ES2709700T3 - Anticuerpos para M-CSF - Google Patents

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ES2709700T3 ES16201588T ES16201588T ES2709700T3 ES 2709700 T3 ES2709700 T3 ES 2709700T3 ES 16201588 T ES16201588 T ES 16201588T ES 16201588 T ES16201588 T ES 16201588T ES 2709700 T3 ES2709700 T3 ES 2709700T3
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Vahe Bedian
Madhav Narasimha Devalaraja
Joseph Edwin Low
James Leslie Mobley
Sirid-Aimee Kellermann
Ian Foltz
Mary Haak-Frendscho
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Warner Lambert Co LLC
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Amgen Fremont Inc
Warner Lambert Co LLC
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano o una porción de unión a antígeno del mismo que se une de forma específica a M-CSF, en donde el anticuerpo comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:26 sin los diecinueve restos de aminoácidos de la secuencia señal (restos 1-19 de la SEQ ID NO: 26), y (b) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 28 sin los veintidós restos de aminoácidos de la secuencia señal (restos 1-20 de la SEQ ID NO: 28); y en donde el anticuerpo tiene al menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste en: (i) inhibe la proliferación celular dependiente del M-CSF con una CI50 de 8 x 10-8 M o menor; (ii) inhibe el cambio de forma de los monocitos humanos dependiente del M-CSF con una CI50 de 9 x 10-8 M o menor; y (iii) inhibe la unión del receptor de M-CSF con una CI50 de 7 x 10-8 M o menor.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos para M-CSF
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/502,163, presentada el 10 de septiembre de 2003.
Antecedentes de la invencion
El factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF) es un miembro de la familia de protemas denominadas factores estimulantes de colonias (CSF). El M-CSF es una glicoprotema secretada o de superficie celular que consta de dos subunidades que se unen mediante un enlace disulfuro con una masa molecular total que vana de 40 a 90 kD ((Stanley E.R., et al., Mol. Reprod. Dev., 46:4-10 (1997)). Al igual que otros CSF, el M-Cs F se produce por macrofagos, monocitos y las celulas del tejido articular, tales como los condrocitos y los fibroblastos sinoviales, en respuesta a protemas tales como la interleucina-1 o el factor de necrosis tumoral alfa. El M-CSF estimula la formacion de colonias de macrofagos a partir de celulas madre progenitoras hematopoyeticas pluripotenciales (Stanley E.R., et al., Mol. Reprod. Dev., 46:4-10 (1997)).
El M-CSF se une a su receptor, c-fms, para ejercer un efecto biologico. El c-fms contiene cinco dominios Ig extracelulares, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular con dos dominios cinasa. Tras la union del M-CSF al c-fms, el receptor se homodimeriza e inicia una cascada de vfas de transduccion de senales que incluyen las vfas JAK/STAT, PI3K y ERK.
El M-CSF es un importante regulador de la funcion, activacion y supervivencia de monocitos/macrofagos. Una serie de animales modelo han confirmado el papel del M-CSF en varias enfermedades, incluyendo la artritis reumatoide (AR) y el cancer. Los macrofagos comprenden celulas efectoras clave en la AR. Se ha demostrado que el grado de infiltracion de macrofagos sinoviales en la AR esta estrechamente correlacionado con el grado de destruccion articular subyacente. El M-CSF, producido de forma endogena en la articulacion reumatoide por los monocitos/macrofagos, fibroblastos y celulas endoteliales actua en las celulas del linaje de los monocitos/macrofagos para promover su supervivencia y diferenciacion en osteoclastos destructores del hueso y potenciar las funciones celulares proinflamatorias, tales como la citotoxicidad, la produccion de superoxido, la fagocitosis, la quimiotaxis y la produccion secundaria de citocinas. Por ejemplo, el tratamiento con M-CSF en el modelo de artritis experimental inducida por Streptococcus agalactiae sonicadas en ratas da lugar a una patologfa aumentada (Abd, A.H., et al., Lymphokine Cytokine Res. 10:43-50 (1991)). De manera similar, las inyecciones subcutaneas de M-CSF en un modelo murino de artritis inducida por colageno (AIC), que es un modelo para AR, dieron como resultado una exacerbacion significativa de los smtomas de la enfermedad de AR (Campbell I.K., et al., J. Leuk. Biol. 68:144-150 (2000)). Ademas, los ratones MRL/lpr que son altamente susceptibles a la AR y a otras enfermedades autoinmunes tienen altas concentraciones basales de M-CSF en el suero (Yui M.A., et al., Am. J. Pathol. 139:255-261 (1991)). Se ha demostrado la necesidad de M-CSF endogeno para mantener la AIC mediante una reduccion significativa en la gravedad de la enfermedad establecida mediante un anticuerpo monoclonal de raton neutralizante de M-CSF (Campbell I.K., et al., J. Leuk. Biol. 68:144-150 (2000)).
Con respecto al cancer, la inhibicion de los factores estimuladores colonias mediante oligonucleotidos antisentido suprime el crecimiento tumoral en xenoinjertos embrionarios y de tumores de colon en ratones mediante la desaceleracion de la degradacion de MEC mediada por macrofagos (Seyedhossein, A., et al., Cancer Research, 62:5317-5324 (2002)).
La union del M-CSF al c-fms y su posterior activacion de los monocitos/macrofagos es importante en una serie de patologfas. Ademas de la AR y el cancer, los otros ejemplos de patologfas relacionadas con el M-CSF incluyen la osteoporosis, la artritis destructiva, la aterogenesis, la glomerulonefritis, la enfermedad de Kawasaki, y la infeccion por el VIH-1, en las cuales estan implicados los monocitos/macrofagos y tipos celulares relacionados. Por ejemplo, los osteoclastos son similares a los macrofagos y se regulan en parte por el M-CSF. Las senales de crecimiento y diferenciacion inducidas mediante M-CSF en las etapas iniciales de la maduracion de osteoclastos son esenciales para su posterior actividad osteoclastica en el hueso.
La perdida de hueso mediada por osteoclastos, tanto en la forma de erosiones focales de hueso como en la de osteoporosis yuxta-articular mas difusa, es un importante problema sin resolver en la AR. Las consecuencias de esta perdida de hueso incluyen deformidades en la articulacion, discapacidad funcional, riesgo aumentado de fracturas oseas y mortalidad aumentada. El M-CSF es umvocamente esencial para la osteoclastogenesis y el bloqueo experimental de esta citocina en modelos animales de artritis anula satisfactoriamente la destruccion de la articulacion. Se conocen vfas de destruccion que actuan de otras formas en la artritis destructiva, tales como la artritis psoriasica, y podnan representar lugares para una intervencion similar.
La perdida postmenopausica de hueso es el resultado de una remodelacion osea defectuosa secundaria a un desacoplamiento de la formacion osea y la resorcion de hueso mediada por osteoclastos exuberantes como consecuencia de un deficit de estrogenos. Se ha demostrado que la neutralizacion in vivo del M-CSF usando un anticuerpo bloqueante en ratones previene por completo el aumento del numero de osteoclastos, el incremento de la resorcion osea y la perdida osea resultante inducida por ovariectoirna.
Varias lmeas de evidencia senalan un papel principal para el M-CSF en la aterogenesis y en la hiperplasia de la mtima proliferativa despues de un traumatismo mecanico en la pared arterial. Se ha demostrado que todos los tipos importantes de celulas en lesiones ateroescleroticas expresan M-CSF, y esto ademas se regula positivamente mediante exposicion a lipoprotemas oxidadas. El bloqueo de la senalizacion de M-SCF con un anticuerpo neutralizante de c-fms reduce la acumulacion de celulas espumosas derivadas de macrofagos en la rafz aortica de ratones deficientes para apolipoprotema E mantenidos con una dieta alta en grasas.
Se ha descubierto que tanto en la glomerulonefritis experimental como en la humana, la expresion glomerular de M-CSF se co-localiza con la acumulacion local, la activacion y la proliferacion de macrofagos y se correlaciona con el alcance de la lesion glomerular y la proteinuria. El bloqueo de la senalizacion de M-CSF mediante un anticuerpo dirigido contra su receptor c-fms regula negativamente de forma significativa la acumulacion local de macrofagos en ratones durante la respuesta inflamatoria renal inducida por la obstruccion ureteral unilateral experimental.
La enfermedad de Kawasaki (EK) es una vasculitis aguda, febril y pediatrica de causa desconocida. Sus complicaciones mas comunes y serias implican la vasculatura coronaria en la forma de dilatacion aneurismatica. Los niveles de M-CSF en suero estan elevados de forma significativa en la fase aguda de la enfermedad de Kawasaki, y se normalizan tras el tratamiento con inmunoglobulina intravenosa. La arteritis de celulas gigantes (ACG) es una vasculopatfa inflamatoria que se da principalmente en la vejez, en la que los linfocitos T y los macrofagos se infiltran en las paredes de las arterias medias y grandes y dan lugar a consecuencias clmicas que incluyen ceguera y accidentes cerebrovasculares secundarios a la oclusion arterial. La implicacion activa de los macrofagos en la ACG se evidencia por la presencia de niveles elevados de mediadores inflamatorios derivados de macrofagos en las lesiones vasculares.
Se ha comunicado que el M-CSF hace que los macrofagos derivados de monocitos humanos sean mas susceptibles a la infeccion por VIH-1 in vitro. En un estudio reciente, el M-CSF aumento la frecuencia con la que se infectaron los macrofagos derivados de monocitos, la cantidad de ARNm de VIH expresada por celula infectada y el nivel de ADN provmco expresado por cultivo infectado.
Dado el papel del M-CSF en varias enfermedades, es deseable un metodo para inhibir la actividad del M-CSF. existe una necesidad cntica de anticuerpos anti-M-CSF.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona anticuerpos humanos aislados o a porciones de union a antfgeno de los mismos que se unen espedficamente al M-CSF humano y que actuan como un antagonista del M-CSF y a composiciones que comprenden dicho anticuerpo o porcion.
La invencion tambien proporciona composiciones que comprenden la cadena pesada y/o ligera, las regiones variables de las mismas o porciones de union a antfgeno de las mismas de un anticuerpo anti-M-CSF, o a moleculas de acido nucleico que codifican un anticuerpo, cadena de anticuerpo o region variable del mismo de la invencion que es eficaz en dicho tratamiento y a un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, las composiciones pueden comprender otro componente, tal como un agente terapeutico o un agente de diagnostico. Tambien proporciona mediante la invencion metodos de diagnostico y terapeuticos. En ciertas realizaciones, las composiciones se usan en una cantidad terapeuticamente eficaz necesaria para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion particular.
Esta invencion tambien proporciona metodos para tratar o prevenir una variedad de enfermedades y afecciones tal como, pero sin limitacion, inflamacion, cancer, aterogenesis, trastornos neurologicos y trastornos cardfacos con una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion, o una porcion de union a antfgeno del mismo, los acidos nucleicos que codifican dicho anticuerpo o cadena pesada y/o ligera, las regiones variables o las porciones de union a antfgeno de los mismos.
La invencion proporciona lmeas celulares aisladas, tales como hibridomas, que producen anticuerpos anti-M-CSF o porciones de union a antfgeno de los mismos.
La invencion tambien proporciona moleculas de acido nucleico que codifican la cadena pesada y/o ligera de anticuerpos anti-M-CSF, la region variable de los mismos o la porcion de union a antfgeno de los mismos.
La invencion proporciona vectores y celulas hospedadoras que comprenden las moleculas de acido nucleico, asf como metodos para producir de manera recombinante los polipeptidos codificados por las moleculas de acido nucleico.
Tambien proporciona animales transgenicos no humanos o plantas que expresan las cadenas pesadas y/o ligeras, o porciones de union a antfgeno de las mismas, de anticuerpos anti-M-CSF.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1Ay 1B son graficos que ilustran que los anticuerpos anti-M-CSF dieron como resultado una disminucion relacionada con la dosis en el recuento total de monocitos en monos macho y hembra con el paso del tiempo. Los recuentos de monocitos se determinaron mediante dispersion de luz, usando un sistema Cell Dyn de Abbott Diagnostics Inc. Los recuentos de monocitos se controlaron desde las 24 horas hasta las 3 semanas despues de la administracion del vehmulo o anticuerpo 8.10.3 a 0, 0,1, 1 o 5 mg/kg en un volumen de dosis de 3,79 ml/kg durante un penodo de aproximadamente 5 minutos.
Figura 1A monos macho.
Figura 1B monos hembra.
Las figuras 2A y 2B son graficos que ilustran que el tratamiento anti-M-CSF dio como resultado una reduccion en el porcentaje de monocitos CD14+CD16+ en monos macho y hembra, a los 0-21 dfas despues de la administracion del vehmulo o anticuerpo 8.10.3 a 0, 0,1, 1 o 5 mg/kg en un volumen de dosis de 3,79 ml/kg durante un penodo de aproximadamente 5 minutos. Para cada mono de ensayo, se determino el porcentaje de monocitos dentro del subconjunto CD14+CD16+ despues de cada extraccion de sangre, en los dfas 1, 3, 7, 14 y 21 despues de la inyeccion de 8.10.3.
Figura 2A monos macho.
Figura 2B monos hembra.
Las figuras 3A y 3B son graficos que ilustran que el tratamiento con anti-M-CSF dio como resultado un descenso en el cambio porcentual de monocitos totales con todas las dosis de anticuerpo 8.10.3F y anticuerpo 9.14.41 en comparacion con los niveles de monocitos antes del ensayo.
La figura 3A muestra los datos recogidos de los experimentos que usan el anticuerpo 8.10.3F.
La figura 3B muestra los datos recogidos de los experimentos que usan el anticuerpo 9.14.4I.
La figura 4 es un alineamiento de secuencias de las secuencias de aminoacidos predichas de las regiones variables de cadena ligera y pesada de veintiseis anticuerpos anti-M-CSF en comparacion con las secuencias de aminoacidos de lmea germinal de los genes correspondientes a las regiones variables. Se indican en negrita las diferencias entre las secuencias de anticuerpos y las secuencias de genes de lmea germinal. Los guiones no representan cambios respecto de la lmea germinal. Las secuencias subrayadas en cada alineacion representan, de izquierda a derecha, las secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
La figura 4A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 252 (restos 21-127 de la SEQ ID NO: 4) respecto de la secuencia Vk012, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 88 (restos 21-127 de la SEQ ID NO: 8) respecto de la secuencia Vk012, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4C muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 100 (restos 21-127 de la SEQ ID NO: 12) respecto de la secuencia VkL2, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 107).
La figura 4D muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 3.8.3 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 16) respecto de la secuencia VkL5, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 109).
La figura 4E muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 2.7.3 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 20) respecto de la secuencia VkL5, Jk4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 117).
La figura 4F muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 1.120.1 (restos 21-134 de la SEQ ID NO: 24) respecto de la secuencia VkB3, Jk1 de lmea germinal (SEQ ID NO: 112).
La figura 4G muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 252 (restos 20-136 de la SEQ ID NO: 2) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27 Jh6 de lmea germinal (SEQ ID NO: 106).
La figura 4H muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 88 (restos 20-138 de la SEQ ID NO: 6) respecto de la secuencia Vh3-7, Dh6-13, Jh4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 105).
La figura 4I muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 100 (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 10) respecto de la secuencia Vh3-23, Dh1-26, Jh4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 104).
La figura 4J muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 3.8.3 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 14) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, Jh4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 108).
La figura 4K muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 2.7.3 (restos 20-137 de la SEQ ID NO: 18) respecto de la secuencia Vh3-33, Dh1-26, Jh4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 110).
La figura 4L muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 1.120.1 (restos 20-139 de la SEQ ID NO: 22) respecto de la secuencia Vh1-18, Dh4-23,
Jh4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 111).
La figura 4M muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3 (restos 21-129 de la SEQ ID NO: 44) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 114).
La figura 4N muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3 (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 30) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26, JH4b de lmea germinal (SeQ ID nO: 113).
La figura 4O muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 28) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4P muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14.4 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 38) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SeQ ID nO: 116).
La figura 4Q muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.7.2 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 48) respecto de la secuencia VkO 12, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4R muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.7.2 (restos 20-136 de la SEQ ID NO: 46) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh6-13, JH6b de lmea germinal (SEQ ID NO: 115).
La figura 4S muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4I (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 28) respecto de la secuencia VkO12 Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4T muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14.41 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 26) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 116).
La figura 4U muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3F (restos 21-129 de la SEQ ID NO: 32) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 114).
La figura 4V muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3F (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 30) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 113).
La figura 4W muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.7.2IF (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 36) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4X muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.7.2IF (restos 20-136 de la SEQ ID NO: 34) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh6-13, JH6b de lmea germinal (SEQ ID NO: 115).
La figura 4Y muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.7.2C-Ser (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 52) respecto de la secuencia Vk012, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4Z muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.7.2C-Ser (restos 20-136 de la SEQ ID NO: 50) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh6-13, JH6b de lmea germinal (SEQ ID NO: 115).
La figura 4AA muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4C-Ser (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 56) respecto de la secuencia Vk012, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4BB muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14:4C-Ser (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 54) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 116).
La figura 4CC muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3C-Ser (restos 21-129 de la SEQ ID NO: 60) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ iD NO: 114).
La figura 4DD muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3C-Ser (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 58) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 113).
La figura 4EE muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3-CG2 (restos 21-129 de la SEQ ID NO: 60) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ iD NO: 114).
La figura 4FF muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3-CG2 (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 62) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 113).
La figura 4GG muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.7.2-CG2 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 52) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4HH muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.7.2-CG2 (restos 20-136 de la SEQ ID NO: 66) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh6-13, JH6b de lmea germinal (SEQ ID NO: 115).
La figura 4II muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.7.2-CG4 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 52) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4JJ muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.7.2-CG4 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 70) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh6-13, JH6b de lmea germinal (SEQ ID NO: 115).
La figura 4KK muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4-CG2 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 56) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4LL muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14.4-CG2 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 74) respecto de la secuencia VH3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 116).
La figura 4MM muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4-CG4 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 56) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4NN muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14.4-CG4 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 78) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 116).
La figura 4OO muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4-Ser (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 28) respecto de la secuencia VkO12, Jk3 de lmea germinal (SEQ iD NO: 103).
La figura 4PP muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14.4-Ser (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 82) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 116).
La figura 4QQ muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.7.2-Ser (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 48) respecto de la secuencia Vk012, Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4RR muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.7.2-Ser (restos 20-136 de la SEQ ID NO: 86) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh6-13, JH6b de lmea germinal (SEQ ID NO: 1l5).
La figura 4SS muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3-Ser (restos 21-129 de la SEQ ID NO: 44) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ iD NO: 114).
La figura 4TT muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3-Ser (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 90) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 113).
La figura 4UU muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3-CG4 (restos 21-129 de la SEQ ID NO: 60) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ iD NO: 114).
La figura 4VV muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3-CG4 (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 94) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 113).
La figura 4WW muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 9.14.4G1 (restos 23-130 de la SEQ ID NO: 28) respecto de la secuencia VkO12 Jk3 de lmea germinal (SEQ ID NO: 103).
La figura 4XX muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 9.14.4G1 (restos 20-135 de la SEQ ID NO: 102) respecto de la secuencia Vh3-11, Dh7-27, JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 116).
La figura 4YY muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena ligera para el anticuerpo 8.10.3FG1 (restos 21-129 de la SEQ ID NO:32) respecto de la secuencia VkA27, Jk4 de lmea germinal (SEQ ID NO: 114).
La figura 4ZZ muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la region variable de cadena pesada para el anticuerpo 8.10.3FG1 (restos 20-141 de la SEQ ID NO: 98) respecto de la secuencia Vh3-48, Dh1-26 JH4b de lmea germinal (SEQ ID NO: 113).
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones y tecnicas generales
A menos que se defina lo contrario en la presente memoria, los terminos cientfficos y tecnicos usados en relacion con la presente invencion tendran los significados que comunmente entienden los expertos en la materia. Ademas, a menos que se requiera lo contrario por el contexto, los terminos en singular incluiran pluralidades y los terminos en plural incluiran el singular. De manera general, las nomenclaturas usadas en relacion con, y las tecnicas de, cultivos de celulas y tejidos, biologfa molecular, inmunologfa, microbiologfa, genetica y qrnmica de protemas y acidos nucleicos e hibridacion descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y usadas comunmente en la materia.
Los metodos y tecnicas de la presente invencion se realizan de forma general segun metodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describen en varias referencias generales y mas espedficas que se citan y describen a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizan segun las especificaciones del fabricante, como comunmente se realizan en la tecnica o se describen en la presente memoria. Las nomenclaturas usadas en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, qrnmica analftica, qrnmica organica sintetica, y medicina y qrnmica farmaceutica descritos en la presente memoria son aquellas bien entendidas y usadas comunmente en la materia. Se usan tecnicas estandar para las smtesis qrnmicas, los analisis qrnmicos, la preparacion farmaceutica, la formulacion, y la administracion, y el tratamiento de pacientes.
A menos que se indique lo contrario, se entendera que los siguientes terminos tienen los siguientes significados: El termino "polipeptido" abarca protemas nativas o protemas artificiales, fragmentos de protemas y analogos de polipeptidos de una secuencia protemica. Un polipeptido puede ser monomerico o polimerico.
La expresion "protema aislada", "polipeptido aislado" o "anticuerpo aislado" es una protema, polipeptido o anticuerpo que en virtud de su origen o fuente de la que procede tiene de uno a cuatro de los siguientes: (1) no esta asociado con componentes naturalmente asociados que lo acompanan en su estado natural, (2) esta libre de otras protemas de la misma especie, (3) se expresa por una celula de una especie diferente (4) no se da en la naturaleza. Por lo tanto, un polipeptido que se sintetiza qmmicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del de la celula a partir de la cual se origina de manera natural estara "aislado" de sus componentes asociados de manera natural. Tambien se puede hacer que una protema quede sustancialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante aislamiento, usando lastecnicas de purificacion de protemas bien conocidas en la materia.
Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-M-CSF que se ha purificado por afinidad usando M-CSF, un anticuerpo anti-M-CSF que se ha sintetizado a partir de un hibridoma u otra lmea celular in vitro y un anticuerpo anti-M-CSF humano que procede de un raton transgenico.
Una protema o polipeptido esta "sustancialmente pura", "sustancialmente homogenea" o "sustancialmente purificada" cuando al menos aproximadamente del 60 al 75 % de una muestra presenta una sola especie de polipeptido. El polipeptido o protema puede ser monomerica o multimerica. Un polipeptido o protema sustancialmente puro comprendera tfpicamente aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % P/P de una muestra de protema, mas normalmente aproximadamente un 95 %, y preferentemente tendra una pureza mayor del 99 %. La pureza u homogeneidad de las protemas se puede indicar por una serie de medios bien conocidos en la materia, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de protema, seguido de la visualizacion de una unica banda de polipeptido al tenir el gel con una tincion bien conocida en la materia. Para determinados fines, se puede conseguir una resolucion mayor usando HPLC u otros medios bien conocidos en la materia para la purificacion.
La expresion "fragmento de polipeptido", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipeptido que tiene una eliminacion amino-terminal y/o carboxilo-terminal, pero donde la secuencia de aminoacidos restante es identica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoacidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos son de al menos 14, al menos 20, al menos 50 o al menos 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoacidos de longitud.
La expresion "analogo de polipeptido" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un polipeptido que comprende un segmento que tiene una identidad sustancial con una porcion de una secuencia de aminoacidos y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) union espedfica a M-CSF en condiciones adecuadas de union, (2) capacidad para inhibir al M-CSF.
Tfpicamente, los analogos de polipeptidos comprenden una sustitucion conservativa de aminoacidos (o insercion o eliminacion) con respecto a la secuencia de origen natural. Los analogos tfpicamente tienen al menos 20 o 25 aminoacidos de longitud, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoacidos de longitud o mas, y a menudo pueden ser tan largos como un polipeptido de longitud completa.
En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoacidos de los anticuerpos o de la porcion de union a antfgeno de los mismos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alteran la afinidad de union para formar complejos proteicos, o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales de dichos analogos. Los analogos pueden incluir varias mutemas de una secuencia diferente a la secuencia de peptidos de origen natural. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones unicas o multiples (preferentemente sustituciones conservativas de aminoacidos) en la secuencia de origen natural, preferentemente en la porcion del polipeptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitucion conservativa de aminoacidos no debena cambiar de forma sustancial las caractensticas estructurales de la secuencia parental; por ejemplo, un aminoacido reemplazado no debena de alterar la lamina p antiparalela que forma el dominio de union de inmunoglobulina que se produce en la secuencia parental o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterice a la secuencia parental. En general, los analogos de glicina y prolina no se usanan en una lamina p antiparalela. Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipeptidos reconocidos en la materia se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991).
Los analogos no peptfdicos se usan comunmente en la industria farmaceutica como farmacos con propiedades analogas a aquellas del peptido molde. Estos tipos de compuestos no-peptfdicos se denominan "mimeticos de peptidos" o "peptidomimeticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS p.392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987),. Dichos compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los mimeticos de peptidos que son similares de manera estructural a los peptidos terapeuticamente utiles se pueden usar para producir un equivalente terapeutico o un efecto profilactico. De manera general, los peptidomimeticos son estructuralmente similares a un polipeptido paradigmatico (es decir, un polipeptido que tiene una propiedad bioqmmica o una actividad farmacologica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o mas enlaces peptfdicos reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- y -CH2SO--, por metodos bien conocidos en la materia. La sustitucion sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia consenso con un D-aminoacido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar tambien para generar peptidos mas estables. Ademas, los peptidos constrenidos que comprenden una secuencia consenso o una variacion de la secuencia consenso sustancialmente identica se pueden generar mediante metodos conocidos en la materia (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992),); por ejemplo, mediante la adicion de restos internos de cistema capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclen el peptido.
Un "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto o a una porcion de union a antfgeno que compite con el anticuerpo intacto por la union espedfica. Vease de manera general, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1.989)). Pueden producirse porciones de union a antfgeno mediante tecnicas de ADN recombinante o mediante escision enzimatica o qrnmica de anticuerpos intactos. En algunas realizaciones, las porciones de union a antigeno incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, la region determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quimericos, diacuerpos y polipeptidos que contienen al menos una porcion de un anticuerpo que sea suficiente para conferir union espedfica a antfgeno al polipeptido.
Desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, tanto los dominios variables maduros como los dominios variables de cadena pesada comprenden las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignacion de aminoacidos a cada dominio es segun las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), Chothia y Lesk, J, Mol. Biol. 196:901-917 (1987), o Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).
Tal como se usa en la presente memoria, un anticuerpo al que se hace referencia en numero es el mismo que un anticuerpo monoclonal que se obtiene a partir del hibridoma del mismo numero. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 3.8.3 es el mismo anticuerpo que el obtenido del hibridoma 3.8.3.
Tal como se usa en la presente memoria, un fragmento Fd se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios Vh y Ch 1; un fragmento Fv consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)) consiste en un dominio Vh.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en el que los dominios Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes a traves de un enlazador sintetico que permite su produccion en forma de una protema de cadena sencilla. (Bird et al., Science 242:423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988).) En algunas realizaciones, los anticuerpos son diacuerpos, es decir, son anticuerpos bivalentes en los cuales los dominios Vh y Vl se expresan en un polipeptido de una sola cadena, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejado entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo a que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antfgeno. (Vease, por ejemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), y Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994).) En algunas realizaciones, se pueden incorporar una o mas CDR de un anticuerpo de la invencion en una molecula tanto de manera covalente como no covalente para convertirla en una inmunoadhesina que se una espedficamente a M-CSF. En dichas realizaciones, las CDR se pueden incorporar como parte de una cadena de polipeptidos mas larga, pueden enlazarse covalentemente a otra cadena de polipeptidos o pueden incorporarse de forma no covalente.
En realizaciones que tienen uno o mas sitios de union, los sitios de union pueden ser identicos entre sf o pueden ser diferentes.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "anticuerpo humano" se refiere a cualquier anticuerpo en el cual las secuencias de los dominios variable y constante son secuencias humanas. El termino abarca anticuerpo con secuencias procedentes de genes humanos, pero que han cambiado, por ejemplo, para disminuir la posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar cistemas que pueden causar plegamientos no deseados, etc. El termino abarca dichos anticuerpos producidos de manera recombinante en celulas no humanas, que pueden conferir glicosilacion no tfpica de celulas humanas. Estos anticuerpos se pueden preparar de una variedad de formas, como se describen a continuacion.
El termino "anticuerpo quimerico" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que comprende regiones de dos o mas anticuerpos diferentes. En una realizacion, uno o mas de las CDR proceden de anticuerpos anti-M-CSF humanos. En otra realizacion, todas las CDR proceden de un anticuerpo anti-M-CSF. En otra realizacion, las CDR de mas de un anticuerpo anti-M-CSF se combinan en un anticuerpo quimerico. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-M-CSF humano, una CDR2 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-M-CSF humano y una CDR3 de la cadena ligera de un tercer anticuerpo anti-M-CSF humano, y las CDR de la cadena pesada pueden derivarse de uno o mas anticuerpos anti-M-CSF diferentes. Ademas, las regiones marco conservadas pueden proceder de uno de los anticuerpos anti-M-CSF de los cuales se toman una o mas de las CDR o de uno o mas anticuerpos humanos diferentes.
Los fragmentos o analogos de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulinas pueden prepararse facilmente por los expertos en la materia siguiendo las ensenanzas de esta memoria descriptiva. Los extremos amino y carboxilo terminales preferidos de fragmentos o analogos tienen lugar cerca de los ftmites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparacion de los datos de la secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos con bases de datos de secuencias publicas o de titularidad privada. Preferentemente, se usan metodos de comparacion computarizada para identificar motivos de secuencia o dominios de conformacion de protemas predichos que tienen lugar en otras protemas de estructura y/o funcion conocida. Se conocen los metodos para identificar las secuencias de protemas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Vease Bowie et al., Science 253:164 (1991).
La expresion "resonancia de plasmon superficial", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenomeno optico que permite el analisis en tiempo real de interacciones bioespedficas mediante deteccion de alteraciones en las concentraciones de protema en una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, vease Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit.
8:125-131 (1995); y Johnsson B. et al., Anal. Biochem. 198:268-277 (1991).
El termino "Kd" se refiere a la constante de disociacion en equilibrio de una interaccion anticuerpo-antigeno en particular.
El termino "epftopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse espedficamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T o de interactuar de otra manera con una molecula. Los determinantes epitopicos consisten generalmente en agrupaciones superficiales qmmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucar y generalmente tienen caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, asf como caractensticas de carga espedficas. Un epftopo puede ser "lineal" o "conformacional". En un epftopo lineal, todos los puntos de interaccion entre la protema y la molecula de interaccion (tal como un anticuerpo) tienen lugar de manera lineal a lo largo de la secuencia primaria de aminoacidos de la protema. En un epftopo conformacional, los puntos de interaccion tienen lugar a traves de restos de aminoacidos en la protema estan separados entre sf Se dice que un anticuerpo se une de manera espedfica a un antfgeno cuando la constante de disociacion es < 1 mM, preferentemente < 100 nM y mas preferentemente < 10 nM. En ciertas realizaciones, la Kd es de entre 1 pM y 500 pM. En otras realizaciones, la Kd es de entre 500 pM y 1 pM. En otras realizaciones, la Kd es de entre 1 pM y 100 nM. En otras realizaciones, la Kd es de entre 100 mM y 10 nM. Una vez que se determina un epftopo deseado en un antfgeno, es posible generar anticuerpos para ese epftopo, por ejemplo, usando las tecnicas descritas en la presente invencion. Como alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generacion y caracterizacion de anticuerpos puede elucidar informacion sobre epftopos deseables. A partir de esta informacion, es entonces posible realizar una seleccion competitiva de anticuerpos para la union al mismo epftopo. Un enfoque para lograr esto es llevar a cabo estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que se unan competitivamente entre sf, por ejemplo, los anticuerpos compiten por la union al antfgeno. Un proceso de alto rendimiento para el "agrupamiento" de anticuerpos basandoseen su competencia cruzada se describe en la Solicitud de Patente Internacional n.° WO 03/48731.
Tal como se usa en la presente memoria, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease Immunology - A Synthesis (2a Edicion, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).
El termino "polinucleotido" tal como se cita en la presente memoria se refiere a una forma polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleotidos. El termino incluye formas mono y bicatenarias.
El termino "polinucleotido aislado" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un polinucleotido de origen genomico, de ADNc o sintetico o alguna combinacion de los mismos, que en virtud de su origen o fuente de la que proviene, el "polinucleotido aislado" tiene de uno a tres de los siguientes: (1) no se asocia con la totalidad o una parte de un polinucleotido con el que el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta unido de manera operable a un polinucleotido al cual no se une en la naturaleza, o (3) no se da de manera natural como una parte de una secuencia mas larga.
El termino "oligonucleotido" tal como se usa en la presente memoria incluye nucleotidos que se dan de manera natural, y nucleotidos modificados unidos entre sf mediante enlaces de oligonucleotidos de origen natural y no natural. Los oligonucleotidos son un subconjunto polinucleotfdico que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferentemente, los oligonucleotidos tienen de 10 a 60 bases de longitud, y mas preferentemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o de 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleotidos son normalmente monocatenarios, por ejemplo, para cebadores y sondas; aunque los oligonucleotidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construccion de un gen mutante. Los oligonucleotidos de la invencion pueden ser tanto codificantes como no codificantes.
La expresion "nucleotidos de origen natural" tal como se usa en la presente memoria incluye ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos. El termino "nucleotidos modificados" tal como se usa en la presente memoria incluye nucleotidos con grupos de azucares modificados o sustituidos y similares. El termino "enlaces de oligonucleotidos" citado en la presente memoria incluye enlaces de oligonucleotidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Vease, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); la Patente de los Estados Unidos n.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990),. Un oligonucleotido puede incluir un marcador para deteccion, si se desea.
Las secuencias "enlazadas operablemente" incluyen secuencias de control de la expresion que son contiguas con el gen de interes y secuencias de control de la expresion que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes. El termino "secuencia de control de expresion" tal como se usa en la presente memoria se refiere a secuencias de polinucleotidos que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que estan ligadas. Las secuencias de control de la expresion incluyen secuencias de iniciacion, terminacion, promotoras y potenciadoras de la transcripcion adecuadas; senales de procesamiento de ARN eficientes tales como senales de corte y empalme y de poliadenilacion; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmatico; secuencias que potencian el rendimiento de la traduccion (es decir, la secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de protemas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secrecion de protemas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en funcion del organismo hospedador; en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio de union ribosomica y la secuencia de terminacion de la transcripcion; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminacion de la transcripcion. La expresion "secuencias de control" pretende incluir, como mmimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresion y el procesamiento y puede tambien incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias companeras de fusion.
El termino "vector", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otra molecula de acido nucleico a la cual se ha enlazado. En algunas realizaciones, el vector es un plasmido, es decir, un bucle de ADN circular bicatenario al cual se pueden unir segmentos adicionales de ADN. En algunas realizaciones, el vector es un vector vmco, en donde pueden ligarse segmentos adicionales de ADN al genoma vmco. En algunas realizaciones, los vectores son capaces de replicarse de manera autonoma en una celula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores episomicos de mairnferos). En otras realizaciones, los vectores (por ejemplo, vectores no episomicos de mai^eras) se pueden integrar en el genoma de una celula hospedadora tras su introduccion en la celula hospedadora, y portanto, se replican junto con el genoma del hospedador. Ademas, determinados vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que se unen de manera operativa. Dichos vectores se citan en la presente memoria como "vectores de expresion recombinante" (o simplemente, "vectores de expresion").
El termino "celula hospedadora recombinante" (o simplemente "celula hospedadora"), tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante. Debe entenderse que "celula hospedadora recombinante" y "celula hospedadora" significan no solo la celula en cuestion particular sino tambien la progenie de dicha celula. Dado que ciertas modificaciones pueden darse en generaciones sucesivas debido tanto a mutaciones como a la influencia ambiental, dicha progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula progenitora pero aun asf se incluye dentro del alcance de la expresion "celula hospedadora" tal como se utiliza en la presente memoria.
La expresion "hibrida de manera selectiva" citada en la presente memoria significa unirse de manera detectable y espedfica. Los polinucleotidos, oligonucleotidos y fragmentos de los mismos segun la invencion hibridan de manera selectiva con cadenas de acido nucleico en condiciones de hibridacion y lavado que minimizan las cantidades apreciables de union detectable a acidos nucleicos no espedficos. Pueden usarse condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" para lograr condiciones de hibridacion selectiva tal como se conocen en la materia y se describen en la presente memoria. Un ejemplo de condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" es la incubacion de un polinucleotido con otro polinucleotido en donde un polinucleotido puede fijarse a una superficie solida tal como una membrana, en un tampon de hibridacion de 6X SSPE o SSC, 50 % de formamida, 5X de reactivo de Denhardt, 0,5 % de SDS, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado y fragmentado a una temperatura de hibridacion de 42 °C durante 12-16 horas, seguido de dos lavados a 55 °C usando un tampon de lavado de SSC 1X, SDS al 0,5 %. Vease tambien Sambrook et al., citado anteriormente, pags. 9.50-9.55.
La expresion "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de acido nucleico se refiere al porcentaje de restos cuando se compara y alinea una primera secuencia contigua para correspondencia maxima con una segunda secuencia contigua. La longitud de la comparacion de identidad de secuencia puede estar sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleotidos, normalmente al menos aproximadamente 18 nucleotidos, mas normalmente al menos aproximadamente 24 nucleotidos, tfpicamente al menos aproximadamente 28 nucleotidos, mas tfpicamente al menos aproximadamente 32 nucleotidos, y preferentemente al menos aproximadamente 36, 48 o mas nucleotidos. Se conocen en la tecnica una serie de algoritmos diferentes que pueden usarse para medir la identidad de secuencia de nucleotidos. Por ejemplo, pueden compararse secuencias de polinucleotidos usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en el Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. El FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regios de mejor solapamiento entre la secuencia de consulta y la secuencia de busqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol.
276:71-84 (1998)). A menos que se especifique lo contrario, se usan los parametros por defecto de un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de acidos nucleicos se puede determinar usando FASTA con sus parametros por defecto (un tamano de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuacion) o usando Gap con sus parametros por defecto como se proporcionan en GCG Version 6.1.Una referencia a una secuencia de nucleotidos abarca su complemento a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, se debe entender que una referencia para un acido nucleico que tenga una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria.
La expresion "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere a una proporcion, expresada como un porcentaje del numero de restos identicos sobre el numero de restos comparados.
La expresion "similitud sustancial" o "similitud de secuencia sustancial", cuando se refiere a un acido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea optimamente con inserciones o eliminaciones de nucleotidos apropiadas con otro acido nucleico (o su cadena complementaria), hay identidad de secuencia de nucleotidos en al menos aproximadamente el 85 %, preferentemente al menos aproximadamente el 90 % y mas preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de las bases de nucleotidos, medidos mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, tal como se ha descrito anteriormente.
Tal como se aplica a los polipeptidos, la expresion "identidad sustancial" significa que dos secuencias de peptidos, cuando se alinean de manera optima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando las ponderaciones por defecto, tal como se proporcionan con los programas, comparten al menos el 70 %, el 75 % o el 80 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos el 90 % o el 95 % de identidad de secuencia, y mas preferentemente al menos el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. En ciertas realizaciones, las posiciones de los restos que no son identicos difieren mediante sustituciones conservativas de aminoacidos. Una "sustitucion de aminoacido conservativa" es una en la que un resto de aminoacido se sustituye con otro resto de aminoacido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades qmmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion de aminoacido conservativa no cambiara de manera sustancial las propiedades funcionales de una protema. En los casos donde dos o mas secuencias de aminoacidos difieran entre sf por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia se debe ajustar al alza para corregir respecto de la naturaleza conservativa de la sustitucion. Los medios para hacer este ajuste se conocen bien por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qmmicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifaticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifaticas-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromaticas: fenilalanina, tirosina y triptofano; 5) cadenas laterales basicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales acidas: acido aspartico y acido glutamico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cistema y metionina. Los grupos de sustitucion conservativa de aminoacidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.
Como alternativa, una sustitucion conservativa es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logantmica PAM250 descrita en Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992),. Una sustitucion "moderadamente conservativa" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logantmica PAM250.
La identidad de secuencia para polipeptidos se mide tfpicamente usando software de analisis de secuencias. El software de analisis de protemas empareja secuencias usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, que incluyen las sustituciones conservativas de aminoacidos. Por ejemplo el GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que se pueden usar con los parametros por defecto, como se especifica con los programas, para determinar homologfa de secuencia o identidad de secuencia entre polipeptidos estrechamente relacionados, tales como polipeptidos homologos de diferentes especies de organismos o entre una protema de tipo silvestre y una mutema de la misma. Vease, por ejemplo, GCG Version 6.1. Las secuencias de polipeptidos tambien se pueden comparar usando FASTA usando los parametros por defecto o parametros recomendados, vease GCG Version 6.1. (Universidad de Wisconsin WI). FASTa (por ejemplo (FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre la secuencia de consulta y la secuencia de busqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invencion con una base de datos que contiene un amplio numero de secuencias de diferentes organismos es el programa informatico BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando los parametros por defecto, tal como se proporcionan con los programas. Vease, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).
La longitud de secuencias de polipeptido comparadas para homologfa sera de al menos aproximadamente 16 restos de aminoacidos, normalmente al menos aproximadamente 20 restos, mas normalmente al menos aproximadamente 24 restos, tipicamente al menos aproximadamente 28 restos, y preferentemente mas de aproximadamente 35 restos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un amplio numero de diferentes organismos, es preferible comparar las secuencias de aminoacidos.
Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporacion de otra molecula en el anticuerpo. En una realizacion, el marcador es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporacion de un aminoacido radiomarcado o la union a un polipeptido de restos de biotinilo que se pueden detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede detectarse mediante metodos opticos o colorimetricos). En otra realizacion, la etiqueta o marcador puede ser terapeutico, por ejemplo, un farmaco conjugado o toxina. Se conocen en la tecnica varios metodos de marcado de polipeptidos y glicoprotemas que pueden usarse. Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero sin limitacion, los siguientes: radioisotopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fosforos de lantanidos), marcadores enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epftopos polipeptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, pares de secuencias de cremallera de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union de metales, marcadores de epftopos), agentes magneticos, tal como quelatos de gadolinio, toxinas tal como toxina de tos ferina, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, teniposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propanolol, y puromicina y analogos u homologos de los mismos. En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir la potencial impedancia esterica.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, se entendera que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implican la inclusion de un numero entero indicado o grupo de numeros enteros pero no la exclusion de un numero entero cualquiera o grupo de numeros enteros.
Anticuerpos anti-M-CSF humanos y caracterizacion de los mismos
En una realizacion, la invencion proporciona anticuerpos anti-M-CSF humanizados. En otra realizacion, la invencion proporciona anticuerpos anti-M-CSF humanos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-M-CSF se producen mediante la inmunizacion de un animal transgenico no humano, por ejemplo, un roedor, cuyo genoma comprende genes de inmunoglobulina humana, de manera que el roedor produce anticuerpos humanos.
Un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion puede comprender una cadena ligera kappa o lambda humana o una secuencia de aminoacidos que proceda de las mismas. En algunas realizaciones que comprenden una cadena ligera kappa, el dominio variable de la cadena ligera (Vl) esta codificado en parte mediante un gen humano Vk012, VkL2, VkL5, VkA27 o VkB3 y un gen JJ, Jk2, Jk3 o Jk4. En realizaciones particulares de la invencion, el dominio variable de la cadena ligera se codifica mediante el gen Vk012/Jk3, VkL2/Jk3, VkL5/Jk3, VkL5/Jk4, VkA27/ Jk4 o VkB3/Jk1.
En algunas realizaciones, la Vl del anticuerpo M-CSF comprende una o mas sustituciones de aminoacidos en relacion con la secuencia de aminoacidos de lrnea germinal. En algunas realizaciones, la Vl del anticuerpo anti-M-CSF comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoacidos en relacion con la secuencia de aminoacidos de lrnea germinal. En algunas realizaciones, una o mas de estas sustituciones de la lrnea germinal es en las regiones CDR de la cadena ligera. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoacidos relativas a la lrnea germinal son en una o mas de las mismas posiciones que las sustituciones en relacion con la lrnea germinal en una cualquiera o mas de la Vl de los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. Por ejemplo, la Vl del anticuerpo anti-M-CSF puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos en comparacion con la lrnea germinal hallada en ka Vl del anticuerpo 88 y otras sustituciones de aminoacidos en comparacion con la lrnea germinal hallada en la Vl del anticuerpo 252 que utiliza el mismo gen Vk que el anticuerpo 88. En algunas realizaciones, los cambios de aminoacido son en una o mas de las mismas posiciones, pero implican una mutacion diferente de la del anticuerpo de referencia.
En algunas realizaciones, los cambios de aminoacidos en relacion con la lrnea germinal tienen lugar en una o mas de las mismas posiciones como en cualquiera de las Vl de los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1, pero los cambios pueden representar sustituciones conservativas de aminoacidos en en dichas posiciones en relacion al aminoacido en el anticuerpo de referencia. Por ejemplo, si se cambia una posicion particular en uno de estos anticuerpos en relacion con la lrnea germinal y es glutamato, se puede sustituir con aspartato en esa posicion. De manera similar, si una sustitucion en comparacion con la lrnea germinal es serina, se puede sustituir serina por treonina en esa posicion. Las sustituciones conservativas de aminoacidos se han descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo anti-M-CSF humano comprende la secuencia de aminoacidos que es igual que la secuencia de aminoacidos de la Vl del anticuerpo 252 (s Eq ID NO: 4), 88 (SEQ ID NO: 8), 100 (SEQ ID NO: 12), 3.8.3 (SEQ ID NO: 16), 2.7.3 (SEQ ID NO: 20), 1.120.1 (SEQ ID NO: 24), 9.14.4I (SEQ ID NO: 28), 8.10.3F (SEQ ID NO: 32), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 36), 9.14.4 (SEQ ID NO: 28), 8.10.3 (SEQ ID NO: 44), 9.7.2 (SEQ ID NO: 48), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 52), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 56), 8.10.3C-Ser (SEQ ID NO: 60), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 60), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 52), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 52), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-CG4 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 28), 9.7.2-Ser (SEQ ID NO: 48), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 44), 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 60) 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 32) o 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 28), o dicha secuencia de aminoacidos que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones conservativas de aminoacidos y/o un total de hasta 3 sustituciones de aminoacidos no conservativas. En algunas realizaciones, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de uno cualquiera de los anticuerpos anteriores.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo anti-M-CSF comprende al menos las CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena ligera de una lmea germinal o una secuencia de anticuerpo, tal como se describe en la presente memoria. En otra realizacion, la cadena ligera puede comprender las regiones CDR1, CDR2 o CDR3 de un anticuerpo seleccionado de manera independiente de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1 o regiones CDR que tienen cada una de ellas menos de 4 o menos de 3 sustituciones conservativas de aminoacidos y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoacidos no conservativas. En otras realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo anti-M-CSF comprende las CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena ligera, cada una de las cuales se selecciona independientemente de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo que tiene una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la region Vl seleccionada de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60, o codificada por una molecula de acido nucleico que codifica la region Vl seleccionada de las SEQ ID NO: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 o 47. La cadena ligera del anticuerpo anti-M-CSF puede comprender las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos de la region Vl seleccionada de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3- Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1 o las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60.
En algunas realizaciones, la cadena ligera comprende las regiones CDR1, CDR2 o CDR3 del anticuerpo 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3- CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1 o dichas regiones CDR que tienen cada una de ellas menos de 4 o menos de 3 sustituciones conservativas de aminoacidos y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoacidos no conservativas.
Con respecto a la cadena pesada, en algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada esta codificada por un gen humano Vh3-11, Vh3-23, Vh3-7, Vh1-18, Vh3-33, Vh3-48 y un gen Jh4, Jh6, JH4b o JH6b. En una realizacion en particular de la invencion, la region variable de la cadena pesada esta codificada por el gen Vh3-11/Dh7-27/Jh6, Vh3-7/Dh6-13/Jh4, Vh3-23/Dh1-26/Jh4, Vh3-11/Dh7-27/Jh4, Vh3-33/Dh1-26/Jh4, Vh1-18/Dh4-23/Jh4, VH3-11/DH7-27/JH4b, Vh3-48/Dh1-26/Jh4^ VH3-11/DH6-13/JH6b, VH3-11/DH7-27/JH4b, VH3-48/DH1-6/JH4b o VH3-11/DH6-13/JH6b. En algunas realizaciones, la Vh del anticuerpo anti-M-CSF contiene una o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones (adiciones) de aminoacidos en relacion con la secuencia de aminoacidos de la lmea germinal. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena pesada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 mutaciones respecto de la secuencia de aminoacidos de la lmea germinal. En algunas realizaciones, las mutaciones son sustituciones no conservativas en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la lmea germinal. En algunas realizaciones, las mutaciones estan en las regiones CDR de la cadena pesada. En algunas realizaciones, los cambios de aminoacidos se efectuan en una o mas de las mismas posiciones que las mutaciones de la lmea germinal en una cualquiera de las Vh de los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3- CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En otras realizaciones, los cambios de aminoacido son en una o mas de las mismas posiciones, pero implican una mutacion diferente a la del anticuerpo de referencia.
En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos del dominio variable (Vh) del anticuerpo 252 (SEQ ID NO: 2), 88 (SEQ ID NO: 6), 100 (SEQ ID NO: 10), 3.8.3 (SEQ ID NO: 14), 2.7.3 (SEQ. ID NO: 18), 1.120.1 (SEQ. ID NO: 22), 9.14.4I (SEQ ID NO: 26), 8.10.3F (SEQ ID NO: 30), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 34), 9.14.4 (SEQ ID NO: 38), 8.10.3 (SEQ ID NO: 30), 9.7.2 (SEQ ID NO: 46), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 50), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 54), 8.10.3C-Ser (SEQ ID NO: 58), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 62), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 66), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 70), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 74), 9.14.4-CG4 (SEQ ID NO: 78), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 82), 9.7.2-Ser (SEQ ID NO: 86), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 90) 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 94), 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 98) o 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 102), o dicha secuencia de aminoacidos que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones conservativas de aminoacidos y/o un total de hasta 3 sustituciones de aminoacidos no conservativas. En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de uno cualquiera de los anticuerpos anteriores.
En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende las regiones CDR1, CDR2 o CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3- CG4, 8.10.3FGI o 9.14.4G1 o dichas regiones CDR que tienen cada una de ellas menos de 8, menos de 6, menos de 4 o menos de 3 sustituciones conservativas de aminoacidos y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoacidos no conservativas.
En algunas realizaciones, la cadena pesada comprende una CDR3 de lmea germinal o anticuerpo, tal como se describe anteriormente, de una secuencia de anticuerpo como se describe en la presente memoria, y puede tambien incluir las regiones CDR1 y CDR2 de una secuencia de lmea germinal, o pueden comprender una CDR1 y CDR2 de una secuencia de anticuerpo, seleccionandose cada una de ellas independientemente de un anticuerpo que comprende una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4- CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En otra realizacion, la cadena pesada comprende una CDR de una secuencia de anticuerpos tal y como se describe en la presente memoria, y tambien puede comprender las regiones CDR1 y CDR2, cada una de las cuales se selecciona de manera independiente de una region CDR1 y CDR2 de una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de la region Vh seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102 o codificada por una molecula de acido nucleico que codifica la region Vh seleccionada de las SEQ ID NO: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 o 101. En otra realizacion, el anticuerpo comprende una cadena ligera como se ha divulgado anteriormente y una cadena pesada como se ha divulgado anteriormente.
Un tipo de sustitucion de aminoacido que se puede hacer es cambiar una o mas cistemas en el anticuerpo, que pueden ser qmmicamente reactivas, a otro resto, tal como, sin limitacion, alanina o serina. En una realizacion, hay una sustitucion de una cistema no canonica. La sustitucion puede ser en una region marco conservada de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En otra realizacion, la cistema esta en una region no canonica del anticuerpo.
Otro tipo de sustitucion de aminoacido que se puede efectuar es retirar cualquier posible sitio proteolftico en el anticuerpo, particularmente aquellos que estan en una CDR o en una region marco conservada de un de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitucion de restos de cistema y la eliminacion de sitios proteolfticos puede disminuir el riesgo de cualquier heterogeneidad en el producto del anticuerpo y, por lo tanto, aumentar su homogeneidad. Otro tipo de sustitucion de aminoacidos es la eliminacion de pares asparagina-glicina, que forman posibles sitios de desamidacion, mediante la alteracion de uno o ambos restos.
En algunas realizaciones, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-M-CSF de la invencion no esta presente (Lewis D.A., et al., Anal. Chem, 66(5): 585-95 (1994)). En varias realizaciones de la invencion, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-M-CSF pueden incluir de manera opcional una secuencia senal.
En un aspecto, la invencion se refiere a la inhibicion de anticuerpos anti-M-CSF monoclonales y a las lmeas celulares modificadas por ingeniena genetica para producirlos. La tabla 1 enumera los identificadores de secuencia (SEQ ID NOS) de los acidos nucleicos que codifican la region variable de las cadenas pesada y ligera y las correspondientes secuencias de aminoacidos predichas para los anticuerpos monoclonales: 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3 y 9.7.2. Las variantes adicionales de los anticuerpos 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG48.10.3FG1 o 9.14.4G1 se pueden producir mediante metodos conocidos por el experto en la materia.
Tabla 1
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Clase y subclase de anticuerpos anti-M-CSF
La clase y subclase de anticuerpos anti-M-CSF se puede determinar mediante cualquier metodo conocido en la materia. En general, la clase y la subclase de un anticuerpo se puede determinar usando anticuerpos que son espedficos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Dichos anticuerpos estan disponibles comercialmente. Pueden determinarse la clase y subclase mediante ELISA o transferencia de Western asf como otras tecnicas. Como alternativa, la clase y subclase se puede determinar mediante secuenciacion de la totalidad o una porcion de los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoacidos con las secuencias de aminoacidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-M-CSF es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo anti-M-CSF puede ser una molecula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En realizaciones preferidas, el anticuerpo anti-M-CSF es una IgG y es una subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otras realizaciones preferidas, el anticuerpo es de subclase IgG2 o IgG4. En otra realizacion preferida, el anticuerpo es de la subclase IgGl.
Selectividad de especies y molecular
En otro aspecto de la invencion, los anticuerpos anti-M-CSF demuestran selectividad tanto de especie como molecular. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-M-CSF se une a un M-CSF humano, de mono cinomolgo y de raton. Siguiendo las ensenanzas de la memoria descriptiva, se puede determinar la selectividad de especie para el anticuerpo anti-M-CSF usando metodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad de especie usando transferencia de Western, FACS, ELISA, RIA, un ensayo de proliferacion celularo un ensayo de union al receptor M-CSF. En una realizacion preferida, se puede determinar la selectividad de especie usando un ensayo de proliferacion celular o ELISA.
En otra realizacion, el anticuerpo anti-M-CSF tiene una selectividad por M-CSF que es al menos 100 veces mayor que su selectividad por GM-/G-CSF. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-M-CSF no muestra ninguna union espedfica apreciable a cualquier otra protema que no sea M-CSF. Se puede determinar la selectividad del anticuerpo anti-M-CSF por M-CSF usando metodos bien conocidos en la materia siguiendo las ensenanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad usando transferencia de Western, FACS, ELISA o RIA.
Identificacion de epftopos M-CSF reconocidos mediante anticuerpos anti-M-CSF
La invencion proporciona un anticuerpo monoclonal anti-M-CSF que se une a M-CSF y compite con, compite de forma cruzada con y/o se une al mismo epftopo y/o se une a M-CSF con la misma Kd que (a) un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3- Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1; (b) un anticuerpo que comprende una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102; (c) un anticuerpo que comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60; (d) un anticuerpo que comprende tanto una region variable de cadena pesada como la que se define en (b) como una region variable de cadena ligera como la que se define en (c).
Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epftopo, compite por la union, compite de forma cruzada por la union o tiene la misma Kd que un anticuerpo anti-M-CSF usando metodos conocidos en la materia. En una realizacion, se permite que el anticuerpo anti-M-CSF de la invencion se una a M-CSF en condiciones de saturacion y entonces se mide la capacidad del anticuerpo de ensayo para unirse a M-CSF. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a M-CSF al mismo tiempo que el anticuerpo anti-M-CSF, entonces el anticuerpo de ensayo se une a un epftopo diferente al del anticuerpo anti-M-CSF. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a M-CSF al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se une al mismo epftopo, a un epftopo solapante o a un epftopo que esta muy cerca del epftopo al que se une el anticuerpo anti-M-CSF humano. Este experimento puede realizarse usando ELISA, RIA o FACS. En una realizacion preferida, el experimento se realiza usando BIACOREtm.
Afinidad de union de anticuerpos anti-M-CSF a M-CSF
En algunas realizaciones de la invencion, los anticuerpos anti-M-CSF se unen a M-CSF con alta afinidad. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-M-CSF se une a M-CSF con una Kd de 1x 10-7 M o menor. En otras realizaciones preferidas, el anticuerpo se une a M-CSF con una Kd de 1 x10' 8 M, 1 x 10‘ 9 M, 1 x 10' 1° M, 1 x 10' 11 M, 1 x 10-12 M o menor. En ciertas realizaciones, la Kd es de entre 1 pM y 500 pM. En otras realizaciones, la Kd es de entre 500 pM y 1 pM. En otras realizaciones, la Kd es de entre 1 pM y 100 nM. En otras realizaciones, la Kd es de entre 100 mM y 10 nM. En una realizacion aun mas preferida, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4- Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En otra realizacion preferida, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma KD que un anticuerpo que comprende una CDR2 de una cadena ligera y/o una CDR3 de una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4- CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En otra realizacion preferida mas, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma KD que un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102, o que comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60. En otra realizacion preferida, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una CDR2 y puede comprender opcionalmente una CDR1 y/o CDR3, de una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de la region Vl de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60, o que comprende una CDR3, y puede comprender opcionalmente una CDR1 y/o una CDR2 de una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de la region Vh de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-M-CSF tiene una baja velocidad de disociacion. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-M-CSF tiene una koff de 2,0 x 10' 4 s' 1 o menor. En otras realizaciones preferidas, el anticuerpo se une a M-CSF con una koff de 2,0 x 10‘ 5 o una koff de 2,0 x 10‘ 6 s_1 o menor. En algunas realizaciones, a koff es sustancialmente la misma que un anticuerpo descrito en la presente memoria, tal como un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma koff que un anticuerpo que comprende (a) una CDR3 y puede comprender de manera opcional una CDR1 y/o una CDR2, de una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2- CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1; o (b) una CDR2, y puede comprender de manera opcional una CDR1 y/o una CDR3 de una cadena ligera de un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2- Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma koff que un anticuerpo que comprende una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102; o que comprende una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60; En otra realizacion preferida, el anticuerpo se une a M-CSF con sustancialmente la misma koff que un anticuerpo que comprende una CDR2 y puede comprender de manera opcional una CDR1 y/o una CDR3 de una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60; o una CDR3, y puede comprender de manera opcional una CDR1 y/o una CDR2 de una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102.
Puede determinarse la afinidad de union y la velocidad de disociacion de un anticuerpo anti-M-CSF a M-CSF mediante metodos conocidos en la tecnica. La afinidad de union se puede medir mediante ELISA competitivos, RIA, resonancia de plasmon superficial (por ejemplo, usando la tecnologfa BIACORE™). La velocidad de disociacion se puede medir mediante resonancia de plasmon superficial. Preferentemente, la afinidad de union y la velocidad de disociacion se mide mediante resonancia de plasmon superficial. Mas preferentemente, la afinidad de union y la velocidad de disociacion se miden usando la tecnologfa BIACORE™. El ejemplo VI ilustra un metodo para determinar las constantes de afinidad de anticuerpos monoclonales anti-M-CSF mediante la tecnologfa BIACORE™. Inhibicion de la actividad de M-CSF mediante anticuerpo anti-M-CSF
Inhibicidn de la union de M-CSF a c-fms
En otra realizacion, la invencion proporciona un anticuerpo anti-M-CSF que inhibe la union de un M-CSF al receptor c-fms y bloquea o previene la activacion de c-fms. En una realizacion preferida, el M-CSF es humano. En otra realizacion preferida, el anticuerpo anti-M-CSF es un anticuerpo humano. Puede medirse la CI50 mediante ELISA, RIA y ensayos basados en celulas tales como un ensayo de proliferacion celular, un ensayo de cambio de forma de monocitos de sangre completa o un ensayo de inhibicion de union a receptor. En una realizacion, el anticuerpo o porcion del mismo inhibe la proliferacion celular con una CI50 de no mas de 8,0 x 10-7 M, preferentemente de no mas de 3 x 10' 7 M o mas preferentemente de no mas de 8 x 10'8 M tal como se mide mediante ensayo de proliferacion celular. En otra realizacion, la CI50 medida mediante un ensayo de cambio de forma de monocitos no es de mas de 2 x 10' 6 M, preferentemente de no mas de 9,0 x 10' 7 M, o mas preferentemente de no mas de 9 x 10' 8 M. En otra realizacion preferida, la CI50 medida mediante ensayo de union a receptor es de no mas de 2 x 10' 6 M, preferentemente de no mas de 8,0 x 10' 7 M, o mas preferentemente de no mas de 7,0 x 10' 8 M. Los ejemplos III, IV y V ilustran varios tipos de ensayos.
En otro aspecto, los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion inhiben la proliferacion de monocitos/macrofagos en respuesta a un M-CSF en al menos un 20 %, mas preferentemente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % en comparacion con la proliferacion de celulas en ausencia de anticuerpo.
Metodos para producir anticuerpos y lmeas celulares que producen anticuerpos
Inmunizacion
En algunas realizaciones, los anticuerpos humanos se producen inmunizando a un animal no humano que comprende en su genoma algunos o todos los loci de la cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulinas humanas con un antfgeno de M-CSF. En una realizacion preferida, el animal no humano es un animal XENOMOUSE™ (Abgenix Inc., Fremont, CA). Otro animal no humano que puede usarse es un raton transgenico producido por Medarex (Medarex, Inc., Princeton, NJ).
Los ratones XENOMOUSE™ son cepas de raton modificadas por ingeniena genetica que comprenden grandes fragmentos de loci de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulinas humanas y son deficientes para la produccion de anticuerpos de raton. Veanse, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las patentes de los Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963 y 6.150.584. Veanse tambien los documentos WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 y WO 00/037504.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para producir anticuerpos anti-M-CSF en animales no humanos y no murinos mediante la inmunizacion con un antigeno M-CSF a animales transgenicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humanos. Se pueden producir dichos animales usando los metodos descritos en los documentos citados anteriormente. Los metodos descritos en estos documentos se pueden modificar como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.994.619. La Patente de los Estados Unidos 5.994.619 describe metodos para producir nuevas celulas y lmeas celulares cultivadas en masa celular interna (CICM), que provienen de cerdos y vacas, y celulas CICM transgenicas en las cuales ha insertado ADN heterologo. Las celulas transgenicas CICM se pueden usar para producir embriones transgenicos, fetos y descendencia clonados. La Patente 5.994.619 tambien describe los metodos para producir estos animales, que son capaces de transmitir el ADN heterologo a su progenie. En realizaciones preferidas, los animales no humanos son ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos.
Los ratones XENOMOUSE™ producen un repertorio completo de anticuerpos humanos similares a los del adulto y generan anticuerpos humanos espedficos de antfgeno. En algunas realizaciones, los ratones XENOMOUSE™ contienen aproximadamente un 80 % del repertorio del gen V del anticuerpo humano mediante la introduccion de fragmentos de cromosomas artificiales de levadura (YAC) de tamano de megabase, de los loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa. En otras realizaciones, los ratones XENOMOUSE™ contienen de manera adicional aproximadamente todo el locus de la cadena ligera lambda. Veanse Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), y el documento WO 98/24893, En algunas realizaciones, el animal no humano que comprende genes de inmunoglobulinas humanas es un animal que tiene el "minilocus" de inmunoglobulina humana. En la estrategia del minilocus, el locus de una Ig exogena se imita mediante la inclusion de genes individuales del locus de la Ig. Por tanto, se forman uno o mas genes Vh, uno o mas genes Dh, uno o mas genes Jh, un dominio mu constante y un segundo dominio constante (preferentemente un dominio constante gamma) en una construccion para su insercion en un animal. Esta estrategia se describe, entre otras, en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y 5.643.763, En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para producir anticuerpos anti-M-CSF humanizados. En algunas realizaciones, los animales no humanos se inmunizan con un antfgeno M-CSF tal como se describe a continuacion en condiciones que permiten la produccion de anticuerpos. Las celulas productoras de anticuerpos se afslan de los animales, se fusionan con mielomas para producir hibridomas y se afslan los acidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo anti-M.CSF de interes. Estos acidos nucleicos se modifican usando tecnicas conocidas por aquellos expertos en la materia tal como se describe con detalle mas adelante para reducir la cantidad de secuencia no humana, es decir, humanizar el anticuerpo para reducir la respuesta inmune en seres humanos.
En algunas realizaciones, el antfgeno M-CSF es un M-CSF aislado y/o purificado. En una realizacion preferida, el antfgeno M-CSF es un M-CSF humano. En algunas realizaciones, el antfgeno M-CSF es un fragmento de M-CSF. En algunas realizaciones, el fragmento de M-CSF es un dominio extracelular de M-CSF. En algunas realizaciones, el fragmento de M-CSF comprende al menos un epftopo de M-CSF. En otras realizaciones, el antfgeno M-CSF es una celula que expresa o sobreexpresa M-CSF o un fragmento inmunogenico del mismo en su superficie. En algunas realizaciones, el antfgeno M-CSF es una protema de fusion de M-CSF. El M-CSF se puede purificar a partir de fuentes naturales usando tecnicas conocidas. El M-CSF recombinante esta disponible comercialmente.
La inmunizacion de animales puede ser mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Los metodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas y caballos se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente, y la Patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una realizacion preferida, el antfgeno M-CSF se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Los ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipeptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipeptido de la dispersion rapida secuestrandolo en un deposito local o pueden contener sustancias que estimulan al hospedador para que secrete factores que son quimiotacticos para los macrofagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, si se esta administrando un polipeptido, la pauta de inmunizacion implicara dos o mas administraciones del polipeptido, distribuidas a lo largo de varias semanas. El ejemplo I ilustra un metodo para producir anticuerpos anti-M-CSF monoclonales en ratones XENOMOUSE™.
Produccion de anticuerpos y lmeas celulares productoras de anticuerpos
Tras la inmunizacion de un animal con un antfgeno M-CSF, pueden obtenerse anticuerpos y/o celulas productoras de anticuerpos del animal. En algunas realizaciones, se obtiene del animal el suero que contiene el anticuerpo anti-M-CSF mediante sangrado o sacrificando al animal. El suero puede usarse tal como se obtiene del animal, puede obtenerse una fraccion de inmunoglobulina del suero, o pueden purificarse los anticuerpos anti-M-CSF a partir del suero.
En algunas realizaciones, se preparan lmeas celulares productoras de anticuerpos inmortalizadas a partir de celulas aisladas del animal inmunizado. Tras la inmunizacion, se sacrifica al animal y se inmortaliza a las celulas del nodulo linfatico y/o a los linfocitos B esplenicos. Los metodos para inmortalizar celulas incluyen, pero sin limitacion, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus oncogenico, cultivarlas en condiciones que seleccionen respecto de celulas inmortalizadas, someterlas a compuestos carcinogenicos o que causen mutaciones, fusionarlas con una celula inmortalizada, por ejemplo, una celula de mieloma y la inactivacion de genes supresores de tumores. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente. Si se usa la fusion con celulas de mieloma, las celulas de mieloma preferentemente no secretan polipetidos de inmunoglobulina (una lmea celular no secretora). Las celulas inmortalizadas se identifican usando M-CSF, una porcion del mismo o una celula que expresa M-CSF. En una realizacion preferida, la exploracion inicial se realiza usando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo. Se proporciona un ejemplo de exploracion con ELISA en el documento WO 00/37504,
Las celulas productoras de anticuerpos anti-M-CSF, por ejemplo, hibridomas, se seleccionan, clonan e identifican adicionalmente respecto de caractensticas deseables, que incluyen crecimiento robusto, alta produccion de anticuerpos y caractensticas deseables de anticuerpos, tal como se describe con mas detalle a continuacion. Los hibridomas pueden expandirse in vivo en animales singenicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos o en cultivo celular in vitro. Los metodos para seleccionar, clonar y expandir los hibridomas se conocen bien por los expertos en la materia.
En una realizacion preferida, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana y los linfocitos B esplenicos se fusionan con una lmea celular de mieloma de la misma especie que el animal no humano. En una realizacion mas preferida, el animal inmunizado es un animal XENOMOUSE™ y la lmea celular de mieloma es un mieloma no secretor de raton. En una realizacion aun mas preferida, la lmea celular de mieloma es P3-X63-AG8-653. Vease, por ejemplo, el ejemplo I.
Por lo tanto, en una realizacion, la invencion proporciona metodos para producir una lmea celular que produce un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo dirigido a M-CSF que comprende (a) inmunizar a un animal transgenico no humano descrito en la presente memoria con M-CSF, una porcion de M-CSF o una celula o tejido que exprese M-CSF; (b) permitir que el animal transgenico genere una respuesta inmune frente a M-CSF; (c) aislar los linfocitos B de un animal transgenico; (d) inmortalizar los linfocitos B; (e) crear poblaciones monoclonales individuales de los linfocitos B inmortalizados; y (f) detectar los linfocitos B inmortalizados para identificar un anticuerpo dirigido contra el M-CSF.
En otro aspecto, la invencion proporciona hibridomas que producen un anticuerpo anti-M-CSF humano. En una realizacion preferida, los hibridomas son hibridomas de raton, tal como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones, los hibridomas se producen en una especie que no es humana ni de raton, tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. En otra realizacion, los hibridomas son hibridomas humanos.
En otra realizacion preferida, se inmuniza un animal transgenico con M-CSF, celulas primarias, por ejemplo, celulas del bazo o de la sangre periferica, se afslan de un animal transgenico inmunizado y se identifican las celulas individuales que producen anticuerpos para el antfgeno deseado. Se afsla ARNm poliadenilado de cada celula individual y se realiza la reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR) usando cebadores sentido que se emparejan con las secuencias de la region variable, por ejemplo, cebadores degenerados que reconocen la mayona o todas las regiones FR1 de los genes de la region variable de las cadenas pesada y ligera humanas y cebadores antisentido que se emparejan con las secuencias de la region constante o de la region de union. Despues, se clonan los ADNc de las regiones variables de la cadena pesada y ligera y se expresan en cualquier celula hospedadora adecuada, por ejemplo, una celula de mieloma, como anticuerpos quimericos con sus respectivas regiones constantes de inmunoglobulina, tal como la cadena pesada y los dominios constantes k o A. Vease Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996, Los anticuerpos anti-M-CSF pueden entonces identificarse y aislarsetal como se describe en la presente memoria.
En otra realizacion, se pueden usar tecnicas de presentacion de fagos para proporcionar bibliotecas que contienen un repertorio de anticuerpos con afinidades variables por M-CSF. Para la produccion de dichos repertorios, no es necesario inmortalizar los linfocitos B del animal inmunizado. Mas bien, pueden usarse los linfocitos B primarios directamente como una fuente de ADN. La mezcla de ADNc obtenida de linfocitos B, por ejemplo, que provienen del bazo, se usa para preparar una biblioteca de expresion, por ejemplo, una biblioteca de presentacion de fago transfectada en E. coli. Las celulas resultantes se ensayan respecto de su inmunorreactividad frente a M-CSF. Las tecnicas para la identificacion de anticuerpos humanos de alta afinidad a partir de dichas bibliotecas se describen en Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698 y en Griffiths et al., ibid, 12:725-734. En ultima instancia, se identifican los clones de la biblioteca que producen afinidades de union por el antfgeno de una magnitud deseada y se recupera y manipula el ADN que codifica el producto responsable de dicha union para su expresion recombinante convencional. Las bibliotecas de presentacion de fago tambien se pueden construir usando secuencias de nucleotidos previamente manipuladas y exploradas de manera similar. En general, los ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera se suministran de manera independiente o se enlazan para formar analogos de Fv para su produccion en la fagoteca.
Despues, se explora la fagoteca para detectar los anticuerpos con las afinidades mas altas por M-CSF y se recupera el material genetico del clon adecuado. Las rondas adicionales de exploracion pueden aumentar la afinidad del anticuerpo original aislado.
En otro aspecto, la invencion proporciona a hibridomas que producen un anticuerpo anti-M-CSF humano. En una realizacion preferida, los hibridomas son hibridomas de raton, tal como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones, los hibridomas se producen en una especie que no es humana ni de raton, tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. En otra realizacion, los hibridomas son hibridomas humanos.
Acidos nucleicos, vectores, celulas hospedadoras, y metodos recombinantes para generar anticuerpos
Acidos nucleicos
La presente invencion tambien abarca moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos anti-M-CSF. En algunas realizaciones, diferentes moleculas de acidos nucleicos codifican una cadena pesada y una cadena ligera de una inmunoglobulina anti-M-CSF. En otras realizaciones, la misma molecula de acido nucleico codifica una cadena pesada y una cadena ligera de una inmunoglobulina anti-M-CSF. En una realizacion, el acido nucleico codifica un anticuerpo M-CSF de la invencion.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera comprende un gen VkL5, O12, L2, B3, A27 y un gen Jk1, Jk2, Jk3 o Jk4 humano.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera, codifica una secuencia de aminoacidos que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 mutaciones respecto de la secuencia de aminoacidos de la lmea germinal. En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos de Vl que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoacidos no conservativas y/o 1, 2 o 3 sustituciones no conservativas en comparacion con la secuencia de la lmea germinal. Las sustituciones pueden estar en las regiones CDR, en las regiones marco conservadas o en el dominio constante.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de Vl que comprende una o mas variantes en comparacion con la secuencia de la lmea germinal que son identicas a las variaciones halladas en la Vl de uno de los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica al menos tres mutaciones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de la lmea germinal halladas en la Vl de uno de los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4, 8.10.3, o 9.7.2.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la Vl del anticuerpo monoclonal 252 (SEQ ID NO: 4), 88 (SEQ ID NO: 8), 100 (SEQ ID NO: 12), 3.8.3 (SEQ ID NO: 16), 2.7.3 (SEQ ID NO: 20), 1.120.1 (SEQ ID NO: 24), 9.14.4I (SEQ ID NO: 28), 8.10.3F (SEQ ID NO: 32), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 36), 9.14.4 (SEQ ID NO: 28), 8.10.3 (SEQ ID NO: 44), 9.7.2 (SEQ ID NO: 48), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 52), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 56), 8.1.0.3C-Ser (SEQ ID NO: 60), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 60), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 52), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 52), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-CG4 (SEQ ID-NO: 56), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 28), 9.7.2-Ser (SEQ ID NO: 48), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 44), 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 60) 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 32) o 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 28) o una porcion del mismo. En algunas realizaciones, dicha porcion comprende al menos la region CDR2. En algunas realizaciones, el acido nucleico codifica la secuencia de aminoacidos de las CDR de cadena ligera de dicho anticuerpo. En algunas realizaciones, dicha porcion es una porcion contigua que comprende CDR1-CDR3.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de una de las SeQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60. En algunas realizaciones preferidas, la molecula de acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos de cadena ligera de las SEQ ID NO: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 o 47, o una porcion de la misma.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de Vl que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una secuencia de aminoacidos de Vl que se muestra en la figura 4 o a las secuencias de aminoacidos de Vl de uno cualquiera de los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1, o una secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60. Las moleculas de acidos nucleicos de la invencion incluyen acidos nucleicos que hibridan en condiciones altamente rigurosas, tales como aquellas descritas anteriormente, con una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60 o que tiene la secuencia de acido nucleico de las SEQ ID NO: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 o 47.
En otra realizacion, el acido nucleico codifica una cadena ligera de longitud completa de un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3 CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1 o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60 y una region constante de una cadena ligera o una cadena ligera que comprende una mutacion. Ademas, el acido nucleico puede comprender la secuencia de nucleotidos de la cadena ligera de las SEQ ID NO: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 o 47 y la secuencia de nucleotidos que codifica una region constante de una cadena ligera, o una molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera que comprende una mutacion.
En otra realizacion preferida, la molecula de acido nucleico codifica el dominio variable de la cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia genica de Vh 1-18, 3-33, 3-11, 3-23, 3-48 o 3-7 humana o una secuencia derivada de las mismas. En varias realizaciones, la molecula de acido nucleico comprende un gen Vh 1-18 humano, un gen Dh4-23 y un gen Jh4 humano; un gen Vh 3-33 humano, un gen Dh1-26 humano y un gen Jh4 humano; un gen Vh 3-11 humano, un gen Dh7-27 humano y un gen Jh4 humano; un gen Vh 3-11 humano, un gen Dh7-27 humano y un gen JH6 humano; un gen VH 3-23 humano, un gen DH1-26 humano y un gen JH4 humano; un gen VH 3-7 humano, un gen Dh6-13 humano y un gen Jh4 humano; un gen Vh 3-11 humano, un gen Dh7-27 humano y un gen JH4b humano; un gen Vh 3-48 humano, un gen Dh1-26 humano y un gen JH4b humano; un gen Vh 3-11 humano, un gen Dh6-13 humano y un gen JH6b humano, o una secuencia derivada de los genes humanos.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17 o 18 mutaciones en comparacion con la secuencia de aminoacidos de lmea germinal de los genes humanos V, D o J. En algunas realizaciones, dichas mutaciones estan en la region Vh. En algunas realizaciones, dichas mutaciones estan en las regiones CDR.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica una o mas mutaciones en comparacion con la secuencia de la lmea germinal que son identicas a las mutaciones de aminoacidos que se encuentran en la Vh de un anticuerpo monoclonal 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3- Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En algunas realizaciones, el acido nucleico codifica al menos tres mutaciones de aminoacidos en comparacion con las secuencias de la lmea germinal que son identicas con al menos tres mutaciones de aminoacidos que se encuentran en uno de los anticuerpos monoclonales enumerados anteriormente.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica al menos una porcion de la secuencia de aminoacidos de la Vh del anticuerpo 252 (SEQ ID NO: 2), 88 (SEQ ID NO: 6), 100 (SEQ ID NO: 10), 3.8.3 (SEQ ID NO: 14), 2.7.3 (SEQ ID NO: 18), 1.120.1 (SEQ ID NO: 22), 9.14.4I (SEQ ID NO: 26), 8.10.3F (SEQ ID NO: 30), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 34), 9.14.4 (SEQ ID NO: 38), 8.10.3 (SEQ ID NO: 30), 9.7.2 (SEQ ID NO: 46), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 50), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 54), 8.10.3C-Ser (SEQ ID NO: 58), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 62), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 66), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 70), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 74), 9.14.4- CG4 (SEQ ID NO: 78), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 82), 9.7.2-Ser (SEQ ID NO: 86), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 90), 8.10.3- CG4 (SEQ ID NO: 94) 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 98) o 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 102)o dicha secuencia quetiene mutaciones de aminoacidos conservativos y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoacidos no conservativas. En varias realizaciones, la secuencia codifica una o mas regiones CDR, preferentemente una region CDR3, las tres regiones CDR, una region contigua que incluye CDR1-CDR3 o la region Vh completa.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos de la cadena pesada que codifica la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102. En algunas realizaciones preferidas, la molecula de acido nucleico comprende al menos una porcion de la secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 o 101. En algunas realizaciones, dicha porcion codifica la region Vh, una region CD3, las tres regiones o una region contigua que incluye CDR1-CDR3.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de la Vh que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a las secuencias de aminoacidos de la Vh mostradas en la figura 4 o a una secuencia de aminoacidos de la Vh de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102. Las moleculas de acidos nucleicos de la invencion incluyen acidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas, tales como aquellas descritas anteriormente, con una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102 o que tiene la secuencia de nucleotidos de las SEQ ID NO: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 o 101.
En otra realizacion, el acido nucleico codifica una cadena pesada de longitud completa de un anticuerpo seleccionado de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3- Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1 o una cadena pesada quetiene la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102 y una region constante de la cadena pesada o una cadena pesada que comprende una mutacion. Ademas, el acido nucleico puede comprender la secuencia de nucleotidos de cadena pesada de las SEQ ID NO: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 o 101 y la secuencia de nucleotidos que codifica una region constante de una cadena ligera o una molecula de acido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende una mutacion.
Puede aislarse una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada o la cadena ligera completa de un anticuerpo anti-M-CSF o porciones de las mismas a partir de cualquier fuente que produzca dicho anticuerpo. En varias realizaciones, las moleculas de acido nucleico se afslan a partir de un linfocito B aislado de un animal inmunizado con M-CSF o de una celula inmortalizada que proviene de dicho linfocito B que expresa el anticuerpo anti-M-CSF. Los metodos para aislar ARNm que codifica un anticuerpo se conocen bien en la materia. Vease, por ejemplo, Sambrook et al. El ARNm puede usarse para producir ADNc para su uso en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o la clonacion de ADNc de los genes de anticuerpos. En una realizacion preferida, la molecula de acido nucleico se afsla a partir de un hibridoma que tiene como uno de sus companeros de fusion una celula productora de inmunoglobulina humanas de un animal transgenico no humano. En una realizacion aun mas preferida, la celula productora de inmunoglobulina humana se afsla a partir de un animal XENOMOUSE™. En otra realizacion, la celula productora de inmunoglobulina humana es de un animal transgenico que no es humano ni es un raton, tal como se ha descrito anteriormente. En otra realizacion, el acido nucleico se afsla a partir de un animal no humano que no es transgenico. Las moleculas de acido nucleico aisladas a partir de un animal no humano que no es transgenico se pueden usar, por ejemplo, para anticuerpos humanizados.
En algunas realizaciones, un acido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio Vh de la invencion unido en fase a una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio constante de una cadena pesada de cualquier fuente. De manera similar, una molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio Vl de la invencion unido en fase a una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio constante de una cadena ligera de cualquier fuente.
En un aspecto adicional de la invencion, las moleculas de acido nucleico que codifican el dominio variable de las cadenas pesada (Vh) y ligera (Vl) se "convierten" en genes de anticuerpo de longitud completa. En una realizacion, las moleculas de acido nucleico que codifican los dominios Vh o Vl se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa mediante su insercion en un vector de expresion que ya codifica los dominios constantes de las cadenas pesada (Ch) o ligera (Cl), respectivamente, de tal forma que el segmento Vh se une de manera operativa al segmento o segmentos Ch dentro del vector y el segmento Vl se une de manera operativa al segmento Cl dentro del vector. En otra realizacion, las moleculas de acido nucleico que codifican los dominios Vh y/o Vl se convierten en genes de anticuerpo de longitud completa mediante union, por ejemplo, ligamiento, de un acido nucleico que codifica los dominios Vh y/o Vl a una molecula de acido nucleico que codifica un dominio Ch y/o Cl usando tecnicas de biologfa molecular convencionales. Se conocen en la tecnica secuencias de acido nucleico de genes de dominio constante de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Vease, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Pub. de NIH n.° 91-3242, 1991. Las moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa pueden expresarse entonces a partir de una celula en la cual se han introducido y se afsla el anticuerpo anti-M-CSF.
Las moleculas de acido nucleico se pueden usar para expresar de manera recombinante grandes cantidades de anticuerpos anti-M-CSF. Las moleculas de acido nucleico tambien se pueden usar para producir anticuerpos quimericos, anticuerpos biespedficos, anticuerpos monocatenarios, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, como se describe adicionalmente a continuacion. Si las moleculas de acido nucleico provienen de un animal no humano que no es transgenico, las moleculas de acido nucleico pueden usarse para la humanizacion de anticuerpos, tambien como se describe a continuacion.
En otra realizacion, una molecula de acido nucleico de la invencion se usa como una sonda o un cebador de PCR para una secuencia de anticuerpo espedfica. Por ejemplo, el acido nucleico puede usarse como una sonda en metodos de diagnostico o como un cebador de PCR para amplificar regiones de ADN que pueden usarse, entre otras cosas, para aislar moleculas adicionales de acido nucleico que codifican dominios variables de anticuerpos anti-M-CSF. En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico son oligonucleotidos. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos son de regiones altamente variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de interes. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos codifican la totalidad o una parte de una o mas de las CDR del anticuerpo 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, o 1.120.1, o variantes del mismo descritas en la presente memoria.
Vectores
La invencion proporciona vectores que comprende moleculas de acido nucleico que codifican la cadena pesada de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion o una porcion de union a antfgeno del mismo. La invencion tambien proporciona vectores que comprenden moleculas de acido nucleico que codifican la cadena ligera de dichos anticuerpos o porciones de union a antfgeno de los mismos. La invencion proporciona ademas vectores que comprenden moleculas de acido nucleico que codifican protemas de fusion, anticuerpos modificados y sondas de los mismos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-M-CSF, o porciones de union a antfgeno de la invencion se expresan mediante la insercion de los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de manera de longitud parcial o completa, obtenidas tal como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresion de tal forma que los genes estan unidos de manera operativa a secuencias de control de la expresion necesarias, tales como las secuencias de control transcripcional y traduccional. Los vectores de expresion incluyen plasmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (VAA), virus de plantas tales como el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco, cosmidos, YAC, episomas derivados del VEB y similares. El gen del anticuerpo esta ligado a un vector, de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector cumplen su funcion prevista de regular la transcripcion y traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se eligen para que sean compatibles con la celula hospedadora de expresion usada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En una realizacion preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes de anticuerpo se insertan en vectores de expresion mediante metodos convencionales (por ejemplo, por ligamiento de los sitios de restriccion complementarios en el fragmento y vector del gen del anticuerpo, o por ligamiento de un extremo romo si no hay sitios de restriccion).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de Ch o Cl de inmunoglobulina humana funcionalmente completa, con sitios de restriccion adecuados disenados de tal forma que puede insertarse y expresarse facilmente cualquier secuencia de Vh o Vl, tal como se ha descrito anteriormente. En dichos vectores, el corte y empalme se produce normalmente entre el sitio de corte y empalme del donante en la region J insertada y el sitio de corte y empalme aceptor que precede al dominio C humano, y tambien en las regiones de corte y empalme que tienen lugar dentro de los exones de Ch humanos. La poliadenilacion y la terminacion de la transcripcion se producen en sitios cromosomicos nativos cadena abajo de las regiones codificantes. El vector de expresion recombinante tambien puede codificar un peptido senal que facilita la secrecion de la cadena del anticuerpo a partir de una celula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en un vector de tal forma que el peptido senal se une en fase al extremo amino terminal de la cadena de la inmunoglobulina. El peptido senal puede ser un peptido senal de una inmunoglobulina o un peptido senal heterologo (es decir, un peptido senal de una protema que no es una inmunoglobulina).
Ademas de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresion recombinante de la invencion portan secuencias reguladoras que controlan la expresion de genes de cadena de anticuerpo en una celula hospedadora. Se apreciara por los expertos en la materia que el diseno del vector de expresion, incluida la seleccion de secuencias reguladoras pueda depender de factores tales como la eleccion de celulas hospedadoras a transformar, el nivel de expresion de la protema deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresion de celulas hospedadoras de mairnferos incluyen elementos virales que dirigen la expresion de altos niveles de protema en celulas de mamffero, tales como promotores y/o potenciadores que provienen de LTR retrovmicos, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), el virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardfo principal del adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamfferos fuertes tales como promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una descripcion adicional de los elementos reguladores virales y las secuencias de los mismos, veanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.168.062, la Patente de los Estados Unidos n.° 4.510.245 y la Patente de los Estados Unidos n.° 4.968.615. Se conocen en la tecnica metodos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripcion de promotores y vectores, asf como la transformacion de plantas. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.517.529. Tambien se conocen bien en la tecnica metodos para expresar polipeptidos en celulas bacterianas o en celulas fungicas, por ejemplo, celulas de levadura.
Ademas de los genes de cadena de anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en celulas hospedadoras (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes marcadores de seleccion. El gen de marcador de seleccion facilita la seleccion de celulas hospedadoras en las cuales se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, el gen de marcador de seleccion confiere tfpicamente resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes de marcadores de seleccion preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en celulas hospedadoras dhfr- con seleccion/amplificacion de metotrexato), el gen de resistencia a la neomicina (para la seleccion con G418) y el gen de la glutamato sintetasa.
Celulas hospedadoras no hibridomas y metodos para producir protema de manera recombinante
Las moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos anti-M-CSF y los vectores que comprenden estas moleculas de acido nucleico se pueden usar para la transfeccion de una celula hospedadora de marnffero, planta, bacteria o levadura adecuada. La transformacion puede ser mediante cualquier metodo para introducir polinucleotidos en una celula hospedadora. Los metodos para introducir polinucleotidos heterologos en celulas de mamffero son bien conocidos en la materia e incluyen la transfeccion mediada por dextrano, la precipitacion de fosfato calcico, la transfeccion mediada por polibreno, la fusion de protoplastos, la electroporacion, la encapsulacion de los polinucleotidos en liposomas y la microinyeccion directa de ADN en el nucleo. Ademas, las moleculas de acido nucleico se pueden introducir en celulas de mam êra mediante vectores vmcos. Los metodos para transformar celulas son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455 . Los metodos para transformar celulas vegetales son bien conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, la transformacion mediada por Agrobacterium, la transformacion bioKstica, la inyeccion directa, la electroporacion y la transformacion vmca. Los metodos para transformar celulas bacterianas y de levadura tambien son bien conocidos en la tecnica.
Las lmeas celulares de mairnferos disponibles como hospedadoras para la expresion se conocen bien en la tecnica e incluyen muchas lmeas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, las celulas de ovario de hamster chino (CHO), NSO, celulas SP2, celulas HeLa, celulas de rinon de cna de hamster (BHK), celulas de rinon de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), celulas A549 y varias otras lmeas celulares. Las lmeas celulares particularmente preferentes se seleccionan determinando que lmeas celulares tienen altos niveles de expresion. Otras lmeas celulares que pueden usarse son lmeas celulares de insecto, tales como las celulas Sf9. Cuando los vectores de expresion que codifican genes de anticuerpo se introducen en celulas hospedadoras de mai^ero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de celulas hospedadoras durante un penodo de tiempo suficiente como para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas hospedadoras o, mas preferentemente, la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se han cultivado las celulas hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando metodos de purificacion de protemas convencionales. Las celulas hospedadoras de planta incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua, mafz, trigo, patata, etc. Las celulas hospedadoras bacterianas incluyen especies de E. coli y Streptomyces. Las celulas hospedadoras de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.
Ademas, la expresion de los anticuerpos de la invencion (u otros restos de los mismos) de las lmeas celulares de produccion puede mejorarse usando varias tecnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresion del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es una estrategia comun para mejorar la expresion en ciertas condiciones. El sistema GS se describe en totalidad o en parte en relacion con las Patentes Europeas n.° 0216846, 0256055 y 0 323997 y la Solicitud de Patente Europea n.° 89303964.4.
Es posible que los anticuerpos expresados por diferentes lmeas celulares o animales transgenicos tengan diferentes glicosilaciones entre sL Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moleculas de acido nucleico proporcionadas en la presente memoria, o que comprenden las secuencias de aminoacidos proporcionadas en la presente memoria son parte de la presente invencion, independientemente del estado de glicosilacion o el patron o la modificacion de los anticuerpos.
Animales y plantas transgenicas
Los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion tambien se pueden producir de manera transgenica mediante la generacion de un marnffero o una planta que es transgenica respecto de las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interes y la produccion del anticuerpo en una forma recuperable del mismo. En relacion con la produccion transgenica en mamfferos, los anticuerpos anti-M-CSF se pueden producir en, y recuperar a partir de leche de cabra, de vaca o de otros mamfferos. Veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. En algunas realizaciones, los animales transgenicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana se inmunizan con M-CSF o una porcion inmunogenica del mismo, tal como se ha descrito anteriormente. Los metodos para generar anticuerpos en plantas, levaduras u hongos/algas se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.046.037 y la Patente de los Estados Unidos n.° 5.959.177.
En algunas realizaciones, los animales no humanos o las plantas transgenicas se producen introduciendo una o mas moleculas de acido nucleico que codifican un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion en el animal o planta mediante tecnicas transgenicas convencionales. Veanse Hogan y la Patente de los Estados Unidos n.° 6.417.429, anteriormente citados. Las celulas transgenicas usadas para producir el animal transgenico pueden ser celulas madre embrionarias o celulas somaticas. Los organismos transgenicos no humanos pueden ser quimericos, heterocigotos no quimericos y homocigotos no quimericos. Vease, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En algunas realizaciones, los animales transgenicos no humanos tienen una disrupcion y sustitucion dirigida por una construccion de direccionamiento que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de interes. En una realizacion preferida, los animales transgenicos comprenden y expresan moleculas de acido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras que se unen espedficamente a M-CSF, preferentemente a M-CSF humano. En algunas realizaciones, los animales transgenicos comprenden moleculas de acido nucleico que codifican un anticuerpo modificado, tal como un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-M-CSF pueden generarse en cualquier animal transgenico. En una realizacion preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. El animal transgenico no humano expresa dichos polipeptidos codificados en la sangre, la leche, la orina, la saliva, las lagrimas, los mocos y otros fluidos corporales.
Biblioteca de presentacion en fagos
La invencion proporciona un metodo para producir un anticuerpo anti-M-CSF o una porcion de union a antfgeno del mismo que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fago, la exploracion de la biblioteca con M-CSF o una porcion del mismo, aislar el fago que se une al M-CSF y obtener el anticuerpo del fago. A modo de ejemplo, un metodo para preparar la biblioteca de anticuerpos para su uso en tecnicas de presentacion en fagos comprende las etapas de inmunizar a un animal no humano que comprende loci de inmunoglobulina humana con M-CSF o una porcion antigenica del mismo para crear una respuesta inmunitaria, extraer celulas productoras de anticuerpos del animal inmunizado; aislar ARN de las celulas extrafdas, retrotranscribir el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando un cebador, e insertar el ADNc en un vector de presentacion de fago de tal forma que los anticuerpos se expresen en el fago. Se pueden obtener de esta manera los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion.
Los anticuerpos anti-M-CSF humanos recombinantes de la invencion se pueden aislar mediante exploracion de una biblioteca recombinante combinatoria de anticuerpos. Preferentemente, la biblioteca es una biblioteca de presentacion de fago de scFv, generada usando los ADNc de Vl y Vh humanos preparados a partir de ARNm aislado a partir de linfocitos B. Se conocen en la tecnica metodologfas para preparar y explorar dichas bibliotecas. Hay kits disponibles comercialmente para generar bibliotecas de presentacion en fago (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n.° de catalogo 27-9400-01; y el kit de presentacion en fagos SurfZAP™ de Stratagene, n.° de catalogo 240612). Tambien hay otros metodos y reactivos que se pueden usar en la generacion y exploracion de bibliotecas de anticuerpos (veanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.223.409; las publicaciones PCT n.°WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); y Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991).
En una realizacion, para aislar los anticuerpos anti-M-CSF humanos con las caractensticas deseadas, se usa en primer lugar un anticuerpo anti-M-CSF human como el descrito en la presente memoria para seleccionar las secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tengan una actividad de union similar a M-CSF, usando los metodos de impronta epitopica descritos en la Publicacion PCT n.° WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este metodo son preferentemente bibliotecas de scFv preparadas y exploradas tal como se describe en la Publicacion PCT n.° WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); y en Griffiths et al., EMBO J.
12:725-734 (1993). Las bibliotecas de anticuerpos scFv se exploran preferentemente usando el M-CSF humano como antfgeno.
Una vez que se seleccionan los dominios Vl y Vh humanos iniciales, se realizan experimentos "mix and match", en los que se exploran diferentes pares de los segmentos Vl y VHinicialmente seleccionados respecto de la union a M-CSF para seleccionar combinaciones de pares de Vl/Vh preferidas. De manera adicional, para mejorar adicionalmente la calidad del anticuerpo, pueden mutarse los segmentos Vl y Vh de los pares Vl/Vh, preferentemente en la region CDR3 de la vH y/o Vl, en un proceso analogo al proceso de la mutacion somatica in vivo responsable de la maduracion por afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduracion por afinidad in vitro se puede lograr por amplificacion de los dominios Vh y Vl usando cebadores PCR complementarios con la CDR3 de Vh o la CDR3 de Vl, respectivamente, cuyos cebadores han sido "sembrados" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleotidos en ciertas posiciones, de manera que los productos resultantes de la PCR codifican los segmentos VH y Vl en los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regionesCDR3 de Vh y/o Vl. Estos segmentos Vh y Vl mutados de manera aleatoria pueden reexplorarse respecto de la union a M-CSF.
Tras la exploracion y el aislamiento de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion a partir de una biblioteca de presentacion de inmunoglobulina recombinante, los acidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se pueden recuperar del paquete de presentacion (por ejemplo, a partir del genoma del fago) y subclonar en otros vectores de expresion mediante tecnicas estandar de ADN recombinante. Si se desea, el acido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invencion, tal como se describe a continuacion. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado mediante la exploracion de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresion recombinante y se introduce en las celulas hospedadoras de un mairnfero, tal como se ha descrito anteriormente.
Cambio de clase
Otro aspecto de invencion proporciona un metodo para convertir la clase o subclase de un anticuerpo anti-M-CSF en otra clase o subclase. En algunas realizaciones, se afsla una molecula de acido nucleico que codifica una Vl o Vh que no incluye ninguna secuencia de acido nucleico que codifica Cl o Ch usando metodos bien conocidos en la tecnica. Despues, se une de manera operativa la molecula de acido nucleico a una secuencia de acido nucleico que codifica una Cl o Ch de una clase o subclase de inmunoglobulina deseada. Esto se puede lograr usando un vector o una molecula de acido nucleico que comprende una cadena Cl o Ch, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, puede cambiarse la clase de un anticuerpo anti-M-CSF que originalmente era IgM a una IgG. Ademas, puede usarse el cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de IgG1 a IgG2. Otro metodo para producir un anticuerpo de la invencion que comprende un isotipo deseado comprende las etapas de aislar un acido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-M-CSF y un acido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-M-CSF, aislar la secuencia que codifica la region Vh, ligar la secuencia VH a una secuencia que codifica un dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar el gen de la cadena ligera y la construccion de la cadena pesada en una celula y recoger el anticuerpo anti-M-CSF con el isotipo deseado.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion tienen la serina en la posicion 228 (segun el convenio de numeracion EU) de la cadena pesada cambiada a una prolina. Por consiguiente, la subsecuencia CPSC en la region Fc de la IgG4 se convierte en CPPC, que es la subsecuencia en IgG1. (Aalberse, R.C. y Schuurman, J., Immunology, 105:9-19 (2002)). Por ejemplo, la serina en el resto 243 de la SEQ ID NO: 46 (que se corresponde con el resto 228 en el convenio de numeracion EU) se convertina en prolina. De manera similar, la serina en el resto 242 de la SEQ ID NO: 38 (que se corresponde con el resto 228 en el convenio de numeracion EU) se convertina en prolina. En algunas realizaciones, la region marco conservada del anticuerpo IgG4 puede retromutarse a la secuencia marco conservada de la lmea germinal. Algunas realizaciones comprenden tanto la region marco conservada retromutada como el cambio de serina a prolina en la region Fc. Veanse, por ejemplo, la SEQ ID NO: 54 (anticuerpo 9.14.4C-Ser) y la SEQ ID NO: 58 (anticuerpo 8.10.3C-Ser) en la tabla 1.
Anticuerpos desinmunizados
Otra manera de producir anticuerpos con inmunogenicidad reducida es la desinmunizacion de anticuerpos. En otro aspecto de la invencion, el anticuerpo puede desinmunizarse usando las tecnicas descritas en, por ejemplo, las publicaciones PCT n.° WO98/52976 y WO00/.
Anticuerpos mutados
En otra realizacion, pueden usarse las moleculas de acido nucleico, los vectores y las celulas hospedadoras para generar anticuerpos anti-M-CSF mutados. Los anticuerpos pueden mutarse en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera, por ejemplo, para alterar una propiedad de union del anticuerpo. Por ejemplo, puede efectuarse una mutacion en una o mas de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo por M-CSF, para aumentar o disminuir la koff, o para alterar la especificidad de union del anticuerpo. Se conocen bien en la materia tecnicas de mutagenesis de sitio dirigido. Veanse, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al., citados anteriormente. En una realizacion preferida, las mutaciones se efectuan en un resto de aminoacido que se sabe que esta cambiado en comparacion con la lmea germinal en un dominio variable de un anticuerpo anti-M-CSF. En otra realizacion, se efectuan una o mas mutaciones en un resto de aminoacido que se sabe que esta cambiado en comparacion con la lmea germinal en una region CDR o en una region marco conservada de un dominio variable o en un dominio constante de un anticuerpo monoclonal 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1. En otra realizacion, se efectuan una o mas mutaciones en un resto de aminoacido que se sabe que esta cambiado en comparacion con la lmea germinal en una region CDR o en una region marco conservada de un dominio variable de una secuencia de aminoacidos de cadena pesada seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 o 102 o cuyas secuencias de nucleotidos de cadena pesada se presentan en las SEQ ID NO: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 o 101. En otra realizacion, se efectuan una o mas mutaciones en un resto de aminoacido que se sabe que esta cambiado en comparacion con la lmea germinal en una region CDR o en una region marco conservada de un dominio variable de una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 o 60, o cuya secuencia de nucleotidos de cadena ligera se presenta en las SEQ ID NO: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 o 47.
En una realizacion, la region marco conservada esta mutada, de manera que las regiones marco conservadas resultantes tienen la secuencia de aminoacidos del gen correspondiente de la lmea germinal. Se puede efectuar una mutacion en una region marco conservada o en un dominio constante para aumentar la semivida del anticuerpo anti-M-CSF. Vease, por ejemplo, la publicacion PCT n.° WO 00/09560,. Tambien se puede efectuar una mutacion en la region marco conservada o en el dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio de union covalente o no covalente a otra molecula o para alterar propiedades tales como la fijacion de complemento, la union a FcR y la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC). De acuerdo con la invencion, un unico anticuerpo puede tener mutaciones en una o mas regiones marco o CDR cualquiera del dominio variable o en el dominio constante.
En algunas realizaciones, hay de 1 a 8 mutaciones, incluyendo cualquier numero intermedio, en cualquiera de los dominios Vh o Vl del anticuerpo anti-M-CSF mutado en comparacion con el anticuerpo anti-M-GSF antes de la mutacion. En cualquiera de las anteriores, las mutaciones pueden darse en una o mas regiones CDR. Ademas cualquiera de las mutaciones puede ser sustituciones conservativas de aminoacidos. En algunas realizaciones, no hay mas de 5, 4, 3, 2 o 1 cambio de aminoacidos en los dominios constantes.
Anticuerpos modificados
En otra realizacion, se puede producir un anticuerpo de fusion o una inmunoadhesina que comprenda la totalidad o una porcion de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion unida a otro polipeptido. En una realizacion preferida, solo estan unidos los dominios variables del anticuerpo anti-M-CSF al polipeptido. En otra realizacion preferida, el dominio Vh de un anticuerpo anti-M-CSF esta unido a un primer polipeptido, mientras que el dominio Vl de un anticuerpo anti-M-CSF esta unido a un segundo polipeptido que se asocia con el primer polipeptido de tal forma que los dominios Vh y Vl pueden interactuar entre sf para formar un sitio de union del anticuerpo. En otra realizacion preferida, el dominio Vh se separa del dominio Vl mediante un enlazador, de manera que los dominios Vh y Vl pueden interactuar entre sf (vease mas adelante en el apartado de Anticuerpos monocatenarios). El anticuerpo Vh-enlazador-VL se une entonces al polipeptido de interes. El anticuerpo de fusion es util para dirigir un polipeptido a una celula o tejido que expresa M-CSF. El polipeptido puede ser un agente terapeutico, tal como una toxina, un factor de crecimiento u otra protema reguladora, o puede ser un agente de diagnostico, tal como una enzima que se puede visualizar facilmente, tal como peroxidasa de rabano picante. Ademas, se pueden crear anticuerpos de fusion en los que dos (o mas) anticuerpos monocatenarios se unen entre sL Esto es util si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una unica cadena de polipeptidos, o si se desea crear un anticuerpo biespedfico.
Para crear un anticuerpo monocatenario, (scFv), los fragmentos de ADN que codifican ka Vh y la Vl estan unidos operablemente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4 -Ser)3, de tal forma que pueden expresarse las secuencias Vh y Vl en forma de una cadena de protema contigua, con los dominios Vl y Vh unidos mediante el enlazador flexible. Veanse, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si solo se usan un unico Vh y Vl, bivalente si se usan dos Vh y Vl o polivalente, si se usan mas de dos Vh y Vl. Se pueden generar anticuerpos biespedficos o polivalentes que se unen de forma espedfica al M-CSF y a otra molecula.
En otras realizaciones, se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos anti-M-CSF. Por ejemplo, pueden prepararse "cuerpos Kappa" (Ill et al., Protein Eng. 10: 949­ 57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)) o "Janusinas" (Traunecker et al., e MbO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) usando tecnicas de biologfa molecular convencionales siguiendo las ensenanzas de la memoria descriptiva.
Los anticuerpos biespedficos o los fragmentos de union a antfgeno se pueden producir mediante una variedad de metodos que incluyen la fusion de los hibridomas o la union de fragmentos Fab'. Veanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Ademas, pueden formarse anticuerpos biespedficos en forma de "diacuerpos" o "janusinas". En algunas realizaciones, el anticuerpo biespedfico se une a dos epftopos diferentes de M-CSF. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespedfico tiene una primea cadena pesada y una primera cadena ligera de un anticuerpo monoclonal 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, o 9.7.2 y una cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo adicional. En algunas realizaciones, la cadena ligera y la cadena pesada adicional tambien son de uno de los anticuerpos monoclonales identificados anteriormente, pero son diferentes de las primeras cadenas pesada y ligera.
En algunas realizaciones, se preparan los anticuerpos modificados descritos anteriormente usando uno o mas dominios variables o regiones CDR a partir de un anticuerpo monoclonal humano anti-M-CSF proporcionado en la presente memoria, a partir de una secuencia de aminoacidos de dicho anticuerpo monoclonal, o de una cadena pesada o ligera codificada por una secuencia de acidos nucleicos que codifica dicho anticuerpo monoclonal.
Anticuerpos derivatizados y marcados
Un anticuerpo anti-M-CSF o una porcion de union a antfgeno de la invencion puede derivatizarse o unirse a otra molecula (por ejemplo, a otro peptido o protema). En general, los anticuerpos o porciones de los mismos se derivatizan de manera que la union a M-CSF no se ve afectada de manera adversa por la derivatizacion o el marcado. Por consiguiente, se pretende que los anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la invencion incluyan formas tanto intactas como modificadas de los anticuerpos anti-M-CSF humanos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, puede enlazarse de manera funcional un anticuerpo o porcion de anticuerpo de la invencion (por acoplamiento qmmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otro modo) a una o mas entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespedfico o un diacuerpo), un agente de deteccion, un agente citotoxico, un agente farmaceutico y/o una protema o peptido que puede mediar la asociacion del anticuerpo o porcion de anticuerpo con otra molecula (tal como la region nucleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina). Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce mediante la reticulacion de dos o mas anticuerpos (del mismo tipo o de distintos tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespedficos). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos diferenciados separados mediante un espaciador adecuado (por ejemplo, ester de m-maleimidobenzoil-n-hidroxisuccinimida) u homobinfuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores estan disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
Otro tipo de anticuerpo derivatizado en un anticuerpo marcado. Los agentes de deteccion utiles con los que se puede derivatizar un anticuerpo o porcion de union a antfgeno de la invencion incluyen compuestos fluorescentes, que incluyen fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fosforos de lantanidos y similares. Tambien se puede marcar un anticuerpo con enzimas que son utiles para la deteccion, tales como la peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando se marca un anticuerpo con una enzima detectable, se detecta anadiendo reactivos adicionales que usa la enzima para producir un producto de reaccion que se puede discernir. Por ejemplo, cuando esta presente el agente peroxidasa de rabano picante, la adicion de peroxido de hidrogeno y diaminobencidina da lugar a un producto de reaccion coloreado, que es detectable. Tambien se puede marcar un anticuerpo con biotina, y detectarse mediante la medicion indirecta de la union de estreptavidina o avidina. Tambien se puede marcar un anticuerpo con un epttopo polipeptfdico reconocido por un indicador secundario (por ejemplo, pares de secuencias de cremallera de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union de metales, marcadores epitopicos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir la potencial impedancia esterica.
Tambien se puede marcar un anticuerpo anti-M-CSF con un aminoacido radiomarcado. El anticuerpo anti-M-CSF radiomarcado puede usarse tanto con fines tanto diagnosticos como terapeuticos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-M-CSF radiomarcado se puede usar para detectar tumores que expresan M-CSF mediante rayos X u otras tecnicas de diagnostico. Ademas, el anticuerpo anti-M-CSF radiomarcado se puede usar de manera terapeutica como una toxina para celulas cancerosas o tumores. Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero sin limitacion, los siguientes radioisotopos o radionuclidos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I y 131I.
Un anticuerpo anti-M-CSF tambien puede derivatizarse con un grupo qrnmico, tal como polietilenglicol, un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos son utiles para mejorar las caractensticas biologicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida en suero o para aumentar la union a tejidos.
Composicion farmaceutica y kits
La invencion tambien se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo humano antagonista anti-M-CSF para el tratamiento de sujetos que necesiten tratamiento para la artritis reumatoide, la osteoporosis o la ateroesclerosis. En algunas realizaciones, el sujeto de tratamiento es un ser humano. En otras realizaciones, el sujeto es un sujeto veterinario. Los trastornos hiperproliferativos donde los monocitos juegan un papel que puede tratarse mediante con un anticuerpo antagonista anti-M-CSF de la invencion pueden implicar cualquier tejido u organo e incluyen pero sin limitacion, cancer cerebral, pulmonar, de celulas escamosas, de vejiga, gastrico, de pancreas, de mama, de cabeza, de cuello, de tugado, renal, de ovario, de prostata, colorrectal, esofagico, ginecologico, nasofarmgeo o de tiroides, melanomas, linfomas, leucemias o mielomas multiples. En particular, los anticuerpos anti-M-CSF antagonistas humanos de la invencion son utiles para tratar o prevenir carcinomas de mama, de prostata, de colon y de pulmon.
La presente invencion tambien abarca composiciones para el tratamiento de una afeccion seleccionada del grupo que consiste en artritis, artritis psoriasica, smdrome de Reiter, gota, artritis traumatica, artritis por rubeola y sinovitis aguda, artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, artrosis, artritis gotosa y otras afecciones artnticas, septicemia, choque septico, choque endotoxico, septicemia por gram negativas, smdrome de choque toxico, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, neurotrauma, asma, smdrome de dificultad respiratoria del adulto, malaria cerebral, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica, silicosis, sarcoidosis pulmonar, enfermedad de la resorcion osea, osteoporosis, restenosis, lesion de reperfusion cardfaca y renal, trombosis, glomerulonefritis, diabetes, reaccion de injerto contra hospedador, rechazo de aloinjerto, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis multiple, degeneracion muscular, eczema, dermatitis de contacto, psoriasis, quemaduras solares y choque de conjuntivitis en un marnffero, incluyendo a un humano, que comprende una cantidad de anticuerpo anti-M-CSF monoclonal humano de la invencion eficaz en dicho tratamiento y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
El tratamiento puede implicar la administracion de uno o mas anticuerpos anti-M-CSF monoclonales antagonistas de la invencion o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, solos o con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Tal como se usa en la presente memoria, un "vehmulo farmaceuticamente aceptable" significa cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares que son fisiologicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehmulos farmaceuticamente aceptables son agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. Los ejemplos adicionales de sustancias farmaceuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida util o la eficacia del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion y las composiciones que los comprenden, se pueden administrar en combinacion con uno o mas agentes terapeuticos, diagnosticos o profilacticos. Los agentes terapeuticos adicionales incluyen otros agentes antineoplasicos, antitumorales, antiangiogenicos o quimioterapeuticos. Dichos agentes adicionales pueden incluirse en la misma composicion o administrarse de forma separada. En algunas realizaciones, se pueden usar uno o mas anticuerpos inhibidores anti-M-CSF de la invencion como una vacuna o como adyuvantes para una vacuna.
Las composiciones de esta invencion pueden estar en una variedad de formas, por ejemplo, formas de dosificacion Kquida, semisolida y solida, tales como soluciones lfquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pfldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo deseado de administracion y de la aplicacion terapeutica. Las composiciones tfpicas preferidas estan en la forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a aquellas usadas para la inmunizacion pasiva de seres humanos. El modo preferido de administracion es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutaneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realizacion preferida, el anticuerpo se administra mediante infusion intravenosa o inyeccion. En otra realizacion preferida, el anticuerpo se administra mediante inyeccion intramuscular o subcutanea. En otra realizacion, la invencion incluye un metodo de tratamiento de un sujeto que lo necesite con un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo que se une de forma espedfica al M-CSF, que comprende las etapas de: (a) administrar una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o la porcion de union a antfgeno de la misma, una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o la porcion de union a antfgeno de la misma, o ambas moleculas de acido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada o las porciones de union a antigeno de las mismas; y (b) expresar la molecula de acido nucleico.
Las composiciones terapeuticas tfpicamente deben ser esteriles y estables en condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, dispersion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentracion elevada de farmaco. Pueden prepararse soluciones esteriles estables incorporando el anticuerpo anti-M-CSF en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, segun sea necesario, seguido de esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo en un vetnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los demas ingredientes necesarios de entre aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son secado al vado y criodeseado, que proporcionan un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion del mismo previamente esterilizada por filtracion. Puede mantenerse la fluidez adecuada de una solucion, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la absorcion prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos de la presente invencion se pueden administrar mediante varios metodos conocidos en la tecnica, aunque para muchas aplicaciones terapeuticas, la ruta o modo de administracion preferido es la infusion subcutanea, intramuscular o intravenosa. Tal como apreciara el experto en la materia, la ruta y/o el modo de administracion variaran dependiendo de los resultados deseados.
En ciertas realizaciones, el principio activo de las composiciones de anticuerpos se puede preparar con un vetnculo que proteja al anticuerpo frente a su rapida liberacion, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos, y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biodegradables y biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianlddridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978).
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion se puede administrar por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vetnculo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) tambien puede encerrarse en capsulas de gelatina duras o blandas, comprimirse para formar comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administracion terapeutica oral, los anticuerpos anti-M-CSF se pueden incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invencion por otra via que no sea la parenteral, podna ser necesario revestir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivacion.
Los principios activos adicionales tambien se pueden incorporar en las composiciones. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion se coformula con y/o se coadministra con uno o mas agentes terapeuticos adicionales. Estos agentes incluyen anticuerpos que se unen a otros marcadores, agentes antineoplasicos, agentes antitumorales, agentes quimioterapeuticos, analogos de peptidos que inhiben al M-CSF, c-fms solubles que se pueden unir al M-CSF, uno o mas agentes qmmicos que inhiben al M-CSF, agentes antiinflamatorios, anticoagulantes, y agentes que disminuyen la presion sangumea (es decir, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE)). Dichas terapias combinadas pueden requerir bajas dosis del anticuerpo anti-M-CSF asf como de los agentes coadministrados, evitando de este modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Los anticuerpos inhibidores anti-M-CSF de la invencion y las composiciones que los comprenden tambien pueden administrate en combinacion con otros regfmenes terapeuticos, en particular en combinacion con el tratamiento de radiacion para el cancer. Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden usar en combinacion con agentes anticancer tales como endostatina y angiostatina o farmacos citotoxicos tales como adriamicina, daunomicina, cisplatino, etoposido, taxol, taxotere y alcaloides, tales como vincristina, inhibidores de la fanesil transferasa, inhibidores de VEGF y antimetabolitos tales como metotrexato.
Los compuestos de la invencion se pueden usar tambien en combinacion con agentes antivmcos, tales como Viracept, AZT, aciclovir y famciclovir y compuestos antisepticos tales como Valant.
Las composiciones de la invencion pueden incluir una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "cantidad profilacticamente eficaz" de un anticuerpo o porcion de union a antigeno de la invencion. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante penodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o porcion de anticuerpo puede variar segun factores tales como la patologfa, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o de la porcion de anticuerpo para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del anticuerpo o de la porcion de anticuerpo esta sobrepasado por los efectos terapeuticos beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante penodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profilactico deseado. Tfpicamente, puesto que se usa una dosis profilactica en sujetos antes o en un estadio anterior de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.
Los regfmenes de dosificacion se pueden ajustar para proporcionar la repuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica o profilactica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis segun este indicado por las exigencias de la situacion terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administracion y uniformidad de la dosificacion. La forma de dosis unitaria tal como se usa en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mairnferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en relacion con el veldculo farmaceutico requerido. La especificacion para la forma de dosis unitaria de la invencion esta dictada y depende directamente de (a) las caractensticas unicas del anticuerpo anti-M-CSF o porcion y el efecto terapeutico o profilactico a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la materia para formar una composicion de dicho anticuerpo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de un anticuerpo o porcion de la invencion es de 0,025 a 50 mg/kg, mas preferentemente de 0,1 a 50 mg/kg, mas preferentemente de 0,1-25, de 0,1 a 10 o de 0,1 a 3 mg/kg. Cabe destacar que los valores de dosificacion pueden variar dependiendo del tipo y la gravedad de la afeccion que se va a aliviar. Ha de entenderse ademas que para cualquier sujeto particular, los regfmenes espedficos de dosis pueden ajustarse a lo largo del tiempo segun la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de dosificacion expuestos en la presente memoria son solo ejemplares y no pretenden limitar el alcance o la practica de la composicion reivindicada.
Otro aspecto de la presente invencion incluyea kits que contienen un anticuerpo anti-M-CSF o una porcion de union a antfgeno de la invencion o una composicion que comprende dicho anticuerpo o porcion. Un kit puede incluir, ademas del anticuerpo o composicion, agentes de diagnostico o terapeuticos. Un kit tambien puede incluir instrucciones para su uso en un metodo de diagnostico o terapeutico. En una realizacion preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composicion que lo comprende y un agente de diagnostico que puede usarse en un metodo descrito mas adelante. En otra realizacion preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composicion que lo contiene y uno o mas agentes terapeuticos que pueden usarse en un metodo que se describe mas adelante. Una realizacion de la invencion es un kit que comprende un envase, instrucciones acerca de la administracion de un anticuerpo anti-M-CSF para un humano que padece una enfermedad inflamatoria o instrucciones para medir el numero de monocitos CD14+CD16+ en una muestra biologica y un anticuerpo anti-M-CSF.
La presente invencion tambien se refiere a composiciones para inhibir el crecimiento celular anormal en un mamffero que comprenden una cantidad de un anticuerpo de la invencion en combinacion con una cantidad de agente quimioterapeutico, en donde las cantidades del compuesto, sal, solvato o profarmaco y del agente quimioterapeutico son eficaces juntas para inhibir un crecimiento celular anormal. Se conocen en la tecnica muchos agentes quimioterapeuticos. En algunas realizaciones, el agente quimioterapeutico se selecciona del grupo que consiste en inhibidores mitoticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, modificadores de la respuesta biologica, antihormonas, por ejemplo, antiandrogenos y agentes antiangiogenesis.
Pueden usarse agentes antiangiogenicos, tales como inhibidores de la MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de la MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9), e inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), conjuntamente con un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion. Los ejemplos de inhibidores de COX-II utiles incluyen CELEBREX™ (celecoxib), valdecoxib, y rofecoxib. Los ejemplos de inhibidores de metaloproteinasa de matriz se describen en el documento WO 96/33172 (publicado el 24 de octubre de 1996), el documento WO 96/27583 (publicado el 7 de marzo de 1996), la Solicitud de Patente Europea n.° 97304971.1 (presentada el 8 dejulio de 1997), la Solicitud de Patente Europea n.° 99308617.2 (presentada el 29 de octubre de 1999), el documento WO 98/07697 (publicado el 26 de febrero de 1998), el documento WO 98/03516 (publicado el 29 de enero de 1998), el documento WO 98/34918 (publicado el 13 de agosto de 1998), el documento WO 98/34915 (publicado el 13 de agosto de 1998), el documento WO 98/33768 (publicado el 6 de agosto de 1998), el documento WO 98/30566 (publicado el 16 de julio de 1998), la Solicitud de Patente Europea 606.046 (publicada el 13 de julio de 1994), la Publicacion de Patente Europea 931.788 (publicada el 28 de julio de 1999), el documento WO 90/05719 (publicado el 31 de mayo de 1990), el documento WO 99/52910 (publicado el 21 de octubre de 1999), el documento WO 99/52889 (publicado el 21 de octubre de 1999), el documento WO 99/29667 (publicado el 17 dejunio de 1999), la Solicitud Internacional PCT n.° PCT/IB98/01113 (presentada el 21 dejulio de 1998), la Solicitud de patente Europea n.° 99302232.1 (presentada el 25 de marzo de 1999), la Solicitud de patente de Gran Bretana n.° 9912961.1 (presentada el 3 dejunio de 1999), la Solicitud Provisional de los Estados Unidos n.° 60/148.464 (presentada el 12 de agosto de 1999), la Patente de los Estados Unidos 5.863.949 (publicada el 26 de enero de 1999), la Patente de los Estados Unidos 5.861.510 (publicada el 19 de enero de 1999), y la Publicacion de Patente Europea 780.386 (publicada el 25 de junio de 1997) ,. Los inhibidores de MMP preferidos son aquellos que no demuestran artralgia. Mas preferidos son aquellos que inhiben de forma selectiva a MMP-2 y/o MMP-9 en relacion con otras metaloproteinasas de matriz (es decir, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, y MMP-13). Algunos ejemplos espedficos de inhibidores de MMP utiles en la presente invencion son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 y los compuestos citados en la siguiente lista: acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoilciclopentil)-amino]-propionico; hidroxiamida del acido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxabicicio[3.2.1]octano-3-carboxflico; hidroxiamida del acido (2R,3R) 1-[4-(2-cloro-4-fluoro-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxflico; hidroxiamida del acido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidropiran-4-carboxflico; acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propi6nico; hidroxiamida del acido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxflico; hidroxiamida del acido (R) 3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-carboxflico; hidroxiamida del acido (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metil-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxflico; acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1-metil-etil)-amino]-propi6nico; acido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(4-hidroxicarbamoil-tetrahidro-piran-4-il)-amino]-propionico; hidroxiamida del acido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxflico; hidroxiamida del acido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxflico; e hidroxiamida del acido (R) 3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-carboxflico; y las sales y solvatos farmaceuticamente aceptables de dichos compuestos.
Un compuesto que comprende un anticuerpo monoclonal humano anti-M-CSF de la invencion tambien puede usarse con inhibidores de la transduccion de senales, tales como agentes que pueden inhibir respuestas del EGF-R (receptor de factor de crecimiento epidermico), tales como anticuerpos para EGF-R, anticuerpos para EGF y moleculas que son inhibidores de EGF-R; inhibidores de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), tales como receptores de VEGF y moleculas que pueden inhibir al VEGF; e inhibidores del receptor erbB2, tales como moleculas organicas o anticuerpos que se unen al receptor erbB2, por ejemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Los inhibidores de EGF-R se describen en, por ejemplo, los documentos WO 95/19970 (publicado el 27 dejulio de 1995), WO 98/14451 (publicado el 9 de abril de 1998), WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), y la Patente de los Estados Unidos 5.747.498 (publicada el 5 de mayo de 1998), y tales sustancias pueden usarse en la presente invencion tal como se describen en la presente memoria. Los agentes inhibidores de EGFR incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales c225 y anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. y Merck KgaA), y los compuestos ZD-1834, ZD-1838 and ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), Ci-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), Cl-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusion Eg F (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), z M-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), lFm -A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y vacuna EGF-R (York Medical/Centro de Immunologfa Molecular (CIM)). Estos y otros agentes inhibidores de EGF-R pueden usarse en la presente invencion.
Los inhibidores de VEGF, por ejemplo SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), AVASTIN™ (Genentech), SH-268 (Schering), y NX-1838 (NeXstar) tambien pueden combinarse con el compuesto de la presente invencion. Los inhibidores de VEGF se describen en, por ejemplo, los documentos WO 99/24440 (publicada el 20 de mayo de 1999), Solicitud Internacional PCT n.° PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo de 1999), en el documento WO 95/21613 (publicado el 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicado el 2 de diciembre de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.834.504 (publicada el 10 de noviembre de 1998), WO 98/50356 (publicado el 12 de noviembre de 1998) , Patente de los Estados Unidos 5.883.113 (publicada el 16 de marzo de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.886.020 (publicada el 23 de marzo de 1999), Patente de los Estados Unidos 5.792.783 (publicada el 11 de agosto de 1998), Wo 99/10349 (publicado el 4 de marzo de 1999), WO 97/32856 (publicado el 12 de septiembre de 1997), WO 97/22596 (publicado el 26 de septiembre de 1997), WO 98/54093 (publicado el 3 de diciembre de 1998), WO 98/02438 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/16755 (publicado el 8 de abril de 1999), y WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), Otros ejemplos de inhibidores de VEGF mas espedficos utiles en la presente invencion son IM862 (Cytran Inc.); el anticuerpo anti-VEGF monoclonal de Genentech, Inc.; y la angiozima, una ribozima sintetica de Ribozime y Chiron. Estos y otros inhibidores de VEGF se pueden usar en la presente invencion tal como se describe en la presente memoria. Los inhibidores del receptor erbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) y 2B-1 (Chiron), se pueden combinar adicionalmente con el compuesto de la invencion, por ejemplo, aquellos indicados en los documentos WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/35146 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 99/35132 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 97/13760 (publicado el 17 de abril de 1997), WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), Patente de los Estados Unidos 5.587.458 (publicada el 24 de diciembre de 1996), y la Patente de los Estados Unidos 5.877.305 (publicada el 2 de marzo de 1999),. Los inhibidores del receptor erB2 utiles en la presente invencion se describen tambien en la Patente de los Estados Unidos 6.465.449 (publicada el 15 de octubre de 2002), y en la Patente de los Estados Unidos 6.284.764 (publicada el 4 de septiembre de 2001),. Los compuestos inhibidores del receptor erbB2 y las sustancias descritas en las solicitudes PCT, en las patentes de los Estados Unidos y en las solicitudes provisionales de los Estados Unidos mencionadas anteriormente, asf como otros compuestos y sustancias que inhiben al receptor erbB2, se pueden usar con el compuesto de la presente invencion segun la presente invencion.
Los agentes antisupervivencia incluyen anticuerpos anti-IGF-IR y agentes antiintegrina, tales como anticuerpos antiintegrina.
Los agentes antiinflamatorios se pueden usar en conjunto con un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion. Para el tratamiento de la artritis reumatoide, los anticuerpos anti-M-CSF humanos de la invencion se pueden combinar con agentes tales como inhibidores de TNF-V, tales como farmacos para el TNF (tales como REMICADE™, CDP-870 y HUMIRA™) y las moleculas de inmunoglobulina del receptor de TNF (tales como ENBREL™), inhibidores de IL-1, antagonistas del receptor o IL-1ra soluble (por ejemplo, Kineret o inhibidores de ICE), inhibidores de COX-2 (tales como celecoxib, rofecoxib, valdecoxib y etoricoxib), inhibidores de la metaloproteasa (preferentemente, inhibidores selectivos de MMP-13), inhibidores de p2X7, ligandos V28 (tales como n Eu ROTIN™ y PREGABALIN™), bajas dosis de metotrexato, leflunomida, hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina u oro parenteral u oral. Los compuestos de la invencion tambien pueden usarse en combinacion con agentes terapeuticos existentes para el tratamiento de la artrosis. Los agentes adecuados para usarse en combinacion incluyen agentes antiinflamatorios no esteroideos convencionales (en adelante, AINE) tales como piroxicam, diclofenaco, acidos propionicos tales como naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tales como acido mefenamico, indometacina, sulindaco, apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina, inhibidores de COX-2 tales como celecoxib, valdecoxib, rofecoxib y etoricoxib, analgesicos y terapias intraarticulares tales como corticosteroides y acidos hialuronicos tales como hyalgan y synvisc.
Los agentes anticoagulantes se pueden usar en conjunto con un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion. Los ejemplos de agentes anticoagulantes incluyen, pero sin limitacion, warfarina (COUMADIN™), heparina, y enoxaparina (LOVENOX™).
Los anticuerpos anti-M-CSF de la presente invencion tambien pueden usarse en combinacion con agentes cardiovasculares, tales como bloqueadores de los canales de calcio, agentes hipolipemiantes tales como estatinas, fibratos, betabloqueantes, inhibidores de ACE, antagonistas del receptor de angiotensina-2 e inhibidores de la agregacion plaquetaria. Los compuestos de la presente invencion se pueden usar tambien en combinacion con agentes del s Nc tales como antidepresivos (tales como sertralina), farmacos antiparkinsonianos (tales como deprenilo, L-dopa, REQUIP™, MIRAPEX™, inhibidores de MAOB tales como selegilina y rasagilina, inhibidores de comP tales como Tasmar, inhibidores de A-2, inhibidores de la recaptacion de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas de nicotina, agonistas de dopamina e inhibidores de la sintasa de oxido mtrico neuronal), y farmacos contra el Alzheimer tales como donepezil, tacrina, inhibidores de ligandos V25 (tales como NEUROTIN™ y PREGABALIN™), inhibidores COX-2, propentofilo o metrifonato.
Los anticuerpos anti-M-CSF humanos de la presente invencion tambien pueden usarse en combinacion con agentes para la osteoporosis, tales como raloxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno o fosamax y agentes inmunosupresores tales como FK-506 y rapamicina.
Metodos de diagnostico de uso
En otro aspecto, la invencion proporciona metodos de diagnostico. Los anticuerpos anti-M-CSF se pueden usar para detectar el M-CSF en una muestra biologica in vitro o in vivo. En una realizacion, la invencion proporciona un metodo para diagnosticar la presencia o localizacion de un tumor que expresa M-CSF en un sujeto que lo necesite, que comprende las etapas de inyectar el anticuerpo en el sujeto, determinar la expresion de M-c Sf en el sujeto localizando donde se ha unido el anticuerpo, comparar la expresion en un sujeto con la de un sujeto normal de referencia o estandary diagnosticar la presencia o localizacion del tumor.
Los anticuerpos anti-M-CSF se pueden usar en un inmunoensayo convencional, que incluye, sin limitacion, un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoqmmica de tejidos, transferencia de Western o inmunoprecipitacion. Los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion se pueden usar para detectar M-CSF de seres humanos. En otra realizacion, los anticuerpos anti-M-CSF se pueden usar para detectar M-CSF de primates tales como mono cinomologo, monos rhesus, chimpances o simios. La divulgacion se refiere a un metodo para detectar M-CSF en una muestra biologica que comprende poner en contacto una muestra biologica con un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion y detectar el anticuerpo unido. En una realizacion, el anticuerpo anti-M-CSF se marca directamente con un marcador detectable. En otra realizacion, el anticuerpo anti-M-CSF (el primer anticuerpo) no esta marcado y un segundo anticuerpo u otra molecula que se puede unir al anticuerpo anti-M-CSF esta marcada. Tal como conocen bien los expertos en la materia, se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de unirse de forma espedfica a la especie y clase particular del primer anticuerpo. Por ejemplo, si en anticuerpo anti-M-CSF es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario podna ser un anti-IgG humana. Otras moleculas que se pueden unir a anticuerpos incluyen, sin limitacion, protema A y protema G, ambas disponibles comercialmente, por ejemplo, en de Pierce Chemical Co.
Los marcadores adecuados para el anticuerpo o el anticuerpo secundario se han divulgado en citas anteriores, e incluyen varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, pgalactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostetico adecuado incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; Los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
En otras realizaciones, el M-CSF se puede ensayar en una muestra biologica mediante un inmunoensayo de competicion utilizando patrones de M-CSF marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-M-CSF no marcado. En este ensayo, la muestra biologica, los patrones de M-CSF marcados y el anticuerpo anti-M-CSF se combinan y se determina la cantidad de patron de M-CSF marcado unido al anticuerpo que no esta marcado. La cantidad de M-CSF en la muestra biologica es inversamente proporcional a la cantidad de patron de M-CSF marcado unido al anticuerpo anti-M-CSF.
Se pueden usar los inmunoensayos divulgados anteriormente con varios fines. Por ejemplo, los anticuerpos anti-M-CSF se pueden usar para detectar M-CSF en celulas o en la superficie de celulas en un cultivo celular o secretado en el medio de cultivo tisular. Los anticuerpos anti-M-CSF se pueden usar para determinar la cantidad de M-CSF en la superficie de las celulas o secretado en el medio de cultivo tisular que se ha tratado con varios compuestos. Este metodo se puede usar para identificar compuestos que son utiles para inhibir o activar la expresion o secrecion del M-CSF. Segun este metodo, se trata una muestra de celulas con un compuesto de ensayo durante un penodo de tiempo mientras otra muestra se deja sin tratar. Si se mide el nivel total del M-CSF, las celulas se lisan y el nivel total de M-CSF se mide usando uno de los inmunoensayos descritos anteriormente. Se compara el nivel total del M-CSF frente al de las celulas que no han sido tratadas para determinar el efecto del compuesto de ensayo.
Un inmunoensayo para medir los niveles totales del M-CSF es un ELISA o una transferencia de Western. Si se mide el nivel del M-CSF en la superficie celular, las celulas no se lisan y se pueden medir los niveles del M-CSF en la superficie celular usando uno de los inmunoensayos descritos anteriormente. Un inmunoensayo para determinar los niveles del M-CSF en la superficie celular puede incluir las etapas de marcar las protemas de la superficie celular con un marcador detectable, tal como biotina o 125I, inmunoprecipitar el M-CSF con un anticuerpo anti-M-CSF y entonces detectar el M-CSF marcado. Otro inmunoensayo para determinar la localizacion del M-CSF, por ejemplo, los niveles en superficie celular, puede ser la inmunohistoqmmica. Los metodos tales como ELISA, RIA, transferencia de Western, inmunohistoqmmica, marcado de las protemas integrales de membrana de la superficie celular e inmunoprecipitacion se conocen bien en la materia. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente. Ademas, pueden ampliarse los inmunoensayos para una exploracion de alto rendimiento con el fin de ensayar un gran numero de compuestos para inhibir o activar el M-CSF.
Otro ejemplo de un inmunoensayo para medir los niveles de M-CSF secretados puede ser un ensayo de captura de antfgeno, un ELISA, un ensayo de inmunohistoqmmica, una transferencia de Western y similares usando los anticuerpos de la invencion. Si se mide el M-CSF secretado, se pueden ensayar los medios de cultivo celular o fluidos corporales tales como suero sangmneo, orina o lfquido sinovial respecto de M-CSF secretado y/o pueden lisarse las celulas para liberar el M-CSF que han producido pero aun no se ha liberado. Un inmunoensayo para determinar los niveles de M-CSF incluye las etapas de marcar las protemas secretadas con un marcador detectable, tal como biotina o 125I, inmunoprecipitar el M-CSF con un anticuerpo anti-M-CSF y detectar entonces el M-CSF marcado. Otro inmunoensayo para determinar los niveles secretados de M-CSF puede incluir las etapas de (a) unir previamente los anticuerpos anti-M-CSF a la superficie de una placa de microtitulacion; (b) anadir medios de cultivo celular de tejidos o fluidos corporales que contienen los M-CSF secretados en los pocillos de una placa de microtitulacion para unir los anticuerpos anti-M-CSF; (c) anadir un anticuerpo que detectara el anticuerpo anti-M-CSF, por ejemplo, un anti-M-CSF marcado con digoxigenina que se une a un epftopo de M-CSF diferente del anticuerpo anti-M-CSF de la etapa (a); (d) anadir un anticuerpo a la digoxigenina conjugada con peroxidasa; y (e) anadir un sustrato de peroxidasa que generara un producto de reaccion coloreado que puede cuantificarse para determinar el nivel de M-CSF en medio de cultivo celular de tejidos o en una muestra de fluido corporal. Los metodos tales como ELISA, RIA, transferencia de Western, inmunohistoqmmica, y ensayo de captura de antfgeno se conocen bien en la materia. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente. Ademas, pueden ampliarse los inmunoensayos para una exploracion de alto rendimiento con el fin de ensayar un gran numero de compuestos para inhibir o activar el M-CSF.
Los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion se pueden usar para determinar los niveles de M-CSF de la superficie celular en un tejido o en celulas que provienen del tejido. En algunas realizaciones, el tejido es de un tejido enfermo. En algunas realizaciones, el tejido puede ser un tumor o una biopsia del mismo. En algunas realizaciones del metodo, se puede extirpar un tejido o una biopsia del mismo de un paciente. El tejido o la biopsia se puede usar despues en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles totales de M-CSF, los niveles del M-CSF en la superficie celular o la localizacion del M-CSF mediante los metodos descritos anteriormente.
El metodo puede comprender las etapas de administrar un anticuerpo anti-M-CSF marcado que se pueda detectar o una composicion que los comprenda a un paciente que necesite dicho ensayo de diagnostico y someter al paciente a un analisis de imagenes para determinar la localizacion de los tejidos que expresan el M-CSF. Los analisis por imagen se conocen bien en el campo de la medicina, e incluyen, sin limitacion, analisis de rayos X, obtencion de imagenes por resonancia magnetica (IRM) y tomograffa computarizada (TC). El anticuerpo se puede marcar con cualquier agente adecuado para obtener imagenes in vivo, por ejemplo, un agente de contraste tal como bario, que puede usarse para analisis de rayos X, o un agente de contraste magnetico tal como quelato de gadolinio, que puede usarse para IRM o TC. Otros agentes de marcado incluyen, sin limitacion, radioisotopos tales como 99Tc. En otra realizacion, el anticuerpo anti-M-CSF no se marcara y se obtendran imagenes del mismo mediante la administracion de un segundo anticuerpo u otra molecula que sea detectable y que pueda unirse al anticuerpo anti-M-CSF. En una realizacion, se obtiene una biopsia de un paciente para determinar si el tejido de interes expresa el M-CSF.
Los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion tambien se pueden usar para determinar los niveles secretados de M-CSF en un fluido corporal tal como suero sangumeo, orina o lfquido sinovial que proviene de un tejido. En algunas realizaciones, el fluido corporal es de un tejido enfermo. En algunas realizaciones, el fluido corporal es de un tumor o una biopsia del mismo. En algunas realizaciones del metodo, se extrae fluido corporal de un paciente. Despues se usa el fluido corporal en un inmunoensayo para determinar los niveles de M-CSF secretados mediante los metodos descritos anteriormente. Una realizacion de la invencion es un metodo de ensayo para la actividad de un antagonista de M-CSF que comprende: administrar un antagonista de M-CSF a un primate o un sujeto humano y medir el numero de monocitos CD 14+CD 16+ en una muestra biologica.
Metodos terapeuticos de uso
En otra realizacion, la invencion proporciona a un metodo para inhibir la actividad del M-CSF mediante la administracion de un anticuerpo anti-M-CSF a un paciente que lo necesite. Puede usarse de forma terapeutica cualquier tipo de anticuerpos descritos en la presente memoria. En una realizacion preferida, el anticuerpo anti-M-CSF es un anticuerpo humano, quimerico o humanizado. En otra realizacion preferida, el M-CSF es humano, y el paciente es un paciente humano. Como alternativa, el paciente puede ser un marnffero que expresa un M-CSF con el que el anticuerpo anti-M-CSF reacciona de manera cruzada. El anticuerpo se puede administrar a un marnffero no humano que expresa un M-CSF con el que el anticuerpo reacciona de manera cruzada (es decir, un primate) con fines veterinarios o como un animal modelo de una enfermedad humana. Dichos modelos animales pueden ser utiles para evaluar la eficacia terapeutica de los anticuerpos de esta invencion.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "un trastorno en el que la actividad del M-CSF es perjudicial" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que la presencia de altos niveles de M-CSF en un sujeto que padezca el trastorno ha mostrado o se sospecha que es la responsable de la fisiopatologfa del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Dichos trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento de los niveles del M-CSF secretado y/o en la superficie celular o un aumento de la autofosforilacion de tirosina de c-fms en las celulas o tejidos afectados de un paciente que padece el trastorno. Se puede detectar el aumento de los niveles de M-CSF, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-M-CSF tal como se ha descrito anteriormente.
En una realizacion, se puede administrar un anticuerpo anti-M-CSF a un paciente que tiene un tumor que expresa cfms o un tumor que secreta M-CSF y/o que expresa M-CSF en su superficie celular. Preferentemente, el tumor expresa un nivel de c-fms o M-CSF que es mas alto que en un tejido normal. El tumor puede ser un tumor solido o puede ser un tumor que no es solido, tal como un linfoma. En una realizacion mas preferida, se puede administrar un anticuerpo anti-M-CSF a un paciente que tiene un tumor que expresa c-fms, un tumor que expresa M-CSF o un tumor que secreta M-CSF que sea canceroso. Ademas, el tumor puede ser canceroso. En una realizacion aun mas preferida, el tumor es un cancer de pulmon, de mama, de prostata o de colon. En otra realizacion preferida, el anticuerpo anti-M-CSF administrado al paciente da como resultado que el M-CSF ya no se una al receptor c-fms. En una realizacion altamente preferida, el metodo provoca que el tumor no aumente en peso o volumen o que disminuya en peso o volumen. En otra realizacion, el metodo provoca que no se le una al c-fms el M-CSF en celulas tumorales. En otra realizacion, el metodo provoca que el M-CSF no se una al c-fms en celulas tumorales. En otra realizacion, el metodo provoca que el M-CSF secretado no se una al c-fms en celulas tumorales. En una realizacion preferida, el anticuerpo se selecciona de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 o 9.14.4G1, o comprende una cadena pesada, una cadena ligera, o una region de union a antigeno de las mismas.
En otra realizacion preferida, se puede administrar un anticuerpo anti-M-CSF a un paciente que expresa niveles inadecuadamente altos de M-CSF. Se sabe en la tecnica que los altos niveles de expresion de M-CSF pueden dar lugar a una variedad de canceres comunes. En una realizacion, dicho metodo se refiere al tratamiento de un cancer tal como cancer cerebral, de celulas escamosas, de vejiga, gastrico, de pancreas, de mama, de cabeza, de cuello, de esofago, de prostata, colorrectal, de pulmon, renal, de ovario, ginecologico o de tiroides. Los pacientes que se pueden tratar con un compuesto de la invencion segun los metodos de esta invencion incluyen, por ejemplo, pacientes a los que se les ha diagnosticado cancer de pulmon, cancer oseo, cancer de pancreas, cancer de piel, cancer de la cabeza y cuello, melanoma cutaneo o intraocular, cancer de utero, cancer de ovario, cancer rectal, cancer de la region anal, cancer de estomago, cancer de colon, cancer de mama, tumores ginecologicos (por ejemplo, sarcoma uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello de utero, carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva), enfermedad de Hodgkin, cancer de esofago, cancer del intestino delgado, cancer del sistema endocrino (por ejemplo, cancer de las glandulas tiroides, paratiroides o adrenal), sarcomas de tejidos blandos, cancer de uretra, cancer de pene, cancer de prostata, leucemia aguda o cronica, tumores solidos (por ejemplo, sarcomas, carcinomas o linfomas que son canceres de tejidos corporales que no son la sangre, la medula osea o el sistema linfatico), tumores solidos de la infancia, linfomas linfocfticos, cancer de vejiga, cancer de rinon o de la uretra (por ejemplo, carcinoma de celulas renales, carcinoma de la pelvis renal), o neoplasias del sistema nervioso central (por ejemplo, linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, gliomas del tronco encefalico o adenomas pituitarios). En una realizacion mas preferida, el anticuerpo anti-M-CSF se administra a un paciente con cancer de mama, cancer de prostata, cancer de pulmon o cancer de colon. En una realizacion aun mas preferida, el metodo hace que el cancer deje de proliferar de forma anormal o no aumente en peso o volumen o disminuya en peso o volumen.
El anticuerpo se puede administrar una vez, pero es mas preferible que se administre multiples veces. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse de tres veces al dfa a una vez cada seis meses o mas. La administracion puede ser con una pauta tal como tres veces al dfa, dos veces al dfa, una vez al dfa, una vez cada dos dfas, una vez cada tres dfas, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo tambien se puede administrar de forma continua mediante una minibomba. El anticuerpo se puede administrar por via oral, mucosa, bucal, intranasal, por inhalacion, intravenosa, subcutanea, intramuscular, parenteral, intratumoral o topica. El anticuerpo puede administrarse en el sitio del tumor o parte del cuerpo inflamada, dentro del tumor o parte del cuerpo inflamada o en un sitio alejado del sitio del tumor o parte del cuerpo inflamada. El anticuerpo se puede administrar una vez, al menos dos veces, o durante al menos el penodo de tiempo hasta que la afeccion se trate, se palie o se cure. El anticuerpo generalmente se administrara mientras el tumor este presente a condicion de que el anticuerpo provoque que el tumor o el cancer deje de crecer o disminuya en peso o volumen o hasta que se sane la parte del cuerpo inflamada. El anticuerpo sera administrado generalmente como parte de una composicion farmaceutica tal como se ha descrito anteriormente. La dosis del anticuerpo estara generalmente en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, mas preferentemente de 0,5-50 mg/kg, mas preferentemente de 1-20 mg/kg, y aun mas preferentemente de 1-10 mg/kg. La concentracion serica del anticuerpo puede medirse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-M-CSF puede coadministrarse con otros agentes terapeuticos, tales como agentes antiinflamatorios, agentes anticoagulantes, agentes que disminuiran o reduciran la presion sangumea, farmacos o moleculas antineoplasicas, a un paciente que tiene un trastorno hiperproliferativo, tal como un cancer o un tumor. En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mairnfero que comprende la administracion a dicho mairnfero de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la invencion en combinacion con un agente antitumoral seleccionado del grupo que consiste en, pero sin limitacion, inhibidores mitoticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biologica, antihormonas, inhibidores de cinasas, inhibidores de metaloproteasa de matriz, terapias geneticas y antiandrogenos. En una realizacion mas preferida, se puede administrar el anticuerpo con un agente antineoplasico, tal como adriamicina o taxol. En otra realizacion preferida, el anticuerpo o la terapia de combinacion se administra junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinamica, cirugfa u otra inmunoterapia. En otra realizacion preferida mas, el anticuerpo se administrara con otro anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-M-CSF se puede administrar con un anticuerpo u otro agente que se sabe que inhibe la proliferacion de celulas tumorales o cancerosas, por ejemplo, un anticuerpo o un agente que inhibe el receptor erbB2, EGF-R, CD20 o VEGF.
La coadministracion del anticuerpo con un agente terapeutico adicional (terapia combinada) abarca la administracion de una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo anti-M-CSF y el agente terapeutico adicional y la administracion de dos o mas composiciones farmaceuticas separadas, una que comprende al anticuerpo anti-M-CSF y la(s) otra(s) que comprenden el agente (o agentes) terapeutico(s) adicional(es). Ademas, aunque la coadministracion o la terapia combinada se refiere generalmente a que el anticuerpo y los agentes terapeuticos adicionales se administran a la vez, tambien abarca casos en los que el anticuerpo y los agentes terapeuticos adicionales se administran en tiempos diferentes. Por ejemplo, se puede administrar el anticuerpo una vez cada tres dfas, mientras que el agente terapeutico adicional se administra una vez al dfa. Como alternativa, se puede administrar el anticuerpo antes o despues del tratamiento del trastorno con el agente terapeutico adicional. De manera similar, la administracion del anticuerpo anti-M-CSF puede hacerse antes o despues de otra terapia, tal como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinamica, c io ^a u otra inmunoterapia.
El anticuerpo y uno o mas agentes terapeuticos adicionales (la terapia de combinacion) se pueden administrar una vez, dos veces o al menos durante el penodo de tiempo hasta que la afeccion se trate, se palie o se cure. Preferentemente, la terapia de combinacion se administra multiples veces. Por ejemplo, la terapia se puede administrar desde tres veces al dfa hasta una vez cada seis meses. La administracion puede ser en una pauta tal como tres veces al dfa, dos veces al dfa, una vez al dfa, una vez cada dos dfas, una vez cada tres dfas, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses o puede administrarse de forma continua mediante una minibomba. La terapia combinada se puede administrar por via oral, mucosa, bucal, intranasal, por inhalacion, intravenosa, subcutanea, intramuscular, parenteral, intratumoral o topica. La terapia combinada se puede administrar en un lugar alejado del sito del tumor. La terapia combinada generalmente se administrara mientras el tumor este presente a condicion de que el anticuerpo provoque que el tumor o el cancer deje de crecer o disminuya en peso o volumen.
En otra realizacion adicional mas, el anticuerpo anti-M-CSF se marca con un radiomarcador, una inmunotoxina o una toxina o es una protema de fusion que comprende un peptido toxico. El anticuerpo anti-M-CSF o la protema de fusion de anticuerpo anti-M-CSF dirigen el radiomarcador, inmunotoxina, toxina o peptido toxico a la celula que expresa M-CSF. En una realizacion preferida, el radiomarcador, la inmunotoxina, la toxina o el peptido toxico se internaliza despues de que el anticuerpo anti-M-CSF se una al M-CSF en la superficie de la celula diana.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-M-CSF se puede usar para tratar estados no cancerosos en los que los niveles altos de M-CSF y/o M-CSF se han asociado con estados o trastornos no cancerosos. En una realizacion, el metodo comprende la etapa de administrar un anticuerpo anti-M-CSF a un paciente que tiene un estado patologico no canceroso provocado o exacerbado por los niveles altos de M-CSF y/o niveles de actividad de M-CSF. En una realizacion mas preferida, el anticuerpo anti-M-CSF frena el progreso del estado patologico no canceroso. En una realizacion mas preferida, el anticuerpo anti-M-CSF detiene o invierte, al menos en parte, el estado patologico no canceroso.
Terapia genica
Las moleculas de acido nucleico de la presente invencion se pueden administrar a un paciente que lo necesite mediante terapia genica. La terapia puede ser tanto in vivo como ex vivo. En una realizacion preferida, se administran a un paciente las moleculas de acido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera. En una realizacion mas preferida, las moleculas de acido nucleico se administran de tal forma que se integran de manera estable en los cromosomas de los linfocitos B porque estas celulas estan especializadas en la produccion de anticuerpos. En una realizacion preferida, los precursores de celulas B se transfectan o infectan ex vivo y se retrasplantan en un paciente que lo necesite. En otra realizacion, los precursores de linfocitos B u otras celulas se infectan in vivo usando un virus conocido para infectar el tipo celular de interes. Los vectores tfpicos que se usan en terapia genica incluyen liposomas, plasmidos y vectores vmcos. Los vectores vmcos ejemplares son retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Tras la infeccion tanto in vivo como ex vivo, los niveles de expresion de anticuerpo se pueden controlar cogiendo una muestra del paciente tratado y usando cualquier inmunoensayo conocido en la materia o descrito en la presente memoria.
En una realizacion preferida, el metodo de terapia genica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porcion de union a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-M-CSF y expresar la molecula de acido nucleico. En otra realizacion preferida, el metodo de terapia genica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o una porcion de union a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-M-CSF y expresar la molecula de acido nucleico. En un metodo mas preferido, el metodo de terapia genica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porcion de union a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o la porcion de union a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-M-CSF de la invencion y expresar las moleculas de acido nucleico. El metodo de terapia genica tambien puede comprender la etapa de administrar otro agente anticancengeno, tal como taxol o adriamicina.
Para que esta invencion se entienda mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invencion de modo alguno.
Ejemplo I
Generacion de lmeas celulares productoras de anticuerpos anti-M-CSF
Los anticuerpos de la invencion se prepararon, seleccionaron y ensayaron del modo siguiente:
Inmunizacion y generacion del hibridoma
Se inmunizo a ratones XENOMOUSE™ de ocho a diez semanas de edad por via intraperitoneal o en sus patas traseras con el M-CSF humano (10 |jg/dosis/raton). Esta dosis se repitio de cinco a siete veces durante un penodo de tres a ocho semanas. Cuatro dfas antes de la fusion, a los ratones se les puso una ultima inyeccion de M-CSF humano en PBS. Los linfocitos del bazo y del nodulo linfatico de los ratones inmunizados se fusionaron con la lmea celular de mieloma no secretora P3-X63-Ag8.653, y las celulas fusionadas se sometieron a seleccion HAT tal como se ha descrito previamente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Se recupero un panel de hibridomas que secretaban todos los anticuerpos IgG2 e IgG4 humanos espedficos de M-CSF. Tambien se generaron anticuerpos usando la tecnologfa XENOMAX™ tal como se describe en Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996. Se seleccionaron para estudios adicionales nueve lmeas celulares modificadas para producir los anticuerpos de la invencion y se denominaron 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4, 8.10.3 y 9.7.2. Los hibridomas se depositaron conforme a los terminos segun el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 el 8 de agosto de 2003. A los hibridomas se les asigno los siguientes numeros de referencia:
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Ejemplo II
Analisis de utilizacion de genes
El ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1,120.1, 9.14.4, 8.10.3 y 9.7.2 se clono a partir de las respectivas lmeas celulares de hibridoma y se determinaron las secuencias de ADN mediante metodos conocidos por el experto en la materia. De forma adicional, se muto el ADN de las lmeas celulares de hibridoma 9.14.4, 8.10.3 y 9.7.2 en regiones marco conservadas espedficas en el dominio variable y/o se les cambio el isotipo para obtener, por ejemplo 9.14.4I, 8.10.3F y 9.7.2IF, respectivamente. Se determino la identidad del uso de genes para cada cadena de anticuerpos ("VBASE") a partir de la secuencia de acidos nucleicos y la secuencia de aminoacidos predicha de los anticuerpos. La tabla 2 expone la utilizacion de genes de los anticuerpos seleccionados segun la invencion:
Tabla 2
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La mutagenesis de restos espedficos de las cadenas pesada y ligera se llevo a cabo mediante el diseno de cebadores y el uso del kit para mutagenesis de sitio dirigido QuickChange de Stratagene, segun las instrucciones del fabricante. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciacion automatica y los insertos mutagenizados se subclonaron en vectores de expresion. Los vectores de expresion se transfectaron en celulas HEK293 para producir suficientes anticuerpos para su caracterizacion.
Ejemplo III
Ensayo de proliferacion de celulas monodticas de raton M-CSF
Se llevaron a cabo ensayos in vitro para medir la proliferacion celular de monocitos de raton dependientes de M-CSF en presencia de anticuerpos anti-M-CSF para determinar el grado de inhibicion mediante anticuerpos anti-M-CSF. Se obtuvieron celulas monodticas de raton, celulas M-NFS-60, de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) y se mantuvieron en medio RPMI-1640 que contema L-glutamina 2 mM (ATCC), suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2-mercaptoetanol 0,05 mM (Sigma, St. Louis MO) (medio de ensayo), con 15 ng/ml de M-CSF humano. Las celulas M-NSF-60 se separaron en 5 x 104 para su uso al dfa siguiente o en 2,5 x 104 para su uso en 2 dfas. Antes de usarlas en el ensayo, las celulas se lavaron tres veces con RPMI-1640, se contaron y se ajusto el volumen con medio de ensayo para producir 2 x 105 celulas/ml. Todas las condiciones se llevaron a cabo por triplicado en placas de 96 pocillos tratadas para cultivo tisular (Corning, Corning, NY). A cada pocillo se anadieron 50 pl de las celulas lavadas, o bien 100 pM o 1000 pM de M-CSF en un volumen de 25 pl y un anticuerpo de ensayo o control a varias concentraciones en un volumen de 25 pl en tampon acetato (cloruro de sodio 140 mM, acetato de sodio 20 mM y 0,2 mg/ml de polisorbato 80, pH 5,5) hasta un volumen final de 100 pl. Los anticuerpos de la invencion se ensayaron solos y con M-CSF humano. Las placas se incubaron durante 24 horas (h) a 37 °C con de CO2 al 5%.
Tras 24 h, se anadieron 10 jl/pocillo de 0,5 jC i 3H-timidina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se pulso con las celulas durante 3 h. Para detectar la cantidad de timidina incorporada, las celulas se recolectaron en placas de filtro unifilter GF/C prehumedecidas (Packard, Meriden, CT) y se lavaron 10 veces con agua. Se dejaron secar las placas durante la noche. Se anadieron sellos inferiores a las placas de filtro. A continuacion se anadieron 45 pl de Microscint 20 (Packard, Meriden, CT) por pocillo. Despues de anadir un sello superior, se contaron las placas en un contador Trilux microbeta (Wallac, Norton, OH).
Estos experimented demuestran que los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion inhiben la proliferacion celular de monocitos de raton en respuesta al M-CSF. Ademas, usando varias concentraciones de anticuerpos, se determino la CI 50 para la inhibicion de la proliferacion celular de monocitos de raton para los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, y 9.7.2 (ensayo de proliferacion celular, tabla 3aytabla 3b).
Tabla 3a
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Tabla 3b
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Ejemplo IV
Ensayo de activacion de monocitos de sangre entera humana
Se llevaron a cabo ensayos in vitro para medir los cambios de forma en los monocitos dependientes del M-CSF en presencia de anticuerpos anti-M-CSF para determinar si los anticuerpos anti-M-CSF eran capaces de inhibir la activacion de monocitos en la sangre entera y su grado de inhibicion de los cambios de forma de los monocitos. En pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, 6 pl de anti-M-CSF 1,7 nM y 94 pl de sangre humana completa para una concentracion final de 102 pM incubador anti cultivo. A continuacion, las placas se sacaron del incubador. A cada pocillo, se le anadieron 100 j l de una solucion fijadora (formalina al 0,5 % en solucion salina tamponada con fosfato sin MgCh o CaCh) y se incubaron las placas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para cada muestra, se mezclaron 180 j l de cada pocillo y 1 ml de tampon de lisis de globulos rojos. Los tubos se agitaron vorticialmente durante 2 segundos. A continuacion, las muestras se incubaron a 37°C durante 5 minutos en un bano de agua con agitacion para lisar los globulos rojos, pero dejar los monocitos intactos. Inmediatamente despues de esta incubacion, se leyeron las muestras en un escaner de celulas activadas por fluorescencia (FACS) (BD Beckman FACS) y los datos se analizaron usando el FACS Station Software Version 3.4. Estos experimentos demuestran que los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion inhiben los cambios de forma de los monocitos en comparacion con las muestras de control. Usando el ensayo de cambio de forma en los monocitos, se determino la CI50 para los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.41, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, y 9.7.2 (activacion de monocitos de sangre entera humana, tabla 3a y tabla 3b).
Ejemplo V
Ensayo de inhibicion de union al receptor c-fms
Se llevaron a cabo ensayos in vitro para medir la union del M-CSF al receptor c-fms en presencia de anticuerpos anti-M-CSF para determinar si los anticuerpos anti-M-CSF eran capaces de inhibir la union del M-CSF al receptor cfms y su grado de inhibicion.
Se lavaron las celulas NIH-3T3 transfectadas con el c-fms humano o las celulas M-NSF-60 mantenidas en solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin magnesio o calcio. Las celulas NIH-3T3 se retiraron de las placas de cultivo tisular con tetraacetato de etilendiamina (EDTA) 5 mM, a pH 7,4. Las celulas NIH-3T3 fueron devueltas a la incubadora de cultivo de tejidos durante 1-2 minutos y se golpearon suavemente los matraces para desprender las celulas. Las celulas NIH-3T3 y las celulas M-NSF-60 se transfirieron a tubos de 50 ml y se lavaron dos veces con tampon de reaccion (lx RPMI sin bicarbonato sodico que contiene acido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfonico (HEPES) 50 mM a pH 7,4). A continuacion, las celulas NIH-3T3 se resuspendieron en tampon de reaccion hasta una concentracion final de 1,5 x 105 celulas/ml. Las celulas M-NSF-60 se resuspendieron en tampon de reaccion hasta una concentracion final de 2,5 x 106 celulas/ml.
Para el ensayo, se anadieron 9 pl de una solucion esteril de sacarosa 0,4 M, 100 pl de 125I-M-CSF (Amersham, IMQ7228v) a una concentracion final de 200 pM en RPMI-1640 que contema HEPES 50 mM (pH 7,4), 0,2 % de albumina de suero bovino y 100 pl de M-CSF sin marcar a una concentracion final de 200 nM en un tubo de union. A continuacion, se anadieron 50 pl/tubo de concentraciones crecientes de un anticuerpo de ensayo. Para determinar la union no espedfica de los anticuerpos, se incluyeron muestras a las cuales tambien se les anadieron M-CSF 200 nM. A los tubos de control no se les anadio el anticuerpo. A continuacion, se anadieron 15.000 celulas NIH-3T3 o 250.000 celulas M-NSF-60 por tubo. Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas y se sometieron a centrifugacion a 10.000 rpm durante 2 min. Se cortaron las puntas de los tubos que contienen los sedimentos celulares y se determino la cantidad de M-CSF unida a las celulas utilizando un contador Gamma Packard Cobra II. La union espedfica se determino restando la union no espedfica de la union total. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Los datos de union se realizaron usando el programa informatico Graph Pad Prism 2.01.
Estos experimentos demuestran que los anticuerpos anti-M-CSF de la invencion inhiben la union del M-CSF al receptor c-fms en comparacion con las muestras de control. Ademas, usando varias concentraciones de anticuerpos, se determino la CI50 para la inhibicion de la union al receptor para los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, y 9.7.2 (Ensayo de inhibicion de la union a receptor, tabla 3a y tabla 3b).
Ejemplo VI
Determinacion de las constantes de afinidad (Kd) de los anticuerpos monoclonales Anti-M-CSF mediante BIACORE™
Se efectuaron medidas de afinidad de los anticuerpos purificados mediante resonancia de plasmon superficial usando el instrumento BIACORE™ 3000, siguiendo los protocolos del fabricante.
Para los anticuerpos 3.8.3, 2.7.3 y 1.120.1, se realizaron los experimentos en un instrumento BIACORE™ 3000 a 25 °C en tampon fosfato salino de Dulbecco que contiene Tween-20 al 0,0005 %. Las concentraciones de protema se obtuvieron a partir de experimentos de velocidad de sedimentacion o mediante la medicion de la longitud de onda de la muestra a 280 nm usando los coeficientes de extincion teoricos derivados de secuencias de aminoacidos. Para los experimentos que miden la union del anticuerpo a antigenos inmovilizados, se inmovilizo el M-CSF en una microplaca B1 mediante procedimientos directos de acoplamiento de amina. Se prepararon muestras de anticuerpos a 0,69 pM para 3.8.3, 2.7.3 y 1.120.1. Estas muestras se diluyeron 3 veces en serie a 8,5 nM o 2,8 nM para aproximadamente un intervalo de 100 veces en concentraciones. Para cada concentracion, las muestras se inyectaron por duplicado a un caudal de 5 pl/min durante 4 min. La disociacion se controlo durante 2000 segundos. Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de union simple 1:1 utilizando el software BIACORE ™ Biaevaluation. En todos los casos, este metodo se uso para obtener la k f y se encontro que este conjunto de datos se compara bien con los datos obtenidos del ajuste global de datos de asociacion y disociacion.
Para los anticuerpos 252, 88 y 100, se realizaron los experimentos en un instrumento BIACORE™ 3000 a 25 °C en tampon HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %). Para los experimentos que miden la union del anticuerpo a antfgenos inmovilizados, se inmovilizo un M-CSF en una microplaca CM5 Research Grade Sensor mediante procedimientos directos de acoplamiento de amina. Se prepararon muestras de anticuerpo a 12,5 nM para los anticuerpos 252 y 100 ya 25,0 nM para el anticuerpo 88. Estas muestras se diluyeron en serie dos veces hasta 0,78 nM para un intervalo de 15-30 veces en concentraciones. Para cada concentracion, las muestras se inyectaron por duplicado en orden aleatorio a un caudal de 30 pl/min durante 3 min. La disociacion se controlo durante 300 segundos. Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de union simple 1:1 utilizando el software BIACORE ™ Biaevaluation. En todos los casos, este metodo se uso para obtener la k f y se encontro que este conjunto de datos se compara bien con los datos obtenidos del ajuste global de datos de asociacion y disociacion.
La tabla 4 muestra los resultados para los anticuerpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3 y 1.120.1.
Tabla 4
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Ejemplo VII
Produccion de anticuerpos 8.10.3 a partir de las celulas de hibridoma 8.10.3
El anticuerpo 8.10.3 se produjo en botellas rotatorias de 3 l con burbujeo. La botella rotatoria de 3 l con burbujeo es un vaso de vidrio en donde se mezclan los cultivos con un impulso controlado por una plataforma magnetica. La botella esta conectada a lmeas de gas para proporcionar el CO2 al 5 % y aire. Las celulas de hibridoma 8.10.3 se descongelaron inicialmente en frascos de cultivo celular T-25. Las celulas se expandieron progresivamente hasta que hubo un numero suficiente de celulas para cultivar las botellas rotatorias con burbujeo.
Se cultivaron dos botellas rotatorias con burbujeo de 3 l con celulas de hibridoma 8.10.3 en medio sin suero de hibridoma con las adiciones indicadas en la tabla 5 para los dos matraces con burbujeo. Las concentraciones de suero de IgG ultra bajo (Gibco n.° de cat. 16250-078), L-glutamina (JRH Biosciences n.° de cat. 59202-500M), aminoacidos no esenciales (Gibco n.° de cat. 11140-050), peptona (Difco n.° de cat. 211693), glucosa (Stock interno preparado por JT Baker n.° de cat. 1920-07) y anti-espuma C (Sigma cat.# A-8011) se dan en sus concentraciones finales en los medios. El balance del volumen en cada reactor es medio sin suero de hibridoma.
Tabla 5. Condiciones para el crecimiento del hibridoma 8.10.3 en dos botellas rotatorias con burbujeo.
Figure imgf000042_0002
Los cultivos se cultivaron durante 15 dfas y se recogieron cuando la viabilidad estaba por debajo del 20 %. La viabilidad se determino mediante exclusion de azul de tripano con un contador de celulas automatico (Cedex, Innovatis). La recogida se realizo por centrifugacion y posterior filtracion. El sobrenadante clarificado se obtuvo despues de centrifugacion durante 15 minutos a 7000 rpm y posterior filtracion con un filtro Opticap Millipore de 4 pulgadas esteril de 0.22 pm 4"(n.° de cat. KVSCO4HB3) en una bolsa esteril de TC-Tech de 10 l (n.° de cat. P/N 12420 Bag Style CC-10 -112420). El filtrado se purifico posteriormente en el siguiente ejemplo.
Ejemplo VIII
Purificacion de un anticuerpo anti-M-CSF
Se preparo una columna de Protema A (Amersham Pharmacia) mediante lavado con 3 volumenes de columna de urea 8M, seguido de un lavado de equilibrado con Tris 20 mM (pH 8). Al filtrado final del Ejemplo VII se le anadio un 2% v/v de Tris 1 M, pH 8,3 y NaN3 al 0,02%, antes de cargarse en la columna de Protema A por medio del modo de goteo por gravedad. Despues de completarse la carga, la resina se lavo con 5 volumenes de columna de Tris 20 mM (pH 8), seguido de 5 volumenes de columna del tampon de elucion (glicina 0,1 M pH 3,0). Se anoto cualquier precipitacion y luego se anadio una pequena cantidad de 10% v/v de Tris 1M pH 8,3 al anticuerpo eluido. La protema eluida se dializo a continuacion en 100 veces la cantidad en volumen de material eluido de tampon de dialisis (NaCI 140 mM/Acetato sodico 20 mM pH 5,5). Despues de la dialisis, el anticuerpo se esterilizo por filtracion con un filtro de 0,22 pm y se almaceno hasta su uso posterior.
Ejemplo IX
Tratamiento de monos y conteos de monocitos
Se administro por v^a intravenosa a un mono cinomolgo macho y uno hembra por cada grupo de dosificacion vehmulo o anticuerpo 8.10.3 (producido como se describe en los Ejemplos VII y VIII) a 0, 0,1, 1 o 5 mg/kg en un volumen de dosificacion de 3,79 ml/kg durante un penodo de aproximadamente 5 minutos. Se recogieron muestras de sangre para analisis de laboratorio clmico a las 24 y 72 horas despues de la dosis y semanalmente durante 3 semanas. Los recuentos de monocitos se determinaron mediante dispersion de luz, usando un sistema Cell Dyn de Abbott Diagnostics Inc. (Abbott Park, Illinois).
Se observo una disminucion relacionada con la dosis (~25 % al 85 %) en los monocitos totales en todas las dosis (Figuras 1A y 1B). Los recuentos de monocitos a 0,1 y 1 mg/kg paredan rebotar hasta cerca de los niveles de control a la semana 2, mientras que los recuentos de monocitos a 5 mg/kg aun estaban disminuidos a las 3 semanas.
Analisis de subconjuntos de monocitos CD14+CD16+
Se extrajo sangre entera de primate en tubos Vacutainer que conteman heparina sodica. Se anadieron 0,2 ml de cada muestra de sangre a un tubo de centrifugacion de polipropileno conico de 15 ml que contema 10 ml de tampon de lisis de globulos rojos (Sigma) y se incubaron en un bano de agua a 37°C durante 15 minutos. Los tubos se centrifugaron a continuacion en una centrifugadora Sorvall RT7 durante 5 minutos a 1.200 rpm. El sobrenadante se aspiro, se resuspendio el sedimento en 10 ml de tampon FACS a 4°C (solucion salina equilibrada de Hanks/FBS al 2%/azida de sodio al 0,02 %) y el tubo se centrifugo de nuevo durante 5 minutos a 1.200 rpm. Se aspiro el sobrenadante y se resuspendio el sedimento en una mezcla de anticuerpos que consiste en 80 pl de tampon FACS a 4 °C, 10 pl de anticuerpo monoclonal anti CD14 humano conjugado con FITC (BD Biosciences, San Diego, CA), 0,5 pl de anticuerpo monoclonal anti - CD16 humano conjugado con Cy5-PE (BD Biosciences, San Diego, CA) y 10 pl de anticuerpo monoclonal anti CD89 humano conjugado con PE (BD Biosciences, San Diego, CA). La suspension celular se incubo en hielo durante 20 minutos, despues de lo cual se anadieron 10 ml de tampon FACS a 4 °C y las celulas se centrifugaron como antes. El sobrenadante se aspiro, y el sedimento celular se resuspendio en 400 pl de tampon y las celulas se analizaron en un citometro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Se recogieron datos para 30.000 celulas de cada muestra.
La poblacion de monocitos se identifico mediante una combinacion de dispersion de luz de angulo directo y dispersion de luz ortogonal. Las celulas en la ventana logica de monocitos se analizaron adicionalmente respecto de la expresion de CD14 y CD16. Se observaron dos poblaciones distintas de monocitos, una que expresaba altos niveles de CD14 con poca o ninguna expresion de CD16 (CD14++CD16-) y la otra que expresaba bajos niveles de CD14, pero altos niveles de CD16 (CD14+CD16+), similares a los dos subconjuntos de monocitos previamente descritos en la sangre periferica humana (Ziegler-Heitbrock H.W., Immunology Today 17:424-428 (1996)). Para cada primate ensayado, se determino el porcentaje de monocitos dentro del subconjunto CD14+CD16+ tras cada extraccion de sangre, en los dfas 1, 3, 7, 14 y 21 despues de la inyeccion de 8.10.3.
En general, el tratamiento con 8.10.3 dio como resultado una reduccion del porcentaje de monocitos CD14+CD16+ (vease las figuras 2A y 2B). Los monos que no recibieron el anticuerpo 8.10.3 demostraron niveles de monocitos CD14+CD16+ relativamente estables. Los monocitos se han denominado como "proinflamatorios" porque producen altos niveles de TNF-a y otras citocinas inflamatorias (Frankenberger, M.T., et al., Blood 87:373-377 (1996)). Tambien se ha informado de que la diferenciacion de monocitos desde el fenotipo convencional CD14++CD16-hasta el fenotipo proinflamatorio depende del M-CSF (Saleh M.N., et al., Blood 85: 2910-2917 (1995)).
Ejemplo X
Tratamiento de monos y conteos de monocitos
A tres monos cinomolgos machos por grupo de dosificacion se les administro un vehmulo (acetato de sodio 20mM, pH 5,5, NaCl 140 mM), el anticuerpo 8.10.3F purificado o el anticuerpo 9.14.4I purificado a 0, 1, o 5 mg/kg en un volumen de dosis de 3,79 ml/kg durante un penodo de aproximadamente 5 minutos. Los monos teman de 4 a 9 anos de edad y pesaban de 6 a 10 kg. Se recogieron muestras de sangre para analisis de laboratorio clmico en los dfas 2, 4, 8, 15, 23 y 29. Los recuentos de monocitos se determinaron mediante dispersion de luz, usando un sistema Cell Dyn de Abbott Diagnostics Inc. (Abbott Park, Illinois).
Se observo una disminucion en el cambio porcentual en los monocitos totales en todas las dosis del anticuerpo 8.10.3F y del anticuerpo 9.14.4I en comparacion con los niveles de monocitos previos al ensayo (figuras 3A y 3B) (vease, por ejemplo, el dfa 4, 8, 15, y 23 en las figuras 3A y 3B).
Secuencias
Clave:
Peptido senal: subrayado minuscula
CDRs 1,2,3: SUBRAYADO MAYUSCULA
Variable domain: MAYUSCULA
Constant domain: minuscula
Mutaciones de la lmea germinal en negrita
SEQ ID NO: 1
Secuencia nucleotida 252 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000044_0001
SEQ ID NO: 2
Secuencia proteica 252 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000044_0002
SEQ ID NO: 3
Secuencia nucleotida 252 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000045_0001
SEQ ID NO: 4
Secuencia proteica 252 de cadena ligera De cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000045_0002
SEQ ID NO: 5
Secuencia nucleotida 88 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000045_0003
SEQ ID NO: 6
Secuencia proteica 88 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000045_0004
SEQ ID NO: 7
Secuencia nucleotida 88 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000046_0001
SEQ ID NO: 8
Secuencia proteica 88 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000046_0002
SEQ ID NO: 9
Secuencia nucleotida 100 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000046_0003
SEQ ID NO: 10
Secuencia proteica 100 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000046_0004
SEQ ID NO: 11
Secuencia nucleotida 100 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000047_0001
SEQ ID NO: 12
Secuencia proteica 100 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000047_0002
SEQ ID NO: 14
Secuencia proteica 3.8.3 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000047_0003
SEQ ID NO: 16
Secuencia proteica 3.8.3 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000047_0004
SEQ ID NO: 18
Secuencia proteica 2.7.3 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000047_0005
SEQ ID NO: 20
Secuencia proteica 2.7.3 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000048_0001
SEQ ID NO: 22
Secuencia proteica 1.120.1 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000048_0002
SEQ ID NO: 24
Secuencia proteica 1.120.1 de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000048_0003
SEQ ID NO: 25
Secuencia nucleotida 9.14.41 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000048_0004
SEQ ID NO: 26
Secuencia proteica 9.14.41 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000049_0001
SEQ ID NO: 27
Secuencia nucleotida 9.14.4, 9.14.4I, 9.14.4-Ser y 9.14.4-G1 de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000049_0002
SEQ ID NO: 28
Secuencia proteica 9.14.4, 9.14.4I, 9.14.4-Ser y 9.14.4-G1 de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000049_0003
SEQ ID NO: 37
Secuencia nucleotida 9.14.4 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000049_0004
SEQ ID NO: 38
Secuencia proteica 9.14.4 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000050_0001
SEQ ID NO: 54
Secuencia proteica 9.14.4C-Ser de cadena pesada [cadena Cadena Gamma]
Figure imgf000050_0002
SEQ ID NO: 56
Secuencia proteica 9.14.4C-Ser, 9.14.4-CG2 y 9.14.4-CG4 de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000050_0003
SEQ ID NO: 74
Secuencia proteica 9.14.4-CG2 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000050_0004
SEQ ID NO: 78
Secuencia proteica 9.14.4-CG4 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000050_0005
SEQ ID NO: 82
Secuencia proteica 9.14.4-Ser de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000051_0001
SEQ ID NO. 101
Secuencia nucleotida 9.14.4G1 de cadena pesada (cadena Gamma)
Figure imgf000051_0002
SEQ ID NO 102
Secuencia proteica 9.14.4G1 de cadena pesada (cadena Gamma)
Figure imgf000051_0003
SEQ ID NO: 29
Secuencia nucleotida 8.10.3 y 8.10.3F de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000052_0001
SEQ ID NO: 30
Secuencia proteica 8.10.3 y 8.10.3F de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000052_0002
SEQ ID NO: 31
Secuencia nucleotida 8.10.3FG1 y 8.10.3F de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000052_0003
SEQ ID NO: 32
Secuencia proteica 8.10.3FG1 y 8.10.3F de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000052_0004
SEQ ID NO: 43
Secuencia nucleotida 8.10.3 y 8.10.3-Ser de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000053_0001
SEQ ID NO: 44
Secuencia proteica 8.10.3 y 8.10.3-Ser de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000053_0002
SEQ ID NO: 58
Secuencia proteica 8.10.3C-Ser de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000053_0003
SEQ ID NO: 60
Secuencia proteica 8.10.3-CG2, 8.10.3-CG4 y 8.10.3C-Ser de cadena ligera [cadena Kappa]
Figure imgf000053_0004
SEQ ID NO: 62
Secuencia proteica 8.10.3-CG2 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000053_0005
SEQ ID NO: 90
Secuencia proteica 8.10.3-Ser de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000054_0001
SEQ ID NO: 94
Secuencia proteica 8.10.3-CG4 de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000054_0002
SEQ ID NO: 97
Secuencia nucleotida 8.10.3FG1 de cadena pesada
Figure imgf000054_0003
SEQ ID NO: 98
Secuencia proteica 8.10.3FG1 de cadena pesada (cadena Gamma)
Figure imgf000054_0004
SEQ ID NO: 33
Secuencia nucleotida 9.7.2IF de cadena pesada [cadena Gamma]
Figure imgf000055_0001
SEQ ID NO: 34
Secuencia proteica 9.7.2IF De cadena pesada [Cadena Gamma] protein sequence
Figure imgf000055_0002
SEQ ID NO: 35
Secuencia nucleotida 9.7.2IF de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000055_0003
SEQ ID NO: 36
Secuencia proteica 9.7.2IF de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000055_0004
SEQ ID NO: 45
Secuencia nucleotida 9.7.2 de cadena pesada [Cadena Gamma]
Figure imgf000056_0001
SEQ ID NO: 46
Secuencia proteica 9.7.2 de cadena pesada [Cadena Gamma]
Figure imgf000056_0002
SEQ ID NO: 47
Secuencia nucleotida 9.7.2 y 9.7.2-Ser de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000056_0003
SEQ ID NO: 48
Secuencia proteica 9.7.2 and 9.7.2-Ser de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000057_0001
SEQ ID NO: 50
Secuencia proteica 9.7.2C-Ser de cadena pesada [Cadena Gamma]
Figure imgf000057_0002
SEQ ID NO: 52
Secuencia proteica 9.7.2C-Ser, 9.7.2-CG2 y 9.7.2-CG4 de cadena ligera [Cadena Kappa]
Figure imgf000057_0003
SEQ ID NO: 66
Secuencia proteica 9.7.2-CG2 de cadena pesada [Cadena Gamma]
Figure imgf000057_0004
SEQ ID NO: 70
Secuencia proteica 9.7.2-CG4 de cadena pesada [Cadena Gamma]
Figure imgf000057_0005
SEQ ID NO: 86
Secuencia proteica 9.7.2-Ser de cadena pesada [Cadena Gamma]
Figure imgf000057_0006

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal humano o una porcion de union a antigeno del mismo que se une de forma espedfica a M-CSF,
en donde el anticuerpo comprende:
(a) una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:26 sin los diecinueve restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-19 de la SeQ ID NO: 26), y
(b) una secuencia de aminoacidos de cadena ligera que es al menos un 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 28 sin los veintidos restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-20 de la SEQ ID NO: 28); y
en donde el anticuerpo tiene al menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) inhibe la proliferacion celular dependiente del M-CSF con una CI50 de 8 x 10'8 M o menor;
(ii) inhibe el cambio de forma de los monocitos humanos dependiente del M-CSF con una CI50 de 9 x 10'8 M o menor; y
(iii) inhibe la union del receptor de M-CSF con una CI50 de 7 x 10'8 M o menor.
2. El anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union al antigeno segun la reivindicacion 1, en donde:
(a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 95 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 26 sin los diecinueve restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-19 de la SEQ ID NO: 26), o
(b) la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 95 % identica a la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 28 sin los veintidos restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-22 de la SEQ ID NO: 28).
3. El anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union al antigeno segun la reivindicacion 1, en donde:
(a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 99% identica a la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 26 sin los diecinueve restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-19 de la SEQ ID NO: 26), o
(b) la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 99% identica a la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 28 sin los veintidos restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-22 de la SEQ ID NO: 28).
4. Un anticuerpo monoclonal humano o una porcion de union a antfgeno del mismo que se une espedficamente al M-CSF, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos de c DR1, CDR2 y CDR3 que se encuentran en el dominio variable de una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26 y la cadena ligera del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 que se encuentran en el dominio variable de una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28.
5. El anticuerpo monoclonal humano o una porcion de union a antfgeno segun la reivindicacion 4, en donde la cadena pesada comprende las secuencias de una cualquiera o mas de FR1, FR2, FR3 y FR4 que se encuentran en el dominio variable de una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26 y la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos de una cualquiera o mas de las FR1, FR2, FR3 y FR4 que se encuentran en el dominio variable de una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28.
6. El anticuerpo monoclonal humano o porcion de union a antfgeno segun la reivindicacion 4, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 que se encuentra en el dominio variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26 y la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 que se encuentra en el dominio variable de una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28.
7. El anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union a antfgeno segun la reivindicacion 4, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos del dominio variable de una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos del dominio variable de una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28.
8. Un anticuerpo monoclonal humano, en donde la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del anticuerpo es la SEQ ID NO: 30 sin los diecinueve restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-19 de la SEQ ID nO:26), y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera del anticuerpo es la SEQ ID NO: 28 sin los veinte restos de aminoacidos de la secuencia senal (restos 1-22 de la SEQ ID NO: 28).
9. El anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union al antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 7, en donde el anticuerpo es una molecula IgG.
10. La porcion de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la porcion se selecciona del grupo que consiste en: un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fv.
11. El anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union a antigeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde no esta presente la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo o porcion.
12. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo monoclonal humano o una porcion de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
13. Uso del anticuerpo monoclonal humano o porcion de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la preparacion de una composicion farmaceutica
14. El uso segun la reivindicacion 13, en donde la composicion farmaceutica es para el tratamiento de una afeccion seleccionada del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter, gota, artritis traumatica, artritis por rubeola y sinovitis aguda y otras afecciones artnticas, septicemia, choque septico, choque endotoxico, septicemia por gram negativas, smdrome de choque toxico, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, neurotrauma, asma, smdrome de dificultad respiratoria del adulto, malaria cerebral, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica, silicosis, sarcoidosis pulmonar, enfermedad de la resorcion osea, osteoporosis, restenosis, lesion de reperfusion cardfaca y renal, trombosis, glomerulonefritis, diabetes, reaccion de injerto contra hospedador, rechazo de aloinjerto, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis multiple, degeneracion muscular, eczema, dermatitis de contacto, psoriasis, quemaduras solares y choque de conjuntivitis en un sujeto que lo necesite.
15. El uso segun la reivindicacion 13, en donde la composicion farmaceutica es para el tratamiendo del cancer en un sujeto que lo necesite.
16. El anticuerpo monoclonal humano o una porcion de union a anrtgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para el uso como medicamento.
17. El anticuerpo monoclonal humano o porcion de union a anrtgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 11 para su uso en el tratamiento de una afeccion seleccionada del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter, gota, artritis traumatica, artritis por rubeola y sinovitis aguda y otras afecciones artnticas, septicemia, choque septico, choque endotoxico, septicemia por gram negativas, smdrome de choque toxico, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, neurotrauma, asma, smdrome de dificultad respiratoria del adulto, malaria cerebral, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica, silicosis, sarcoidosis pulmonar, enfermedad de la resorcion osea, osteoporosis, restenosis, lesion de reperfusion cardfaca y renal, trombosis, glomerulonefritis, diabetes, reaccion de injerto contra hospedador, rechazo de aloinjerto, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis multiple, degeneracion muscular, eczema, dermatitis de contacto, psoriasis, quemaduras solares y choque de conjuntivitis en un sujeto que lo necesite.
18. El anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union a anrtgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de cancer en un sujeto que lo necesite.
19. El uso segun la reivindicacion , 15 el anticuerpo monoclonal humano o la porcion de union a anrtgeno para uso segun la reivindicacion 18 en donde el cancer es un cancer cerebral, cancer de celulas escamosas, cancer de vejiga, cancer gastrico, cancer de pancreas, cancer de mama, cancer de cabeza, cancer de cuello, cancer de tugado, cancer de esofago, cancer de prostata, cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma renal, cancer de rinon, cancer de ovario, cancer de utero, cancer ginecologico, cancer nasofarmgeo, cancer de tiroides, cancer de paratiroides, cancer de glandula suprarrenal, cancer de intestino delgado, cancer de colon, cancer de estomago, cancer de recto, cancer de ano, cancer de piel, cancer de cabeza y cuello, cancer uretral, cancer de pene, melanoma, un tumor solido de la infancia, linfoma, leucemia o mieloma multiple.
20. Una lmea celular aislada que produce los anticuerpos monoclonales humanos o una porcion de union a anrtgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
21. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica tanto la cadena pesada como la cadena ligera, o una porcion de union a anrtgeno de las mismas, de un anticuerpo monoclonal humano, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
22. Una primera molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la cadena pesada, o una porcion de union a anrtgeno de la misma, de un anticuerpo monoclonal humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y una segunda molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la cadena ligera, o una porcion de union a antfgeno de la misma, de un anticuerpo monoclonal humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
23. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 21, en donde el vector opcionalmente comprende una secuencia de control de la expresion unida a dicha molecula de acido nucleico.
24. Una celula hospedadora aislada que comprende el vector segun la reivindicacion 23 o primera y segunda de la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 22.
25. Un metodo para preparar un anticuerpo anti-M-CSF o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende el cultivo de la lmea celular segun la reivindicacion 20 o la celula hospedadora segun la reivindicacion 24 en condiciones adecuadas y la recuperacion el anticuerpo o la porcion.
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