PT1266025E - Esqueletos proteicos para imitadores de anticorpos e outras proteínas de ligação - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Esqueletos proteicos para imitadores de anticorpos e outras proteínas de ligação"

Antecedentes do Invento

Este invento refere-se a esqueletos proteicos úteis, por exemplo, para a criação de produtos possuindo novas caracteristicas de ligação.

As proteínas possuindo estruturas tridimensionais relativamente definidas, vulgarmente referidas como esqueletos proteicos, podem ser utilizadas como reagentes para o desenho de produtos modificados. Estes esqueletos contêm tipicamente uma ou mais regiões que são passíveis de variação de sequência específica ou aleatória, e tal aleatoriedade de sequência é frequentemente utilizada para produzir bibliotecas de proteínas das quais podem ser seleccionados produtos desejados. Uma área particular na qual tais esqueletos são úteis é o campo do desenho de anticorpos.

Foram tentadas várias abordagens anteriores à manipulação do sistema imunitário de mamíferos para obter reagentes ou fármacos. Estas incluíam injecção de animais com antigénios de interesse para obter misturas de anticorpos policlonais reactivos contra antigénios específicos, produção de anticorpos monoclonais em cultura de células de hibridoma (Koehler e Milstein, Nature 256: 495, 1975), modificação de anticorpos monoclonais existentes para obter novas ou optimizadas propriedades de reconhecimento, criação de novos fragmentos de anticorpo com caracteristicas de ligação desejáveis e aleatorização de anticorpos de cadeia simples (criados através da união de regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de moléculas de anticorpo com um ligante peptídico flexível) seguida de selecção para ligação ao antigénio através de apresentação fágica (Clackson et al., Nature 352: 624, 1991).

Adicionalmente, foram propostos vários esqueletos proteicos não imunoglobulina para obtenção de proteínas com novas propriedades de ligação. Por exemplo, um esqueleto 2

ΕΡ 1 266 025 /PT "minicorpo", que está relacionado com a dobra da imunoglobulina, foi desenhado através da deleção de três cadeias beta de um domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal (Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7: 9, 1994) . Esta proteína inclui 61 resíduos e pode ser utilizada para apresentar duas voltas hipervariáveis. Estas duas voltas podem ser tornadas aleatórias e os produtos seleccionados para ligação ao antigénio, mas até agora a estrutura parece ter de algum modo utilidade limitada devido a problemas de solubilidade. Outra estrutura utilizada para apresentar voltas tem sido o tendamistat, uma sanduíche de folhas beta de seis cadeias de 74 resíduos mantidas unidas através de ligações dissulfureto (McConnell e Hoess, J. Mol. Biol. 250: 460, 1995). Este esqueleto inclui três voltas, mas, até a data, apenas duas destas voltas foram examinadas quanto a potencial aleatorização.

Outras proteínas foram testadas como estruturas e foram utilizadas para apresentar resíduos aleatórios em superfícies helicoidais alfa (Nord et al., Nat. Biotechnol. 15: 772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8: 601, 1995), voltas entre hélices alfa em feixes de hélices alfa (Ku e Schultz, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 6552, 1995) e voltas restringidas por pontes dissulfureto, tais como as dos pequenos inibidores de proteases (Markland et al., Biochemistry 35: 8045, 1996;

Rottgen e Collins, Gene 164: 243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270: 12250, 1995). O potencial do domínio da fibronectina de tipo III como esqueleto para concepção de novas proteínas de ligação foi também demonstrado (Koide et al., J. Mol. Biol. 284: 1141, 1998) .

Sumário do Invento O presente invento proporciona uma nova familia de proteínas capazes de evoluir para se ligarem a qualquer composto de interesse. Estas proteínas, que utilizam um esqueleto de fibronectina ou semelhante ao da fibronectina, funcionam de um modo característico dos anticorpos naturais ou modificados (isto é, anticorpos policlonais, monoclonais ou de cadeia simples) e, adicionalmente, possuem vantagens 3 ΕΡ 1 266 025 /PT estruturais. Especificamente, a estrutura destes imitadores de anticorpos foi concebida para uma óptima dobragem, estabilidade e solubilidade, mesmo sob condições que conduzem normalmente à perda da estrutura e função em anticorpos.

Estes imitadores de anticorpos podem ser utilizados com o fim de conceber proteínas que sejam capazes de se ligar virtualmente a qualquer composto (por exemplo, qualquer proteína) de interesse. Em particular, as moléculas baseadas em fibronectina aqui descritas podem ser utilizadas como esqueletos que são sujeitos a evolução dirigida desenhada para tornar aleatória uma ou mais das três voltas de fibronectina que são análogas às regiões determinantes de complementaridade (CDR) de uma região variável de anticorpo. Uma tal abordagem de evolução dirigida resulta na produção de moléculas semelhantes a anticorpos com elevadas afinidades para antigénios de interesse. Adicionalmente, os esqueletos aqui descritos podem ser utilizados para apresentar voltas expostas definidas (por exemplo, voltas anteriormente tornadas aleatórias e seleccionadas com base na ligação ao antigénio) para dirigir a evolução de moléculas que se ligam a tais voltas introduzidas. Uma selecção deste tipo pode ser realizada para identificar moléculas de reconhecimento para qualquer volta individual semelhante a CDR ou, alternativamente, para o reconhecimento de duas ou todas as três voltas semelhantes a CDR combinadas num epítopo não linear.

Assim, o presente invento inclui uma proteína que inclui um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, sendo a proteína caracterizada pela sua capacidade para se ligar a um composto ao qual a fibronectina de ocorrência natural correspondente não se liga.

Em concretizações preferidas, o domínio de fibronectina de tipo III é um domínio de fibronectina de tipo III de mamífero (por exemplo, humano); e a proteína inclui o décimo módulo do domínio de fibronectina de tipo III (10Fn3) . Em tais proteínas, a ligação ao composto é de preferência mediada por uma, duas ou três voltas de 10Fn3. Noutras concretizações preferidas, a segunda volta de 10Fn3 pode ser 4

ΕΡ 1 266 025 /PT prolongada em comprimento relativamente ao módulo de ocorrência natural ou o 10Fn3 pode não ter um motivo de ligação a integrina. Nestas moléculas, o motivo de ligação a integrina pode ser substituído por uma sequência de aminoácidos na qual uma sequência de aminoácido básico- aminoácido neutro-aminoácido ácido (na direcção N-terminal para C-terminal) substitui o motivo de ligação à integrina; uma sequência preferida é serina-glicina-glutamato. Noutra concretização preferida, as proteínas contendo o domínio de fibronectina de tipo III do presente invento não têm ligações dissulfureto.

Qualquer uma das proteínas contendo o domínio de fibronectina de tipo III aqui descritas pode ser formulada como parte de uma proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão que inclui ainda um domínio Fc de imunoglobulina, uma proteína do complemento, uma proteína toxina ou uma proteína albumina). Adicionalmente, qualquer uma das proteínas com domínio de fibronectina de tipo III pode ser covalentemente ligada a um ácido nucleico (por exemplo, um ARN) e o ácido nucleico pode codificar a proteína. Para além disso, a proteína pode ser um multímero, ou, particularmente se não tiver um motivo de ligação a integrina, pode ser formulada num transportador fisiologicamente aceitável. O presente invento apresenta ainda proteínas que incluem um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma mutação numa sequência de folha β com alterações na estrutura do esqueleto. Novamente, estas proteínas são caracterizadas pela sua capacidade para se ligarem a compostos aos quais a fibronectina de ocorrência natural não se liga.

Adicionalmente, qualquer um dos esqueletos de fibronectina do presente invento pode ser imobilizado num suporte sólido (por exemplo, uma conta ou um chip) e estes esqueletos podem ser dispostos em qualquer configuração no suporte sólido, incluindo um arranjo.

Num aspecto relacionado, o presente invento apresenta ainda ácidos nucleicos codificando qualquer uma das proteínas 5

ΕΡ 1 266 025 /PT do presente invento. Em concretizações preferidas, o ácido nucleico é ADN ou ARN.

Noutro aspecto relacionado, o presente invento apresenta também um método para criação de uma proteína que inclui um domínio de fibronectina de tipo III e que é farmaceuticamente aceitável para um mamífero, envolvendo a remoção do domínio de ligação a integrina do referido domínio de fibronectina de tipo III. Este método pode ser aplicado a qualquer uma das proteínas contendo domínio de fibronectina de tipo III descritas acima e é particularmente útil para a criação de proteínas para aplicações terapêuticas humanas. O presente invento inclui também proteínas contendo um domínio de fibronectina de tipo III que não possuem domínios de ligação a integrina.

Ainda noutros aspectos relacionados, o presente invento inclui métodos de pesquisa que podem ser utilizados para obter ou desenvolver proteínas de fibronectina de tipo III tornadas aleatórias capazes de se ligar a compostos de interesse, ou para obter ou desenvolver compostos (por exemplo, proteínas) capazes de se ligar a uma determinada proteína contendo um motivo de fibronectina de tipo III tornado aleatório. Adicionalmente, o presente invento apresenta procedimentos de pesquisa que combinam estes dois métodos, por qualquer ordem, para obter compostos ou proteínas de interesse.

Em particular, o primeiro método de pesquisa, útil para o isolamento ou a identificação de proteínas aleatórias de interesse, envolve: (a) colocação do composto em contacto com uma proteína candidata, incluindo a proteína candidata um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, sendo o contacto realizado sob condições que permitem a formação de um complexo composto-proteína; e (b) obtenção, a partir do complexo, da proteína que se liga ao composto. 0 segundo método de pesquisa, para isolamento ou identificação de um composto que se liga a uma proteína possuindo um domínio de fibronectina de tipo III tornado aleatório, envolve: (a) colocação da proteína em contacto com 6

ΕΡ 1 266 025 /PT um composto candidato, sendo o contacto realizado sob condições que permitem a formação de um complexo composto-proteína; e (b) obtenção, a partir do complexo, do composto que se liga à proteína.

Em concretizações preferidas, os métodos envolvem ainda a aleatorização de pelo menos uma volta do dominio de fibronectina de tipo III da proteína obtida no passo (b) e a repetição dos passos (a) e (b) utilizando a proteína tornada mais aleatória, ou a modificação do composto obtido no passo (b) e a repetição dos passos (a) e (b) utilizando o composto mais modificado. Adicionalmente, o composto é de preferência uma proteína e o domínio de fibronectina de tipo III é de preferência um domínio de fibronectina de tipo III de mamífero (por exemplo, humano). Noutras concretizações preferidas, a proteína inclui o décimo módulo do domínio de fibronectina de tipo III (10Fn3) e a ligação é mediada por uma, duas ou três voltas de 10Fn3. Adicionalmente, a segunda volta de 10Fn3 pode ser prolongada em comprimento relativamente ao módulo de ocorrência natural ou o 10Fn3 pode não ter um motivo de ligação a integrina. Novamente, tal como descrito acima, o motivo de ligação a integrina pode ser substituído por uma sequência de aminoácidos na qual uma sequência de aminoácido básico-aminoácido neutro-aminoácido ácido (na direcção N-terminal para C-terminal) substitui o motivo de ligação a integrina; uma sequência preferida é serina-glicina-glutamato.

Os métodos de selecção aqui descritos podem ser realizados utilizando qualquer proteína contendo um domínio de fibronectina de tipo III. Por exemplo, a proteína contendo um domínio de fibronectina de tipo III pode não ter ligações dissulfureto ou pode ser formulada como parte de uma proteína de fusão (por exemplo, uma proteína de fusão que inclua ainda um domínio Fc de imunoglobulina, uma proteína do complemento, uma proteína toxina ou uma proteína albumina). Adicionalmente, as selecções podem ser realizadas utilizando as proteínas de domínio de fibronectina de tipo III covalentemente ligadas a ácidos nucleicos (por exemplo, ARN ou qualquer ácido nucleico que codifique a proteína). Para além disso, as selecções podem ser realizadas utilizando multímeros proteicos contendo domínios de fibronectina. 7

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De preferência, as selecções envolvem a imobilização do alvo de ligação num suporte sólido. Suportes sólidos preferidos incluem colunas (por exemplo, colunas de afinidade, tais como colunas de agarose) ou microchips.

Adicionalmente, o presente invento inclui métodos de diagnóstico que empregam as proteínas de esqueleto de fibronectina do presente invento. Tais métodos de diagnóstico podem ser realizados numa amostra (por exemplo, uma amostra biológica) para detectar uma substância a analisar ou para detectar simultaneamente muitas substâncias a analisar diferentes na amostra. O método pode empregar qualquer uma das moléculas esqueleto aqui descritas. De preferência, o método envolve (a) a colocação da amostra em contacto com uma proteína que se liga ao composto da substância a analisar e que inclui um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, sendo o contacto realizado sob condições que permitam a formação de um complexo composto-proteína; e (b) detecção do complexo, e desse modo do composto na amostra.

Em concretizações preferidas, a proteína é imobilizada num suporte sólido (por exemplo, um chip ou uma conta) e pode ser imobilizada como parte de um arranjo. A proteína pode ser covalentemente ligada a um ácido nucleico, de preferência um ácido nucleico tal como ARN, que codifique a proteína. Adicionalmente, o composto é frequentemente uma proteína, mas pode também ser qualquer outra substância a analisar numa amostra. A detecção pode ser alcançada através de qualquer técnica padrão incluindo, sem limitação, radiografia, detecção de fluorescência, espectroscopia de massa ou ressonância plasmónica de superfície.

Tal como aqui se utiliza, por “domínio de fibronectina de tipo III" entenda-se um domínio possuindo 7 ou 8 cadeias beta que estão distribuídas entre duas folhas beta, que se empacotam a si mesmas umas contra as outras para formar o núcleo da proteína, e contendo ainda voltas que ligam as cadeias beta umas às outras e estão expostas ao solvente. Existem pelo menos três dessas voltas em cada extremidade da sanduíche de folhas beta, onde a extremidade é o limite da proteína perpendicular à direcção das cadeias beta. De 8 ΕΡ 1 266 025 /PT preferência, um domínio de fibronectina de tipo III inclui uma sequência que exibe pelo menos uma identidade de aminoácidos de 30% e de preferência pelo menos uma identidade de aminoácidos de 50%, com a sequência codificando a estrutura do domínio 10Fn3 referido como "lttg" (lD="lttg" (um ttg)) disponível na Protein Data Base. A identidade da sequência referida nesta definição é determinada pelo programa Homology, disponível em Molecular Simulation (San Diego, CA) . O presente invento inclui ainda polímeros de moléculas relacionadas com 10Fn3, que são uma extensão da utilização da estrutura monomérica, sejam ou não as subunidades da poliproteína idênticas ou diferentes na sequência.

Por "fibronectina de ocorrência natural" entenda-se qualquer proteína fibronectina que é codificada por um organismo vivo.

Por "tornado aleatório" entenda-se incluindo uma ou mais alterações de aminoácidos relativamente a uma sequência molde.

Por uma "proteína" entenda-se qualquer sequência de dois ou mais aminoácidos, independentemente do comprimento, da modificação pós-tradução ou da função. "Proteína" e "péptido" são aqui utilizados indiferentemente.

Por "ARN" entenda-se uma sequência de dois ou mais ribonucleótidos de ocorrência natural ou modificados ligados covalentemente. Um exemplo de um ARN modificado incluído dentro deste termo é ARN fosforotioato.

Por "ADN" entenda-se uma sequência de dois ou mais desoxirribonucleótidos de ocorrência natural ou modificados ligados covalentemente.

Por um "ácido nucleico" entenda-se quaisquer dois ou mais nucleótidos ou análogos ou derivados de nucleótidos ligados covalentemente. Tal como aqui se utiliza, este termo inclui, sem limitação, ADN, ARN e PNA. 9

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Por "farmaceuticamente aceitável" entenda-se um composto ou proteína que pode ser administrado a um animal (por exemplo, um mamífero) sem consequências médicas adversas significativas.

Por "transportador fisiologicamente aceitável" entenda-se um transportador que não possui um impacto prejudicial significativo no hospedeiro tratado e que mantém as propriedades terapêuticas do composto com o qual é administrado. Um transportador fisiologicamente aceitável exemplar é solução salina fisiológica. Outros transportadores fisiologicamente aceitáveis e suas formulações são conhecidos de um perito na arte e estão descritos, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", (18a edição), ed. A. Genaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Por "selecção" entenda-se a divisão substancial de uma molécula a partir de outras moléculas numa população. Tal como aqui se utiliza, um passo de "selecção" proporciona um enriquecimento de pelo menos 2 vezes, de preferência 30 vezes, sendo preferível 100 vezes e de maior preferência 1000 vezes numa molécula desejada relativamente a moléculas indesejadas numa população após o passo de selecção. Um passo de selecção pode ser repetido qualquer número de vezes e diferentes passos de selecção podem ser combinados numa dada abordagem.

Por "parceiro de ligação", tal como aqui se utiliza, entenda-se qualquer molécula que possua uma afinidade covalente ou não covalente específica para uma porção de um composto desejado (por exemplo, proteína) de interesse. Exemplos de parceiros de ligação incluem, sem limitação, membros de pares antigénio/anticorpo, pares proteína/inibidor, pares receptor/ligando (por exemplo pares receptor da superfície celular/ligando, tais como pares receptor de hormona/hormona peptídica), pares enzima/substrato (por exemplo, pares quinase/substrato), pares lectina/hidrato de carbono, agregados proteicos oligoméricos ou hetero-oligoméricos, pares proteína de ligação ao ADN/local de ligação do ADN, pares ARN/proteína e dúplices, heterodúplices ou cadeias ligadas de ácidos nucleicos, bem como qualquer molécula que seja capaz de 10

ΕΡ 1 266 025 /PT formar uma ou mais ligações covalentes ou não covalentes (por exemplo, ligações dissulfureto) com qualquer porção de outra molécula (por exemplo, um composto ou proteína).

Por um "suporte sólido" entenda-se, sem limitação, qualquer coluna (ou material de coluna), conta, tubo de ensaio, placa de microtítulo, partícula sólida (por exemplo, agarose ou Sepharose), microchip (por exemplo, chip de silicone, silicone-vidro ou ouro) ou membrana (por exemplo, a membrana de um lipossoma ou de uma vesícula) ao qual se pode ligar um esqueleto de fibronectina ou um complexo de afinidade, directamente ou indirectamente (por exemplo, através de outros parceiros de ligação intermediários tais como outros anticorpos ou Proteína A) ou no qual um esqueleto de fibronectina ou um complexo de afinidade pode ser embebido (por exemplo, através de um receptor ou canal). O presente invento proporciona várias vantagens. Por exemplo, tal como descrito em mais detalhe abaixo, o presente imitador de anticorpo exibe propriedades biofísicas melhoradas, tais como estabilidade sob condições redutoras e solubilidade a elevadas concentrações. Adicionalmente, estas moléculas podem ser facilmente expressas e dobradas em sistemas procarióticos, tais como E. coli, em sistemas eucarióticos, tais como levedura, e em sistemas de tradução in vitro, tais como o sistema de lisado de reticulócitos de coelho. Para além disso, estas moléculas são facilmente sujeitas a técnicas de maturação de afinidade envolvendo múltiplos ciclos de selecção, incluindo selecção in vitro utilizando tecnologia de fusão de ARN-proteína (Roberts e Szostak, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297, 1997; Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700), apresentação fágica (ver, por exemplo, Smith e Petrenko, Chem. Rev. 97 : 317, 1997) e sistemas de apresentação de levedura (ver, por exemplo, Boder e Wittrup, Nature Biotech. 15: 553, 1997).

Outras características e vantagens do presente invento serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada deste e a partir das reivindicações. 11

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Breve Descrição dos Desenhos A FIGURA 1 é uma fotografia que mostra uma comparação entre as estruturas das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo de camelo (azul-escuro) e lama (azul-claro), em cada uma de duas orientações. A FIGURA 2 é uma fotografia que mostra uma comparação entre as estruturas da região variável da cadeia pesada do anticorpo de camelo (azul-escuro) , da região variável da cadeia pesada do anticorpo de lama (azul-claro) e de um módulo número 10 da fibronectina de tipo III (10Fn3) (amarelo). A FIGURA 3 é uma fotografia que mostra um módulo número 10 da fibronectina de tipo III (10Fn3) com as voltas correspondentes às voltas de ligação ao antigénio em cadeias pesadas de IgG realçadas a vermelho. A FIGURA 4 é um gráfico que ilustra um alinhamento de sequências entre um domínio proteico de fibronectina de tipo III e domínios proteicos relacionados. A FIGURA 5 é uma fotografia que mostra as semelhanças estruturais entre um domínio 10Fn3 e 15 proteínas aparentadas, incluindo fibronectinas, tenascinas, colagénios e undulina. Nesta fotografia, as regiões são marcadas como se segue: constante, azul-escuro; conservada, azul-claro; neutra, branco; variável, vermelho; e motivo de ligação a integrina RGD (variável), amarelo. A FIGURA 6 é uma fotografia que mostra modelos de preenchimento do espaço dos módulos 9 e 10 da fibronectina III, em cada uma de duas orientações diferentes. Os dois módulos e a volta de ligação a integrina (RGD) estão marcados. Nesta figura, o azul indica resíduos de carga positiva, o vermelho indica resíduos de carga negativa e o branco indica resíduos sem carga. A FIGURA 7 é uma fotografia que mostra modelos de preenchimento do espaço dos módulos 7-10 da fibronectina III, em cada uma de três orientações diferentes. Os quatro módulos 12

ΕΡ 1 266 025 /PT estão marcados. Nesta figura, o azul indica resíduos de carga positiva, o vermelho indica resíduos de carga negativa e o branco indica resíduos sem carga. A FIGURA 8 é uma fotografia que ilustra a formação, sob diferentes condições salinas, de fusões ARN-proteína que incluem domínios de fibronectina de tipo III. A FIGURA 9 é uma série de fotografias que ilustram a selecção de fusões ARN-proteína contendo o domínio de fibronectina de tipo III, medida através da análise do sinal de PCR. A FIGURA 10 é um gráfico que ilustra um aumento na percentagem de ligação de TNF-α durante as selecções aqui descritas, bem como uma comparação entre as selecções de fusões ARN-proteína e proteína livre. A FIGURA 11 é uma série de representações esquemáticas mostrando IgG, 10Fn3, Fn-CHi-CH2-CH3 e Fn-CH2-CH3 (no sentido dos ponteiros do relógio a partir da parte superior esquerda). A FIGURA 12 é uma fotografia que mostra um modelo molecular de Fn-CHi-CH2-CH3 com base em estruturas tridimensionais conhecidas de IgG (cristalografia de raios X) e 10Fn3 (RMN e cristalografia de raios X). A FIGURA 13 é um gráfico que mostra o decurso de tempo de uma selecção de uma fusão exemplar ácido nucleico-proteína baseada em 10Fn3 de ligantes de TNF-α. É mostrada a proporção do banco de fusão ácido nucleico-proteína (losangos vazios) e do banco de proteína livre (círculos vazios) que se liga a TNF-a-Sepharose, e a proporção do banco de proteína livre (círculos a cheio) que se liga a Sepharose não derivada.

As FIGURAS 14 e 15 são gráficos que ilustram a ligação a TNF-α de ligantes Fn de TNF-α. Em particular, estas figuras mostram dados de espectros de massa obtidos a partir de um chip de fusão de 10Fn3 e de um chip de não fusão, respectivamente. 13

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As FIGURAS 16 e 17 são a fosforimagem e o varrimento de fluorescência, respectivamente, de um arranjo de 10Fn3, que ilustra a ligação a TNF-a.

Descrição Detalhada

Os novos imitadores de anticorpos aqui descritos foram desenhados para serem superiores tanto a fragmentos derivados de anticorpos como a estruturas não de anticorpos, por exemplo, as estruturas descritas acima. A principal vantagem destes imitadores de anticorpo sobre os fragmentos de anticorpo é estrutural. Estes esqueletos são derivados de módulos estruturais inteiros, estáveis e solúveis em proteínas de fluidos corporais humanos. Consequentemente, exibem melhores propriedades de dobragem e termostabilidade que os fragmentos de anticorpo, cuja criação envolve a remoção de partes da dobra nativa do anticorpo, expondo frequentemente resíduos de aminoácidos que, num anticorpo intacto, ficariam enterrados num ambiente hidrófobo, tal como uma interface entre domínios variáveis e constantes. A exposição de tais resíduos hidrófobos ao solvente aumenta a probabilidade de agregação.

Adicionalmente, os imitadores de anticorpos aqui descritos não possuem ligações dissulfureto, que foram relatadas como atrasando ou impedindo uma dobragem apropriada dos fragmentos de anticorpo sob certas condições. Uma vez que os presentes esqueletos não se baseiam em dissulfuretos para a estabilidade da dobra nativa, são estáveis sob condições redutoras, ao contrário dos anticorpos e seus fragmentos que se desenrolam após quebra das ligações dissulfureto.

Para além disso, estes esqueletos baseados em fibronectina proporcionam as vantagens funcionais das moléculas de anticorpo. Em particular, apesar do facto do módulo 10Fn3 não ser uma imunoglobulina, a sua dobra global está próxima da da região variável da cadeia pesada da IgG (Figura 2), tornando possível apresentar as três voltas de fibronectina análogas às CDR em orientações relativas semelhantes à dos anticorpos nativos. Devido a esta estrutura, o presente imitador de anticorpo possui 14

ΕΡ 1 266 025 /PT propriedades de ligação ao antigénio que são semelhantes na natureza e afinidade às dos anticorpos, e pode ser empregue uma estratégia de aleatorização e baralhação das voltas in vitro que seja semelhante ao processo de maturação da afinidade dos anticorpos in vivo. São agora descritos abaixo esqueletos baseados em fibronectina exemplares e a sua utilização para identificação, selecção e desenvolvimento de novas proteínas de ligação bem como dos seus ligandos alvo. Estes exemplos são proporcionados com o fim de ilustrar e não de limitar o presente invento.

Motivo Estrutural 10Fn3

Os imitadores de anticorpos do presente invento são baseados na estrutura de um módulo de fibronectina de tipo III (Fn3), um domínio vulgar verificado no sangue de mamífero e em proteínas estruturais. Este domínio ocorre mais de 400 vezes na base de dados de sequências proteicas e estimou-se que ocorre em 2% das proteínas sequenciadas até à data, incluindo fibronectinas, tenascina, proteínas do citosqueleto intracelulares e enzimas procarióticas (Bork e Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 8990, 1992; Bork et ai., Nature Biotech. 15: 553; 1997; Meinke et al., J.

Bacteriol. 175 : 1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265: 15659, 1990). Em particular, estes esqueletos incluem, como moldes, o décimo módulo de Fn3 humano (10Fn3), que compreende 94 resíduos de aminoácidos. A dobragem global deste domínio é intimamente aparentada com a do menor fragmento de anticorpo funcional, a região variável da cadeia pesada, que compreende toda a unidade de reconhecimento do antigénio na IgG de camelo e de lama (Figura 1, 2) . As principais diferenças entre os domínios de camelo e lama e o domínio 10Fn3 são que (i) 10Fn3 possui menos cadeias beta (sete vs. nove) e (ii) as duas folhas beta empacotadas uma contra a outra estão ligadas através de uma ponte dissulfureto nos domínios de camelo e de lama, mas não em 10Fn3 .

As três voltas de 10Fn3 correspondentes às voltas de ligação ao antigénio da cadeia pesada de IgG encontram-se 15

ΕΡ 1 266 025 /PT entre os aminoácidos 21-31, 51-56 e 76-88 (Figura 3) . O comprimento da primeira e da terceira volta, 11 e 12 resíduos, respectivamente, estão dentro do intervalo das correspondentes voltas de reconhecimento do antigénio verificadas nas cadeias pesadas dos anticorpos, isto é, 10-12 e 3-25 resíduos, respectivamente. Assim, uma vez tornadas aleatórias e seleccionadas para elevada afinidade pelo antigénio, estas duas voltas fazem contactos com antigénios equivalentes aos contactos das voltas correspondentes nos anticorpos.

Em contraste, a segunda volta de 10Fn3 tem apenas 6 resíduos de comprimento, enquanto que a volta correspondente nas cadeias pesadas dos anticorpos variam de 16-19 resíduos. Portanto, para optimizar a ligação ao antigénio, a segunda volta de 10Fn3 é de preferência prolongada em 10-13 resíduos (para além de ser tornada aleatória) para se obter a maior flexibilidade e afinidade possíveis na ligação ao antigénio. De facto, em geral, os comprimentos bem como as sequências das voltas semelhantes a CDR do imitador de anticorpo podem ser tornados aleatórios durante a maturação de afinidade in vitro ou in vivo (tal como descrito em mais detalhe abaixo). O domínio de fibronectina de tipo III humano, 10Fn3, redobra-se rapidamente mesmo a baixa temperatura; a sua conformação estrutural foi recuperada dentro de 1 segundo a 5°C. A estabilidade termodinâmica de 10Fn3 é elevada (AGu = 24 kJ/mol = 5,7 kcal/mol), correlacionando-se com a sua elevada temperatura de fusão de 110°C.

Um dos papéis fisiológicos de 10Fn3 é como subunidade da fibronectina, uma glicoproteína que existe numa forma solúvel em fluidos corporais e numa forma insolúvel na matriz extracelular (Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236: 1079, 1994). Um monómero de fibronectina de 220-250 kDa contém 12 módulos de tipo I, dois módulos de tipo II e 17 módulos de fibronectina de tipo III (Potts e Campbell, Curr. Opin. Cell. Biol. 6 : 648, 1994) . Os diferentes módulos de tipo III estão envolvidos na ligação da fibronectina a integrinas, heparina e ao sulfato de condroitina. Verificou-se que 10Fn3 medeia a adesão celular através de um motivo Arg-Gly-Asp (RGD) de 16

ΕΡ 1 266 025 /PT ligação a integrina numa das suas voltas expostas. Foi mostrado que motivos RGD semelhantes estavam envolvidos na ligação a integrina por outras proteínas, tais como o fibrinogénio, o factor de von Wellebrand e a vitronectina (Hynes et al., Cell 69 : 11, 1992). Nenhum outro papel de ligação à matriz ou a células foi descrito para 10Fn3. A observação de que 10Fn3 possui uma actividade apenas ligeiramente mais adesiva que um péptido curto contendo RGD é consistente com a conclusão de que a actividade de ligação a células de 10Fn3 se localiza no péptido RGD em vez de estar distribuída pela estrutura de 10Fn3 (Baron et al., Biochemistry 31: 2068, 1992) . O facto de ser improvável que 10Fn3 sem o motivo RGD se ligue a outras proteínas plasmáticas ou à matriz extracelular torna 10Fn3 um esqueleto útil para substituir anticorpos. Adicionalmente, a presença de 10Fn3 no fibrinogénio natural na corrente sanguínea sugere que seja improvável que 10Fn3 seja ele próprio imunogénico no organismo de origem.

Adicionalmente, determinámos que a estrutura de 10Fn3 possui sequências de volta expostas tolerantes a aleatorização, facilitando a criação de diversos bancos de imitadores de anticorpos. Esta determinação foi feita através da exame da flexibilidade da sequência de 10Fn3. Em particular, a sequência de 10Fn3 humana foi alinhada com as sequências de fibronectinas de outras fontes bem como sequências de proteínas aparentadas (Figura 4) e os resultados deste alinhamento foram mapeados na estrutura tridimensional do domínio 10Fn3 humano (Figura 5). Este alinhamento revelou que a maioria dos resíduos conservados se encontram no núcleo da sanduíche de folhas betas, enquanto que os resíduos altamente variáveis se localizam ao longo das extremidades das folhas beta, incluindo os terminais N e C, nas faces não acessíveis ao solvente de ambas a folhas beta e em três voltas acessíveis ao solvente que servem como voltas hipervariáveis para maturação de afinidade dos imitadores de anticorpos. À luz destes resultados, é improvável que a aleatorização destas três voltas tenha um efeito adverso na dobragem ou estabilidade global da própria estrutura de 10Fn3 . 17

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Para a sequência de 10Fn3 humana, esta análise indica que, no mínimo, os aminoácidos 1-9, 44-50, 61-54, 82-94 (extremidades das folhas beta); 19, 21, 30-46 (par), 79-65 (impar) (faces acessíveis ao solvente de ambas as folhas beta); 21-31, 51-56, 76-88 (voltas acessíveis ao solvente semelhantes a CDR); e 14-16 e 36-45 (outras voltas acessíveis ao solvente e voltas beta) podem ser tornados aleatórios para desenvolver novas ou melhores proteínas de ligação a compostos. Adicionalmente, tal como discutido acima, alterações nos comprimentos de uma ou mais voltas expostas ao solvente podem também estar incluídas em tais métodos de evolução dirigida. Alternativamente, mudanças nas sequências das folhas β podem também ser utilizadas para desenvolver novas proteínas. Estas mutações alteram o esqueleto e alteram deste modo indirectamente a(s) estrutura(s) das voltas. Se for tomada esta abordagem, as mutações não devem saturar a sequência, mas devem em vez disso ser introduzidas poucas mutações. De preferência, não devem ser introduzidas mais de 10 mudanças de aminoácidos, e, de maior preferência, não mais de 3 mudanças de aminoácidos nas sequências das folhas β através desta abordagem.

Fusões de Fibronectina

Os imitadores de anticorpos aqui descritos podem ser fundidos com outros domínios proteicos. Por exemplo, estes imitadores podem ser integrados com a resposta imunitária humana através da fusão da região constante de uma IgG (Fc) com um módulo 10Fn3, de preferência através do terminal C de 10Fn3. A Fc numa tal molécula de fusão 10Fn3-Fc activa o componente do complemento da resposta imunitária e aumenta o valor terapêutico do imitador de anticorpo. De forma semelhante, uma fusão entre 10Fn3 e uma proteína do complemento, tal como Clq, pode ser utilizada para atingir células e uma fusão entre 10Fn3 e uma toxina pode ser utilizada para destruir especificamente células que possuam um determinado antigénio. Adicionalmente, 10Fn3 em qualquer forma pode ser fundido com albumina para aumentar a sua semivida na corrente sanguínea e a sua penetração nos tecidos. Qualquer uma destas fusões pode ser gerada através de técnicas padrão, por exemplo, através de expressão da proteína de fusão a partir de um gene de fusão recombinante 18 ΕΡ 1 266 025 /PT construído utilizando sequências génicas publicamente disponíveis.

Multímeros de Esqueletos de Fibronectina

Para além dos monómeros de fibronectina, qualquer uma das construções de fibronectina aqui descrita pode ser gerada como um dímero ou multímero de imitadores de anticorpo baseados em 10Fn3 como meio de aumentar a valência e assim a avidez de ligação ao antigénio. Tais multímeros podem ser gerados através de ligação covalente entre módulos 10Fn3 individuais, por exemplo, através da imitação da ligação natural de 8Fn3-9Fn3-10Fn3 do C-para-N-terminal ou através da imitação dímeros de anticorpo que são mantidos juntos através das suas regiões constantes. Uma construção 10Fn3-Fc pode ser explorada para conceber dímeros com o esquema geral de 10Fn3-Fc::F c-10Fn3. As ligações modificadas na interface Fc::Fc podem ser covalentes ou não covalentes. Adicionalmente, podem ser utilizados parceiros de dimerização ou multimerização diferentes de Fc em híbridos de 10Fn3 para criar tais estruturas de ordem superior.

Em exemplos particulares, multímeros ligados covalentemente podem ser gerados através da construção de genes de fusão que codificam o multímero ou, alternativamente, através da modificação de codões para resíduos de cisteína em sequências monoméricas e permitindo que ocorra a formação de ligações dissulfureto entre os produtos de expressão. Multímeros ligados não covalentemente podem também ser gerados através de uma variedade de técnicas. Estas incluem a introdução, em sequências monoméricas, de codões correspondentes a resíduos carregados positivamente e/ou negativamente, permitindo que ocorram interacções entre estes resíduos nos produtos de expressão (e portanto entre os monómeros). Esta abordagem pode ser simplificada tirando partido de resíduos com carga naturalmente presentes numa subunidade monomérica, por exemplo, os resíduos carregados negativamente da fibronectina. Outro meio de criação de imitadores de anticorpos ligados não covalentemente é introduzir, no gene do monómero (por exemplo, no terminal amino ou carboxilo), as sequências de codificação para proteínas ou domínios 19 ΕΡ 1 266 025 /PT proteicos que se saiba que interagem. Tais proteínas ou domínios proteicos incluem motivos "coil-coil", motivos de fecho de leucina e qualquer uma das numerosas subunidades proteicas (ou fragmentos destas) que se saiba dirigirem a formação de dímeros ou multímeros de ordem superior.

Moléculas Semelhantes a Fibronectina

Embora 10Fn3 represente um esqueleto preferido para a criação de imitadores de anticorpos, outras moléculas podem ser substituídas por 10Fn3 nas moléculas aqui descritas. Estas incluem, sem limitação, os módulos de fibronectina humanos 1Fn3-9Fn3 e nFn3-17Fn3 bem como módulos de Fn3 aparentados de animais não humanos e procariotas. Adicionalmente, podem também ser utilizados módulos de Fn3 de outras proteínas com homologia de sequência com 10Fn3, tais como tenascinas e undulinas. Módulos de diferentes organismos e de proteínas originais podem ser muito apropriados para diferentes aplicações; por exemplo, no desenho de um imitador de anticorpo, pode ser muito desejável gerar essa proteína a partir uma molécula de fibronectina ou semelhante a fibronectina nativa do organismo para o qual se pretende a molécula terapêutica ou de diagnóstico.

Evolução Dirigida de Proteínas de Ligação Baseadas em Esqueletos

Os imitadores de anticorpo aqui descritos podem ser utilizados em qualquer técnica para desenvolver novas ou melhores proteínas de ligação. Num exemplo particular, o alvo de ligação é imobilizado num suporte sólido, tal como uma resina de coluna ou o poço de uma placa de microtítulo, e o alvo é colocado em contacto com uma biblioteca de proteínas de ligação candidatas baseadas em esqueletos. Uma tal biblioteca pode consistir em clones de 10Fn3 construídos a partir do esqueleto 10Fn3 de tipo selvagem através da aleatorização da sequência e/ou do comprimento das voltas semelhantes a CDR de 10Fn3. Se desejado, esta biblioteca pode ser uma biblioteca de fusões ARN-proteína gerada, por exemplo, através das técnicas descritas em Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700; e Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297-12302, 1997. 20

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Alternativamente, pode ser uma biblioteca de ADN-proteina (por exemplo, tal como descrito em Lohse, "DNA-Protein Fusions and Uses Thereof", USSN 60/110549, USSN 09/459190 e US 99/28472) . A biblioteca de fusões é incubada com o alvo imobilizado, o suporte é lavado para remover ligantes não específicos e os ligantes mais fortes são eluídos sob condições muito rigorosas e sujeitos a PCR para recuperar a informação da sequência ou para criar uma nova biblioteca de ligantes que pode ser utilizada para repetir o processo de selecção, com ou sem mais mutagénese da sequência. Podem ser efectuados vários ciclos de selecção até serem obtidos ligantes de afinidade ao antigénio suficiente.

Num exemplo particular, o esqueleto 10Fn3 pode ser utilizado como alvo de selecção. Por exemplo, se for necessária uma proteína que se ligue a uma sequência peptídica específica apresentada numa volta de dez resíduos, é construído um único clone de 10Fn3 no qual uma das suas voltas foi concebida com o comprimento de dez e para a sequência desejada. O novo clone é expresso in vivo e purificado e depois imobilizado num suporte sólido. Permite-se então que uma biblioteca de fusões ARN-proteína baseada no esqueleto apropriado interaja com o suporte, o qual é então lavado e as moléculas desejadas eluídas e novamente seleccionadas tal como descrito acima.

De forma semelhante, o esqueleto 10Fn3 pode ser utilizado para descobrir proteínas naturais que interajam com a sequência peptídica apresentada numa volta 10Fn3. A proteína 10Fn3 é imobilizada tal como descrito acima e a biblioteca de fusões ARN-proteína é pesquisada quanto a ligantes para a volta apresentada. Os ligantes são enriquecidos através de múltiplos ciclos de selecção e identificados através de sequenciação de ADN.

Adicionalmente, nas abordagens de cima, embora as bibliotecas de ARN-proteína representem bibliotecas exemplares para evolução dirigida, pode ser utilizado qualquer tipo de biblioteca baseada num esqueleto nos métodos de selecção do presente invento. 21

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Utilização

Os imitadores de anticorpos aqui descritos podem ser desenvolvidos para se ligarem a qualquer antigénio de interesse. Estas proteínas possuem propriedades termodinâmicas superiores às dos anticorpos naturais e podem ser desenvolvidas rapidamente in vitro. Assim, estes imitadores de anticorpos podem ser empregues em vez de anticorpos em todas a áreas nas quais são utilizados anticorpos, incluindo nos campos da investigação, da terapêutica e do diagnóstico. Adicionalmente, devido a estes esqueletos possuírem propriedades de solubilidade e estabilidade superiores às dos anticorpos, os imitadores de anticorpos aqui descritos podem também ser utilizados sob condições que destruiriam ou inactivariam as moléculas de anticorpo. Finalmente, como os esqueletos do presente invento podem evoluir para se ligarem a virtualmente qualquer composto, estas moléculas proporcionam proteínas de ligação completamente novas que também encontram utilização nas áreas da investigação, do diagnóstico e da terapêutica.

Resultados Experimentais

As moléculas esqueleto exemplares descritas acima foram geradas e testadas, por exemplo, em protocolos de selecção, tal como se segue.

Construção de uma Biblioteca

Uma biblioteca complexa foi construída a partir de três fragmentos, cada um dos quais continha uma área tornada aleatória correspondente a uma volta semelhante a CDR. Os fragmentos foram designados BC, DE e FG, com base nos nomes das voltas semelhantes a CDR-H contidas neles; para além de 10Fn3 e de uma sequência tornada aleatória, cada um dos fragmentos continha trechos codificando um domínio His6 N-terminal ou uma etiqueta peptídica FLAG C-terminal. Em cada junção entre dois fragmentos (i.e., entre os fragmentos BC e DE ou entre os fragmentos DE e FG) , cada fragmento de ADN continha sequências de reconhecimento para a endonuclease de restrição EarI Tipo IIS. Esta enzima de restrição permitiu a união de fragmentos adjacentes ao mesmo tempo que removia 22 ΕΡ 1 266 025 /PT todas as sequências estranhas não 10Fn3. Permite também uma mistura semelhante a recombinação dos três fragmentos 10Fn3 entre os ciclos de mutagénese e selecção.

Cada fragmento foi montado a partir de dois oligonucleótidos sobreponíveis, que foram primeiro ligados, depois prolongados para formar a forma de ADN de cadeia dupla do fragmento. Os oligonucleótidos que foram utilizados para construir e processar os três fragmentos estão listados abaixo; as espécies "Cimo" e "Baixo" para cada fragmento são os oligonucleótidos que continham toda a sequência de codificação de 10Fn3. Nestas designações de oligonucleótidos "N" indica A, T, C ou G; e "S" indica C ou G.

HfnLBCTop(His): 5'- GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC-3' (SEQID NO: 1)

HfnLBCTop (um terminal N alternativo): 5'- GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC-3' (SEQ ID NO: 2) HFnLBCBot-flag8: 5-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CCC TGT TTC TCC GTA AGT GAT CCT GTA ATA TCT (SNN)7 CCA GCT GAT CAG TAG GCT GGT GGG GGT CGC AGC -3' (SEQ ID NO: 3) HFnBC3’-flag8: 5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CCC TGT TTC TCC GTA AGT GAT CC-3' (SEQ ID NÔ: 4) HFnLDETop: 5'- GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC CTC TTC ACA GGA GGA AAT AGC CCT GTC C-3' (SEQ ID NO: 5) 23

ΕΡ 1 266 025 /PT HFnLDEBot-flag 8: 5-AGC GGATGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CGT ATA ATC AAC TCC AGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AGC TGT (SNN)4 AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT TCC TCC TGT -3' (SEQ Π) NO: 6) HFnDE3'-flag8: 5-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CGT ATA ATC AAC TCC AGG TTT AAG G-3’ (SEQ ID NO: 7) HFnLFGTop: 5'- GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ÀTT ACA ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC CTC TTC TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC-3' (SEQ ID NO: 8) HFnLFGBot-flag8: 5-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT TCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG (SNN)10 AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA -3’ (SEQ ID NO: 9) HFnFG3'-flag8: 5-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT TCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG-3’(SEQ ID NO: 10) T7TMV (introduz o promotor de T7 e a região não traduzida de necessários para a tradução in vitro) : 5’- GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA ITT ACA ATT ACA-3' (SEQ ID NO: 11) ASAflag8: 5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC-3' (SEQ ID NO: 12)

Unispl-s (oligonucleótido de união utilizado para ligar o ARNm ao ligante contendo puromicina, descrito por Roberts et al., 1997, supra): 5i-TTTTTTTTTNAGCGGATGC-3' (SEQ ID NO: 13) A18--2PEG (ligante ADN-puromicina): 5'—(A)18(PEG)2CCPur (SEQ ID NO: 14) 24

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Os pares de oligonucleót idos (500 pmol de cada) foram ligados em 100 μΐ de Tris 7,5 10 mM, NaCl 50 mM durante 10 minutos a 85°C, seguido de um lento arrefecimento (0,5-1 hora) até à temperatura ambiente. Os fragmentos ligados com extremidades salientes de cadeia simples foram então prolongados utilizando 100 U de Klenow (New England Biolabs, Beverly, MA) para cada aliquota de 100 μΐ de oligos ligados, e o tampão feito de 838,5 μΐ de H20, 9 μΐ de Tris 7,5 1 M, 5 μΐ de MgCl2 1 M, 20 μΐ de dNTP 10 mM e 7,5 μΐ de DTT 1 M. As reacções de extensão prosseguiram durante 1 hora a 25°C.

Depois, cada um dos fragmentos de ADN de cadeia dupla foi transformado numa fusão ARN-proteina utilizando a técnica desenvolvida por Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700; e Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297-12302, 1997. Resumidamente, os fragmentos foram transcritos utilizando um estojo de transcrição in vitro Ambion, MEGAshortscript (Ambion, Austin, TX) e a fusão ARNm-ADN-puromicina-proteina resultante foi purificada utilizando Oligo(dT)-celulose e uma cadeia de ADN complementar foi sintetizada utilizando transcritase reversa e os iniciadores RT descritos acima (Unisplint-S ou flagASA), seguindo as instruções do fabricante. A fusão ARN-proteína obtida para cada fragmento foi depois purificada na resina apropriada para a sua etiqueta de purificação peptídica, i.e., em Ni-NTA-agarose para a etiqueta His6 e M2-agarose para a etiqueta FLAG, seguindo o procedimento recomendado pelo fabricante. O componente de ADNc das fusões ARN-proteína que se ligam à etiqueta foi amplificado através de PCR utilizando Pharmacia Ready-to-Go PCR Beads, 10 pmol de iniciadores de PCR 5' e 3' e o seguinte programa de PCR (Pharmacia, Piscataway, NJ) : Passo 1: 95°C durante 3 minutos; Passo 2: 95°C durante 30 segundos, 58/62°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto, 20/25/30 ciclos, conforme necessário; Passo 3: 72°C durante 5 minutos; Passo 4: 4°C até ao final. O ADN amplificado resultante foi clivado com 5 U de EarI (New England Biolabs) por 1 yg de ADN; a reacção ocorreu em Tampão da ADN-ligase T4 (New England Biolabs) a 37°C, durante 25 ΕΡ 1 266 025 /PT 1 hora, e foi seguida por uma incubação a 70 °C durante 15 minutos para inactivar EarI. Quantidades iguais dos fragmentos de ADN BC, DE e FG foram combinadas e ligadas para formar um gene de 10Fn3 inteiro com voltas aleatórias. A ligação requereu 10 U de EarI fresca (New England Biolabs) e 20 U de ADN-ligase T4 (Promega, Madison, WI) e levou 1 hora a 3 7 °C.

Foram feitas três bibliotecas diferentes do modo descrito acima. Cada uma continha a forma da volta FG com 10 resíduos aleatórios. As voltas BC e DE da primeira biblioteca ficaram com a sequência de 10Fn3 de tipo selvagem; uma volta BC com 7 resíduos aleatórios e uma volta DE de tipo selvagem constituíram a segunda biblioteca; e uma volta BC com 7 resíduos aleatórios e uma volta DE com 4 resíduos aleatórios constituíram a terceira biblioteca. A complexidade da volta FG em cada uma destas três bibliotecas foi de 1013; as outras duas voltas aleatórias proporcionaram o potencial para uma complexidade demasiado grande para ser amostrada num laboratório.

As três bibliotecas construídas foram combinadas numa biblioteca principal para simplificar o processo de selecção; esperava-se que a própria ligação ao alvo seleccionasse a biblioteca mais adequada para um determinado confronto. As fusões ARN-proteína foram obtidas a partir da biblioteca principal seguindo o procedimento geral descrito em Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700; e Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297-12302, 1997 (Figura 8).

Selecções das Fusões A biblioteca principal na forma de fusão ARN-proteína foi sujeita a selecção para ligação a TNF-α. Foram empregues dois protocolos: um no qual o alvo foi imobilizado numa coluna de agarose e um no qual o alvo foi imobilizado num chip BIACORE. Primeiro, uma extensa optimização das condições para minimizar os ligantes de fundo à coluna de agarose deu as condições de tampão favoráveis de HEPES 50 mM pH 7,4, Triton a 0,02%, 100 pg/ml de ADN de Esperma de Salmão Fragmentado. Neste tampão, a ligação não específica da fusão 26

ΕΡ 1 266 025 /PT de ARN de 10Fn3 a TNF-a-Sepharose foi de 0,3%. 0 fundo de ligação não especifica de ARN-ADN de 10Fn3 a TNF-a-Sepharose verificou-se ser de 0,1%. Durante cada ciclo de selecção em TNF-a-Sepharose, a biblioteca Profusion™ foi primeiro pré-incubada durante uma hora com Sepharose não derivada para remover quaisquer ligantes não específicos restantes; o produto eluído desta pré-eliminação foi incubado durante mais uma hora com TNF-a-Sepharose.

Durante cada ciclo de selecção em TNF-a-Sepharose, a biblioteca de fusões ARN-proteína foi primeiro incubada durante uma hora com Sepharose não derivada para remover quaisquer ligantes não específicos restantes; o produto eluído desta pré-eliminação foi incubado durante mais uma hora com TNF-a-Sepharose. A TNF-a-Sepharose foi lavada durante 3-30 minutos.

Após cada selecção, o ADNc da fusão ARN-proteína que tinha sido eluído do suporte sólido com NaOH 0,3 M ou KOH 0,1 M foi amplificado por PCR; uma banda de ADN do tamanho esperado persistiu ao longo de múltiplos ciclos de selecção (Figura 9); resultados semelhantes foram observados nos dois protocolos de selecção alternativos e apenas os dados da selecção da coluna de agarose são mostrados na Figura 9.

Nos primeiros sete ciclos, a ligação da biblioteca de fusões ARN-proteína ao alvo permaneceu baixa; em contraste quando a proteína livre foi traduzida a partir de bancos de ADN a diferentes estádios da selecção, a proporção das espécies de ligação à coluna aumentaram significativamente entre os ciclos (Figura 10). Selecções semelhantes podem ser efectuadas com quaisquer outras espécies de alvo de ligação (por exemplo, IL-1 e IL-13).

Estudos Animais 10Fn3 de tipo selvagem contém um motivo tripeptídico de ligação a integrina, Arginina 78-Glicina 79-Aspartato 80 (o "motivo RGD") na ponta da volta FG. Para evitar a ligação a integrina e uma potencial resposta inflamatória baseada neste tripéptido in vivo, foi gerada uma forma mutante de 10Fn3 que 27

ΕΡ 1 266 025 /PT continha uma sequência inerte, Serina 78-Glicina 79-Glutamato 80 (o "mutante SGE") , uma sequência que se verificou no domínio i:lFn3 de tipo selvagem intimamente aparentado. Este mutante SGE foi expresso como uma proteína livre marcada com His6 no terminal N em E. coli e purificada até à homogeneidade numa coluna de quelato metálico seguida de uma coluna de exclusão de tamanho.

Em particular, a sequência de ADN codificando His6-10Fn3(SGE) foi clonada no vector de expressão pET9a e transformada para células BL21 DE3 pLysS. A cultura foi então criada em caldo LB contendo 50 pg/ml de canamicina a 37°C, com agitação, até A560=1 , 0 e foi então induzida com IPTG 0,4 mM. A cultura induzida foi ainda incubada, sob as mesmas condições, de um dia para o outro (14-18 horas); as bactérias foram recuperadas através de centrifugação padrão de baixa velocidade. O sedimento celular foi ressuspenso em 1/50 do volume de cultura original do tampão de lise (Tris 50 mM, NaCl 0,5 M, glicerol a 5%, Triton X-100 a 0,05% e PMSF 1 mM) e as células foram lisadas através da passagem três vezes da pasta resultante através de um Microfluidificador de Microfluidics Corporation M110-EH. O lisado foi clarificado por centrifugação e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,45 μιη seguido de filtração através de um filtro de 0,2 |±m. 100 ml do lisado clarificado foram carregados numa coluna de cobalto Talon de 5 ml (Clontech, Paio Alto, CA) , lavada com 70 ml de tampão de lise, e eluído com um gradiente linear de 0-30 mM de imidazole em tampão de lise. O caudal através da coluna ao longo de todos os passos foi de 1 ml/min. A proteína eluída foi concentrada 10 vezes através de diálise (separação de PM = 3500) contra 15000-20000 PEG. A amostra resultante foi dialisada em tampão 1 (tampão de lise sem o glicerol), depois carregada, 5 ml de cada vez, numa coluna de exclusão de tamanho Sephacryl de 16 χ 60 mm equilibrada em tampão 1. A coluna foi corrida a 0,8 ml/min, em tampão 1; todas as fracções que continham uma proteína do PM esperado foram reunidas, concentradas 10x tal como descrito acima, depois dialisadas para PBS. Utilizou-se Toxikon (MA) para efectuar pesquisas de endotoxinas e estudos animais na amostra resultante. 28

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Nestes estudos animais, os níveis de endotoxina nas amostras examinadas até à data ficaram abaixo do nível de detecção do ensaio. Num estudo de toxicologia preliminar, esta proteína foi injectada em dois ratinhos na dose terapêutica estimada 100x de 2,6 mg/ratinho. Os animais sobreviveram as duas semanas do estudo sem efeitos de doença aparentes. Estes resultados sugerem que 10Fn3 pode ser incorporado com segurança num fármaco IV.

Construções Alternativas para Utilização in vivo

Para prolongar a semivida do domínio 10Fn3 de 8 kDa, foi também construída uma molécula maior que imita os anticorpos naturais. Esta molécula 10Fn3-Fc contém os domínios -CHi-CH2-CH3 (Figura 11) ou -CH2-CH3 domínios da região constante da IgG do hospedeiro; nestas construções, o domínio 10Fn3 é enxertado no terminal N em vez do domínio VH da IgG (Figuras 11 e 12). Espera-se que tais construções semelhantes a anticorpos melhorem a farmacocinética da proteína bem como a sua capacidade para travar a resposta imunitária natural.

Para construir a forma de murídeo do clone de 10Fn3-CHi-CH2-CH3, a região -CHi-CH2-CH3 foi primeiro amplificada a partir de uma biblioteca de ADNc de fígado e baço de ratinho (Clontech), depois ligada no vector pET26b. Os iniciadores utilizados na clonagem foram 5' Fc Nest e 3' 5 Fc Nest e os iniciadores utilizados para enxertar os locais de restrição apropriados nas extremidades da inserção recuperada foram 5' Fc HlII e 3' Fc Nhe: 5' Fc Nest 5'GCG GCA GGG TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG 3' (SEQ ID NO: 15) ; 3' Fc Nest 5'GGG AGG GGT GGA GGT AGG TCA CAG TCC 3' (SEQ ID NO: 16); 3' Fc Nhe 5' TTT GCT AGC TTT ACC AGG AGA GTG GGA GGC 3' (SEQ ID NO: 17); and 5' Fc HlII 5' AAA AAG CTT GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC 3' (SEQ ID NO: 18). É utilizada mais PCR para remover a região CH3 deste clone e criar a parte Fc do clone de 10Fn3-CH2-CH3 mais curto. A sequência codificando 10Fn3 é unida à extremidade 5' de 29 ΕΡ 1 266 025 /PT cada clone; pode ser utilizado tanto o 10Fn3 de tipo selvagem clonado a partir da mesma biblioteca de ADNc de baço de ratinho como um 10Fn3 modificado obtido através de mutagénese ou aleatorização das moléculas. Os oligonucleótidos utilizados na clonagem de 10Fn3 de tipo selvagem de murideo foram:

Mo 5PCR-NdeI: 5' CATATGGTTTCTGATATTCCGAGAGATCTGGAG 3' (SEQ ID NO: 19);

Mo5PCR-His-NdeI (para um terminal N alternativo com o marcador de purificação His6) : 5' CAT ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GTT TCT GAT ATT CCG AGA G 3' (SEQ ID NO: 20); e

Mo3PCR-EcoRI: 5' GAATTCCTATGTTTTATAATTGATGGAAAC3' (SEQ ID NO: 21).

Os equivalentes humanos dos clones são construídos utilizando a mesma estratégia com sequências oligonucleotídicas humanas.

Esqueletos 10Fn3 em Aplicações de Chips de Proteínas A adequação do esqueleto 10Fn3 para aplicações de chips de proteínas é consequência (1) da sua capacidade para suportar muitas funções de ligação que podem ser rapidamente seleccionadas na bancada ou num dispositivo automático, e (2) das suas superiores propriedades biofísicas.

As propriedades de ligação versáteis de 10Fn3 são uma função das voltas apresentadas pela dobra em sanduíche beta de Fn3 semelhante a imunoglobulina. Tal como discutido acima, estas voltas são semelhantes às regiões determinantes de complementaridade dos domínios variáveis dos anticorpos e podem cooperar de um modo semelhante ao das voltas de anticorpo para se ligarem aos antigénios. No nosso sistema, as voltas de 10Fn3 BC (resíduos 21-30), DE (resíduos 51-56) e FG (resíduos 76-87) são tornadas aleatórias na sequência, no comprimento ou tanto na sequência como no comprimento para gerar diversas bibliotecas de fusões ARNm-10Fn3. Os ligantes em tais bibliotecas são então enriquecidos com base na sua 30

ΕΡ 1 266 025 /PT afinidade para um alvo imobilizado ou marcado, até ser gerada uma pequena população de ligantes de elevada afinidade. Também, pode ser empregue PCR sujeita a erros e recombinação para facilitar a maturação de afinidade de ligantes seleccionados. Devido aos rápidos e eficientes protocolos de selecção e maturação de afinidade, ligantes para um grande número de alvos podem ser seleccionados num período curto.

Como esqueleto para ligantes a imobilizar em chips de proteínas, o domínio 10Fn3 tem a vantagem sobre os fragmentos de anticorpos e os anticorpos de cadeia simples de ser menor e mais fácil de manusear. Por exemplo, ao contrário dos esqueletos de cadeia simples ou domínios variáveis isolados de anticorpos, que variam amplamente na sua estabilidade e solubilidade e que requerem um ambiente oxidante para conservar as suas ligações dissulfureto estruturalmente essenciais, 10Fn3 é extremamente estável, com uma temperatura de fusão de 110°C e solubilidade a uma concentração >16 mg/ml. O esqueleto 10Fn3 também não contém dissulfuretos ou cisteínas livres; consequentemente, é insensível ao potencial redox do seu ambiente. Outra vantagem de 10Fn3 é que as suas voltas de ligação ao antigénio e o terminal N estão na extremidade da sanduíche beta oposta ao terminal C; assim a ligação de um esqueleto 10Fn3 a um chip através do seu terminal C alinha as voltas de ligação ao antigénio, permitindo a sua maior acessibilidade à solução a ensaiar. Uma vez que 10Fn3 é um domínio simples de apenas 94 resíduos de aminoácidos, é também possível imobilizá-lo na superfície de um chip a uma densidade superior à utilizada para anticorpos de cadeia simples, com os seus aproximados 250 resíduos. Adicionalmente, a hidrofobicidade do esqueleto 10Fn3, que é reflectida na elevada solubilidade deste domínio, conduz a uma ligação de fundo inferior à média de 10Fn3 a uma superfície de um chip. É provável que a estabilidade do esqueleto 10Fn3 bem como a sua adequação para a formação de bibliotecas e selecção de ligantes sejam partilhadas pela grande classe de domínios proteicos semelhantes a Fn3 com uma dobra semelhante a imunoglobulina, tais como os domínios da tenascina, N-caderina, E-caderina, ICAM, titina, GCSF-R, receptor de citocina, inibidor da glicosidase e cromoproteína 31 ΕΡ 1 266 025 /PT antibiótica. As caracteristicas chave partilhadas por todos estes domínios são uma estrutura estável proporcionada por duas folhas beta, que são empacotadas uma contra a outra e que são unidas através de pelo menos três voltas acessíveis ao solvente por extremidade da folha; tais voltas podem ser tornadas aleatórias para gerar uma biblioteca de potenciais ligantes sem destruir a estrutura do esqueleto (tal como descrito acima).

Imobilização de Ligantes de Esqueleto de Fibronectina (ligantes de Fn)

Para imobilizar ligantes de Fn numa superfície de um chip, podem ser utilizadas várias técnicas exemplares. Por exemplo, os ligantes de Fn podem ser imobilizados como fusões ARN-proteína através de hibridação de Watson-Crick da porção ARN da fusão com um ADN de bases complementares imobilizado na superfície do chip (tal como descrito, por exemplo, em "Addressable Protein Arrays", USSN 60/080686; USSN 09/282734 e WO 99/51773). Alternativamente, os ligantes de Fn podem ser imobilizados como proteínas livres directamente na superfície de um chip. Podem ser utilizados dispositivos manuais bem como robotizados para a deposição dos ligantes de Fn na superfície do chip. Podem ser utilizados robôs de aplicação para a deposição dos ligantes de Fn a elevada densidade num formato de arranjo (por exemplo, através do método de Lueking et al., Anal. Biochem. 270 (1) : 103-11, 15 de Maio de 1999) . Métodos diferentes podem também ser utilizados para ancorar o ligante de Fn à superfície do chip. Podem ser utilizados vários procedimentos de imobilização padrão incluindo os descritos em "Methods in Enzymology", (K. Mosbach e B. Danielsson, eds.), vols. 135 e 136, Academic Press, Orlando, Florida, 1987; Nilsson et al., Protein Expr. Purif. 11(1): 1-16, Out de 1997; e referências aí. A imobilização orientada de ligantes de Fn pode aumentar a capacidade de ligação dos ligantes de Fn ligados no chip. Abordagens exemplares para alcançar uma conjugação orientada estão descritas em Lu et al., The Analyst 121: 29R-32R, 1996; e Turkova, J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. App. 722(1-2): 11-31, 5 de Fev. de 1999. Adicionalmente, qualquer um dos métodos aqui descritos para ancoragem dos ligantes de Fn a superfícies de 32 ΕΡ 1 266 025 /PT chips pode também ser aplicado à imobilização dos ligantes de Fn em contas ou outros suportes.

Captura e Detecção de Proteínas Alvo

Podem ser utilizadas populações seleccionadas de ligantes de Fn para detecção e/ou quantificação de alvos a analisar, por exemplo, em amostras tais como amostras biológicas. Para realizar este tipo de ensaio de diagnóstico, ligantes de Fn seleccionados para alvos de interesse são imobilizados num suporte apropriado para formar chips de proteínas com múltiplas características. A seguir, é aplicada uma amostra no chip e os componentes da amostra que se associam aos ligantes de Fn são identificados com base na especificidade para o alvo dos ligantes imobilizados. Utilizando esta técnica, um ou mais componentes podem ser simultaneamente identificados ou quantificados numa amostra (por exemplo, como meio de realizar um perfil da amostra).

Os métodos para a detecção de alvos permitem a medição dos níveis de alvos proteicos ligados e incluem, sem limitação, radiografia, varrimento de fluorescência, espectroscopia de massa (MS) e ressonância plasmónica de superfície (SPR). A autorradiografia utilizando um sistema de fosforimagiologia (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) pode ser utilizada para detecção e quantificação da proteína alvo que foi marcada radioactivamente, p. ex., utilizando 35S-metionina. O varrimento de fluorescência utilizando um sistema de varrimento por laser (ver abaixo) pode ser utilizado para detecção e quantificação de alvos marcados com fluorescência. Alternativamente, o varrimento de fluorescência pode ser utilizado para a detecção de ligandos marcados com fluorescência que se ligam eles próprios à proteína alvo (p. ex., anticorpos específicos para os alvos marcados com fluorescência ou estreptavidina marcada com fluorescência que se liga a um alvo-biotina, tal como descrito abaixo). A espectroscopia de massa pode ser utilizada para detectar e identificar alvos ligados com base na sua massa molecular. A dessorção da proteína alvo ligada pode ser alcançada com assistência de laser directamente a partir da 33

ΕΡ 1 266 025 /PT superfície do chip tal como descrito abaixo. A detecção da massa permite também determinações, com base na massa molecular, de modificações do alvo incluindo modificações pós-tradução como fosforilação ou glicosilação. A ressonância plasmónica de superfície pode ser utilizada para quantificação de alvos proteicos ligados onde o ligante ou ligantes de Fn são imobilizados numa superfície de ouro adequada (por exemplo, tal como obtido a partir de Biacore, Suécia).

Estão descritos abaixo esquemas exemplificativos para selecção de ligantes de Fn (neste caso, ligantes de Fn específicos para a proteína, TNF-α) e a utilização dessas populações seleccionadas para detecção em chips. Este exemplo é proporcionado com o fim de ilustrar o presente invento e não deve ser entendido como limitante.

Selecção de Ligantes de TNF-α Baseados no Esqueleto 10Fn3

Numa utilização exemplar para selecção de esqueletos de fibronectina em chips, foi efectuada uma selecção baseada em 10Fn3 contra TNF-α, utilizando uma biblioteca de variantes de 10Fn3 humano com voltas aleatórias BC, DE e FG. A biblioteca foi construída a partir de três fragmentos de ADN, cada um dos quais continha sequências nucleotídicas que codificavam aproximadamente um terço dos 10Fn3 humanos, incluindo uma das voltas aleatórias. As sequências de ADN que codificavam os resíduos de volta listados acima foram reconstruídas através de síntese oligonucleotídica, de forma a que os codões para os resíduos de interesse fossem substituídos por (NNS)n, onde N representa qualquer um dos quatro desoxirribonucleótidos (A, C, G ou T) e S representa C ou G. O terminal C de cada fragmento continha a sequência para a etiqueta de purificação FLAG.

Uma vez prolongado pela Klenow, cada fragmento de ADN foi transcrito e o transcrito foi ligado a um ligante de ADN contendo puromicina e traduzido in vitro, tal como descrito por Szostak et al. (Roberts e Szostak, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12297, 1997; Szostak et al., WO 00/47775, Szostak et al., WO 98/31700), para gerar uma fusão ARNm-péptido, que foi então retro-transcrita numa fusão ADN-ARNm-péptido. A ligação 34 ΕΡ 1 266 025 /PT do péptido etiquetado com FLAG a M2-agarose separou as moléculas de fusão inteiras das que continham mudanças de enquadramento ou codões de terminação supérfluos; o ADN associado à fusão inteira purificada foi amplificado por PCR, depois os três fragmentos de ADN foram cortados pela endonuclease de restrição EarI e ligados para formar o molde inteiro. O molde foi transcrito e o transcrito foi ligado a ligantes de ADN contendo puromicina e traduzido para gerar uma biblioteca de fusões 10Fn3-ARN-proteína, que foi então retro-transcrita para produzir a biblioteca de fusões ADN-ARNm-péptido que foi subsequentemente utilizada na selecção. A selecção de ligantes de TNF-α ocorreu em HEPES 50 mM, pH 7,4, Triton-X a 0,02%, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão. A biblioteca de fusões ARN-proteína foi incubada com TNF-α imobilizado em Sepharose; após lavagem, o ADN associado aos ligantes mais fortes foi eluido com KOH 0,1 M, amplificado por PCR e transcrito, e o transcrito foi traduzido, retro-transcrito no material de partida para o próximo ciclo de selecção.

Dez ciclos de tal selecção foram efectuados (tal como mostrado na Figura 13); resultaram num banco de fusões ARN-proteína que se ligou a TNF-a-Sepharose com a Kd média aparente de 120 nM. Os componentes clonais específicos do banco que foram caracterizados mostraram ligação a TNF-α no intervalo de 50-500 nM.

Imobilização de Ligantes de Fn, Captura de Proteínas Alvo e Detecção por MALDI-TOF

Como primeiro passo para a imobilização de ligantes de Fn à superfície de um chip, foi preparada uma sonda oligonucleotídica de captura com um sintetizador de ADN automático (PE BioSystems Expedite 8909) utilizando a abordagem do fosforamidito em suporte sólido. Todos os reagentes foram obtidos em Glen Research. A síntese foi iniciada com um suporte sólido contendo uma ligação dissulfureto para proporcionar eventualmente uma funcionalidade tiol 3'-terminal. Os primeiros quatro monómeros a serem adicionados foram unidades de óxido de hexaetileno, seguidos de 20 monómeros T. O grupo DMT 35

ΕΡ 1 266 025 /PT 5'-terminal foi removido. A sonda de captura foi clivada do suporte sólido e desprotegida com hidróxido de amónio, concentrado até à secura numa centrífuga de vácuo e purificada através de HPLC de fase reversa utilizando um gradiente de acetonitrilo em tampão acetato de trietilamónio. As fracções apropriadas da HPLC foram recolhidas, evaporadas até à secura numa centrífuga de vácuo e o grupo DMT 5'-terminal foi removido através de tratamento com AcOH a 80% durante 30 minutos. O ácido foi removido por evaporação e o oligonucleótido foi então tratado com DTT 100 mM durante 30 minutos para clivar a ligação dissulfureto. O DTT foi removido através de extracção repetida com EtOAc. O oligonucleótido foi precipitado em etanol a partir da camada aquosa restante e verificado quanto à pureza através de HPLC de fase reversa. A sonda de captura 3'-tiol foi ajustada para 250 μΜ em tampão PBS lx desgaseif içado e aplicada como uma única gotícula (75 μΐ) num chip revestido a ouro de 9x9 mm (Biacore) numa câmara passada por árgon contendo uma pequena quantidade de água. Após 18 horas à temperatura ambiente, a solução da sonda de captura foi removida e o chip funcionalizado foi lavado com 50 ml de tampão PBS 1χ (2x durante 15 minutos cada) com agitação suave e depois foi enxaguada com 50 ml de água (2x durante 15 minutos cada) do mesmo modo. O líquido restante foi cuidadosamente removido e os chips funcionalizados foram utilizados imediatamente ou armazenados a 4°C sob árgon.

Cerca de 1 pmol do banco de fusões de 10Fn3 do Ciclo 10 de selecção com TNF-α (acima) foi tratado com ARNase A durante várias horas, ajustado a SSC 5x em 70 μΐ e aplicado num chip de ouro funcionalizado de cima como uma única gotícula. Um dispositivo vedante com um volume de 50 μΐ foi utilizado para selar a mistura de fusão com o chip funcionalizado e o aparelho foi continuamente rodado a 4°C. Após 18 horas o aparelho foi desmontado e o chip de ouro foi lavado com 50 ml de SSC 5x durante 10 minutos com agitação suave. O excesso de líquido foi cuidadosamente removido da superfície do chip e o chip foi desactivado com uma solução de bloqueio (TBS lx + Tween-20 a 0,02% + BSA a 0,25%) durante 36

ΕΡ 1 266 025 /PT 10 minutos a 4°C. O excesso de líquido foi cuidadosamente removido e uma solução contendo 500 pg/ml de TNF-α na mesma solução de bloqueio foi aplicada no chip como uma única gotícula e incubada a 4°C durante duas horas com mistura ocasional da gotícula através de uma pipeta. Após a remoção da solução de ligação, o chip foi lavado durante 5 minutos a 4°C com agitação suave (50 ml de TBS lx + Tween-20 a 0,02%) e depois seco à temperatura ambiente. Um segundo chip foi preparado exactamente tal como descrito acima, excepto que não foi adicionada fusão à mistura de hibridação.

Depois, uma matriz de MALDI-TOF (15 mg/ml de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico em etanol/ácido fórmico a 10% em água 1:1) foi uniformemente aplicada nos chips de ouro com um robô de elevada precisão de 3 eixos (MicroGrid, BioRobotics). Foi utilizada uma ferramenta de 16 pinos para transferir a matriz de uma placa de microtítulo de 384 poços para os chips, produzindo apresentações de 200 micrómetros de diâmetro com um tamanho dos pontos de 600 micrómetros. A regulação do instrumento espectrómetro de massa MALDI-TOF (Voyager DE, PerSeptive Biosystems) foi como se segue: Voltagem de Aceleração = 25 k, Voltagem da Grelha = 92%,

Voltagem do Fio Guia = 0,05%, Atraso = 200 ligado, Potência do Laser = 2400, Porta da Massa Baixa = 1500, Iões Negativos = desligado. Os chips de ouro foram colocados individualmente num base de amostras MALDI modificada para manter o nível do chip igual ao nível da base, permitindo assim uma distância de voo correcta. O monitor vídeo e o sistema de controlo do movimento do instrumento foram utilizados para dirigir o feixe do laser para as apresentações individuais da matriz.

As Figuras 14 e 15 mostram os espectros de massa do chip de fusões 10Fn3 e do chip sem fusões, respectivamente. Em cada caso, foi analisado um pequeno número de apresentações de 200 micrómetros para recolher os espectros, mas a Figura 15 requereu significativamente mais aquisições. O sinal a 17,5 kDa corresponde ao monómero de TNF-a. 37

ΕΡ 1 266 025 /PT

Imobilização do Ligante de Fn, Captura da Proteína Alvo e Detecção de Fluorescência Lâminas de microscópio de vidro de 1x3 polegadas pré-limpas (Goldseal, #3010) foram tratadas com Nanostrip (Cyantek) durante 15 minutos, NaOH aquoso a 10% a 70°C durante 3 minutos, e HC1 aquoso a 1% durante 1 minuto e minuciosamente enxaguadas com água desionizada após cada reagente. As lâminas foram então secas num excicador de vácuo sobre sulfato de cálcio anidrido durante várias horas. Foi preparada uma solução a 1% de aminopropiltrimetoxissilano em acetona a 95%/água a 5% e deixou-se a hidrolisar durante 20 minutos. As lâminas de vidro foram imersas em solução salina hidrolisada durante 5 minutos com agitação suave. O silano em excesso foi removido através da sujeição das lâminas a lavagens de 5 minutos, utilizando porções frescas de acetona a 95%/água a 5% para cada lavagem, com agitação suave. As lâminas foram então curadas através de aquecimento a 110°C durante 20 minutos. As lâminas tratadas com silano foram imersas numa solução a 0,2% preparada de fresco de fenileno-1,4-diisotiocianato em DMF a 90%/piridina a 10% durante duas horas, com agitação suave. As lâminas foram lavadas sequencialmente com DMF a 90%/piridina a 10%, metanol e acetona. Após secagem ao ar, as lâminas funcionalizadas foram armazenadas a 0°C numa excicador de vácuo sobre sulfato de cálcio anidrido. Resultados semelhantes foram obtidos com lâminas amino-reactivas comerciais (3-D Link, Surmodics).

As sondas de captura oligonucleotídicas foram preparadas com um sintetizador de ADN automático (PE BioSystems Expedite 8909) utilizando química de fosforamidito convencional. Todos os reagentes foram de Glen Research. A síntese foi iniciada com um suporte sólido possuindo uma funcionalidade amino protegida ortogonalmente, por meio da qual a amina 3'-terminal não é desmascarada até ao passo final de desprotecção. Os primeiros quatro monómeros a adicionar foram unidades de óxido de hexaetileno, seguidos de quatro monómeros A, G, C e T padrão. Todas as sequências oligo de captura foram clivadas do suporte sólido e desprotegidas com 38

ΕΡ 1 266 025 /PT hidróxido de amónio, concentradas até à secura, precipitadas em etanol e purificadas através de HPLC de fase reversa utilizando um gradiente de acetonitrilo em tampão acetato de trietilamónio. As fracções apropriadas da HPLC foram recolhidas, evaporadas até à secura numa centrífuga de vácuo e depois co-evaporadas com uma porção de água. Os oligos de captura amino-marcados foram ajustados até uma concentração de 250 μΜ em tampão carbonato de sódio 50 mM (pH 9,0) contendo glicerol a 10%. As sondas foram aplicadas sobre a superfície de vidro amino-reactiva em posições definidas num padrão matricial de 5χ5χ6 com um robô de 3 eixos (MicroGrid, BioRobotics). Foi utilizada uma ferramenta de 16 pinos para transferir o líquido de placas de microtítulo de 384 poços, produzindo apresentações de 200 micrómetros com um tamanho dos pontos de 600 micrómetros. Cada sub-grelha de 24 apresentações representa uma única sonda de captura (i.e., 24 pontos duplicados). Os arranjos foram incubados à temperatura ambiente num ambiente saturado de humidade durante 12-18 horas. A reacção de ligação foi terminada através da imersão dos chips em hidróxido de amónio aquoso a 2% durante cinco minutos com agitação suave, seguida de enxaguamento com água destilada (3x durante 5 minutos cada). O arranjo foi finalmente embebido em solução de PBS 10x durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois novamente enxaguado durante 5 minutos em água destilada.

Identificaram-se sequências específicas e termodinamicamente isoenergéticas ao longo do ARNm de 10Fn3 para servirem como pontos de captura para auto-montar e ancorar a proteína 10Fn3. O programa de suporte lógico HybSimulator v4.0 (Advanced Gene Computing Technology, Inc.) facilitou a identificação e análise de potenciais sondas de captura. Seis sondas de captura únicas foram escolhidas e impressas no chip, três das quais são complementares a regiões comuns do ARNm do banco de fusões de 10Fn3 (CP3', CP5' e CPflag). As três sequências restantes (CPnegl, CPneg2 e CPneg3) não são complementares e funcionam em parte como controlos negativos. Cada uma das sondas de captura possui um terminal 3'-amino e quatro unidades espaçadoras de óxido de hexaetileno, tal como descrito acima. A seguinte é uma lista 39

ΕΡ 1 266 025 /PT das sequências das sondas de captura que foram empregues (5 '—>3 ') : CP3': TGTAAATAGTAATTGTCCC (SEQ ID NO: 22) CP5': TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO: 23) CPnegl: CCTGTAGGTGTCCAT (SEQ ID NO: 24) CPflag: CATCGTCCTTGTAGTC (SEQ ID NO: 25) CPneg2: CGTCGTAGGGGTA (SEQ ID NO: 26) CPneg3: CAGGTCTTCTTCAGAGA (SEQ ID NO: 27)

Cerca de 1 pmol do banco de fusões de 10Fn3 do Ciclo 10 da selecção com TNF-α foi ajustado para SSC 5x contendo

Tween-20 a 0,02% e complexo de vanadil-ribonucleótidos 2 mM num volume total de 350 μΐ. Todo o volume foi aplicado no micro-arranjo sob um dispositivo vedante de 400 μΐ e a montagem foi continuamente rodada durante 18 horas à temperatura ambiente. Após hibridação a lâmina foi lavada sequencialmente com porções de 500 ml agitadas de SSC 5x, SSC 2,5χ e SSC lx durante 5 minutos cada. Os vestígios de líquido foram removidos através de centrifugação e a lâmina foi deixada a secar ao ar. TNF-α humano recombinante (500 yg, liofilizado, de

PreproTech) foi tomado em 230 μΐ de PBS lx e dialisado contra 700 ml de PBS lx agitado a 4°C durante 18 horas numa unidade Microdialyzer (3500 MWCO, Pierce). O TNF-α dialisado foi tratado com reagente de biotinilação EZ-Link NHS-LC-LC (20 yg, Pierce) durante 2 horas a 0°C, e novamente dialisado contra 700 ml de PBS lx agitado a 4°C durante 18 horas numa unidade Microdialyzer (3500 MWCO, Pierce). O conjugado resultante foi analisado através de espectrometria de massa MALDI-TOF e verificou-se estar quase completamente funcionalizado com uma única porção de biotina.

Cada um dos processos seguintes foi conduzido a 4°C com rotação ou mistura contínua. A superfície do micro-arranjo de proteínas foi desactivada através de tratamento com TBS lx contendo Tween-20 a 0,02% e BSA a 0,2% (200 μΐ) durante 60 minutos. O TNF-α biotinilado (concentração de 100 nM feita no tampão de desactivação) foi posto em contacto com o micro-arranjo durante 120 minutos. O micro-arranjo foi lavado com 40

ΕΡ 1 266 025 /PT TBS lx contendo Tween-20 a 0,02% (3x 50 ml, 5 minutos cada lavagem). Estreptavidina marcada com fluorescência (2,5 pg/ml de conjugado Alexa 546-estreptavidina de Molecular Probes, feito no tampão de desactivação) foi colocada em contacto com o micro-arranj o durante 60 minutos. 0 micro-arranjo foi lavado com TBS lx contendo Tween-20 a 0,02% (2x 50 ml, 5 minutos cada lavagem) seguido de um enxaguamento de 3 minutos com TBS lx. Os vestígios de líquido foram removidos através de centrifugação e a lâmina foi deixada a secar à temperatura ambiente. O varrimento por laser de fluorescência foi efectuado com um sistema GSI Lumonics ScanArray 5000 utilizando uma resolução de 10 μΜ/pixel e comprimentos de onda de excitação e emissão preestabelecidos para o corante Alexa 546. A análise de fosforimagem foi efectuada com um sistema Molecular Dynamics Storm. O tempo de exposição foi de 48 horas com contacto directo entre o micro-arranjo e o ecrã de armazenamento fósforo. O varrimento de fosforimagem foi efectuado a uma resolução de 50 μΜ e os dados foram extraídos com o suporte lógico ImageQuant v4.3.

As Figuras 16 e 17 são a fosforimagem e o varrimento de fluorescência, respectivamente, do mesmo arranjo. A fosforimagem mostra onde a fusão de 10Fn3 hibridou com base no sinal de 35S-metionina. O varrimento de fluorescência mostra onde o TNF-oí marcado se ligou.

Outras Concretizações

Outras concretizações estão dentro das reivindicações.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Phylos, Inc. <120> "Esqueletos proteicos para imitadores de anticorpos e outras proteínas de ligação" <130> 171-125 <140> EP 01 913 159.8 <141> 2002-09-26 41

ΕΡ 1 266 025 /PT <150> 09/515,260 <151> 2000-02-29 <160> 27 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 122 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ggaattccta atacgactca ctatagggac aattactatt tacaattaca atgcatcacc 60 atcaccatca cgtttctgat gttccgaggg acctggaagt tgttgctgcg acccccacca 120 qc 122

<210> 2 <211> 104 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 ggaattccta atacgactca ctatagggac aattactatt tacaattaca atggtttctg 60 atgttccgag ggacctggaa gttgttgctg cgacccccac cagc 104 <210> 3 <211 > 126 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_ feature <222> (D .. . (126) <223> n = A ,T,C ou <221> misc_ feature <222> (D · · . (126) <223> s = C ou G <400> 3 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtcgctcttc cctgtttctc cgtaagtgat 60 cctgtaatat ctsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnccagctg atcagtaggc tggtgggggt 120 cgcagc 126

<210> 4 <211> 62 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtcgctcttc cctgtttctc cgtaagtgat 60 cc 62 42

ΕΡ 1 266 025 /PT

<210> 5 <211> 99 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 ggaattccta atacgactca ctatagggac aattactatt tacaattaca atgcatcacc 60 atcaccatca cctcttcaca ggaggaaata gccctgtcc 99 <2 10 > 6 <2 11 > 132 <2 12 > ADN <2 13 > Homo sapiens <2 20 > <2 21 > mi sc _feature <2 22 > (D .. (132) <2 23 > n = A, T, C ou <2 21 > mi sc _feature <2 22 > (D ... (132 <2 23 > s = C ou G <4 00 > 6 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtcgctcttc gtataatcaa ctccaggttt 60 aaggccgctg atggtagctg tsnnsnnsnn snnaggcaca gtgaactcct ggacagggct 120 atttcctcct gt 132

<210> 7 <211> 64 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtcgctcttc gtataatcaa ctccaggttt 60 aagg 64

<210> 8 <211> 101 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 ggaattccta atacgactca ctatagggac aattactatt tacaattaca atgcatcacc 60 atcaccatca cctcttctat accatcactg tgtatgctgt c 101

<210> 9 <211> 114 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)...(114)

<223> n = A, T, C ou G 43 ΕΡ 1 266 025 /PT <221> misc_feature <222> (1) .. (114)

<223> s = C ou G <400> 9 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtctgttcgg taattaatgg aaattggsnn 60 snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnagt gacagcatac acagtgatgg tata 114

<210> 10 <211> 57 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtctgttcgg taattaatgg aaattgg 57

<210> 11 <211> 45 <212> ADN <213> fago T7 e vírus do mosaico do tabaco <400> 11 gcgtaatacg actcactata gggacaatta ctatttacaa ttaca 45

<210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Flag <400> 12 agcggatgcc ttgtcgtcgt cgtccttgta gtc 33

<210> 13 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido Splint <221> misc_feature <222> (1)...(19)

<223> n = A,T,C ou G <400> 13 tttttttttn agcggatgc 19

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 44

ΕΡ 1 266 025 /PT <2 2 0 > <223> oligonucleótido ligante <400> 14 aaaaaaaaaa aaaaaaaacc 20 <210 > 15 <211 > 30 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 15 gcggcagggt ttgcttactg gggccaaggg <210 > 16 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 16 gggaggggtg gaggtaggtc acagtcc 27 <210> 17 <211 > 30 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 17 tttgctagct ttaccaggag agtgggaggc <210 > 18 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 18 aaaaagcttg ccaaaacgac acccccatct <210> 19 <211 > 33 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 19 catatggttt ctgatattcc gagagatctg <210 > 20 <211> 43 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 catatgcatc accatcacca tcacgtttct 43

ΕΡ 1 266 025 /PT 45 <210> <211 > <212> <213> 21 30 ADN Mus musculus <400> 21 gaattcctat gttttataat tgatggaaac 30 <210 > 22 <211 > 19 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 22 tgtaaatagt aattgtccc 19 <210 > 23 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 23 tttttttttt tttttttttt 20 <210 > 24 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 24 cctgtacgtg tccat 15 <210 > 25 <211 > 16 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 25 catcgtcctt gtagtc 16 <210> 26 <211 > 13 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 26 cgtcgtaggg gta 13

ΕΡ 1 266 025 /PT <210> 27 <211 > 17 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 27 caggtcttct tcagaga 17 4 6

Lisboa,

Claims (37)

1. ΕΡ 1 266 025 /PT 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Arranjo de proteínas imobilizadas num suporte sólido, compreendendo cada uma das referidas proteínas um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, pelo menos uma folha β tornada aleatória, ou uma combinação destas, e sendo caracterizado pela sua capacidade para se ligar a um composto que não se liga através de uma fibronectina de ocorrência natural correspondente.
2. 2. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido domínio de fibronectina de tipo III é um domínio de fibronectina de tipo III de mamífero.
3. 3. Arranjo de acordo com a reivindicação 2, em que o referido domínio de fibronectina de tipo III é um domínio de fibronectina tipo de III humano.
4. 4. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que cada uma das referidas proteínas compreende o décimo módulo do referido domínio de fibronectina de tipo III (1 2Fn3).
5. 5. Arranjo de acordo com a reivindicação 4, em que a aleatorização de uma, duas ou três voltas resulta na ligação da proteína ao referido composto.
6. 6. Arranjo de acordo com a reivindicação 5, em que a aleatorização das duas voltas resulta na ligação da proteína ao referido composto.
7. 7. Arranjo de acordo com a reivindicação 6, em que a aleatorização das três voltas resulta na ligação da proteína ao referido composto.
8. 8. Arranjo de acordo com a reivindicação 4, em que o referido 2Fn3 está desprovido de um motivo de ligação a integrina. 1 Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que 2 cada uma das referidas proteínas está desprovida de ligações dissulfureto.
9. ΕΡ 1 266 025 /PT 2/5
10. 10. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que cada uma das referidas proteínas é um monómero ou um dímero.
11. 11. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que cada uma das referidas proteínas está covalentemente liqada a um ácido nucleico.
12. 12. Arranjo de acordo com a reivindicação 11, em que o referido ácido nucleico codifica a proteína liqada covalentemente.
13. 13. Arranjo de acordo com a reivindicação 12, em que o referido ácido nucleico é ARN.
14. 14. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido suporte sólido é um chip.
15. 15. Método para identificação de uma proteína que se liga a um composto, compreendendo o referido método: a) colocação do referido composto em contacto com um arranjo de proteínas candidatas imobilizadas num suporte sólido, cada uma das referidas proteínas candidatas compreendendo um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, uma folha β tornada aleatória, ou uma combinação destas, sendo o referido contacto realizado sob condições que permitam a formação do complexo composto-proteína; e b) identificação, a partir do referido complexo, de uma proteína que se ligue ao referido composto.
16. 16. Método para identificação de um composto que se liga a uma proteína, compreendendo a referida proteína um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, pelo menos uma folha β tornada aleatória, ou uma combinação destas, compreendendo o referido método: a) colocação de um arranjo de proteínas imobilizadas num suporte sólido em contacto com um composto candidato, compreendendo cada uma das referidas proteínas um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos uma volta tornada aleatória, uma folha β tornada aleatória, ΕΡ 1 266 025 /PT 3/5 ou uma combinação destas, sendo o referido contacto realizado sob condições que permitam a formação do complexo composto-proteína; e b) identificação, a partir do referido complexo, de um composto que se ligue a uma proteína do arranjo.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda o referido método os passos de: c) aleatorização adicional de uma proteína que se liga ao referido composto no passo (b); d) formação de um arranjo num suporte sólido com as proteínas tornadas mais aleatórias do passo (c); e e) repetição dos passo (a) e (b) utilizando, no passo (a), o arranjo de proteínas tornadas mais aleatórias como o referido arranjo de proteínas candidatas.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16, compreendendo ainda o referido método os passos de: c) modificação do composto que se liga à referida proteína no passo (b); e d) repetição dos passos (a) e (b) utilizando, no passo (a), o referido composto mais modificado como o referido composto candidato.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que o referido suporte sólido é um chip.
20. 20. Método para detecção de um composto numa amostra, compreendendo o referido método: a) colocação de uma amostra em contacto com uma proteína que se liga ao referido composto e que compreende um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos três voltas tornadas aleatórias, sendo o referido contacto realizado sob condições que permitam a formação do complexo composto-proteína; e b) detecção do referido complexo, detectando deste modo o referido composto na referida amostra, ΕΡ 1 266 025 /PT 4/5 em que a referida proteína é imobilizada num suporte sólido, e em que a referida proteína é imobilizada no referido suporte sólido como parte de um arranjo.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o referido suporte sólido é uma conta ou um chip.
22. 22. Método da reivindicação 15, 16 ou 20 em que o referido composto é uma proteína.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 15, 16 ou 20 em que o referido domínio de fibronectina de tipo III é um domínio de fibronectina de tipo III de mamífero.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23 em que o referido domínio de fibronectina de tipo III é um domínio de fibronectina de tipo III humano.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 15, 16 ou 20 em que cada uma das referidas proteínas compreende o décimo módulo do referido domínio de fibronectina de tipo III (10Fn3) .
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a aleatorização das três voltas resulta na ligação da referida proteína ao referido composto.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido 10Fn3 não possui um motivo de ligação a integrina.
28. 28. Método de acordo com a reivindicação 15, 16 ou 20 em que cada uma das referidas proteínas está covalentemente ligada a um ácido nucleico.
29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o referido ácido nucleico codifica a proteína covalentemente ligada.
30. 30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referido ácido nucleico é ARN. ΕΡ 1 266 025 /PT 5/5
31. 31. Método de acordo com a reivindicação 15, 16 ou 20 em que o referido complexo ou o referido composto é detectado através de radiografia, detecção de fluorescência, espectroscopia de massa ou ressonância plasmónica de superfície.
32. 32. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida proteína contendo o domínio de fibronectina de tipo III possui pelo menos uma mutação na folha β.
33. 33. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida proteína contendo o domínio de fibronectina de tipo III possui pelo menos uma volta tornada aleatória.
34. 34. Arranjo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida proteína contendo o domínio de fibronectina de tipo III possui pelo menos três voltas alteradas.
35. 35. Arranjo de acordo com a reivindicação 34 ou método de acordo com a reivindicação 20, em que as referidas três voltas são as voltas BC, DE, FG do domínio de fibronectina de tipo III.
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a referida proteína contendo o domínio de fibronectina de tipo III possui pelo menos uma mutação na folha β.
37. 37. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a referida proteína contendo o domínio de fibronectina de tipo III possui pelo menos uma volta tornada aleatória. Lisboa,