量的估計限值(Gabrielson及Arthur,Methods 54：83-91(2011))。此是藉由SE-HPLC與AUC之間的HMWS百分比明顯差異(表11)反映。對一系列HMWS水平之相關性進行了評估。相關係數(Lin,L,Biometrics 45：255-68(1989))計算為0.97(N=5)，此表明用於定量HMWS之AUC與SE-HPLC之間良好的一致性(圖28)。
該等結果證實，SE-HPLC在測量帕妥珠單抗之HMWS時強勁。SE-HPLC能檢測並準確地定量由AUC觀察到之所有HMWS種類。
基於尺寸之不均勻性，藉由SE-HPLC、SDS-PAGE及CE-SDS之分析在批次之間是一致的。針對測試的所有批次而言，SE-HPLC檢定顯 示類似水平的HMWS(0.1%至0.2%)及LMWS(0.0%至0.1%)。藉由SDS-PAGE分析，還原及非還原樣品所形成之帶圖是一致的，正如由CE-SDS所產生之電泳譜。
在一個實施例中，如藉由SE-HPLC評估之主要種類帕妥珠單抗及HMWS變體及LMWS變體之含量如下：
96%主峰例如，96.7%主峰，例如，97.3%主峰，例如，97.4%主峰
2%HMWS，例如，1.7%HMWS，例如，1.5%HMWS，例如，1.4%HMWS，例如0.8%HMWS。
2%LMWS，例如，1.6%LMWS，例如，1.2%LMWS，例如0.6%LMWS。
藉由SE-HPLC純化之帕妥珠單抗HMWS及LMWS餾分均展現相比主峰及對照下降的抗增殖活性，其是完全有效的。所有尺寸變體顯示出與對照相比可比擬之HER2結合活性及FcRn的結合活性，除了LMWS，其顯示較低的FcRn結合。由於LMWS樣品含有2/3 Fab片段及1/3 Fc片段，較低的抗增殖及FcRn結合活性是如預期的。HMWS顯示出較高的FcγRIIIa(CD16)V158結合活性，但是較低的ADCC活性。LMWS顯示出較低的FcγRIIIa(CD16)V158結合活性，且該變體未觀測到ADCC活性(表12)。
註：記錄之活性百分比係相對於帕妥珠單抗參考標準(批次 anti2C4907-2)。
ADCC=抗體依賴性細胞介導之細胞毒性；HMWS=高分子量種類；LMWS=低分子量種類。
a LMWS樣品由2/3 Fab及1/3 Fc片段組成。所示之值反映基於分子量之nM/nM調整(Fab=47644Da，Fc=52800Da及全長抗體=148088Da)。
b 帕妥珠單抗參考標準(批次anti2C4907-2)具有2.2%之G0-F水平，而對照樣品具有1.7%之G0-F。對於無岩藻糖基化材料水平之差，結果並無相關性。
毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS) ：具有雷射誘導螢光(LIF)檢測之CE-SDS分析是一種高靈敏度的檢定，其提供一種定量地評估在變性條件下之蛋白質的分子大小分佈的方法。在非還原樣品的CE-SDS分析中(圖29)，帕妥珠單抗遷移為一個由96%至98%之總峰面積組成的主要峰及代表LMWS及HMWS之較小峰。對所測試的所有材料而言，藉由該技術測定之HMWS之含量為0.6%。其餘種類遷移為如圖30(放大圖)所示之LMWS。利用烷基化作用使加熱樣品引起之片段化最小化(Salas-Solano等人，Anal Chem 78：6583-6594(2006))。藉由CE-SDS分離之種類的相對分佈列於表13中。
註：由於四捨五入，總%可能不是精確地相加成100%。
CE-SDS=毛細管電泳十二烷基硫酸鈉。
HMWS=高分子量種類。
觀測到小差異，其中峰6從在參考標準批次anti2C4-900-1(I/II期方法)之0.9%增至參考標準批次anti2C4907-2、運行1及運行3至7之1.7%至2.3%。
在一個實施例中，如藉由NR-CE-SDS分離或單離之帕妥珠單抗主峰(不包括LMWS及HMWS)為約95%至約99%，例如，約96.0%至約97.8%。視情況，如藉由CE-SDS分離或單離，HMWS之含量為1%，例如0.6%及LMWS之含量為4%，例如3.4%。
實例6 帕妥珠單抗片段化之檢測及定量
本實例之目的係評估用於檢測帕妥珠單抗片段之尺寸排除層析(SE-HPLC)、還原毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(R-CE-SDS)及非還原CE-SDS(NR-CE-SDS)的方法。
材料及方法
在本研究中評估之樣品匯總如下。此等包括已接受可能會導致更多片段化之各種受應力條件的帕妥珠單抗樣品。
˙參考標準(2C4907-2)
˙熱應力(42天，40℃)
˙經酸處理(pH 3.2，1天，40℃)
˙加速穩定性(30天，在40℃下，然後儲存在約5℃)
˙實時藥品(DP)穩定性(T=0及T=548天，並儲存在約5℃)及相應的原料藥(DS)
如以上實例5所述進行SE-HPLC，具有以下可記錄值：LMWS、主峰、HMWS、及定量限值(LOQ)以上之所有其他顯著峰。
根據上述實例5進行還原CE-SDS(R-CE-SDS)，具有可記錄值：峰 1、LC、峰2、峰3、NGHC、HC、峰5、Inc.Red.、及LOQ以上之所有其他顯著峰。
根據上述實例5進行非還原CE-SDS(NR-CE-CDS)，其中樣品製備不包括抗體還原步驟，以允許藉由自SDS複合步驟消除之二硫蘇糖醇(DTT)的非還原分析。
藉由SE-HPLC、NR-CE-SDS及R-CE-SDS獲得之定性結果分別示於圖31A至B、圖32A至B及圖33A至B中，以及分別示於表14、表15及表16。
峰識別是基於Hunt & Nashabeh Analytical Chemistry 71：2390-2397(1999)及Ma & Nashabeh Chromatographia Supplement 53：S75-S89(2001)。對於NR-CE-SDS分析，峰2後的小峰，通常列為資料報告中峰2的一部分。在此項研究中，該小峰被單獨列報為峰2a以區分輕鏈(LC)片段。
LC=輕鏈、HC=重鏈、L=輕、H=重
NGHC=非糖基化重鏈、HC=重鏈，Inc.Red.=不完全還原
資料評估 ：比較相關片段之峰面積百分比(或校正峰面積百分比，%CPA，對於CE-SDS而言)，以確定是否任一CE-SDS方法提供相比於SE-HPLC之非冗餘資訊。相關片段包括具有未知結構之峰，或彼等已知含有多肽鏈之裂解衍生產物。此等片段不同於抗體產品中存在且藉由CE-SDS通常觀察到之可離解非二硫鍵連接之重及/或輕鏈片段。片段峰必須從其他峰解析出，以靈敏檢測及準確定量。
檢測小片段之能力 ：小片段可在R-CE-SDS及NR-CE-SDS分析中觀察到，並且在該兩種檢定中被命名為峰1。此等峰在該兩種檢定中保留相同的一般形狀及遷移時間，並在受應力條件下以類似的方式增加。因此，認為峰1在兩種檢定中包含相同種類。如表17所註明，兩種CE-SDS檢定能夠檢測小片段。
檢測藉由酸水解(酸性夾)產生之片段的能力 ：長期暴露至酸性條件可以產生片段，特別是在Asp-Pro序列(帕妥珠單抗重鏈殘基272至273)，如藉由經酸處理之樣品的質譜分析所支持，其顯示在29039Da(HC 1至272)及21513Da(具有G0糖之HC 273至448)之質量。該等形 式之理論質量分別為29031Da及21510Da。根據該等形式之預期遷移時間，相應的峰值可以明顯地在經酸處理之樣品之還原CE-SDS分析(峰2，圖34)中見到，但是在比非還原檢定中在低得多的水平下(較低信號)被檢測到。可以推測，在NR-CE-SDS檢定中，峰2片段大概是二硫鍵連接的，因此沒有檢測到。由於經酸處理之樣品中藉由R-CE-SDS檢測到之峰2的水平(5.58%)高於藉由SE-HPLC檢測到之該樣品之總LMWS(0.26%)，因此可以得出結論，SE-HPLC還不足以檢測該等形式。因此，還原CE-SDS檢定係本文中所呈現的能夠檢測因酸水解所產生之片段化的唯一檢定，如表17中所述。
檢測Fab/DesFab片段的能力 ：藉由SE-HPLC檢測到之LMWS與來自非還原CE-SDS檢定之峰3之間有良好的線性關係(r2=0.97)(圖35)。LMWS藉由與醇促產生之Fab共洗脫的研究，被識別為包含Fab片段。同樣，在NR-CE-SDS檢定中之峰3及峰5藉由分別與酶促產生之Fab及DesFab共遷移的研究(Ma & Nashabeh，同上)進行識別。該desFab峰起因於產生該Fab形式的重鏈裂解，因此認為其相對於Fab片段呈等莫耳量(對應於2：1的質量比)，並且因此，該形式之資訊亦可以藉由SE-HPLC間接獲得，如表17中所述。
還原CE-SDS峰3 ：R-CE-SDS峰3為帕妥珠單抗獨有，並沒有在其他抗體之CE-SDS分析中觀察到。擴展的表徵結果支持該結論：峰3不 是產物變體或雜質，而是一種特定於帕妥珠單抗之方法誘導之人造物，其由LC-LC二聚體之可離解形式組成。採用多種技術以表徵峰3。
峰3是由具有UV及LIF檢測之R-CE-SDS觀察到，此表明其不是一種染料標記或樣品製備人造物。
當藉由R-CE-SDS分析時，經純化之帕妥珠單抗輕鏈餾分產生具有表觀MW約2倍於LC之理論尺寸的峰3。
當電泳條件包括更高的毛細管溫度時峰3未被觀察到，且在此等條件下沒有觀察到其他共同遷移的片段。
涉及單個胺基酸突變之研究已識別與LC-LC二聚體形成相關的三個在LC CDR1及CDR2中之胺基酸殘基。當此三個殘基中任一個被替換為另一個胺基酸時，峰3完全離解，並藉由還原CE-SDS無法再觀察到。
結合MALDI-TOF蛋白質質量指紋法(PMF)之SDS-PAGE分析確認無宿主細胞蛋白質存在於帕妥珠單抗中，也不是在藉由CE-SDS觀察到之水平檢測到之類似譜帶。
總的來看，該等結果支持峰3識別為一種方法誘導之特定於帕妥珠單抗的LC-LC二聚體。
討論
從該研究中獲得之資料之評估表明：
(1)就檢測片段而言，NR-CE-SDS確實提供相比SE-HPLC之非冗餘資訊
(2)亦可以使用R-CE-SDS方法獲得藉由NR-CE-SDS方法獲得之非冗餘片段化資訊(相比SE-HPLC)。
如表16所示，還原檢定檢測自可能會在原料藥製造期間出現之低pH暴露所導致之裂解產物。表18包含針對帕妥珠單抗參考標準、 III期材料(n=3)及使用商業製造方法製備之批次(n=39)之還原CE-SDS峰1及峰2所獲得的數值。峰1及峰2之95/99容忍區間(TI)已使用3.2之k值計算出，並在表18中給出。峰1之95/99容忍區間為0.0至0.4%CPA。峰2之95/99容忍區間為0.3至0.9%CPA。
本文選擇原料藥釋放時峰10.5%及峰21.0%之最終接受標準。
由於帕妥珠單抗原料藥係冷凍儲存，將對DS穩定性沒有預期變化。此外，基於在T=0及T=548d時獲得之藥物產品的R-CE-SDS資料(表19)，任何該等命名種類未觀察到顯著變化。
NGHC=非糖基化重鏈，HC=重鏈，Inc.Red.=不完全還原
<110> 美商建南德克公司琳A潔納羅永祥 高永華 章
<120> 帕妥珠單抗(PERTUZUMAB)變體及其評估
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<210> 1
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<212> PRT
<213> 現代人
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<212> PRT
<213> 家鼠
<400> 5
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<212> PRT
<213> 家鼠
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<223> Xaa較佳係D或S
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<223> 序列係合成的。
<400> 24

Claims (13)

  1. 一種包含帕妥珠單抗(Pertuzumab)及其不成對半胱胺酸變體之組合物，其中該不成對半胱胺酸變體包括帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中的Cys23及Cys88以及其一個或兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸。
  2. 如請求項1之組合物，其中該不成對半胱胺酸變體為包含帕妥珠單抗之僅一個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的異源二聚體變體。
  3. 如請求項1之組合物，其中該不成對半胱胺酸變體為包含帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的同源二聚體變體。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該帕妥珠單抗及該不成對半胱胺酸變體各包括分別為SEQ ID NO.7及8的可變輕及可變重胺基酸序列。
  5. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該帕妥珠單抗及該不成對半胱胺酸變體各包括SEQ ID No.11或15的輕鏈胺基酸序列及SEQ ID No.12或16的重鏈胺基酸序列。
  6. 如請求項1至3中任一項之組合物，其進一步包括帕妥珠單抗之一或多種其他變體，其中該等其他變體係選自以下組成之群：無岩藻糖基化變體、低分子量種類(LMWS)、高分子量種類(HMWS)、糖化變體、二硫鍵還原變體、非可還原變體、去醯胺基化變體、唾液酸化變體、VHS-變體、C-端離胺酸變體、甲硫胺酸氧化變體、G1糖基化變體、G2糖基化變體及非糖基化重鏈變體。
  7. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物中之該不成對 半胱胺酸變體之含量為25%，其係藉由Fab疏水相互作用層析(HIC)測得。
  8. 如請求項3之組合物，其中該組合物中之該同源二聚體變體之含量為4.9%，其係藉由完整抗體之疏水相互作用層析(HIC)測得。
  9. 如請求項2之組合物，其中該組合物中之該異源二聚體變體之含量為13%至18%，其係藉由完整抗體之疏水相互作用層析(HIC)測得。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之組合物及一或多種醫藥上可接受的賦形劑。
  11. 一種製作物品，其包括具有如請求項10之醫藥組合物於其中之容器及具有指示其使用者使用該醫藥組合物來治療癌症患者之處方資訊的包裝插頁。
  12. 如請求項11之物品，其中該癌症為乳癌、胃癌、卵巢癌、HER2-陽性癌或低HER3癌。
  13. 一種經單離之帕妥珠單抗變體，其中該經單離之變體包括：(a)帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體，其中該變體為包含帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中的Cys23及Cys88以及其僅一個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的異源二聚體變體；或(b)帕妥珠單抗之不成對半胱胺酸變體，其中該變體為包含帕妥珠單抗之兩個輕鏈可變域中的Cys23及Cys88以及其兩個輕鏈可變域中的Cys23/Cys88不成對半胱胺酸的同源二聚體變體。
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