CN104379163A - 用于治疗癌症的磷酸肌醇3激酶抑制剂化合物和化疗剂的突变选择性及组合 - Google Patents

用于治疗癌症的磷酸肌醇3激酶抑制剂化合物和化疗剂的突变选择性及组合 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用PI3K抑制剂，GDC-0032作为单药或与化疗剂组合用于治疗患者过度增生性病症的方法和组合物。

Description

用于治疗癌症的磷酸肌醇3激酶抑制剂化合物和化疗剂的突变选择性及组合
相关申请的交叉参考
按照37CFR§1.53(b)提交的本项非临时申请按照35USC§119(e)要求于2012年6月8日提交的美国临时申请61/657,484和于2013年4月5日提交的美国临时申请61/808,727的权益，且这些申请在此整体引入作为参考。
发明领域
本申请通常涉及使用抑制PI3激酶活性的化合物治疗过度增生性疾病如癌症。本发明还涉及使用所述化合物用于体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关的病理性病症的方法。
发明背景
现在以同时或序贯给药方案给予抗癌药物疗法的组合在癌症治疗中是常见的。成功的组合疗法相比于单一疗法(即药物治疗限于一种药物)提供改善的甚至是协同的作用(Ouchi et al(2006)Cancer Chemother.Pharmacol.57:693-702；Higgins et al(2004)Anti-Cancer Drugs 15:503-512)。临床前研究是预测临床阶段抗癌药物治疗组合(如卡培他滨和紫杉烷类用于治疗乳腺癌)协同作用的基础(Sawada et al(1998)Clin.Cancer Res.4:1013-1019)。一些组合疗法的剂量和方案可改善安全性而不损害有效性(O’Shaughnessy et al(2006)Clin.Breast Cancer Apr 7(1):42-50)。体外协同作用与临床阶段协同作用相关(Steinbach et al(2003)Clin.Inf.Dis.Oct 1:37Suppl 3:S188-224)。
磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt信号转导通路的上调是大多数癌症的共同特征(Yuan and Cantley(2008)Oncogene 27:5497-510)。所述通路的遗传差已在很多人类癌症中被检测到(Osaka et al(2004)Apoptosis 9:667-76)并起主要作用地刺激细胞增殖、迁移和生存。所述通路的活化发生于编码p110a PI3K同工型的PIK3CA基因的突变点活化或扩增之后(Hennessy et al(2005)Nat.Rev.Drug Discov.4:988-1004)。肿瘤抑制因子PTEN(一种具有与PI3K相反功能的磷酸酶)内功能突变的遗传缺失或丢失也增加PI3K通路信号转导(Zhang andYu(2010)Clin.Cancer Res.16:4325-30)。这些畸变通过激酶如Akt和mTOR增加下游信号转导并且PI3K通路增加的活性已被提议作为对癌症治疗耐药的标志(Opel et al(2007)Cancer Res.67:735-45；Razis et al(2011)Breast CancerRes.Treat.128:447-56)。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是淋巴瘤关键存活和生长信号的主要信号转导结(signaling node)，且被磷酸酶PTEN的活性对抗。在侵袭性形式的淋巴瘤中，PI3K通路是失调的(Abubaker(2007)Leukemia 21:2368-2370)。8％的DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)癌具有PI3CA(磷脂酰肌醇-3激酶催化亚单位α)错义突变并且通过免疫组化检测37％为PTEN阴性的。
磷脂酰肌醇是细胞膜中存在的多种磷脂中的一种，其参与细胞内信号转导(intracellular signal transduction)。经由3'-磷酸化磷酸肌醇(3'-phosphorylated phosphoinositide)的细胞信号传导(cell signaling)牵涉多种细胞过程，例如恶性转化(malignant transformation)、生长因子信号传导、炎症和免疫(Rameh et al(1999)J.Biol Chem.274:8347-8350)中。导致生成这些磷酸化信号转导产物的酶，即磷脂酰肌醇3-激酶(也称为PI3-激酶或PI3K)，最初被鉴定为具有与病毒癌蛋白和生长因子受体酪氨酸激酶相关的活性，所述酶对磷脂酰肌醇(PI)及其位于肌醇环的3'-羟基的磷酸化衍生物进行磷酸化(Panayotou et al(1992)Trends Cell Biol 2:358-60)。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)是在肌醇环的3-羟基残基对脂质进行磷酸化的脂质激酶(lipid激酶)(Whitman et al(1988)Nature,332:664)。由PI3-激酶生成的3-磷酸化磷脂(PIP3)充当第二信使，所述第二信使募集具有脂质结合结构域(lipid binding domain)(包括锤型同源(PH)区域)的激酶(如Akt和PDK1(磷酸肌醇依赖性激酶-1))(Vivanco et al(2002)Nature Rev.Cancer 2:489；Phillips et al(1998)Cancer 83:41)。
PI3激酶家族包括按结构同源性细分的至少15种不同的酶，根据序列同源性和由酶催化形成的产物而分为三类。I类PI3激酶由2个亚单位(subunit)组成：110kd催化亚单位和85kd调节亚单位。所述调节亚单位含有SH2结构域，并结合于具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体或癌基因产物所磷酸化的酪氨酸残基，从而诱导p110催化亚单位(将它的脂质底物磷酸化)的PI3K活性。I类PI3激酶牵涉细胞因子、整合素、生长因子和免疫受体下游的重要的信号传导过程，这表明所述途径的控制可导致重要的治疗效果，如调节细胞增殖和癌变。I类PI3K能够将磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇-4-磷酸酯和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯(PIP2)磷酸化，分别产生磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(PIP)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸酯和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯。II类PI3K将PI和磷脂酰肌醇-4-磷酸酯磷酸化。III类PI3K仅能将PI磷酸化。如p110α中经常发生的癌基因突变所指示的，癌症中一种关键的PI3激酶同工型为I类PI3激酶，p110α(Samuels et al(2004)Science 304:554；US 5824492；US 5846824；US 6274327)。其它同工型在癌症中可能是重要的，且也牵涉于心血管和免疫炎性疾病(Workman P(2004)Biochem Soc Trans32:393-396；Patel et al(2004)Proc.Am.Assoc.of Cancer Res.(Abstract LB-247)95th Annual Meeting,March 27-31,Orlando,Florida,USA；Ahmadi K andWaterfield MD(2004)“Phosphoinositide 3-Kinase:Function and Mechanisms”Encyclopedia of Biological Chemistry(Lennarz W J,Lane M D eds)Elsevier/Academic Press)，已在结肠、乳腺、脑、肝脏、卵巢、胃、肺和头颈实体瘤中发现显著频率的p110α的癌基因突变。约35-40％的激素受体阳性(HR+)乳腺癌肿瘤具有PIK3CA突变。已在胶质母细胞瘤、黑素瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、肝细胞癌和甲状腺癌中发现PTEN异常。
PI3激酶是由p85和p110亚单位组成的杂二聚体(Otsu et al(1991)Cell65:91-104；Hiles et al(1992)Cell 70:419-29)。已经鉴定了四种不同的I类PI3K，表示为PI3Kα(alpha)，β(beta)，δ(delta)和ω(gamma)，其各自由不同的110kDa催化亚单位和调节亚单位组成。所述催化亚单位中的三个，即p110α、p110β和p110δ，各自与相同的调节亚单位p85相互作用；而p110γ与不同的调节亚单位p101相互作用。这些PI3K各自在人的细胞和组织中的表达模式也是不同的。在PI3Kα，β，δ亚单位的每一个中，p85亚单位通过其SH2结构域与靶蛋白中磷酸化酪氨酸残基(存在于适当的序列背景中)的相互作用起到将PI3激酶定位于质膜上的作用(Rameh et al(1995)Cell,83:821-30；Volinia et al(1992)Oncogene,7:789-93)。
测量生物标志物的表达水平(例如血浆中的分泌蛋白)可以是鉴定将会对特异性疗法应答的患者或患者群体的有效有段，所述特异性疗法包括，例如使用化疗剂治疗。需要更有效的手段测定哪些患有过度增生性病症如癌症的患者会对哪些化疗剂治疗应答，并将此类测定纳入对于患者而言更有效的治疗方案中，无论所述化疗剂用作单一药物或与其它药物组合。
PI3激酶/Akt/PTEN通路是癌症药物开发的有吸引力的靶标，因为这些药物预计会抑制细胞增殖，抑制自维持存活和癌症细胞的药物抗性的间质细胞的信号，逆转凋亡的阻遏和克服癌细胞对细胞毒药物的内在耐药性。PI3激酶抑制剂已有报道(Yaguchi et al(2006)Jour.of the Nat.Cancer Inst.98(8):545-556；US 7173029；US 7037915；US 6608056；US 6608053；US6838457；US 6770641；US 6653320；US 6403588；US 7750002；WO2006/046035；US 7872003；WO 2007/042806；WO 2007/042810；WO2004/017950；US 2004/092561；WO 2004/007491；WO 2004/006916；WO2003/037886；US 2003/149074；WO 2003/035618；WO 2003/034997；US2003/158212；EP 1417976；US 2004/053946；JP 2001247477；JP 08175990；JP08176070)。
某些噻吩并嘧啶化合物具有p110α结合、PI3激酶抑制活性，并抑制癌细胞生长(Wallin et al(2011)Mol.Can.Ther.10(12):2426-2436；Sutherlin et al(2011)Jour.Med.Chem.54:7579-7587；US 2008/0207611；US 7846929；US7781433；US 2008/0076758；US 7888352；US 2008/0269210)。GDC-0941(CAS登录号957054‐30‐7,Genentech Inc.)是一种选择性的，口服可生物利用的PI3K抑制剂，其具有有希望的药动学和药物学性质(Folkes et al(2008)Jour.of Med.Chem.51(18):5522-5532；US 7781433；Belvin et al,AmericanAssociation for Cancer Research Annual Meeting 2008,99th:April 15,Abstract4004；Folkes et al,American Association for Cancer Research Annual Meeting2008,99th:April 14,Abstract LB-146；Friedman et al,American Association forCancer Research Annual Meeting 2008,99th:April 14,Abstract LB-110)并且与某些抗实体瘤细胞系的化疗剂组合显示体外和体内协同活性(US2009/0098135)。
GDC-0032(Roche RG7604,CAS登录号1282512-48-4)，命名为2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺，具有有效地PI3K活性(WO 2011/036280；US 8242104；US 8343955)并且已在患有局部晚期或转移性实体瘤的患者中研究。
发明概述
本申请还包括以下所列的本发明各方面的组合。
已经测定化合物GDC-0032或其药学上可接受的盐与某些其它特异性化疗剂的组合可实现体外和体内抑制癌细胞生长的加成或协同作用。所述组合和方法可用于治疗过度增生性病症如癌症。
在一方面中，本发明包括治疗过度增生性病症的方法，其包括向哺乳动物以组合制剂给予或交替给予治疗组合，其中所述治疗组合包括治疗有效量的具有以下结构的GDC-0032：
和治疗有效量的选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。
在一方面中，本发明提供治疗过度增生性病症的方法，其中给予GDC-0032和一种或多种选自以下的治疗剂在治疗过度增生性病症中提供了协同作用：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。在另一方面，所述协同作用具有低于约0.8的联合指数值(Combination Index value)。
在一方面中，本发明提供的治疗组合进一步包含卡铂。
在一方面中，本发明包括进一步包含抗VEGF抗体的治疗组合。
在一方面中，本发明包括的抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。
在一方面中，本发明包括GDC-0032的药学上可接受的盐，其选自与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乙磺酸、天冬氨酸和谷氨酸的盐。
在一方面中，本发明包括治疗患者过度增生性病症的方法，其包括向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合，其中检测在向所述患者给予所述组合前从所述患者获得的生物样品以得到生物标志物的状态，且其中所述生物标志物的状态指示患者对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗可应答性。在一项实施方案中，通过测量功能性生物标志物蛋白水平检测生物样品，其中升高的功能性生物标志物水平指示患者对GDC-0032或所述组合耐药。在另一项实施方案中，通过测量功能性生物标志物水平检测生物样品，其中升高的或降低的功能性生物标志物水平指示患者对GDC-0032或所述组合耐药。
在一方面中，本发明包括药物制剂，其包括GDC-0032和选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。
在一方面中，本发明包括GDC-0032和选自以下的化疗剂的治疗组合在制备用于治疗过度增生性病症的药物中的用途：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。
在一方面中，本发明包括GDC-0032和选自以下的化疗剂的治疗组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，其中所述癌症选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
在一方面中，本发明包括具有下式结构的GDC-0032：
与选自以下的化疗剂的治疗组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，所述治疗组合用于治疗过度增生性病症。
在一方面中，本发明包括具有下式结构的GDC-0032：
与选自以下的化疗剂的治疗组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，所述治疗组合用于治疗选自以下的癌症：乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
在一方面中，本发明包括具有下式结构的GDC-0032：
和选自以下的化疗剂的组合在治疗过度增生性病症中的用途：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumabemtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。
在一方面中，本发明包括具有下式的GDC-0032：
和选自以下的化疗剂的治疗组合在治疗癌症中的用途：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，其中所述癌症选自：乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
在一方面中，本发明包括如前所述的发明。
在一方面中，本发明包括用于治疗过度增生性病症的制造品，其包含：
a)GDC-0032和选自以下的化疗剂的治疗组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑；和
b)使用说明。
在一方面中，本发明包括包含GDC-0032和选自以下的化疗剂的产品：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑；以组合制剂的形式单独、同时或序贯(sequential)用于治疗过度增生性病症。
在一方面中，本发明包括方法，其中以组合制剂的形式给予治疗有效量的GDC-0032和治疗有效量的化疗剂。
在一方面中，本发明包括向哺乳动物交替给予治疗有效量的GDC-0032和治疗有效量的化疗剂。
在一方面中，本发明包括向所述哺乳动物先给予化疗剂，随后给予GDC-0032。
在一方面中，本发明包括通过给药方案给予所述治疗组合，其中以每天两次至每三周一次的范围给予治疗有效量的GDC-0032，且以每天两次至每三周一次的范围给予治疗有效量的化疗剂。
在一方面中，本发明包括重复所述给药方案一次或多次。
在一方面中，本发明包括治疗组合的给予导致协同作用。
在一方面中，本发明包括治疗组合的给予导致低于约0.7的联合指数值。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为癌，其选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
在一方面中，本发明包括所述癌症表达PIK3CA突变体，所述突变体选自E542K、E545K、Q546R、H1047L和H1047R。
在一方面中，本发明包括所述癌症表达PTEN突变体。
在一方面中，本发明包括所述癌症为HER2阳性的。
在一方面中，本发明包括所述哺乳动物为乳腺癌患者，其中所述患者为HER2阴性，ER(雌激素受体)阴性且PR(孕酮受体)阴性的。
在一方面中，本发明包括所述乳腺癌亚型为基底型(Basal)或管腔上皮型(Luminal)。
在一方面中，本发明包括向所述患者给予GDC-0032和艾日布林。
在一方面中，本发明包括分别以每单位剂型约1mg至约1000mg的量给予GDC-0032和化疗剂。
在一方面中，本发明包括以重量比为约1:50至约50:1给予GDC-0032和化疗剂。
在一方面中，本发明包括药物制剂，其包含GDC-0032和选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。
在一方面中，本发明包括所述药物制剂进一步包含选自以下的药学上可接受的助流剂：二氧化硅、粉状纤维素、微晶纤维素、硬脂酸金属盐、铝硅酸钠、苯甲酸钠、碳酸钙、硅酸钙、玉米淀粉、碳酸镁、无石棉滑石、stearowetC、淀粉、淀粉1500、月桂基硫酸镁、氧化镁和其组合。
在一方面中，本发明包括药物制剂，其中每单位剂型GDC-0032和化疗剂各自包含约1mg至约1000mg的量。
在一方面中，本发明包括用于治疗癌症的方法中的药物制剂。
在一方面中，本发明包括确定待组合用于治疗癌症的化合物的方法，其包括：
a)使用GDC-0032和选自以下的化疗剂的治疗组合体外处理具有K-ras突变的肿瘤细胞系：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，和
b)测量协同或非协同作用；
从而确定用于治疗癌症的协同治疗组合。
在一方面中，本发明包括选择待组合用于治疗癌症的化合物的方法，其包括：
a)向肿瘤细胞给予GDC-0032和选自以下的化疗剂的治疗组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumabemtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑；
b)测量pAkt水平的变化；和
c)选择显示pAkt水平升高的协同治疗组合。
在一方面中，本发明包括治疗患者过度增生性病症的方法，其包括向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，其中检测向所述患者给予所述组合前自所述患者获得的生物样品以得到PIK3CA或PTEN突变状态，且其中PIK3CA或PTEN突变状态指示所述患者对所述组合的治疗可应答性。向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032作为单一药物，或GDC-0032和化疗剂的组合。在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后，可通过测量功能性PI3K蛋白水平检测所述生物样品，其中功能性PI3K蛋白水平的变化指示患者对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合耐药或应答。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
在一方面中，本发明包括在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后，通过测量功能性PI3K蛋白水平检测所述生物样品，其中功能性PI3K蛋白水平的变化指示患者对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合耐药或应答。
在一方面中，本发明包括监测患有过度增生性病症的患者是否对使用GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗应答的方法，所述方法包括：
(a)检测在给予至少一剂GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合后自所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN突变：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumabemtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑；和
(b)比较在向患者给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合前自所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN突变状态，
其中在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后获得的样品中PIK3CA或PTEN突变状态的变化或调整鉴定将对使用GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗应答的患者。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
在一方面中，本发明包括优化GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗效果的方法，所述方法包括：
(a)检测在给予至少一剂GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合后自所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN突变：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumabemtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑；和
(b)比较在向患者给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合前自所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN状态，
其中在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后获得的样品中PIK3CA或PTEN的变化或调整鉴定对使用GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗有更大可能性受益的患者。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
在一方面中，本发明包括鉴定用于监测对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合应答的生物标志物的方法，所述方法包括：
(a)检测自接受至少一剂GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合后自所述患者获得的生物样品中选自PIK3CA或PTEN突变的生物标志物的表达、调节或活性：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑；和
(b)比较所述生物标志物的表达、调节或活性与参照样品中所述生物标志物的状态，其中所述参照样品为在向所述患者给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合前自所述患者获得的生物样品；
其中与参照样品相比，所述生物标志物调节变化至少更低或更高2倍(changes by at least 2fold lower or higher compared to the reference sample)被鉴定为可用于监测对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合应答的生物标志物。在一项实施方案中，所述生物标志物为pAkt。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
在一方面中，本发明包括治疗患者过度增生性病症的方法，其包括向患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，其中治疗基于获自具有PIK3CA或PTEN突变的患者的样品。所述生物标志物突变可以是PIK3CA的H1047R、H1047L、E545K或E542K突变。
在一方面中，本发明包括所述生物标志物突变为PIK3CA的H1047R或H1047L突变。
在一方面中，本发明包括所述生物标志物突变为PIK3CA的E542K、E545K或Q546R突变。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌。
在一方面中，本发明包括GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合在治疗患者过度增生性病症中的用途，其包括向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，
其中检测在向所述患者给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合之前自所述患者获得的生物样品得到PIK3CA或PTEN突变状态，且其中PIK3CA或PTEN突变状态指示所述患者对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗应答。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
在一方面中，本发明包括所述过度增生性病症为雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌。
附图简述
图1两图显示在细胞增殖(Cell-TiterPromega)分析中GDC-0032和GDC-0941(4-(2-(1H-吲唑-4-基)-6-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)吗啉)对PIK3CA野生型(WT)和突变型细胞系的有效性(EC50μmol)。每个点代表一种不同的癌细胞系。
图2两个图显示在细胞增殖分析中GDC-0032和GDC-0941对PIK3CA野生型(WT)、PIK3CA突变型、表达HER2的和PI3K突变型/表达HER2的细胞系的有效性(EC50μmol)。每个点代表一种不同的细胞系。
图3三个图显示在4天Cell-Titer活力分析中GDC-0032对下列细胞系的有效性(EC50μmol)：(3a,上)PIK3CA螺旋状(helical)和激酶结构域突变型细胞系；(3b,中)PIK3CA野生型，PIK3CA突变型，PTEN缺失(null)，和PTEN/PIK3CA突变型细胞系；和(3c,下)PIK3CA野生型、PIK3CA突变型、Ras突变型和Ras/PIK3CA突变型细胞系。每个点代表一种不同的细胞系。
图4a显示GDC-0032在SW48等基因细胞系情况中的效力。SW48亲代细胞和具有常见PIK3CA热点突变E545K或H1047R的敲入突变型亚克隆获自Horizon Discovery。使用4天分析测定这些细胞系中的GDC-0032EC50活力值。
图4b显示SW48等基因细胞(亲代和PIK3CA敲入突变型E545K和H1047R)中暴露于一系列浓度的GDC-003218小时后收集的细胞裂解物的凝胶电泳的western blot放射自显影图。
图5a显示GDC-0032、紫杉醇(PTX)以及GDC-0032和紫杉醇的组合对具有PIK3CA H1047R和D350N的乳腺癌细胞系MFM223的作用。体外分析(Cell-TiterPromega)通过2倍剂量调整GDC-0032、紫杉醇(PTX)以及GDC-0032和紫杉醇的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图5b显示GDC-0032+紫杉醇和GDC-0941+紫杉醇组合对抗基底型和管状上皮型的PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。PIK3CA突变包括E545K和H1047R。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。
图6a显示GDC-0032、艾日布林以及GDC-0032和艾日布林的组合对具有PIK3CA E542K突变和PTEN丢失的基底乳腺癌细胞系Cal51的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-TiterPromega)通过2倍剂量调整GDC-0032、艾日布林以及GDC-0032和艾日布林的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图6b显示GDC-0032+艾日布林、GDC0032+多西他赛、GDC-0941+艾日布林和GDC-0941+多西他赛组合对抗基底型和管状上皮型的乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种乳腺癌细胞系。
图7显示GDC-0032+艾日布林和GDC-0941+艾日布林组合对抗基底型和管状上皮型的PIK3CA野生型和PIK3CA E545K、H1047R突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。
图8a显示GDC-0032、多西他赛以及GDC-0032和多西他赛的组合对具有PIK3CA E542K突变和PTEN缺失的基底乳腺癌细胞系Cal51的作用。体外分析(Cell-TiterPromega)通过剂量调整GDC-0032、多西他赛以及GDC-0032+多西他赛的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图8b显示GDC-0032+多西他赛和GDC-0941+多西他赛组合对抗PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。
图9a显示GDC-0032、曲妥珠单抗以及GDC-0032+曲妥珠单抗的组合对具有高HER2表达的乳腺癌细胞系SKBR3的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-TiterPromega)通过剂量调整GDC-0032、曲妥珠单抗以及GDC-0032+曲妥珠单抗的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图9b显示GDC-0032+多西他赛和GDC-0941+多西他赛组合对抗HER2+PIK3CA野生型和PIK3CA突变型乳腺癌细胞系(包括E545K和H1047R)的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。
图10a显示曲妥珠单抗、GDC-0032、紫杉醇和GDC-0032+曲妥珠单抗、紫杉醇+曲妥珠单抗、GDC-0032+紫杉醇的组合，以及GDC-0032+紫杉醇+曲妥珠单抗的三联组合对具有HER2、PIK3CA H1047R和D350N的乳腺癌细胞系KPL4的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-TiterPromega)通过剂量调整改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图10b显示曲妥珠单抗、GDC-0032、紫杉醇和GDC-0032+曲妥珠单抗、紫杉醇+曲妥珠单抗、GDC-0032+紫杉醇以及GDC-0032+紫杉醇+曲妥珠单抗的组合对具有高HER2表达的乳腺癌细胞系SKBR3的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-TiterPromega)通过剂量调整改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图11a显示5-FU、GDC-0032以及5-FU和GDC-0032的组合对ER+乳腺癌细胞系HCC1428的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Promega)通过剂量调整5-FU、GDC-0032以及5-FU+GDC-0032的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。
图11b显示GDC-0032+5-FU和GDC-0941+5-FU组合对抗HER2+(HER2阳性)PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系(包括基底亚型和管状上皮亚型的E545K和H1047R)的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。
图12a显示GDC-0032+常规化疗剂(包括5-FU、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛和艾日布林)的组合对抗癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种所述化疗剂+GDC-0032组合中使用的不同细胞系。
图12b显示GDC-0032+靶向化疗剂(包括曲妥珠单抗()、曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)和MEKi(GDC-0973))的组合对抗癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种不同的细胞系。
图13显示在每天一次通过PO(口服)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、GDC-0941和GDC-0032的、携带有具有PIK3CA H1047R(PI3Kα)突变的HCC1954.x1乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠的队列中，21天内的适体肿瘤体积变化。术语μL是指微升。
图14显示在通过PO(口服)给予媒介物和GDC-0032的、携带有具有HER2+和PIK3CA H1047R突变的KPL4乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠的队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图15显示在每天一次通过PO(口服)给予媒介物和GDC-0032的、具有MCF7-neo/HER2(HER2+，PIK3CA E545K)乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠中，21天的适体肿瘤体积变化。
图16显示在每天一次通过PO(口服)给予MCT媒介物和GDC-0032的、携带有具有PIK3CA E545K突变的MCF-7的乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图17显示在每天一次通过PO(口服)给予媒介物和GDC-0032的、携带有具有PIK3CA H1047R突变的SKOV3卵巢肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图18显示在每天一次通过PO(口服)给予媒介物和GDC-0032的、携带有具有PI3K alpha(α)突变(H1047R)的HM-7结直肠肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，6+天的适体肿瘤体积变化。
图19显示在每天一次通过PO(口服)给予媒介物和GDC-0032的、携带有PTEN缺失的PC3前列腺肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，14天的适体肿瘤体积变化。
图20显示在通过PO(口服)给予媒介物和GDC-0032的、携带有具有PI3Kα突变(Q546R)的22RV1前列腺肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，24天的适体肿瘤体积变化。
图21显示在通过PO(口服)给予媒介物、GDC-0941和GDC-0032的、携带有PTEN缺陷的并且具有B-Raf扩增的537MEL黑素瘤肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图22显示在通过PO(口服)给予媒介物(MCT)和GDC-0032的、携带有具有EGFR-双突变型L858R和T790M、PIK3CA G118D、p53突变的NCI-H1975非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，0-24+天的适体肿瘤体积变化。
图23显示在根据表5的方案给药的、携带有具有PI3K alpha(E545K)的MCF-7neo/HER2乳腺肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，51天的适体肿瘤体积变化。每天一次通过PO(口服)给予GDC-0032和GDC-0941并IP给予多西他赛，在第21天进行最后给药。各队列为媒介物、多西他赛(DTX)、GDC-0941、GDC-0032，以及多西他赛+GDC-0941和多西他赛+GDC-0032的组合。
图24显示在给予媒介物、多西他赛、GDC-0032和GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有PTEN缺失的MX-1三阴性(ER–(雌激素受体)，PR–(孕酮受体)，HER2–(HER2阴性))的乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，25天的适体肿瘤体积变化。
图25显示在给予媒介物、多西他赛、GDC-0032和GDC-0032+多西他赛的组合21天的、携带有具有PIK3CA(PI3Kα)H1047R的SKOV3卵巢肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，26天的适体肿瘤体积变化。
图26显示在给予媒介物、紫杉醇、GDC-0032和紫杉醇+GDC-0032的组合21天的、携带有具有PI3Kα突变(E545K)的MCF-7PIK3CA突变型乳腺肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，40天的适体肿瘤体积变化。
图27显示在给予媒介物、曲妥珠单抗、GDC-0032和曲妥珠单抗+GDC-0032的组合21天的、携带有BT474、HER2+的乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，61天的适体肿瘤体积变化。
图28显示在给予媒介物、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)、GDC-0032、曲妥珠单抗+GDC-0032的组合以及曲妥珠单抗emtansine和GDC-0032的组合的、携带有BT474、HER2+的乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，14天的适体肿瘤体积变化。
图29显示在给予曲妥珠单抗()、多西他赛、GDC-0032、曲妥珠单抗和多西他赛的组合以及曲妥珠单抗、多西他赛和GDC-0032的三联组合的、携带有BT474、HER2+的乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图30显示在通过PO(口服)给予氟维司群、GDC-0032以及氟维司群和GDC-0032的组合21天的、携带有具有PI3Kα突变(E545K)PIK3CA的MCF-7ER+的8-10只免疫受损的小鼠队列中，42天的适体肿瘤体积变化。
图31显示在给予他莫昔芬、GDC-0032以及他莫昔芬和GDC-0032的组合的、携带有MCF-7neo/HER2(ER+,PIK3CA(PI3Kα突变(E545K),HER2+)乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图32显示在通过每天一次PO(口服)给予GDC-0973、GDC-0032以及GDC-0973和GDC-0032的组合21天的、携带有A549非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，40天的适体肿瘤体积变化。
图33显示在给予地塞米松、GDC-0980、GDC-0032、地塞米松和GDC-0980的组合，以及地塞米松和GDC-0032的组合的、携带有MM.1s多发性骨髓瘤肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，18天的适体肿瘤体积变化。
图34显示在通过PO(口服)给予卡培他滨()、GDC-0032以及卡培他滨和GDC-0032的组合的、携带有MCF-7neo/HER2乳腺癌肿瘤异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。
图35显示在给予媒介物、多西他赛、GDC-0032以及GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有A549(KRASG12S、PI3KM772X,N996H)NSCLC(非小细胞肺癌)异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，20天的适体肿瘤体积变化。
图36显示在给予媒介物、多西他赛、GDC-0032以及GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有H520(p53mut)NSCLC(非小细胞肺癌)异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，28天的适体肿瘤体积变化。
图37在有和无雄烯二酮条件下，来曲唑和GDC-0032在表达芳香化酶的MCF7细胞中的活性。
图38通过细胞活力抑制、BLISS和HSA的定量评分显示GDC-0032与来曲唑组合良好。
图39显示PI3K和ER通路的串扰(cross-talk)显示GDC-0032和来曲唑的组合的作用机制。
图40显示在4天CellTiter-Glo分析中在24小时处理后，内分泌耐药MCF7-ARO细胞具有升高的PI3K通路信号转导并且对GDC-0032敏感。
图41显示在给予氟维司群和GDC-0032单药的MCF-7/ER+/HER2-小鼠，和给予氟维司群和GDC-0032组合的MCF-7/ER+/HER2-小鼠，和给予他莫昔芬和GDC-0032单药的MCF-7/ER+/HER2+小鼠，以及他莫昔芬和GDC-0032组合的MCF-7/ER+/HER2+小鼠中，在第21天测量肿瘤生长抑制(％TGI)，以媒介物对照的百分数表示。
图42显示在给予媒介物、紫杉醇、GDC-0032以及GDC-0032和紫杉醇的组合的、携带有MCF-7(PI3Kmut,ER+)乳腺异种移植物的12只免疫受损的小鼠队列中，23天的适体肿瘤体积变化。口服(PO)、每天(QD，在紫杉醇给药的前一天给药休假)给药持续21天或每4天(Q4D)给药持续5个周期给予GDC-0032。以7.5mg/kg的药物每4天静脉给予紫杉醇，持续5个周期。
图43显示在给予媒介物、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、GDC-0032以及GDC-0032+曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的三联组合的、携带有KPL-4(PI3Kmut,Her2+)乳腺异种移植物的8-10只免疫受损小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。口服(PO)且每天(QD)给予GDC-0032，持续21天。以3mg/kg的药物每周一次腹膜内给予曲妥珠单抗，持续3周，以2.5mg/kg的药物每周一次腹膜内给予帕妥珠单抗，持续3周。
图44显示在给予媒介物、紫杉醇、卡铂、抗-VEGF抗体(B20-4.1.1)、GDC-0032以及GDC-0032+紫杉醇(PTX)、卡铂、+/-抗-VEGF的三联和四联组合的、携带有H292(KRASmut)NSCLC(非小细胞肺癌)异种移植物的10只免疫受损小鼠队列中，22天的适体肿瘤体积变化。口服(PO)且每天(QD)给予GDC-0032，持续21天。在第1天以10mg/kg的药物静脉给予紫杉醇，在第1天以80mg/kg的药物腹膜内给予卡铂，并以5mg/kg的药物每周两次腹膜内给予抗-VEGF，持续3周。
示例性实施方案的详述
现将详细描述本发明一些实施方案，其实施例在所附结构式和化学式中说明。当本发明将结合所列实施方案来描述时，应该理解的是，所述实施方案不是意在将本发明限于这些实施方案。相反地，本发明意在涵盖可包括在如权利要求书所定义的本发明范围内的所有可选形式、修改形式和等价形式。本领域技术人员将认识到与本申请描述的方法和物质类似或等价的可用于实施本发明的多种方法和物质。本发明决不限于所描述的方法和物质。若一篇或多篇所引入的文献、专利和类似材料与本申请不同或矛盾(包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等)，则以本申请为准。
定义
当用于本说明书和权利要求书中时，词语“包含”“包括”意在明确所述特征、整数、组分或步骤的存在，但并不排除存在或附加有一个或多个其它特征、整数、组分、步骤或其组。
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施两者，其中目的是预防或减慢(减轻)不希望有的生理变化或障碍，例如癌症的生长、发生或扩散。对于本发明的目的来说，有益或所需的临床结果包括但不限于减轻症状、减轻疾病程度、稳定疾病状态(即没有恶化)、延迟或减慢疾病进程、改善或缓和以及缓解疾病状态(不论是部分还是全部)，不论是可检测到还是不能检测到。“治疗”还可以表示与如果没有接受治疗的期望存活期相比，延长存活期。需要治疗的那些人包括已患有所述疾病或病症的那些人以及易患所述疾病或病症的那些人或要预防所述疾病或病症的那些人。
短语“治疗有效量”是指(i)治疗特定疾病、病症或障碍；(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或者(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或障碍的一个或多个症状开始出现的本发明化合物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即一定程度减慢，且优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度减慢，且优选停止)肿瘤转移；一定程度抑制肿瘤生长；和/或一定程度减轻与癌症相关的一种或多种症状。所述药物可以一定程度防止癌细胞生长和/或杀死存在的癌细胞，它可以抑制细胞生长和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，例如可以通过评定疾病进展时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来测定效力。
术语“检测”包括任何检测(包括直接和间接检测)手段。
本申请使用的术语"诊断"是指分子或者病理状态、疾病或者病症的鉴定或者分类。例如，“诊断”可指具体类型的癌症例如肺癌的鉴定。“诊断”也可指具体类型的癌症的分类，例如通过组织学(例如非小细胞肺癌)、通过分子特征(例如肺癌，其特征在于在具体基因或者蛋白质中的核苷酸和/或氨基酸变异)或者通过两者来分类。
本申请使用的术语"预后(prognosis)"是指预测癌症引起的死亡或者进程包括例如肿瘤性疾病诸如癌症的复发、转移性扩散以及药物抗性的可能性。
本申请使用的术语"预测(prediction)"(以及变化形式诸如预告)是指患者会有利地或者不利地对药物或者一系列药物响应的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在另外的实施方案中，预测涉及患者是否会在治疗(例如用具体的治疗剂治疗和/或手术切除原发性肿瘤和/或一定时间段的化学治疗而无癌症复发)后存活和/或患者会在所述治疗后存活的可能性。本发明的预测方法可在临床上使用以通过针对任何特定患者选择最适当的治疗方式来作出治疗决定。本发明的预测方法在以下方面为有价值的工具：预测患者是否可能有利地对治疗方案诸如给定的治疗方案(包括例如给予给定的治疗或者组合、外科手术、化学治疗等)响应，或者预测患者是否在治疗方案后可能长期地存活。
当根据本发明使用时，术语对具体治疗剂或者治疗选项的"增加的抗性"是指对标准药物剂量或者标准治疗方案的降低的响应。
当根据本发明使用时，术语对具体治疗剂或者治疗选项的"降低的敏感性"是指对标准药物剂量或者标准治疗方案的降低的响应，其中降低的响应可通过增加药物的剂量或者治疗的强度来补偿(至少部分补偿)。
"患者响应"可使用表示对患者的益处的任何终末点来评估，包括但不限于(1)对肿瘤生长的某种程度的抑制，包括减缓生长或者完全生长阻滞；(2)减少肿瘤细胞的数目；(3)减小肿瘤大小；(4)抑制(例如降低、减慢或者完全终止)肿瘤细胞向邻近外周器官和/或组织的渗透；(5)抑制(例如降低、减慢或者完全终止)转移；(6)增强抗肿瘤免疫反应，其可能但是并非必须导致肿瘤的消退或者排斥；(7)某种程度减轻一种或者多种与肿瘤相关的症状；(8)增加治疗后存活的时长；和/或(9)在治疗后的给定的时间点降低死亡率。
“生物标志物”是指可客观测量和评价为正常生理过程、病例过程或对治疗干预的药理应答的指标的特性。生物标志物可为若干种类型：预测性、诊断性或药效学(PD)。预测性生物标志物预测哪些患者可能对特定疗法应答或从特定疗法受益。诊断性生物标志物预测患者疾病的可能原因并可指导治疗。药效学生物标志物确认药物活性，并使剂量和给药方案最优化。
生物标志物状态的“变化”或“调节”，包括PIK3CA突变或PIK3CA突变组，由于其发生于体外或体内，因此使用一种或多种常用于确认药效学(PD)的方法通过分析生物样品检测，所述方法包括：(1)测序所述生物样品的基因组DNA或逆转录PCR产物，从而检测一个或多个突变；(2)通过定量信息水平或评价拷贝数评估基因表达水平；和(3)通过免疫组织化学、免疫细胞化学、ELISA或质谱分析蛋白质，从而检测所述蛋白质的降解、稳定化或翻译后修饰如磷酸化或泛素化。
术语“癌症(cancer)”和“癌性(cancerous)”是指哺乳动物中特征通常为未调节的细胞生长的生理病症或描述所述生理病症。“肿瘤”包含一种或多种癌性细胞。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病(leukemia)或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancy)。所述癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC")、肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)和肺鳞状细胞癌(squamous carcinoma of the lung)；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌(gastric orstomach cancer)，包括胃肠癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌；肝细胞瘤(hepatoma)；乳腺癌(breast cancer)；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾脏癌；前列腺癌；外阴癌(vulval cancer)；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛门癌；阴茎癌；以及头颈癌。本文所用的胃癌(gastric cancer)，包括胃癌(stomach cancer)，其可在胃的任何部分形成并扩散至整个胃和其它器官；具体地食管、肺、淋巴结和肝。
术语“血液肿瘤(hematopoietic malignancy)”是指在涉及细胞如白细胞、淋巴细胞、天然杀伤细胞、浆细胞和髓细胞如嗜中性粒细胞和单核细胞的造血作用过程中产生的癌症或过度增生性病症。血液肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大造血淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病和髓细胞白血病。淋巴细胞白血病(或“成淋巴细胞”)包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。髓性白血病(也称为“髓样”或“非淋巴细胞性”)包括急性髓性(或成髓细胞)白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。
“化疗剂”是用于治疗癌症的生物(大分子)或化学(小分子)化合物，无论作用机制如何。
术语“哺乳动物”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、猴、狗、猫、马、牛、猪和羊。
术语“包装说明书”是指通常包括在治疗产品的市售包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或注意事项的信息，这些信息涉及所述治疗产品的使用。
本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐(tannate)、泛酸盐(pantothenate)、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖二酸盐(saccharate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-二-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可涉及另一种分子诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子的包合物(inclusion)。抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个带电原子。多个带电原子为药学上可接受的盐的部分的实例可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
可通过本领域可用的任何适合的方法制备所需的药学上可接受的盐。例如，使用无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等或用有机酸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟乙酸、水杨酸、吡喃糖基酸(pyranosidyl acid)诸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸诸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸诸如天冬氨酸或谷氨酸、芳族酸诸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸诸如对甲苯磺酸或乙磺酸等处理游离碱。一般而言被视为适合用于自碱性药物化合物形成药学上有用的或可接受的盐的酸在以下文献中有所讨论，例如P.Stahl et al,Camille G.(eds.)Handbook ofPharmaceutical Salts.Properties,Selection and Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge et al,Journal of Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)119；P.Gould,International J.of Pharmaceutics(1986)33201217；Anderson et al,The Practiceof Medicinal Chemistry(1996),Academic Press,New York；Remington’sPharmaceutical Sciences,18th ed.,(1995)Mack Publishing Co.,Easton PA；and inThe Orange Book(Food&Drug Administration,Washington,D.C.on theirwebsite)。这些内容在此引入作为参考。
短语“药学上可接受的”表示所述物质或组合物必须与制剂包含的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物在化学上和/或毒理学上是相容的。
本文所用的术语“协同的”是指比两种或多种单药的相加作用更有效地治疗组合。GDC-0032化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种化疗剂之间的协同相互作用的测定可基于自本文所述的分析获得的结果。这些分析的结果可使用Chou和Talalay组合方法以及剂量作用分析使用CalcuSyn软件分析从而获得联合指数(Chou and Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22:27-55)。本发明所提供的组合可在若干分析系统中评价，并且可使用量化抗癌药物之间的协同作用、相加作用和拮抗作用的标准程序分析数据。所使用的程序，例如图10中，为Chou和Talalay在"New Avenues in Developmental CancerChemotherapy,"Academic Press,1987,Chapter 2中所描述的。联合指数值低于0.8指示协同，值大于1.2指示拮抗作用而值介于0.8和1.2之间指示相加作用。所述组合疗法可提供“协同作用”并证明具有“协同性”，即当所述活性成分一起使用时所实现的作用大于分别使用所述化合物产生的作用的加和。当活性成分为下列情况时，可达到协同作用：(1)以组合的、单位剂量制剂共配制和给药或同时递送；(2)以单独的制剂交替或平行递送；或(3)通过一些其它方案。当以交替疗法递送时，当所述化合物例如通过在单独的注射器中不同的注射或以单独的丸剂或片剂序贯给药或递送时，可达到协同作用。一般来说，在交替疗法中，序贯即连续地给予每种活性成分的有效剂量，而在组合疗法中，一起给予两种或多种活性成分的有效剂量。使用BLISS非依赖模型和最高单药(HSA)模型评价组合作用(Lehár et al.2007,MolecularSystems Biology 3:80)。BLISS分数量化自单药的增强程度，且BLISS分数>0表示大于简单的相加作用。HSA分数>0表示组合作用大于在相应浓度时最大的单药应答。
“ELISA”(酶联免疫吸附分析)是一种普遍形式的“湿室”型分析性生化分析，其使用一种非均相、固相酶免疫分析(EIA)的亚型检测液体样品或湿样品中物质的存在(Engvall E,Perlman P(1971)."Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA).Quantitative assay of immunoglobulin G".Immunochemistry 8(9):871–4；Van Weemen BK,Schuurs AH(1971)."Immunoassay usingantigen-enzyme conjugates".FEBS Letters 15(3):232–236)。ELISA可进行其它形式的配体结合分析而不是严格的“免疫”分析，尽管因为所述方法的常见用途和发展历史，名字带有最初的“免疫”。所述技术本质上需要任何可与检测试剂固定于固相上的闭合试剂(ligating reagent)，所述检测试剂将特异性结合并使用酶产生可适当定量的信号。在各次洗涤之中，只有配体和其特异性结合对应物通过抗原-抗体相互作用仍然特异性结合或“免疫吸附”至固相上，而非特异性或未结合组分被洗掉。不同于其它分光光度计测量的湿室分析形式(其中相同的反应孔(例如，比色杯)可在洗涤后再次使用)，ELISA板具有吸附至作为所述板一部分的固相上的反应产物，因此不易再次使用。进行ELISA涉及至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。含有未知量的抗原的样品被非特异性地(经由吸附至表面)或特异性地(在“夹心”ELISA中，经由对相同抗原具有特异性的另一抗体的捕获)固定于固体载体上(通常为聚苯乙烯微孔板)。在抗原被固定后，添加检测抗体，与所述抗原形成复合物。检测抗体可共价地与酶连接，或者其自身可被通过生物共轭与酶连接的二抗检测。在每一步骤之间，通常使用温和的去污溶液洗涤所述板以除去未特异性结合的任何蛋白或抗体。在最后一次洗涤步骤后，通过添加酶底物产生可见信号显影所述板，所述信号指示样品中抗原的量。
“免疫组织化学”(IHC)是指通过利用抗体特异性结合生物组织中的抗原的原理检测组织切片的细胞中抗原(例如，蛋白质)的过程。免疫组化染色广泛用于诊断异常细胞如癌性肿瘤中发现的那些细胞。特异性分子标志物是特定细胞事件如增殖或细胞死亡(凋亡)的特征。IHC还广泛用于理解生物标志物的分布和定位以及生物组织不同部分中区别表达的蛋白质。可以多种方式使抗体-抗原相互作用可视化。在最常见的情况中，抗体与可催化生色反应的酶如过氧化物酶扼合(参见免疫过氧化物酶染色)。或者，所述抗体还可标记有荧光团，如荧光素或罗丹明(参见免疫荧光)。
“免疫细胞化学”(ICC)是一种常见的实验室技术，其使用经由特异性表位靶向细胞中特异性肽或蛋白质抗原的抗体。然后可使用若干种不同的方法检测这些结合抗体。ICC可评价特定样品中的细胞是否表达所述抗原。在发现免疫阳性信号的情况中，ICC还测定哪些亚细胞隔室表达所述抗原。
示例性实施方案的详述
GDC-0032的制备
本发明化合物被称作GDC-0032(CAS登录号1282512-48-4)，命名为2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺，并具有以下结构：
包括其立体异构体、几何异构体、互变异构体和药学上可接受的盐。
可以如WO 2011/036280、US 8242104和US 8343955中所述，或如以下实施例1所述制备和表征GDC-0032。
化疗剂
某些化疗剂已被证明在体外和体内抑制细胞增殖中与GDC-0032的组合具有令人惊讶的和预料不到的性质。所述化疗剂包括：5-FU、多西他赛、艾日布林(eribulin)、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。
5-FU(氟尿嘧啶,5-氟尿嘧啶,CAS登录号51-21-8)是一种胸苷酸合酶抑制剂，且已被用于治疗癌症包括结直肠癌和胰腺癌数十年(US 2802005；US2885396；Duschinsky et al(1957)J.Am.chem.Soc.79:4559；Hansen,R.M.(1991)Cancer Invest.9:637-642)。5-FU命名为5-氟-1H-嘧啶-2,4二酮，且具有以下结构：
多西他赛(Sanofi-Aventis)用于治疗乳腺癌、卵巢癌和NSCLC癌(US 4814470；US 5438072；US 5698582；US 5714512；US 5750561；Mangatalet al(1989)Tetrahedron 45:4177；Ringel et al(1991)J.Natl.Cancer Inst.83:288；Bissery et al(1991)Cancer Res.51:4845；Herbst et al(2003)Cancer Treat.Rev.29:407-415；Davies et al(2003)Expert.Opin.Pharmacother.4:553-565)。多西他赛命名为(2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸，N-叔丁酯，13-酯与5,20-环氧-1,2,4,7,10,13-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸酯2-苯甲酸酯，三水合物((2R,3S)-N-carboxy-3-phenylisoserine,N-tert-butyl ester,13-ester with 5,20-epoxy-1,2,4,7,10,13-hexahydroxytax-11-en-9-one 4-acetate 2-benzoate,trihydrate)(US 4814470；EP 253738；CAS登录号114977-28-5)，且具有以下结构：
艾日布林(Eisai co.,E7389,ER-086526,NSC 707389(NSNCI designation))被批准用于治疗曾接受至少两次在先化疗方案用于晚期乳腺癌的患有转移性乳腺癌患者，且正被研究用于治疗其它实体瘤，包括非小细胞肺癌(NSCLC)，前列腺癌和肉瘤。艾日布林是来自海绵动物Halichondra属(Halichondra genus of sponges)(Hirata,Y.and Uemura D.(1986)Pure Appl.Chem.58(5):701-710；Bai et al(1991)J.Biol.Chem.266(24):15882-15889)的海绵天然产物软海绵素B的类似物(Towle et al(2001)Cancer Res.61(3):1013-1021；Yu et al(2005)Anticancer agents from natural products.Wash.DC,Taylor&Francis,ISBN 0-8493-1863-7；Kim et al(2009)J.Am.Chem.Soc131(43):15636-15641)。艾日布林是微管的抑制剂，其主要结合现存微管的(+)极处的高亲和性位点的选择性基团并通过在延长的且不可逆的有丝分裂阻断后触发癌细胞凋亡发挥其抗癌作用(Jordan et al(2005)Mol.Cancer Ther.4(7):1086-1095；Okouneva et al(2008)Mol.Cancer Ther.7(7):2003-2011；Smithet al(2010)Biochem.49(6)1331-1337；Kuznetsov et al(2004)Cancer Res.64(16):5760-5766；Towle et al(2011Cancer Res.71(2):496-505)。艾日布林命名为2-(3-氨基-2-羟基丙基)二十六氢-3-甲氧基-26-甲基-20,27-双(亚甲基)11,15-18,21-24,28-三环氧-7,9-桥亚乙基-12,15-亚甲基-9H,15H-呋喃并(3,2-i)呋喃并(2',3'-5,6)吡喃并(4,3-b)(1,4)二氧杂环二十五烯(dioxacyclopentacosin)-5-(4H)-酮(2-(3-Amino-2-hydroxypropyl)hexacosahydro-3-methoxy-26-methyl-20,27-bis(methylene)11,15-18,21-24,28-triepoxy-7,9-ethano-12,15-methano-9H,15H-furo(3,2-i)furo(2',3'-5,6)pyrano(4,3-b)(1,4)dioxacyclopentacosin-5-(4H)-one)(CAS登录号253128-41-5)，且具有以下结构：
吉西他滨(Lilly,CAS登录号95058-81-4)是一种阻断DNA复制的核苷酸类似物，其用于治疗多种癌症包括胰腺癌、乳腺癌、NSCLC和淋巴瘤(US 4808614；US 5464826；Hertel et al(1988)J.Org.Chem.53:2406；Hertelet al(1990)Cancer Res.50:4417；Lund et al(1993)Cancer Treat.Rev.19:45-55)。吉西他滨命名为4-氨基-1-[3,3-二氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2-酮，且具有以下结构：
GDC-0973(XL-518,CAS登录号934660-93-2,Genentech Inc.和Exelixis)是一种有效地且高度选择性的小分子MEK抑制剂，其口服给药用于癌症包括实体瘤的潜在治疗(US 7803839；US 7999006；US 7915250)。GDC-0973和GDC-0941，I类PI3K抑制剂，作为单药和组合处于早期临床试验(Hoeflich etal(2012)Cancer Research,72(1):210-219；US 20110086837)。ERK通路的异常活化在人肿瘤中是常见的。所述通路由包含激酶RAF、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)激酶(MEK)和细胞外信号调节激酶(ERK)三重激酶模型组成，ERK激酶起负反馈放大器的作用以赋予通路输出稳健性(robustness)和稳定性。因为ERK通路经常在人癌症中失调，所以正在付出大量努力研发ERK通路的选择性抑制剂作为抗癌药物。GDC-0973和PI3K抑制剂GDC-0941的组合经由引入与凋亡相关的生物标志物包括Bcl-2家族预凋亡调节因子在体外和体内产生组合作用。GDC-0973命名为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)氮杂环丁烷-1-基)甲酮，且具有以下结构：
GDC-0623(CAS登录号1168091-68-6,Genentech Inc.)是一种有效的且高度选择性的小分子MEK抑制剂，其口服给药用于癌症包括实体瘤的潜在治疗(US 7923456；US 2011/0158990)。GDC-0623命名为5-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-N-(2-羟基乙氧基)咪唑并[1,5-a]吡啶-6-甲酰胺，且具有以下结构：
紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton NJ,CAS登录号33069-62-4)是分离自太平洋紫杉树Taxus brevifolia树皮的化合物，且用于治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌和晚期形式的卡波氏肉瘤(Wani et al(1971)J.Am.Chem.Soc.93:2325；Mekhail et al(2002)Expert.Opin.Pharmacother.3:755-766)。紫杉醇命名为β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基-,6,12b-双(乙酰基氧基)-12-(苯甲酰基氧基)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-4,11-二羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧基-7,11-亚甲基-1H-环癸(3,4)苯并(1,2-b)氧杂环丁烷-9-基酯，(2aR-(2a-α,4-β,4a-β,6-β,9-α(α-R*,β-S*),11-α,12-α,12a-α,2b-α))-苯丙酸，且具有以下结构：
他莫昔芬(CAS登录号10540-29-1)是一种乳腺组织中雌激素受体的拮抗剂，其经由活性代谢产物羟基他莫昔芬起作用。在其它组织如子宫内膜中，它起激动剂的作用，因此可被表征为混合激动剂/拮抗剂(New Engl.J.Med.(2009)361:766Aug.20,2009)。他莫昔芬是绝经前妇女激素受体阳性乳腺癌的常用内分泌(抗雌激素)疗法，且也是绝经后妇女中的标准疗法，尽管在后一情况下芳香化酶抑制剂也被频繁使用。目前，他莫昔芬用于治疗绝经前和绝经后妇女的早期和晚期ER+(雌激素受体阳性)乳腺癌(Jordan,V.(1993)Br J Pharmacol 110(2):507–17)。他莫昔芬命名为(Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，且具有以下结构：
氟维司群(AstraZeneca,CAS登录号129453-61-8)是一种治疗绝经后妇女在抗雌激素疗法后疾病进展的激素受体阳性转移性乳腺癌的药物(Kansra(2005)Mol Cell Endocrinol 239(1-2):27–36)。它是一种无激动剂作用的雌激素受体拮抗剂，其通过下调和降解雌激素受体起作用(Croxtall(2011)Drugs 71(3):363–380)。氟维司群是一种选择性雌激素受体下调调节剂(SERD)。氟维司群适用于治疗绝经后妇女在抗雌激素疗法后疾病进展的激素受体阳性的转移性乳腺癌患者(Flemming et al(2009)Breast Cancer ResTreat.May；115(2):255-68；Valachis et al(2010)Crit Rev Oncol Hematol.Mar；73(3):220-7)。氟维司群命名为(7α,17β)-7-{9-[(4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基]壬基}雌-1,3,5(10)-三烯-3,17-二醇，且具有以下结构：
地塞米松是一种有效的糖皮质类固醇激素，其具有抗炎和免疫抑制活性。在肿瘤学中，向正在进行化疗的癌症患者给予地塞米松以抵消某些抗肿瘤治疗的副作用。地塞米松可增强5-HT3受体拮抗剂如昂丹司琼的止吐作用。地塞米松还用于某些血液肿瘤，特别是在治疗多发性骨髓瘤中，其中地塞米松被单独或者与沙利度胺(thal-dex)或阿霉素(多柔比星)和长春新碱(VAD)的组合一起给药。在脑部肿瘤(原发性或转移性)中，地塞米松用于抵消水肿(其可最终压迫其它脑结构)的发生。地塞米松命名为(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,11,12,14,15,16-八氢环戊并[a]菲-3-酮(CAS登录号50-02-2)，且具有以下结构：
帕妥珠单抗(2C4,rhuHAb 2C4,CAS登录号380610-27-5,Genentech)是一种重组、人源化单克隆抗体，其抑制HER2二聚化(US6054297；US 6407213；US 6800738；US 6627196,US 6949245；US 7041292)。帕妥珠单抗和曲妥珠单抗靶向HER-2酪氨酸激酶受体的不同胞外区(Nahta etal(2004)Cancer Res.64:2343-2346)。表达2C4(帕妥珠单抗)的杂交瘤细胞系于1999年4月8日以ATCC HB-12697保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA。帕妥珠单抗阻断HER2受体与其它HER受体家族成员即HER1/EGFR、HER3和HER4协作的能力(Agus et al(2002)Cancer Cell 2:127–37；Jackson et al(2004)Cancer Res 64:2601–9；Takai et al(2005)Cancer 104:2701–8；US 6949245)。在癌症细胞中，妨碍HER2与其它HER家族受体协作的能力可阻断细胞信号转导并可能最终导致癌细胞生长抑制和癌细胞死亡。HDI，由于其独特的作用方式，具有潜在的可能性用于多种肿瘤，包括并不过表达HER2的那些肿瘤(Mullen et al(2007)Molecular Cancer Therapeutics 6:93-100)。帕妥珠单抗已被研发用于治疗转移性HER2-阳性(+)乳腺癌。
曲妥珠单抗emtansine(KADCYLATM,曲妥珠单抗-DM1,PR-132365,PRO-132365；R-3502,RG-3502；Tmab-MCC-DM1,曲妥珠单抗-美登素曲妥珠单抗-MCC-DM1,T-DM1,Genentech Inc.)是一种抗体-药物缀合物(CAS登录号139504-50-0)，被批准用于治疗HER2-阳性(HER2+)转移性乳腺癌(Burriset al(2011)Clinical Breast Cancer,11(5):275-82；Phillips et al(2008)Cancer Res2008；68(22):9280-9290。曲妥珠单抗emtansine具有以下结构：
其中Tr是曲妥珠单抗，其通过连接部分MCC与美登素药物部分DM1连接(US 5208020；US 6441163)。药物和抗体的比例或药物装载量由以上曲妥珠单抗-MCC-DM 1结构式中的p表示，且范围为1至约8的整数值。药物装载量p值为1至8。曲妥珠单抗-MCC-DM1包括各种装载的和连接的抗体-药物缀合物的混合物，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价地连接至所述抗体曲妥珠单抗上(US 7097840；US 2005/0276812；US2005/0166993)。
曲妥珠单抗(huMAb4D5-8,rhuMAb HER2,Genentech)是一种鼠HER2抗体的重组DNA-衍生的人源化的、IgG1kappa、单克隆抗体形式，其在基于细胞的分析中选择性地高亲和力地(Kd＝5nM)结合人表皮生长因子受体2蛋白HER2(ErbB2)的胞外域(US 5821337；US 6054297；US 6407213；US6639055；Coussens L,et al(1985)Science 230:1132-9；Slamon DJ,et al(1989)Science 244:707-12)。曲妥珠单抗包含具有与HER2结合的鼠抗体(4D5)的互补决定区的人框架区。曲妥珠单抗结合所述HER2抗原，从而抑制癌性细胞的生长。已显示，在体外分析和动物中，曲妥珠单抗抑制过度表达HER2的人肿瘤细胞的增殖(Hudziak RM,et al(1989)Mol Cell Biol 9:1165-72；LewisGD,et al(1993)Cancer Immunol Immunother；37:255-63；Baselga J,et al(1998)Cancer Res.58:2825-2831)。曲妥珠单抗是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性ADCC的介质(Hotaling TE,et al(1996)[abstract].Proc.Annual Meeting AmAssoc Cancer Res；37:471；Pegram MD,et al(1997)[abstract].Proc Am AssocCancer Res；38:602；Sliwkowski et al(1999)Seminars in Oncology 26(4),Suppl12:60-70；Yarden Y.and Sliwkowski,M.(2001)Nature Reviews:Molecular CellBiology,Macmillan Magazines,Ltd.,Vol.2:127-137)。于1998年被批准用于治疗患有ErbB2过度表达的转移性乳腺癌患者(Baselga et al,(1996)J.Clin.Oncol.14:737-744)。FDA于2006年批准作为用于辅助治疗患有HER2-阳性、淋巴结-阳性乳腺癌患者的包含多柔比星、环磷酰胺和紫杉醇的治疗方案的一部分。对于研发另一种用于患有HER2-过度表达的肿瘤或其它与HER2表达相关的疾病、对治疗不响应或响应较差的那些患者的HER2-指向的癌症疗法，存在显著的临床需求。
来曲唑(Novartis Pharm.)是一种术后用于治疗激素响应性乳腺癌的口服非甾体芳香化酶抑制剂(Bhatnagar et al(1990)J.Steroid Biochem.andMol.Biol.37:1021；Lipton et al(1995)Cancer 75:2132；Goss,P.E.and Smith,R.E.(2002)Expert Rev.Anticancer Ther.2:249-260；Lang et al(1993)TheJournal of Steroid Biochem.and Mol.Biol.44(4–6):421–8；EP 236940；US4978672)。被FDA批准用于在绝经后妇女中治疗激素受体阳性(HR+)或受体状态未知的局部或转移性乳腺癌。来曲唑命名为4,4'-((1H-1,2,4-三唑-1-基)亚甲基)二苄腈(CAS登录号112809-51-5)，且具有以下结构：
卡铂(CAS登录号41575-94-4)是一种化疗剂，其用于抗卵巢癌、肺癌、头颈癌(US 4140707)。卡铂命名为氨基；环丁烷-1,1-二甲酸铂，且具有以下结构：
贝伐单抗(CAS登录号216974-75-3,Genentech)是一种用于治疗癌症的抗血管内皮生长因子抗-VEGF单克隆抗体(US 7227004；US6884879；US 7060269；US 7169901；US 7297334)，其中它通过阻断新血管的形成抑制肿瘤生长。贝伐单抗是美国第一种临床可用的血管生成抑制剂，于2004年被FDA批准与标准化疗组合用于治疗转移性结肠癌和大多数形式的转移性非小细胞肺癌。若干正在进行中的后期临床研究测定其对患有以下癌症的患者的安全性和有效性：辅助/非转移性结肠癌、转移性乳腺癌、转移性肾细胞癌、转移性多形性胶质母细胞瘤、转移性卵巢癌、转移性激素难治性前列腺癌和转移性或不可切除的局部晚期胰腺癌。
抗-VEGF抗体通常不与其它VEGF类似物如VEGF-B或VEGF-C结合，也不与其它生长因子如PlGF、PDGF或bFGF结合。优选的抗-VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗-VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；根据Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599产生的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于贝伐单抗，其包括突变的人IgG1框架区和自阻断人VEGF与它的受体结合的鼠抗-hVEGF单克隆抗体A4.6.1获得的抗原结合互补决定区。大约93％的贝伐单抗的氨基酸序列，包括大多数框架区，衍生自人IgG1，并且越7％的学列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗的分子量为约149,000道尔顿，且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化的抗-VEGF抗体进一步描述于US 6884879中。其它抗-VEGF抗体包括G6或B20系列抗体(例如，G6-31，B20-4.1)，如在WO2005/012359的图27-29中的任一个所述。在一项实施方案中，B20系列抗体结合包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103和C104的人VEGF上的功能性表位。A 4.6.1(ATCC HB 10709)和B 2.6.2(ATCC HB 10710)抗-VEGF表达杂交瘤细胞系已被保藏并维持于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209USA。B20-4.1.1是一种贝伐单抗的替代物(Liang et al(2006)Jour.Biol.Chem.281:951-961)。表达由ATCC保藏确认为DNA29101-1276的核苷酸序列插入片段编码的VEGF-E多肽(US 6391311)的克隆于1998年3月5日以ATCC209653保藏并维持于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA。
生物学评价
以单药和与多种化疗剂包括小分子和大分子(蛋白质、抗体)的组合测量GDC-0032的生物学活性。GDC-0032作为单药和在组合中的此类生物学活性与PI3K抑制剂GDC-0941和GDC-0980(均为Genentech研发用于治疗癌症)比较。
GDC-0941(pictrelisib,Genentech Inc.,Roche,RG-7321)是一种有效地多靶点的I类(泛)PI3K同工型抑制剂。目前GDC-0941处于治疗晚期实体瘤的II期临床试验中。GDC-0941命名为4-(2-(1H-吲唑-4-基)-6-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)吗啉(US 7781433；US 7750002；Folkes et al(2008)Jour.of Med.Chem.51(18):5522-5532)，且具有以下结构：
包括其立体异构体、几何异构体、互变异构体和药学上可接受的盐。
GDC-0980(Genentech Inc.,Roche,RG-7422)是一种有效的mTOR和PI3K双重抑制剂(Wallin et al(2011)Mol.Can.Ther.10(12):2426-2436；Sutherlin et al(2011)Jour.Med.Chem.54:7579-7587)。GDC-0980在临床前异种移植物癌症模型(乳腺癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌)中表现出广泛活性，并被研发用于癌症包括实体瘤和非霍奇金淋巴瘤的潜在口服治疗(Wagner AJ；Burris III HA；de Bono JS et al AACR-NCI-EORTC International Congress(2009),21st:November 17(Abs B137)“Pharmacokinetics and Pharmacodynamicbiomarkers for the dual PI3K/mTOR inhibitor GDC-0980:initial phase Ievaluation”；US 7888352；US 2009/0098135；US 2010/0233164)。目前GDC-0980处于治疗晚期实体瘤的II期临床试验。GDC-0980命名为(S)-1-(4-((2-(2-氨基嘧啶-5-基)-7-甲基-4-吗啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)哌嗪-1-基)-2-羟基丙-1-酮，且具有以下结构：
包括其立体异构体、几何异构体、互变异构体和药学上可接受的盐。
表1GDC-0032和GDC-0941结合活性的比较*
*Folkes et al(2008)Jour.of Med.Chem.51(18):5522-5532)
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信号转导级联，一种细胞存活、生长和代谢的关键介质，在人癌症中频繁地变更。PIK3CA(编码PI3Kα-催化亚单位的基因)中的活化突变发生于约30％的乳腺癌中。这些突变导致所述酶的组成性活性，并且是致癌的。官腔乳腺上皮中突变型PIK3CA H1047R的表达诱发表达管状上皮和基底标志物并且对雌激素受体呈阳性的异质性肿瘤。PIK3CAH1047R癌基因靶向多能祖细胞且概述了具有PIK3CA H1047R的人乳腺癌的特征(Meyer et al(2011).Cancer Res；71(13):4344–51)。PI3K的超活化可作为PIK3CA(编码PI3K的p110α亚单位的基因)中体细胞突变的结果发生。HER2癌基因在25％的全部乳腺癌中扩增，并且这些肿瘤中的一些也具有PIK3CA突变。PI3K可促进转化并赋予对HER2-指向疗法的抗性。引入MCF10A人乳腺上皮细胞的PI3K突变E545K和H1047R向MCF10A/HER2细胞赋予功能的获得，所述乳腺上皮细胞还过表达HER2。在培养物中，表达芳香化酶的MCF7细胞将雄烯二酮转化为雌激素。H1047R PI3K而不是E545K PI3K的表达显著地上调HER3/HER4配体神经生长因子(HRG)(Chakrabarty et al(2010)Oncogene 29(37):5193-5203)。
GDC-0032单药体外活性
通过以下方法测量GDC-0032作为单药的细胞毒性活性或抑制细胞活性：在细胞培养基质中创建增殖的哺乳动物肿瘤细胞系，添加测试化合物，培养这些细胞约6小时至约5天；且测量细胞活力(实施例3)。基于细胞的体外分析用于测量活力，即增殖(IC50)、细胞毒性(EC50)和凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。
通过实施例3的细胞增殖分析发光细胞活力分析，购自Promega Corp.,Madison,WI)测量GDC-0032的体外效力。所述均质分析方法基于Coleoptera荧光素酶的重组表达(US 5583024；US 5674713；US 5700670)并基于存在的ATP的定量(代谢活性细胞的指示剂)测定培养物中活力细胞的数目(Crouch et al(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6602677)。分析在96或384孔板中进行，使得它能够自动化高通量筛选(HTS)(Cree et al(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。所述均质分析过程包括直接向培养于补充有血清的基质中的细胞添加单一试剂(试剂)。无需洗涤细胞，除去基质和多次移液步骤。在添加试剂并混合后，在384孔板中，在10分钟内，所述系统可检测最低15细胞/孔。
均质的“加样-混合-检测”形式使得细胞裂解和产生的发光信号与存在的ATP量成正比。ATP量直接与培养物中存在的细胞数量成正比。分析产生一种由荧光素酶反应产生的“辉光型”的发光信号，半衰期一般大于5小时，取决于细胞类型和所用的基质。活力细胞以相对发光单位(RLU)反映。底物甲虫荧光素被重组萤火虫荧光素酶氧化脱羧，同时伴有ATP向AMP的转化并产生光子。延长的半衰期不需要使用试剂进样器，并可灵活地进行连续的或批量模式的多孔板处理。所述细胞增殖分析可使用多种多孔板，例如96或384孔板。数据可通过发光计或CCD照相机成像装置记录。发光输出量以相对光单位(RLU)表示，并随时间测量。
通过分析(实施例3)测量GDC-0032和GDC-0941抗图1-4和表2中的肿瘤细胞系的抗增殖作用进行比较。为各试验确立EC50值。体外细胞效力活性的范围为约100nM至约10μM。
表2细胞增殖分析中GDC-0032单药体外活性
表2显示了GDC-0032作为单药活性在细胞增殖中在抗PIK3CA和HER2扩增的细胞系的体外分析中的显著效力。
图1两图显示GDC-0032和GDC-0941(4-(2-(1H-吲唑-4-基)-6-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)吗啉)在抗PIK3CA野生型(WT)和突变型细胞系(包括具有H1047R突变的HCC-1954)的细胞增殖分析中的有效性(EC50μmol)。图1的上图显示相比于泛抑制剂GDC-0941(下图)，GDC-0032具有更宽的抗PIK3CA突变型细胞系治疗窗。图2两图显示GDC-0032和GDC-0941在抗PIK3CA野生型(WT)、PIK3CA突变型、表达HER2的和PIK3CA突变型/表达HER2的细胞系的细胞增殖分析中的有效性(EC50μmol)。图1和图2显示相比于GDC-0941，GDC-0032抗PIK3CA突变型细胞和HER2+乳腺癌细胞更有效力。具有HER2扩增的癌细胞系比那些无HER2扩增的细胞系对GDC-0032敏感约44倍，相较于对GDC-0941敏感9倍。
图2两图显示GDC-0032和GDC-0941在抗PIK3CA野生型(WT)、PIK3CA突变型、表达HER2的和PIK3CA突变型/表达HER2的细胞系的细胞增殖分析中的有效性(EC50μmol)。每个点代表一种不同的细胞系。
图3三图显示GDC-0032抗以下细胞系的有效性(EC50μmol)：(3a,上图)螺旋状和激酶结构域突变型细胞系；(3b,中图)PI3K通路野生型、PIK3CA突变型、PTEN缺失和PTEN/PIK3CA细胞系；(3c,下图)PI3K通路野生型、PIK3CA突变型、Ras突变型和Ras/PIK3CA突变型细胞系。所述结果显示当PIK3CA突变型肿瘤具有Ras共突变或PTEN丢失时，GDC-0032有效性较差。
图4a显示GDC-0032在SW48等基因细胞系情况中的效力。SW48亲代细胞和具有常见PI3K热点突变E545K或H1047R的敲入突变型亚克隆获自Horizon Discovery，并使用4天CellTiter-Glo(Promega)分析测定这些细胞系中的GDC-0032EC50活力值。三种细胞亚型的活力EC50值为亲代0.022μM、E545K 0.005μM和H1047R 0.008μM。总之，具有PI3K突变的等基因细胞系表明对GDC-0032的敏感性增加。
图4b显示SW48等基因细胞(亲代和PI3K突变型敲入突变型E545K和H1047R)给药18小时后收集的细胞裂解物的凝胶电泳的放射自显影图。GDC-0032在非常低的化合物浓度诱导具有PI3K突变的细胞凋亡。类似的作用可在自MCF10乳腺细胞系和HCC-1954(PI3K H1047R突变型乳腺癌细胞系)获得的PI3K突变型等基因细胞中观测到。
GDC-0032和化疗组合的体外活性
通过以下方法测量GDC-0032和示例性化疗剂的组合的细胞毒性活性或抑制细胞活性：在细胞培养基质中创建增殖的哺乳动物肿瘤细胞系，添加测试化合物，培养这些细胞约6小时至约5天；且测量细胞活力(实施例3)。基于细胞的体外分析用于测量活力，即增殖(IC50)、细胞毒性(EC50)和凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。
通过实施例3的细胞增殖分析(发光细胞活力分析，购自Promega Corp.,Madison,WI)测量GDC-0032与化疗剂的组合的体外效力。所述均质分析方法基于Coleoptera荧光素酶的重组表达(US 5583024；US5674713；US 5700670)并基于存在的ATP的定量(代谢活性细胞的指示剂)测定培养物中活力细胞的数目(Crouch et al(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US6602677)。分析在96或384孔板中进行，使得它能够自动化高通量筛选(HTS)(Cree et al(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。所述均质分析过程包括直接向培养于补充有血清的基质中的细胞添加单一试剂(试剂)。无需洗涤细胞，除去基质和多次移液步骤。在添加试剂并混合后，在384孔板中，在10分钟内，所述系统可检测最低15细胞/孔。
通过分析(实施例3)测量GDC-0032和化疗剂的组合抗图5-12中的肿瘤细胞系的抗增殖作用。为所测试的化合物和组合确立EC50值。体外细胞效力活性的范围为约100nM至约10μM。
将单独测量的GDC-0032和化疗剂抗特定细胞的EC50值与组合EC50值相比。通过Chou和Talalay方法(Chou,T.and Talalay,P.(1984)Adv.Enzyme Regul.22:27-55)计算联合指数(CI)分数。CI低于约0.7指示协同。CI在0.8～1.2指示相加作用。CI大于1.2指示拮抗作用。根据Chou和Talalay评价协同作用的强度。图4-6中的某些治疗组合在以下肿瘤类型细胞系的体外细胞增殖分析中显示令人惊讶且预料不到的协同作用性质，所述细胞系包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤细胞系。其它组合未显示协同作用；且仅显示加成作用或拮抗作用。某些组合对一种或多种肿瘤类型是协同作用，但对其它类型不是。体外细胞增殖分析中所表明协同作用为预期在治疗人患者癌症中有相应的协同作用提供了基础。
图5a显示GDC-0032、紫杉醇(PTX)以及GDC-0032和紫杉醇的组合对具有H1047R和D350N突变的乳腺癌细胞系MFM223的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Glo,Promega)通过剂量调整GDC-0032、紫杉醇(PTX)以及GDC-0032和紫杉醇的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。当两药联合时，观测到细胞活力抑制显著地改善。
图5b显示GDC-0032+紫杉醇和GDC-0941+紫杉醇组合抗基底型和管状上皮型的PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。PIK3CA突变包括E545K和H1047R。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。所述结果显示两种组合抗PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系的活性具有类似地趋势。
图6a显示GDC-0032、艾日布林以及GDC-0032和艾日布林的组合对具有E542K PIK3CA突变和PTEN蛋白质表达丢失的基底亚型乳腺癌细胞系Cal51的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Glo,Promega)通过剂量调整GDC-0032、艾日布林以及GDC-0032和艾日布林的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。当两药联用时，观测到细胞活力抑制的显著改善。
图6b显示GDC-0032+艾日布林、GDC0032+多西他赛、GDC-0941+艾日布林和GDC-0941+多西他赛组合对抗基底型和管状上皮型的PIK3CA野生型和E545K、H1047R、PTEN阴性以及PTEN阴性/E542K突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。在大多数被评价的细胞系中，观测到这些组合的协同作用。
图7显示GDC-0032+艾日布林和GDC-0941+艾日布林组合对抗基底型和管状上皮型的PIK3CA野生型和E545K、H1047R PIK3CA突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种癌细胞系。在大多数被评价的细胞系中，观测到这些组合的协同作用。
表3细胞增殖分析中GDC-0032+化疗第二药物组合的体外活性
表3显示观测到GDC-0032与若干种不同的化疗剂和靶向药物的组合的协同作用。
与GDC-0941(CI 0.39)相比，GDC-0032与曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)的组合对具有E545K PIK3CA突变的MCF7.1-neo/HER2乳腺癌细胞显示出更优越的协同作用(CI 0.25)。
图8a显示GDC-0032、多西他赛以及GDC-0032+多西他赛的组合对具有E542K突变和基底亚型PTEN蛋白质表达丢失的乳腺癌细胞系Cal51的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Promega)通过剂量调整GDC-0032、多西他赛以及GDC-0032+多西他赛的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。当两药联用时，观测到细胞活力抑制的显著改善。
图8b显示GDC-0032+多西他赛和GDC-0941+多西他赛组合对抗PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种不同的细胞系。在大多数被评价的细胞系中，观测到所述组合的协同作用。
图9a显示GDC-0032、曲妥珠单抗以及GDC-0032+曲妥珠单抗的组合对具有高HER2表达的乳腺癌细胞系SKBR3的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-TiterPromega)通过剂量调整GDC-0032、曲妥珠单抗以及GDC-0032+曲妥珠单抗的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。当两药联用时，观测到细胞活力抑制的显著改善。
图9b显示GDC-0032+多西他赛和GDC-0941+多西他赛组合对抗HER2+PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系(包括E545K和H1047R)的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种不同的细胞系。在大多数被评价的细胞系中，观测到所述组合的协同作用。
图10a显示曲妥珠单抗、GDC-0032、紫杉醇和GDC-0032+曲妥珠单抗、紫杉醇+曲妥珠单抗、GDC-0032+紫杉醇的组合，以及GDC-0032+紫杉醇+曲妥珠单抗的三联组合对具有H1047R和D350N PIK3CA突变的乳腺癌细胞系KPL4的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Glo,Promega)通过剂量调整改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。紫杉醇+GDC-0032的组合降低细胞活力。所述组合中的曲妥珠单抗未对所述细胞系的细胞活力起作用。
图10b显示曲妥珠单抗、GDC-0032、紫杉醇和GDC-0032+曲妥珠单抗、紫杉醇+曲妥珠单抗、GDC-0032+紫杉醇以及GDC-0032+紫杉醇+曲妥珠单抗的组合对具有高HER2表达的乳腺癌细胞系SKBR3的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Glo,Promega)通过剂量调整改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。观测到两联或三联组合使得所述细胞系中细胞活力降低的显著改善。
图11a显示5-FU、GDC-0032以及5-FU和GDC-0032的组合对乳腺癌细胞系HCC1428的作用。体外细胞存活和增殖分析(Cell-Titer Glo,Promega)通过剂量调整5-FU、GDC-0032以及5-FU+GDC-0032的组合改变抑制剂浓度测量活力细胞(RLU＝相对光单位)。当两药联用于所述细胞系时，观测到细胞活力抑制的显著改善。
图11b显示GDC-0032+5-FU和GDC-0941+5-FU组合对抗HER2+PIK3CA野生型和突变型乳腺癌细胞系(包括基底亚型和管状上皮亚型的E545K和H1047R)的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种不同的细胞系。在若干种被评价的细胞系中观测到所述组合的协同作用。
图12a显示GDC-0032+常规化疗剂(包括5-FU、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛和艾日布林)的组合对抗癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种不同的细胞系。在大多数被评价的细胞系和化疗剂组合中观测到指示协同作用的CI值。
图12b显示GDC-0032+靶向化疗剂(包括曲妥珠单抗()、曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)和MEKi(GDC-0973))的组合对抗癌细胞系的联合指数(CI)。低于约0.7的CI值指示协同。每个点代表一种不同的细胞系。在大多数被评价的细胞系中观测到靶向药物的协同作用。
内分泌疗法如来曲唑或氟维司群是转移性激素受体阳性(HR+)乳腺癌的常用治疗选择，但患者最终复发。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)调节乳腺肿瘤细胞生长、迁移和存活。HR+乳腺癌中，PI3K的α同工型频繁地突变和活化，且与对内分泌疗法的耐药性有关。因此，PI3K抑制剂与内分泌疗法的组合是有吸引力的。GDC-0032是一种口服可生物利用的、有效的和选择性的I类PI3Kα、δ和γ同工型抑制剂，且对PI3Kβ同工型的抑制低于PI3Kα同工型30倍。临床前数据显示GDC-0032对PI3Kα同工型(PIK3CA)突变型和HER2-扩增的癌细胞系具有升高的活性。已进行单药和组合研究以测定GDC-0032是否增强内分泌疗法在人乳腺癌模型的抗肿瘤活性。图37显示来曲唑和PI3K抑制剂GDC-0032在表达芳香化酶的MCF7细胞中的活性。在含雌激素前体雄烯二酮的培养基中生长的MCF7-ARO细胞中，对内分泌疗法的敏感性增加。在培养物中，表达芳香化酶的MCF7细胞将雄烯二酮转化为雌激素。使用芳香化酶基因转染MCF7细胞(雌激素受体阳性(ER+)，PI3KαE545K突变型)并选择能够在培养物中将雄烯二酮转化为雌激素的稳定的克隆(MCF7-ARO)。当在雄烯二酮存在下生长时，MCF7-ARO细胞更依赖于雌激素生长。在含雌激素前体的培养基中生长的MCF7-ARO细胞中，对内分泌疗法的敏感性增加。在这些条件下，使用GDC-0032与内分泌疗法的组合处理细胞，并分析细胞活力、PI3K通路和ER通路标志物的调节和细胞凋亡诱导。GDC-0032与内分泌疗法的组合降低MCF7-ARO细胞的细胞活力并增加相对于任一单药的细胞凋亡。GDC-0032和来曲唑的组合增加响应细胞的细胞凋亡，因为来曲唑降低mTOR处的PI3K通路信号转导且来曲唑上调pAKT和HER2，如同氟维司群。
图38通过细胞活力抑制、BLISS和HSA的定量评分显示GDC-0032与来曲唑在体外联用良好。图39显示观测到PI3K和ER通路之间的交叉串扰(cross-talk)，其显示GDC-0032和来曲唑组合的作用机理。使用来曲唑处理细胞24小时增加HER2和pAkt，但降低pmTOR和pp70S6K。图40显示内分泌耐药的细胞具有提高的PI3K通路转导且对GDC-0032敏感。通过历时约4个月的来曲唑剂量攀升获得内分泌耐药的MCF7-ARO细胞。所述细胞对伊西美坦、氟维司群、他莫昔芬和来曲唑耐药。数据为临床评价GDC-0032与内分泌疗法组合用于HR+乳腺癌治疗提供了理论基础。
GDC-0032单药在体内肿瘤异种移植物中的活性
通过在免疫受损的小鼠中移植呈现乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤和结直肠癌的肿瘤细胞的异种移植物并使用GDC-0032处理携带肿瘤的动物来测量GDC-0032的体内有效性。结果取决于细胞系、肿瘤细胞中某些突变的存在或缺乏、GDC-0032的剂量方案和其它因素。使用一种或多种药物或对照(媒介物)处理受试小鼠并监测若干周或更长时间以测量肿瘤体积倍增前的时间、细胞死亡对数和肿瘤抑制(实施例4)。图13-22各图显示在根据实施例4的方案使用GDC-0032处理携带肿瘤的小鼠后，肿瘤体积随时间的变化。
图13显示根据表4的方案在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、GDC-0941和GDC-0032的、携带有具有PIK3CA突变(H1047R)的HCC1954.x1乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，21天内的适体肿瘤体积变化。每天一次给药GDC-0032观测到肿瘤生长抑制(TGI)的剂量依赖性增加，并且在给药末期于第21天达到138％的最大TGI。在12.5和25mg/kg剂量的GDC-0032下观测到肿瘤消退。术语μL是指微升。
表4在具有H1047R突变的HCC1954.x1乳腺癌异种移植物中每天一次给药(QD)GDC-0032的单药活性。
括号中的*值表示95％置信区间；TGI(肿瘤生长抑制)；MCT(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温-80)
图14显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有具有PI3Kα(H1047R)突变的KPL4乳腺肿瘤异种移植物的免疫受损的(SCID浅褐色)小鼠的队列中，21天的适体肿瘤体积变化。在KPL4异种移植物模型中，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低，而与媒介物对照处理的小鼠相比，在治疗末期于第21天，观测到25mg/kg GDC-0032处理的小鼠肿瘤消退增加。
图15显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有具有PI3Kα突变(E545K)的MCF7-neo/HER2乳腺肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，20天的适体肿瘤体积变化。在MCF7-neo/HER2异种移植物模型中，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低，而与媒介物对照处理的小鼠相比，观测到22.5mg/kg GDC-0032处理的小鼠在处理10天后肿瘤消退增加。
图16显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有具有PI3Kα突变(E545K)的MCF-7乳腺肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，21天的适体肿瘤体积变化。在MCF7异种移植物模型中，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低，而与媒介物对照相比，观测到所有受测试剂量的GDC-0032肿瘤消退增加。
图17显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有PI3Kα突变(H1047R)的SKOV3卵巢肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，21天的适体肿瘤体积变化。在SKOV3异种移植物模型中，在21天治疗期间，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低。
图18显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有具有PI3Kα突变(H1047R)的HM-7结直肠癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，7天的适体肿瘤体积变化。在HM-7异种移植物模型中，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低，而与媒介物对照处理的小鼠相比，在治疗末期于第7天，观测到25mg/kg GDC-0032处理的小鼠肿瘤消退增加。
图19显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有PTEN阴性(缺失)的PC3前列腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，14天的适体肿瘤体积变化。在每天一次给药GDC-003214天后GDC-0032<12.5mg/kg的剂量并不有效。然而，在最高测试剂量(25mg/kg)观测到PC3异种移植物模型的抗肿瘤应答且表征为肿瘤抑制。
图20显示在通过PO(口服)或每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有PTEN阴性(缺失)的22RV1前列腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，24天的适体肿瘤体积变化。在22RV1异种移植物模型中，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低。
图21显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、GDC-0941和GDC-0032的、携带有PTEN缺失且具有B-Raf扩增的537MEL黑素瘤肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，21天的适体肿瘤体积变化。在22RV1异种移植物模型中，每天一次给药GDC-0032实现肿瘤体积的剂量依赖性降低。
图22显示在通过PO(口服)且每天一次(QD)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)和GDC-0032的、携带有具有EGFR突变(T790M)、PI3K突变(G118D)和p53突变的NCI-H1975非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)队列中，24天的适体肿瘤体积变化。与媒介物对照控制处理的小鼠相比，在使用GDC-0032处理的24天期间，观测到肿瘤体积的剂量依赖性降低。
GDC-0032和化疗组合在体内肿瘤异种移植物中的活性
通过将癌细胞的同种异体移植物或异种移植物移植至啮齿动物中并使用药物组合处理携带肿瘤的动物体内测量GDC-0032与多种化疗剂(包括小分子和大分子靶向药物)的组合的有效性。结果取决于细胞系、肿瘤细胞中某些突变的存在或缺乏、GDC-0032和化疗剂的给药顺序、剂量方案和其它因素。使用一种或多种药物或对照(媒介物)处理受试小鼠并监测若干周或更长时间以测量肿瘤体积倍增前的时间、细胞死亡对数和肿瘤抑制(实施例4)。图23-36各图显示在根据实施例4的方案使用GDC-0032和多种化疗剂的组合处理携带肿瘤的小鼠后，肿瘤体积随时间的变化。
图23显示根据表5的方案给予媒介物、多西他赛(DTX)、GDC-0941和GDC-0032以及多西他赛+GDC-0941或多西他赛+GDC-0032的组合的、携带有MCF-7neo/HER2乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，51天内的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0941和GDC-0032，持续21天。静脉且每周一次(QW)给予多西他赛，持续3周。在于第21天结束给药后，监测小鼠的肿瘤再生长，持续额外的30天。当与单独的每一单药相比时，GDC-0032的组合通过增加了肿瘤的消退增强了DTX的抗肿瘤活性。就％TGI而言，最高测试剂量的GDC-0032(20mg/kg)和DTX的组合与GDC-0941和DTX的组合是相当的(表5)。
表5在MCF-7neo/HER2乳腺癌异种移植物中，每天一次(QD)或每周一次(QW)剂量方案，口服(PO)途径给药GDC-0941/GDC-0032与多西他赛(DTX)的组合，并在第21天测量肿瘤生长抑制(TGI)。
图24显示给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、多西他赛(DTX)、GDC-0032以及GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有PTEN阴性(缺失)的MX-1三阴性(ER–(雌激素受体)、PR–(孕酮受体)、neu/HER2–(HER2受体)乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠的队列中，25天内的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，持续21天。静脉且每周一次(QW)给予DTX，2.5、5.0和7.5mg/kg药物，持续3周。在于第21天结束给药后，监测小鼠的肿瘤再生长，持续额外的4天。GDC-0032在所有测试剂量增强DTX的抗肿瘤活性。当与单独的每一单药相比时，在5和10mg/kg GDC-0032+7.5mg/kg DTX处观测到最大组合活性。
图25显示给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、多西他赛(DTX)、GDC-0032以及GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有具有PI3K突变(H1047R)的SKOV3卵巢癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠的队列中，25天内的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，持续21天。静脉且每周一次(QW)给予DTX，7.5mg/kg药物，持续3周。在于第21天结束给药后，监测小鼠的肿瘤再生长，持续额外的4天。在所有测试的GDC-0032剂量，GDC-0032增强DTX的抗肿瘤活性。当与单独的每一单药相比时，在15mg/kg GDC-0032+7.5mg/kg DTX处观测到最大组合活性。
图26显示给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、紫杉醇、GDC-0032以及GDC-0032+紫杉醇的组合的、携带有具有PI3K突变(E545K)的MCF-7乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，40+天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，持续21天。静脉且每周一次(QW)给予紫杉醇，10mg/kg药物，持续3周。当与单独的每一单药相比时，7.5和12.5mg/kg GDC-0032增强紫杉醇的抗肿瘤活性。
图27显示在通过PO(口服)给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、曲妥珠单抗()、GDC-0032以及曲妥珠单抗+GDC-0032的组合的、携带有具有PI3K突变(K111N)的BT474、HER2+乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠的队列中，60天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，5、10和20mg/kg，持续21天。静脉(IV)且每周一次(qW)给予曲妥珠单抗，3mg/kg。在IV给药前给予6mg/kg的负荷剂量的曲妥珠单抗。GDC-0032以剂量依赖方式增强曲妥珠单抗的有效性。
图28显示在通过PO(口服)给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、曲妥珠单抗()、曲妥珠单抗emtansine(TDM-1)、GDC-0032、曲妥珠单抗+GDC-0032的组合以及T-DM1+GDC-0032的组合的、携带有通过小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)工程改造以过表达HER2的Founder 5(Fo5)HER2+乳腺肿瘤同种异体移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，10+天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，25mg/kg药物，持续15天。静脉(IV)且每周一次(qW)给予曲妥珠单抗，30mg/kg，且IV给药T-DM1一次。与单独的每一药物相比，GDC-0032的组合增强曲妥珠单抗和T-DM1的抗肿瘤活性并诱导肿瘤抑制。未观测到GDC-0032+曲妥珠单抗vs.GDC-0032+T-DM1组合活性的不同。
图29显示在通过PO(口服)给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、曲妥珠单抗()、多西他赛、GDC-0032、曲妥珠单抗+多西他赛的组合以及曲妥珠单抗、多西他赛和GDC-0032的三联组合的、携带有BT474,HER2+乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，21天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，5、10和15mg/kg，持续21天。静脉(IV)且每周一次(qW)给予曲妥珠单抗，3mg/kg。静脉(IV)且每周一次(QW)给予多西他赛，7.5mg/kg药物，持续3周。与曲妥珠单抗和多西他赛单一疗法相比，两种药物的组合均增加肿瘤消退。向多西他赛和曲妥珠单抗添加所有测试剂量的GDC-0032在治疗期间进一步增加肿瘤消退。
图30显示在通过PO(口服)给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、氟维司群、GDC-0032以及氟维司群和GDC-0032的组合的、携带有具有PI3K突变(E545K)的MCF-7乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，40+天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(qd)给予GDC-0032，5、10和15mg/kg，持续21天。皮下每周一次(qW)给予氟维司群，5mg药物，持续3周。与单一疗法相比，5和10mg/kg GDC-0032在治疗期间和给药结束后的额外20天内增强氟维司群的抗肿瘤活性。与GDC-0032单药活性相比，15mg/kg GDC-0032和氟维司群的组合在治疗期后得到持续的肿瘤生长抑制。
图31显示在通过PO(口服)给予媒介物(MCT；0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、他莫昔芬、GDC-0032以及他莫昔芬和GDC-0032的组合的、携带有具有PI3K突变(E545K)的MCF-7neo/HER2乳腺癌肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，20+天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，5、10和15mg/kg，持续21天。通过将5mg丸剂植入皮下向小鼠给予他莫昔芬。与单一疗法相比，20mg/kg GDC-0032增强他莫昔芬的抗肿瘤活性并导致肿瘤消退。
图32显示在通过PO(口服)给予媒介物(0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80)、GDC-0973、GDC-0032以及GDC-0973和GDC-0032的组合的、携带有A549突变型非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植物的免疫受损的小鼠(裸鼠)的队列中，40天的平均肿瘤体积变化。分别每天一次给予7.5和5.0mg/kgGDC-0032和GDC-0973。GDC-0032和GDC-0973的组合导致治疗期肿瘤消退增加。两种药物的组合作用均是持久的，在治疗结束后额外的19天观测到持续的抗肿瘤活性。
图33显示在通过给予媒介物、地塞米松、GDC-0980、GDC-0032、地塞米松+GDC-0980的组合以及地塞米松+GDC-0032的组合的、携带有MM.1s多发性骨髓瘤肿瘤异种移植物的免疫受损的(SCID浅褐色)小鼠的队列中，15+天的平均肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，1和4mg/kg药物。口服且每天一次给予GDC-0980，1mg/kg药物。与单一疗法相比，1和4mg/kg药物GDC-0032的组合增强地塞米松(2.5mg/kg)的抗肿瘤活性。GDC-0032和地塞米松组合的抗肿瘤作用与GDC-0980和地塞米松的抗肿瘤作用是相当的。
图34显示在通过给予卡培他滨()、GDC-0032以及卡培他滨和GDC-0032的组合的、携带有MCF-7neo/HER2乳腺癌肿瘤异种移植物的10只小鼠的队列中，21天的平均肿瘤体积变化。
图35显示在给予媒介物、多西他赛、GDC-0032以及GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有A549(KRASG12S、PI3KM772X,N996H)NSCLC(非小细胞肺癌)异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，20天的适体肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，持续21天。静脉且每周一次(QW)给予DTX，10mg/kg药物，持续3周。在第21天给药结束后，监测小鼠肿瘤再生长额外的4天。在所有测试的GDC-0032的剂量下，GDC-0032增强DTX的抗肿瘤活性。当与单独的每一药物相比时，15mg/kg GDC-0032+10mg/kg of DTX观测到最大组合活性。
图36显示在给予媒介物、多西他赛、GDC-0032以及GDC-0032+多西他赛的组合的、携带有H520(p53mut)NSCLC(非小细胞肺癌)异种移植物的8-10只免疫受损的小鼠队列中，28天的适体肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，持续21天。静脉且每周一次(QW)给予DTX，10mg/kg药物，持续3周。在第21天给药结束后，监测小鼠肿瘤再生长额外的4天。在所有测试的GDC-0032的剂量下，GDC-0032增强DTX的抗肿瘤活性。当与单独的每一药物相比时，15mg/kg GDC-0032+10mg/kg DTX观测到最大组合活性。
图41显示当GDC-0032与抗雌激素药物氟维司群和他莫昔芬组合时，增加体内抗肿瘤活性。在单独给药氟维司群和GDC-0032的MCF-7/ER+/HER2-小鼠、组合给药氟维司群和GDC-0032的MCF-7/ER+/HER2-小鼠、单独给药他莫昔芬和GDC-0032的MCF-7/ER+/HER2+小鼠以及组合给药他莫昔芬和GDC-0032的MCF-7/ER+/HER2+小鼠中，在第21天测量肿瘤生长抑制(％TGI)，为媒介物对照的百分数。与单药相比，GDC-0032与雌激素受体拮抗剂氟维司群和他莫昔芬的组合增加TGI，表明协同作用。
图42显示在给予媒介物、紫杉醇、GDC-0032以及GDC-0032+紫杉醇的组合的、携带有MCF-7(PI3Kmut,ER+)乳腺异种移植物的12只免疫受损的小鼠队列中，23天的适体肿瘤体积变化。口服、每天(QD，在紫杉醇给药的前一天给药休假)给药持续21天或每4天(Q4D)给药持续5个周期给予GDC-0032。以7.5mg/kg药物每4天静脉给予紫杉醇，持续5个周期。两种GDC-0032(QD和Q4D)方案均增强所述组合的抗肿瘤活性。当与每种药物相比时，40mg/kg GDC-0032+紫杉醇观测到最大组合活性。
图43显示在给予媒介物、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、GDC-0032以及GDC-0032+曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的三联组合的、携带有KPL-4(PI3Kmut,Her2+)乳腺异种移植物的8-10只免疫受损小鼠队列中，21天的适体肿瘤体积变化。口服(PO)且每天一次(QD)给予GDC-0032，持续21天。以3mg/kg药物每周一次腹膜内给予曲妥珠单抗，持续3周，以2.5mg/kg药物每周一次腹膜内给予帕妥珠单抗，持续3周。在所有测试的GDC-0032剂量下，GDC-0032增强所述组合的抗肿瘤活性。与单独的每一药物或无GDC-0032的组合相比，1.56-6.25mg/kg GDC-0032+曲妥珠单抗和帕妥珠单抗观测到最大组合活性。
图44显示在给予媒介物、紫杉醇、卡铂、B20-4.1.1抗小鼠VEGF抗体(Bagri et al(2010)Clin.Cancer Res.16:3887；Shrimali et al(2010)Cancer Res.70(15):6171-6180)、GDC-0032以及GDC-0032+紫杉醇(PTX)、卡铂+/-B20-4.1.1抗-VEGF的三联和四联组合的、携带有H292(KRASmut)NSCLC(非小细胞肺癌)异种移植物的10只免疫受损小鼠队列中，22天的适体肿瘤体积变化。B20-4.1.1是贝伐单抗(Genentech Inc.)的替代物(Liang et al(2006)Jour.Biol.Chem.281:951-961)。口服(PO)且每天(QD)给予GDC-0032，持续21天。在第1天以10mg/kg药物静脉给予紫杉醇，在第1天以80mg/kg药物腹膜内给予卡铂，并以5mg/kg药物每周两次腹膜内给予抗-VEGF，持续3周。在所有测试的GDC-0032的剂量下，GDC-0032增强所述组合的抗肿瘤活性。与单独的每一药物或无GDC-0032的组合相比，5mg/kgGDC-0032+紫杉醇(PTX)、卡铂和抗-VEGF观测到最大组合活性。
药物组合物和配制剂
本发明的药物组合物或配制剂包括GDC-0032、化疗剂和一种或多种药学可接受载体、助流剂、稀释剂、或赋形剂的组合。
本发明的GDC-0032和化疗剂可以未被药学上可接受的溶剂如水、乙醇等溶剂化和被这些溶剂溶剂化的形式存在，且本发明意欲包括溶剂化和非溶剂化形式两者。
本发明的化合物也可以不同的互变异构形式存在，且所有此类形式均包括在本发明的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”指的是可经由低能障互相转化的具有不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子移变互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移进行的互相转化，诸如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组进行的互相转化。
药物组合物涵盖散装组合物(bulk compostion)和个体剂量单位二者，其包含超过一种(例如两种)药学活性剂(包括GDC-0032和选自本文所述的其它药物列表中的化疗剂)以及任何药学无活性赋形剂、稀释剂、载体、或助流剂。散装组合物和每个单独的剂量单位(individual dosage unit)可含有固定量的上述药学活性剂。散装组合物指尚未形成单个剂量单位的物质。一种例示性的剂量单位是口服剂量单位，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、等等。类似地，通过给予药物组合物治疗患者的方法也意图涵盖给予散装组合物和单个剂量单位。
药物组合物还涵盖同位素标记的本发明化合物，它们与本文所述化合物相同，只是一个或多个原子被具有与自然界通常找到的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子替换。规定的任何特定原子或元素的所有同位素涵盖在本发明化合物及其用途的范围内。能掺入本发明化合物的例示性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯和碘的同位素，诸如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、32P、33P、35S、18F、36Cl、123I和125I。某些同位素标记的本发明化合物(例如那些用3H和14C标记的)在化合物和/或底物组织分布测定法中是有用的。氚(3H)和碳-14(14C)同位素因它们易于制备和可检测性而有用。另外，用更重的同位素诸如氘(2H)替代可提供某些治疗优势，其源自更大的代谢稳定性(例如体内半衰期延长或剂量需求降低)，并因此在有些情况中是优选的。发射正电子的同位素，诸如15O、13N、11C和18F，可用于正电子发射断层摄影术(PET)研究以检查底物受体占据。同位素标记的本发明化合物一般能通过遵循与下文实施例中公开的规程类似的规程，通过用同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂来制备。
根据标准制药规范配制的GDC-0032和化疗剂用于治疗性治疗(包括预防性治疗)哺乳动物(包括人)的过度增生性病症的治疗性组合中。本发明提供药物组合物，其包含GDC-0032和一种或多种药学上可接受的载体、助流剂、稀释剂、添加剂或赋形剂。
合适的载体、稀释剂、添加剂、和赋形剂是本领域熟练技术人员公知的，而且包括下述物质，诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可膨胀聚合物、亲水性或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等等。所使用的具体载体、稀释剂或赋形剂会取决于应用本发明化合物的手段和目的。一般基于本领域技术人员公认对哺乳动物施用安全(GRAS)的溶剂来选择溶剂。一般而言，安全的溶剂是无毒的水性溶剂，诸如水和其它在水中可溶或易混合的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG 400，PEG 300)、二甲亚砜(DMSO)、cremophor(例如CREMOPHORBASF)及其混合物。配制剂还可以包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、助流剂、操作助剂、着色剂、增甜剂、芳香剂、矫味剂和其它已知添加剂以提供药物(即本发明的化合物或其药物组合物)有效的(elegant)呈现或帮助制造药学产品(即药物)。
可以施用常规溶解和混合规程来制备配制剂。例如，在存在一种或多种上文所述赋形剂下在合适的溶剂中溶解散装药物物质(即本发明的化合物或化合物的稳定化形式(例如与环糊精衍生物或其它已知的络合剂复合)。本发明的化合物通常配制成药学剂量形式，以提供可容易控制剂量的药物和使得患者顺从处方方案。
可以以多种方式包装供应用的药物组合物(或配制剂)，这取决于用于施用药物的方法。一般而言，分发的物品包括容器，其中沉积有适宜形式的药物配制剂。合适的容器是本领域技术人员公知的，而且包括诸如瓶(塑料的和玻璃的)、囊、安瓿、塑料袋、金属筒、等等材料。容器还可以包括防干扰装置以防止不慎接触到包装的内容物。另外，容器上可贴有描述容器中所含内容物的标签。标签还可以包括适宜的警告。
可以制备本发明的化合物的药物配制剂，供各种路径和类型的施用(给予)。例如，任选可以以冻干配制剂、碾碎的粉末、或水溶液的形式将具有期望纯度的GDC-0032与药学可接受稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences(1995)18th edition，Mack Publ.Co.，Easton，PA)。可以通过于环境温度与适宜的pH，及于期望的纯度，与生理学可接受载体(即在所采用的剂量和浓度对接受者无毒的载体)混合来进行配制。配制剂的pH主要取决于具体用途和化合物的浓度，但是范围可以是约3至约8。
药物配制剂优选是无菌的。具体而言，用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这种无菌易于通过无菌滤膜过滤来实现。
药物配制剂通常能作为固体组合物、冻干配制剂或作为水溶液来贮存。
本发明的药物配制剂会以与优良医学实践一致的方式即量、浓度、时间表、疗程、媒介和施用路径来进行剂量给药和施用。在此语境中要考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间表、和医学从业人员知道的其它因素。待施用的化合物的“治疗有效量”会由此类考虑来决定，而且是预防、改善、或治疗凝血因子介导的病症所必需的最小量。所述量优选低于对宿主有毒性或使宿主显著更易于出血的量。
每剂口服或胃肠外施用的GDC-0032的初始药学有效量会在约0.01-1000mg/kg的范围内，即每天约0.1至20mg/kg患者体重，所使用的化合物的典型初始范围为0.3-15mg/kg/天。待施用的GDC-0032的剂量和化疗剂的剂量各自的范围可以为约1mg至约1000mg/单位剂量形式或约10mg至约100mg/单位剂量形式。GDC-0032化合物和化疗剂的剂量可以以按重量计约1:50至约50:1的比或以按重量计约1:10至约10:1的比施用。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类，二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、CREMOPHORPLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。活性药物组分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition，(1995)Mack Publ.Co.，Easton，PA。
可制备GDC-0032和化疗化合物的持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括固态疏水性聚合物的半透性基质，其含有GDC-0032，所述基质以成形制品形式(例如膜或微囊)存在。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯基酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的注射用微球)和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
药物配制剂包括那些适合于本文详述的施用路径的。配制剂可以方便地以单位剂量形式存在，而且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。技术和配方一般见Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Ed.(1995)MackPublishing Co.，Easton，PA。此类方法包括使活性组分与构成一种或多种辅助组分的载体联合的步骤。一般而言，通过均匀且紧密地使活性组分与液体载体或粉碎的固体载体或二者联合，然后在必要时使产物定形来制备配制剂。
适于口服给药的GDC-0032和/或化疗剂的配制剂可制备为离散单位，如丸剂、硬或软例如明胶胶囊、扁囊剂、含片、锭剂、水性或油性混悬液、可分散粉末或颗粒剂、乳剂、糖浆剂或酏剂，各自含有预定量的GDC-0032和/或化疗剂。所述量的GDC-0032和所述量的化疗剂可配制于丸剂、胶囊、溶液或混悬剂中作为组合制剂。或者，GDC-0032和化疗剂可单独配制于丸剂、胶囊、溶液或混悬液中用于交替给药。
可根据本领域用于制备药物组合物的任何已知的方法制备制剂，且此类组合物可含有一种或多种试剂，所述试剂包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，从而提供适口的制备物。压制片可通过在合适的机器中将任选混有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性或分散剂的自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒压片来制备。模制片可通过在合适的机器将被惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分模制来制备。可任选包衣或刻划所述片剂，且任选调配所述片剂以使得活性成分从其中缓释或控释。
本发明药物制剂的片剂赋形剂可包括：填充剂(或稀释剂)以增加制成所述片的粉状药物的分散体积；崩解剂以使得片剂分解成小的部分，当其被摄入时优选各别的药物颗粒并且促进药物的快速溶出和吸收；粘合剂以确保可形成具有所需的机械强度的颗粒剂和片剂并在压制成片后保持片剂完整，预防其在包装、运输和日常操作中分解成其组分粉末；助流剂以改善组成所述片剂的粉末在生产过程中的流动性；润滑剂以确保所述制片粉末在制备过程中不粘附至用于压制片剂的设备上。它们通过按压改善粉末混合物的流动并随成片从设备中射出最小化摩擦和脆碎度；与助流剂的作用类似的抗粘剂，减少在制备过程中组成所述片剂的粉末和用于弹射出片剂形状的机器之间的粘附；掺入片剂的香味使它们具有更怡人的味道或者掩盖令人讨厌的味道，而着色剂有助于鉴定和患者依从性。
含有与适于制备片剂的无毒的生理学上可接受的赋形剂混合在一起的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可为例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，诸如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可不经包衣或可通过已知的技术(包括微囊化)来包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，由此提供历时较长时间的持续作用。例如，可使用时间延迟物质，诸如单独的或与蜡在一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
为了治疗眼部或其它外部组织例如嘴部和皮肤，所述制剂优选按局部用软膏剂或乳膏剂形式来施用，其含有的活性成分(或多种活性成分)的量为例如0.075至20％w/w。当配制成软膏剂时，活性成分可与石蜡性或水可混溶性软膏基质一起使用。可选择地，活性成分可与水包油型乳膏基质一起配制成乳膏剂。
乳膏基质中的水相可包括多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，诸如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及它们的混合物。局部用制剂可按需包括促进活性成分吸收或渗透通过皮肤或其它作用区域的化合物。上述皮肤渗透促进剂的实例包括二甲基亚砜和相关类似物。
本发明乳剂中的油相可由已知的成分以已知的方式来构成，其包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂包括在一起。含有或不含有稳定剂(或多种稳定剂)的乳化剂(或多种乳化剂)一起构成乳化蜡且所述含油和脂肪的蜡包含形成乳膏剂中的油性分散相的乳化软膏基质。适用于本发明制剂的乳化剂和乳剂稳定剂包括十八烷基醇/十六烷基醇、苄醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。
本发明的药物制剂的水性混悬剂含有与适于制备水性混悬剂的赋形剂混合在一起的活性物质。上述赋形剂包括助悬剂，诸如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；和分散剂或润湿剂，诸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙氧基十六烷基醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、氧化乙烯与由脂肪酸和己糖醇酐(hexitolanhydride)衍生的偏酯(partial ester)的缩合产物(例如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate))。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂(诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂(诸如蔗糖或糖精)。
药物组合物可呈无菌注射剂诸如无菌注射用水性或油性混悬剂形式。所述混悬剂可根据本领域已知的方法使用上述那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌注射剂可为在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的溶液剂或混悬剂，诸如在丁-1,3-二醇中的溶液或制备自冻干粉末剂。可使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或混悬介质。出于所述目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸也可用于制备注射剂。
可与载体物质组合以制备单一剂量形式的活性成分的量将随所治疗的宿主和具体的给药模式而变化。例如，意在用于口服给药于人类的定时释放制剂可含有约1至1000mg活性物质及合适和适宜量的载体物质，所述载体物质可占总组合物的约5至约95％(重量:重量)。可制备药物组合物以提供可容易测量的给药量。例如，意在用于静脉内输注的水性溶液剂可含有约3至500μg活性成分/毫升溶液，从而可进行速率为约30mL/hr的合适体积的输注。
适于胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与所预期的受体的血液等渗的溶质；及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含助悬剂和增稠剂。
适于局部给药于眼部的制剂还包括滴眼剂，其中将活性成分溶于或悬浮于合适的载体(尤其是用于活性成分的含水溶剂)中。存在于上述制剂中的活性成分的浓度优选为约0.5至20％w/w，例如约0.5至10％w/w，或例如约1.5％w/w。
适于在口中局部给药的制剂包括糖锭剂，其含有处于矫味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中的活性成分；锭剂，其含有处于惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；和口腔洗剂，其包含处于合适的液态载体中的活性成分。
适于直肠给药的制剂可按含有合适基质(其包含例如可可脂或水杨酸酯)的栓剂形式存在。
适于肺内或经鼻给药的制剂具有例如范围为0.1至500微米的粒度(包括范围为0.1至500微米且增量微米数为诸如0.5、1、30、35微米等的粒度)，其通过经由鼻道快速吸入或经口吸入来给药以到达肺泡囊。合适的制剂包括活性成分的水性或油性溶液。适于气雾给药或干粉给药的制剂可根据常规方法来制备且可与其它治疗剂(诸如迄今用于治疗或预防下述障碍的化合物)一起递送。
适于阴道给药的制剂可按阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂形式存在，这些制剂除活性成分外还含有本领域已知为合适的载体。
所述制剂可包装在单位剂量容器或多剂量容器例如密封的安瓿或小瓶中且可在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，其仅需要在使用前即时加入无菌液态载体例如水以供注射。现用现配的注射溶液剂和混悬剂由上述种类的无菌粉末剂、颗粒剂和片剂来制备。优选的单位剂量制剂为含有本申请上述日剂量或单位日亚剂量或其合适分数的活性成分的那些制剂。
本发明还提供兽用组合物，因此其含有上述至少一种活性成分及兽用载体。兽用载体为可用于给药所述组合物这一目的的物质且可为固态、液态或气态物质，这些物质在兽医领域中要么是惰性的要么是可接受的且与活性成分是相容的。这些兽用组合物可通过胃肠外、口服或任何其它期望的途径来给药。
组合疗法
GDC-0032可与某些化疗剂组合用于治疗过度增生性病症，包括实体瘤或血液恶性肿瘤，以及恶化前和非新生物的或非恶性的过度增生性病症。在某些实施方案中，GDC-0032与化疗剂在单一制剂中组合，作为单一片剂、丸剂、胶囊剂或溶液用于所述组合的同时给药。在其它实施方案中，GDC-0032和化疗剂根据剂量方案或疗程以单独的制剂给药，如单独的片剂、丸剂、胶囊剂或溶液用于依序给药GDC-0032和选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。化疗剂具有抗过度增生性质或可用于治疗过度增生性病症。GDC-0032和化疗剂的组合可具有协同性质。所述药物组合制剂或给药方案的化疗剂优选具有与GDC-0032互补的活性，从而使得它们不会不利地影响彼此。这些治疗组合的化合物可以以对预期目的而言有效的量给药。在一项实施方案中，本发明的药物制剂包含GDC-0032和如本文所述的化疗剂。在另一实施方案中，根据给药方案给予所述治疗组合，其中GDC-0032的治疗有效量的给药范围为每天两次至每三周一次(q3wk)，且所述化疗剂的治疗有效量，交替单独给药的范围为每天两次至每三周一次。
本发明的治疗组合包含GDC-0032和选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑，以单独、同时或依序用于治疗过度增生性病症。
所述组合疗法可以以同时或依序(序贯)方案给予。当依序给药时，所述组合可以以两次或更多次给药给予。所述组合给药包括同时给药，使用单独的制剂或单一药物制剂，和任一顺序的连续给药，其中优选存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时期。
任何上述同时给药的药物的合适剂量为那些目前所使用的且由于新鉴定药物和其它化疗剂或治疗的组合(协同)作用，如增加治疗指数或减轻毒性或其它副作用或后果，可降低剂量。
在抗癌疗法的一项具体实施方案中，所述治疗组合可与手术疗法和放射疗法组合，作为辅助疗法。本发明的组合疗法包括给予GDC-0032和一种或多种其它癌症治疗方法或方式。应当选择GDC-0032和一种或多种化疗剂的量以及相对给药时间从而达成所需的组合治疗效果。
药物组合物的给药
本发明的治疗组合可通过任何适于所治疗病症的途径给药。适合的途径包括经口、经胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、吸入、皮内、鞘内、硬膜外和输注技术)、经透皮、经直肠、经鼻、经局部(包括经口腔和经舌下)、经阴道、经腹膜内、经肺内和经鼻内。局部给药还包括使用透皮给药如透皮贴剂或电离子透入装置。药物的制剂论述于Remington's PharmaceuticalSciences,18th Ed.,(1995)Mack Publishing Co.,Easton,PA中。药物制剂的其它实例可在Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,Vol 3,2nd Ed.,New York,NY中找到。对于局部免疫抑制治疗，所述化合物可通过病变内给药(intralesional administration)给予，包括灌注或者在移植前使移植物与抑制剂接触。应当理解优选途径可随例如受体的状况改变。当口服所述化合物时，可将其与药学上可接受的载体、助流剂或赋形剂一起配制成丸剂、胶囊剂、片剂等。当胃肠外给予所述化合物时，可将其与药学上可接受的胃肠外媒介物或稀释剂一起配制成如下文所述的单位剂量的可注射形式。
治疗人类患者的剂量的范围可为约1mg至约1000mg GDC-0032，如约5mg至约20mg所述化合物。剂量可一天一次(QD)、一天两次(BID)或更频繁地给药，取决于药动学(PK)和药效学(PD)性质，包括具体化合物的吸收、分布、代谢和排泄。此外，毒性因素可影响剂量和给药剂量方案。当口服给药时，丸剂、胶囊剂或片剂可一天两次、一天一次或更少如一周一次或每两周或三周一次摄入，持续特定的时期。可重复所述方案多个治疗周期。
治疗方法
本发明的方法包括：
基于生物标志物鉴定的诊断方法；
测定患者是否将对GDC-0032或GDC-0032与化疗剂组合应答的方法；
通过监测GDC-0032或GDC-0032与化疗剂组合的清除来优化治疗效果的方法；
通过监测治疗耐药突变的形成优化GDC-0032或GDC-0032与化疗剂组合的治疗方案的方法；和
鉴定哪些患者将从GDC-0032或GDC-0032与化疗剂疗法组合的治疗获益最大并监测患者对GDC-0032或GDC-0032与化疗剂疗法组合的治疗的敏感性和可应答性的方法。
本发明的方法可用于抑制异常细胞生长或治疗过度增生性病症如哺乳动物(例如，人类)中的癌症。例如，所述方法可用于诊断、监测和治疗哺乳动物(例如人类)中的多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、胰腺癌和/或结直肠癌。
(1)GDC-0032和(2)化疗剂的治疗组合可用于治疗疾病、病状和/或病症，其包括但不限于由PI3激酶通路激活所表征的那些。因此，本发明的另一方面包括治疗可通过抑制脂质激酶包括PI3治疗的疾病或病状的方法。在一项实施方案中，治疗实体瘤或血液恶性肿瘤的方法包括向哺乳动物以组合制剂或交替给予治疗组合，其中所述治疗组合包含治疗有效量的GDC-0032和治疗有效量的选自以下的一种或多种化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine(trastuzumab emtansine)、曲妥珠单抗和来曲唑。(1)GDC-0032和(2)化疗剂的治疗组合可用于治疗过度增生性疾病或病症，其包括血液恶性肿瘤、肿瘤、癌症和肿瘤新生物组织，以及恶化前和非新生性的或非恶性的过度增生性病症。在一项实施方案中，使用治疗组合和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物治疗人类患者，其中所述治疗组合中的GDC-0032或其代谢物以可检测地抑制PI3激酶活性的量存在。
血液恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大血液淋巴瘤(diffuse largehematopoietic lymphoma)、滤泡淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、AML和MCL。
本发明的另一方面提供药物组合物或治疗组合用于在罹患本文所述的疾病或病状的哺乳动物例如人类中治疗这些疾病或病状。本发明还提供了药物组合物在制备用于在罹患本文所述的疾病或病状的温血动物如哺乳动物例如人类中治疗这些病症的药物中的用途。
制造品
本发明另一个实施方案提供包含可用于治疗上述疾病和障碍的GDC-0032的制造品或“试剂盒”。在一项实施方案中，所述试剂盒包含容器，所述容器包含GDC-0032。试剂盒还可包含在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的市售包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或注意事项的信息，这些信息涉及上述治疗产品的使用。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、发泡包装等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)来形成。容器可容纳有效治疗所述病症的GDC-0032或其制剂且可具有无菌出口(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞的小瓶)。组合物中的至少一种活性药物为GDC-0032。标签或包装说明书指示所述组合物可用于治疗所选择的病症诸如癌症。在一个实施方案中，标签或包装说明书指示包含式I化合物的组合物可用于治疗起因于异常细胞生长的障碍。标签或包装说明书还可指示所述组合物可用于治疗其它障碍。可选择地或额外地，所述制造品还可包含第二容器，所述第二容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和右旋糖溶液。其还可包含基于商业和使用者立场而期望的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
试剂盒还可包含关于给药GDC-0032及第二药物制剂(若存在)的指导。例如，若试剂盒包含第一组合物(其含有GDC-0032)和第二药物制剂，则试剂盒还可包含关于将第一和第二药物组合物同时、先后或分开给药于需要其的患者的指导。
在另一个实施方案中，试剂盒适于递送GDC-0032的固态口服形式，诸如片剂或胶囊剂。上述试剂盒优选包含多个单位剂量。上述试剂盒可包含具有关于其预期用途的给药方法的卡片。上述试剂盒的实例为“发泡包装”。发泡包装在包装工业中是公知的且广泛用于包装药物单位剂量形式。当需要时，可提供记忆辅助件，其例如呈数字、字母或其它标记形式或带有日历插入件，其指明在治疗时间表中可进行给药的那些天。
根据一个实施方案，试剂盒可包含(a)在其中含有GDC-0032的第一容器；和任选的(b)在其中含有第二药物制剂的第二容器，其中所述第二药物制剂包含具有抗过度增殖活性的第二化合物。可选择地或额外地，试剂盒还可包含第三容器，其包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和右旋糖溶液。其还可包含基于商业和使用者立场而期望的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
当所述试剂盒包含GDC-0032和第二治疗剂即所述化疗剂时，试剂盒可包含用于容纳分开的组分的容器，诸如分开的瓶或分开的箔包装，然而，分开的组分也可容纳在单一的未分开的容器中。通常，试剂盒包含关于给药分开的组分的指导。当分开的组分优选以不同的剂型(例如口服和胃肠外)或不同的给药间隔来给药时或当逐渐增加组合中各个组分的剂量是开具处方的医生所期望的时，试剂盒形式是特别有利的。
实施例
实施例1 2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(GDC-0032)
步骤1：2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酸乙酯
9-溴-2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓(500mg,0.001mol)和2-甲基-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)丙酸乙酯(594mg,0.0015mol)在微波(uW)、钯催化的Suzuki偶联条件下与Pd(dppf)Cl2和Cs2CO3水以及二甲氧基乙烷反应生成2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酸乙酯和相应的酸。LC/MS(ESI+):m/z 490(M+H)
步骤2：2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酸
2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酸乙酯(250mg,0.5mmol)经于水(2mL)和甲醇(1mL)中的1M氢氧化锂处理。在室温搅拌所述反应12h。通过10％水性柠檬酸酸化至pH5并用EtOAc萃取两次。合并的有机层经盐水洗涤、干燥并浓缩。所得的2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酸无需进一步纯化步骤即可使用。LC/MS(ESI+):m/z 462(M+H)。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.44(s,1H),8.36(d,J＝8.4,1H),7.97(s,1H),7.86(s,1H),7.44(dd,J＝8.4,1.7,1H),7.35(d,J＝1.7,1H),5.82(dt,J＝13.1,6.6,1H),4.52(s,4H),2.25(s,3H),1.78(s,6H),1.45(t,J＝13.9,6H)
步骤3：将2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酸(90mg,0.2mmol)溶解于DMF(2mL)中并用NH4Cl(40mg,0.8mmol)、DIPEA(0.3mL,2mmol)处理，随后用N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HATU,100mg,0.4mmol)处理。在室温搅拌所述混合物2h。添加饱和的碳酸氢钠，并用EtOAc萃取所述混合物。合并的有机层经硫酸钠干燥并浓缩。通过10％MeOH/EtOAc然后最小量的EtOAc研磨纯化粗物质，得到74mg(82％收率)2-(4-(2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙酰胺(GDC-0032,CAS登录号1282512-48-4)。LC/MS(ESI+):m/z 463(M+H)。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.44–8.26(m,2H),8.01(s,1H),7.86(s,1H),7.44(dd,J＝8.4,1.8,1H),7.35(d,J＝1.7,1H),7.15(s,1H),6.79(s,1H),5.82(dt,J＝13.3,6.6,1H),4.52(s,4H),2.25(s,3H),1.75(s,6H),1.47(d,J＝6.6,6H)
实施例2 p110αPI3K结合测定
结合测定：初始偏振实验用Analyst HT 96-384(Molecular Devices Corp,Sunnyvale,CA.)进行。用于荧光偏振亲和力测量的试样如下制备：将1:3连续稀释的p110αPI3K(Upstate Cell Signaling Solutions,Charlottesville,VA)(由20μg/毫升在偏振缓冲液(10mM Tris pH 7.5、50mM NaCl、4mM MgCl2、0.05％Chaps和1mM DTT)中的最终浓度开始)加到最终浓度为10mM的PIP2(Echelon-Inc.,Salt Lake City,UT.)中。在室温温育30分钟后，反应通过加入GRP-1和PIP3-TAMRA探针(Echelon-Inc.,Salt Lake City,UT.)(最终浓度分别为100nM和5nM)来停止。在384孔黑色低容量(PerkinElmer,Wellesley,MA.)中用标准截止滤波器对罗丹明荧光团进行读取(λex＝530nm；λem＝590nm)。将荧光偏振值绘制为蛋白质浓度的函数。EC50值如下得到：使用软件(Synergy software,Reading,PA)将数据拟合成四参数方程。所述实验还确定了适用于以下抑制剂竞争实验的蛋白质浓度。
抑制剂IC50值如下确定：将0.04毫克/毫升p110αPI3K(最终浓度)与PIP2(10mM最终浓度)一起加到以下孔中，所述孔含有在最终浓度为25mM的ATP(Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA)/偏振缓冲液中1:3连续稀释的拮抗剂。在室温温育30分钟后，反应通过加入GRP-1和PIP3-TAMRA探针(Echelon-Inc.,Salt Lake City,UT.)(最终浓度分别为100nM和5nM)来停止。在384孔黑色低容量(PerkinElmer,Wellesley,MA.)中用标准截止滤波器对罗丹明荧光团进行读取(λex＝530nm；λem＝590nm)。将荧光偏振值绘制为拮抗剂浓度的函数且IC50值如下得到：用Assay Explorer软件(MDL,San Ramon,CA.)将数据拟合成四参数方程。
可选择地，对PI3K的抑制在放射性测定中使用浓度为1μM(微摩尔)的ATP和纯化重组酶来确定。将所述化合物在100％DMSO中连续稀释。将激酶反应混合物在室温温育1h且反应通过加入PBS来终止。然后IC50值使用S形剂量响应曲线拟合(可变斜率)来确定。
实施例3体外细胞增殖分析
通过细胞增殖分析使用以下方案测量GDC-0032和化疗化合物的有效性(Mendoza et al(2002)Cancer Res.62:5485-5488)。
发光细胞活力分析是基于存在的ATP的定量(其指示代谢活性细胞的存在)测定培养物中活力细胞的数目的均质方法。分析经设计使用多孔板，使得它能够理想地用于自动化高通量筛选(HTS)、细胞增殖和细胞毒性分析。所述均质分析过程包括直接向培养于补充有血清的基质中的细胞添加单一试剂试剂)。无需洗涤细胞，除去基质和多次移液步骤。Cell发光细胞活力分析，包括试剂和说明是市售可得的(Promega Corp.,Madison,WI,Technical Bulletin TB288)。
所述分析评价化合物进入细胞和抑制细胞增殖的能力。所述分析的原理基于通过定量所述均质分析中存在的ATP测定存在的活力细胞的数目，其中添加Cell试剂使得细胞裂解并通过荧光素酶反应产生发光信号。所述发光信号与存在的ATP的量成比例。
操作：第1天1–接种细胞培养板(384-孔黑色，透明底，microclear，有盖的TC培养板，来自Falcon#353962)，收货细胞，以每孔每54μl 1000细胞将细胞接种至384孔培养板中，用于3天分析。细胞培养培养基：RPMI或DMEM高葡萄糖，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，P/S。在37℃5％CO2温育O/N(过夜)。
第2天–向细胞、化合物稀释液、DMSO培养板中添加药物(系列1:2，9个点)。在96孔板的第2栏添加20μl 10mM的化合物。使用从Nunc获得的精密培养基板96孔锥形底聚丙烯板(类别号249946)横跨整个板进行系列1:2(10μl+20μl 100％DMSO)，总共9个点(1:50稀释)。向所有孔中添加147μl培养基。使用(Caliper,a Perkin-Elmer Co.)从DMSO板中的各孔转移3μl DMSO+化合物至培养基板上相应的各孔中。对于2项药物组合研究，使用Rapidplate从DMSO板中的各孔将一种药物1.5μl DMSO+化合物转移至培养基板上的相应的各孔中。然后将另一药物1.5μl转移至培养基板。
添加药物至细胞，细胞板(1:10稀释)：向细胞中直接添加6μl培养基+化合物(在这些细胞上已经有54μl培养基)。在不会经常打开的培养箱中在37℃5％CO2下温育3天。
第5天–显色培养板，在室温溶解Cell Titer Glo缓冲液：从37℃除去细胞培养板并且平衡至室温约30分钟。向Cell底物添加Cell缓冲液(瓶对瓶)。向各细胞孔中添加30μl Cell试剂(Promega类别号G7572)。放置于细胞板振荡器上震荡约30分钟。在AnalystHT细胞板读数器上读取发光值(每孔半秒)。
细胞活力分析和组合分析：以1000-2000细胞/孔将细胞接种于384-孔板，持续16h。在第2天，在96孔板在DMSO中制备9个系列1:2化合物稀释液。使用机器人(Zymark Corp.,Hopkinton,MA)将化合物进一步稀释至生长培养基中。然后将稀释的化合物添加384孔细胞板中的4个复孔中并在37℃和5％CO2下温育。在4天后，通过发光根据制造商说明书使用Cell(Promega)测量活力细胞的相对数目并在Wallac Multilabel(PerkinElmer,Foster City)上读取。使用4.0软件(GraphPad,San Diego)计算EC50值。组合分析中的药物以4X EC50浓度起始给药。如果药物的EC50>2.5μM，则使用的最高浓度为10μM。在所有分析中，GDC-0032和化疗剂同时添加或单独相隔4h添加(一个在另一个之前)。
一种另外的例示性体外细胞增殖分析包括以下步骤：
1.将100μl细胞培养物等分液(在培养基中含有约104个细胞(细胞系和肿瘤类型参见表3))置于384孔壁不透明的板的每个孔中。
2.制备含有培养基但不含有细胞的对照孔。
3.将化合物加到实验孔中且温育3-5天。
4.将板平衡至室温且保持约30分钟。
5.加入体积与存在于每个孔中的细胞培养基的体积相同的试剂。
6.内含物用定轨振荡器混合2分钟以使细胞裂解。
7.将板在室温温育10分钟以使发光信号稳定。
8.记录发光信号且以图表形式报道为RLU＝相对发光单位。
9.使用Chou和Talalay组合方法分析并用软件(Biosoft,Cambridge,UK)分析剂量效应从而获得联合指数。
或者，以最佳密度将细胞接种于96孔板中并在测试化合物存在下温育4天。随后将Alamar BlueTM添加至分析培养基中，并将细胞温育6h，然后在544nm激发光，590nm发射光下读取。使用S形剂量响应曲线拟合计算EC50值。
或者，在药物处理48h后使用Cell试剂(Promega Inc.,Madison,WI)分析增殖/活力。在所有活力分析中DMSO处理可用作对照。使用XL拟合软件(IDBS,Alameda,CA)计算IC50值。
细胞系获自ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)或DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,DE)。细胞在补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、2mML-谷氨酰胺和100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(Life Technology,GrandIsland,NY)中在37℃在5％CO2下培养。
实施例4体内小鼠肿瘤异种移植物有效性
小鼠：雌性重症联合免疫缺陷的小鼠(Fox ChaseC.B-17/IcrHsd,Harlan)或裸鼠(Taconic Farms,Harlan)为8至9周龄，并且在试验的第0天BW范围为15.1至21.4g。任意喂养这些动物水(反渗透，1ppm Cl)和NIH 31改良的且放射标记的Lab(由18.0％粗蛋白，5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成)。小鼠被圈养在微隔离器中的被照射的床LaboratoryAnimal Bedding上，12h光照周期，21-22℃(70-72°F)和40-60％湿度。对于约束方法、管理方法、外科手术方法、喂养和流体调节以及兽医护理，PRC明确地遵从护理和使用实验动物指南的建议。PRC的动物护理和使用程序是国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care International)认可的，其确保符合可接受的实验动物护理和使用的标准。
肿瘤移植：异种移植物由癌细胞引发。细胞在补充有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和25μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基中培养。在指数生长期间收获细胞并将其以5x106或10x106细胞/mL的浓度重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，所述浓度取决于所述细胞系的倍增时间。将肿瘤细胞皮下植入右胁腹侧(right flank)，并监测肿瘤生长，平均大小达到目标范围100-150mm3。在肿瘤移植后的21天(指定为研究的第0天)，小鼠被分为4组，每组包括具有单个肿瘤体积范围为75-172mm3且组平均肿瘤体积为120-121mm3的10只小鼠(见附件A)。使用下式计算体积：
肿瘤体积(mm3)＝(w2xl)/2，其中w＝肿瘤的宽度并且l＝肿瘤的长度，单位为mm。肿瘤重量可通过1mg等于1mm3肿瘤体积的假设来估算。
治疗剂：以干粉提供盐形式的GD-0032，其含有73％的活性剂，且避光保存于室温。每周一次在0.5％甲基纤维素：0.2％吐温80的去离子水(“媒介物”)中制备药物剂量并保存于4℃。G-033829剂量的制剂中包含所述含有73％活性剂的盐形式。GDC-0032的剂量在给药的每一天通过用无菌生理盐水(0.9％NaCl)稀释和等分储备液来制备。所有剂量配制用于以0.2mL体积/20g体重(10mL/kg)递送标明的mg/kg剂量。
治疗：所有剂量按比例放大到个体动物的体重，并按各图所标示的途径提供。
终点：使用Ultra Cal IV测径器(Model 5410111；Fred V.Fowler Company)如下在两个维度(长度和宽度)测量肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)×0.5，并使用Excel 11.2版(Microsoft Corporation)分析。使用线性混合效应(LME)建模方法分析随时间从相同动物重复测量的肿瘤体积(Pinheiro J,et al.nlme:linear and nonlinear mixed effects models.R package version 3.192.2009；Tan N,et al.Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lungcancer models.Clin.Cancer Res.2011；17(6):1394–1404)。所述方法解决了重复测量和由于研究结束前任何的非治疗相关的动物死亡引起的适度的偏差(dropout)。使用三次样条回归(Cubic regression splines)拟合各剂量水平下log2肿瘤体积时程的非线性特点。然后将这些非线性特点与此混合模型内的剂量相关联。使用下式，以拟合曲线下面积(AUC)计算相对于媒介物每天各自剂量组的肿瘤生长抑制，为媒介物对照的百分数(％TGI)：％TGI＝100×(1-AUCdose/AUCveh)。使用所述式，100％的TGI值指示肿瘤停滞，＞1％但＜100％的TGI指示肿瘤生长延迟，而＞100％的TGI指示肿瘤消退。对于动物而言，部分应答(PR)定义为肿瘤消退＞50％但＜100％的初始肿瘤体积。完全应答(CR)定义为在研究期间的任一天100％肿瘤消退(即，无可测量的肿瘤)。
毒性：在研究的前5天，每天一次称量动物，随后每周两次称量。使用AdventurerAV812天平(Ohaus Corporation)测量动物体重。如下计算百分比体重变化：体重变化(％)＝[(重量新的一天-重量第0天)/重量第0天]×100。频繁地观察小鼠是否有任何不良的、治疗相关的副作用的明显体征，并在观察到时记录毒性的临床体征。可接受的毒性定义为在研究期间组平均体重(BW)丢失低于20％并且在10只受治疗的动物中不超过1例治疗相关的(TR)死亡。任何导致更大毒性的给药方案被视为高于最大耐受剂量(MTD)。如果通过临床体征和/或尸检证明死亡归因于治疗副作用，则死亡被归类为TR，或者如果在给药期间或最后一次给药后10天内由于未知原因引起的死亡，也可归类为TR。如果无证据表明死亡与治疗副作用相关，则死亡被归类为NTR。
尽管为了更清楚的理解，已通过解释和实施例在一定程度上详述了前述发明，但说明书和实施例不应当解释为限制本发明的范围。本文所引用的所有专利和科学文献的公开内容均明确地整体引入作为参考。

Claims (66)

1.一种治疗过度增生性病症的方法，其包括以组合制剂或交替向哺乳动物给予治疗组合，其中所述治疗组合包含：
治疗有效量的具有以下结构的GDC-0032：
以及治疗有效量的选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑。
2.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为5-FU。
3.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为多西他赛。
4.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为艾日布林。
5.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为吉西他滨。
6.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为GDC-0973。
7.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为GDC-0623。
8.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为紫杉醇。
9.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为他莫昔芬。
10.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为氟维司群。
11.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为地塞米松。
12.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为帕妥珠单抗。
13.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为曲妥珠单抗emtansine。
14.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为曲妥珠单抗。
15.权利要求1的方法，其中所述化疗剂为来曲唑。
16.权利要求1的方法，其中所述治疗组合进一步包含卡铂。
17.权利要求1的方法，其中所述治疗组合进一步包含抗-VEGF抗体。
18.权利要求1的方法，其中所述抗-VEGF抗体为贝伐单抗。
19.权利要求1-19任一项的方法，其中GDC-0032的药学上可接受的盐选自与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乙磺酸、天冬氨酸和谷氨酸形成的盐。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中以组合制剂给予治疗有效量的GDC-0032和治疗有效量的化疗剂。
21.权利要求1-19任一项的方法，其中向哺乳动物交替给予治疗有效量的GDC-0032和治疗有效量的化疗剂。
22.权利要求21的方法，其中向所述哺乳动物给予化疗剂并随后给予GDC-0032。
23.权利要求21的方法，其中按照给药方案给予所述治疗组合，其中以每天两次至每三周一次的范围给予治疗有效量的GDC-0032，且以每天两次至每三周一次的范围给予治疗有效量的化疗剂。
24.权利要求23的方法，其中所述给药方案重复一次或多次。
25.权利要求1-19任一项的方法，其中所述治疗组合的给予产生协同作用。
26.权利要求25的方法，其中所述治疗组合的给予产生低于约0.7的联合指数值。
27.权利要求1-19任一项的方法，其中所述过度增生性病症为选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的癌症。
28.权利要求27的方法，其中所述癌症表达选自E542K、E545K、Q546R、H1047L和H1047R的PIK3CA突变型。
29.权利要求27的方法，其中所述癌症表达PTEN突变型。
30.权利要求27的方法，其中所述癌症是HER2阳性的。
31.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物为乳腺癌患者，其中所述患者是HER2阴性、ER(雌激素受体)阴性和PR(孕酮受体)阴性的。
32.权利要求31的方法，其中所述乳腺癌亚型是基底型或管状上皮型。
33.权利要求30的方法，其中向所述患者给予GDC-0032和艾日布林。
34.权利要求1-19任一项的方法，其中以每单位剂型约1mg至约1000mg的量分别给予GDC-0032和所述化疗剂。
35.权利要求1-19任一项的方法，其中以约1:50至约50:1的重量比给予GDC-0032和所述化疗剂。
36.药物制剂，其包含：
GDC-0032以及
选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑。
37.权利要求36的药物制剂，其进一步包含选自以下的药学上可接受的助流剂：二氧化硅、粉状纤维素、微晶纤维素、硬脂酸金属盐、铝硅酸钠、苯甲酸钠、碳酸钙、硅酸钙、玉米淀粉、碳酸镁、无石棉滑石、stearowet C、淀粉、淀粉1500、月桂基硫酸镁、氧化镁和其组合。
38.权利要求36的药物制剂，其中GDC-0032和所述化疗剂各自包含每单位剂型约1mg至约1000mg的量。
39.权利要求36的药物制剂，其用于治疗癌症的方法中。
40.具有以下结构的GDC-0032：
以及下述化疗剂的治疗组合在制备用于治疗选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的癌症的药物中的用途，所述化疗剂选自：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑。
41.一种用于治疗过度增生性病症的制造品，其包含：
a)权利要求1-19任一项的治疗组合；和
b)使用说明。
42.一种产品，其包含具有以下结构的GDC-0032：
以及选自以下的化疗剂：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑；作为组合制剂单独、同时或依序用于治疗过度增生性病症。
43.一种确定待组合用于治疗癌症的化合物的方法，其包括：
a)使用具有以下结构的GDC-0032
以及选自以下的化疗剂的治疗组合处理具有K-ras突变的体外肿瘤细胞系：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑，且
b)测量协同作用或非协同作用；
从而确定用于治疗癌症的协同性治疗组合。
44.一种选择待组合用于治疗癌症的化合物的方法，其包括：
a)对肿瘤细胞给予具有以下结构的GDC-0032
以及选自以下的化疗剂的治疗组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑；
b)测量pAkt水平的变化；且
c)选择显示pAkt水平增加的协同性治疗组合。
45.一种治疗患者中过度增生性病症的方法，其包括向患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑，其中检测在向所述患者给予所述组合前从所述患者获得的生物样品以得到PIK3CA或PTEN的突变状态，以及其中PIK3CA或PTEN的突变状态指示患者对所述组合的治疗可应答性。
46.权利要求45的方法，其中向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032单药。
47.权利要求45的方法，其中向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032和化疗剂的组合。
48.权利要求45的方法，其中所述过度增生性病症是表达HER2的乳腺癌。
49.权利要求45的方法，其中在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后通过测量功能性PI3K蛋白水平检测生物样品，其中功能性PI3K蛋白水平的变化指示患者对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合耐药或应答。
50.一种监测患有过度增生性病症的患者是否对使用GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗应答的方法，所述方法包括：
(a)检测在给予至少一剂GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合后从所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN突变：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑；和
(b)比较在给予患者GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合前从所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN突变状态，
其中在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后获得的样品中PIK3CA或PTEN突变状态的变化或调整鉴定将对使用GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗应答的患者。
51.权利要求50的方法，其中所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
52.一种优化GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合在治疗过度增生性病症中的治疗效果的方法，所述方法包括：
(a)检测在给予至少一剂GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合后从患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN突变：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑；和
(b)比较在向患者给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合前从所述患者获得的生物样品中的PIK3CA或PTEN状态，
其中在给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合后获得的样品中PIK3CA或PTEN的变化或调整鉴定对使用GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗有更大可能性受益的患者。
53.权利要求50的方法，其中所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
54.一种鉴定用于在治疗过度增生性病症中监测对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合可应答性的生物标志物的方法，所述方法包括：
(a)检测从接受至少一剂GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合的患者获得的生物样品中选自PIK3CA或PTEN突变的生物标志物的表达、调节或活性：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑；和
(b)比较所述生物标志物的表达、调节或活性与参照样品中所述生物标志物的状态，其中所述参照样品为在向所述患者给予GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合前从所述患者获得的生物样品；
其中与参照样品相比，所述生物标志物调节变化至少更低或更高2倍被鉴定为可用于监测对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的可应答性的生物标志物。
55.权利要求54的方法，其中所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
56.一种治疗患者中过度增生性病症的方法，其包括向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和选自以下的化疗剂的组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑，其中治疗基于从具有PIK3CA或PTEN突变的患者获得的样品。
57.权利要求56的方法，其中所述生物标志物突变为PIK3CA的H1047R或H1047L突变。
58.权利要求56的方法，其中所述生物标志物突变为PIK3CA的E542K、E545K或Q546R突变。
59.权利要求56的方法，其中所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
60.权利要求56的方法，其中所述过度增生性病症为雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌。
61.GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合在治疗患者中过度增生性病症中的用途，其包括向所述患者给予治疗有效量的GDC-0032或GDC-0032和选自以下的治疗剂的组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑，
其中检测在向所述患者给予GDC-0032或所述GDC-0032和化疗剂的组合前从所述患者获得的生物样品以得到PIK3CA或PTEN的突变状态，以及其中PIK3CA或PTEN的突变状态指示患者对GDC-0032或GDC-0032和化疗剂的组合的治疗可应答性。
62.权利要求61的用途，其中所述过度增生性病症为表达HER2的乳腺癌。
63.权利要求61的用途，其中所述过度增生性病症为雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌。
64.具有以下结构的GDC-0032：
以及选自以下的化疗剂的治疗组合：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑，其用于治疗选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的癌症。
65.具有以下结构的GDC-0032：
以及选自以下的化疗剂的治疗组合在治疗选自乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的癌症中的用途：5-FU、多西他赛、艾日布林、吉西他滨、GDC-0973、GDC-0623、紫杉醇、他莫昔芬、氟维司群、地塞米松、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、曲妥珠单抗和来曲唑。
66.如本文所述的本发明。
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