KR20070007246A - Ｍ-ｃｓｆ에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 M-CSF, 바람직하게는 인간 M-CSF에 특이적으로 결합하며 M-CSF를 억제하는 기능을 하는 항체 및 이의 항원-결합 부위에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-M-CSF 항체 및 이의 항원-결합 부위에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라, 이중특이적, 유도체화된, 단일쇄 항체 또는 융합 단백질의 부분인 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-M-CSF 항체로부터 유래된 단리된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 그러한 면역글로불린을 암호하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-M-CSF 항체를 만드는 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물 및 진단 및 치료를 위해 항체와 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 항-M-CSF 항체를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 암호하는 핵산 분자를 이용하는 유전자 치료를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 형질전환 동물 및 형질전환 식물에 관한 것이다.
M-CSF, 항체

Description

Ｍ-ＣＳＦ에 대한 항체{ANTIBODIES TO M-CSF}
본 출원은 2003년 9월 10일에 출원된 미국 가출원 60/502,163호의 우선권을 주장한다.
대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)는 콜로니 자극 인자(CSF)로 불리는 단백질 패밀리의 구성원이다. M-CSF는 40 내지 90 kDa의 전체 분자 질량을 가지며 이황화 결합에 의해 연결되는 두 서브유닛으로 구성되는 분비 또는 세포 표면 당단백질이다(Stanley E. R., et al., Mol. Reprod. Dev. , 46: 4-10 (1997)). 다른 CSF와 유사하게, M-CSF는 인터루킨-1 또는 종양 괴사 인자-알파와 같은 단백질에 대한 반응으로 대식세포, 단핵구, 및 연골세포와 윤활 섬유모세포와 같은 인간 관절 조직 세포에 의해 생산된다. M-CSF는 전능성 조혈 선조 줄기 세포로부터 대식세포 콜로니의 형성을 자극한다(Stanley E. R., et al., Mol. Reprod. Dev., 46: 4-10 (1997)).
M-CSF는 생물학적 효과를 나타내기 위하여 그 수용체인 c- fms에 결합한다. c-fms는 다섯 개의 세포외 Ig 도메인, 하나의 경막 도메인, 및 두 개의 키나제 도메인을 가진 세포내 도메인을 함유한다. M-CSF가 c- fms에 결합하면, 수용체는 동종이량체화하여 JAK/STAT, PI3K, 및 ERK 경로를 비롯한 신호 전달 경로의 캐스캐이드 를 시작한다.
M-CSF는 단핵구/대식세포의 기능, 활성화 및 생존의 중요한 조절자이다. 많은 동물 모델은 류마티스성 관절염(RA) 및 암을 비롯한 다양한 질병에서 M-CSF의 역할을 확인하였다. 대식세포는 RA에서 핵심 효과인자 세포를 구성한다. RA에서 연골 대식세포 침윤의 정도는 하부 관절 파괴의 정도와 밀접하게 관련되는 것으로 나타났다. 단핵구/대식세포, 섬유모세포, 및 내피 세포에 의해 류마티스 관절에서 내인성으로 생산되는 M-CSF는 단핵구/대식세포 계통의 세포에 작용하여 그들의 생존 및 뼈를 파괴하는 파골세포로의 분화를 촉진하며, 세포독성, 수퍼옥사이드 생산, 포식작용, 화학주성 및 이차 사이토카인 생산과 같은 프로-염증성 세포 기능을 증강시킨다. 예를 들어, 쥐 스트렙토코커스 아가락티애 소니케이트-유도된 실험적 관절염 모델에서 M-CSF로 처리하면 병리가 증가된다(Abd, A. H., et al., Lymphokine Cytokine Res. 10: 43-50 (1991)). 유사하게, RA를 위한 모델인 콜라겐-유도된 관절염(CIA)의 쥐 모델에서 M-CSF를 피하 주사하면 RA 질병 증상이 상당히 악화된다(Campbell I.K., et al., J. Leuk. Biol. 68: 144-150 (2000)). 더욱이, RA 및 다른 자가면역 질병에 매우 민감한 MRL/lpr 마우스는 증가된 기본 M-CSF 혈청 농도를 가진다(Yui M. A., et al., Am. J.Pathol. 139: 255-261 (1991)). CIA를 유지하는 데 있어서 내인성 M-CSF의 필요성은 M-CSF 중화 마우스 모노클로날 항체에 의해 질병의 심각성이 크게 감소되는 것에 의해 입증되었다(Campbell I.K., et al.,J. Leuk. Biol. 68: 144-150 (2000)).
암과 관련하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 콜로니 자극 인자의 억 제는 대식세포-매개 ECM 분해를 약화시켜 마우스에서 배아 및 결장 종양 이종이식편에서의 종양 성장을 억제한다(Seyedhossein, A., et al., Cancer Research, 62: 5317-5324 (2002)).
c- fms에의 M-CSF 결합 및 단핵구/대식세포의 후속 활성화는 많은 질병 증상에서 중요하다. RA 및 암에 더하여, M-CSF-관련 질병 증상의 다른 예는 골다공증, 파괴성 관절염, 죽종형성, 사구체신염, 카와사키 질병, 및 HIV-1 감염을 포함하며, 이들에서 단핵구/대식세포 및 관련 세포 타입이 역할을 한다. 예를 들어, 파골세포는 대식세포와 유사하며 부분적으로 M-CSF에 의해 조절된다. 파골세포 성숙의 초기 단계에서 M-CSF에 의해 유도되는 성장 및 분화 신호는 뼈에서 그들의 후속적인 파골세포 활성에 필수적이다.
국소적인 뼈 부식 및 보다 확산된 관절곁 골다공증 둘다의 형태에서, 파골세포 매개 골 손실은 RA에서 주요한 미해결 문제이다. 이러한 뼈 손실의 결과는 관절 변형, 기능 장애, 골절 위험 증가 및 사망률 증가를 포함한다. M-CSF는 파골세포생성에 독특하게 필수적이며 관절염의 동물 모델에서 이 사이토카인의 실험적 차단은 성공적으로 관절 파괴를 막았다. 유사한 파괴성 경로가 건선 관절염과 같은 파괴성 관절염의 다른 형태에서 작용하는 것으로 알려져 있으며 유사한 간섭을 위한 논거를 나타낼 수 있다.
폐경후 골 손실은 에스트로젠 결핍의 결과로서 왕성한 파골세포 매개 골 흡수로부터 뼈 형성의 탈커플링에 수반되는 결함성 뼈 리모델링에서 생겨난다. 차단 항체를 이용한 M-CSF의 생체내 중화는 마우스에서 파골세포 수의 상승, 뼈 흡수의 증가 및 난소절제술에 의해 유도된 뼈 손실을 완전히 예방하는 것으로 나타났다.
몇몇 증거는 죽종형성, 및 동맥 벽에의 기계적 외상 후의 증식성 혈관내막 증식증에서 M-CSF의 중심 역할을 지적한다. 아테롬성경화증 병변에서 모든 주요 세포 타입은 M-CSF를 발현하는 것으로 나타났으며, 이것은 추가로 산화된 지질단백질에의 노출에 의해 상향 조절된다. 중화성 c- fms 항체를 이용하여 M-CSF 시그널링을 차단하면 고지방식에서 유지된 아포지질단백질 E 결핍 마우스의 대동맥 루트에서 대식세포-유래된 거품 세포의 축적을 감소시킨다.
실험 및 인간 사구체신염 둘다에서, 사구체 M-CSF 발현은 국소 대식세포 축적, 활성화 및 증식과 동시-국소화하는 것으로 밝혀졌으며 사구체 손상 및 단백뇨의 정도에 상관된다. 그 수용체 c- fms에 대해 형성된 항체를 통한 M-CSF 시그널링의 차단은 실험적 일측 요관 폐쇄에 의해 유도된 신장 염증 반응동안 마우스에서 국소 대식세포 축적을 상당히 하향 조절한다.
카와사키 질병(KD)은 원인이 알려지지 않은 급성의 열성, 소아 혈관염이다. 이 병의 가장 일반적이고 심각한 합병증은 동맥류 팽창 형태의 관상 혈관구조에 관련된다. 혈청 M-CSF 수준은 급성 단계 카와사키 질병에서 크게 증가되며, 정맥내 면역글로불린을 이용한 치료 후 정상화된다. 거대 세포 관절염(GCA)은 T 세포와 대식세포가 중간 및 큰 동맥의 벽에 침윤하여 실명 및 동맥 폐색에 수반되는 졸중을 포함하는 임상적 결과를 야기하는, 노인에서 주로 발생하는 염증성 혈관병증이다. GCA에서 대식세포의 활발한 관련은 혈관 병변내에서 대식세포 유래된 염증성 매개자의 수준 증가의 존재에 의해 입증된다.
M-CSF는 인간 단핵구 유래 대식세포를 생체외에서 HIV-1 감염에 더욱 민감하도록 하는 것으로 보고되었다. 최근 연구에서, M-CSF는 단핵구-유래 대식세포가 감염되는 빈도를 증가시켰으며, 감염된 세포 당 발현된 HIV mRNA의 양, 및 감염된 배양물 당 발현된 프로바이러스 DNA의 수준을 증가시켰다.
다양한 질병에서 M-CSF의 역할을 고려할 때, M-CSF 활성을 억제하는 방법이 필요하다.
치료성 항-M-CSF 항체가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 인간 M-CSF에 특이적으로 결합하며 M-CSF 길항제로 작용하는 단리된 인간 항체 또는 이의 항원-결합 부위 및 상기 항체 또는 부위를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 항-M-CSF 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 그 가변 영역, 또는 이의 항원-결합 부위, 또는 그러한 치료에서 효과적인 본 발명의 항체, 항체 쇄 또는 그 가변 영역을 암호하는 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 추가로 치료제 또는 진단제와 같은 다른 성분을 포함할 수도 있다. 진단 및 치료 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 특정 질병 또는 증상을 치료하거나 예방하는 데 필요한 치료 유효량으로 이용된다.
본 발명은 또한 염증, 암, 죽종생성, 신경 질병 및 심장 질병을 비롯한 다양한 질병과 증상을, 본 발명의 항-M-CSF 항체 또는 이의 항원 결합 부위, 상기 항체, 중쇄 및/또는 경쇄, 가변 영역 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 핵산의 유효량으로 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 항-M-CSF 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 생산하는 하이브리도마와 같은 단리된 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 항-M-CSF 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 그 가변 영역, 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터와 숙주 세포, 및 상기 핵산 분자에 의해 암호되는 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하는 방법을 제공한다.
항-M-CSF 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 항원-결합 부위를 발현하는 비-인간 형질전환 동물 또는 식물 또한 제공된다.
도 1a와 1b는 항-M-CSF 항체가 시간에 따라 웅성 및 자성 원숭이에서 전체 단핵구 계수에서 투여량-관련 감소를 야기함을 보여주는 그래프이다. 단핵구 계수는 애보트 디아그노스틱스 인크. 셀 딘(Cell Dyn) 시스템을 이용하여 광산란에 의해 결정하였다. 단핵구 계수는 약 5분 기간에 걸쳐 3.79 ml/kg의 투여량 부피로 0, 0.1, 1 또는 5 mg/kg으로 비히클 또는 항체 8.10.3을 투여한 후 24시간부터 3주동안 모니터하였다.
도 1a 웅성 원숭이.
도 1b 자성 원숭이.
도 2a와 2b는 웅성 및 자성 원숭이에서 항-M-CSF 처리가 CD14+CD16+단핵구의 퍼센티지에서 감소를 야기함을 보여주는 그래프이다. 약 5분 기간에 걸쳐 3.79 ml/kg의 투여량 부피로 0, 0.1, 1 또는 5 mg/kg으로 비히클 또는 항체 8.10.3의 투여 후 0-21일. 시험된 각 원숭이를 위하여, CD14+CD16+ 서브세트내의 단핵구의 퍼센티지는 8.10.3 주사 후 1,3,7,14 및 21일에 각 혈액 채취 후 결정하였다.
도 2a 웅성 원숭이.
도 2b 자성 원숭이.
도 3a 와 3b는 항-M-CSF 처리가 시험 전 단핵구 수준과 비교할 때 모든 투여량의 항체 8.10.3F와 항체 9.14.4I에서 전체 단핵구의 퍼센티지 변화의 감소를 야기함을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 항체 8.10.3F를 이용하는 실험으로부터 수집된 데이터를 보여준다.
도 3b는 항체 9.14.4I를 이용하는 실험으로부터 수집된 데이터를 보여준다.
도 4는 상응하는 가변 영역 유전자의 생식세포 아미노산 서열과 비교한 26개 항-M-CSF 항체로부터의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 예측된 아미노산 서열의 서열 배열이다. 항체 서열과 생식세포 유전자 서열 사이의 차이는 진하게 표시된다. 대쉬는 생식세포와 차이가 없음을 나타낸다. 각 배열에서 밑줄친 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 나타낸다.
도 4a는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 252를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 4의 잔기 21-127)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4b는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 88을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 8의 잔기 21-127)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4c는 생식세포 VκL2, Jκ3 서열(서열 번호 107)에 대한 항체 100을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 12의 잔기 21-127)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4d는 생식세포 VκL5, Jκ3 서열(서열 번호 109)에 대한 항체 3.8.3을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 16의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4e는 생식세포 VκL5, Jκ4 서열(서열 번호 117)에 대한 항체 2.7.3을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 20의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4f는 생식세포 VκB3, Jκ1 서열(서열 번호 112)에 대한 항체 1.120.1을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 24의 잔기 21-134)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4g는 생식세포 VH3-11, DH7-27 JH6 서열(서열 번호 106)에 대한 항체 252를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 2의 잔기 20-136)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4h는 생식세포 VH3-7, DH6-13, JH4 서열(서열 번호 105)에 대한 항체 88을 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 6의 잔기 20-138)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4i는 생식세포 VH3-23, DH1-26 JH4 서열(서열 번호 104)에 대한 항체 100을 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 10의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4j는 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4 서열(서열 번호 108)에 대한 항체 3.8.3을 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 14의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4k는 생식세포 VH3-33, DH1-26, JH4 서열(서열 번호 110)에 대한 항체 2.7.3을 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 18의 잔기 20-137)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4l은 생식세포 VH1-18, DH4-23, JH4 서열(서열 번호 111)에 대한 항체 1.120.1을 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 22의 잔기 20-139)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4m은 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 44의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4n은 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3을 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 30의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4o는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 28의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4p는 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 38의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4q는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.7.2를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 48의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4r은 생식세포 VH3-11, DH6-13, JH6b 서열(서열 번호 115)에 대한 항체 9.7.2를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 46의 잔기 20-136)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4s는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4I를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 28의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4t는 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4I를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 26의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4u는 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3F를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 32의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4v는 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3F를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 30의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4w는 생식세포 Vκ012, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.7.2IF를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 36의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4x는 생식세포 VH3-11, DH6-13, JH6b 서열(서열 번호 115)에 대한 항체 9.7.2IF를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 34의 잔기 20-136)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4y는 생식세포 Vκ012, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.7.2C-Ser을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 52의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4z는 생식세포 VH3-11, DH6-13, JH6b 서열(서열 번호 115)에 대한 항체 9.7.2C-Ser를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 50의 잔기 20-136)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4aa는 생식세포 Vκ012, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4C-Ser을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 56의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4bb는 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4C-Ser를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 54의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4cc는 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3C-Ser을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 60의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4dd는 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3C-Ser를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 58의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4ee는 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3-CG2를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 60의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4ff는 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3-CG2를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 62의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4gg는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.7.2- CG2를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 52의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4hh는 생식세포 VH3-11, DH6-13, JH6b 서열(서열 번호 115)에 대한 항체 9.7.2-CG2를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 66의 잔기 20-136)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4ii는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.7.2-CG4를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 52의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4jj는 생식세포 VH3-11, DH6-13, JH6b 서열(서열 번호 115)에 대한 항체 9.7.2-CG4를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 70의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4kk는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4-CG2를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 56의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4ll은 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4-CG2를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 74의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4mm은 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4-CG4를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 56의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열 의 배열을 보여준다.
도 4nn은 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4-CG4를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 78의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4oo는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4-Ser를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 28의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4pp는 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4-Ser를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 82의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4qq는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.7.2-Ser를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 48의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4rr은 생식세포 VH3-11, DH6-13, JH6b 서열(서열 번호 115)에 대한 항체 9.7.2-Ser를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 86의 잔기 20-136)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4ss는 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3-Ser를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 44의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4tt는 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3-Ser를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 90의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4uu는 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3-CG4를 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 60의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4vv는 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3-CG4를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 94의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4ww는 생식세포 VκO12, Jκ3 서열(서열 번호 103)에 대한 항체 9.14.4G1을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 28의 잔기 23-130)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4xx는 생식세포 VH3-11, DH7-27, JH4b 서열(서열 번호 116)에 대한 항체 9.14.4G1를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 102의 잔기 20-135)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4yy는 생식세포 VκA27, Jκ4 서열(서열 번호 114)에 대한 항체 8.10.3FG1을 위한 경쇄 가변 영역(서열 번호 32의 잔기 21-129)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
도 4zz는 생식세포 VH3-48, DH1-26, JH4b 서열(서열 번호 113)에 대한 항체 8.10.3FG1를 위한 중쇄 가변 영역(서열 번호 98의 잔기 20-141)의 예측된 아미노산 서열의 배열을 보여준다.
발명의 상세한 설명
정의 및 일반 기법
여기서 달리 정의되지 않으면, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 내용에 의해 달리 필요하지 않으면, 단수는 복수를 포함하며 복수는 단수를 포함한다. 일반적으로, 여기서 개시된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화과 관련하여 이용되는 명명법 및 기법은 공지되고 당업계에서 흔히 이용되는 것들이다.
본 발명의 방법과 기법은 일반적으로 당업계에 공지된 종래의 방법에 따라 그리고 달리 표시되지 않으면 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 개시되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 문헌에 개시된 대로 실시된다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)를 참고하며 이들은 참고로 여기에 통합된다. 효소 반응 및 정제 기법은 당업계에서 일반적으로 이루어지거나 여기서 개시된 대로 제조자의 설명에 따라 실시된다. 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 기계 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 그 실험 과정 및 기법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 흔히 이용된다. 표준 기법은 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 조제, 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 이용된다.
달리 표시되지 않으면 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해된다.
용어 "폴리펩티드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포괄한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
용어 "단리된 단백질", "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 항체"는 그 기원 또는 유래된 공급원에 의해 하기 중 하나 내지 네개를 갖는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이다: (1) 그 천연 상태에서 그것에 수반되는 천연 연합 성분과 연합되지 않음, (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 없음, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현됨, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않음. 따라서, 화학적으로 합성되거나 그것이 자연적으로 기원하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 그것의 천연 연합 성분으로부터 "단리될" 것이다. 단백질은 또한 공지의 단백질 정제 기법을 이용한 단리에 의해 천연 연합 성분이 실질적으로 없게 될 수 있다.
단리된 항체의 예는 M-CSF를 이용하여 친화성 정제된 항-M-CSF 항체, 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 생체외에서 합성된 항-M-CSF 항체, 및 형질전환 마우스로부터 유래된 인간 항-M-CSF-항체를 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드는 샘플의 적어도 약 60 내지 75%가 단일 종의 폴리펩티드를 나타낼 때 "실질적으로 순수"하거나, "실질적으로 균질"하거나 또는 "실 질적으로 정제"된다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 일반적으로 단백질 샘플의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%W/W를, 더욱 일반적으로는 약 95%를 구성할 것이며, 바람직하게는 99% 이상 순수할 것이다. 단백질 순도 또는 균질성은 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 이어서 공지의 염료로 젤을 염색하여 단일 폴리펩티드 밴드를 가시화하는 것과 같은 공지의 많은 수단에 의해 나타내질 수 있다. 일부 목적을 위하여, 보다 높은 해상도는 HPLC 또는 정제를 위해 공지된 다른 수단에 의해 제공될 수 있다.
여기서 이용될 때 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 갖지만 나머지 아미노산 서열은 자연 발생 서열의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 말한다. 일부 구체예에서, 단편은 적어도 5,6,8 또는 10 아미노산 길이이다. 다른 구체예에서, 단편은 적어도 14, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 70, 80, 90, 100, 150 또는 200 아미노산 길이이다.
여기서 이용될 때 용어 "폴리펩티드 유사체"는 아미노산 서열의 부위에 실질적인 동일성을 가지며 하기 특성 중 적어도 하나를 갖는 절편을 포함하는 폴리펩티드를 말한다: (1) 적합한 결합 조건하에서 M-CSF에의 특이적 결합, (2) M-CSF를 억제하는 능력.
일반적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연 발생 서열에 관하여 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 일반적으로 적어도 20 또는 25 아미노산 길이이며, 바람직하게는 적어도 50,60,70,80,90,100,150 또는 200 아미노 산 길이 또는 그 이상이며, 종종 전장 폴리펩티드만큼 길수 있다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부위의 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 민감성을 감소, (2) 산화에 대한 민감성을 감소, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경, 또는 (4) 그러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여 또는 변화시키는 것들이다. 유사체는 자연-발생 펩티드 서열외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인 바깥의 폴리펩티드 부위에서, 자연 발생 서열에서 만들어질 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시켜서는 안된다; 예, 치환 아미노산은 모 서열에 발생하는 면역글로불린 결합 도메인을 구성하는 항-평행 β-시트를 변화시키거나, 또는 모 서열을 특징짓는 2차 구조의 다른 타입을 파괴하지 않아야 한다. 일반적으로, 글리신 및 프롤린 유사체는 항-평행 β-시트에 이용되지 않을 것이다. 공지의 폴리펩티드 이차 및 삼차 구조의 예는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York (1984) ) ; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N. Y.(1991)) ; 및 Thornton et al., Nature 354 : 105(1991)에 개시되며, 이들은 참고로 여기에 통합된다.
비-펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 약물로서 약 학 산업에서 흔히 이용된다. 비-펩티드 화합물의 이들 타입은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"로 불린다. Fauchere, J Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p. 392 (1985); 및 Evans et al., R Med. Chenu. 30: 1229 (1987)를 참고하며 이들은 참고로 여기에 통합된다. 그러한 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 등가의 치료적 또는 예방적 효과를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드(즉, 원하는 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 공지의 방법에 의해, --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--,--CH=CH-- (시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--,및 -CH2SO--로 구성되는 군으로부터 선택된 결합에 의해 임의로 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 타입의 D-아미노산(예, L-라이신 대신 D-라이신)으로 체계적으로 치환하는 것은 또한 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 억제된 펩티드를 공지 방법에 의해 생성할 수 있으며(Rizo and Gierasch, Ann. Rev.Biochem. 61: 387 (1992), 참고로 여기에 통합됨), 예를 들어, 펩티드를 고리화하는 분자내 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하는 것이 있다.
"항체"는 본래의 항체 또는 특이적 결합을 위해 본래의 항체와 경쟁하는 항 원-결합 부위를 말한다. 일반적으로, Fundamental Immunology. Ch. 7 (Paul,W., ed. , 2nd ed. Raven Press, N. Y.(1989))(참고로 전체가 여기에 통합됨)를 참고한다. 항원-결합 부위는 재조합 DNA 기법에 의해 또는 본래의 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-결합 부위는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(scFv), 키메라 항체, 디아바디 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 항체의 부분를 적어도 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
N-말단에서 C-말단으로, 성숙 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배열은 Kabat, Sequences of Proteins of Imnzunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk, J Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), 또는 Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)의 정의에 따른다.
여기서 이용될 때, 번호로 언급되는 항체는 동일한 번호의 하이브리도마로부터 얻어진 모노클로날 항체와 동일하다. 예를 들어, 모노클로날 항체 3.8.3은 하이브리도마 3.8.3으로부터 얻어진 것과 동일한 항체이다.
여기서 이용될 때, Fd 단편은 VH 및 CH 1 도메인으로 구성되는 항체 단편을 의미하며; Fv 단편은 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되며; 그리고 dAb 단편(Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989))은 VH 도메인으로 구성된다.
일부 구체예에서, 항체는 VL 및 VH 도메인이 이들이 단일 단백질 쇄로 만들어지도록 하는 합성 링커를 통해 일가 분자를 형성하기 위하여 짝을 이룬다.(Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988).) 일부 구체예에서, 항체는 디아바디이며, 즉, VH와 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되지만 동일한 쇄상의 두 도메인 사이의 짝형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용하여 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝을 이루고 두 개의 항원 결합 부위를 생성하도록 하는 이가항체이다.(예를 들어, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), 및 Poljak R. J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994).를 참고한다). 일부 구체예에서, 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 CDR은 공유적으로 또는 비공유적으로 분자내로 통합되어 그 분자를 M-CSF에 특이적으로 결합하는 이뮤노어드헤신(immunoadhesin)로 만들 수도 있다. 그러한 구체예에서, CDR은 더 큰 폴리펩티드쇄의 일부로서 통합되거나, 다른 폴리펩티드쇄에 공유적으로 연결되거나, 또는 비공유적으로 통합될 수도 있다.
하나 이상의 결합 부위를 갖는 구체예에서, 결합 부위는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
여기서 이용될 때, 용어 "인간 항체"는 가변 도메인 서열과 불변 도메인 서열이 인간 서열인 임의의 항체를 말한다. 상기 용어는 인간 유전자로부터 유래된 서열을 갖지만 예를 들어, 가능한 면역원성을 감소시키고, 친화성을 증가시키고, 원치않는 접힘을 야기할 수 있는 시스테인을 제거하기 위해 변화된 항체를 포괄한다. 상기 용어는 인간 세포에 일반적이지 않은 당화를 부여할 수 있는 비-인간 세포에서 재조합적으로 생산된 항체를 포괄한다. 이들 항체는 후술하는 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
여기서 이용될 때 용어 "키메라 항체"는 둘 이상의 상이한 항체로부터의 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 한 구체예에서, CDR중 하나 이상은 인간 항-M-CSF 항체로부터 유래된다. 다른 구체예에서는, 모든 CDR이 인간 항-M-CSF 항체로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 둘 이상의 인간 항-M-CSF 항체로부터의 CDR이 키메라 항체로 결합된다. 예를 들어, 키메라 항체는 첫번째 인간 항-M-CSF 항체의 경쇄로부터의 CDR1, 두번째 인간 항-M-CSF 항체의 경쇄로부터의 CDR2, 및 세번째 인간 항-M-CSF 항체의 경쇄로부터의 CDR3를 포함할 수 있으며, 중쇄로부터의 CDR은 하나 이상의 다른 항-M-CSF 항체로부터 유래될 수 있다. 또한, 골격 영역은 CDR중 하나 이상이 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 취해지는 항-M-CSF 항체 중 하나로부터 유래할 수도 있다.
항체 또는 면역글로불린분자의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시에 따라 당업자가 쉽게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시-말단은 기능성 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공지의 또는 독점적 서열 데이터베이스와 비교하여 확인될 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터화된 비교 방법을 이용하여 공지 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단 백질 형태 도메인을 확인한다. 공지의 삼차 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법은 알려져 있다. Bowie et al., Science 253: 164 (1991) 참고.
여기서 이용될 때, 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들어, BIACORETM 시스템(뉴저지, 스웨덴 및 피스카타웨이, 웁살라에 소재하는 파마시아 바이오센서 에이비)을 이용하여, 바이오센서 매트릭스내에서 단백질 농도의 변화를 검출하여 실시간으로 생물특이적 상호작용을 분석하도록 하는 광학적 현상을 말한다. 추가의 설명을 위해, Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993);Jonsson U. et al., Biotechniques 11: 620-627(1991) ; Jonsson B. et al.,J Mol. Recognit. 8 : 125-131 (1995); 및 Johnsson B. et al., Anal. Biochem.198 :268-277 (1991)을 참고한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 말한다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적 결합을 할 수 있거나 또는 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑으로 구성되며 일반적으로 특이적 삼차원 구조 특징 및 특이적 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형" 또는 "형태적"일 수 있다. 선형 에피토프에서는, 단백질과 상호작용 분자(예, 항체) 사이의 상호작용의 모든 지점이 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. 형태적 에피토프에서는, 상호작용 지점이 단백질상의 서로 단리된 아미노산 잔기를 가로질러 발생한다. 항체는 해리 상수가 ≤1mM, 바람직하게는 ≤100 nM 그리고 가장 바람직하게는 ≤10 nM일 때 항원에 특이적으로 결합한다고한다. 일부 구체예에서, KD는 1 pM 내지 500 pM이다. 다른 구체예에서는, KD는 500 pM 내지 1 μM이다. 다른 구체예에서는, KD는 1 μM 내지 100 nM이다. 다른 구체예에서는, KD는 100 mM 내지 10 nM이다. 일단 항원상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본 발명에 개시된 기법을 이용하여, 그 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 다르게는, 발견 과정동안, 항체의 생성 및 규명은 바람직한 에피토프에 대한 정보를 제공할 수도 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프와의 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이것을 이루기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예, 항원에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항체를 찾기 위해 교차-경쟁 연구를 실시하는 것이다. 항체의 교차-경쟁에 기초하여 항체를 "비닝(binning)" 하기 위한 고처리 과정은 국제 특허 출원 제 WO03/48731호에 개시된다.
여기서 이용될 때, 20개의 종래의 아미노산 및 그들의 약자는 통상의 용법을 따른다. 참고로 본원에 통합되는 Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991))를 참고한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들 중 어느 타입의 변형된 형태인, 적어도 10 염기 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일 및 이중 쇄 형태를 포함한다.
여기서 이용될 때 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 그 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 그 기원 또는 유래 공급원에 의해 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 하기 중 하나 내지 세 의미를 갖는다: (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부와 연합되지 않음, (2) 그것이 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결됨, 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않음.
여기서 이용될 때 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생 및 비자연 발생 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200 염기 이하의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 10 내지 60 염기 길이이며 가장 바람직하게는 12,13,14,15,16,17,18,19 또는 20 내지 40 염기 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 대개 예를 들어 프라이머와 프로브의 경우 단일쇄이며, 유전자 돌연변이의 구성에 사용하기 위해서는 이중쇄일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
여기서 이용될 때 용어 "자연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 여기서 이용될 때 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당 기 등을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아니라데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들어, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986) ; Stec et al., J Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. AcidsRes. 16: 3209 (1988) ; Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991) ; Zon et al., Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)) ; 미국 특허 제5,151,510호 ; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990)를 참고하며, 이들은 참고로 여기에 통합된다. 올리고뉴클레오티드는 필요하면 검출을 위한 라벨을 포함할 수 있다.
"작동가능하게 연결된" 서열은 대상 유전자와 인접한 발현 조절 서열 및 대상 유전자를 조절하기 위해 트랜스로 또는 떨어져서 작용하는 발현 조절 서열을 포함한다. 여기서 이용될 때 용어 "발현 조절 서열"은 그들이 연결되는 암호 서열의 발현과 프로세싱을 일으키는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 시그널; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증가시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증가시키는 서열; 및 필요할 경우, 단백질 분비를 증가시키는 서열을 포함한다. 그러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며, 원핵생물에서는, 그러한 조절 서열은 대개 프로모터, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하며, 진핵생물에서는, 대개 그러한 조절 서열은 프로모터와 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소한 그 존재가 발현과 프로세싱에 필수적인 모든 성분을 포함하며, 또한 그 존재가 유익한 추가 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
여기서 이용될 때 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구체예에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 원형 이중쇄 DNA 루프이다. 일부 구체예에서는, 벡터는 바이러스 벡터이며, 이때 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈내로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하다(예, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터). 다른 구체예에서, 벡터(예, 비-에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 일부 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 여기서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 불린다.
여기서 이용될 때, 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 구체적인 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 후손을 의미한다. 일부 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후손 세대에서 발생할 수 있으므로, 그러한 후손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여기서 이용되는 용어 "숙주 세포"의 범위내에 여전히 포함된다.
여기서 용어 "선택적으로 하이브리드한다"는 검출가능하게 그리고 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그 단편은 비특이적 핵산에의 검출가능한 결합의 양을 최소화하는 하이브리 드화 및 세척 조건하에서 핵산 쇄에 선택적으로 하이브리드한다. "높은 엄격도" 또는 "매우 엄격한" 조건은 당업계에서 공지되고 여기서 개시되는 선택적인 하이브리드화 조건을 이루기 위해 이용될 수 있다. "높은 엄격도" 또는 "매우 엄격한" 조건의 한 예는 42℃의 하이브리드화 온도에서 12-16시간동안 6X SSPE 또는 SSC, 50% 포름아미드, 5X 덴하르트 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍/ml의 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA의 하이브리드화 완충액에서 막과 같은 고형 표면에 한 폴리뉴클레오티드가 고정되고, 이어서 1 X SSC, 0.5% SDS의 세척 완충액을 이용하여 55℃에서 두번 세척하는, 폴리뉴클레오티드와 다른 폴리뉴클레오티드의 항온처리이다. 또한 상기한 Sambrook et al., pp. 9.50-9.55를 참고한다.
핵산 서열의 내용에서 용어 "퍼센트 서열 동일성"은 첫번째 연속 서열을 두번째 연속 서열과 최대로 상응하도록 비교 배열할때 잔기의 퍼센트를 의미한다. 서열 동일성 비교의 길이는 적어도 약 9 뉴클레오티드, 대개 적어도 약 18 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로는 적어도 약 24 뉴클레오티드, 일반적으로는 적어도 약 28 뉴클레오티드, 보다 일반적으로는 적어도 약 32 뉴클레오티드, 그리고 바람직하게는 적어도 약 36, 48 또는 그 이상 뉴클레오티드의 스트레치일 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 이용될 수 있는 많은 상이한 알고리즘이 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 위스콘신, 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG)의 위스콘신 패키지 버젼 10.0내의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 이용하여 비교할 수 있다. 예를 들어, 프로그램 FASTA2와 FASTA3를 포함하는 FASTA는 질문 서열과 조사 서열 사이의 최상의 중복의 영역의 배열 및 퍼 센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson,J.Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); 참고로 여기에 통합됨). 달리 특정되지 않으면, 특정 프로그램 또는 알고리즘을 위한 디폴트 파라미터가 이용된다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 그 디폴트 파라미터를 이용하는 FASTA를 이용하거나(6의 단어 크기 및 스코어링 매트릭스를 위한 NOPAM 인자) 또는 여기서 참고로 통합되는 GCG 버젼 6.1에 제공되는 디폴트 파라미터를 이용하여 Gap을 이용하여 결정될 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 특정되지 않으면 그 보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 그 상보성 서열을 갖는 그 상보성쇄를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "퍼센트 서열 동일성"은 비교되는 잔기의 수에 대한 동일한 잔기의 수의 퍼센트로 표현된 비율을 의미한다.
핵산 또는 그 단편을 말할 때, 용어 "상당한 유사성" 또는 "상당한 서열 유사성"은 다른 핵산(또는 그 상보성 쇄)와 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 가지고 적절히 배열될 때, 전술한 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 공지의 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정할 때, 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%에서의 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 의미한다.
폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "상당한 동일성"은 프로그램에 공급되는 디폴 트 갭 중량을 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 적절히 배열될 때, 두 펩티드 서열이 적어도 70%, 75% 또는 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 또는 95% 서열 동일성, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 일부 구체예에서는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 크게 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향으로 조절될 수 있다. 이 조절을 만드는 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994)를 참고한다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 보존적 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민.
다르게는, 보존적 치환은 여기서 참고로 통합되는 Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "온건하게 보존적인" 치환은 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 비음성 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩티드에 대한 서열 동일성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 비롯한, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정을 이용하여 서열을 매치한다. 예를 들어, GCG는 프로그램에 특정된 디폴트 파라미터로 이용될 수 있는 "Gap" 및 "Bestfit"과 같은 프로그램을 함유하여 상이한 유기체 종으로부터의 상동성 폴리펩티드 또는 야생형 단백질과 그 뮤테인 사이와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩티드 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정한다. 예를 들어 GCG 버젼 6.1을 참고한다. 폴리펩티드 서열은 또한 디폴트 또는 추천 파라미터를 이용하는 FASTA를 이용하여 비교될 수 있다. GCG 버젼 6.1(위스콘신주 위스콘신 대학)참고. FASTA(예, FASTA2 및 FASTA3)는 질문 서열과 조사 서열 사이의 최상의 중복의 영역의 배열 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson,Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). 본 발명의 서열을 다른 유기체로부터의 많은 서열을 함유한 데이터베이스에 비교할 때 다른 바람직한 알고리즘은 프로그램과 함께 공급되는 디폴트 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다. 예를 들어, Altschul et al.,J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al.,Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)를 참고한다.
상동성을 위해 비교된 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 아미노산 잔기, 대개 적어도 약 20 잔기, 더욱 일반적으로 적어도 약 24 잔기, 일반적으로 적어도 약 28 잔기, 그리고 바람직하게는 약 35 잔기를 초과할 것이다. 많은 상이한 유기체로부터의 서열을 함유하는 데이터베이스를 조사할 경우, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다.
여기서 이용될 때, 용어 "라벨" 또는 "표지된"은 항체내에 다른 분자가 포함됨을 말한다. 한 구체예에서, 라벨은 검출가능한 마커이며, 예를 들어, 마크된 아비딘(예, 광학적 또는 발색 방법에 의해 검출될 수 있는 효소 활성 또는 형광 마커를 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 부위의 폴리펩티드에의 부착 또는 방사성표지된 아미노산의 통합이 있다. 다른 구체예에서, 라벨 또는 마커는 치료성이어서 예를 들어 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드와 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 공지되어 있으며 이용될 수 있다. 폴리펩티드를 위한 라벨의 예는 하기를 포함하며 이에 한정되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성뉴클라이드(예, 3H, 14C, 15N,35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 라벨(예, FITC, 로다민, 란탄계 포스포어), 효소 라벨(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제), 화학발광 마커, 비오티닐기, 이차 리포터에 의해 인식되는 선결된 폴리펩티드 에피토프(예, 루이신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자기성 제제, 예, 가도리늄 킬레이트, 백일해 독소와 같은 독소, 택솔, 시토카라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 이메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코콜티코이드, 프로케인, 테트라케인, 리도케인, 프로프라놀올, 및 푸로마이신 및 그 유사체 또는 상동체. 일부 구체예에서, 라벨은 잠재적인 입체 장해를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
본 명세서와 청구항을 통해, 단어 "포함한다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 기재된 정수 또는 정수의 그룹을 포함을 의미하지만 다른 정수 또는 다른 정수의 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
인간 항-M- CSF 항체 및 그 특성규명
한 구체예에서, 본 발명은 인간화 항-M-CSF 항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 항-M-CSF 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 인간 항-M-CSF 항체는 그 게놈이 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 설치류와 같은 비-인간 형질전환 동물을 면역화시켜 생산되며, 설치류가 인간 항체를 생산한다.
본 발명의 항-M-CSF 항체는 인간 카파 또는 인간 람다 경쇄 또는 그로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 카파 경쇄를 포함하는 일부 구체예에서, 경쇄 가변 도메인(VL)은 부분적으로 인간 VκO12, VκL2, VκL5, VκA27 또는 VκB3 유전자 및 Jκ1, Jκ2, Jκ3 또는 Jκ4 유전자에 의해 부분적으로 암호된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 VκO12/Jκ3, VκL2/Jκ3,VκL5/Jκ3, VκL5/Jκ4, VκA27/Jκ4 또는 VκB3/Jκ1 유전자에 의해 암호된다.
일부 구체예에서, M-CSF 항체의 VL은 생식세포 아미노산 서열에 비하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 VL은 생식세포 아미노산 서열에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 생식세포로부터의 이들 치환 중 하나 이상은 경쇄의 CDR 영역내에 있다. 일부 구체예에서, 생식세포에 대한 아미노산 치환은 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8. 10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 VL 중 하나 이상에서 생식세포에 대한 치환과 동일한 위치 중 하나 이상에 있다. 예를 들어, 항-M-CSF 항체의 VL은 항체 88의 VL에서 발견되는 생식세포에 비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 그리고 항체 88과 동일한 Vκ 유전자를 이용하는 항체 252의 VL에서 발견되는 생식세포에 비하여 다른 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 변화는 동일한 위치중 하나 이상에 있지만 기준 항체에서와 상이한 돌연변이에 관련된다.
일부 구체예에서, 생식세포에 대한 아미노산 변화는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14. 4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 VL 중 어느 것에서와 동일한 위치 중 하나 이상에서 발생하지만, 상기 변화는 기준 항체의 아미노산에 대하여 그러한 위치에서의 보존적 아미노산 치환을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 만일 이들 항체 중 하나의 특정 위치가 생식세포에 비하여 변화되고 글루타메이트이면, 그 위치에서 아스파테이트를 대신할 수 있다. 유사하게, 만일 생식세포에 비하여 아미노산 치환이 세린이면, 그 위치에서 세린을 트레오닌으로 치환할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 상기에서 개시된다.
일부 구체예에서, 인간 항-M-CSF 항체의 경쇄는 항체 252 (서열 번호 4), 88 (서열 번호 8), 100 (서열 번호 12), 3.8.3 (서열 번호 16), 2.7.3 (서열 번호 20), 1.120.1 (서열 번호 24), 9.14.4I (서열 번호 28), 8.10.3F (서열 번호 32), 9.7.2IF (서열 번호 36), 9.14.4 (서열 번호 28), 8.10.3 (서열 번호 44), 9.7.2 (서열 번호 48), 9.7.2C-Ser (서열 번호 52), 9.14.4C-Ser (서열 번호 56), 8.10.3C-Ser (서열 번호 60), 8.10.3-CG2 (서열 번호 60), 9.7.2-CG2 (서열 번호 52), 9.7.2-CG4 (서열 번호 52), 9.14.4-CG2 (서열 번호 56), 9.14.4-CG4 (서열 번호 56), 9.14.4-Ser (서열 번호 28), 9.7.2-Ser (서열 번호 48), 8.10.3-Ser (서열 번호 44), 8.10.3-CG4 (서열 번호 60), 8.10.3FG1 (서열 번호 32) 또는 9.14.4G1 (서열 번호 28)의 VL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 또는 상기 아미노산 서열은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 최대 3개의 비보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 경쇄는 전술한 항체 중 어느 것의 CDR1의 시작에서 CDR3의 마지막까지의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 경쇄는 생식세포 또는 전술한 항체 서열의 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3를 적어도 포함한다. 다른 구체예에서, 경쇄는 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 독립적으로 선택된 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역, 또는 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 각각 갖는 CDR 영역을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 경쇄는 경쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3를 포함하며 그 각각은 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60으로부터 선택된 VL 영역의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 또는 47로부터 선택된 VL 영역을 암호하는 핵산 분자에 의해 암호되는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로부터 독립적으로 선택된다. 항-M-CSF 항체의 경쇄는 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60으로부터 선택된 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 경쇄는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하거나, 또는 상기 CDR 영역은 각각 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는다.
중쇄와 관련하여, 일부 구체예에서, 중쇄 아미노산 서열의 가변 영역은 부분적으로 VH3-11, VH3-23, VH3-7, VH1-18, VH3-33, VH3-48 유전자 및 JH4, JH6, JH4b, 또는 JH6b 유전자에 의해 암호된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 VH3-11/DH7-27/JH6, VH3-7/DH6-13/JH4, VH3-23/DH1-26/JH4, VH3-11/DH7-27/JH4, VH3-33/DH1-26/JH4, VH1-18/DH4-23/JH4, VH3-11/DH7-27/JH4b, VH3-48/DH1-26/JH4b, VH3-11/DH6-13/JH6b, VH3-11/DH7-27/JH4b, VH3-48/DH1-6/JH4b, 또는 VH3-11/DH6-13/JH6b 유전자에 의해 암호된다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 VH는 생식세포 아미노산 서열에 비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(첨가)을 함유한다. 일 부 구체예에서, 중쇄의 가변 도메인은 생식세포 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 생식세포 아미노산 서열에 비교할 때 비보존적 치환이다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 중쇄의 CDR 영역에 있다. 일부 구체예에서, 아미노산 변화는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14. 4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 VH 중 하나 이상에서 생식세포로부터의 돌연변이와 동일한 위치 중 하나 이상에서 만들어진다. 다른 구체예에서, 아미노산 변화는 동일한 위치 중 하나 이상에 있지만 기준 항체에서와 상이한 돌연변이에 관련된다.
일부 구체예에서, 중쇄는 항체 252 (서열 번호 2), 88 (서열 번호 6), 100 (서열 번호 10), 3.8.3 (서열 번호 14), 2.7.3 (서열 번호 18), 1.120.1 (서열 번호 22), 9.14.4I (서열 번호 26), 8.10.3F (서열 번호 30), 9.7.2IF (서열 번호 34), 9.14.4 (서열 번호 38), 8.10.3 (서열 번호 30), 9.7.2 (서열 번호 46), 9.7.2C-Ser (서열 번호 50), 9.14.4C-Ser (서열 번호 54), 8.10.3C-Ser (서열 번호 58), 8.10.3-CG2 (서열 번호 62), 9.7.2-CG2 (서열 번호 66), 9.7.2-CG4 (서열 번호 70), 9.14.4-CG2 (서열 번호 74), 9.14.4-CG4 (서열 번호 78), 9.14. 4-Ser (서열 번호 82), 9.7.2-Ser (서열 번호 86), 8.10.3-Ser (서열 번호 90) 8.10.3-CG4 (서열 번호 94), 8.10.3FG1 (서열 번호 98) 또는 9.14.4G1 (서열 번호 102)의 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 최대 3개 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄는 전술한 항체 중 임의의 하나의 CDR1의 시작에서 CDR3의 마지막까지의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, 또는 각각 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 CDR 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄는 여기서 개시된 항체 서열의 전술한 생식세포 또는 항체 CDR3를 포함하며, 또한 생식세포 서열의 CDR1 및 CDR2 영역을 포함하거나, 또는 항체 서열의 CDR1 및 CDR2를 포함할 수 있으며, 각각은 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체의 중쇄를 포함하는 항체로부터 독립적으로 선택된다. 다른 구체예에서, 중쇄는 여기서 개시된 항체 서열의 CDR3를 포함하며, 또한 CDR1 및 CDR2 영역을 포함할 수 있으며, 그 각각은 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102로부터 선택된 VH 영역의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 또는 101로부터 선택된 VH 영역을 암호하는 핵산 서열에 의해 암호되는 VH 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 CDR1 및 CDR2 영역으로부터 독립적으로 선택된다. 다른 구체예에서, 항체는 상기에서 개시된 경쇄 및 상기에서 개시된 중쇄를 포함한다.
만들어질 수 있는 한가지 아미노산 치환 타입은 화학적으로 반응성일 수 있는, 항체내의 시스테인 하나 이상을 제한없이 알라닌 또는 세린과 같은 다른 잔기로 변화시키는 것이다. 한 구체예에서는, 비공칭 시스테인의 치환이 있다. 치환은 항체의 가변 도메인의 골격 영역내 또는 불변 도메인내일 수 있다. 다른 구체예에서, 시스테인은 항체의 비공칭 영역내에 있다.
만들어질 수 있는 다른 아미노산 치환 타입은 항체내의 임의의 가능한 단백질분해 부위, 특히 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 골격 영역내 또는 불변 도메인내에 있는 단백질 분해 부위를 제거하는 것이다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질 분해 부위의 제거는 항체 생성물에서 임의의 이질성의 위험을 감소시키고 따라서 그 균질성을 증가시킬 수 있다. 다른 타입의 아미노산 치환은 잔기 중 하나 또는 둘다를 변화시켜 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제 거하는 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체의 중쇄의 C-말단 리신은 존재하지 않는다(Lewis D. A., et al.,Anal Chem, 66 (5): 585-95 (1994)). 본 발명의 다양한 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 시그널 서열을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 인간 항-M-CSF 모노클로날 항체를 억제하는 것 및 그들을 생산하도록 조작된 세포주에 관련된다. 표 1은 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3 및 9.7.2 를 위한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호하는 핵산 및 상응하는 예측된 아미노산 서열의 서열 동정자(서열 번호)를 열거한다: 추가의 변이체 항체 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14. 4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1은 공지 방법에 의해 만들어질 수 있다.
[표 1]
Figure 112006024760111-PCT00001
항-M- CSF 항체의 클래스 및 서브클래스
항-M-CSF 항체의 클래스 및 서브클래스는 임의의 공지 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스는 항체의 구체적인 클래스 및 서브클래스에 대해 특이적인 항체를 이용하여 결정할 수 있다. 그러한 항체는 시판 된다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 또는 웨스턴 블롯 및 다른 기법에 의해 결정될 수 있다. 다르게는, 클래스와 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 모두 또는 일부를 서열결정하고, 그들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지의 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 모노클로날 항체이다. 항-M-CSF 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 IgG이며 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스이다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서브클래스 IgG2 또는 IgG4이다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서브클래스 IgG1이다.
종 및 분자 선택성
본 발명의 다른 양태에서, 항-M-CSF 항체는 종 및 분자 선택성 둘다를 입증한다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 인간, 키노몰구스 원숭이 및 마우스 M-CSF에 결합한다. 명세서의 교시에 따라, 공지의 방법을 이용하여 항-M-CSF 항체에 대한 종 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS, ELISA, RIA, 세포 증식 분석, 또는 M-CSF 수용체 결합 분석을 이용하여 종 선택성을 결정할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 세포 증식 분석 또는 ELISA를 이용하여 종 선택성을 결정할 수 있다.
다른 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 GM-/G-CSF에 대한 그 선택성보다 적어도 100 배 더 큰 M-CSF에 대한 선택성을 갖는다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 M-CSF외의 임의의 다른 단백질에 대해 감지할수 있는 특이적 결합을 나타내지 않는다. 본 명세서의 교시에 따라 공지의 방법을 이용하여 M-CSF에 대한 항-M-CSF 항체의 선택성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS, ELISA 또는 RIA를 이용하여 선택성을 결정할 수 있다.
항-M- CSF 항체에 의해 인식된 M- CSF 에피토프의 확인
본 발명은 M-CSF에 결합하며 경쟁하거나, 교차-경쟁하거나 및/또는 동일한 에피토프에 결합하거나 및/또는 (a) 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9. 14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체; (b) 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체; (c) 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; (d) (b)에 정의된 중쇄 가변 영역과 (c)에 정의된 경쇄 가변 영역 둘다를 포함하는 항체와 동일한 KD로 M-CSF에 결합하는 인간 항-M-CSF 모노클로날 항체를 제공한다.
항체가 동일한 에피토프에 결합하는지, 결합을 위해 경쟁하는지, 결합을 위해 교차 경쟁하는지, 또는 항-M-CSF 항체와 동일한 KD를 갖는지 여부를 공지 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체가 포화 조건하에서 M-CSF에 결합하도록 하고 이어서 시험 항체가 M-CSF에 결합하는 능력을 측정한다. 만일 시험 항체가 항-M-CSF 항체와 동시에 M-CSF에 결합할 수 있으면, 시험 항체는 항-M-CSF 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 하지만, 만일 시험 항체가 동시에 M-CSF에 결합할 수 없으면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중복 에피토프, 또는 인간 항-M-CSF 항체에 의해 결합되는 에피토프와 매우 인접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은 ELISA, RIA 또는 FACS를 이용하여 실시할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 실험은 BIACORETM을 이용하여 실시된다.
M- CSF 에 대한 항-M- CSF 항체의 결합 친화성
본 발명의 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 높은 친화성으로 M-CSF에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 1 X 10-7 M 이하의 KD로 M-CSF에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 1 X 10-8 M, 1 X 10-9 M, 1 X 10-10 M, 1 X 10-11 M, 1 X 10-12 M 또는 그 미만의 KD로 M-CSF에 결합한다. 일부 구체예에서, KD는 1 pM 내지 500 pM이다. 다른 구체예에서, KD는 500 pM 내지 1 μM이다. 다른 구체예에서, KD는 1 μM 내지 100 nM이다. 다른 구체예에서, KD는 100 mM 내지 10 nM이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 항체는 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8. 10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체와 실질적으로 동일한 KD로 M-CSF에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체로부터의 경쇄의 CDR2 및/또는 중쇄의 CDR3를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 M-CSF에 결합한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 M-CSF에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 VL 영역의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR2를 포함하며 임의로 CDR1 및/또는 CDR3를 포함할 수 있는 항체, 또는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 VH 영역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR3를 포함하며 임의로 CDR1 및 /또는 CDR2를 포함할 수 있는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 M-CSF에 결합한다.
일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 낮은 해리 속도를 갖는다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 2.0 X 10-4 s-1 또는 그 미만의 koff를 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 2.0 X 10-5 또는 2.0 X 10-6 s-1 또는 그 미만의 koff로 M-CSF에 결합한다. 일부 구체예에서, koff는 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8. 10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체와 같은 여기서 개시된 항체와 실질적으로 동일하다. 일부 구체예에서, 항체는 (a) 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체의 중쇄의 CDR3를 포함하며 임의로 CDR1 및/또는 CDR2를 포함할 수 있거나; 또는 (b) 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8. 10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체로부터의 경쇄의 CDR2를 포함하며 임의로 CDR1 및/또는 CDR3를 포함할 수 있는 항체와 실질적으로 동일한 koff로 M-CSF에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 koff로 M-CSF에 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역의 CDR2를 포함하며 임의로 CDR1 및/또는 CDR3를 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역의 CDR3를 포함하며 임의로 CDR1 및/또는 CDR2를 포함할 수 있는 항체와 실질적으로 동일한 koff로 M-CSF에 결합한다.
항-M-CSF 항체의 M-CSF에 대한 결합 친화성 및 해리 속도는 공지의 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화성은 경쟁적 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명(예, BIACORETM 기법 이용)에 의해 측정할 수 있다. 해리 속도는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는, 결합 친화성 및 해리 속도는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. 더욱 바람직하게는, 결합 친화성 및 해리 속도는 BIACORETM 기법을 이용하여 측정된다. 실시예 VI은 BIACOREATM 기법에 의해 항-M-CSF 모노클로 날 항체의 친화성 상수를 결정하는 방법을 예시한다.
항-M- CSF 항체에 의한 M- CSF 활성의 억제
c-fms에 대한 M- CSF 결합의 억제
다른 구체예에서, 본 발명은 c- fms 수용체에 대한 M-CSF의 결합을 억제하며 c-fms의 활성화를 차단하거나 예방하는 항-M-CSF 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, M-CSF는 인간이다. 다른 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 인간 항체이다. IC50은 ELISA, RIA, 및 세포 증식 분석과 같은 세포계 분석, 전혈 단핵구 모양 변화 분석, 또는 수용체 결합 억제 분석에 의해 측정될 수 있다. 한 구체예에서, 항체 또는 그 일부는 세포 증식 분석에 의해 측정할 때 8.0 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 3 x 10-7 M 이하, 또는 더욱 바람직하게는 8 x 10-8 M 이하의 IC50으로 세포 증식을 억제한다. 다른 구체예에서, 단핵구 모양 변화 분석에 의해 측정된 IC50은 2 x 10-6 M 이하, 바람직하게는 9.0 x 10-7 M 이하, 또는 더욱 바람직하게는 9 10-8M 이하이다. 다른 바람직한 구체예에서, 수용체 결합 분석에 의해 측정한 IC50은 2 x 10-6 M 이하, 바람직하게는 8.0 x 10-7 M 이하, 또는 더욱 바람직하게는 7.0 x 10-8 M 이하이다. 실시예 III, IV 및 V는 다양한 타입의 분석을 예시한다.
다른 양태에서 본 발명의 항-M-CSF 항체는 M-CSF에 대한 반응으로 단핵구/대 식세포 세포 증식을 항체의 부재하에서의 세포의 증식과 비교하여 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 억제한다.
항체를 생산하는 방법 및 항체 생산 세포주
면역화
일부 구체예에서, 인간 항체는 그 게놈내에 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-인간 동물을 M-CSF 항원으로 면역화시켜 생산된다. 바람직한 구체예에서, 비-인간 동물은 XENOMOUSETM 동물(캘리포니아주 프레몬트에 소재한 아브게닉스 인코포레이티드)이다. 이용될 수 있는 다른 비-인간 동물은 메다렉스(뉴저지주 프린스턴에 소재한 메다렉스 인코포레이티드)에 의해 생산된 형질전환 마우스이다.
XENOMOUSETM 마우스는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌의 큰 단편을 포함하는 조작된 마우스 스트레인이며 마우스 항체 생산이 결핍되어 있다. 예를 들어, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) 및 미국 특허 제 5,916,771호, 5, 939,598호, 5,985,615호, 5,998,209호, 6,075,181호, 6,091,001호, 6,114,598호, 6,130,364호, 6,162,963호 및 6,150,584호를 참고한다. 또한 WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, 및 WO 00/037504를 참고한다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 면역글로불린 좌를 포함하는 비-인간 형질전 환 동물을 M-CSF 항원으로 면역화시켜 비-인간, 비-마우스 동물로부터 항-M-CSF 항체를 만드는 방법을 제공한다. 전술한 문헌에 개시된 방법을 이용하여 그러한 동물을 생산할 수 있다. 이들 문헌에 개시된 방법은 미국 특허 제5,994,619호에 개시된 대로 변형될 수 있다. 미국 특허 제5,994,619호는 돼지 및 소로부터 유래된, 신규한 배양 속 세포 덩어리(CICM) 세포와 세포주를 생산하는 방법을 개시하며, 이종성 DNA가 삽입된 형질전환 CICM 세포를 개시한다. CICM 형질전환 세포는 클론된 형질전환 배아, 태아, 및 자손을 생산하기 위해 이용될 수 있다. '619 특허는 또한 이종성 DNA를 후손에 전달할 수 있는 형질전환 동물을 생산하는 방법을 개시한다. 바람직한 구체예에서, 비-인간 동물은 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다.
XENOMOUSETM 마우스는 완전히 인간 항체의 성인형 인간 레퍼토리를 생산하며 항원-특이적 인간 항체를 생성한다. 일부 구체예에서, XENOMOUSETM 마우스는 인간 중쇄 좌 및 카파 경쇄 좌의 메가베이스 크기의 생식세포 형태 효모 인공 염색체(YAC) 단편의 도입을 통해 인간 항체 V 유전자 레퍼토리의 약 80%를 함유한다. 다른 구체예에서, XENOMOUSETM 마우스는 람다 경쇄 좌의 대략 전부를 추가로 함유한다. Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J Exp. Med. 188 :483-495(1998), 및 WO 98/24893을 참고하며 이들은 참고로 여기에 통합된다.
일부 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 "미니좌"를 갖는 동물이다. 미니좌 접근법에서, 외인성 Ig 좌는 Ig 좌로부터의 개별 유전자의 포함을 통해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 도메인, 및 두번째 불변 도메인(바람직하게는 감마 불변 도메인)이 동물내로 삽입되기 위한 구조체내로 형성된다. 이 방법은 특히 미국 특허 제5,545,807호, 5,545,806호, 5,569,825호, 5,625,126호, 5,633,425호, 5,661,016호, 5,770,429호, 5,789,650호, 5,814,318호, 5,591,669호, 5,612,205호, 5,721,367호, 5,789,215호 및 5,643,763호에 개시되며 이들은 참고로 여기에 통합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항-M-CSF 항체를 만드는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 항체 생산을 허용하는 조건하에서 후술하는 대로 M-CSF 항원으로 면역된다. 항체-생산 세포는 동물로부터 단리되고, 골수종과 융합되어 하이브리도마를 생산하며, 대상 항-M-CSF 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산이 단리된다. 이들 핵산은 비-인간 서열의 양을 감소시키기 위하여, 즉 인간에서 면역 반응을 감소시키기 위하여 항체를 인간화하기 위하여 당업계에 공지되고 하기에서 추가로 개시되는 기법을 이용하여 후속하여 조작된다.
일부 구체예에서, M-CSF 항원은 단리되고/되거나 정제된 M-CSF이다. 바람직한 구체예에서, M-CSF 항원은 인간 M-CSF이다. 일부 구체예에서, M-CSF 항원은 M-CSF의 단편이다. 일부 구체예에서, M-CSF 단편은 M-CSF의 세포외 도메인이다. 일부 구체예에서, M-CSF 단편은 M-CSF의 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 다른 구체예에서, M-CSF 항원은 그 표면상에 M-CSF 또는 그 면역원성 단편을 발현하거나 과 다발현하는 세포이다. 일부 구체예에서, M-CSF 항원은 M-CSF 융합 단백질이다. M-CSF는 공지 기법을 이용하여 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다. 재조합 M-CSF는 시판된다.
동물의 면역화는 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다. 예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990를 참고한다. 마우스, 쥐, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 같은 비-인간 동물을 면역화시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 상기한 Harlow and Lane 및 미국 특허 제5,994,619호를 참고한다. 바람직한 구체예에서, M-CSF 항원은 면역 반응을 자극하기 위하여 아쥬반트(adjuvant)와 함께 투여된다. 예시적인 아쥬반트는 완전 또는 불완전 프로인트 아쥬반트, RIBI(무라밀 디펩티드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)을 포함한다. 그러한 아쥬반트는 폴리펩티드를 국소적 저장소에 격리시켜 폴리펩티드가 신속하게 분산되는 것을 방지하거나, 또는 숙주가 대식세포 및 면역 시스템의 다른 성분에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 자극하는 물질을 함유할 수도 있다. 바람직하게는, 만일 폴리펩티드가 투여되면, 면역화 스케쥴은 몇주에 걸친 폴리펩티드의 2회 이상의 투여에 관련될 것이다. 실시예 I은 XENOMOUSETM 마우스에서 항-M-CSF 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 예시한다.
항체의 생산 및 항체-생산 세포주
동물을 M-CSF 항원으로 면역화시킨 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포는 동물로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, 항-M-CSF 항체-함유 혈청은 출혈 또는 동물의 사멸에 의해 동물로부터 얻어진다. 혈청은 동물로부터 얻어진 대로 이용될 수 있으며, 면역글로불린 분획은 혈청으로부터 얻어지거나, 또는 항-M-CSF 항체는 혈청으로부터 정제될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체-생산 불멸화 세포주는 면역된 동물로부터 단리된 세포로부터 제조된다. 면역화 후, 동물을 죽이고 림프절 및/또는 비장 B 세포를 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법은 암유전자로 이들을 형질감염시키거나, 암유발성 바이러스로 이들을 감염시키거나, 불멸화된 세포를 선택하는 조건하에서 이들을 배양하거나, 이들을 발암성 또는 돌연변이성 화합물에 노출하거나, 이들을 불멸화된 세포, 예, 골수종 세포와 융합하거나 종양 억제자 유전자를 불활성화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기한 Harlow and Lane을 참고한다. 만일 골수종 세포와의 융합을 이용하면, 골수종 세포는 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다(비분비성 세포주). 불멸화된 세포는 M-CSF, 그 일부, 또는 M-CSF를 발현하는 세포를 이용하여 스크리닝한다. 바람직한 구체예에서, 초기 스크리닝은 효소-연결된 면역분석(ELISA) 또는 방사성면역분석을 이용하여 실시된다. ELISA 스크리닝의 예는 여기에 참고로 통합되는 WO 00/37504호에 제공된다.
항-M-CSF 항체-생산 세포, 예, 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고 추가로 후술한 대로 강한 성장, 높은 항체 생산 및 원하는 항체 특성을 비롯한 바람직한 특성에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마는 공통유전자 동물에서 생체내에서, 면역 시스템이 없는 동물, 예, 누드 마우스에서, 또는 생체외 세포 배양물에서 확장될 수 있다. 하이브리도마를 선택, 클로닝 및 확장하는 방법은 공지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 면역화된 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비-인간 동물이며 비장 B 세포는 비-인간 동물과 동일 종으로부터의 골수종 세포주에 융합된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 면역된 동물은 XENOMOUSETM 동물이며 골수종 세포주는 비분비성 마우스 골수종이다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 골수종 세포주는 P3-X63-AG8-653이다. 실시예 I을 참고한다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 (a) 여기서 개시된 비-인간 형질전환 동물을 M-CSF, M-CSF의 일부 또는 M-CSF를 발현하는 세포 또는 조직으로 면역화시키는 단계; (b) 형질전환 동물이 M-CSF에 대한 면역 반응을 형성하도록 하는 단계; (c) 형질전환 동물로부터 B 림프구를 단리하는 단계; (d) B 림프구를 불멸화시키는 단계; (e) 불멸화된 B 림프구의 개별 모노클로날 집단을 생성하는 단계; 및 (f) M-CSF에 대해 형성된 항체를 확인하기 위하여 불멸화된 B 림프구를 스크리닝하는 단계를 포함하는, M-CSF에 대해 형성된 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편을 생산하는 세포주를 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 항-M-CSF 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 하이브리도마는 전술한 대로 마우스 하이브리도마이다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비-인간, 비-마우스 종에서 생산된다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 인간 하이브리도마이다.
다른 바람직한 구체예에서는, 형질전환 동물을 M-CSF로 면역화시키고, 일차 세포, 예, 비장 또는 말초 혈액 세포를 면역된 형질전환 동물로부터 단리하고, 원하는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 개별 세포를 확인한다. 각 개별 세포로부터의 폴리아데닐화된 mRNA를 단리하고 가변 영역 서열에 어닐하는 센스 프라이머, 예, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 FR1 영역의 대부분 또는 모두를 인식하는 축퇴 프라이머 및 불변 또는 연결 영역 서열에 어닐하는 안티센스 프라이머를 이용하여 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 실시한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 cDNA를 이어서 임의의 적합한 숙주 세포, 예, 골수종 세포에 클로닝하고, 중쇄 및 κ 또는 λ 불변 도메인과 같은 각각의 면역글로불린 불변 영역을 갖는 키메라 항체로서 발현시킨다. 여기서 참고로 통합되는 Babcook, J. S. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48, 1996를 참고한다. 이어서 항 M-CSF 항체를 확인하고 여기서 개시된 대로 단리한다.
다른 구체예에서, 파아지 디스플레이 기법을 이용하여 M-CSF에 대해 변하는 친화성을 갖는 항체 레퍼토리를 함유하는 라이브러리를 제공한다. 그러한 레퍼토리의 생산을 위해, 면역된 동물로부터의 B 세포를 불멸화시키는 것은 필요하지 않다. 오히려, 일차 B 세포를 직접 DNA 공급원으로 이용할 수 있다. 예를 들어, 비장에서 유래한 B 세포로부터 얻어진 cDNA의 혼합물은 발현 라이브러리, 예를 들어, 이.콜리내로 형질감염된 파아지 디스플레이 라이브러리를 준비하기 위해 이용된다. 생성된 세포는 M-CSF에 대한 면역반응성에 대해 시험된다. 그러한 라이브러리로부터의 고 친화성 인간 항체의 확인을 위한 기법은 Griffiths et al.,EMBO J., 13: 3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp.692-698 및 Griffiths et al., ibid, 12: 725-734에 의해 개시된다. 궁극적으로는, 항원에 대해 원하는 양의 결합 친화성을 생산하는 라이브러리로부터의 클론이 확인되며 그러한 결합을 일으키는 생성물을 암호하는 DNA가 회수되며 표준 재조합 발현을 위해 조작된다. 파아지 디스플레이 라이브러리는 또한 이전에 조작된 뉴클레오티드 서열을 이용하여 구성되고 유사한 방식으로 스크리닝될 수 있다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 암호하는 cDNA는 독립적으로 공급되거나 연결되어 파아지 라이브러리에서의 생산을 위한 Fv 유사체를 형성한다.
파아지 라이브러리를 이어서 M-CSF에 대한 최고의 친화성을 갖는 항체에 대해 스크리닝하며 유전 물질을 적절한 클론으로부터 회수한다. 추가의 스크리닝은 단리된 원래의 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 항-M-CSF 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 하이브리도마는 전술한 마우스 하이브리도마이다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비-인간, 비-마우스 종에서 생산된다. 다른 구체예에서, 하이브리도마는 인간 하이브리도마이다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 항체를 만드는 재조합 방법
핵산
본 발명은 또한 항-M-CSF 항체를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 상이한 핵산 분자들이 항-M-CSF 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 암호한다. 다른 구체예에서, 동일한 핵산 분자가 항-M-CSF 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 암 호한다. 한 구체예에서, 핵산은 본 발명의 M-CSF 항체를 암호한다.
일부 구체예에서, 경쇄의 가변 도메인을 암호하는 핵산 분자는 인간 VκL5, O12, L2, B3, A27 유전자와 Jκ1, Jκ2, Jκ3 또는 Jκ4 유전자를 포함한다.
일부 구체예에서, 경쇄를 암호하는 핵산 분자는 생식세포 아미노산 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 생식세포 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 비보존적 아미노산 치환 및/또는 1,2 또는 3개 비보존적 치환을 포함하는 VL 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치환은 CDR 영역, 골격 영역, 또는 불변 도메인 내에 있을 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9. 14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1 중 하나의 VL에서 발견되는 변이와 동일한 하나 이상의 변이를 생식세포 서열과 비교할 때 포함하는 VL 아미노산 서열을 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120. 1, 9.14.4, 8.10.3, 또는 9.7.2 중 하나의 VL에서 발견되는 아미노산 돌연변이 적어도 세개를 생식세포 서열에 비교하여 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 모노클로날항체 252 (서열 번호 4), 88 (서열 번호 8), 100 (서열 번호 12), 3.8.3 (서열 번호 16), 2.7.3 (서열 번호 20), 1.120.1 (서열 번호 24), 9.14.4I (서열 번호 28), 8.10.3F (서열 번호 32), 9.7.2IF (서열 번호 36), 9.14.4 (서열 번호 28), 8.10.3 (서열 번호 44), 9.7.2 (서열 번호 48), 9.7.2C-Ser (서열 번호 52), 9.14.4C-Ser (서열 번호 56), 8.10. 3C-Ser (서열 번호 60), 8.10.3-CG2 (서열 번호 60), 9.7.2-CG2 (서열 번호 52), 9.7. 2-CG4 (서열 번호 52), 9.14.4- CG2 (서열 번호 56), 9.14.4-CG4 (서열 번호 56), 9.14.4-Ser (서열 번호 28), 9.7.2-Ser (서열 번호48), 8.10.3-Ser (서열 번호 44), 8.10.3-CG4 (서열 번호 60) 8.10.3FG1 (서열 번호 32) 또는 9.14.4G1 (서열 번호 28)의 VL 아미노산 서열 또는 그 일부를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 일부는 적어도 CDR2 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산은 상기 항체의 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 상기 일부는 CDR1-CDR3를 포함하는 인접 부위이다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60 중 하나의 경쇄 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 또는 47의 경쇄 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부를 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 도 1에 나타난 VL 아미노산 서열 또는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1 중 어느 하나의 VL 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열, 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60 중 하나의 아미노산 서열을 암호한다. 본 발명의 핵산 분자는 전술한 것과 같은 매우 엄격한 조건하에서 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 경쇄 아미노산 서열을 암호하는 핵산 서열에 하이브리드하거나, 또는 서열 번호 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 또는 47의 경쇄 핵산 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
다른 구체예에서, 핵산은 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체의 전장 경쇄, 또는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60의 아미노산 서열 및 경쇄의 불변 영역을 포함하는 경쇄, 또는 돌연변이를 포함하는 경쇄를 암호한다. 또한, 핵산은 서열 번호 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 또는 47의 경쇄 뉴클레오티드 서열 및 경쇄의 불변 영역을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 경쇄를 암호하는 핵산 분자는 돌연변이를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 인간 VH 1-18, 3-33, 3-11, 3-23, 3-48, 또는 3-7 유전자 서열 또는 그로부터 유래한 서열을 포함하는 중쇄(VH)의 가 변 도메인을 암호한다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 인간 VH1-18 유전자, DH4-23 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 VH 3-33 유전자, 인간 DH1-26 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 VH 3-11 유전자, 인간 DH7-27 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 VH 3-11 유전자, 인간 DH 7-27 유전자 및 인간 JH6 유전자; 인간 VH 3-23 유전자, 인간 DH1-26 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 VH 3-7 유전자, 인간 DH6-13 유전자 및 인간 JH4 유전자; 인간 VH3-11 유전자, 인간 DH7-27 유전자, 및 인간 JH4b 유전자 ; 인간 VH3-48 유전자, 인간 DH1-26 유전자, 및 인간 JH4b 유전자; 인간 VH3-11 유전자, 인간 DH6-13 유전자, 및 인간 JH6b 유전자 또는 상기 인간 유전자로부터 유래한 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 인간 V,D 또는 J 유전자의 생식세포 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호한다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이는 VH 영역에 있다. 일부 구체예에서, 상기 돌연변이는 CDR 영역에 있다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 생식세포 서열과 비교하여 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3- CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 VH에서 발견되는 아미노산 돌연변이와 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 암호한다. 일부 구체예에서, 핵산은 상기에서 열거한 모노클로날 항체 중 하나에서 발견되는 적어도 세 개의 아미노산 돌연변이와 동일한 아미노산 돌연변이 적어도 세개를 생식세포 서열과 비교하여 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 항체 252 (서열 번호 4), 88 (서열 번호 8), 100 (서열 번호 12), 3.8.3 (서열 번호 16), 2.7.3 (서열 번호 20), 1.120.1 (서열 번호 24), 9.14.4I (서열 번호 28), 8.10.3F (서열 번호 32), 9.7.2IF (서열 번호 36), 9.14.4 (서열 번호 28), 8.10.3 (서열 번호 44), 9.7.2 (서열 번호 48), 9.7. 2C-Ser (서열 번호 52), 9.14.4C-Ser (서열 번호 56), 8.10.3C-Ser (서열 번호 60), 8.10.3-CG2 (서열 번호 60), 9.7.2-CG2 (서열 번호 52), 9.7.2-CG4 (서열 번호 52), 9.14.4- CG2 (서열 번호 56), 9.14.4-CG4 (서열 번호 56), 9.14.4-Ser (서열 번호 28), 9.7.2-Ser (서열 번호48), 8.10.3-Ser (서열 번호 44), 8.10.3-CG4 (서열 번호 60) 8.10.3FG1 (서열 번호 32) 또는 9.14.4G1 (서열 번호 28)의 VH 아미노산 서열, 또는 보존적 아미노산 돌연변이 및/또는 전체 셋 또는 그 미만의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 서열의 적어도 일부를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 서열은 하나 이상의 CDR 영역, 바람직하게는 CDR3 영역, 모든 세 CDR 영역, CDR1-CDR3를 포함하는 연속 부위, 또는 전체 VH 영역을 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102 중 하나의 아미노산 서열을 암호하는 중쇄 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 또는 101의 중쇄 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 부위는 VH 영역, CDR3 영역, 모든 세 CDR 영역, 또는 CDR1-CDR3를 포함하는 연속 영역을 암호한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 도 4에 나타난 VH 아미노산 서열 또는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102 중 어느 하나의 VH 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 암호한다. 본 발명의 핵산 분자는 전술한 것과 같은 매우 엄격한 조건하에서 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 중쇄아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 하이브리드하거나 또는 서열 번호 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 또는 101의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
다른 구체예에서, 핵산은 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택된 항체 의 전장 중쇄, 또는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 중쇄의 불변 영역, 또는 돌연변이를 포함하는 중쇄를 암호한다. 또한, 핵산은 서열 번호 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 또는 101의 중쇄 뉴클레오티드 서열 및 경쇄의 불변 영역을 암호하는 뉴클레오티드 서열, 또는 돌연변이를 포함하는 중쇄를 암호하는 핵산 분자를 포함할 수도 있다.
항-M-CSF 항체의 중쇄 또는 전체 경쇄 또는 그 일부를 암호하는 핵산 분자는 그러한 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다양한 구체예에서, 핵산 분자는 M-CSF로 면역된 동물로부터 단리된 B 세포로부터 또는 항-M-CSF 항체를 발현하는 그러한 B 세포로부터 유래된 불멸화 세포로부터 단리된다. 항체를 암호하는 mRNA를 단리하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등을 참고한다. mRNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 항체 유전자의 cDNA 클로닝에 사용하기 위한 cDNA를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 그 융합 파트너의 하나로서 비-인간 형질전환 동물로부터의 인간 면역글로불린-생산 세포를 갖는 하이브리도마로부터 단리된다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 인간 면역글로불린 생산 세포는 XENOMOUSETM 동물로부터 단리된다. 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린-생산 세포는 전술한 대로, 비-인간, 비-마우스 형질전환 동물로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 핵산은 비-인간, 비-형질전환 동물로부터 단리된다. 비-인간, 비-형질전환 동물로부터 단리된 핵산 분자는 예를 들어, 인간화 항체 를 위해 이용될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체의 중쇄를 암호하는 핵산은 임의의 공급원으로부터의 중쇄 불변 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 인프레임으로 연결된 본 발명의 VH 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 항-M-CSF 항체의 경쇄를 암호하는 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터의 경쇄 불변 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열에 인프레임으로 연결된 본 발명의 VL 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인을 암호하는 핵산 분자는 전장 항체 유전자로 "전환"된다. 한 구체예에서, VH 또는 VL 도메인을 암호하는 핵산 분자를, VH 분절이 벡터내의 CH 분절에 작동가능하게 연결되고 VL 분절이 벡터내의 CL 분절에 작동가능하게 연결되도록 각각 중쇄 불변(CH) 도메인 또는 경쇄(CL) 불변 도메인을 이미 암호하는 발현 벡터내로 삽입시켜 전장 항체 유전자로 전환시킨다. 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 암호하는 핵산 분자는 VH 및/또는 VL 도메인을 암호하는 핵산 분자를 표준 분자 생물학적 기법을 이용하여 CH 및/또는 CL 도메인을 암호하는 핵산 분자에 연결, 예, 결찰시켜 전장 항체 유전자로 전환시킨다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 불변 도메인 유전자의 핵산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , NIH Publ. No. 91-3242,1991를 참고한다. 이어서 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 그들이 도입된 세포로부터 발현시키고 항-M-CSF 항체를 단리한다.
핵산 분자를 이용하여 항-M-CSF 항체를 대량으로 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 핵산 분자는 또한 키메라 항체, 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, 이뮤노어드헤신, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 만일 핵산 분자가 비-인간, 비-형질전환 동물로부터 유래되면, 핵산 분자는 후술하는 바대로 항체 인간화에 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특이적 항체 서열을 위한 프로브 또는 PCR 프라이머로서 이용된다. 예를 들어, 핵산은 진단 방법에서의 프로브로서 또는 이용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서, 특히 항-M-CSF 항체의 가변 도메인을 암호하는 추가의 핵산 분자를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 대상 항체의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 또는 1.120.1의 CDR중 하나 이상의 모두 또는 일부, 또는 여기서 개시된 그 변이체를 암호한다.
벡터
본 발명은 본 발명의 항-M-CSF 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 항체의 경 쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 추가로 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 그 프로브를 암호하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체, 또는 항원-결합 부위는 전술한 대로 얻어진, 부분 길이 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호하는 DNA를 발현 벡터내로 삽입시켜 유전자가 전사 및 번역 조절 서열과 같은 필요한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스(AAV), 컬리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스와 같은 식물 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀, 등을 포함한다. 항체 유전자는 벡터내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 하도록 벡터내로 연결된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 이용된 발현 숙주세포에 적합하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터내로 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터내로 삽입된다(예, 항체 유전자 단편과 벡터상의 상보성 제한 부위의 연결, 또는 제한 부위가 없으면 블런트 말단 연결).
편리한 벡터는 전술한 대로, 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 가진, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호하는 것이다. 그러한 벡터에서, 스플라이싱은 대개 삽입 된 J 영역내의 스플라이스 공여 부위와 인간 C 도메인에 선행하는 스플라이스 수용 부위 사이에서, 그리고 또한 인간 CH 엑손 내에서 발생하는 스플라이스 영역에서 발생한다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 암호화 영역의 하부의 천연 염색체 부위에서 발생한다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진하는 시그널 펩티드를 암호할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 벡터 내로 클론되어 시그널 펩티드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인프레임으로 연결되도록 할 수 있다. 시그널 펩티드는 면역글로불린 시그널 펩티드 또는 이종성 시그널 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 시그널 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 고안은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)(CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV 40)(SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은, 포유류 세포에서 고농도의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 성분 및 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 성분 및 그 서열의 추가 설명을 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,168,062호, 미국 특허 제4,510,245호 및 미국 특허 제4,968,615호를 참고한다. 식물의 형질전환뿐만 아니라 프로모터 및 벡터의 설명을 비롯한 식물에서의 항체의 발현 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 참고로 여기에 통합되는 미국 특허 제6,517,529호를 참고한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예, 효모 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법 또한 공지되어 있다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 오리진) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가 서열을 보유할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참고). 예를 들어, 일반적으로 선별 마커 유전자는 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을, 그 벡터가 도입되는 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr-숙주 세포에서 사용), 네오마이신 내성 유전자(G418 선별을 위함), 및 글루타메이트 신세타제 유전자를 포함한다.
비- 하이브리도마 숙주 세포 및 단백질을 재조합적으로 생산하는 방법
항-M-CSF 항체를 암호하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유류, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염을 위해 이용될 수 있다. 형질전환은 숙주 세포내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 임의의 공지 방법에 의할 수 있다. 포유류 세포내로 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 방법은 공지되어 있으며 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 -매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드를 리포좀내로 캡슐화시키기, 및 핵내로 DNA의 직접 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호를 참고한다(이들은 참고로 여기에 통합됨). 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이오리스틱 형질전환, 직접 주입, 전기천공 및 바이러스 형질전환이 있으며 공지되어 있다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환하는 방법 또한 공지되어 있다.
발현용 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 공지되어 있으며 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)로부터 이용가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예, Hep G2), A549 세포, 및 많은 다른 세포주를 포함한다. 특히 선호되는 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 가질 것인지를 결정하여 선택된다. 이용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예, Sf9 세포이다. 항체 유전자를 암호하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기에 충분한 기간동안 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장한 배양 배지내로 항체가 분비되기에 충분한 기간동안 숙주 세포를 배양하여 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 식물 숙주 세포는 예를 들어, 담배, 아라비돕시스, 좀개구리밥속의 수초, 옥수수, 밀, 감자 등을 포함한다. 박테리아 숙주 세포는 이.콜리 및 스트렙토마이세스 종을 포함한다. 효모 숙주 세포는 쉬조사카로마이세스 폼베, 사카로마이세스 세레비제 및 피치아 파스토리스를 포함한다.
또한, 생산 세포주로부터 본 발명의 항체(또는 그로부터의 다른 부위)의 발현은 많은 공지 기법을 이용하여 증가될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신세타제 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 일부 조건하에서 발현을 증가시키기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 전체 또는 부분적으로 유럽 특허 제0 216 846호, 0 256 055호, 및 0 323 997호 및 유럽 특허 출원 제 89303964.4호와 관련하여 개시된다.
상이한 세포주에 의해 또는 형질전환 동물에서 발현된 항체는 서로 상이한 당화를 가질 것이다. 하지만, 여기서 제공된 핵산 분자에 의해 암호된 모든 항체, 또는 여기서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 당화 상태 또는 패턴 또는 변형에 관계없이 본 발명의 일부이다.
형질전환 동물 및 식물
본 발명의 항-M-CSF 항체는 또한 대상 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 위해 형질전환인 포유류 또는 식물의 생성을 통해 그리고 그로부터 회수가능한 형태로 항체를 생산함으로써 형질전환하게 생산될 수 있다. 포유류에서 형질전환 생산과 관련하여, 항-M-CSF 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유류의 우유에서 생산되고 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호, 및 제5,741,957호를 참고한다. 일부 구체예에서, 인간 면역글로불린 좌를 포함하는 비-인간 형질전환 동물은 전술한 대로 M-CSF 또는 그 면역원성 부위로 면역된다. 식물, 효모 또는 진균/조류에서 항체를 만드는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,046,037호 및 제5,959,177호에 개시된다.
일부 구체예에서, 비-인간 형질전환 동물 또는 식물은 본 발명의 항-M-CSF 항체를 암호하는 핵산 분자 하나 이상을 표준 형질전환 기법에 의해 동물 또는 식물내로 도입함으로써 생산된다. 상기한 Hogan 및 미국 특허 제6,417,429호를 참고한다. 형질전환 동물을 만들기 위해 이용되는 형질전환 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포일 수 있다. 형질전환 비-인간 유기체는 키메라, 비키메라 이종접합체, 및 비키메라 동종접합체일 수 있다. 예를 들어, Hogan et al.,Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2ed. , Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000); 및 Pinkert, Transgenic Animal Technology : A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)를 참고한다. 일부 구체예에서, 형질전환 비-인간 동물은 대상 중쇄 및/또는 경쇄를 암호하는 구조체를 표적화시킴으로써 표적화된 파괴 및 치환을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 형질전환 동물은 M-CSF, 바람직하게는 인간 M-CSF에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 포함하며 발현한다. 일부 구체예에서, 형질전환 동물은 단일쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체와 같은 변형 항체를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 항-M-CSF 항체는 임의의 형질전환 동물에서 만들어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스, 쥐, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 비-인간 형질전환 동물은 혈액, 우유, 소변, 타액, 눈물, 점액 및 다른 체액에서 상기 암호된 폴 리펩티드를 발현한다.
파아지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 파아지에서 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, M-CSF 또는 그 일부로 라이브러리를 스크리닝하는 단계, M-CSF에 결합하는 파아지를 단리하는 단계, 및 파아지로부터 항체를 얻는 단계를 포함하는, 항-M-CSF 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 생산하는 방법을 제공한다. 예로서, 파아지 디스플레이 기법에 사용하기 위한 항체의 라이브러리를 제조하는 한 가지 방법은 인간 면역글로불린 좌를 포함하는 비-인간 동물을 M-CSF 또는 이의 항원 부위로 면역화시켜 면역 반응을 생성하는 단계, 면역된 동물로부터 항체 생산 세포를 추출하는 단계, 추출된 세포로부터 RNA를 단리하는 단계, RNA를 역전사하여 cDNA를 생산하는 단계, 프라이머를 이용하여 cDNA를 증폭하는 단계, 및 cDNA를 파아지 디스플레이 벡터내로 삽입하여 항체가 파아지에서 발현되도록 하는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항-M-CSF 항체는 이 방식으로 얻어질 수 있다.
본 발명의 재조합 항-M-CSF 인간 항체는 재조합 조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 바람직하게는 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 이용하여 생성된, scFv 파아지 디스플레이 라이브러리이다. 그러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 시판 키트가 있다(예, 파마시아 재조합 파아지 항체 시스템, 카타로그 번호 27-9400-01; 및 스트라타젠 SurfZAPTM 파 아지 디스플레이 키트, 카타로그 번호 240612). 또한 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데 이용될 수 있는 다른 방법 및 시약이 있다(예, 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공개 WO92/18619, WO91/17271, WO92/20791, WO92/15679, WO93/01288, WO92/01047, WO92/09690; Fuchs et al.,Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum.Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993); Hawkins et al.,J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580(1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377(1991); Hoogenboom et al., Nuc.Acid Res. 19:4133-4137(1991); 및 Barbas et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991)참고).
한 구체예에서, 원하는 특징을 가진 인간 항-M-CSF 항체를 단리하기 위하여, 여기서 개시된 인간 항-M-CSF 항체는 먼저 PCT 공개 WO93/06213에 개시된 에피토프 임프린팅 방법을 이용하여, M-CSF에 대해 유사한 결합 활성을 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선택하기 위해 이용된다. 이 방법에서 이용된 항체 라이브러리는 바람직하게는 PCT 공개 WO92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990) 및 Griffiths et al., EMBO J.12:725-734(1993)에 개시된 대로 제조되고 스크리닝된 scFv 라이브러리이다. scFv 항체 라이브러리는 바람직하게는 인간 M-CSF를 항원으로 이용하여 스크리닝된다.
일단 초기 인간 VL 및 VH 도메인이 선택되면, "믹스 앤드 매치" 실험이 실시되며, 여기서는 처음에 선택된 VL 및 VH 분절의 상이한 쌍들을 M-CSF 결합에 대해 스크리닝하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 추가로, 항체의 질을 추가 개선하기 위하여, 바람직한 VL/VH 쌍의 VL 및 VH 분절이 임의로 돌연변이될 수 있으며, 바람직하게는 천연 면역 과정동안 항체의 친화성 성숙을 일으키는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 과정에서 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역내에서 돌연변이될 수 있다. 이러한 생체외 친화성 성숙은 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭시켜 이루어질 수 있으며, 상기 프라이머는 일부 위치에서 4 뉴클레오티드 염기의 임의 혼합물로 "스파이크(spike)"되어 생성된 PCR 생성물은 임의 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역내로 도입된 VH 및 VL 분절을 암호한다. 이들 임의로 돌연변이된 VH 및 VL 분절은 M-CSF와의 결합에 대해 재스크리닝될 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 본 발명의 항-M-CSF 항체의 스크리닝 및 단리 후, 선택된 항체를 암호하는 핵산은 디스플레이 패키지(예, 파아지 게놈으로부터)로부터 회수되고, 포준 재조합 DNA 기법에 의해 다른 발현 벡터내로 서브클로닝될 수 있다. 필요하면, 핵산은 추가로 조작되어, 후술하는 대로 본 발명의 다른 항체 형태를 생성할 수 있다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위하여, 항체를 암호하는 DNA는 재조합 발현 벡터내로 클로닝되며 전술한 대로 포유류 숙주 세포내로 도입된다.
클래스 스위칭
본 발명의 다른 양태는 항-M-CSF 항체의 클래스 또는 서브클래스를 다른 클래스 또는 서브클래스로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, CL 또는 CH 를 암호하는 임의의 핵산 서열을 포함하지 않는 VL 또는 VH를 암호하는 핵산 분자를 공지의 방법을 이용하여 단리한다. 이어서 핵산 분자를 원하는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스로부터의 CL 또는 CH를 암호하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 이것은 전술한 대로, CL 또는 CH 쇄를 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 항-M-CSF 항체는 IgG로 클래스 전환될 수 있다. 또한, 클래스 스위칭은 하나의 IgG 서브클래스를 다른 것으로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2로 전환시키기 위해 이용될 수 있다. 원하는 아이소타입을 포함하는 본 발명의 항체를 생산하기 위한 다른 방법은 항-M-CSF 항체의 중쇄를 암호하는 핵산 및 항-M-CSF 항체의 경쇄를 암호하는 핵산을 단리하는 단계, VH 영역을 암호하는 서열을 단리하는 단계, 원하는 아이소타입의 중쇄 불변 도메인을 암호하는 서열에 VH 서열을 연결하는 단계, 경쇄 유전자 및 중쇄 구조체를 세포에서 발현시키는 단계, 및 원하는 아이소타입을 가진 항-M-CSF 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체는 중쇄의 위치 228(EU-넘버링 협약에 따름)의 세린이 프롤린으로 바뀐다. 따라서, IgG4의 Fc 영역내의 CPSC 서브-서열은 IgG1의 서브 서열인 CPPC가 된다. (Aalberse, R. C. and Schuurman, J. , Immunology, 105: 9-19 (2002) ). 예를 들어, 서열 번호 46의 잔기 243의 세린(EU-넘버링 협약에서 잔기 228에 해당)은 프롤린이 될 것이다. 유사하게, 서열 번호 38의 잔기 242의 세린(EU-넘버링 협약에서 잔기 228에 해당)은 프롤린이 될 것이다. 일부 구체예에서, IgG4 항체의 골격 영역은 생식세포 골격 서열로 역-돌연변이될 수 있다. 일부 구체예는 역돌연변이 골격 영역 및 Fc 영역에서 세린에서 프롤린으로의 변화 둘다를 포함한다. 예, 표 1의 서열 번호 54(항체 9.14.4C-Ser) 및 서열 번호 58 (항체 8.10.3C-Ser) 참고.
탈면역화된 항체
감소된 면역원성을 갖는 항체를 생산하는 다른 방법은 항체의 탈면역화이다. 본 발명의 다른 양태에서, 항체는 PCT 공개 W098/52976 및 WO00/34317에 개시된 기법을 이용하여 탈면역될 수 있다(전체가 참고로 여기에 통합됨).
돌연변이된 항체
다른 구체예에서, 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포는 돌연변이된 항-M-CSF 항체를 만들기 위해 이용될 수 있다. 항체는 항체의 결합 특성을 변화시키기 위하여 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이될 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이는 M-CSF에 대한 항체의 KD를 증가 또는 감소시키기 위하여, koff를 증가 또는 감소 시키기 위하여, 또는 항체의 결합 특이성을 변화시키기 위하여 CDR 영역 중 하나 이상에서 만들어질 수 있다. 부위 특이적 돌연변이유발에서의 기법은 공지되어 있다. 예, Sambrook et al. 및 Ausubel et al., 참고. 바람직한 구체예에서, 돌연변이는 항-M-CSF 항체의 가변 도메인에서 생식세포과 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다. 다른 구체예에서, 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 가변 도메인의 CDR 영역 또는 골격 영역에서 또는 불변 도메인에서 생식세포와 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 하나 이상의 돌연변이가 만들어진다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이가 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 또는 102로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열 또는 그 중쇄 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 또는 101로 제시되는 중쇄 아미노산 서열의 가변 도메인의 CDR 영역 또는 골격 영역에서 생식세포와 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이가 서열 번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 또는 60으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열 또는 그 경쇄 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 또는 47로 제시되는 경쇄 아미노산 서열의 가변 도메인의 CDR 영역 또는 골격 영역에서 생식세포와 비교하여 변화될 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 만들어진다.
한 구체예에서, 골격 영역은 돌연변이되어 생성된 골격 영역이 상응하는 생식세포 유전자의 아미노산 서열을 갖는다. 돌연변이는 항-M-CSF 항체의 반감기를 증가시키기 위해 골격 영역 또는 불변 도메인에서 만들어질 수도 있다. 예를 들어, 여기서 참고로 통합되는 PCT 공개 WO00/09560을 참고한다. 골격 영역 또는 불변 도메인에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 바꾸기 위해, 다른 분자에의 공유적 또는 비공유적 결합을 위한 부위를 제공하기 위해, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)과 같은 특성을 변화시키기 위해 만들어질 수 있다. 본 발명에 따라, 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 중 어느 하나 이상 또는 골격 영역에서 또는 불변 도메인에서 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 돌연변이 전의 항-M-CSF 항체와 비교하여 돌연변이된 항-M-CSF 항체의 VH 또는 VL 도메인에서 1 내지 8개 아미노산 돌연변이가 있다. 상기 중 어느 것에서, 돌연변이는 하나 이상의 CDR 영역에서 발생할 수 있다. 추가로, 돌연변이 중 임의의 것은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 도메인에서 5,4,3,2 또는 1개 아미노산 변화가 있다.
변형된 항체
다른 구체예에서, 다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 항-M-CSF 항체의 모두 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 이뮤노어드헤신이 만들어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 다 른 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체의 VH 도메인은 첫번째 폴리펩티드에 연결되는 한편, 항-M-CSF 항체의 VL 도메인은 VH 와 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항체 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 첫번째 폴리펩티드와 연합하는 두번째 폴리펩티드에 연결된다. 다른 바람직한 구체예에서, VH 도메인은 링커에 의해 VL 도메인으로부터 단리되어 VH 와 VL 도메인은 서로 상호작용할 수 있다(단일쇄 항체 참고). VH-링커-VL 항체는 이어서 대상 폴리펩티드에 연결된다. 융합 항체는 폴리펩티드를 M-CSF-발현 세포 또는 조직으로 보내기에 유용하다. 폴리펩티드는 독소, 성장 인자 또는 다른 조절 단백질과 같은 치료제이거나, 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같이 쉽게 가시화될 수 있는 효소와 같은 진단제일 수 있다. 또한, 두(또는 그 이상) 단일쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이것은 단일 폴리펩티드쇄상의 이가 또는 다가 항체를 생성하기 원하거나 이중특이적 항체를 생성하기 원하면 유용하다.
단일쇄 항체를 생성하기 위하여, (scFv) VH- 및 VL-암호 DNA 단편은 가요성 링커를 암호하는, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호하는 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH와 VL 서열이 VL과 VH 도메인이 가용성 링커에 의해 연결된 채 연속적인 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다. 예, Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) ; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348 : 552-554 (1990) 참고. 단일쇄 항체 는 만일 단일 VH 및 VL이 이용되면 일가이고, 두개의 VH및 VL이 이용되면 이가이며, 둘보다 많은 VH 및 VL이 이용되면 다가이다. M-CSF 및 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.
다른 구체예에서, 다른 변형된 항체는 항-M-CSF 항체-암호 핵산 분자를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, ,"카파 바디(Kappa bodies)" (Ill et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)),"미니바디" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "디아바디" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)), 또는 "야누신스(Janusins)" (Traunecker et al.,EMBO J. 10: 3655- 3659 (1991) 및 Traunecker et al., Int.J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992))는 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 제조될 수 있다.
이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 비롯한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예, Songsivilai & Lachmann,Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al.,J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992) 참고. 또한, 이중특이적 항체는 "디아바디" 또는 "야누신스"로 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 M-CSF의 두 가지 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 또는 9.7.2로부터의 첫번째 중쇄 및 첫번째 경쇄 및 추가의 항체 중쇄 및 경쇄를 갖는다. 일부 구체예에서, 추가의 경쇄 및 중쇄는 또한 전술한 모노클로날 항체 중 하나로부터 유래하지만 첫번째 중쇄 및 경쇄와 상이하다.
일부 구체예에서, 전술한 변형 항체는 여기서 개시된 인간 항-M-CSF 모노클로날 항체로부터, 상기 모노클로날 항체의 아미노산 서열로부터, 또는 상기 모노클로날 항체를 암호하는 핵산 서열에 의해 암호되는 중쇄 또는 경쇄로부터의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 이용하여 제조된다.
유도체화되고 표지된 항체
본 발명의 항-M-CSF 항체 또는 항원-결합 부위는 유도체화되거나 다른 분자(예, 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 그 일부는 M-CSF 결합이 유도체화 또는 표지화에 의해 불리한 영향을 받지 않도록 유도체화된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부는 여기서 개시된 인간 항-M-CSF 항체의 본래 형태 및 변형된 형태 둘다를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 다른 항체(예, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출 제제, 세포독성 제제, 약학 제제, 및/또는 항체 또는 항체 일부가 다른 분자와 연합하는 것을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드(예, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와 같은 하나 이상의 다른 분자 실체에 기능적으로 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 또는 기타에 의해) 연결될 수 있다.
유도체화된 항체의 한 가지 타입은 둘 이상의 항체(예를 들어 이중특이적 항체를 생성하기 위하여, 동일한 타입 또는 상이한 타입)를 교차결합시켜 생산된다. 적합한 교차결합제는 적절한 스페이서(예, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 단리된 두 개의 구별되는 반응성 기를 갖는 이종이기능성인 또는 동종이기능성인(예, 디석신이미딜 수버레이트) 것을 포함한다. 그러한 링커는 일리노이주 록포드에 소재한 피어스 케미컬 컴퍼니에서 구입할 수 있다.
유도체화된 항체의 다른 타입은 표지된 항체이다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위가 유도체화될 수 있는 유용한 검출 제제는 플루오르세인, 플루오르세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란타니드 포스포어 등을 비롯한 형광 화합물을 포함한다. 항체는 또한 서양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알카라인 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등과 같은 검출에 유용한 효소로 표지될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 표지될 경우, 이것은 효소가 구별될 수 있는 반응 생성물을 생산하기 위해 이용하는 추가 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 제제인 서양고추냉이 퍼옥시다제가 존재할 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 착색된 반응 생성물을 야기하며, 이것은 검출가능하다. 항체는 또한 비오틴으로 표지되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적 측정을 통해 검출될 수 있다. 항체는 또한 이차 리포터에 의해 인식되는 선결된 폴리펩티드 에피토프(예, 루이신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)로 표지될 수 있다. 일부 구체예에서, 라벨은 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
항-M-CSF 항체는 또한 방사성표지된 아미노산으로 표지될 수 있다. 방사성표지된 항-M-CSF 항체는 진단 및 치료 목적을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 방사성표지된 항-M-CSF 항체는 X-선 또는 다른 진단 기법에 의해 M-CSF-발현 종양을 검 출하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 방사성표지된 항-M-CSF 항체는 암종 세포 또는 종양을 위한 독소로서 치료적으로 이용될 수 있다. 폴리펩티드를 위한 라벨의 예는 하기의 방사성동위원소 또는 라디오뉴클라이드를 포함하며 이에 한정되지 않는다 - 3H, 14C, l5N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 및 131I.
항-M-CSF 항체는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 카보하이드레이트 기와 같은 화학기로 유도체화될 수 있다. 이들 기는 항체의 생물학적 특성을 개선하기 위하여, 예를 들어 혈청 반감기를 증가시키거나 조직 결합을 증가시키기 위하여 유용하다.
약학 조성물 및 키트
본 발명은 또한 류마티스성 관절염, 골다공증, 또는 아테롬성경화증의 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 인간 항-M-CSF 길항제 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 치료 대상체는 인간이다. 다른 구체예에서는, 대상체는 수의학적 대상체이다. 본 발명의 길항제 항-M-CSF 항체에 의해 치료될 수 있는, 단핵구가 역할을 하는 과다증식성 질병은 임의의 조직 또는 기관에 관여할 수 있으며, 뇌, 폐, 편평 상피세포, 방광, 위장, 췌장, 유방, 머리, 목, 간, 신장, 난소, 전립선, 결장직장, 식도, 부인병, 코인두, 또는 갑상선 암, 흑색종, 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 인간 길항제 항-M-CSF 항체는 유방, 전립선, 결장 및 폐의 암종을 치료 또는 예방하기에 유용하다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 인간 항-M-CSF 모노클로날 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 인간을 비롯한 포유류에서 관절염, 건선 관절염, 라이터 증후군, 통풍, 외상성 관절염, 풍진 관절염 및 급성 윤활막염, 류마티스성 관절염, 류마티스 척추염, 강직척추염, 골관절염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 그람 음성 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 알츠하이머 병, 졸중, 신경외상, 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 뇌 말라리아, 만성 폐렴 염증 질병, 규소폐증, 폐사르코이드증, 뼈 흡수 질병, 골다공증, 재협착, 심장 및 신장 재관류 손상, 혈전증, 사구체신염, 당뇨병, 이식편 대 숙주 반응, 동종이식 거부, 염증성 장 질병, 크론병, 궤양성 결장염, 다발성 경화증, 근육 퇴화증, 습진, 접촉성 피부염, 건선, 일광화상, 또는 결막염 쇼크로 구성되는 군으로부터 선택되는 증상의 치료를 위한 조성물을 포함한다.
치료는 본 발명의 길항제 항-M-CSF 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편 하나 이상을 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여하는 것에 관련될 수 있다. 여기서 이용될 때, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 융화성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균 제제, 등장 및 흡수 지연 제제, 등을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체의 일부 예는 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그 조합이다. 많은 경우에, 등장 제제, 예, 당, 만니톨, 솔비톨과 같은 폴리알콜, 또는 염화나트륨을 조성물내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용가능한 물질의 추가 예는 습윤제 또는 항체의 반감기 또는 효율을 증가시키는 소량의 보조 물질, 예, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액이다.
본 발명의 항-M-CSF 항체 및 이를 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 치료제, 진단제 또는 예방제와 함께 조합되어 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 다른 항신생물제, 항종양제, 항혈관생성제 또는 화학요법제를 포함한다. 그러한 추가 제제는 동일한 조성물에 포함되거나 별도로 투여된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 억제성 항-M-CSF 항체는 백신으로 또는 백신에 대한 아쥬반트로 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태일 수 있으며, 예를 들어, 액체 용액(예, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포좀 및 좌약일 수 있다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 모드 및 치료 용례에 의존한다. 전형적인 바람직한 조성물은 인간의 수동 면역화에 이용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사용 또는 주입용 용액의 형태이다. 바람직한 투여 모드는 비경구이다(예, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내). 바람직한 구체예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, M-CSF 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부위로 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다: (a) 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 단리된 핵산 분자, 경쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 단리된 핵산 분자, 또는 경쇄 및 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 핵산 분자 모두의 유효량을 투여하는 단계, 및 (b) 핵산 분자를 발현 시키는 단계.
치료 조성물은 일반적으로 멸균되어야 하며 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 질서를 가진 구조로 조제될 수 있다. 멸균된 주사용 용액은 적절한 용매내에 필요한 양의 항-M-CSF 항체를 필요에 따라 전술한 성분 중 하나 또는 그 조합과 함께 포함시키고 이어서 여과 멸균시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 전술한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 포함시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 원하는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 모노스테아레이트염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물내에 포함시켜 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체는 많은 치료 용례의 경우 바람직한 투여 경로/모드가 피하, 근육내 또는 정맥내 주입임에도 불구하고, 다양한 공지의 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에게 명백할 것처럼, 투여 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라 다를 것이다.
일부 구체예에서, 항체 조성물 활성 성분은 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 서방성 제제와 같은, 신속한 방출에 대해 항체를 보 호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생물융화성 중합체가 이용될 수 있으며, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 있다. 그러한 제제의 제조를 위한 많은 방법은 특허되고 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson,ed., Marcel Dekker, Inc., New York,1978)를 참고한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체는 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 상기 화합물(및 기타 필요한 성분)은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 포장되거나, 정제로 압착되거나, 직접 대상체의 식사내에 포함될 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 항-M-CSF 항체는 부형제와 함께 포함되고 소화가능한 정제, 볼 정제, 트로치, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 이용될 수 있다. 비경구 투여외의 다른 것에 의해 본 발명 화합물을 투여하기 위해서는, 화합물의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 화합물을 코팅하거나, 그 물질과 화합물을 동시투여하는 것이 필요할 수도 있다.
추가의 활성 화합물은 또한 조성물내로 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-M-CSF 항체는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동 조제되고/되거나 동시투여된다. 이들 제제는 다른 표적에 결합하는 항체, 항신생물질제, 항종양제, 화학요법제, M-CSF를 억제하는 펩티드 유사체, M-CSF에 결합할 수 있는 가용성 c-fms, M-CSF를 억제하는 하나 이상의 화학 제제, 항염증제, 항응고제, 혈압을 낮추 는 제제(즉, 안지오텐신-전환 효소(ACE) 억제제)를 포함한다. 그러한 조합 치료는 동시투여되는 제제 및 항-M-CSF 항체의 보다 낮은 투여량을 필요로 하여 다양한 단일치료와 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
본 발명의 억제성 항-M-CSF 항체 및 이를 포함하는 조성물은 또한 다른치료 요법과 조합되어, 특히 암을 위한 방사선 치료와 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 엔도스타틴 및 안지오스타틴과 같은 항암제 또는 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-플라티늄, 에토포시드, 택솔, 택소테르와 같은 세포독성 약물 및 빈크리스틴, 파네실 트랜스퍼라제 억제제, VEGF 억제제와 같은 알카로이드 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물과 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 비라셉트(Viracept), AZT, 아시클로비어 및 팜시클로비어와 같은 항바이러스 제제, 및 바란트(Valant)와 같은 항패혈증 화합물과 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 "치료 유효량" 또는 "예방 유효량"의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. "치료 유효량"은 필요한 투여량으로 필요한 기간동안 원하는 치료 결과를 얻기 위해 효과적인 양을 말한다. 항체 또는 항체 일부의 치료 유효량은 개체의 질병 증상, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 항체 또는 항체 일부가 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력에 따라 다를 수 있다. 치료 유효량은 또한 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과에 의해 상쇄되는 것이다. "예방 유효량"은 필요한 투여량 및 기간동안 원하는 예방 결과를 얻는데 효과적인 양을 말한다. 일반적으로, 예방적 투 여량은 질병에 앞서 또는 초기 단계에 대상체에서 이용되므로, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
투여량 체계는 최적의 원하는 반응을 제공하기 위해(예, 치료적 또는 예방적 반응) 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 환괴가 투여될 수 있으며, 여러개의 분할된 투여량이 시간에 걸쳐 투여되거나 또는 치료 상황의 긴급함에 의해 표시되는 대로 투여량은 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여량 단위 형태로 조제하는 것이 특히 유익하다. 여기서 이용될 때 투여량 단위 형태는 치료될 포유류 대상체를 위한 단위 투여량으로 적합하게 된 물리적으로 구별되는 단위를 말하며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 화합물의 선결된 양을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태를 위한 상세 사항은 (a) 항-M-CSF 항체 또는 일부의 독특한 특성 및 이루고자 하는 구체적인 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 그러한 항체를 혼합하는 분야의 고유한 제한에 의해 지배되며 직접 의존한다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부의 치료적 또는 예방 유효량을 위한 예시적인 비제한적인 범위는 0.025 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1-25, 0.1 내지 10 또는 0.1 내지 3 mg/kg이다. 투여량 값은 완화될 증상의 타입 및 심각성에 따라 변할 수 있다. 임의의 구체적인 대상체의 경우, 구체적인 투여량 체계는 개체의 필요 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 인간의 전문적인 판단에 따라 시간에 따라 조절되어야 하며, 여기서 개시된 투여량 범위는 단지 예시이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하는 것이 아니다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항-M-CSF 항체 또는 항원-결합 부위 또는 그러한 항체 또는 부위를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 항체 또는 조성물에 더하여, 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 방법 또는 치료 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 키트는 항체 또는 이를 포함하는 조성물 및 후술하는 방법에 사용될 수 있는 진단제를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 키트는 항체 또는 이를 포함하는 조성물 및 후술하는 방법에 사용될 수 있는 하나 이상의 치료제를 포함한다. 본 발명의 한 구체예는 용기, 염증성 질병을 앓고 있는 인간에게 항-M-CSF 항체를 투여하는 설명서, 또는 생물학적 샘플에서 CD14+CD16+ 단핵구의 수를 측정하기 위한 설명서 및 항-M-CSF 항체를 포함하는 키트이다.
본 발명은 또한 일정량의 화학요법제와 함께 본 발명의 항체 일정량을 포함하는, 포유류에서 비정상적인 세포 성장을 억제하는 조성물에 관한 것이며, 이때 화합물, 염, 용매화물, 또는 전구약물의 양 및 화학요법제의 양은 함께 비정상 세포 성장을 억제하는 데 효과적이다. 많은 화학요법제가 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 화학요법제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물, 인터킬레이팅 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 사이클 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물 반응 개질제, 항호르몬, 예, 항안드로겐, 및 항혈관생성제로 구성된 군으로부터 선택된다.
MMP-2(매트릭스-메탈로프로테나제 2) 억제제, MMP-9(매트릭스-메탈로프로테 나제 9) 억제제, 및 COX-II(시클로옥시게나제 II) 억제제와 같은 항혈관생성제는 본 발명의 항-M-CSF 항체와 함께 이용될 수 있다. 유용한 COX-II 억제제의 예는 CELEBREXTM(세레콕시브), 발데콕시브, 및 로페콕시브를 포함한다. 유용한 매트릭스 메탈로프로테나제 억제제의 예는 WO96/33172 (1996.10.24 공개), WO 96/27583 (1996.3.7 공개), 유럽 특허 출원 제97304971.1 (1997.7.8 출원), 유럽 특허 출원 제99308617.2 (1999.10.29 출원), WO98/07697 (1998.2.26 공개), WO98/03516 (1998.1.29 공개), WO98/34918 (1998.8.13 공개), WO 98/34915 (1998.8.13 공개), WO98/33768 (1998.8.6 공개), WO98/30566 (1998.7.16 공개), 유럽 특허 공개 606,046 (1994.7.13 공개), 유럽 특허 공개 931,788 (1999.7.28 공개), WO 90/05719 (1990.5.31 공개), WO99/52910 (1999.10.21 공개), WO99/52889 (1999.10.21 공개), WO99/29667 (1999.6.17 공개), PCT 국제 출원 PCT/IB98/01113 (1998.7.21 출원), 유럽 특허 출원 99302232.1 (1999.3.25 출원), 영국 특허 출원 번호 9912961.1 (1999.6.3 출원), 미국 가출원 60/148,464 (1999.8.12 출원), 미국 특허 제5,863,949호 (1999.1.26 발행), 미국 특허 제5,861,510호 (1999.1.19 발행), 및 유럽 특허 공개 780,386 (1997.6.25 공개)에 개시되며, 이들 모두는 전체가 참고로 여기에 통합된다, 바람직한 MMP 억제제는 관절통을 나타내지 않는 것들이다. 더욱 바람직한 것은 다른 매트릭스-메탈로프로테나제(즉, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, 및 MMP-13)에 대하여 MMP-2 및/또는 MMP-9를 선택적으로 억제하는 것들이다. 본 발명에서 유용한 MMP 억 제제의 일부 특이적인 예는 AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, 및 하기 리스트에 열거되는 화합물이다: 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(l-하이드록시카바모일-시클로펜틸)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-비시클로[3.2.1]옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드; (2R,3R)1-[4-(2-클로로-4-플루오로-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 하이드록시아미드; 4-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카르복실산 하이드록시아미드;3- [[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-시클로부틸)-아미노]-프로피온산;4-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카르복실산 하이드록시아미드; (R)3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-3-카르복실산 하이드록시아미드; (2R, 3R)1-[4-(4-플루오로-2-메틸-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카르복실산 하이드록시아미드;3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-1-메틸-에틸)-아미노]-프로피온산;3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(4-하이드록시카바모일-테트라하이드로-피란-4-일)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-비시클로 [3.2.1]옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드 ; 3-엔도-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-비시클로 [3.2.1] 옥탄-3-카르복실산 하이드록시아미드; 및 (R)3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-푸란-3-카르복실산 하이드록시아미드 및 상기 화합물의 약학적 허용 염 및 용매화물.
본 발명의 인간 항-M-CSF 모노클로날 항체를 포함하는 화합물은 또한 EGF-R 항체, EGF 항체 및 EGF-R 억제제인 분자와 같은, EGF-R(상피 성장 인자 수용체) 반응을 억제할 수 있는 제제; VEGF 수용체 및 VEGF를 억제할 수 있는 분자와 같은 VEGF(혈관 내피 성장 인자)억제제; 및 erbB2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체, 예, HERCEPTINTM(제넨테크사)와 같은 erbB2 수용체 억제제와 같은 시그널 전달 억제제와 함께 이용될 수 있다. EGF-R 억제제는 예를 들어, WO 95/19970 (1995.7.27 공개), WO 98/14451 (1998.4.9 공개), WO98/02434 (1998.1.22 공개), 및 미국 특허 제5,747,498호 (1998.5.5 발행)에 개시되며, 그러한 물질은 여기서 개시된 대로 본 발명에 이용될 수 있다. EGFR-억제제는 모노클로날 항체 C225 및 항-EGFR 22Mab(임클론 시스템 인코포레이티드), ABX-EGF (아브게닉스/셀 제네시스), EMD-7200(머크 케이지에이에이), EMD-5590(머크 케이지에이에이), MDX-447/H-477 (메다렉스 인코포레이티드 및 머크 케이지에이에이), 및 화합물 ZD-1834, ZD-1838 및 ZD-1839 (아스트라제네카), PKI-166 (노바티스), PKI-166/CGP-75166 (노바티스), PTK 787 (노바티스), CP 701 (세파론), 레프루노미드(파마시아/수겐), CI-1033 (워너 램버트 파크 데이비스), CI-1033/PD 183,805 (워너 램버트 파크 데이비스), CL-387,785 (위에스-에이어스트), BBR-1611 (뵈링거 만하임 게엠베하/로쉐), 나미딘 A (브리스톨 마이어스 스퀴브), RC-3940-Ⅱ(파마시아), BIBX-1382 (뵈링거 잉겔하임), OLX-103(머크 & 컴퍼니), VRCTC-310 (벤텍 리서치), EGF 융합 독소 (세라겐 인코포레이티드), DAB-389 (세라겐/리간드), ZM-252808 (임페리얼 캔서 리서 치 펀드), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (파커 휴스 캔서 센터), WHI-P97 (파커 휴스 캔서 센터), GW-282974 (글락소), KT-8391(쿄와 하코) 및 EGF-R 백신 (요크 메디컬/센트로 드 임뮤노로지아 몰에큘라(CIM))를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이들 및 기타 EGF-R 억제제는 본 발명에 이용될 수 있다.
VEGF 억제제, 예, SU-5416 및 SU-6668 (수겐 인코포레이티드), AVASTINTM (제넨테크), SH-268 (쉐링), 및 NX-1838 (넥스스타)는 또한 본 발명의 화합물과 조합될 수 있다. VEGF 억제제는 예를 들어, WO 99/24440 (1999.5.20 공개), PCT 국제출원 PCT/IB99/00797 (1999.5.3 출원), WO 95/21613 (1995.8.17 공개), WO 99/61422 (1999.12.2 공개), 미국 특허 제5,834,504호 (1998.11.10 발행), WO 98/50356 (1998.11.12 공개), 미국 특허 제5,883,113호 (1999.3.16 발행), 미국 특허 제5,886,020호 (1999.3.23 발행), 미국 특허 제5,792,783호 (1998.8.11 발행), WO 99/10349 (1999.3.4 공개), WO 97/32856 (1997.9.12 공개), WO 97/22596 (1997.6.26 공개), WO 98/54093 (1998.12.3 공개), WO98/02438 (1998.1.22 공개), WO 99/16755 (1999.4.8 공개), 및 WO 98/02437 (1998.1.22 공개)에 개시되며, 이들은 모두 전체가 참고로 여기에 통합된다. 본 발명에 유용한 일부 특이적인 VEGF 억제제의 다른 예는 IM862(시트란 인코포레이티드); 제넨테크 인코포레이티드의 항-VEGF 모노클로날 항체; 및 리보자임 앤드 키론으로부터의 합성 리보자임인 안지오자임이다. 이들 및 다른 VEGF 억제제는 여기서 개시된 대로 본 발명에 이용될 수 있다. GW-282974(글락소 웰컴 피엘씨)와 같은 ErbB2 수용체 억제제, 및 모노클로날 항체 AR-209(아로넥스 파마슈티컬스 인코포레이티드) 및 2B-1(키론)은 본 발명의 화합물과 조합될 수 있으며, 예를 들어, WO 98/02434 (1998.1.22 공개), WO 99/35146 (1999.7.15 공개), WO 99/35132 (1999.7.15 공개), WO 98/02437 (1998.1.22 공개), WO 97/13760 (1997.4.17 공개), WO 95/19970 (1995.7.27 공개), 미국 특허 제5,587,458호 (1996.12.24 발행), 및 미국 특허 제5,877,305호 (1999.3.2 발행)에 개시된 것들이 있으며, 이들은 모두 참고로 전체가 여기에 통합된다. 본 발명에 유용한 ErbB2 수용체 억제제는 또한 미국 특허 제6,465,449호(2002.10.15 발행), 및 미국 특허 제6,284,764호(2001.9.4 발행)에 개시되며, 둘다 참고로 전체가 여기에 통합된다. 전술한 PCT 출원, 미국 특허 및 미국 가출원에 개시된 erbB2 수용체 억제제 화합물 및 물질, 및 erbB2 수용체를 억제하는 다른 화합물과 물질은 본 발명에 따라 본 발명의 화합물과 이용될 수 있다.
항-생존 제제는 항-인테그린 항체와 같은 항-IGF-IR 항체 및 항-인테그린 제제를 포함한다.
항염증성 제제는 본 발명의 항-M-CSF 항체와 함께 이용될 수 있다. 류마티스성 관절염의 치료를 위하여, 본 발명의 인간 항-M-CSF 항체는 TNF 약물(REMICADETM, CDP-870 및 HUMIRATM) 및 TNF 수용체 면역글로불린 분자(ENBRELTM)와 같은 TNF-α 억제제, IL-1 억제제, 수용체 길항제 또는 가용성 IL-1ra(예, Kineret 또는 ICE 억제제), COX-2 억제제(세레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브 및 에토리콕시브), 메탈로프로테아제 억제제(바람직하게는 MMP-13 선택적 억제제), p2X7 억제제, α2δ 리간 드(NEUROTINTM 및 PREGABALINTM), 저 투여량 메토트렉세이트, 레프루노미드, 하이드록시클로로퀸, d-페니실아민, 오라노핀 또는 비경구 또는 경구 금과 같은 제제와 조합될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 골관절염의 치료를 위한 기존의 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 조합하여 사용될 적합한 제제는 피록시캄, 디크로페낙, 나프록센, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜과 같은 프로피온산, 메페남산, 인도메타신, 수린닥, 아파존과 같은 페나메이트, 페닐부타존과 같은 피라졸론, 아스피린과 같은 살리실레이트, 세레콕시브, 발데콕시브, 로페콕시브 및 에토리콕시브와 같은 COX-2 억제제와 같은 표준 비스테로이드 항염증제(이하에서 NSAID), 코르티코스테로이드와 같은 진통제 및 관절내 치료 및 히알간 및 신비스크와 같은 히아루론산을 포함한다.
항응고제는 본 발명의 항-M-CSF 항체와 함께 이용될 수 있다. 항응고제의 예는 와파린(COUMADINTM), 헤파린, 및 에녹사파린(LOVENOXTM)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 인간 항-M-CSF 항체는 또한 칼슘 채널 차단제, 지질 강하제, 예, 스타틴, 피브레이트, 베타-차단제, Ace 억제제, 안지오텐신-2 수용체 길항제 및 혈소판 응집 억제제와 같은 심혈관제와 함께 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 항우울증제(세르트랄린), 항-파킨슨 약물(예, 데프레닐, L-도파, REQUIPTM, MIRAPEXTM, MAOB 억제제, 예, 세레진 및 라사지린, comP 억제제, 예, 타스마르, A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 아고니스트, 도파민 아고니스트 및 신경 니트릭 옥사이드 신타제의 억제제), 및 도네페질, 타크린, α2δ LIGANDS(예, NEUROTINTM 및 PREGABALINTM) 억제제, COX-2 억제제, 프로펜토피린 또는 메트리포네이트와 같은 항-알츠하이머 약물과 같은 CNS 제제와 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 인간 항-M-CSF 항체는 또한 로록시펜, 드로록시펜, 라소폭시펜 또는 포소막스와 같은 골다공증 제제 및 FK-506 및 라파마이신과 같은 면역억제제와 함께 이용될 수 있다.
진단 방법
다른 양태에서, 본 발명은 진단 방법을 제공한다. 항-M-CSF 항체는 생체외 또는 생체내에서 생물 샘플내의 M-CSF를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 항체를 대상체에게 주사하는 단계, 항체가 결합된 곳을 찾아서 대상체에서 M-CSF의 발현을 결정하는 단계, 정상 기준 대상체 또는 표준의 발현과 대상체에서의 발현을 비교하는 단계, 및 종양의 존재 또는 위치를 진단하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 M-CSF-발현 종양의 존재 또는 위치를 진단하는 방법을 제공한다.
항-M-CSF 항체는 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 비롯한 종래의 면역분석에서 이용될 수 있다. 본 발명의 항-M-CSF 항체는 인간으로부터의 M-CSF를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 항- M-CSF 항체는 사이노몰로구스 원숭이, 레서스 원숭이, 침팬지 또는 유인원과 같은 영장류로부터의 M-CSF를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명은 생물 샘플을 본 발명의 항-M-CSF 항체와 접촉시키는 단계 및 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 생물 샘플에서 M-CSF를 검출하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 검출가능한 라벨로 직접 표지화된다. 다른 구체예에서, 항-M-CSF 항체(제 1 항체)는 표지되지 않고 제 2 항체 또는 항-M-CSF 항체에 결합할 수 있는 다른 분자가 표지된다. 당업계에 공지되어 있는 바처럼, 제 1 항체의 특정 종 및 클래스에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 항체가 선택된다. 예를 들어, 만일 항-M-CSF 항체가 인간 IgG이면, 제 2 항체는 항-인간-IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자는 제한없이 단백질 A 및 단백질 G를 포함하며, 이들은 예를 들어 피어스 케미컬 컴퍼니에서 시판된다.
항체 또는 2차 항체를 위한 적합한 라벨은 상기에서 개시되었으며, 다양한 효소, 보철기, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알카라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며, 적합한 보철기 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오르세인, 플루오르세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오르세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
다른 구체예에서, M-CSF는 검출가능한 물질로 표지된 M-CSF 표준 및 표지되지 않은 항-M-CSF 항체를 이용하는 경쟁 면역분석에 의해 생물 샘플에서 분석될 수 있다. 이 분석에서는, 생물 샘플, 표지된 M-CSF 표준 및 항-M-CSF 항체를 배합하고 비표지 항체에 결합된 표지된 M-CSF 표준의 양을 결정한다. 생물 샘플내의 M-CSF의 양은 항-M-CSF 항체에 결합된 표지된 M-CSF 표준의 양에 역비례한다.
많은 목적을 위해 전술한 면역분석을 이용할 수 있다. 예를 들어, 항-M-CSF 항체는 세포에서 또는 세포 배양물내의 세포의 표면상의, 또는 조직 배양 배지내로 분비된 M-CSF를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 항-M-CSF 항체는 세포 표면상의 또는 다양한 화합물로 처리된 조직 배양 배지내로 분비된 M-CSF의 양을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법은 M-CSF 발현 또는 분비를 억제하거나 활성화시키기 위해 유용한 화합물을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 이 방법에 따라, 세포 샘플 하나를 일정 기간동안 시험 화합물로 처리하는 한편 다른 샘플은 처리하지 않는다. M-CSF의 전체 수준을 측정한다면, 세포를 용해시키고 전술한 면역분석 중 하나를 이용하여 전체 M-CSF 수준을 측정한다. 처리된 세포 대 미처리 세포에서 M-CSF의 전체 수준을 비교하여 시험 화합물의 효과를 결정한다.
전체 M-CSF 수준을 측정하기 위한 면역분석은 ELISA 또는 웨스턴 블롯이다. 만일 M-CSF의 세포 표면 수준을 측정한다면, 세포를 용해시키지 않으며, 전술한 면역분석 중 하나를 이용하여 M-CSF 세포 표면 수준을 측정할 수 있다. M-CSF의 세포 표면 수준을 결정하기 위한 면역분석은 비오틴 또는 125I와 같은 검출가능한 라벨로 세포 표면 단백질을 표지하는 단계, 항-M-CSF 항체로 M-CSF를 면역침전시키는 단계 및 이어서 표지된 M-CSF를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. M-CSF의 국소화, 예, 세포 표면 수준을 결정하기 위한 다른 면역분석은 면역조직화학일 수 있다. ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 통합 막 단백질의 세포 표면 표지화 및 면역침전과 같은 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 상기한 Harlow and Lane 참고. 또한, 면역분석은 M-CSF의 억제 또는 활성화를 위해 많은 화합물을 시험하기 위하여 고처리량 스크리닝을 위해 규모를 크게 할 수 있다.
분비된 M-CSF 수준을 측정하기 위한 면역분석의 다른 예는 항원 포획 분석, ELISA, 면역조직화학 분석, 웨스턴 블롯 및 본 발명의 항체를 이용하는 다른 것일 수 있다. 만일 분비된 M-CSF를 측정한다면, 세포 배양 배지 또는 혈액 혈청, 소변 또는 활액과 같은 체액을 분비된 M-CSF에 대해 분석하고/하거나 세포를 용해시켜 생산되었지만 아직 분비되지 않은 M-CSF를 방출시킬 수 있다. M-CSF의 분비 수준을 결정하기 위한 면역분석은 비오틴 또는 125I와 같은 검출가능한 라벨로 분비된 단백질을 표지하는 단계, 항-M-CSF 항체로 M-CSF를 면역침전시키는 단계 및 이어서 표지된 M-CSF를 검출하는 단계를 포함한다. 분비된 M-CSF의 수준을 결정하기 위한 다른 면역분석은 (a) 항-M-CSF 항체를 미세적정 플레이트의 표면에 예비결합시키는 단계; (b) 조직 배양 세포 배지 또는 분비된 M-CSF를 함유하는 체액을 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하여 항-M-CSF 항체에 결합시키는 단계; (c) 항-M-CSF 항체를 검출할 항체, 예, 단계 (a)의 항-M-CSF 항체와 상이한 M-CSF의 에피토프에 결합하 는 딕옥시제닌으로 표지된 항-M-CSF를 첨가하는 단계; (d) 퍼옥시다제에 접합된 딕옥시제닌에 항체를 첨가하는 단계; 및 (e) 조직 배양 세포 배지 또는 체액 샘플에서 분비된 M-CSF의 수준을 결정하기 위해 정량될 수 있는 착색된 반응 생성물을 생성하는 퍼옥시다제 기질을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 및 항원 포획 분석과 같은 방법은 공지되어 있다. 예, 상기한 Harlow and Lane 참고. 또한, 면역분석은 M-CSF의 억제 또는 활성화를 위해 많은 화합물을 시험하기 위하여 고처리량 스크리닝을 위해 규모를 크게 할 수 있다.
본 발명의 항-M-CSF 항체는 또한 조직내 또는 조직에서 유래한 세포내의 세포 표면 M-CSF의 수준을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 조직은 질병 조직에서 온다. 일부 구체예에서, 조직은 종양 또는 그 생검일 수 있다. 상기 방법의 일부 구체예에서, 조직 또는 그 생검은 환자로부터 절제될 수 있다. 조직 또는 생검은 전술한 방법에 의해 전체 M-CSF 수준, M-CSF의 세포 표면 수준, 또는 M-CSF의 국소화를 결정하기 위해 면역분석에 이용될 수 있다.
상기 방법은 검출가능하게 표지된 항-M-CSF 항체 또는 이를 포함하는 조성물을 그러한 진단 시험을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계 및 M-CSF-발현 조직의 위치를 결정하기 위하여 상기 환자를 영상화 분석에 노출하는 단계를 포함할 수 있다. 영상화 분석은 공지되어 있으며, X-선 분석, 자기공명 영상화(MRI) 또는 컴퓨터화된 단층 X-선 사진 촬영법(CE)을 제한없이 포함한다. 항체는 생체내 영상화를 위해 적합한 임의의 제제, 예를 들어 X-선 분석을 위해 이용될 수 있는 대조제, 예, 바륨, 또는 MRI 또는 CE를 위해 이용될 수 있는 자기 대조제, 예, 가도리늄 킬 레이트로 표지될 수 있다. 다른 표지 제제는 99Tc와 같은 방사성동위원소를 제한없이 포함한다. 다른 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 표지되지 않을 것이며, 검출가능하며 항-M-CSF 항체에 결합할 수 있는 제 2 항체 또는 다른 분자를 투여함으로써 영상화될 것이다. 한 구체예에서, 대상 조직이 M-CSF를 발현하는지를 결정하기 위하여 생검을 환자로부터 얻는다.
본 발명의 항-M-CSF 항체는 또한 혈액 혈청, 소변, 또는 조직에서 유래된 활액과 같은 체액내의 M-CSF의 분비 수준을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 체액은 질병 조직에서 유래된다. 일부 구체예에서, 체액은 종양 또는 그 생검에서 얻는다. 상기 방법의 일부 구체예에서, 체액은 환자로부터 제거된다. 이어서 체액을 면역분석에서 이용하여 전술한 방법에 의해 분비된 M-CSF 수준을 결정한다. 본 발명의 한 구체예는 영장류 또는 인간 대상체에게 M-CSF 길항제를 투여하고 생물 샘플내의 CD14+CD16+ 단핵구의 수를 측정하는 것을 포함하는, M-CSF 길항제의 활성을 분석하는 방법이다.
치료 방법
다른 구체예에서, 본 발명은 항-M-CSF 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 M-CSF 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 여기서 개시된 항체의 임의의 타입은 치료적으로 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 다른 바람직한 구체예에서, M-CSF는 인간이며 환자는 인간 환자이다. 다르게는, 환자는 항-M-CSF 항체가 교차반응하는 M- CSF를 발현하는 포유류일 수 있다. 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질병의 동물 모델로서 항체가 교차반응하는 M-CSF를 발현하는 비인간 포유류(즉, 영장류)에 투여될 수 있다. 그러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하기에 유용할 수 있다.
여기서 이용될 때, 용어 "M-CSF 활성이 치명적인 질환"은 그 질환을 앓고 있는 대상체에서 고수준의 M-CSF의 존재가 질환의 병리생리에 책임이 있거나 질환의 악화에 기여하는 인자로 나타나거나 의심되는 질병 및 다른 질환을 포함한다. 그러한 질환은 예를 들어, 분비되고/되거나 세포 표면상의 M-CSF의 수준의 증가 또는 질환을 앓고 있는 대상체의 세포 또는 조직에서 c- fms의 티로신 자가인산화 증가에 의해 입증될 수 있다. M-CSF 수준의 증가는 예를 들어, 전술한 항-M-CSF 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 c- fms-발현 종양 또는 M-CSF를 분비하고/하거나 그 세포 표면에 M-CSF를 발현하는 종양을 가진 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양은 정상 조직보다 높은 수준의 c- fms 또는 M-CSF를 발현한다. 종양은 고형 종양이거나 또는 림프종과 같은 비고형 종양일 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 c- fms-발현 종양, M-CSF-발현 종양, 또는 암성인 M-CSF를 분비하는 종양을 가진 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 종양은 암성일 수 있다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 종양은 폐, 유방, 전립선 또는 결장의 암이다. 다른 바람직한 구체예에서, 환자에게 투여된 항-M-CSF 항체는 M-CSF가 더이상 c-fms 수용체에 결합하지 않도록 한다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 종양 이 중량 또는 부피가 증가하지 않거나 중량 또는 부피가 감소하도록 한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 종양 세포상의 c- fms가 M-CSF에 의해 결합되지 않도록 한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 종양 세포상의 M-CSF가 c- fms에 결합하지 않도록 한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 종양 세포의 분비된 M-CSF가 c- fms에 결합하지 않도록 한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 252, 88, 100, 3.8. 3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14. 4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1로부터 선택되거나, 또는 중쇄, 경쇄 또는 이의 항원 결합 영역을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 부적절하게 높은 수준의 M-CSF를 발현하는 환자에게 투여될 수 있다. 높은 수준의 M-CSF 발현은 다양한 흔한 암을 야기할 수 있음이 알려져 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 뇌, 편평 세포, 방광, 위장, 췌장, 유방, 머리, 목, 식도, 전립선, 결장직장, 폐, 콩팥, 신장, 난소, 부인과 또는 갑상선 암과 같은 암의 치료에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 환자는 예를 들어, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 머리 및 목의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 결장암, 유방암, 부인과 종양(예, 자궁 육종, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁막의 암종, 질의 암종 또는 음문의 암종), 호킨스 질병, 식도 암, 소장암, 내분비 시스템의 암(예, 갑상선 암, 부갑상선 또는 부신의 암), 연질 조직의 육종, 요도의 암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 고형 종양 (예, 혈액, 골수 또는 림프계외의 신체 조직의 암인 육종, 암종 또는 림프종), 아동기의 고형 종양, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 요관의 암(예, 신장 세포 암종, 신장 골반의 암종), 또는 중추신경계의 종양(예, 일차 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경아교종 또는 뇌하수체 샘종)를 갖는 것으로 진단된 환자를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 유방암, 전립선암, 폐암 또는 결장암을 가진 환자에게 투여된다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 암이 비정상적으로 증식하는 것을 멈추거나 중량 또는 부피가 증가하지 않거나 중량 또는 부피가 감소하도록 한다.
항체는 한번 투여될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 여러번 투여된다. 예를 들어, 항체는 하루 세번에서 6개월 이상에 한번씩 투여될 수 있다. 투여는 하루 세번, 하루 두번, 하루 한번, 2일마다 한번, 3일마다 한번, 1주일에 한번, 2주일에 한번, 한달에 한번, 두달에 한번, 3개월에 한번 및 6개월에 한번과 같은 스케쥴일 수 있다. 항체는 또한 미니펌프를 통해 연속적으로 투여될 수도 있다. 항체는 경구, 점막, 볼, 비강내, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 항체는 종양 부위 또는 염증 신체 부분에서, 종양 또는 염증 신체 부분내로, 또는 종양 부위 또는 염증 신체 부분에서 떨어진 부위에서 투여될 수 있다. 항체는 한번, 적어도 두번 또는 증상이 치료되거나 완화되거나 완치될 때까지 적어도 일정 기간동안 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 항체가 종양 또는 암이 성장을 멈추거나 중량 또는 부피가 감소하도록 한다면 종양이 존재하는 한 또는 염증 신체 부분이 치유될 때까지 투여될 것이다. 항체는 일반적으로 전술 한 약학 조성물의 일부로서 투여될 것이다. 항체의 투여량은 일반적으로 0.1-100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.5-50 mg/kg, 더욱 바람직하게는 1-20 mg/kg, 그리고 더욱 더 바람직하게는 1-10 mg/kg의 범위내일 것이다. 항체의 혈청 농도는 임의의 공지 방법에 의해 측정될 수 있다.
다른 양태에서, 항-M-CSF 항체는 항염증제, 항응고제, 혈압을 낮추거나 감소시키는 제제, 항신생물질 약물 또는 분자와 같은 다른 치료제와 함께 암 또는 종양과 같은 과다증식성 질환을 가진 환자에게 동시투여될 수도 있다. 한 양태에서, 본 발명은 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물, 인터킬레이팅제, 성장 인자 억제제, 세포 사이클 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물 반응 개질제, 항호르몬, 키나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 유전자 치료제 및 항안드로겐으로 구성되며 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 항종양 제제와 조합된 본 발명 화합물의 치료 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 과다증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 항체는 아드리아마이신 또는 택솔과 같은 항신생물질제와 함께 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체 또는 조합 치료는 방사성치료, 화학요법, 광선역학요법, 수술 또는 다른 면역요법과 함께 투여된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 다른 항체와 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 항-M-CSF 항체는 항체 또는 종양 또는 암세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 다른 제제, 예, erbB2 수용체, EGF-R, CD20 또는 VEGF를 억제하는 항체 또는 제제와 함께 투여될 수 있다.
추가의 치료제와 항체의 동시 투여(조합 치료)는 항-M-CSF 항체 및 추가의 치료제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것과 항-M-CSF 항체를 포함하는 하나 및 추가의 치료제를 포함하는 다른 하나인 둘 이상의 별도의 약학 조성물을 투여하는 것을 포괄한다. 또한, 동시-투여 또는 조합 치료는 일반적으로 항체와 추가 치료제가 서로 동시에 투여됨을 의미함에도 불구하고, 항체와 추가의 치료제가 상이한 시간에 투여되는 경우도 포함된다. 예를 들어, 항체는 3일마다 한번 투여되는 한편, 추가의 치료제는 하루 한번 투여된다. 다르게는, 항체는 추가의 치료제로 질환의 치료 전 또는 후에 투여될 수 있다. 유사하게, 항-M-CSF 항체의 투여는 방사선요법, 화학요법, 광선역학 요법, 수술 또는 다른 면역치료와 같은 다른 치료 전 또는 후에 투여될 수 있다.
항체 및 하나 이상의 추가의 치료제(조합 치료)는 한번, 두번 또는 증상이 치료, 완화, 또는 완치될 때까지 적어도 일정 기간동안 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조합 치료는 여러번 투여된다. 조합 치료는 하루 세번 내지 6개월에 한번 투여될 수 있다. 투여는 하루 세번, 하루 두번, 하루 한번, 2일마다 한번, 3일마다 한번, 1주일에 한번, 2주일에 한번, 한달에 한번, 두달에 한번, 3개월에 한번 및 6개월에 한번과 같은 스케쥴이거나, 또는 미니펌프를 통해 연속적으로 투여될 수도 있다. 조합 치료는 경구, 점막, 볼, 비강내, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 조합 치료는 종양 부위와 떨어진 부위에서 투여될 수 있다. 조합 치료는 일반적으로 항체가 종양 또는 암이 성장을 멈추거나 중량 또는 부피가 감소하도록 한다면 종양이 존재하는 한 투여될 것이다.
다른 추가 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 방사성라벨, 면역독소 또는 독소로 표지되거나, 또는 독성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 항-M-CSF 항체 또는 항-M-CSF 항체 융합 단백질은 방사성라벨, 면역독소, 독소 또는 독성 펩티드를 M-CSF-발현 세포로 보낸다. 바람직한 구체예에서, 방사성라벨, 면역독소, 독소 또는 독성 펩티드는 항-M-CSF 항체가 표적 세포의 표면상의 M-CSF에 결합한 후 내부화된다.
다른 양태에서, 항-M-CSF 항체는 고수준의 M-CSF 및/또는 M-CSF가 비암성 증상 또는 질병과 관련된 비암성 증상을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 고수준의 M-CSF 및/또는 M-CSF 수준 또는 활성에 의해 야기되거나 악화된 비암성 병리 상태을 가진 환자에게 항-M-CSF 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 비암성 병리 증상의 진전을 늦춘다. 더욱 바람직한 구체예에서, 항-M-CSF 항체는 적어도 부분적으로 비암성 병리 증상을 중지시키거나 역전시킨다.
유전자 치료법
본 발명의 핵산 분자는 유전자 치료를 통해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 상기 치료법은 생체내 또는 싱체외 치료일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄를 암호하는 핵산 분자가 환자에게 투여된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 B 세포가 전문화된 항체 생산 세포이므로 B 세포의 염색체내로 안정하게 통합되도록 투여된다. 바람직한 구체예에서, 전구체 B 세포는 생체외로 형질감염되거나 감염되고 이를 필요로 하는 환자에게 재이식된다. 다른 구체 예에서는, 전구체 B 세포 또는 다른 세포는 대상 세포 타입을 감염시키는 것으로 알려진 바이러스를 이용하여 생체내에서 감염된다. 유전자 치료에 이용되는 일반적인 벡터는 리포좀, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스이다. 생체내 또는 생체외에서 감염 후, 항체 발현의 수준은 치료된 환자로부터 샘플을 취하고 임의의 공지된 면역분석을 이용하여 모니터할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 유전자 치료 방법은 항-M-CSF 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 단리된 핵산 분자를 투여하고 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 치료 방법은 항-M-CSF 항체의 경쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 단리된 핵산 분자를 투여하고 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 더욱 바람직한 방법에서, 유전자 치료 방법은 본 발명의 항-M-CSF 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 단리된 핵산 분자 및 경쇄 또는 이의 항원 결합 부위를 암호하는 단리된 핵산 분자를 투여하고 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 유전자 치료 방법은 또한 택솔 또는 아드리아마이신과 같은 다른 항암제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예를 개시한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적이며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 I
항-M- CSF 항체를 생산하는 세포주의 생성
본 발명의 항체를 하기와 같이 제조, 선택, 및 분석하였다.
면역화 및 하이브리도마 생성
8 내지 10주된 XENOMOUSETM 마우스를 인간 M-CSF(10 ㎍/투여량/마우스)로 복강내로 또는 그들의 뒷발바닥에서 면역화시켰다. 3 내지 8주 기간에 걸쳐 이 투여량을 5 내지 7회 반복하였다. 융합 4일 전에, PBS중의 인간 M-CSF를 마우스에 최종 주사하였다. 면역된 마우스로부터의 비장 및 림프절 림프구를 비분비성 골수종 P3-X63-Ag8.653 세포주와 융합시키고, 융합된 세포를 이전에 개시된 대로 HAT 선택에 노출시켰다(Galfre and Milstein, Methods Enzymol.73: 3-46,1981). M-CSF 특이적 인간 IgG2 및 IgG4 항체를 분비하는 하이브리도마 패널을 회수하였다. 항체는 또한 Babcook, J. S. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93:7843-48, 1996에 개시된 대로 XENOMAXTM 기법을 이용하여 생성하였다. 본 발명의 항체를 생산하도록 조작된 9개의 세포주를 추가 연구를 위하여 선택하고 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1. 120.1, 9.14.4, 8.10.3 및 9.7.2로 지정하였다. 하이브리도마를 2003년 8월 8일에 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불레바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 부다페스트 조약에 따라 기탁하였다. 하이브리도마는 하기 기탁 번호가 주어졌다:
하이브리도마 3.8.3 (LN 15891) PTA-5390
하이브리도마 2.7.3 (LN 15892) PTA-5391
하이브리도마 1.120.1 (LN 15893) PTA-5392
하이브리도마 9.7.2 (LN 15894) PTA-5393
하이브리도마 9.14.4 (LN 15895) PTA-5394
하이브리도마 8.10.3 (LN 15896) PTA-5395
하이브리도마 88-감마 (UC 25489) PTA-5396
하이브리도마 88-카파 (UC 25490) PTA-5397
하이브리도마 100-감마 (UC 25491) PTA-5398
하이브리도마 100-카파 (UC 25492) PTA-5399
하이브리도마 252-감마 (UC 25493) PTA-5400
하이브리도마 252-카파 (UC 25494) PTA-5401
실시예 Ⅱ
유전자 이용 분석
모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1, 120.1, 9.14.4, 8.10.3 및 9.7.2의 중쇄 및 경쇄를 암호하는 DNA를 각 하이브리도마 세포주로부터 클로닝하고 공지의 방법에 의해 DNA 서열을 결정하였다. 추가로, 하이브리도마 세포주 9.14.4, 8.10.3 및 9.7.2로부터의 DNA를 가변 도메인내의 특이적 골격 영역에서 돌연변이시키거나 및/또는 아이소타입-스위치시켜, 예를 들어 각각 9.14.4I, 8. 10.3F, 및 9.7.2IF를 얻었다. 항체의 핵산 서열 및 예측된 아미노산 서열로부터, 각 항체 쇄를 위한 유전자 용법의 실체를 결정하였다("VBASE"). 표 2는 본 발명에 따라 선택된 항체의 유전자 이용을 개시한다.
[표 2]
중쇄 및 경쇄 유전자 이용
Figure 112006024760111-PCT00002
중쇄 및 경쇄의 특정 잔기의 돌연변이유발은 프라이머를 고안하고 제조자의 지시에 따라 스트라타젠으로부터의 퀵체인지 사이트 다이렉티드 뮤타제네시스 키트를 이용하여 실시하였다. 돌연변이는 자동화 서열결정에 의해 확인하고, 돌연변이된 삽입물을 발현 벡터내로 서브클로닝하였다. 발현 벡터를 HEK293 세포내로 형질 감염시켜 특성 규명을 위해 충분한 항체를 생산하였다.
실시예 Ⅲ
M- CSF 마우스 단핵구 세포 증식 분석
생체외 분석을 실시하여 항-M-CSF 항체의 존재하에서 M-CSF-의존성 마우스 단핵구 세포 증식을 측정하여 항-M-CSF 항체에 의한 억제 정도를 결정하였다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)(버지니아주 마나사스)로부터 마우스 단핵구 세포 M-NFS-60 세포를 얻어서 2 mM L-글루타민(ATCC), 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS)(캘리포니아주 칼스바드에 소재한 인비트로겐), 0.05 mM 2-머캡토에탄올(세인트루이스에 소재한 시그마)(분석 배지)를 함유한 RPMI-1640 배지에서 15 ng/ml 인간 M-CSF와 유지하였다. M-NSF-60 세포를 다음날 사용을 위해 5 X 104으로 또는 2일내에 사용하기 위해 2.5 X 104으로 분할하였다. 분석에 사용하기에 앞서, 세포를 RPMI-1640으로 세번 세척하고, 계수하고 분석 배지로 부피를 2 X 105 세포/ml이 되게 조절하였다. 모든 조건은 96-웰 처리된 조직 배양 플레이트(뉴욕 코닝에 소재한 코닝)에서 세벌로 실시하였다. 각 웰에 세척된 세포 50 ㎕, 25 ㎕ 부피내의 100 pM 또는 1000 pM M-CSF 및 아세테이트 완충액(140 mM 염화나트륨, 20 mM 아세트산나트륨, 및 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 80, pH 5.5)중의 25 ㎕ 부피내의 다양한 농도의 시험 또는 대조구 항체를 최종 부피 100 ㎕로 첨가하였다. 본 발명의 항체를 단독으로 그리고 인간 M-CSF와 함께 시험하였다. 플레이트를 5% CO2로 37℃에 서 24시간동안 항온처리하였다.
24시간 후, 0.5 μCi 3H-티미딘(뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 아머샴 바이오사이언스) 10 ㎕/웰을 첨가하고 3시간동안 세포로 펄스하였다. 통합된 티미딘의 양을 검출하기 위하여, 미리적신 유니필터 GF/C 필터플레이트(코네티컷주 메리덴에 소재한 패커드)상에 세포를 수집하고 물로 10회 세척하였다. 플레이트를 밤새 건조시켰다. 바닥 시일을 필터플레이트에 첨가하였다. 이어서, 45 ㎕ 마이크로신트 20(코네티컷주 메리덴에 소재한 패커드)/웰을 첨가하였다. 상부 시일을 첨가한 후, 플레이트를 트리룩스 마이크로베타 계수기(오하이오주 노톤에 소재한 왈락)에서 계수하였다.
이들 실험은 본 발명의 항-M-CSF 항체가 M-CSF에 대한 반응으로 마우스 단핵구 세포 증식을 억제함을 입증한다. 또한, 다양한 농도의 항체를 이용함으로써, 마우스 단핵구 세포 증식의 억제를 위한 IC50을 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 및 9.7.2에 대해 결정하였다(세포 증식 분석, 표 3a 및 표 3b).
[표 3a]
Figure 112006024760111-PCT00003
[표 3b]
Figure 112006024760111-PCT00004
실시예 Ⅳ
인간 전혈 단핵구 활성화 분석
생체외 분석을 실시하여 항-M-CSF 항체의 존재하에서 M-CSF 의존성 단핵구 모양 변화를 측정하여 항-M-CSF 항체가 전혈 단핵구 활성화를 억제할 수 있는 지 여부와 단핵구 모양 변화의 억제 정도를 결정하였다.
96-웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에서, 1.7 nM 항-M-CSF 6 ㎕ 및 102 pM 항-M-CSF 항체의 최종 농도를 위한 인간 전혈 94 ㎕를 혼합하였다. CO2 조직 배양 항온기에서 37 ℃에서 플레이트를 항온처리하였다. 이어서, 항온기에서 플레이트를 제거하였다. 각 웰에, 고정 용액(MgCl2 또는 CaCl2 없는 인산염 완충된 염수내의 0.5% 포르말린) 100 ㎕를 추가하고 실온에서 10분동안 플레이트를 항온처리하였다. 각 샘플을 위하여, 각 웰로부터의 180 ㎕와 적혈구 용해 완충액 1 ml을 혼합하였다. 튜브를 2초동안 볼텍스하였다. 이어서, 샘플을 교반 수조에서 5분동안 37 ℃에서 항온처리하여 적혈구 세포를 용해시키되 단핵구는 그대로 두었다. 이 항온처리 직후, 샘플을 형광-활성화된 세포 스캐닝(FACS) 기계(BD 벡크만 FACS)에서 판독하고 FACS 스테이션 소프트웨어 버젼 3.4를 이용하여 데이터를 분석하였다.
이들 실험은 본 발명의 항-M-CSF 항체가 대조구 샘플에 비하여 단핵구 모양 변화를 억제함을 입증한다. 단핵구 모양 변화 분석을 이용하여, IC50을 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 및 9.7.2를 위해 결정하였다(인간 전혈 단핵구 활성화, 표 3a 및 표 3b).
실시예 V
c- fms 수용체 결합 억제 분석
생체외 분석을 실시하여 항-M-CSF 항체의 존재하에서 M-CSF의 c- fms 수용체와의 결합을 측정하여 항-M-CSF 항체가 c- fms에의 M-CSF 결합을 억제할 수 있는지 그리고 그 억제 정도를 결정하였다.
마그네슘 또는 칼슘이 없는 둘베코 인산염 완충된 염수에서 유지된 인간 c-fms 또는 M-NSF-60 세포로 형질감염된 NIH-3T3 세포를 세척하였다. 5 mM 에틸렌-디아민-테트라-아세테이트(EDTA), pH 7.4를 가진 조직 배양 플레이트로부터 NIH-3T3 세포를 제거하였다. NIH-3T3 세포를 1-2분동안 조직 배양 항온기에 되돌리고 플라스크를 두드려 세포를 느슨하게 하였다. NIH-3T3 세포 및 M-NSF-60 세포를 50 ml 튜브로 옮기고 반응 완충액(50 mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), pH 7.4을 함유한 중탄산나트륨이 없는 1×RPMI)로 두번 세척하였다. 이어서, NIH-3T3 세포를 최종 농도가 1.5 X 105세포/ml이도록 반응 완충액에 재현탁시켰다. M-NSF-60 세포를 최종 농도가 2.5 X 106세포/ml이 되도록 반응 완충액에 재현탁시켰다.
분석을 위하여, 멸균 0.4 M 수크로스 용액 9 ㎕, 50 mM HEPES(pH 7.4)를 함유하는 RPMI-1640중의 200 pM의 최종 농도의 125I-M-CSF(아머샴, IMQ7228v) 100 ㎕ , 0.2% 소 혈청 알부민, 및 최종 농도 200 nM의 비표지 M-CSF 100 ㎕를 결합 튜브내에서 혼합하였다. 이어서 시험 항체 농도가 증가하는 50 ㎕/튜브를 첨가하였다. 항체의 비특이적 결합을 결정하기 위하여, 200 nM M-CSF를 첨가한 샘플을 포함시켰다. 대조구 튜브에는, 항체를 첨가하지 않았다. 이어서, 15,000 NIH-3T3 세포 또는 250,000 M-NSF-60 세포를 튜브마다 첨가하였다. 모든 튜브를 3시간동안 실온에서 항온처리하고 2분동안 10,000 rpm에서 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 함유하는 튜브의 팁을 잘라내고 세포에 결합된 M-CSF의 양을 패커드 코브라 II 감마 계수기를 이용하여 결정하였다. 특이적 결합은 전체 결합에서 비특이적 결합을 뺌으로써 결정하였다. 모든 분석은 2벌로 실시하였다. 컴퓨터 프로그램, 그래프 패드 프리즘 2.01을 이용하여 결합 데이터를 분석하였다.
이들 실험은 본 발명의 항-M-CSF 항체가 대조구 샘플에 비하여 M-CSF의 c-fms 수용체와의 결합을 억제함을 입증한다. 또한, 다양한 농도의 항체를 이용함으로써, 수용체 결합의 억제를 위한 IC50을 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1. 120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 및 9.7.2에 대해 결정하였다(수용체 결합 억제 분석, 표 3a 및 표 3b).
실시예 Ⅵ
BIACORE TM 에 의한 항-M- CSF 모노클로날 항체의 친화성 상수( K D )의 결정
정제된 항체의 친화성 측정은 제조자의 프로토콜을 따라 BIACORETM 3000 기구를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 실시하였다.
항체 3.8.3, 2.7.3 및 1.120.1의 경우, 0.0005% Tween-20을 함유하는 둘베코 인산염 완충된 염수에서 25℃의 BIACORETM 3000 기구에서 실험을 실시하였다. 단백질 농도는 침강 속도 실험으로부터 얻어지거나 또는 아미노산 서열로부터 유도된 이론적 소멸 계수를 이용하여 280 nm에서 샘플의 파장을 측정하여 얻어졌다. 고정된 항원에의 항체의 결합을 측정하는 실험의 경우, M-CSF를 표준 직접 아민 커플링 과정에 의해 B1 칩에 고정시켰다. 항체 샘플을 3.8.3, 2.7.3 및 1.120.1을 위해 0.69 μM에서 준비하였다. 이들 샘플을 대략 농도에서 100배 범위를 위해 8.5 nM 또는 2.8 nM로 연속하여 3배 희석시켰다. 각 농도를 위해, 샘플을 4분동안 5 ㎕/분으로 2벌로 주사하였다. 해리를 2000초동안 모니터하였다. BIACORETM 이중평가 소프 트웨어를 이용하여 간단한 1:1 결합 모델에 전체적으로 최적화시켰다. 모든 경우에, koff를 얻기 위하여 이 방법을 이용하였으며 이 데이터 세트는 연합 및 해리 데이터의 전체적인 최적화로부터 얻은 데이터에 잘 비교되었다.
항체 252, 88 및 100을 위하여, 실험을 HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)에서 25℃의 BIACORETM 3000 기구에서 실시하였다. 고정된 항원에 대한 항체의 결합을 측정하는 실험의 경우, M-CSF는 표준 직접 아민 커플링 과정에 의해 CM5 리서치 그레이드 센서 칩에 고정되었다. 항체 샘플은 항체 252 및 100을 위해 12.5 nM 그리고 항체 88을 위해 25.0 nM에서 준비하였다. 이들 샘플을 대략 농도에서 15-30 배 범위를 위하여 0.78 nM로 연속적으로 2배 희석시켰다. 각 농도를 위하여, 샘플을 3분동안 30 ㎕/분 유동으로 임의 순서로 2벌로 주사하였다. 해리는 300초동안 모니터하였다. BIACORETM 이중평가 소프트웨어를 이용하여 간단한 1:1 결합 모델에 데이터를 전체적으로 최적화시켰다. 모든 경우에, koff를 얻기 위하여 이 방법을 이용하였으며 이 데이터 세트는 연합 및 해리 데이터의 전체적인 최적화로부터 얻은 데이터에 잘 비교되었다.
표 4는 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3 및 1.120.1을 위한 결과를 보여준다.
[표 4]
Figure 112006024760111-PCT00005
실시예 Ⅶ
8.10.3 하이브리도마 세포로부터 8.10.3 항체의 생산
항체 8.10.3을 3L 살포 스피너에서 생산하였다. 3L 살포 스피너 플라스크는 배양물이 자기 플랫폼에 의해 조절되는 날개바퀴로 혼합되는 유리 용기이다. 스피너는 가스선에 연결되어 5% CO2와 공기를 공급한다. 8.10.3 하이브리도마 세포를 먼저 T-25 세포 배양물 플라스크내로 해동시켰다. 살포 스피너를 접종하기에 충분한 수의 세포가 있을 때까지 세포를 점차 확장시켰다.
2개의 3L 살포 스피너 플라스크를 표 5에 나타난 첨가물을 갖는 하이브리도마 무혈청 배지내의 8.10.3 하이브리도마 세포로 접종하였다. 극히 낮은 IgG 혈청(지브코 cat# 16250-078), L-글루타민 (JRH 바이오사이언스 cat# 59202-500M), 비필수 아미노산 (지브코 cat# 11140-050), 펩톤 (디프코 cat# 211693), 글루코스 (JT 베이커 cat# 1920-07로부터 제조된 회사내 저장용액), 및 항-발포 C (시그마 cat# A-8011)를 위한 농도가 배지에서의 그들의 최종 농도로 주어진다. 각 반응기에서 부피의 나머지는 하이브리도마 무혈청 배지이다.
[표 5]
2개의 3L 살포 스피너에서 하이브리도마 8.10.3을 성장시키기 위한 조건
조건 스피너 1 스피너 2
접종 밀도(1X106세포/ml) 0.16 ml 0.16 ml
하이브리도마 무혈청 배지(지브코 cat# 12045-076) 나머지 나머지
극히 낮은 IgG 혈청(지브코 cat# 16250-078 5% 5%
L-글루타민(JRH 바이오사이언스 cat# 59202-500M 8 mmol/L 8 mmol/L
비필수 아미노산 (지브코 cat# 11140-050) 1% 1%
펩톤 (디프코 cat# 211693) 1g/L 1g/L
2M 글루코스 (JT 베이커 cat# 1920-07로부터 제조된 회사내 저장용액) 8g/L 8g/L
항-발포 C (시그마 cat# A-8011) 1m/L 1m/L
배양물을 15일간 성장시키고 생존율이 20% 미만일 때 수집하였다. 생존율은 자동 세포 계수기(세덱스, 이노바티스)를 이용하여 트리판 블루 배제 방법에 의해 결정하였다. 수집은 원심분리 및 후속 여과에 의해 실시하였다. 청정해진 상등액은 7000 rpm에서 15분간 원심분리 및 이어서 멸균 0.22 ㎛ 4" Opticap 밀리포어 필터(cat# KVSCO4HB3)로 10L 멸균 TC-Tech 백(cat# P/N 12420 Bag Style CC-10-112420)내로 여과한 후 얻어졌다. 이어서 여과물을 하기 실시예에서 정제하였다.
실시예 Ⅷ
항-M- CSF 항체의 정제
8M 우레아의 3 컬럼 부피로 세척하고, 이어서 20 mM Tris(pH 8)로 평형화 세척하여 단백질 A 컬럼(아머샴 파마시아)을 준비하였다. 실시예 Ⅶ로부터의 최종 여과물을 2%v/v의 1M Tris pH8.3 및 0.02% NaN3로 스파이크한 후 중력-드립 방식을 통해 단백질 A 컬럼에 로드하였다. 로드가 끝난 후, 수지를 5 컬럼 부피의 20 mM Tris(pH 8) 및 이어서 5 컬럼 부피의 용출 완충액(0.1 M 글리신 pH 3.0)으로 세척하였다. 임의의 침전을 주목하고, 이어서 10% v/v 스파이크의 1M Tris pH 8.3을 용출된 항체에 첨가하였다. 용출된 단백질을 이어서 용출된 물질의 100배 부피량의 투석 완충액(140 mM NaCl/20mM 아세트산나트륨 pH 5.5)내로 투석시켰다. 투석 후, 항체를 0.22 ㎛ 필터로 멸균 여과하고 추가 사용까지 저장하였다.
실시예 Ⅸ
원숭이 처리 및 단핵구 계수
투여량 그룹 당 웅성 한마리와 자성 한마리의 사이노몰구스 원숭이를 약 5분에 걸쳐 3.79 mL/kg의 투여량 부피로 0, 0.1, 1 또는 5 mg/kg으로 비히클 또는 항체 8.10.3(실시예 Ⅶ 및 Ⅷ에 개시된 대로 생산됨)를 정맥내로 투여하였다. 임상적 실험실 분석을 위한 혈액 샘플을 투여 후 24 및 72 시간에 그리고 3주동안 매주 수집하였다. 애보트 디아그노스틱스 인코포레이티드 셀 딘 시스템(일리노이주에 소재하는 애보트 파크)을 이용하는 광 산란에 의해 단핵구 계수를 결정하였다.
모든 투여량에서 전체 단핵구의 투여량-관련 감소(~25% 내지 85%)(도 1a 및 1b)가 관찰되었다. 0.1 및 1 mg/kg에서의 단핵구 계수는 2주째에 거의 대조구 수준으로 되돌아가는 것으로 나타난 한편, 5 mg/kg에서의 단핵구 계수는 3주째에도 여전히 감소하였다.
CD14 + CD16 + 단핵구 서브세트 분석
영장류 전혈을 소듐 헤파린을 함유한 배큐테이너 튜브내로 채취하였다. 각 혈액 샘플 0.2 ml을 적혈구 세포 용해 완충액(시그마) 10 ml을 함유하는 15 ml 원 추형 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 첨가하고, 15분간 37℃ 수조에서 항온처리하였다. 이어서 1200 rpm에서 5분간 소발(sorvall) RT7 원심분리기에서 튜브를 원심분리시켰다. 상등액을 흡입하고, 펠렛을 4 ℃ FACS 완충액 10 ml(행크스 밸런스드 염 용액/2% FBS/0.02% 아지드화나트륨)에 재현탁시키고, 튜브를 다시 1200 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 흡입하고 펠렛을 80 ㎕ 4℃ FACS 완충액, 10 ㎕ FITC-접합된 항-인간 CD14 모노클로날 항체(캘리포니아주 샌디애고에 소재하는 BD 바이오사이언스), 0.5 ㎕ Cy5-PE-접합된 항-인간 CD16 모노클로날 항체(캘리포니아주 샌디애고에 소재하는 BD 바이오사이언스), 및 10 ㎕ PE-접합된 항-인간 CD89 모노클로날 항체(캘리포니아주 샌디애고에 소재하는 BD 바이오사이언스)로 구성된 항체 칵테일에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 20분간 얼음에서 항온처리하고, 그 후 4 ℃ FACS 완충액 10 ml을 첨가하고 세포를 앞서와 같이 원심분리하였다. 상등액을 흡입하고, 세포 펠렛을 400 ㎕ FACS 완충액에 재현탁하고 세포를 FACSCaliber 유동 계량계(캘리포니아주 샌디애고에 소재하는 BD 바이오사이언스)에서 분석하였다. 30,000 개의 세포를 위한 데이터를 각 샘플로부터 수집하였다.
단핵구 집단을 전방 각도 광 산란기 및 직교 광 산란기의 조합에 의해 확인하였다. 단핵구 게이트내의 세포를 CD14 및 CD16의 발현에 대해 추가로 분석하였다. 두 개의 별도의 단핵구 집단을 관찰하였으며, 하나는 CD16의 발현이 거의 없이 고수준의 CD14를 발현하였으며(CD14++CD16-) 다른 하나는 낮은 수준의 CD14와 고수준의 CD16(CD14+CD16+)을 발현하여, 인간 말초 혈액에서 이전에 개시된 두 단핵구 서브세트와 유사하였다(Ziegler-Heitbrock H. W., Immunology Today 17: 424-428 (1996)). 시험된 각 영장류를 위하여, CD14+CD16+ 서브세트내의 단핵구의 퍼센티지를 각 혈액 채취 후, 8.10.3 주사 후 1,3,7,14 및 21일에 결정하였다.
일반적으로, 8.10.3 처리는 CD14+CD16+ 단핵구의 퍼센티지의 감소를 야기하였다(도 2a 및 2b 참고). 8.10.3 항체가 주어지지 않은 원숭이는 상대적으로 안정한 CD14+CD16+ 단핵구 수준을 입증하였다. CD14+CD16+ 단핵구는 높은 수준의 TNF-α 및 다른 염증성 사이토카인을 생산하므로 "프로염증성"으로 불렸다(Frankenberger, M. T., et al., Blood 87: 373-377 (1996)). 종래의 CD14++CD16- 표현형으로부터의 단핵구의 프로염증성 표현형으로의 분화는 M-CSF에 의존성인 것으로 알려져 있다 (Saleh M. N., et al., Blood 85: 2910-2917 (1995)).
실시예 Ⅹ
원숭이 처리 및 단핵구 계수
투여량 그룹 당 세 마리의 웅성 사이노몰구스 원숭이를 약 5분에 걸쳐 3.79 ml/kg의 투여량 부피로 비히클(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5, 140 mM NaCl), 정제된 항체 8.10.3F, 또는 정제된 항체 9.14.4I를 0, 1, 또는 5 mg/kg으로 정맥내로 투여하였다. 원숭이는 4 내지 9년령이고 6 내지 10 kg이었다. 임상적 실험실 분석을 위한 혈액 샘플은 2,4,8,15,23 및 29일에 수집하였다. 단핵구 계수는 애보트 디아그노스틱스 인코포레이티드의 셀 딘 시스템(일리노이주, 애보트 파크)를 이용한 광 산란에 의해 결정하였다.
단핵구의 시험 전 수준에 비교할 때 항체 8.10.3F 및 항체 9.14.4I의 모든 투여량에서 전체 단핵구의 퍼센티지 변화의 감소(도 3a 및 3b)가 관찰되었다(예, 도 3A 및 3B에서 4,8,15 및 23일).
본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 각 개별 문헌 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고로 통합되는 것처럼 참고로 여기에 통합된다. 전술한 발명이 예시에 의해 그리고 이해를 명확히 하기 위한 예로서 일부 상세히 개시되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게는 일부 변화 및 변형이 청구된 청구항의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있음이 명백할 것이다.
서열
요지:
시그널 펩티드: 밑줄친 소문자
CDR 1,2,3 : 밑줄친 대문자
가변 도메인: 대문자
불변 도메인: 소문자
생식세포로부터의 돌연변이: 진하게
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SEQUENCE LISTING <110> ABGENIX, INC. WARNER-LAMBERT COMPANY LLC BEDIAN, VAHE DEVALARAJA, MADHAV NARASIMHA FOLTZ, IAN HAAK-FRENDSCHO, MARY KELLERMANN, SIRID-AIMEE LOW, JOSEPH EDWIN MOBLEY, JAMES LESLIE <120> ANTIBODIES TO M-CSF <130> ABX-PF4 PCT <140> <141> <150> 60/502,163 <151> 2003-09-10 <160> 117 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 1383 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagttgg ggctgtgctg gattttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtcaagcctg gagggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagtgac tactacatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtggat ttcatacatt agtggtagtg gtagtaccat atactacgca 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatc actgtgcgag agccctgggt 360 gggatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctct agaagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaa 1383 <210> 2 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Leu Gly Leu Cys Trp Ile Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr His Cys Ala Arg Ala Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 5 <211> 1389 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggaatttg ggctgtgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagtagc tattggatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ggccaacata aagcaagatg gaagtgagaa atactatgtg 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgctcc gggtatagca 360 gcagctggta gggcctactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcttccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctctagaa gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc 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Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 225 230 235 240 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 260 265 270 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 355 360 365 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 103 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 104 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 105 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ile Ala Ala Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 <210> 106 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala 115 <210> 107 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 108 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala 115 <210> 109 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 110 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala 115 <210> 111 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala 115 <210> 112 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 113 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 114 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 115 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala <210> 116 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala 115 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (34)

  1. M-CSF에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  2. 제1항에 있어서,
    a) M-CSF의 인간 분비 이소체(isform) 및 M-CSF의 막 결합 이소체에 결합하는 특성;
    b) GM-CSF 또는 G-CSF에 대한 선택성보다 100배 이상 더 높은 M-CSF에 대한 선택성을 가지는 특성;
    c) 1.0 x 10-7 M 이하의 KD로 M-CSF에 결합하는 특성;
    d) 2.0 x 10-4s-1 이하의 M-CSF에 대한 해리 속도(koff)를 가지는 특성; 또는
    e) 인간 c- fms의 존재하에서 인간 M-CSF에 결합하는 특성
    중 적어도 하나의 특성을 보유하는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  3. 제2항에 있어서, c- fms와의 결합을 차단하고 1.0 x 10-7 M 이하의 KD로 M-CSF에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  4. M-CSF에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 8.10.3F 또는 이의 항원-결합 부위.
  5. M-CSF에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 9.14.4I 또는 이의 항원-결합 부위.
  6. a) M-CSF에 결합하기 위해 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체와 교차-경쟁하는 특성;
    b) M-CSF에 결합하기 위하여 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체와 경쟁하는 특성;
    c) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3- Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체와 동일한 M-CSF의 에피토프에 결합하는 특성;
    d) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체와 실질적으로 동일한 KD로 M-CSF에 결합하는 특성; 및
    e) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체와 실질적으로 동일한 해리 속도로 M-CSF에 결합하는 특성
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 특성 중 하나 이상을 가지는, 인간 M-CSF에 특이적으로 결합하여 이를 억제하는 인간화 항체, 키메라 항체 또는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  7. a) 시그널 서열 없이, 서열 번호 2에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 4에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    b) 시그널 서열 없이, 서열 번호 6에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번 호 8에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    c) 시그널 서열 없이, 서열 번호 10에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 12에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    d) 시그널 서열 없이, 서열 번호 14에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 16에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    e) 시그널 서열 없이, 서열 번호 18에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 20에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    f) 시그널 서열 없이, 서열 번호 22에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 24에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    g) 시그널 서열 없이, 서열 번호 26에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 28에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    h) 시그널 서열 없이, 서열 번호 38에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 28에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    i) 시그널 서열 없이, 서열 번호 54에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 56에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    j) 시그널 서열 없이, 서열 번호 74에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 56에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    k) 시그널 서열 없이, 서열 번호 78에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 56에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    l) 시그널 서열 없이, 서열 번호 82에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 28에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    m) 시그널 서열 없이, 서열 번호 102에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 28에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    n) 시그널 서열 없이, 서열 번호 30에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 32에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    o) 시그널 서열 없이, 서열 번호 30에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 44에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    p) 시그널 서열 없이, 서열 번호 58에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 60에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    q) 시그널 서열 없이, 서열 번호 62에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 60에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    r) 시그널 서열 없이, 서열 번호 90에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 44에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    s) 시그널 서열 없이, 서열 번호 94에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 60에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    t) 시그널 서열 없이, 서열 번호 98에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 32에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    u) 시그널 서열 없이, 서열 번호 34에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 36에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    v) 시그널 서열 없이, 서열 번호 46에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 48에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    w) 시그널 서열 없이, 서열 번호 50에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    x) 시그널 서열 없이, 서열 번호 66에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
    y) 시그널 서열 없이, 서열 번호 70에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
    z) 시그널 서열 없이, 서열 번호 86에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 48에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체
    로 구성되는 군으로부터 선택되는, M-CSF에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    a) 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄로부터 독립적으로 선택되는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는
    b) 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3
    를 포함하는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  9. a) 중쇄가 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하거나;
    b) 경쇄가 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하거나;
    c) (a)의 중쇄 및 (b)의 경쇄를 포함하거나; 또는
    d) 중쇄 및 경쇄 CDR 아미노산 서열이 동일한 항체로부터 선택되는 (c)의 항체인,
    M-CSF에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  10. a) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄의 CDR1의 첫 아미노산부터 CDR3의 마지막 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    b) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄의 CDR1의 첫 아미노산부터 CDR3의 마지막 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    c) (a)의 중쇄 및 (b)의 경쇄; 또는
    d) 동일한 항체로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 (a)의 중쇄 및 (b)의 경쇄
    를 포함하는 것인, M-CSF에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  11. 제10항에 있어서,
    a) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 가변 도메인(VH) 아미노산 서열(시그널 서열 없음);
    b) 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열(시그널 서열 없음);
    c) (a)의 VH 아미노산 서열 및 (b)의 VL 아미노산 서열; 또는
    d) 동일 항체에서 유래하는 (a)의 VH 아미노산 서열 및 (b)의 VL 아미노산 서열
    을 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  12. a) 시그널 서열 없이 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) 시그널 서열 없이 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    c) 시그널 서열 없이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    d) 시그널 서열 없이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    e) 시그널 서열 없이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    f) 시그널 서열 없이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    g) 시그널 서열 없이 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    h) 시그널 서열 없이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    i) 시그널 서열 없이 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    j) 시그널 서열 없이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    k) 시그널 서열 없이 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    l) 시그널 서열 없이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    m) 시그널 서열 없이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    n) 시그널 서열 없이 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    o) 시그널 서열 없이 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    p) 시그널 서열 없이 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    q) 시그널 서열 없이 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    r) 시그널 서열 없이 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    s) 시그널 서열 없이 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    t) 시그널 서열 없이 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    u) 시그널 서열 없이 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    v) 시그널 서열 없이 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    w) 시그널 서열 없이 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    x) 시그널 서열 없이 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    y) 시그널 서열 없이 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 시그널 서열 없이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 시그널 서열 없이 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  15. a) 시그널 서열 없이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) 시그널 서열 없이 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    c) 시그널 서열 없이 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    d) 시그널 서열 없이 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    e) 시그널 서열 없이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    f) 시그널 서열 없이 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    g) 시그널 서열 없이 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    h) 시그널 서열 없이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    i) 시그널 서열 없이 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    j) 시그널 서열 없이 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    k) 시그널 서열 없이 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    l) 시그널 서열 없이 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    m) 시그널 서열 없이 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    n) 시그널 서열 없이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 시그널 서열 없이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  17. 제15항에 있어서, 시그널 서열 없이 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  18. 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 FR1, FR2, FR3 또는 F4 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, M-CSF에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  19. 제1항에 있어서,
    a) 시그널 서열 없이, 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는9.14.4G1의 중쇄 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열;
    b) 시그널 서열 없이, 모노클로날 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 또는 9.14.4G1의 경쇄 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열; 또는
    c) (a)의 중쇄 아미노산 서열 및 (b)의 경쇄 아미노산 서열
    을 포함하는 인간 모노클로날 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 부위의 중쇄의 C-말단 리신이 존재하지 않는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 부위.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 부위 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 항체가 모노클로날 항-M-CSF 항체 9.14.4I 또는 8.10.3F인 약학 조성물.
  23. M-CSF를 억제하는 제1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부위, 또는 제21항 또는 제22항의 약학 조성물의 치료 유효량을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 비롯한 대상체에서 관절염, 건선 관절염, 강직척추염, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 통풍, 외상성 관절염, 풍진 관절염 및 급성 윤활막염 및 기타 관절염 증상, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 그람 음성 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 알츠하이머 병, 졸중, 신경외상, 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 뇌 말라리아, 만성 폐렴 염증 질병, 규소폐증, 폐사르코이드증, 뼈 흡수 질병, 골다공증, 재협착, 심장 및 신장 재관류 손상, 혈전증, 사구체신염, 당뇨병, 이식편 대 숙주 반응, 동종이식 거부, 염증성 장 질병, 크론 병, 궤양성 결장염, 다발성 경화증, 근육 퇴화, 습진, 접촉성 피부염, 건선, 일광화상, 및 결막염 쇼크로 구성되는 군으로부터 선택되는 증상을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 증상이 류마티스성 관절염인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 사용되는 항체가 모노클로날 항-M-CSF 항체 8.10.3F 또는 9.14.4I인 방법.
  26. c- fms에의 M-CSF 결합을 억제하는 제1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 부위 또는 제21항 또는 제22항의 약학 조성물을 대상체 에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 비롯한 대상체에서 육종, 암종과 같은 고형 종양 또는 림프종과 같은 비-고형 종양을 치료하는 방법.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 부위 또는 상기 항체 또는 상기 항원-결합 부위의 중쇄 또는 경쇄를 생산하는 단리된 세포주.
  28. 제27항에 있어서, 항체 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 및 9.14.4G1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 및 전술한 항체 중 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산하는 세포주.
  29. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위 또는 경쇄 또는 이의 항원-결합 부위를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  30. 제29항의 핵산 분자 및 임의로 이 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터.
  31. 제30항의 벡터 또는 제29항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  32. 제31항에 있어서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 부위의 중쇄를 암호하는 핵산 분자 및 경쇄를 암호하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  33. 적합한 조건하에서 제32항의 숙주 세포 또는 제28항의 세포주를 배양하고 항-M-CSF 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 회수하는 것을 포함하는, 항-M-CSF 항체 또는 이의 항원-결합 부위의 제조 방법.
  34. a) 인간 항체를 생산할 수 있는 비-인간 형질전환 동물을 M-CSF, M-CSF의 면역원성 부위 또는 M-CSF를 발현하는 세포 또는 조직으로 면역화시키는 단계;
    b) 상기 형질전환 동물이 M-CSF에 대한 면역반응을 일으키게 하는 단계; 및
    c) 상기 형질전환 동물로부터 B 림프구를 단리하는 단계
    를 포함하는, M-CSF에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 제조 방법.
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