ES2903029T3 - La inhibición de DICKKOPF2 (DKK2) suprime la formación de tumores - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un anticuerpo de depleción y neutralizante de Dickkopf2 (DKK2) que se une específicamente a un epítopo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 5 y 7, donde el anticuerpo es: (i) anticuerpo monoclonal YAL008-5-1A10 (SEQ ID NOs 8 y 9), YAL008-7-1A10 (SEQ ID NO 12 y 13), YAL008-1- 5F8 (SEQ ID NO 10 y 11) o 1A10 (SEQ ID NO 9 y 11); o; (ii) un anticuerpo sintético que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO 8 y 9, o las SEQ ID NO 12 y 13, o las SEQ ID NO 10 y 11; o (iii) una versión humanizada o humana del anticuerpo monoclonal de (i); o (iv) un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal de (i) tal como un fragmento de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

Description

DESCRIPCIÓN

La inhibición de Dickkopf2 (DKK2) suprime la formación de tumores

Referenciacruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N.° 62/020.684, presentada el 3 de julio de 2014.

DECLARACIÓN SOBRE LA INVESTIGACIÓN O EL DESARROLLO PATROCINADOS POR VÍA FEDERAL

La presente invención fue realizada con el apoyo del gobierno con la beca n.° CA132317 concedida por el National Institute of Health. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

El cáncer es un problema de salud importante en todo el mundo. Cada año, a decenas de millones de personas se les diagnostica cáncer en todo el mundo, y más de la mitad de los pacientes finalmente mueren a causa de él. Aproximadamente la mitad de todos los hombres y un tercio de todas las mujeres en los EE.UU. serán diagnosticados con cáncer en algún momento de su vida, y una de cada cuatro muertes es causada por cáncer (Jemal et al., CA Cancer J. Clin., 2002, 52:23-47; Howlader et al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010, National Cancer Institute). Los cánceres humanos más comúnmente identificados incluyen los que surgen de órganos y tejidos sólidos, por ejemplo, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer de próstata y cáncer de endometrio. El cáncer de colon afecta a 1 de cada 20 personas en los hemisferios occidentales (Henderson, Nature Cell Biology, 2000, 2(9): págs. 653-60). A nivel mundial, cada año 1 millón de nuevos pacientes son diagnosticados con cáncer de colon y la mitad de ellos sucumben a esta enfermedad (Liu et al., Cell, 2002, 108(6): págs. 837-47).

En las últimas décadas se han producido avances notables en el tratamiento y el diagnóstico del cáncer. Las opciones de tratamiento para el cáncer incluyen cirugía, quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia. El tratamiento de inmunoterapia más reciente, con el objetivo de estimular el sistema inmunitario, particularmente ha atraído muchas investigaciones. Aunque la inmunoterapia podría ser muy eficaz, solo pequeños subgrupos de pacientes, independientemente del órgano de origen del tumor, generalmente responden a la terapia. Claramente, se necesitan nuevos hallazgos en este campo para mejorar la eficacia y la especificidad de la inmunoterapia.

La señalización Wnt controla una amplia variedad de procesos celulares, incluida la determinación del destino celular, la diferenciación, la polaridad, la proliferación y la migración. La familia Wnt de proteínas secretadas se une a varias clases de receptores, como las proteínas 5 y 6 (LRP5/6) relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP), lo que da como resultado la activación de varias cascadas de señalización intracelular diferentes, incluyendo las vías Wnt/p-catenina, Wnt/calcio y Wnt/Jnk. La unión de Wnts a LRP5/6 activa específicamente la vía Wnt/pcatenina al bloquear la función de un complejo multiproteico que prepara a la p-catenina para la degradación, resultando en la acumulación de p-catenina en el citoplasma y el núcleo. La p-catenina nuclear forma complejos con miembros de la familia de factores de transcripción Lef/TCF y activa la expresión génica.

Los estados patológicos que pueden surgir de la función alterada de las células madre, como enfermedades degenerativas y cáncer, se asocian con frecuencia con cambios en la actividad de la vía Wnt/p-catenina. De hecho, se cree que la hiperactivación de la vía Wnt/p-catenina induce la senescencia prematura de las células madre y la pérdida de la función de las células madre relacionada con la edad (Brack et al, Science, 2007, Vol. 317 n.° 5839 págs.

807-810; Liu et al., Science, 2007, Vol. 317 n.° 5839 págs. 803-806). En el cáncer, la hiperactivación de la vía Wnt/pcatenina, a menudo junto con mutaciones en otros genes reguladores del crecimiento celular, puede conducir a un crecimiento celular anómalo (Reya y Clevers, Nature, 2005, 434(7035):843-50). Por lo tanto, muchas investigaciones en curso se centran en la vía Wnt/p-catenina como una posible diana terapéutica en el cáncer (Breuhahn et al, Oncogene, 2006, 25: 3787-3800; Greten et al., Br J Cancer, 2009, 100: 19-23). Particularmente, varios estudios de investigación, incluidos proyectos de secuenciación genómica del cáncer, revelaron que más del 80 % de los cánceres de colon albergan una mutación o incluso una pérdida del gen de poliposis adenomatosa del colon (APC, por sus siglas en inglés), un supresor principal de la vía Wnt/p-catenina (Kinzler y Vogelstein, Cell. 1996, 18 de octubre;87(2): 159-70. Review; Sjoblom et al., Science, 2006, 13 de octubre;314(5797):268-74; Mann et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 1999. 96(4): págs. 1603-8). La APC y proteínas como GSK3p y Axina forman un complejo que marca la pcatenina para su degradación. Las mutaciones en APC interrumpen este complejo y conducen a niveles aumentados de p-catenina citoplasmática y su translocación nuclear. Dado que la p-catenina es el adaptador más importante de la señalización de Wnt, promueve la expresión de factores oncogénicos en respuesta a los ligandos de Wnt.

La señalización de Wnt también está regulada por varios antagonistas de polipéptidos secretados. Estos incluyen cuatro proteínas Dickkopf (Dkk) secretadas (Monaghan et al., Mech Dev, 1999. 87: 45-56; Krupnik et al., Gene, 1999.

238: 301-13). Entre estas cuatro proteínas Dkk, se ha demostrado que DKK1, 2 y 4 son antagonistas eficaces de la señalización canónica de Wnt (Mao et al., Nature, 2001.411: 321-5; Semenov et al., Curr Biol, 2001. 11: 951-61; Bafico et al., Nat Cell Biol, 2001. 3: 683-6; Niehrs, Nature, 2006. 25: 7469-81) uniéndose directamente al correceptor Wnt LRP 5/6 con afinidades altas (Mao et al., Nature, 2001.411: 321-5; Semenov et al., Curr Biol, 2001. 11: 951-61; Bafico et al., Nat Cell Biol, 2001. 3: 683-6). Si bien se informa de que DKK1 juega un papel crucial en la formación de la cabeza y el corazón en el desarrollo de los vertebrados (Niida et al., Oncogene, 2004, 4 de noviembre; 23(52):8520-6), Dkk2 no parece desempeñar funciones corticales en el desarrollo de los vertebrados. Los ratones que carecen de Dkk2 tienen niveles más bajos de glucosa en sangre (Li et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 2012. 109: 11402-7), masa ósea reducida (Li et al., Nat Genet, 2005. 37: 945-52) y epitelios de la superficie ocular defectuosos (Gage et al., Dev Biol, 2008. 317: 310-24; Mukhopadhyay et al., Development, 2006. 133: 2149-54). Dado que las proteínas DKK son antagonistas de Wnt, la sabiduría convencional es que la inactivación de DKK aumentaría la actividad de Wnt y, por lo tanto, aceleraría la formación de cáncer. Sin embargo, su papel en la formación del cáncer no se ha investigado directamente.

Las moléculas Dkk contienen dos dominios ricos en cisteína conservados (Niehrs, Nature, 2006. 25: 7469-81). Anteriormente, se demostró que los segundos dominios ricos en Cys de DKK1 y DKK2 desempeñaban un papel más importante en la inhibición de la señalización canónica de Wnt (Li et al., J Biol Chem, 2002. 277: 5977-81; Brott y Sokol Mol. Cell. Biol., 2002. 22: 6100-10). Más recientemente, se resolvió la estructura del segundo dominio rico en Cys de DKK2 y se delinearon los restos de aminoácidos en el dominio que se requieren para la interacción de DKK con LRP5/6 y los de Kremens (Chen et al., J Biol Chem, 2008. 283: 23364-70; Wang et al., J Biol Chem, 2008. 283: 23371-5). La interacción de Dkk con LRP5/6 subyace al mecanismo principal de inhibición de Wnt mediada por Dkk. Aunque la interacción de Dkk con Kremen, también una proteína transmembrana, se demostró que facilita el antagonismo de Dkk de la señalización Wnt, esta interacción puede tener otras funciones sin resolver. La mutagénesis de exploración de Ala identificó restos de aminoácidos en el tercer dominio repetido YWTD de LRP5 como importantes para la unión a DKK1 y DKK2 (Zhang et al., Mol. Cell. Biol., 2004. 24: 4677-84). Estos resultados han sido confirmados por los estudios estructurales de un tercer y cuarto complejo de dominio de repetición YWTD DKK1/LRP6 (Cheng et al., Nat Struct Mol Biol, 2011. 18: 1204-10; Chen et al., Dev Cell, 2011. 21: 848-61; Ahn et al.,. Dev Cell, 2011. 21: 862-73. ; Bourhis et al., Structure, 2011. 19: 1433-42). Uno de los estudios estructurales también reveló un segundo sitio de interacción DKK-LRP entre el extremo N-terminal de DKK y el primer dominio repetido YWTD de LRP (Bourhis et al., Structure, 2011. 19: 1433-42).

Hauer, K. et al. (Cancer Res. Vol. 7, 2012, págs. 967-77) enseña que DKK2 media la osteólisis, invasividad y diseminación metastásica en el sarcoma de Ewing. El documento WO 00/06714 se refiere a un polipéptido DDKh-3, así como a anticuerpos específicos de DDKh-3. El documento US 2013/309250 se refiere a un método para inmunoterapia de un sujeto que padece cáncer, comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que inhibe la señalización de la vía de señalización de PD-1/PD-L1. Honggryeol, P. et al. (Angiogenesis Vol. 17, 2013, p. 221-34) informa sobre distintas funciones de DKK1 y DKK2 en la angiogénesis tumoral. Li, Q., et al. (FEBS Lett. Vol. 587, 2013, págs. 1742-8) enseña que el microARN-222 promueve la tumorigénesis dirigiéndose a DKK2 y activando la vía de señalización de Wnt/[beta]-catenina. Yaganida, A. et al. (Biochim Biophys. Acta Vol. 1812, 2011, págs. 1403-11) desvela que la regulación negativa del antagonista de Wnt Dkk2 vincula la pérdida de Sept4 y la transformación miofibroblástica de las células estrelladas hepáticas. Sato, H. et al. (Carcinogenesis Vol. 28, 2007, págs. 2459-66) informa sobre una inactivación epigenética frecuente de genes de la familia DICKKOPF en tumores gastrointestinales humanos. Song, Y. et al. (Society for Neuroscience & 39th Annual meeting of ~, Vol 39, 2009, "Neuroprotective role of Dickkopf2 (Dkk2) in the endothelial cells after the cerebral ischemia") desvela un papel neuroprotector de Dickkopf2 (Dkk2) en las células endoteliales después de la isquemia cerebral. Min, J. et al. (J. Clin. Invest. Vol. 121, 2011, págs. 1882-93) enseña que el antagonista de WNT Dickkopf2 promueve la angiogénesis en células endoteliales humanas y de roedores. Ying, Y. y Tao, Q. (Epigenetics Vol. 4, 20019, págs. 307-12) informa sobre la alteración epigenética de la vía de señalización de WNT/p-catenina en cánceres humanos. Saif, M.W. (Cancer management and Research Vol. 5, 2013, págs. 103-15) analiza el papel de los agentes anti-VEGF en el cáncer colorrectal metastásico (mCRC).

Aunque la señalización de Wnt se descubrió inicialmente por su papel en el desarrollo embrionario temprano y por su promoción de la tumorigénesis, estudios recientes han revelado que desempeña un papel importante en una amplia gama de procesos biológicos. La presente invención se obtiene del descubrimiento inesperado de un papel de un antagonista de Wnt, contra la sabiduría convencional, en la promoción de tumores. La neutralización de este inhibidor de Wnt, que daría lugar a la alteración de la señalización Wnt, inhibe la formación de tumores probablemente modulando el microambiente inmunológico del tumor. Claramente existe la necesidad de nuevas formas de disminuir la proliferación de células cancerosas, para desencadenar la muerte de las células cancerosas y para tratar el cáncer. La presente invención satisface esta necesidad. Además, la presente invención satisface la necesidad de mejorar la inmunoterapia contra el cáncer y el diagnóstico del cáncer.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para tratar un cáncer en un sujeto mamífero que lo necesita, como se describe adicionalmente a continuación. El tratamiento de un cáncer que expresa DKK2 comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente agotante de Dickkopf2 (DKK2) en un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde el agente reductor de DKK2 es un anticuerpo como se especifica adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas.

El tratamiento puede implicar la reducción de la angiogénesis tumoral asociada con el cáncer en un sujeto que lo necesite.

La invención incluye una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa DKK2 en un sujeto mamífero, en el que la composición farmacéutica comprende un anticuerpo neutralizante y agotador de DKK2 como se define en las reivindicaciones y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, la invención proporciona los anticuerpos tal como se definen en las reivindicaciones para su uso en un método de tratamiento del cáncer estimulando en un sujeto mamífero una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+ (Cytotoxic T Lymphocyte, CTL) contra el cáncer.

Además, la invención incluye una composición que comprende un anticuerpo neutralizante de DKK2 que se une a un epítopo de DKK2 que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 5 y 7 tal como se definen con más detalle en las reivindicaciones.

En otro aspecto más, la invención incluye un kit para diagnosticar un cáncer que expresa DKK2 o una predisposición a desarrollar dicho cáncer o una metástasis del mismo en un sujeto mamífero. El kit comprende un anticuerpo neutralizante de DKK2 como se define en las reivindicaciones como reactivo para detectar una proteína DKK2.

En algunas realizaciones, el cáncer comprende un tumor que comprende células que expresan una mutación de poliposis adenomatosa del colon (Adenomatosis Polyposis Coli, APC). En la presente invención, el agente reductor de DKK2 es un anticuerpo de DKK2 como se define en las reivindicaciones que posee actividad neutralizante. En algunas realizaciones, el anticuerpo de DKK2 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, anticuerpo sintético, anticuerpo humano, fragmento biológicamente activo de un anticuerpo como se especifica en las reivindicaciones. En la presente invención, el anticuerpo de DKK2 se dirige a un epítopo neutralizante de DDK2 que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 5 y 7. En realizaciones adicionales, el anticuerpo de DKK2 es un anticuerpo sintético que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en YAL008-5-1A10 (SEQ ID NO 8 y 9), YAL008-7-1A10 (SEQ ID NO 12 y 13) y YAL008-1-5F8 (SEQ ID NO 10 y 11).

En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer intestinal, cáncer de páncreas y cáncer de esófago.

En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender además administrar al sujeto un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente de anti-proliferación celular, un agente inmunoterapéutico y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente adicional es un anticuerpo de muerte celular programada 1 (PD-1). En otras realizaciones, el agente reductor de DKK2 y el agente adicional deben coadministrarse al sujeto mamífero. En otras realizaciones más, el agente reductor de DKK2 y el agente adicional se coformulan y se coadministran al sujeto mamífero.

En algunas realizaciones, la vía de administración se selecciona del grupo que consiste en inhalación, oral, rectal, vaginal, parenteral, tópica, transdérmica, pulmonar, intranasal, bucal, oftálmica, intratecal y cualquier combinación de las mismas.

En el contexto de la presente invención, el nivel de expresión del gen DKK2 en la muestra biológica del sujeto es al menos un 10% mayor que el nivel de control normal. El nivel de expresión se determina mediante un método seleccionado del grupo que consiste en detectar el ARNm del gen, detectar una proteína codificada por el gen y detectar una actividad biológica de la proteína codificada por el gen.

En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

En realizaciones adicionales, el reactivo del kit de la presente invención comprende un anticuerpo neutralizante de DKK2 que se une específicamente a un epítopo de DKK2 que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 5 y 7 como se especifica en el

OTROS ELEMENTOS DESVELADOS PERO NO REIVINDICADOS

Se desvela un método para diagnosticar un cáncer que expresa DKK2 o una predisposición a desarrollar dicho cáncer en un sujeto mamífero. El método comprende determinar el nivel de expresión de un gen DKK2 en una muestra biológica del sujeto, donde un aumento en el nivel de expresión de DKK2 en la muestra biológica del sujeto en comparación con el nivel de expresión de DKK2 en una muestra biológica de control de un sujeto que no tiene cáncer es una indicación de que el sujeto tiene cáncer o predisposición a desarrollar un cáncer, y donde cuando se detecta un cáncer o una predisposición a desarrollar un cáncer en un sujeto, se recomienda un tratamiento para el sujeto. Se describe además un método para determinar la eficacia de un tratamiento para el cáncer en un sujeto que lo necesite. El método comprende determinar el nivel de expresión del gen DKK2 en una muestra biológica del sujeto, donde un aumento en el nivel de expresión de DKK2 en la muestra biológica del sujeto en comparación con el nivel de expresión de DKK2 en una muestra biológica de control de un sujeto que no tiene cáncer es una indicación de que el tratamiento es eficaz, y donde cuando el tratamiento se determina que es eficaz recomendando un tratamiento adicional para el sujeto. El tratamiento puede comprender al menos uno seleccionado del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y terapia con vacunas contra el cáncer.

Breve descripción de los dibujos

A fin de ilustrar la invención, se representan en los dibujos ciertas realizaciones de la invención.

Las Figs. 1A-1C son una serie de histogramas e imágenes que ilustran la disminución de la carga tumoral en ratones APCKO (APCminDKK2_/'). Se alojaron ratones compañeros de camada (machos) en un vivero SPF durante 18 semanas con una dieta de pienso regular. Fig. 1A: tumor/número de pólipo. Fig. 1B: tumor/tamaño de pólipo: Los tumores APCKO tienden a ser más pequeños que los de los ratones a Pc . Fig. 1C: La tinción representativa de H y E revela tumores más pequeños y menos frecuentes en ratones APCKO.

Las Fig. 2A-2B son histogramas que demuestran que DKK2 no regula la proliferación en células MC38. Fig. 2A: Se sembraron en placa 50K células. Después de la inanición de suero durante la noche, se añadió DKK2 recombinante (r) al medio. 24 horas después, la proliferación se midió usando un kit ATPlite. Fig. 2B: En un entorno similar, las células se recolectaron y contaron usando un hemocitómetro. Ambos experimentos n = 3, P>0,05

Las Fig. 3A-3B son gráficos que representan el análisis de citometría de flujo de CTL de pólipos (Fig. 3A) y placas de Peyer (PP) (Fig. 3B) de ratones APC o APCKO de 18 semanas de vida. CD69 y Granzima B (Gz Mb ) son marcadores de activación de CTL (linfocitos T citotóxicos). Este análisis destaca que la inactivación de DKK2 conduce a la hiperactivación de CTL CD8+ en pólipos y PP. Las PP son ganglios linfáticos intestinales

La Fig. 4 es una serie de gráficos e histogramas que ilustran el aumento de la expresión de granzima B (gzmb) por células CD8 de placas de Peyer de ratones APCKO a las 11 semanas, a las que los pólipos son apenas visibles. APC y APKCKO son compañeros de jaula/camada.

La Fig. 5 es una serie de imágenes que demuestran la relación y consistencia entre tumores nulos para DKK2, la hiperactivación de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y el aumento de la apoptosis. Las células epiteliales del intestino se tiñeron mediante marcaje de extremos de mella de dUTP de desoxinucleotidil transferasa (TUNEL).

Las Fig. 6A y 6B son gráficos que ilustran que la DKK2 producida por células no hematopoyéticas contribuye en gran medida a los aumentos en la expresión de GZMB en células CD8. Los ratones compañeros de jaula TS y Ko (DKK2-/-) (Fig. 6A) y APC y APCKO (Fig. 6B) se irradiaron letalmente y se trasplantaron con células de médula ósea TS CD45.1. Los ratones se trataron con sulfatrim durante 4 semanas. 8 semanas después de la irradiación, fueron sacrificados y sus PP se recolectaron y analizaron para determinar la expresión de GZMB usando citometría de flujo. Se observó un aumento de la expresión de GZMB en células CD8 trasplantadas en ratones DKK Ko independientemente del estado de APC.

La Fig. 7 es una serie de gráficos que demuestran que la deleción de DKK2 en las células epiteliales da como resultado una mayor activación de las células CD8 de las placas de Peyer (PP) de los ratones APC. Los compañeros de jaula y de camada fueron tratados con tamoxifeno a las 5 semanas de edad. Se estudiaron ratones de 11 semanas de edad para las células CD8. Se detecta un aumento de la expresión de gzmb y CD69 en PP de muestras de ratones APC que carecen de DKK2 en células epiteliales.

Las Fig. 8A-8B son una serie de histogramas que ilustran dos clones de anticuerpos DKK2 YAL008-1-5F8 (5F8) y YAL008-5-1A10 (1A10). Fig. 8A: ELISA que muestra 5F8 y 1A10 que reconocen rDKK2 (3 nM), pero no rDKM. Fig. 8B: Las funciones inhibidoras de Wnt de DKK2 se invierten mediante 1A10 y 5F8 en un ensayo indicador de Wnt en células 293T, 24 horas.

Las Fig. 9A-9C ilustran la neutralización de DKK2 a través de un nuevo Ab a-DKK2 (5F8 = YAL008-1-5F8 y 1A10 = YAL008-5-1A10) da como resultado una reducción significativa en la carga tumoral de ratones APCmin. Se trataron ratones APC de 8 semanas de vida con 200 ug de 5F8, 1A10 e IgG durante 8 semanas cada 72 horas. La carga tumoral se midió mediante tinción con azul de metileno del intestino fijado con formalina. Tanto el número de tumores (Fig. 9A) como el volumen del tumor (Fig. 9B) son menores en los ratones tratados con ab a-Dkk2 (anticuerpo, ab). No hay diferencias significativas en el peso corporal (Fig. 9C). n=5, *P<0,05.

La Fig. 10 es una serie de gráficos e histogramas que demuestran que el anticuerpo anti-DKK2 aumenta la activación de CTL en las placas de Peyer (PP). n=5, *P<0,05

La Fig. 11 es una tabla que enumera los antígenos utilizados para inmunizar ratones y sus secuencias. Dos anticuerpos principales fueron de particular interés (marcados con un * o **): El anticuerpo YAL008-1-5F8, contra el antígeno YAL008-1 (SEQ ID NO 1), muestra la mayor afinidad por la proteína DKK2 de longitud completa y se caracterizó además por la actividad de neutralización. El anticuerpo YAL008-5-1A10, contra el antígeno YAL008-5 (SEQ ID NO 5) y el anticuerpo YAL008-7-1A10, contra el antígeno YAL008-7 (SEQ ID NO 7) reconoce la proteína DKK2 de longitud completa y tiene actividad de neutralización. Los anticuerpos fueron generados a partir de péptidos sintéticos por AbMax (AbMax Biotechnology Co., Ltd., China). Mientras que YAL008-5-1A10 y YAL008-7-1A10 se hicieron a partir de una secuencia idéntica tanto en DKK2 humano como en ratón, YAL008-1-5F8 está hecho de una secuencia humana, que tiene dos restos diferentes al del ratón. YAL008-1-5F8 todavía presenta una buena reacción cruzada con la proteína DKK2 de ratón. Las afinidades de ambos anticuerpos por la proteína DKK2 de ratón están en un intervalo de 0,1-1 nM según el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). El signo "#" indica el resto de cisteína añadido para la conjugación. Las secuencias de aminoácidos de las CDR para YAL008-1-5F8, YAL008-5-1A10 y YAL008-7-1A10 (Se Q ID NO: 8-13) también se enumeran debajo de la tabla.

La Fig. 12 es una imagen que ilustra un mecanismo propuesto de interacción DKK - ectodominio LRP6. En esta representación se muestran las cuatro hélices beta del ectodominio LRP6. Se muestran DKK (incluido el péptido N-terminal y DKK1C). Los antígenos para los anticuerpos neutralizantes Dkk2 de YAL008-1-5F8 (5F8) y YAL008-5-1A10 (1A10) se indican con flechas.

Las Fig. 13A-13B son series de gráficos e imágenes que muestran que la neutralización de DKK2 reduce la carga tumoral acompañada de aumentos en las células positivas para Granzima B y muerte de las células tumorales en un modelo de aloinjerto tumoral. Se injertaron células de cáncer de colon de ratón (MC38) por vía subcutánea a ratones C57BL inmunocompetentes y se trataron con el anticuerpo anti-DKK2 (5F8 = YAL-008-1-5F8) comenzando 6 días después del injerto. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral (Fig. 13A) y la inmunotinción de secciones tumorales para células apoptóticas y células positivas para Granzima B (Fig. 13B). n=5

La Fig. 14 es una serie de histogramas que muestran que el anticuerpo anti-DKK2 neutralizante aumenta los linfocitos citolíticos naturales y CD8 positivas para Granzima B. El análisis de citometría de flujo de las células en los tumores de aloinjerto de la Fig.13 revela que la neutralización de DKK2 no afectó al número de células hematopoyéticas CD45, linfocitos citolíticos naturales o células CD8+, pero aumenta el porcentaje de células hematopoyéticas positivas para Granzima B, linfocitos citolíticos naturales y células CD8+ en los tumores. n=5

La Fig. 15 es una serie de gráficos que demuestran que la neutralización de DKK2 retarda la progresión del tumor de una manera dependiente de la dosis en un régimen de tratamiento a más largo plazo. 5F8 = YAL-008-1-5F8

La Fig. 16 es una serie de histogramas e imágenes que muestran que el análisis de inmunotinción de los tumores de la Fig. 15 confirma que la neutralización de DKK2 aumenta las células positivas para GZMB y la muerte de las células tumorales. Esta figura también revela que el tratamiento más prolongado del anticuerpo neutralizante DKK2 induce efectos antitumorales secundarios que incluyen un aumento en el número de células CD8 y disminuciones en la angiogénesis tumoral y la proliferación de células tumorales.

La Fig. 17 es una serie de gráficos e histogramas que muestran que la reducción en la expresión de DKK2 en las células tumorales retarda la progresión del tumor acompañada de aumentos en las células positivas para GZMB y muerte de las células tumorales. La expresión de DKK2 en MC38 fue silenciada por ARNhc y las células MC38 que expresan un nivel más bajo de DKK2 formaron tumores más pequeños en un modelo de aloinjerto. De acuerdo con el mecanismo de acción eludido en los experimentos anteriores, la expresión reducida de DKK2 se correlacionó con aumentos en la muerte de células tumorales y células positivas para Granzima B.

La Fig. 18 es una serie de gráficos e histogramas que muestran que la inactivación de DKK2 del hospedador también retarda la progresión del tumor acompañada de aumentos en las células positivas para GZMB y muerte de las células tumorales. Los datos en esta figura y en la Fig.19 indican que puede haber dos fuentes de DKK2, una es el hospedador y la otra es la célula tumoral. Ambas son importantes para facilitar el crecimiento tumoral.

La Fig. 19 es una serie de gráficos e histogramas que muestran que la neutralización de DKK2 reduce la formación de cáncer de pulmón acompañada de un aumento de células positivas para GZMB y apoptosis de células tumorales usando un modelo de aloinjerto de tumor en ratón. 5F8 = YAL-008-1-5F8.

Las Fig. 20A-20C son series de gráficos que ilustran el efecto comparativo de YAL-008-1-5F8 sobre la formación de tumores cuando se administra solo o en combinación con otros anticuerpos (Sigma IgG; anticuerpo PD-1). La Fig. 20A demuestra que en el modelo de aloinjerto de tumor de carcinoma de Lewis en pulmón (LLC), YAL-008-1-5F8 tuvo un efecto similar sobre el retraso del tumor como lo hizo el anticuerpo PD-1; y la combinación de YAL-008-1-5F8 y anticuerpo PD-1 presentó una mayor supresión de la progresión tumoral que con el anticuerpo PD-1 solo. La Fig. 20B muestra el efecto comparativo de YAL-008-1-5F8 sobre la supervivencia del ratón cuando se administra solo o en combinación con otros anticuerpos (Sigma IgG; anticuerpo PD-1) utilizando el modelo de aloinjerto de tumor LLC. La Fig. 20C ilustra el efecto comparativo de YAL-008-1-5F8 sobre la formación de tumores cuando se administra solo o en combinación con otros anticuerpos en el modelo de cáncer de colon MC38. En este modelo MC38, el anticuerpo PD-1 no tiene un efecto significativo sobre la formación de tumores.

Descripción detallada

La presente invención se refiere al descubrimiento inesperado de que la inhibición de Dickkopf2 (DKK2) da como resultado la supresión de la formación de tumores acompañada de una mayor actividad citotóxica de las células efectoras inmunitarias, incluidos los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) y aumento de la apoptosis de las células tumorales y reducción de la angiogénesis tumoral. Por lo tanto, en varios aspectos descritos en el presente documento, la invención se refiere al tratamiento del cáncer mediante la administración a un paciente de una cantidad eficaz de agente agotador del gen DKK2 tal como se describe en las reivindicaciones, proporcionar inmunidad antitumoral en un sujeto, o estimular respuestas inmunes mediadas por células efectoras inmunes a una población celular o un tejido en un sujeto. Adicionalmente, la presente divulgación incluye métodos para diagnosticar un cáncer o una predisposición a desarrollar un cáncer y métodos para determinar el uso del tratamiento de inmunoterapia para tratar el cáncer. Además, la invención comprende una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer así como un kit para llevar a cabo los métodos antes mencionados.

Advertencias.

La información técnica establecida en la presente descripción detallada puede, en algunos aspectos, ir más allá del ámbito de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.

Las referencias incidentales a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para dicho método como tal, sino que deben interpretarse como reivindicaciones de productos, en particular sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos métodos.

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica para el análisis de la presente invención también se puede usar cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen en el presente documento los materiales y métodos preferentes. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.

Como se usa en el presente documento, los artículos "un" y "una" se usan para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, el término "aproximadamente" pretende abarcar variaciones de ± 20% o ± 10%, más preferentemente ±5 %, incluso más preferentemente ±1 % y aún más preferentemente ±0,1 % con respecto al valor especificado, ya que dichas variaciones son adecuadas para realizar los métodos desvelados.

Una "mutación", tal como se usa en ese documento, es un cambio en una secuencia de ADN que da como resultado una alteración de su estado natural. La mutación puede comprender deleción y/o inserción y/o duplicación y/o sustitución de al menos una base de ácido desoxirribonucleico tal como una purina (adenina y/o timina) y/o una pirimidina (guanina y/o citosina). Las mutaciones pueden o pueden no producir cambios discernibles en las características observables (fenotipo) de un organismo (sujeto).

El término "inmunogenicidad", tal como se usa en el presente documento, es la capacidad de una sustancia en particular, tal como un antígeno o epítopo, para provocar una respuesta inmunitaria en el cuerpo de un mamífero. Esta respuesta inmunitaria podría ser humoral y/o mediada por células.

El término "activación", como se usa en el presente documento, se refiere al estado de una célula después de un ligamiento suficiente de la porción de la superficie celular para inducir un cambio bioquímico o morfológico notable. Dentro del contexto de los linfocitos T, tal activación se refiere al estado de un linfocito T que ha sido suficientemente estimulado para inducir una proliferación celular. La activación de un linfocito T también puede inducir la producción de citocinas y el desempeño de funciones efectoras reguladoras o citolíticas. Dentro del contexto de otras células, este término infiere la regulación positiva o negativa de un proceso físico-químico en particular. La expresión "linfocitos T activados" indica linfocitos T que se encuentran actualmente en división celular, la producción de citocinas, el desempeño de funciones efectoras reguladoras o citolíticas, y/o ha experimentado recientemente el proceso de "activación".

Como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto comprendido por restos de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se limita el número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan habitualmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que se denominan en general en la técnica proteínas, de las que existen muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico habituales. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a la citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina, y "U" se refiere a uridina.

El término "ARN", tal como se usa en el presente documento, se define como ácido ribonucleico.

La expresión "agente inmunoterapéutico" tal como se usa en el presente documento pretende incluir cualquier agente que modula el sistema inmunitario del paciente, "inmunoterapia" se refiere al tratamiento que altera el sistema inmunitario del paciente.

El término "terapéutico", como se usa en el presente documento, significa un tratamiento y/o profilaxis.

Se obtiene un efecto terapéutico mediante supresión, remisión o erradicación de una patología.

El término "tratamiento", tal como se usa dentro del contexto de la presente invención, pretende incluir tratamiento terapéutico así como medidas profilácticas o supresoras para la enfermedad o trastorno. Por lo tanto, por ejemplo, el término tratamiento incluye la administración de un agente antes o después del inicio de una enfermedad o trastorno, previniendo o eliminando así todos los signos de la enfermedad o trastorno. Como ejemplo adicional, la administración del agente después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende el "tratamiento" de la enfermedad. Esto incluye la prevención del cáncer.

La expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de un organismo o de componentes (por ejemplo, células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido o fluido biológico. Con frecuencia, la muestra será una "muestra clínica", que es una muestra obtenida de un paciente. Tales muestras incluyen, pero sin limitación, médula ósea, tejido cardíaco, esputo, sangre, líquido linfático, células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos), muestras de biopsia de tejido o con aguja fina, orina, líquido peritoneal y líquido pleural, o células de los mismos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos, como secciones congeladas tomadas con fines histológicos.

"Proteína DKK" se refiere a una proteína de la familia de proteínas Dkk que contiene uno o más dominios ricos en cisteína. La familia de proteínas Dkk incluye Dkk1, Dkk2, Dkk3 y Dkk4, y cualquier otra proteína suficientemente relacionada con una o más de estas proteínas a nivel de secuencia, estructural o funcionalmente. Esta familia de proteínas se describe, por ejemplo, en Krupnik et al. (1999) Gene 238:301. Las variantes alélicas y mutantes de proteínas Dkk, tales como las que se enumeran en el presente documento, también están incluidas en esta definición.

El término "equivalente", cuando se usa en referencia a secuencias de nucleótidos, se entiende que se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos funcionalmente equivalentes. Las secuencias de nucleótidos equivalentes incluirán secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas; y, por tanto, incluirán secuencias que difieren de la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento debido a la degeneración del código genético.

"Hibridación" se refiere a cualquier proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une a una hebra complementaria a través del emparejamiento de bases. Dos ácidos nucleicos monocatenarios "hibridan" cuando forman un dúplex bicatenario. La región de cadena doble puede incluir la longitud completa de uno o ambos ácidos nucleicos monocatenarios, o todo un ácido nucleico monocatenario y una subsecuencia del otro ácido nucleico monocatenario, o la región de cadena doble puede incluir una subsecuencia de cada ácido nucleico. La hibridación también incluye la formación de dúplex que contienen ciertos desajustes, siempre que las dos hebras sigan formando una hélice de cadena doble. "Condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones de hibridación que dan como resultado una hibridación esencialmente específica. El término "hibridación específica" de una sonda a un sitio diana de un ácido nucleico molde se refiere a la hibridación de la sonda predominantemente a la diana, de modo que la señal de hibridación se pueda interpretar claramente. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, tales condiciones que dan como resultado una hibridación específica varían dependiendo de la longitud de la región de homología, el contenido de GC de la región, la temperatura de fusión "Tm" del híbrido. Por tanto, las condiciones de hibridación variarán en el contenido de sal, acidez y temperatura de la solución de hibridación y los lavados.

El término "aislado" como se usa en el presente documento con respecto a los ácidos nucleicos, tal como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. El término aislado como se usa en el presente documento también se refiere a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de material celular, material vírico o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Por otra parte, un "ácido nucleico aislado" pretende incluir fragmentos de ácido nucleico que no se encuentran de forma natural como fragmentos y no se encontrarían en el estado natural. El término "aislado" también se usa en el presente documento para referirse a polipéptidos que se aíslan de otras proteínas celulares y pretende abarcar tanto polipéptidos purificados como recombinantes. Una "célula aislada" o "población aislada de células" es una célula o población de células que no está presente en su entorno natural.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando sea adecuado, ácido ribonucleico (ARN). El término también debe entenderse que incluye, como equivalentes, análogos de ARN o ADN elaborados a partir de análogos de nucleótidos, y, según sea aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (sentido o antisentido) y bicatenarios. EST, cromosomas, ADNc, ARNm y ARNr son ejemplos representativos de moléculas que pueden denominarse ácidos nucleicos.

Una "célula madre" se refiere a una célula que es capaz de diferenciarse en un tipo de célula deseado. Una célula madre incluye células madre embrionarias (Embryonic Stem, ES); células madre adultas; y células madre somáticas, como las células SP del mesodermo no comprometido. Una célula madre "totipotente" es capaz de diferenciarse en todos los tipos de tejidos, incluidas las células del mesodermo, endodermo y ectodermo. Una célula madre "multipotente" o "pluripotente" es una célula que es capaz de diferenciarse en al menos dos de varios destinos.

El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con la de un gen o la secuencia codificante del mismo. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes "alélicas" "de corte y empalme", "de especies" o "polimórficas". Los polipéptidos generalmente tendrán una identidad de aminoácidos significativa entre sí. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimórficas pueden abarcar "polimorfismos de un solo nucleótido" (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) en los que la secuencia de polinucleótidos varía en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una determinada población, una patología, o una propensión a una patología.

La expresión "antagonista de Wnt" o "inhibidor de Wnt" se refiere a una molécula o composición que regula negativamente (por ejemplo, suprime o inhibe) la transducción de señales a través de la vía Wnt. La regulación negativa puede ocurrir directamente, por ejemplo, inhibiendo una bioactividad de una proteína en una vía de señalización Wnt, o indirectamente, por ejemplo, inhibiendo los mediadores aguas abajo de la señalización de Wnt (como TCF3) o disminuyendo la estabilidad de la p-catenina, etc. Ejemplos de antagonistas de Wnt incluyen, pero sin limitación, polipéptidos Dkk (Glinka et al., Nature, 1998, 391: 357-62; Niehrs, Trends Genet, 1999, l5(8):314-9), polipéptidos de media luna (Marvin et al., Genes & Dev., 2001, 15: 316-327), polipéptidos de cerberus (Patente de Estados Unidos N.° 6.133.232), WISE/Esclerostina (Li et al., J Biol Chem, 2005. 280: 19883-7), polipéptidos de axina (Zeng et al., Cell, 1997, 90(1): 181-92; Itoh et al., Curr Biol, 1998, 8(10):591-4; Willert et al., Development, 1999, 126(18):4165-73), polipéptidos Frzb (Cadigan et al., Cell, 1998, 93(5):767-77; patente de EE.UU. n.° 6.133.232; patente de EE.u U. n.° 6.485.972), polipéptidos de glucógeno sintasa cinasa (GSK) (He et al., Nature, 1995) 374(6523): 617-22), polipéptidos de factor de linfocitos T (TCF) (Molenaar et al., Cell, 1996, 86 (3): 391-9), polipéptidos dishevelled dominantes negativos (Wallingford et al., Nature, 2000, 405(6782): 81-5), polipéptidos de N-cadherina negativos dominantes (Patente de Estados Unidos N.° 6.485.972), polipéptidos de p-catenina negativos dominantes (Patente de Estados Unidos N.° 6.485.972), negativos dominantes de factores de transcripción aguas abajo (por ejemplo, TCF, etc.), negativos dominantes de polipéptidos Wnt, agentes que alteran los complejos LRP-frizzled-wnt y agentes que secuestran Wnts (por ejemplo, media luna y anticuerpos contra Wnts). Los polipéptidos antagonistas de Wnt pueden ser de origen mamífero, por ejemplo, ser humano, ratón, rata, cánidos, felinos, origen bovino, ovino o no mamífero, por ejemplo, de Xenopus, pez cebra, Drosophila, pollo o codorniz. Los antagonistas de Wnt también abarcan fragmentos, homólogos, derivados, variantes alélicas y peptidomiméticos de varios polipéptidos, que incluyen, pero sin limitación, Dkk, media luna, cerberus, axina, Frzb, GSK, TCF, dominante negativo deshevelled, N-cadherina dominante negativa y polipéptidos de p-catenina dominante negativa. En otras realizaciones, los antagonistas de Wnt también incluyen anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos específicos de Wnt), polinucleótidos y moléculas pequeñas.

El término "cáncer", como se usa en el presente documento, incluye cualquier tumor maligno incluyendo, pero sin limitación, carcinoma, sarcoma. El cáncer surge de la división incontrolada y/o anómala de células que luego invaden y destruyen los tejidos circundantes. Como se usa en el presente documento, "proliferar" y "proliferación" se refieren a células que experimentan mitosis. Como se usa en el presente documento, "metástasis" se refiere a la diseminación distante de un tumor maligno desde su origen. Las células cancerosas pueden hacer metástasis a través del torrente sanguíneo, a través del sistema linfático, a través de las cavidades corporales, o cualquier combinación de las mismas.

El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno formado por células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dar lugar a metástasis.

La expresión "vacuna contra el cáncer" se refiere a una vacuna que estimula el sistema inmunitario para combatir un cáncer o para combatir los agentes que contribuyen al desarrollo de un cáncer. Hay dos tipos amplios de vacunas contra el cáncer: vacunas preventivas contra el cáncer, que están pensadas para prevenir el desarrollo de cáncer en un sujeto sano; y vacunas terapéuticas contra el cáncer, que están pensadas para tratar un cáncer existente mediante el fortalecimiento de las defensas naturales del cuerpo contra el cáncer (Lollini et al., Nature Reviews Cancer, 2006; 6(3):204-216). Como se usa en el presente documento, la expresión "vacuna contra el cáncer" debe interpretarse para incluir vacunas contra el cáncer tanto preventivas como terapéuticas.

El término "metástasis" se refiere a la propagación de un cáncer de un órgano o parte a otro órgano o parte no adjunto.

El término "angiogénesis" se refiere a la generación de nuevos vasos sanguíneos, generalmente alrededor o dentro de un tejido u órgano. En condiciones fisiológicas normales, los seres humanos o los animales se someten a angiogénesis solo en situaciones restringidas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis se observa normalmente en la cicatrización de heridas, el desarrollo del feto y embrión y la formación del cuerpo lúteo, endometrio y placenta. La angiogénesis incontrolada (persistente y/o no regulada) está relacionada con diversas patologías y se produce durante el crecimiento del tumor y la metástasis.

El término "mejorar" o "tratar" significa que los signos clínicos y/o los síntomas asociados con el cáncer o melanoma se reducen como resultado de las acciones realizadas. Los signos o síntomas a monitorizar serán característicos de un cáncer o melanoma particular y serán bien conocidos por el médico experto, al igual que los métodos para monitorear los signos y las afecciones. Por ejemplo, el médico experto sabrá que el tamaño o la velocidad de crecimiento de un tumor puede monitorizarse usando un método de diagnóstico por imagen usado típicamente para el tumor particular (por ejemplo, usando ultrasonido o imagen de resonancia magnética (MRI) para monitorear un tumor).

Como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de al menos un compuesto útil en la invención con otros componentes químicos, tales como transportadores, estabilizantes, diluyentes, agentes de dispersión, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o excipientes. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un organismo. Existen múltiples técnicas de administración de un compuesto en la técnica que incluyen, pero sin limitación: intravenosa, oral, aerosol, parenteral, oftálmica, pulmonar y tópica.

la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye una sal farmacéuticamente aceptable, material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicados en llevar o transportar un compuesto o compuestos de la presente invención dentro o al sujeto de modo que pueda realizar su función prevista. Normalmente, tales compuestos son llevados o transportados desde un órgano o parte del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada sal o vehículo tiene que ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no lesivo para el sujeto. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua exenta de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de tampón fosfato; diluyente; agentes de granulación; lubricante; aglutinante; agentes disgregantes; agente humectante; emulsionante; agente colorante; agente de liberación; agentes de recubrimiento; agente edulcorante; agente aromatizante; agentes perfumante; conservante; antioxidante; plastificante; agente gelificante; espesante; endurecedor; agente fijador; agente de suspensión; tensioactivo; humectante; vehículo; estabilizante; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas, o cualquier combinación de las mismas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye también cualquiera y todos los recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y agentes retardadores de la absorción y similares que son compatibles con la actividad del compuesto, y son fisiológicamente aceptables para el sujeto. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

El término "anticuerpo" o "Ab" como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína o secuencia polipeptídica que proviene de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas procedentes de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden existir en diversas formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos intracelulares ("intracuerpos"), Fv, Fab y F(ab)², así como anticuerpos monocatenarios y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1998, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Un anticuerpo puede obtenerse de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos son normalmente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina.

Por la expresión "anticuerpo sintético", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo generado usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado mediante un bacteriófago como se describe en el presente documento. La expresión también debe interpretarse como un anticuerpo generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y que la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido usando tecnología de ADN sintético o de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere al menos a una porción de un anticuerpo intacto, o variantes recombinantes del mismo, y se refiere al dominio de unión al antígeno, por ejemplo, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo intacto, que sea suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo a una diana, tal como un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab', F(ab')², y fragmentos Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. El término "scFv" se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, donde las regiones variables de cadena ligera y pesada están unidas de forma contigua mediante un enlazador polipeptídico flexible corto y pueden expresarse como un polipéptido de cadena sencilla, y donde el scFv conserva la especificidad del anticuerpo intacto del que se obtiene. A menos que se especifique, tal como se usa en el presente documento, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-enlazador-VH o puede comprender VH-enlazador-VL.

Una "cadena pesada de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales, y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo.

Una "cadena ligera de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere al menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpo en sus configuraciones de origen natural. Las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) se refieren a los dos isotipos principales de cadena ligera de los anticuerpos.

Por la expresión "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago o un sistema de expresión de levadura. La expresión también debe interpretarse como un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y que la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido usando tecnología de ADN recombinante o de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

El término "antígeno" o "Ag", como se usa en el presente documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la materia comprenderá que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede actuar como antígeno. Además, los antígenos pueden proceder de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia comprenderá que cualquier ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifica una proteína que provoca una respuesta inmunitaria, por lo tanto, codifica un "antígeno" como se usa ese término en el presente documento. Además, un experto en la técnica comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Resulta evidente que la presente invención incluye, pero sin limitación, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos se disponen en diversas combinaciones para provocar la respuesta inmunitaria deseada. Por otra parte, un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado por un "gen" en absoluto. Resulta evidente que un antígeno se puede generar sintetizado o se puede obtener de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero sin limitación, una muestra tisular, una muestra tumoral, una célula o un líquido biológico.

Por el término "aplicador", tal como se usa el término en el presente documento, se refiere a cualquier dispositivo, incluido, pero sin limitación, una jeringa hipodérmica, una pipeta y similares, para administrar los compuestos y composiciones de la invención.

Como se usa en el presente documento, "aptámero" se refiere a una molécula pequeña que puede unirse específicamente a otra molécula. Los aptámeros son típicamente moléculas basadas en polinucleótidos o péptidos. Un aptámero de polinucleótidos es una molécula de ADN o ARN, generalmente comprende varias cadenas de ácidos nucleicos, que adopta una conformación tridimensional altamente específica diseñada para tener afinidades y especificidades de unión apropiadas hacia moléculas diana específicas, como péptidos, proteínas, fármacos, vitaminas, entre otras moléculas orgánicas e inorgánicas. Dichos aptámeros polinucleotídicos pueden seleccionarse de una vasta población de secuencias aleatorias mediante el uso de la evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial. Un aptámero de péptido es típicamente un bucle de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos unido a un armazón de proteína que se une a ligandos específicos. Los aptámeros de péptidos pueden identificarse y aislarse de bibliotecas combinatorias, utilizando métodos como el sistema de dos híbridos de levadura.

La expresión "efecto antitumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, que incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la esperanza de vida, disminución de la proliferación de células tumorales, disminución de la supervivencia de las células tumorales o mejora de varios síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un "efecto antitumoral" también se puede manifestar mediante la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la invención en la prevención de la aparición de tumores en primer lugar.

El término "xenoinjerto", como se usa en el presente documento, se refiere a un injerto de tejido tomado de un donante de una especie e injertado en un receptor de otra especie.

El término "aloinjerto", como se usa en el presente documento, se refiere a un injerto de tejido tomado de un donante de una especie e injertado en un receptor de la misma especie

Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debería entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, debería considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debería considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

El sistema inmunitario está equilibrado entre la activación y la supresión. La evasión de la inmunovigilancia es uno de los requisitos previos para la formación de tumores. Una de las formas en que los tumores evitan la inmunovigilancia es produciendo una cantidad elevada de moléculas inmunosupresoras. Se ha identificado un número creciente de moléculas y mecanismos inmunosupresores a lo largo de los años. Se ha demostrado que la neutralización de estas moléculas inmunosupresoras es eficaz en el tratamiento de diversas neoplasias malignas.

La presente invención se refiere al descubrimiento de un potenciador de la formación de tumores secretado DKK2 que suprime la actividad de los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) y estimula la angiogénesis tumoral. DKK2 es una proteína secretada, que puede inhibir la señalización de Wnt mediada por pcatenina, alterar la actividad de Wnt no mediada por p-catenina y también pueden tener funciones independientes de Wnt. También se ha demostrado que tiene actividad proangiogénica (Park et al., Angiogenesis, 2014. 17: 221-34; Min et al., J Clin Invest, 2011. 121: 1882-93). DKK2 se expresa en muchos tejidos y está regulada positivamente en los cánceres humanos colorrectal, de intestino gástrico, de hígado, de riñón y de páncreas. La evidencia experimental descrita a continuación indica que los inhibidores de DKK2 y los anticuerpos neutralizantes son inmunomoduladores y supresores clave de la angiogénesis tumoral para el tratamiento de cánceres en los que se expresa DKK2. Por tanto, DKK2 es una diana prometedora para el tratamiento de estos cánceres.

Métodos de la invención

La presente invención está dirigida a medios para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente que agota el gen DKK2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se define en las reivindicaciones.

Por la expresión "agente de agotamiento del gen DKK2" se entiende un anticuerpo anti-DKK2 neutralizante como se define en las reivindicaciones que inhibe o reduce la actividad de DKK2 en una célula, tejido o fluido corporal.

No reivindicado: ARN de interferencia pequeño (ARNip):

En un aspecto de la divulgación, el agente de agotamiento es un ARN de interferencia pequeño (ARNip). ARNip es una molécula de ARN que comprende un conjunto de nucleótidos que se dirige a un gen o polinucleótido de interés. Como se usa en el presente documento, el término "ARNip" abarca todas las formas de ARNip incluyendo, pero sin limitación (i) un polinucleótido de ARN bicatenario, (ii) un polinucleótido monocatenario, y (iii) un polinucleótido de (i) o (ii) en el que dicho polinucleótido, tiene una, dos, tres, cuatro o más alteraciones o sustituciones de nucleótidos en el mismo. Los ARNip y su uso para inhibir la expresión génica son bien conocidos en la técnica (Elbashir et al., Nature, 2001, 411 (6836): 494-988). El ARNip es capaz de interferir con la expresión y/o la actividad del gen de interés como DKK2.

Ribozima:

En un aspecto adicional de la divulgación, el agente de agotamiento es una ribozima. Las ribozimas y su uso para inhibir la expresión génica también son bien conocidos en la técnica (Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:17479-17482; Hampel et al, 1989, Biochemistry 28:4929-4933; Eckstein et al., publicación internacional N.° WO 92/07065; Altaian et al., patente de EE.UU. N.° 5.168.053). Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad de escindir específicamente otro ARN monocatenario de una manera análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. Mediante la modificación de las secuencias de nucleótidos que codifican estos ARN, las moléculas pueden diseñarse para reconocer secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ARN y escindirlas (Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030). Una ventaja importante de este enfoque es el hecho de que las ribozimas son específicas de secuencia. Hay dos tipos básicos de ribozimas, en concreto, las de tipo tetrahymena (Hasselhoff, 1988, Nature 334:585) y las de tipo cabeza de martillo. Las ribozimas de tipo tetrahymena reconocen secuencias que tienen cuatro bases de longitud, mientras que las ribozimas de tipo cabeza de martillo reconocen secuencias de bases de 11-18 bases de longitud. Cuanto más larga sea la secuencia, mayor será la probabilidad de que la secuencia ocurra exclusivamente en la especie de ARNm diana. En consecuencia, las ribozimas de tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo tetrahymena para inactivar especies de ARNm específicas, y las secuencias de reconocimiento de 18 bases son preferibles a las secuencias de reconocimiento más cortas que pueden ocurrir aleatoriamente dentro de varias moléculas de ARNm no relacionadas. Las ribozimas útiles para inhibir la expresión de un gen de interés (es decir, DKK2) pueden diseñarse incorporando secuencias diana en la estructura básica de la ribozima que son complementarias a la secuencia de ARNm del gen deseado. Las ribozimas que se dirigen al gen de interés se pueden sintetizar utilizando reactivos disponibles comercialmente (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) o pueden expresarse genéticamente a partir del ADN que los codifica.

No reivindicado: Molécula antisentido:

En otro aspecto de la divulgación, el agente de agotamiento es una secuencia de ácido nucleico antisentido. Las moléculas antisentido y su uso para inhibir la expresión génica son bien conocidos en la técnica (Cohen, 1989, Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press). Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias, tal como ese término se define en otra parte del presente documento, al menos a una porción de una molécula de ARNm específica (Weintraub, 1990, Scientific American 262:40). En la célula, los ácidos nucleicos antisentido hibridan con el ARNm correspondiente, formando una molécula de doble cadena inhibiendo así la traducción de genes. Se pueden proporcionar moléculas antisentido a la célula mediante expresión genética usando ADN que codifica la molécula antisentido como enseñó Inoue, 1993, Patente de los EE.UU. N.° 5.190.931. Como alternativa, las moléculas antisentido pueden fabricarse sintéticamente y luego proporcionarse a la célula. Los oligómeros antisentido de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30, son preferidos, ya que se sintetizan y se introducen fácilmente en una célula diana. Las moléculas antisentido sintéticas contempladas por la invención incluyen derivados de oligonucleótidos conocidos en la técnica que tienen una actividad biológica mejorada en comparación con los oligonucleótidos no modificados (patente de EE.UU. N.° 5.023.243).

No reivindicado: Inhibidores de moléculas pequeñas

Es bien conocido en la técnica que algunos restos de aminoácidos, localizados en la cavidad superior de la estructura de la hélice p del tercer dominio de repetición YWTD de la LRP5 humana, son importantes para la unión de DKK y el antagonismo de Wnt mediado por DKK (Zhang et al, Mol Cell Biol. 2004;24:4677-4684) (Fig. 12). En un aspecto de la presente divulgación, una pequeña molécula que puede unirse a esta cavidad e interrumpir la interacción entre DKK y LRP5/6, actúa como agente inhibidor de DKK2. El agente inhibidor de DKK2 puede ser cualquier molécula pequeña análoga a cualquier resto de aminoácido de LRP5 conocido en la técnica por estar implicado en la unión de DKK. Ejemplos de esos restos son Glu721, Trp863, Tyr719, Arg764, Asp887, Phe888, Gly781, Trp780 y Met890 (Zhang et al., Mol Cell Biol. 2004;24:4677-4684). La molécula pequeña que actúa como inhibidor de DKK2 puede ser un compuesto de galocianina (por ejemplo, IIC8 y IIIC3) (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012. 109: 11402-7).

Anticuerpos

La invención contempla el uso de una composición que comprende un anticuerpo anti-DKK2 como se define en las reivindicaciones. En una realización, el anticuerpo comprende un anticuerpo seleccionado de, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo sintético, un anticuerpo de cadena pesada, un anticuerpo humano y un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo y cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, el anticuerpo sintético es producido por AbMax Biotechnology Co. Ltd. (China) como el anticuerpo YAL008-1-5F8 (con una secuencia de péptido antigénico que es 5'-KLNSIk Ss LGGETp G-3', SEQ ID NO 1, ubicada en el extremo N-terminal de DKK2), ubicada en el extremo N-terminal de DKK2), el anticuerpo YAL008-5-1A10 (con una secuencia de péptido antigénico que es 5'-CKVWKDATYSSKAR-3', SeQ ID NO 5, ubicada en el segundo dominio rico en Cys de DKK2) y el anticuerpo YAL008-7-1A10 (con una secuencia de péptido antigénico que es 5'-CARHFWTKIC-3', SEQ ID NO 7, ubicada en el segundo dominio rico en Cys de DKK2) (Figuras 11 y 12). En una realización adicional, se añade una cisteína ("C") en el extremo 3' del péptido antigénico para la conjugación.

Se conocen en la técnica métodos de producción de anticuerpos. En el presente documento se describen técnicas ilustrativas para la producción de los anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que un anticuerpo comprende cualquier molécula de inmunoglobulina, ya sea obtenida de fuentes naturales o de fuentes recombinantes, que es capaz de unirse específicamente a un epítopo presente en una molécula diana.

Cuando el anticuerpo contra la molécula diana usado en las composiciones y métodos de la invención es un anticuerpo policlonal (IgG), el anticuerpo se genera inoculando un animal adecuado con un péptido que comprende la proteína diana de longitud completa, o un fragmento de la misma, un regulador aguas arriba, o fragmentos del mismo. Estos polipéptidos, o fragmentos de los mismos, se pueden obtener por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo síntesis química y síntesis biológica.

Los anticuerpos producidos en el animal inoculado que se unen específicamente a la molécula diana, o fragmentos de la misma, luego se aíslan del líquido obtenido del animal. Los anticuerpos se pueden generar de esta manera en varios mamíferos no humanos tales como, pero sin limitación, cabra, oveja, caballo, camello, conejo y burro. Los métodos para generar anticuerpos policlonales son bien conocidos en la materia y se describen, por ejemplo en Harlow et al., 1998, en: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra una molécula diana de longitud completa, o fragmentos de la misma, pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento de preparación de anticuerpos monoclonales bien conocido, tal como el descrito, por ejemplo, en Harlow et al. (1998, En: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) y en Tuszynski et al. (1988, Blood, 72:109-115). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar mediante el método descrito en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0224490. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un antígeno se generan a partir de ratones inmunizados con el antígeno usando procedimientos estándar como se hace referencia en el presente documento. El ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal obtenido usando los procedimientos descritos en el presente documento puede clonarse y secuenciarse usando tecnología que está disponible en la técnica, y se describe, por ejemplo, en Wright et al., 1992, Critical Rev. Immunol.

12(3,4): 125-168, y las referencias allí citadas.

Cuando el anticuerpo utilizado es un fragmento de anticuerpo biológicamente activo o un anticuerpo sintético correspondiente a un anticuerpo contra una molécula diana de longitud completa, o fragmentos de la misma, el anticuerpo se prepara de la siguiente manera: se clona un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado o un fragmento del mismo en un vector adecuado. El vector se transfecta en células adecuadas para la generación de grandes cantidades del anticuerpo o fragmento del mismo. El ADN que codifica el anticuerpo deseado se expresa luego en la célula produciendo así el anticuerpo. El ácido nucleico que codifica el péptido deseado se puede clonar y secuenciar usando tecnología disponible en la técnica, y se describe, por ejemplo, en Wright et al., 1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4): 125-168 y las referencias allí citadas. Como alternativa, también se pueden sintetizar cantidades del anticuerpo deseado o fragmento del mismo usando tecnología de síntesis química. Si se conoce la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, el anticuerpo deseado se puede sintetizar químicamente usando métodos conocidos en la técnica.

La presente invención también puede incluir el uso de anticuerpos humanizados específicamente reactivos con un epítopo presente en una molécula diana. Estos anticuerpos son capaces de unirse a la molécula diana. Los anticuerpos humanizados útiles en la invención tienen un marco humano y tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo, típicamente un anticuerpo de ratón, específicamente reactivo con una molécula de superficie celular dirigida. Las secuencias de aminoácidos de las secuencias de CDR para YAL008-1-5F8, YAL008-5 1A10 y YAL008-7-1A10 se enumeran en la Fig. 11.

Cuando el anticuerpo utilizado en la invención está humanizado, el anticuerpo se puede generar como se describe en Queen et al. (Patente de Estados Unidos N.° 6.180.370), Wright et al., 1992, Critical Rev. Immunol. 12(3,4): 125-168, y en las referencias allí citadas, o en Gu et al., 1997, Thrombosis & Hematocyst 77(4):755-759, o usando otros métodos para generar un anticuerpo humanizado conocido en la técnica. El método revelado en Queen et al. está dirigido en parte al diseño de inmunoglobulinas humanizadas que se producen expresando segmentos de ADN recombinante que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera a partir de una inmunoglobulina donante capaz de unirse a un antígeno deseado, unido a segmentos de ADN que codifican regiones marco humanas aceptoras. En términos generales, la invención en la patente de Queen tiene aplicabilidad hacia el diseño de sustancialmente cualquier inmunoglobulina humanizada. Queen explica que los segmentos de ADN típicamente incluirán una secuencia de ADN de control de expresión operativamente ligada a secuencias codificantes de inmunoglobulinas humanizadas, incluyendo regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas, o las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores procariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos introducidas y, según se desee, la recogida y purificación de las cadenas ligeras humanizadas, cadenas pesadas, dímeros de cadena ligera/pesada o anticuerpos intactos, fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina puede seguir (Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, Nueva York, 1979).

Las secuencias de ADN de anticuerpos humanos y particularmente las regiones determinantes de complementariedad (CDR) pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Preferentemente, las secuencias de ADN de las CDR humanas se aíslan de linfocitos B inmortalizados como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 1987/02671. Las CDR útiles para producir los anticuerpos de la presente invención pueden obtenerse de manera similar de ADN que codifica anticuerpos monoclonales capaces de unirse a la molécula diana. Dichos anticuerpos humanizados se pueden generar usando métodos bien conocidos en cualquier fuente de mamífero conveniente capaz de producir anticuerpos, que incluyen, pero sin limitación, ratones, ratas, camellos, llamas, conejos u otros vertebrados. Las células adecuadas para secuencias de ADN de región constante y marco y células hospedadoras en las que se expresan y secretan los anticuerpos, se pueden obtener de linfocitos T de varias fuentes, tales como la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Otro método para generar anticuerpos específicos, o fragmentos de anticuerpos, reactivo contra un DKK2 implica el cribado de bibliotecas de expresión que codifican genes de inmunoglobulina, o partes de los mismos, expresado en bacterias con una proteína o péptido DKK2. Por ejemplo, los fragmentos completos de Fab, las regiones VH y las regiones Fv se pueden expresar en bacterias usando bibliotecas de expresión en fagos. Véase, por ejemplo, Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-546; Huse et al., Science, 1989, 246: 1275-1281; y McCafferty et al., Nature, 1990, 348: 552-554. El cribado de dichas bibliotecas con, por ejemplo, un péptido d KK2, puede identificar fragmentos de inmunoglobulina reactivos con DKK2. Como alternativa, el ratón sClD-hu (disponible de Genpharm) se puede usar para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos.

En un aspecto adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty. et al., Nature, 1990, 348: 552-554. Clackson et al., Nature, 1991, 352: 624-628 y Marks et al., J Mol Biol, 1991, 222: 581-597 describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por mezcla de cadenas (Marks et al., BioTechnology, 1992, 10: 779-783), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 1993, 21: 2265-2266). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE.UU. N.° 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1984, 81: 6851), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina. Normalmente, dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que tiene un sitio de combinación de antígeno con especificidad para un primer antígeno y otro sitio de combinación de antígeno con especificidad para un antígeno diferente.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos funcionales. El fragmento de anticuerpo puede incluir una región variable o una región de unión al antígeno del anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1992, 24: 107-117 y Brennan et al., Science, 1985, 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos tratadas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 1992, 10: 163-167). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes para el médico experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase el documento WO 93/16185; patente de EE.UU. n.° 5.571.894; y la patente de los Estados Unidos n.° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la patente de EE.UU. N.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Los miméticos de anticuerpos o la "proteína que no se une al anticuerpo" utilizan andamiajes de proteínas que no son de inmunoglobulina, incluyendo adnectinas, avímeros, moléculas de unión a polipéptidos de cadena sencilla y peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo utilizando andamiajes proteicos no inmunoglobulínicos como andamiajes proteicos alternativos para las regiones variables de anticuerpos (patente de EE.UU. n.° 5.260.203; 5770380; 6.818.418 y 7.115.396). Se han desarrollado otros compuestos que se dirigen y se unen a dianas de una manera similar a los anticuerpos. Algunos de estos "miméticos de anticuerpos" utilizan andamiajes proteicos no inmunoglobulínicos como andamiajes proteicos alternativos para las regiones variables de anticuerpos. Una metodología para reducir anticuerpos en peptidomiméticos más pequeños, denominados "peptidomiméticos de unión de tipo anticuerpo" (ABiP), una metodología para reducir anticuerpos en peptidomiméticos más pequeños, también puede ser útil como alternativa a los anticuerpos (Murali et al. Cell Mol Biol., 2003, 49(2):209-216).

Las proteínas de fusión que son polipéptidos monocatenarios que incluyen múltiples dominios denominados "avímeros" se desarrollaron a partir de dominios de receptores extracelulares humanos por mezcla in vitro de exones y presentación en fagos y son una clase de proteínas de unión algo similar a los anticuerpos en sus afinidades y especificidades para varias moléculas diana (Silverman et al. Nat Biotechnol, 2005, 23: 1556-1561). Las proteínas multidominio resultantes pueden incluir múltiples dominios de unión independientes que pueden presentar afinidad (en algunos casos subnanomolar) y una especificidad mejorada en comparación con las proteínas de unión de un solo epítopo. Se divulgan detalles adicionales sobre los métodos de construcción y uso de avímeros, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. n.° 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 y 20050221384.

Además de los marcos proteicos no inmunoglobulínicos, las propiedades de los anticuerpos también se han mimetizado en compuestos que incluyen, pero sin limitación, moléculas de ARN y oligómeros no naturales (por ejemplo, inhibidores de la proteasa, benzodiazepinas, derivados de purina y miméticos de giro beta), todos los cuales son adecuados para su uso con la presente invención. Estos tienen como objetivo eludir las limitaciones del desarrollo de anticuerpos en animales mediante el desarrollo completo de técnicas in vitro para diseñar anticuerpos de especificidad personalizada.

Como se conoce en la técnica, los aptámeros son macromoléculas compuestas de ácido nucleico que se unen estrechamente a una diana molecular específica. Tuerk y Gold (Science, 1990, 249:505-510) desvela el método SELEX (Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial) para la selección de aptámeros. En el método SELEX, se produce y/o analiza una gran biblioteca de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, 1015 moléculas diferentes) con la molécula diana. Los aptámeros aislados pueden luego refinarse aún más para eliminar cualquier nucleótido que no contribuya a la unión de la diana y/o la estructura del aptámero (es decir, aptámeros truncados a su dominio de unión del núcleo). Véase, por ejemplo, Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45:1628-1650 para revisar la tecnología de aptámeros.

El término "neutralizante" en referencia a un anticuerpo anti-DKK2 de la invención o la expresión "anticuerpo que neutraliza la actividad de DKK2" pretende referirse a un anticuerpo cuya unión o contacto con DKK2 da como resultado la inhibición de una actividad proliferativa celular, metástasis de cáncer, invasión de células cancerosas o migración de células cancerosas, inhibición de la señalización Wnt, angiogénesis, establecimiento de un microambiente que promueve la formación de tumores inducido por DKK2. Debido a que la DKK2 se secreta al medio extracelular y funciona como un factor esencial de la proliferación, la migración, la invasión y la metástasis de células cancerosas, algunos anticuerpos anti-DKK2 pueden neutralizar esta actividad. El anticuerpo neutralizante y agotador de DKK2 de la presente invención es especialmente útil en aplicaciones terapéuticas: para prevenir o tratar cánceres de enfermedades intratables y metástasis de cáncer. El anticuerpo neutralizante y agotador de DKK2 de la presente invención puede administrarse a un paciente o ponerse en contacto con una célula para inhibir la metástasis de un cáncer caracterizado por la sobreexpresión de DKK2.

Se puede evaluar la unión inmunoespecífica del anticuerpo de la presente invención mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas como análisis por transferencia de Western, radioinmunoensayos, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar solo unos pocos. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel et al., eds.), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Nueva York, 2002).

Terapias de combinación

Los compuestos identificados en los métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles cuando se combinan con al menos un compuesto adicional útil para tratar el cáncer. El compuesto adicional puede comprender un compuesto identificado en el presente documento o un compuesto, por ejemplo, compuestos disponibles comercialmente, conocidos para tratar, prevenir o reducir los síntomas del cáncer y/o metástasis.

En un aspecto, la presente divulgación contempla que los agentes de la invención se pueden usar en combinación con un agente terapéutico tal como un agente antitumoral, incluyendo un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico, un agente antiproliferación celular o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, cualquier agente quimioterapéutico convencional de las siguientes clases ilustrativas puede incluirse en la combinación: agentes alquilantes; nitrosoureas; antimetabolitos; antibióticos antitumorales; alquiloides vegetales; taxanos; agentes hormonales; y diversos agentes.

Los agentes alquilantes se denominan así debido a su capacidad para añadir grupos alquilo a muchos grupos electronegativos en las condiciones presentes en las células, interfiriendo así con la replicación del ADN para evitar que las células cancerosas se reproduzcan. La mayoría de los agentes alquilantes no son específicos del ciclo celular. En aspectos específicos, detienen el crecimiento tumoral reticulando bases de guanina en cadenas de ADN de doble hélice. Los ejemplos no limitantes incluyen busulfán, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, clorhidrato de mecloretamina, melfalán, procarbazina, tiotepa y mostaza de uracilo.

Los antimetabolitos evitan la incorporación de bases al ADN durante la fase de síntesis (S) del ciclo celular, prohibiendo el desarrollo normal y la división. Los ejemplos no limitantes de antimetabolitos incluyen medicamentos como el 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, capecitabina, arabinósido de citosina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato y tioguanina.

Los antibióticos antitumorales generalmente previenen la división celular al interferir con las enzimas necesarias para la división celular o al alterar las membranas que rodean las células. En esta clase se incluyen las antraciclinas, tales como doxorrubicina, que actúa para prevenir la división celular al alterar la estructura del ADN y poner fin a su función. Estos agentes no son específicos del ciclo celular. Los ejemplos no limitantes de antibióticos antitumorales incluyen aclacinomicina, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carubicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, mitoxantrona, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorrubicina.

Los alcaloides vegetales inhiben o detienen la mitosis o inhiben las enzimas que evitan que las células produzcan las proteínas necesarias para el crecimiento celular. Los alcaloides vegetales de uso frecuente incluyen, por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.

Los taxanos afectan a las estructuras celulares llamadas microtúbulos que son importantes en las funciones celulares. En crecimiento celular normal, los microtúbulos se forman cuando una célula comienza a dividirse, pero una vez que la célula deja de dividirse, los microtúbulos se desmontan o destruyen. Los taxanos prohíben que los microtúbulos se descompongan de manera que las células cancerosas se obstruyan tanto con los microtúbulos que no puedan crecer ni dividirse. Los taxanos ilustrativos no limitantes incluyen paclitaxel y docetaxel.

Los agentes hormonales y los medicamentos similares a las hormonas se utilizan para ciertos tipos de cáncer, que incluyen, por ejemplo, leucemia, linfoma y mieloma múltiple. A menudo se emplean con otros tipos de medicamentos de quimioterapia para mejorar su eficacia. Las hormonas sexuales se utilizan para alterar la acción o producción de hormonas femeninas o masculinas y se utilizan para retardar el crecimiento de los cánceres de mama, próstata y endometrio. La inhibición de la producción (inhibidores de la aromatasa) o la acción (tamoxifeno) de estas hormonas a menudo se puede utilizar como complemento de la terapia. Algunos otros tumores también dependen de las hormonas. El tamoxifeno es un ejemplo no limitativo de un agente hormonal que interfiere con la actividad del estrógeno, que promueve el crecimiento de células cancerosas de mama.

Los agentes diversos incluyen agentes quimioterapéuticos tales como bleomicina, hidroxiurea, L-asparaginasa y procarbazina.

Otros ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitación, los siguientes y sus sales farmacéuticamente aceptables, ácidos y derivados: mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatrexato; defofamina; demecolcina; diacicuona; eflomitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; PSK@ razoxano; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triacicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; y capecitabina.

Un agente antiproliferación celular se puede definir además como un agente inductor de apoptosis o un agente citotóxico. El agente inductor de la apoptosis puede ser una granzima, un miembro de la familia Bcl-2, el citocromo C, una caspasa, o una combinación de las mismas. Las granzimas ilustrativas incluyen granzima A, granzima B, granzima C, granzima D, granzima E, granzima F, granzima G, granzima H, granzima I, granzima J, granzima K, granzima L, granzima M, granzima N o una combinación de las mismas. En otros aspectos específicos, el miembro de la familia Bcl-2 es, por ejemplo, Bax, Bak, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Hrk, Bok o una combinación de los mismos.

En aspectos adicionales, la caspasa es caspasa-1, caspasa-2, caspasa-3, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-6, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10, caspasa-11, caspasa-12, caspasa-13, caspasa-14 o una combinación de las mismas. En aspectos específicos, el agente citotóxico es TNF-a, gelonina, prodigiosina, una proteína inhibidora de ribosomas (RIP), exotoxina de Pseudomonas, toxina B de Clostridium difficile, VacA de Helicobacterpylori, YopT de Yersinia enterocolitica, violaceína, ácido dietilentriaminopentaacético, irofulvén, toxina de difteria, mitogilina, ricina, toxina botulínica, toxina del cólera, saporina 6, o una combinación de los mismos.

Un agente inmunoterapéutico puede ser, pero sin limitación, una interleucina-2 u otra citocina, un inhibidor de la señalización de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), tal como un anticuerpo monoclonal que se une a PD-1, ipilimumab. El agente inmunoterapéutico también puede bloquear la señalización del antígeno A-4 (CTLA-4) asociado a linfocitos T citotóxicos y también puede relacionarse con vacunas contra el cáncer y terapias basadas en células dendríticas.

El agente inmunoterapéutico puede ser además linfocitos citolíticos naturales que se activan y expanden mediante tratamiento con citocinas o transfiriendo células exógenas mediante terapia celular adoptiva y/o trasplante de células madre hematopoyéticas. Los linfocitos citolíticos naturales adecuados para la terapia celular adoptiva pueden obtenerse de diferentes fuentes, que incluyen la expansión ex vivo de linfocitos citolíticos naturales autólogos, linfocitos citolíticos naturales no estimulados o expandidos de sangre periférica, obtenidos de progenitores hematopoyéticos CD34+ de sangre periférica y sangre de cordón umbilical, y líneas de linfocitos citolíticos naturales. Los linfocitos citolíticos naturales genéticamente modificados que expresan receptores de antígenos quiméricos o citocinas también se contemplan en la presente invención. Otro agente inmunoterapéutico útil para la presente invención es un agente basado en la terapia adoptiva de linfocitos T (Adoptive T Cell Therapy, ACT) en la que se administran a los pacientes linfocitos infiltrantes de tumores (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL). Los linfocitos T administrados pueden modificarse genéticamente para expresar receptores de antígenos específicos de tumores, como los receptores de antígenos quiméricos (Chimeric Antigen Receptors, CAR), que reconocen los antígenos de la superficie celular de una manera restringida por histocompatibilidad no mayor (MHC); o pueden ser TCR ap tradicionales, que reconocen epítopos de antígenos intracelulares presentados por moléculas del MHC.

Composiciones y formulaciones farmacéuticas.

La divulgación prevé el uso de una composición farmacéutica que comprende un agente de agotamiento de DKK2 para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

Dicha composición farmacéutica está en una forma adecuada para la administración a un sujeto, o la composición farmacéutica puede comprender además uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales, o alguna combinación de los mismos. Los diversos componentes de la composición farmacéutica pueden estar presentes en forma de una sal fisiológicamente aceptable, tal como en combinación con un catión o anión fisiológicamente aceptable, tal como se conoce bien en la materia.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar para suministrar una dosis de entre 1 ng/kg/día y 100 mg/kg/día. En otra realización, las composiciones farmacéuticas útiles para poner en práctica la invención se pueden administrar para suministrar una dosis de entre 1 ng/kg/día y 500 mg/kg/día.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de la invención variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y la afección del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la cual se administrará la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 100 % p/p) de principio activo.

Las composiciones farmacéuticas pueden desarrollarse adecuadamente para inhalación, oral, rectal, vaginal, parenteral, tópica, transdérmica, pulmonar, intranasal, bucal, oftálmica, intratecal, intravenosa u otra vía de administración. Otras formulaciones contempladas incluyen nanopartículas proyectadas, preparaciones liposomales, eritrocitos resellados que contienen el principio activo y formulaciones de base inmunológica. La(s) vía(s) de administración es fácilmente evidente para el experto en la materia y depende de varios factores, incluido el tipo y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el tipo y edad del paciente veterinario o humano que se está tratando, y similares.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado de aquí en adelante en la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el principio activo con un vehículo o uno o más de otros ingredientes accesorios, y luego, si es necesario o deseable, dar forma o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

Como se usa en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosis del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de tal dosis como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosis. La forma farmacéutica unitaria puede ser una única dosis diaria o una de múltiples dosis diarias (por ejemplo, aproximadamente 1 a 4 o más veces al día). Cuando se utilizan múltiples dosis diarias, la forma farmacéutica unitaria puede ser la misma o diferente para cada dosis.

Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se dirigen principalmente a composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración ética a los seres humanos, el experto en la materia entenderá que tales composiciones son generalmente adecuadas para la administración a animales de todo tipo. Se comprende bien la modificación de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a varios animales, y el farmacólogo veterinario habitualmente experto puede diseñar y realizar dicha modificación con experimentación meramente ordinaria, si la hay. Los sujetos a los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, humanos y otros primates, mamíferos, incluidos los mamíferos comercialmente relevantes como el ganado, cerdos, caballos, oveja, gatos y perros.

Las composiciones se pueden formular usando uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Normalmente, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de agente reductor de DKK2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, que son útiles, incluyen, pero sin limitación, glicerol, agua, solución salina, etanol y otras soluciones salinas farmacéuticamente aceptables tales como fosfatos y sales de ácidos orgánicos. Se describen ejemplos de estos y otros vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1991, Mack Publication Co., Nueva Jersey.

El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, o polialcoholes, tales como manitol y sorbitol, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede facilitarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las formulaciones pueden emplearse en mezclas con excipientes convencionales, es decir, sustancias vehículo orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para administración oral, parenteral, nasal, intravenosa, subcutánea, enteral, o cualquier otro modo de administración adecuado, conocido en la técnica. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en los tampones para presión osmótica, coloración, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares. También se pueden combinar donde se desee con otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes analgésicos.

La composición de la invención puede comprender un conservante de aproximadamente 0,005 % a 2,0 % en peso total de la composición. El conservante se utiliza para evitar el deterioro en caso de exposición a contaminantes en el medio ambiente. Los ejemplos de conservantes útiles de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, los seleccionados del grupo que consiste en alcohol bencílico, ácido sórbico, parabenos, imidurea y combinaciones de los mismos. Un conservante particularmente preferido es una combinación de aproximadamente el 0,5 % al 2,0 % de alcohol bencílico y el 0,05 % al 0,5 % de ácido sórbico.

La composición incluye preferentemente un antioxidante y un agente quelante que inhibe la degradación del compuesto. Los antioxidantes preferidos para algunos compuestos son BHT, BHA, alfa-tocoferol y ácido ascórbico en el intervalo preferido de aproximadamente el 0,01 % al 0,3 % y más preferentemente BHT en el intervalo del 0,03 % al 0,1 % en peso por peso total de la composición. Preferentemente, el agente quelante está presente en una cantidad del 0,01 % al 0,5 % en peso del peso total de la composición. Los agentes quelantes particularmente preferidos incluyen sales de edetato (por ejemplo, edetato de disodio) y ácido cítrico en el intervalo de peso de aproximadamente el 0,01 % al 0,20% y más preferentemente en el intervalo del 0,02% al 0,10% en peso por peso total de la composición. El agente quelante es útil para quelar iones metálicos en la composición que pueden ser perjudiciales para la vida útil de la formulación. Si bien el BHT y el edetato de disodio son los agentes antioxidantes y quelantes particularmente preferidos, respectivamente, para algunos compuestos, por lo tanto, pueden sustituirse por otros antioxidantes y agentes quelantes adecuados y equivalentes, como sabrán los expertos en la técnica.

Administración/Dosificación

El régimen de administración puede afectar a lo que constituye una cantidad eficaz. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas se pueden administrar al paciente antes o después de una intervención quirúrgica relacionada con el cáncer, o poco después de que el paciente haya sido diagnosticado con cáncer. Además, varias dosis divididas, así como las dosis escalonadas pueden administrarse diariamente o secuencialmente, o la dosis puede infundirse continuamente, o puede ser una inyección en bolo. Además, las dosis de las formulaciones terapéuticas pueden aumentarse o disminuirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.

La administración de las composiciones de la presente invención a un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente, un ser humano, puede llevarse a cabo usando procedimientos conocidos, en dosificaciones y durante períodos de tiempo eficaces para tratar un cáncer en el paciente. Una cantidad eficaz del compuesto terapéutico necesaria para lograr un efecto terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como la actividad del compuesto particular empleado; la hora de administración; la velocidad de excreción del compuesto; la duración del tratamiento; otros fármacos, compuestos o materiales usados en combinación con el compuesto; la patología o el trastorno, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud general y los antecedentes médicos anteriores del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o se puede reducir proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Un ejemplo no limitativo de un intervalo de dosis eficaz para un compuesto terapéutico de la invención es de aproximadamente 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal/por día. Un experto en la materia podría estudiar los factores relevantes y determinar la cantidad eficaz del compuesto terapéutico sin una experimentación excesiva.

El compuesto se puede administrar a un animal con tanta frecuencia como varias veces al día, o se puede administrar con menos frecuencia, tal como una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o incluso con menos frecuencia, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al año o menos. Se entiende que la cantidad del compuesto administrado al día se puede administrar, en ejemplos no limitativos, cada día, en días alternos, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días o cada 5 días. Por ejemplo, con la administración en días alternos, se puede iniciar una dosis de 5 mg al día el lunes con una primera dosis posterior de 5 mg al día administrada el miércoles, una segunda dosis posterior de 5 mg al día se puede administrar el viernes, etc. La frecuencia de la dosis es fácilmente evidente para el experto en la materia y depende de varios factores, tal como, pero sin limitación, el tipo y gravedad de la enfermedad que se está tratando, y el tipo y edad del animal. Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración concretos, sin ser tóxicos para el paciente. Un doctor, por ejemplo, médico o veterinario, que sea un experto habitual en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar las dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.

Es especialmente ventajoso formular el compuesto en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los pacientes que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Las formas farmacéuticas unitarias de la invención están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto terapéutico y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos/formular dicho compuesto terapéutico para el tratamiento de un cáncer en un paciente.

Vías de administración

Un experto en la técnica reconocerá que aunque se puede usar más de una vía para la administración, una vía concreta puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.

Las vías de administración de cualquiera de las composiciones de la invención incluyen la inhalación, oral, nasal, rectal, parenteral, sublingual, transdérmica, transmucosal (por ejemplo, sublingual, lingual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (por ejemplo, trans- y perivaginal), (intra)nasal y (trans)rectal), intravesical, intrapulmonar, intraduodenal, intragástrica, intratecal, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intrarterial, intravenosa, intrabronquial, inhalación y administración tópica. Las composiciones adecuadas y las formas farmacéuticas incluyen, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, comprimidos encapsulados, píldoras, cápsulas de gel, trociscos, dispersiones, suspensiones, soluciones, jarabes, gránulos, perlas, parches transdérmicos, geles, polvos, restos, magmas, pastillas para chupar, cremas, pastas, apósitos, lociones, discos, supositorios, aerosoles líquidos para administración nasal u oral, polvo seco o formulaciones en aerosol para inhalación, composiciones y formulaciones para administración intravesical y similares. Debe entenderse que las formulaciones y composiciones que serían útiles en la presente invención no están limitadas a las formulaciones y composiciones particulares que se describen en el presente documento.

Formulaciones de liberación controlada y sistemas de administración de fármacos

Las formulaciones de liberación controlada o sostenida de una composición farmacéutica de la invención se pueden preparar usando tecnología convencional. En algunos casos, las formas de dosificación que se van a utilizar pueden proporcionarse como liberación lenta o controlada de uno o más principios activos utilizando, por ejemplo, hidropropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, revestimientos multicapa, micropartículas, liposomas o microesferas o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Formulaciones adecuadas de liberación controlada conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente para su uso con las composiciones farmacéuticas de la invención. Por lo tanto, formas de dosificación unitarias únicas adecuadas para la administración oral, tales como comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel y cápsulas, que están adaptados para liberación controlada están abarcados por la presente invención.

La mayoría de los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen el objetivo común de mejorar la terapia con medicamentos en comparación con la lograda por sus contrapartes no controladas. De manera ideal, el uso de una preparación de liberación controlada diseñada de manera óptima en el tratamiento médico se caracteriza por el empleo de un mínimo de sustancia farmacológica para curar o controlar la afección en una cantidad mínima de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen una actividad prolongada del fármaco, frecuencia de dosificación reducida y mayor cumplimiento por parte del paciente. Además, las formulaciones de liberación controlada se pueden usar para afectar el tiempo de inicio de la acción u otras características, tales como el nivel en sangre del fármaco y, por lo tanto, puede afectar la aparición de efectos secundarios.

Estimulación de la respuesta inmune.

La inmunidad antitumoral y la estimulación de la respuesta inmune mediada por linfocitos T pueden proporcionarse administrando al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo de DKK2 o un fragmento del mismo con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los linfocitos T de activación (células T) y su uso dentro de la inmunoterapia para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas, es bien conocido en la técnica (Melief et al., Immunol. Rev., 1995, 145:167-177; Riddell et al., Annu. Rev. Immunol., 1995, 13:545-586).

Tal como se desvela en la presente invención, la eliminación de DKK2 conduce a la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ y la supresión de tumores.

Los marcadores para la activación de CTL podrían ser, pero sin limitación, citotoxinas tales como perforina, granzimas y granulisina, citocinas, IL-2, IL-4, CD25, CD54, CD69, CD38, CD45RO, CD49d, CD40L, CD137, CD134. La medición en una muestra del nivel de al menos uno de estos marcadores puede usarse para evaluar la activación de CTL como se presenta en la presente sección de Ejemplos. La clasificación de linfocitos T, o en general cualquier célula de la presente invención, puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de una variedad de clasificadores de células disponibles comercialmente, que incluyen, pero sin limitación, clasificador MoFlo (DakoCytomation, Fort Collins, Colo.), FACSAria™, FACSArray™, FACSVantage™, BD™ LSR II y FACSCalibur™ (b D Biosciences, San Jose, California).

Angiogénesis

La angiogénesis es un proceso normal y vital en el crecimiento y el desarrollo, así como en la cicatrización de heridas y en la formación de tejido de granulación. La regulación normal de la angiogénesis se rige por un delicado equilibrio entre los factores que inducen la formación de vasos sanguíneos y los que detienen o inhiben el proceso. Cuando este equilibrio se destruye, generalmente da como resultado una angiogénesis patológica que provoca un aumento de la formación de vasos sanguíneos. La angiogénesis patológica es un sello distintivo del cáncer y de diversas enfermedades isquémicas e inflamatorias (por ejemplo, enfermedades cardiovasculares). Como los tumores no pueden crecer más allá de un cierto tamaño o diseminarse sin un suministro de sangre, el bloqueo de la angiogénesis tumoral es un enfoque eficaz en la terapia contra el cáncer. También el uso de inhibidores de la angiogénesis, también conocidos como agentes antiangiogénicos, es conocido en la técnica como relevante para el tratamiento de enfermedades isquémicas e inflamatorias. En una realización de la presente invención, el agente reductor de DKK2 es un inhibidor de la angiogénesis que previene o ralentiza el crecimiento del cáncer.

Diagnóstico y tratamiento

En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para diagnosticar un cáncer o una predisposición a desarrollar un cáncer o una metástasis en un sujeto. El método comprende determinar el nivel de expresión del gen DKK2 en una muestra biológica del sujeto, donde un aumento en el nivel de expresión de DKK2 en comparación con un nivel de control normal de expresión de DKK2 es una indicación de que el sujeto tiene cáncer o tiene predisposición a desarrollar cáncer o metástasis.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para determinar la eficacia del tratamiento de inmunoterapia para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende determinar el nivel de expresión del gen DKK2 en una muestra biológica del sujeto, donde un aumento en el nivel de expresión de DKK2 en comparación con el nivel de expresión de DKK2 en un control normal es una indicación de que el tratamiento de inmunoterapia será eficaz. En algunos aspectos, el tratamiento del cáncer puede incluir el tratamiento de tumores sólidos o el tratamiento de metástasis. La metástasis es una forma de cáncer en la que las células transformadas o malignas viajan y propagan el cáncer de un sitio a otro. Dichos cánceres incluyen cánceres de piel, mama, de cerebro, cuello de útero, de testículos, etc. Más particularmente, los cánceres pueden incluir, pero no se limitan a los siguientes órganos o sistemas: cardíaco, de pulmón, gastrointestinal, tracto urogenital, de hígado, de huesos, sistema nervioso, ginecológico, hematológico, de piel y de glándulas suprarrenales. Más particularmente, los métodos del presente documento pueden usarse para tratar gliomas (Schwannoma, glioblastoma, astrocitoma), neuroblastoma, feocromocitoma, paraganlioma, meningioma, carcinoma de la corteza suprarrenal, cáncer de riñón, cáncer vascular de varios tipos, osteocarcinoma osteoblástico, cáncer de próstata, cáncer de ovario, leiomiomas uterinos, cáncer de las glándulas salivales, carcinoma de plexo coroideo, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de colon y leucemia megacarioblástica. El cáncer de piel incluye melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Karposi, lunares nevos displásicos, lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides y psoriasis.

Cantidad estándar de control de la expresión del gen de interés (DKK2)

El método desvelado en el presente documento incluye comparar una cantidad medida de expresión de DKK2 en una muestra biológica de un sujeto con una cantidad de control (es decir, la referencia) de expresión de DKK2.

El nivel de control estándar de expresión de DKK2 puede obtenerse midiendo el nivel de expresión de DKK2 en un sujeto sano. Preferentemente, el sujeto sano es un sujeto de edad similar, género y raza y nunca se le ha diagnosticado ningún tipo de enfermedad grave, en particular ningún tipo de cáncer.

La cantidad de control de expresión de DKK2 puede ser un valor para la expresión de DKK2 que se acepta en la técnica. Este valor de referencia puede ser un valor inicial calculado para un grupo de sujetos basado en los valores promedio o promedio de la expresión de DKK2 aplicando métodos estadísticos estándar.

El nivel de expresión se puede determinar mediante un método seleccionado del grupo que consiste en detectar el ARNm del gen, detectar una proteína codificada por el gen y detectar una actividad biológica de la proteína codificada por el gen.

En determinados aspectos de la presente divulgación, el nivel de expresión de DKK2 se determina en una muestra de un sujeto. La muestra incluye preferentemente células tumorales, cualquier líquido del entorno de las células tumorales (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.) o cualquier fluido que esté en contacto fisiológico o en la proximidad del tumor, o cualquier otro fluido corporal además de los enumerados en el presente documento también debe considerarse.

Métodos de medición

Puede emplearse cualquier método conocido por los expertos en la técnica para determinar el nivel de expresión de DKK2. Por ejemplo, se puede utilizar una micromatriz. Las micromatrices son conocidas en la técnica y consisten en una superficie a la que las sondas que corresponden en secuencia a productos génicos (por ejemplo, ARNm, polipéptidos, fragmentos de los mismos, etc.) se pueden hibridar o unir específicamente a una posición conocida. Para detectar al menos un gen de interés, se forma una muestra de hibridación poniendo en contacto la muestra de prueba con al menos una sonda de ácido nucleico. Una sonda preferida para detectar DKK2 es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar con ARNm de DKK2. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un oligonucleótido de al menos 10, 15 o 20 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones rigurosas con la diana apropiada. La muestra de hibridación se mantiene en condiciones que son suficientes para permitir la hibridación específica de la sonda de ácido nucleico con una diana de interés. La hibridación específica se puede realizar en condiciones de alta rigurosidad o condiciones de rigurosidad moderada, según sea adecuado. En un aspecto preferido, las condiciones de hibridación para la hibridación específica son muy rigurosas. La hibridación específica, si está presente, luego se detecta utilizando métodos estándar. Si se produce una hibridación específica entre la sonda de ácido nucleico y un gen en la muestra de prueba, la secuencia que está presente en la sonda de ácido nucleico también está presente en el ARNm del sujeto. También se puede usar más de una sonda de ácido nucleico. Los datos de intensidad de hibridación detectados por el escáner son adquiridos y procesados automáticamente por el programa informático Affymetrix Microarray Suite (MASS). Los datos brutos se normalizan a niveles de expresión utilizando una intensidad diana de 150. Un método alternativo para medir los perfiles de expresión de ARNm de un pequeño número de genes diferentes es, por ejemplo, mediante los ensayos clásicos de expresión génica TaqMan® o TaqMan® Low Density Array: tarjetas micro fluídicas (Applied Biosystems). Particularmente, la presente invención utiliza preferentemente un sistema qPCR. Los ejemplos no limitantes incluyen kits comerciales tales como PrimePCRPathways® disponible comercialmente de Bio-rad (Berkley, California).

El estado transcripcional de una muestra, particularmente ARNm, también se puede medir mediante otras tecnologías de expresión de ácidos nucleicos conocidas en la técnica. El ARNm se puede aislar de la muestra usando cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen kits comerciales, tales como el RNeasy® disponible comercialmente en Qiagen (Países Bajos) o el Mini Kit el TRI Reagent® disponible comercialmente en Molecular Research Center, Inc. (Cincinnati, Ohio), se puede utilizar para aislar ARN. Generalmente, el ARNm aislado puede amplificarse usando métodos conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen sistemas de amplificación que utilizan, por ejemplo, metodologías de PCR o RT-PCR. Para obtener una descripción general de la tecnología de amplificación, véase, por ejemplo, Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1995).

Otro método preciso para perfilar la expresión de ARNm puede ser el uso de la secuenciación de próxima generación (NGS), incluidas las tecnologías de secuenciación de próxima generación primera, segunda, tercera y subsiguientes.

En otros aspectos de la presente divulgación, determinar la cantidad o detectar la actividad biológica de un péptido, el polipéptido se puede conseguir por todos los medios conocidos en la técnica para determinar la cantidad de un péptido o polipéptido en una muestra. Estos medios comprenden dispositivos y métodos de inmunoensayo que pueden utilizar moléculas marcadas en varios formatos de ensayo sándwich, de competición u otros. Dichos ensayos desarrollarán una señal indicativa de la presencia o ausencia del péptido o polipéptido. Por otra parte, la fuerza de la señal puede, preferentemente, estar correlacionada directa o indirectamente (por ejemplo, inversamente proporcional) con la cantidad de polipéptido presente en una muestra. Otros métodos adecuados comprenden medir una propiedad física o química específica para el péptido o polipéptido, como su masa molecular precisa o espectro de RMN. Dichos métodos comprenden, preferentemente, biosensores, dispositivos ópticos acoplados a inmunoensayos, biochips, dispositivos analíticos como espectrómetros de masas, analizadores de RMN o dispositivos de cromatografía. Además, los métodos incluyen métodos basados en ELISA de microplacas, inmunoensayos robóticos o totalmente automatizados (disponibles, por ejemplo, en analizadores Elecsys™), CBA (un ensayo enzimático de unión al cobalto, disponible, por ejemplo, en los analizadores Roche-Hitachi™) y ensayos de aglutinación de látex (disponibles, por ejemplo, en los analizadores Roche-Hitachi™).

Kit

También se desvela un conjunto de anticuerpos preferidos, ya sea marcados (por ejemplo, con fluorescencia, inactivadores, etc.) o sin marcar, que son útiles para la detección de al menos DKK2.

También se proporcionan kits. Los kits disponibles comercialmente para su uso en estos métodos son, en vista de la presente memoria descriptiva, conocidos por los expertos en la técnica. En general, los kits comprenderán un reactivo de detección que sea adecuado para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico, o ARNm de interés.

En otro aspecto, hay un panel de anticuerpos que puede comprender un anticuerpo neutralizante y agotamiento de DKK2 dirigido a un epítopo de DKK2 como se define en las reivindicaciones, es decir, que se une específicamente a un epítopo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en KLNSIKSSLGGETPG (SEQ ID NO 1), CKVWKDATYSSKAR (SEQ ID NO 5) y CARHFWTKIC (SEQ ID NO 7). Puede diseñarse un panel de conjuntos de sondas para detectar el nivel de DKK2 y proporcionar información sobre el diagnóstico de cáncer o la predisposición a desarrollar un cáncer o una metástasis. Los conjuntos de sondas son particularmente útiles porque son más pequeños y más baratos que los conjuntos de sondas que están destinados a detectar tantos péptidos como sea posible en un genoma particular. Los conjuntos de sondas pueden estar dirigidos a la detección de polipéptidos que son informativos sobre los genes del cáncer. Los conjuntos de sondas también pueden comprender un número grande o pequeño de sondas que detectan péptidos que no son informativos sobre el cáncer. Estas sondas son útiles como controles y para la normalización (por ejemplo, marcadores añadidos). Los juegos de sondas pueden ser una mezcla seca o una mezcla en solución. Los juegos de sondas se pueden fijar a un sustrato sólido para formar una serie de sondas. Las sondas pueden ser anticuerpos o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, formas químicamente modificadas de ADN y a Rn ), ANB (ácidos nucleicos bloqueados) o ANP (ácidos nucleicos peptídicos) o cualquier otro compuesto polimérico capaz de interactuar específicamente con los péptidos o secuencias de ácidos nucleicos de interés.

Se contempla que los kits pueden diseñarse para aislar y/o detectar péptidos (por ejemplo, DKK2, conocer los marcadores de cáncer, activadores inmunes o proteínas apoptóticas) o secuencias de ácidos nucleicos en prácticamente cualquier muestra (por ejemplo, sangre leucémica, células tumorales, tejido tumoral, etc.), y una amplia variedad de reactivos y métodos son, en vista de la presente memoria descriptiva, conocidos en la técnica.

Ejemplos

La invención se describe ahora en referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan con fin ilustrativo.

Ejemplo Comparativo 1: La deleción genética de DKK2 conduce a una reducción de la carga tumoral en ratones APCMín/+

Los ratones APCMín/+ (denominados APC) y APCMín/+ DKK2'A (APCKO) se alojaron en un vivero libre de patógenos específicos. En ausencia de DKK2, la progresión del tumor se redujo significativamente según lo indicado por el menor número y tamaño del tumor (Figuras 1A y 1B). En consecuencia, anomalías inducidas por tumores como esplenomegalia, atrofia tímica y linfopenia (You, S., et al., Int J Exp Pathol, 2006. 87(3): págs. 227-36) fueron significativamente menores en ratones APCKO. Este fenómeno se observó en grupos de ratones machos y hembras con dietas altas y bajas en grasas con resultados consistentes. Conjuntamente, estos datos sugieren fuertemente que en ausencia de DKK2, la progresión del cáncer de colon es significativamente menor. Dado que algunos estudios han relacionado la DKK2 con un aumento o disminución de la proliferación de células tumorales (Hirata, H., et al., Clin Cancer Res, 2009. 15(18): págs. 5678-87; Hauer, K., et al., Cancer Res, 2013. 73(2): págs. 967-77), DKK2 se probó por su posible participación en la promoción de la proliferación. En esta investigación, las células MC38 de carcinoma de colon de ratón (Mayo Clinic) se trataron con DKK2 recombinante (rDKK2) 24 horas después, luego se midió el efecto sobre la proliferación celular usando un kit ATPlite (PerkinElmer) y un hemocitómetro (Fig. 2). Los datos muestran que rDKK2 no influye en la proliferación de células MC38. La neutralización de DKK2 con sus anticuerpos neutralizantes tampoco alteró la proliferación de MC38 (no mostrado). El análisis histológico de ratones APC y APCKO para la expresión de Ki67, una proteína asociada con la proliferación celular, tampoco mostró diferencias significativas en la proliferación del tumor o la región normal.

Ejemplo Comparativo 2: La falta de DKK2 aumenta la activación de CD8+ sin efectos significativos sobre otras subpoblaciones de leucocitos o marcadores.

Para probar si la expresión de DKK2 puede alterar el microambiente del tumor para generar una respuesta inmunitaria antitumoral adecuada, se analizaron los niveles y la actividad antitumoral de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Debido a la naturaleza de sus tumores, los ratones APC brindan una oportunidad única para estudiar la región del tumor y compararla con la normal adyacente. El análisis, incluida la medición de los niveles, marcador de activación y producción de citocinas de CD4 (IL-2, IFNg, TNFa, CD25, CD69, FoxP3), las células y algunas propiedades supresoras de MDSC (función Arginasa e iNOS) no mostraron diferencias en los ratones APC frente a APCKO.

Otros órganos como las placas de Peyer (PP), el bazo, los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), la lámina propia, el timo y la médula ósea también se analizaron y no se observaron diferencias significativas.

Una de las principales actividades antitumorales del sistema inmunitario incluye la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+ reactivos al tumor (Waldner et al., World J Gastroenterol, 2006. 12(45): págs. 7233-8). Los CTL mediante el reconocimiento de su antígeno afín dentro del MHC I, se dirigen a las células tumorales y liberan compuestos citotóxicos como gzmb (Naito, Y., et al. Cancer Res, 1998. 58(16): págs. 3491-4). La captación de gzmb, que es una serina proteasa, conduce a la activación proteolítica de las caspasas, la escisión de Bid, la fragmentación del ADN y la inducción de apoptosis en las células diana (Thornberry et al., J Biol Chem, 1997. 272(29): págs. 17907-11; Heusel et al., Cell, 1994. 76(6): págs. 977-87). El análisis de los TIL en ratones APC y APCKO reveló un aumento significativo en el porcentaje de células CD8 gzmb+y CD69+ (otro marcador de activación de CD8+) (Fig. 3A). Varios subtipos de linfocitos T CD8+ se infiltran en los tumores intestinales; se descubrió que las células CD8ab+ tenían la diferencia más pronunciada en la expresión de gzmb (datos no mostrados).

El aumento de la expresión de gzmb en TIL CD8 de APCKO coincide con niveles más altos de células apoptóticas en sus tumores detectados en un ensayo TUNEL (Fig. 5). Un análisis más detallado del sistema linfático de ratones APC reveló un nivel significativamente mayor de expresión de gzmb en células CD8+ de PP en 18 semanas de edad (Fig. 3B). Los ratones de 11 semanas, en los que los pólipos son apenas visibles, también fueron analizados para la activación de CD8+ en sus PP. Se observaron aumentos significativos en la expresión de gzmb en PP de APCKO sobre los de APC (Fig. 4). También se analizaron varios otros órganos linfáticos para determinar la expresión de gzmb (es decir, MLN, bazo y LN inguinal), pero no se observó ninguna diferencia.

Ejemplo Comparativo 3: DKK2 intestinal no hematopoyético es el principal responsable del fenotipo en ratones KO.

Anteriormente se informó que DKK2 se expresa en las células epiteliales intestinales (Li et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 2012. 109(28): págs. 11402-7). Para determinar si la expresión de DKK2 en las células epiteliales intestinales en lugar de en las células inmunes/hematopoyéticas podría ser una de las principales causas de reducción de la actividad CD8+ de las PP, se realizaron los dos experimentos siguientes:

A) Generación de ratones DKK2.KO condicionales específicos del intestino: Se generaron ratones con atenuación de DKK2 y se cruzaron con ratones villin-cre inducibles con tamoxifeno cruzados con ratones APC (descendencia designada: APC-V-KO y APC). De hecho, se detectó un aumento de la expresión de gzmb y CD69 en APC-V-KO de 11 semanas de vida tratados con tamoxifeno en comparación con ratones APC en células CD8 de PP (Fig. 7).

B) Transferencia adoptiva de la MO: Para descartar la posibilidad de que la expresión de DKK2 en las células inmunes regule la actividad de linfocitos T CD8+, los ratones Ts /KO fueron irradiados y la transferencia adoptiva de MO de CD45.1+ se realizó en los ratones. Aumento de los niveles de expresión de gzmb en células CD45.1+CD8+ de PP de ratones APCKO (Fig. 6) coincidían con la posibilidad de que la fuente de DKK2 no sea hematopoyética.

Ejemplo 4: El direccionamiento de DKK2 en el cáncer intestinal/de colon tiene beneficios terapéuticos.

DKK2 se secreta y es un candidato adecuado para ser dirigido con anticuerpos (Ab) para reducir la carga tumoral. Si bien DKK2 es importante para el desarrollo de los párpados (Gage et al., Dev Biol, 2008. 317(1): págs. 310-24), no se sabe que tenga una función vital en ratones adultos. La presente invención desvela tres nuevos clones de Ab (YAL008-1-5F8, YAL008-5-1A10 y YAL008-7 1A10; Fig.11) que se desarrollaron con alta especificidad para DKK2, pero no DKK1 (Fig. 8A), que neutraliza DKK2 e inhibe sus funciones antagonistas de Wnt (Fig. 8B). En una prueba preliminar, a los ratones ApC (8 semanas de vida) se les inyectó por vía intraperitoneal YAL008-1-5F8, YAL008-5-1A10, YAL008-7 1A10 o IgG. 8 semanas más tarde se evaluaron sus tumores intestinales y se observaron disminuciones significativas en el número de tumores y el volumen de los ratones tratados con ab a-Dkk2 junto con anomalías inmunes inducidas por tumores más bajas (Figuras 9A y 9B).

El tratamiento tuvo poco efecto sobre el peso corporal, lo que sugiere que puede no inducir efectos secundarios significativos (Fig. 9C). Los resultados indican una reducción significativa de tumor/pólipo tras la deleción global de DKK2 en un modelo de ratón con cáncer de colon. Esto coincide con una mayor expresión de gzmb en células CD8+ de PP en estos ratones (Fig. 10). Conjuntamente, estos resultados demuestran que se desarrollaron anticuerpos funcionales (Ab) que pueden dirigir y neutralizar DKK2 y disminuir la carga tumoral en ratones APC, proporcionando una prueba de evidencia principal para la aplicación terapéutica de direccionamiento de DKK2. Esta diferencia en la expresión de gzmb es un contribuyente significativo a la disminución de la carga tumoral/pólipo en los ratones APCKO. Por lo tanto, los datos presentados en el presente documento resaltan el papel crítico de DKK2 en la progresión del cáncer de intestino/colon.

Ejemplo 5: El direccionamiento de DKK2 en modelos de ratón de injerto de células de cáncer de colon muestra que DKK2 es un factor importante para la regulación del comportamiento del tumor y el microambiente.

Las células MC38, que se obtuvieron del carcinoma de colon de ratón en un ratón C57B, progresan muy rápido cuando se injertan en ratones TS C57BL inmunocompetentes. Por lo tanto, este modelo de xenoinjerto sirve como una buena alternativa a los modelos tumorales avanzados agresivos, que se pueden utilizar para probar el potencial terapéutico de los Ab a-Dkk2 para el tratamiento de cánceres avanzados. En un estudio, se injertaron ratones C57BL (n=5 por grupo) con células MC38. Seis días después, los ratones se trataron por vía intraperitoneal (IP) con IgG de ratón o Ab a-Dkk2 (YAL008-1-5F8) a 8 mg/kg. La Fig. 13A muestra que YAL008-1-5F8 inhibe significativamente el crecimiento tumoral. La inmunotinción de las secciones tumorales revela que YAL008-1-5F8 aumenta la apoptosis de las células tumorales y las células positivas para Granzima B (Fig. 13B). Cabe destacar que, el análisis de citometría de flujo de los leucocitos infiltrados en estos tumores injertados no muestra diferencias en el número de CD45, linfocitos citolíticos naturales, CD8+, células mieloides o CD4, pero el tratamiento con YAL008-1-5F8 dio como resultado aumentos significativos en leucocitos positivos para CD45 positivos para Granzima B, incluidos linfocitos citolíticos naturales y células CD8+ positivas para Granzima B (Fig.14). Estos resultados son consistentes con el estudio del modelo genético de que la neutralización de DKK2 suprime la formación de tumores a través de un mecanismo que involucra la regulación de las células inmunes efectoras.

La Fig. 15 muestra que el tratamiento a más largo plazo del anticuerpo anti-DKK2 dio como resultado una reducción adicional en la formación de tumores en el modelo de aloinjerto usando las células MC38. Además, el anticuerpo muestra un efecto óseo-dependiente sobre la supresión de la formación de tumores. Además de los aumentos en las células positivas para Granzima B y la apoptosis de las células tumorales en los tumores tratados con el anticuerpo (YAL008-1-5F8), el tratamiento más prolongado conduce a un aumento de linfocitos T CD8+ y reducción de la angiogénesis y proliferación tumoral (Fig. 16).

Ejemplo 6: Direccionamiento de DKK2 en un modelo de cáncer colorrectal avanzado.

Si bien los ratones APC son uno de los modelos de ratón más establecidos, sus pólipos rara vez se transforman en carcinoma. Para estudiar el direccionamiento de DKK2 en modelos de cáncer de colon con mutaciones oncogénicas más fuertes que desarrollan tumores y no solo pólipos, se crían varias cepas de ratón: ratones C57BL/6APCtmlTyJ/J, ratones B6.129S4-Krasta4Tyj/J y ratones villin-CreER2. El tamoxifeno se inyecta a la edad de 5 semanas. Se tratan 3 grupos de ratones (n = 5) con 200 ug de YAL008-1-5F8/YAL008-5-IA10/IgG a partir de las 9 semanas cada 72 horas hasta las 18 semanas. Sus intestinos se fijan, las PP se aíslan para el análisis FACS y la evaluación de la carga tumoral. El bazo, timo, y la sangre también se recolecta para analizarlos en busca de linfopenia (linfocitos B/T). Después de la evaluación del tumor, el intestino se procesa para evaluación histológica. Los resultados deberían mostrar un número y volumen de tumores disminuidos en los ratones tratados con YAL008-1-5F8 y YAL008-5-1A10 en comparación con los ratones tratados con IgG. Por otra parte, se detectaron niveles más altos de gzmb en las células CD8 de las PP.

Ejemplo 7: Direccionamiento de DKK2 en ratones APC con pólipos y tumores establecidos.

El tratamiento se realiza en ratones APC comprados de 16 semanas de vida (pólipos/tumor completamente desarrollados) con 200 ug de YAL008-1-5F8, YAL008-5-1A10 o IgG durante 5 semanas cada 72 horas. En el día del criterio de valoración, los datos se recopilan como se describió anteriormente en el ejemplo 7. Debe observarse una disminución significativa en la carga tumoral (número y volumen) de los ratones tratados con Ab a-DKK2. También deben detectarse niveles más altos de gzmb en sus células CD8 de las PP.

Ejemplo Comparativo 8: Investigación de las fuentes de DKK2 que promueven el crecimiento tumoral.

Para investigar el papel de DKK2 producido por tumores en la formación de tumores, a un grupo de ratones se le inyectan células DKK2-ARNhc-MC38 y al otro se le inyectan células ctrl-ARNhc-MC38. El ARNhc de DKK2 reduce la expresión de DKK2 en más de la mitad (Fig. 17, panel izquierdo). Las células DKK2-ARNhc-MC38 muestran una formación tumoral significativamente más lenta en el modelo de injerto que las células ctrl-ARNhc-MC38 (Fig. 17, panel central). Cabe destacar que, hay aumentos en células positivas para Granzima B y células apoptóticas en los tumores injertados con células DKK2-ARNhc-MC38 (Fig. 17, panel derecho).

Para investigar el papel de DKK de los hospedadores, los presentes inventores injertaron células MC38 en ratones TS C57BL o C57BL nulos para DKK2. La figura 18 muestra que los tumores se forman más lentamente en ratones sin DKK2. Además, hay aumentos en células granzima B+ y células apoptóticas en los tumores injertados en los ratones sin DKK2.

En conjunto, estos datos indican que el DKK2 producido por las células tumorales y el hospedador son importantes para sustentar el crecimiento tumoral.

Ejemplo 9: El papel de los linfocitos T en la reducción de la carga tumoral en ratones APC tratados con YAL008-1-5F8.

Los resultados descritos en el presente documento previamente han demostrado que una disminución significativa en la carga tumoral en ratones APC tratados con APCKO y YAL008-1-5F8 se acompaña de niveles más altos de expresión de gzmb en el tumor de APCKO y PP de ratones tratados con YAL008-1-5F8. Para investigar si los linfocitos T son responsables de tales fenómenos o si se detecta un gzmb más alto porque hay menos supresión inducida por tumores, se utilizan ratones que carecen de linfocitos T. Los ratones deficientes en Rag2 se cruzan con ratones APC. Se tratan ratones APC con inactivación génica de linfocitos T/B (n = 5) con YAL008-1-5F8 o IgG durante 8 semanas. En el día del criterio de valoración, los ratones se sacrifican y se estudia su carga tumoral. No deben detectarse diferencias significativas en la carga tumoral de estos 2 grupos. Por lo tanto, la falta de DKK2 está provocando una mayor expresión de gzmb en los linfocitos T que se infiltran en los tumores intestinales y destruyen las células cancerosas.

Ejemplo Comparativo 10: El papel de DKK2 en la regulación de la activación de linfocitos T.

Es importante saber si DKK2 influye directamente en la expresión de gzmb en los linfocitos T o si influye en otras células/factores, que regulan su expresión. Para estudiar este asunto, se aíslan linfocitos T CD8+ del bazo, MLN, iel y PP. Estas células se incuban en placas recubiertas con CD3/CD28 con o sin rDKK2 y rWnt3a en sus medios. Después de 48 y 72 horas, correspondientes respectivamente a la activación temprana y media, las muestras se recogen y analizan para determinar la expresión de gzmb mediante FACS. Se administra una dosis adicional de rDKK2 a los pocillos a las 48 horas ya que rDKK2 pierde su bioactividad en incubaciones largas. Se debe detectar una disminución en la expresión de gzmb una vez que se agrega rDKK2 a los medios que apoyan la idea de que DKK2 está influyendo directamente en la expresión de gzmb.

Ejemplo 11: El papel de las células de linfocitos intraepiteliales (iel) en la regulación de la carga tumoral: Capacidad de destrucción de iel en presencia y ausencia de rDKK2 y YAL008-1-5F8.

El aumento de la expresión de gzmb en las células CD8 está fuertemente correlacionado con su capacidad citotóxica y propiedades antitumorales. Varios estudios, incluida la presente invención, han demostrado que los iel pueden, de hecho, destruir las células de cáncer de colon (Arvonen et al., Clin Exp Rheumatol, 2010, 28(1): págs. 128-34; Ebert Immunology, 2009. 127(2): págs. 206-15; Di Sabatino et al. Gut, 2006, 55(4): págs. 469-77; Lundqvist et al., J Immunol, 1996. 157(5): págs. 1926-34; Melgar et al., Immunology, 2002. 106(4): págs. 476-85 y Nussler et al., Langenbecks Arch Surg, 2000. 385(3): págs. 218-24). Hasta el momento, los resultados desvelados en el presente documento han demostrado que la expresión de gzmb en Tils CD8+ de APCKO estaban particularmente elevados y la fuente de estas células pueden ser los linfocitos intraepiteliales del intestino. El fenotipo de estas células es consistente con el de iel, ya que son altamente gzmb+, > 95 % CD69+, y una población CD4+CD8+ significativa (un sello distintivo de iel CD4+ activado) se observa (Pahar et al., Eur J Immunol, 2006. 36(3): págs. 583-92).

Para estudiar si DKK2 o su inhibición pueden regular directamente la capacidad de destrucción de los iels, los iel CD8+ de ratones APC de 11 semanas de vida se clasifican mediante FACS y se incuban con células MC38 10K en una relación E:T de 10: 1 y 5:1. Se añaden rDKK2 (15 nM) y YAL008-1-5F8/IgG (3 nM) a los medios para investigar si DKK2 puede influir directamente en la capacidad de destrucción de los iel. 24 horas después, las células MC38 se analizan para la tinción con AnexinaV y PI mediante FACS. Este experimento se repite 3 veces (n=3 cada vez) y debería mostrar una mayor destrucción en las células tratadas con YAL008-1-5F8 y una disminución en la destrucción en los pocillos tratados con DKK2. Este experimento también se realiza en células APC10.1 que se obtienen de ratones APC (De Giovanni et al., Int J Cancer, 2004, 109(2): págs. 200-6) y debería mostrar resultados similares. Se agrega un inhibidor de gzmb (por ejemplo, Z-AAD-CMK (Biovision, CA) a 25-100 uM) para asegurar el papel de gzmb en las funciones citotóxicas de los iel.

Ejemplo Comparativo 12: El papel de los iel en la regulación de la carga tumoral: Capacidad de destrucción de iel de APC/APCKO y APC/APC-V-KO,

Los iel CD8+ de ratones APC/APCKO y APC/APC-V-KO de 11 semanas se clasifican mediante FACS para comparar su actividad CTL. Los ratones son compañeros de camada y compañeros de jaula de la misma edad/sexo. El experimento se realiza como se describe previamente en el presente documento en el ejemplo 11. Debería detectarse una mayor capacidad citotóxica en los iel de ratones APCKO o APC-V-KO. También se realiza un experimento similar con Tils CD8 de ratones APC/APCKO y APC/APC-V-KO de 24 semanas de vida. En este experimento, los tumores intestinales se recogen y digieren cuidadosamente antes de que FACS clasifique las células CD8. Dado que los tumores son muy pequeños, se agrupan dos ratones por grupo. Para este experimento se utiliza una relación E:T de 5:1.

Ejemplo Comparativo 13: El papel de la señalización de Wnt en la regulación de gzmb en células CD8.

Muchos estudios han relacionado la señalización de Wnt con las funciones de los linfocitos T y la señalización de Wnt en las células de memoria es de particular interés (Xue y Zhao Ann NY Acad Sci, 2012. 1247: págs. 16-33; Jeannet et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 2010. 107(21): págs. 9777-82; Barker et al., Adv Cancer Res, 2000. 77: págs. 1-24 y Zhou et al., Immunity, 2010. 33(2): págs. 229-40). La propiedad antagonista de Wnt de DKK2 podría ser responsable de la regulación negativa de gzmb. Para investigar el papel de Wnt en la regulación de la expresión de gzmb, los linfocitos T CD8+ tímicos sin exposición previa de ratones LRP5/6 KO se clasifican usando perlas, seleccionando así las células sin señalización de Wnt. A continuación, las células se marcan con CFSE y se inyectan por vía i.v. en ratones APC y APC-v-KO de 11 semanas de vida (compañero de jaula/compañero de camada). Como los resultados anteriores mostraron que las células sin exposición previa inyectadas que migran a las PP comienzan a producir gzmb 24-96 horas después de la inyección, las PP se recogen 48 horas después y los niveles de gzmb en las células CFSE+ se miden mediante FACS. Dado que los linfocitos T LRP5/6KO no pueden responder a los ligandos Wnt, no deberían mostrar ninguna diferencia en la expresión de gzmb en ratones APC/APC-v-KO. Por lo tanto, los resultados presentados en el presente documento deberían establecer que la reducción de DKK2 de la expresión de gzmb en las células CD8+ pueden deberse a la inhibición de la señalización de Wnt.

Ejemplo 14: DKK2 para la terapia del cáncer y el uso de anti-DKK2 para mejorar la inmunoterapia del cáncer.

La presente invención describe el papel de DKK2 en el cáncer de colon. Los datos presentados en el presente documento proporcionan argumentos sólidos y convincentes con respecto al papel importante y poco apreciado de DKK2 en la promoción del cáncer de colon. Además, como se muestra en la presente invención actual, el papel de DKK2 en la regulación de gzmb también es muy inesperado. Así, la regulación de la expresión de DKK2 en el cáncer de colon abre las puertas a nuevas opciones terapéuticas para los pacientes. Se están llevando a cabo varios experimentos que incluyen la transferencia adoptiva de varios linfocitos T con inactivación génica a ratones APC/APCKO y el uso de ratones APC/APC-V-KO envejecidos para estudiar su carga tumoral. Si bien la neutralización de DKK2 no parece detener el desarrollo del tumor, el hecho de que pueda aumentar la expresión de gzmb en TIL lo convierte en una excelente herramienta para mejorar las vacunas contra el cáncer u otras inmunoterapias que no han sido 100% efectivas. El uso de anticuerpos contra DKK2 como se presenta en la presente invención es ideal para mejorar la inmunoterapia del cáncer, como la mejora de la vacuna MUC1 y el direccionamiento de PD-1 en el tratamiento del cáncer de colon.

Ejemplo 15: El anticuerpo DKK2 suprime la formación de tumores pulmonares en un modelo de aloinjerto.

Se injertaron células de cáncer de pulmón LLC de ratón en ratones C57BL y se trataron con anticuerpo anti-DKK2 (YAL008-1-5F8). El anticuerpo suprimió la formación de tumores, acompañado de un aumento en las células positivas para Granzima B y en las células tumorales apoptóticas (Fig.19)

Ejemplo comparativo 16. Efecto de DKK2 y Wnt sobre la activación de linfocitos citolíticos naturales.

La línea celular humana de linfocitos citolíticos naturales NK-92 y los linfocitos citolíticos naturales primarios de ratón de bazos y tumores injertados con MC38 se analizaron para determinar su expresión de Granzima y actividad citotóxica en presencia o ausencia de proteínas recombinantes de DKK2, Wnt 3a, Wnt5A y DKK1, y en presencia o ausencia de inhibidores de Wnt (incluido LGK-974) e inhibidores de GSK (incluido CHIR 99021). De esta manera, puede evaluarse la regulación de la activación de los linfocitos citolíticos naturales por DKK2 y Wnt.

Ejemplo 17: El anticuerpo de DKK2 suprime de manera óptima la formación de tumores cuando se asocia con el anticuerpo de PD-1.

Se injertaron ratones C57BL (n = 5 por grupo) con células LLC o MC38. Seis días después, los ratones fueron tratados por vía intraperitoneal (IP) con IgG de ratón, anticuerpo a-Dkk2 (YAL008-1-5F8) y/o anticuerpo PD-1 a 16 mg (8 mg por anticuerpo)/kg. El efecto de YAL-008-1-5F8 sobre la formación de tumores se comparó con un anticuerpo PD-1

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un anticuerpo de depleción y neutralizante de Dickkopf2 (DKK2) que se une específicamente a un epítopo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 5 y 7, donde el anticuerpo es:

(i) anticuerpo monoclonal YAL008-5-1A10 (SEQ ID NOs 8 y 9), YAL008-7-1A10 (SEQ ID NO 12 y 13), YAL008-1-5F8 (SEQ ID NO 10 y 11) o 1A10 (SEQ ID NO 9 y 11); o;

(ii) un anticuerpo sintético que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO 8 y 9, o las SEQ ID NO 12 y 13, o las SEQ ID NO 10 y 11; o

(iii) una versión humanizada o humana del anticuerpo monoclonal de (i); o

(iv) un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal de (i) tal como un fragmento de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

2. Un kit para diagnosticar un cáncer que expresa DKK2 o una predisposición a desarrollar dicho cáncer o una metástasis del mismo en un sujeto, comprendiendo el kit un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 1.

3. El kit de la reivindicación 2, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer intestinal, cáncer de páncreas y cáncer de esófago.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa DKK2 en un mamífero.

5. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el cáncer comprende células tumorales que expresan una mutación de poliposis adenomatosa del colon (APC).

6. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer intestinal, cáncer de páncreas, cáncer de esófago y melanoma maligno.

7. La composición para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 4-6, donde la administración de la composición reduce la angiogénesis tumoral asociada con el cáncer.

8. La composición para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 4-6, donde la administración de la composición estimula una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ contra el cáncer en el sujeto.

9. La composición para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 4-8, que comprende además el uso de un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo de muerte celular programada 1 (PD-1), un agente quimioterapéutico, un agente de anti-proliferación celular, un agente inmunoterapéutico y cualquier combinación de los mismos.

10. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la composición y el agente adicional deben coadministrarse al mamífero, preferentemente, la composición y el agente adicional se formulan conjuntamente para la coadministración al mamífero.

11. La composición para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 4-10, donde la vía de administración se selecciona del grupo que consiste en inhalación, oral, rectal, vaginal, parenteral, tópica, transdérmica, pulmonar, intranasal, bucal, oftálmica, intratecal y cualquier combinación de las mismas.

12. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-11, donde el mamífero es un ser humano.