BRPI0414269B1 - anticorpos monoclonais humanos anti-m-csf, método de preparação dos mesmos, composição farmacêutica, moléculas de ácido nucléico isoladas e vetor - Google Patents

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Narasimha Devalaraja Madhav
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Kellermann Sirid-Aimee
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Abstract

"anticorpos para m-csf". a presente invenção refere-se a anticorpos e porções de ligação de antígeno desses que se ligam especificamente a m-csf, preferivelmente m-csf humano, e que funcionam para inibir um m-csf. a invenção refere-se ainda a anticorpos anti-m-csf humanos e porções de ligação de antígeno desses. a invenção refere-se ainda a anticorpos que são anticorpos ou porções de proteínas de fusão de cadeia única, derivados, biespecíficos, quiméricos. a invenção se refere ainda a imunoglobulinas de cadeia pesada e leve isoladas derívadas de anticorpos anti-m-csf humanos e moléculas de acido nucléico que codificam tais imunoglobulinas. a presente invenção se refere ainda a métodos para fazer anticorpos anti-m-csf humanos, composições compreendendo esses anticorpos e métodos para usar os anticorpos e composição e para diagnóstico e tratamento. a invenção ainda fornece métodos de terapia gênica usando moléculas de ácido nucléico que codificam as moléculas de imunoglobulina pesadas e/ou leves que compreendem os anticorpos anit-m-csf humano. a invenção refere-se ainda a animais transgênicos e plantas transgênicas compreendendo moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS ANTI-M-CSF, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DOS MESMOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADAS E VETOR.
[0001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos
Estados Unidos 60/502,163, depositado em 10 de setembro de 2003. Antecedentes da Invenção [0002] A presente invenção refere-se ao fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF) é um membro da família de proteínas referidas como fatores estimuladores de colônia (CSFs). M-CSF é uma glicoproteína secretada ou de superfície celular compreendida de duas subunidades que são unidas por uma ponte de dissulfeto com uma massa molecular total variando de 40 a 90 kD (Stanley E. R., et al., Mol. Reprod. Dev., 46:4-10(1997)). Semelhante a outras CSFs, M-CSF é produzida por macrófagos, monócitos e células de tecido articular humano, tais como condrócitos e fibroblastos sinoviais, em resposta e proteínas, tais como interleucina-1 ou fator de necrose tumoral-alfa. MCSF estimula a formação de colônias de macrófago a partir de célulastronco progenitoras hematopoiéticas pluripotentes (Stanley E. R., et al., Mol. Reprod. Dev., 46:4-10(1997)).
[0003] M-CSF tipicamente se liga ao seu receptor, c-fms, a fim de exercer um efeito biológico. c-fms contém cinco domínios Ig extracelulares, um domínio transmembrana, e um domínio intracelular com dois domínios quinase. Quando M-CSF se liga a c-fms, o receptor homo-dimeriza e inicia uma cascata de vias de transdução de sinais incluindo as vias JAK/STAT, PI3K, e ERK.
[0004] M-CSF é um importante regulador da função, ativação, e sobrevivência de monócitos/macrófagos. Muitos modelos animais confirmaram o papel de M-CSF em várias doenças, incluindo artrite reumatóide (RA) e câncer. Macrófagos compreendem células efetoras
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 7/156
2/140 chave em RA. O grau de infiltração de macrófago em RA tem se mostrado intimamente correlacionado com a extensão da destruição da articulação subjacente. M-CSF, endogenamente produzido na articulação reumatóide por monócitos/macrófagos, fibroblastos, e células endoteliais, age nas células da linhagem de monócito/macrófago para promover sua sobrevivência e diferenciação em osteoclastos destruidores do osso, e aumentam funções celulares pró-inflamatórias tais como citotoxicidade, produção de superóxido, fagocitose, quimiotaxia e produção de citocina secundária. Por exemplo, tratamento com M-CSF no modelo de artrite experimental induzida por sonicado de streptococcus agalactiae de rato leva a patologia aumentada (Abd, A.H., et al., Lymphokine Cytokine Res. 10:43-50 (1991)). De forma semelhante, injeções subcutâneas de M-CSF em um modelo murino de artrite induzida por colágeno (CIA), que é um modelo para RA, resultou uma exacerbação significativa dos sintomas da doença de RA (Campbell I.K., et al., J. Leuk. Biol. 68:144-150 (2000)). Além disso, camundongos MRL/lpr que são altamente suscetíveis a RA e outras doenças autoimunes elevaram as concentrações séricas de M-CSF basais (Yui M.A., et al., Am. J. Pathol. 139:255-261 (1991)). A necessidade da M-CSF endógena de manter CIA foi demonstrada por uma significativa redução na severidade de doença estabelecida por anticorpo monoclonal de camundongo neutralizador de M-CSF (Campbell I.K., et al., J. Leuk. Biol. 68:144-150 (2000)).
[0005] Com relação ao câncer, inibição de fatores estimuladores de colônia por oligonucleotídeos antisenso suprime o crescimento tumoral em xenoenxertos de tumor de cólon e embriônico em camundongos pela desaceleração da destruição de ECM mediada por macrófago. (Seyedhossein, A., et al., Cancer Research, 62:5317-5324 (2002)).
[0006] Ligação de M-CSF a c-fms e sua subseqüente ativação é importante em muitos estados de doença. Além de RA e câncer, os
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3/140 outros exemplos de estados de doença relacionados a M-CSF incluem osteoporose, artrite destrutiva, aterogênese, glomerulonefrite, doença de Kawasaki, e infecção por HIV-1, nas quais monócitos/macrófagos e tipos celulares relacionados tem um papel. Por exemplo, osteoclastos são semelhantes a macrófagos e são regulados em parte por M-CSF. Sinais de crescimento e diferenciação induzidos por M-CSF nos estágios iniciais da maturação de osteoclastos são essenciais para suas atividade osteoclástica subseqüente no osso.
[0007] Perda óssea mediada por osteoclasto na forma de erosões ósseas focais e osteoporose justa-articular mais difusa, é um problema importante não solucionado em RA. As conseqüências dessa perda óssea incluem deformidades nas articulações, incapacidade funcional, risco aumentado de fraturas ósseas e mortalidade aumentada. M-CSF é singularmente essencial para osteoclastogênese e bloqueio experimental dessa citocina em modelos animais de artrite impede com sucesso a destruição articular. Vias destrutivas semelhantes são conhecidas de operar em outras formas de artrite destrutiva tais como artrite psoriásica, e podem representar locais para intervenções semelhantes.
[0008] Perda óssea pós-menopáusica resulta do remodelamento ósseo defeituoso secundário a um desacoplamento da formação óssea até reabsorção óssea exuberante mediada por osteoclasto como uma conseqüência da deficiência de estrogênio. Neutralização in vivo de MCSF usando um anticorpo bloqueador tem mostrado, em camundongos, prevenir completamente a elevação do número de osteoclastos, o aumento na reabsorção óssea e a perda óssea resultante induzida por ovariectomia.
[0009] Várias linhas de evidência apontam para um papel central para M-CSF na aterogênese, e em hiperplasia intima proliferativa após trauma mecânico na parede arterial. Todos os tipos celulares principais
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4/140 em lesões ateroscleróticas tem mostrado expressar M-CSF, e isso é adicionalmente supra-regulado por exposição lipoproteína oxidada. Bloqueio da sinalização de M-CSF com um anticorpo de c-fms neutralizante reduz o acúmulo de células esponjosas derivadas de macrófagos na raiz da aorta de camundongos deficientes em apoliproteína E mantidos em uma dieta altamente gordurosa.
[00010] Tanto em glomerunofrite experimental como humana, expressão de M-CSF glomerular tem sido encontrada co-localizada com acúmulo, ativação e proliferação de macrófago local e correlacionada com a extensão de dano glomerular e proteinúria. Bloqueio de sinalização de M-CSF via um anticorpo direcionado contra seu receptor c-fms regula negativamente, de forma significativa, acúmulo de macrófogo local em camundongo durante a resposta inflamatória renal induzida por obstrução uretérica unilateral experimental.
[00011] A doença de Kawasaki (KD) é uma vasculite pediátrica, aguda, febril de causa desconhecida. Suas complicações mais sérias e comuns envolvem a vasculatura coronária na forma de dilatação aneurismática. Níveis de M-CSF séricos estão significativamente elevados na fase aguda da doença de Kawasaki, e normalizam seguindo tratamento com imunoglobulina intravenosa. Arterite de célula gigante (GCA) é uma vasculopatia inflamatória que ocorre principalmente no idoso na qual células T e macrófagos infiltram as paredes de artérias médias e largas levando a conseqüências clínicas que incluem cegueira e acidente vascular cerebral secundário à oclusão arterial. O envolvimento ativo de macrófagos em GCA é evidenciado pela presença de níveis elevados de mediadores inflamatórios derivados de macrófagos nas lesões vasculares.
[00012] Tem sido relatado que M-CSF torna macrófagos derivados de monócitos humanos mais suscetíveis à infecção por HIV-1 in vitro. Em um estudo recente, M-CSF aumentou a freqüência com que
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5/140 macrófagos derivados de monócitos ficaram infectados, a quantidade de RNAm de HIV por célula infectada, e o nível de DNA pró-viral expresso por cultura infectada.
[00013] Dado o papel do M-CSF em várias doenças, um método para inibir a atividade de M-CSF é desejável.
[00014] Há uma necessidade crítica por anticorpos anti-M-CSF terapêuticos.
Sumário da Invenção [00015] A presente invenção fornece anticorpos humanos ou porções de ligação de antígeno desses que se ligam especificamente a M-CSF humano e agem como antagonista de M-CSF e composições compreendendo ditos anticorpos ou porção.
[00016] A invenção ainda fornece composições compreendendo a cadeia pesada e/ou leve, as regiões variáveis dessas, ou porções de ligação de antígeno dessas, um anticorpo anti-M-CSF, ou moléculas de acido nucléico que codificam um anticorpo, cadeia de anticorpo ou região variável desse, a invenção eficaz em tal tratamento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, as composições podem ainda compreender outro componente, tal como um agente terapêutico, ou um agente diagnóstico. Métodos diagnósticos e terapêuticos são ainda fornecidos pela invenção. Em certas modalidades, as composições são usadas em uma quantidade terapeuticamente eficaz para tratar ou prevenir uma doença ou condição particular.
[00017] A invenção ainda fornece métodos para tratar ou prevenir uma variedade de doenças e condições tais como, mas não limitadas a, inflamação, câncer, aterogênese, distúrbios neurológicos e distúrbios cardíacos com uma quantidade eficaz do anticorpo anti-M-CSF da invenção, ou porção de ligação desse, ácidos nucléicos que codificam dito anticorpo, ou cadeia pesada e/ou leve, as regiões variáveis, ou
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6/140 porções de ligação de antígeno desse.
[00018] A invenção fornece linhagens celulares isoladas, tais como hibridomas, que produzem anticorpos anti-M-CSF ou porções de ligação de antígeno desses.
[00019] A invenção fornece ainda moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos anti-M-CSF, as regiões variáveis dessas, ou as porções de ligação de antígeno dessas. [00020] A invenção fornece vetores e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucléico, assim como métodos de produzir de recombinantemente os polipeptídios codificados pelas moléculas de ácido nucléico.
[00021] Plantas ou animais transgênicos não humanos que expressam as cadeias pesadas e/ou leves, ou porções de ligação de antígeno dessas, de anticorpos anti-M-CSF são ainda fornecidos. Breve Descrição dos Desenhos [00022] Figuras 1A e 1B são gráficos ilustrando que os anticorpos anti-M-CSF resultaram em uma diminuição relacionada a dose na contagem total de monócitos em macacos machos e fêmeas durante o tempo. As contagens de monócitos foram determinadas por dispersão da luz usando um sistema Abbott Diagnostics Inc. Cell Dyn. Contagens de monócitos foram monitoradas por 24 horas até 3 semanas após administração de veículo ou anticorpo 8.10.3 a 0, 0.1, 1 ou 5 mg/kg em um volume de dose de 3,79 mL/kg durante um período de aproximadamente 5 minutos.
[00023] Figura 1A macacos machos.
[00024] Figura 1B macacos fêmeas.
[00025] Figuras 2A e 2B são gráficos ilustrando que o tratamento com anti-M-CSF resultou em uma redução da porcentagem de monócitos CD14+CD16+, em macacos machos e fêmeas. 0-21 dias após administração de veículo ou anticorpo 8.10.3 a 0, 0.1, 1 ou 5 mg/kg
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7/140 em um volume de dose de 3,79 mL/kg durante um período de aproximadamente 5 minutos. Para cada macaco testado, a porcentagem dos monócitos no subconjunto CD14+CD16+ foi determinada após cada extração de sangue, nos dias 1, 3, 7, 14 e 21 após injeção de 8.10.3.
[00026] Figura 2A macacos machos.
[00027] Figura 2B macacos fêmeas.
[00028] Figuras 3A e 3B são gráficos ilustrando que o tratamento com anti-M-CSF resultou em uma redução da porcentagem de mudança de monócitos totais em todas as doses de anticorpo 8.10.3F e anticorpo
9.14.4I se comparado com níveis de monócitos de pré-teste.
[00029] Figura 3A mostra dados coletados de experimentos usando anticorpo 8.10.3F.
[00030] Figura 3B mostra dados coletados de experimentos usando anticorpo 9.14.4I.
[00031] Figura 4 é um alinhamento de seqüência das seqüências de aminoácido previstas das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de vinte e seis anticorpos anti-M-CSF comparados com as seqüências de aminoácidos de linhagem germinativa dos genes das regiões variáveis correspondentes. Diferenças entre as seqüências de aminoácidos e as seqüências de gene da linhagem germinativa são indicadas em negrito. Traços representam nenhuma diferença em relação a linhagem germinativa. As seqüências sublinhadas em cada alinhamento representam, da esquerda para a direita, as seqüências de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[00032] Figura 4A mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 252 (resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00033] Figura 4B mostra um alinhamento da seqüência de
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8/140 aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 88 (resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 8) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00034] Figura 4C mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 100 (resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 12) com a seqüência de VkL2, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 107).
[00035] Figura 4D mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
3.8.3 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 16) com a seqüência de VkL5, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 109).
[00036] Figura 4E mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
2.7.3 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 20) com a seqüência de VkL5, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 117).
[00037] Figura 4F mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 1.120.1 (resíduos 21-134 de SEQ ID NO: 24) com a seqüência de VkB3, Jk1 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 112).
[00038] Figura 4G mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 252 (resíduos 20-136 de SEQ ID NO: 2) com a seqüência de Vh3-11, Dh7-27 Jh6 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 106).
[00039] Figura 4H mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 88 (resíduos 20-138 de SEQ ID NO: 6) com a seqüência de Vh3-7, Dh6-13 Jh4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 105).
[00040] Figura 4I mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 100 (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 10) com a seqüência de
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Vh3-23, Dh1-26 Jh4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 104). [00041] Figura 4J mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 3.8.3 (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 14) com a seqüência de Vh3-11, Dh7-27 Jh4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 108).
[00042] Figura 4K mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 2.7.3 (resíduos 20-137 de SEQ ID NO: 18) com a seqüência de Vh3-33, Dh1-26 Jh4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 110).
[00043] Figura 4L mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 1.120.1 (resíduos 20-139 de SEQ ID NO: 22) com a seqüência de Vh1-18, Dh4-23 Jh4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 111).
[00044] Figura 4M mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
8.10.3 (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 44) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00045] Figura 4N mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3 (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 30) com a seqüência de Vh3-48, Dh1-26 JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
[00046] Figura 4O mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.14.4 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 28) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00047] Figura 4P mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4 (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 38) com a seqüência de Vh3-11, Dh7-27 JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00048] Figura 4Q mostra um alinhamento da seqüência de
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10/140 aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.7.2 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 48) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00049] Figura 4R mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.7.2 (resíduos 20-136 de SEQ ID NO: 46) com a seqüência de Vh3-11, Dh6-13 JH6b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 115).
[00050] Figura 4S mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.14.4I (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 28) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00051] Figura 4T mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4I (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 26) com a seqüência de Vh3-11, Dh7-27, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00052] Figura 4U mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 8.10.3F (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 32) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00053] Figura 4V mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3F (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 30) com a seqüência de Vh3-48, Dh1-26, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
[00054] Figura 4W mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 9.7.2IF (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 36) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00055] Figura 4X mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.7.2IF (resíduos 20-136 de SEQ ID NO: 34) com a seqüência
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11/140 de Vh3-11, Dh6-13 Jh6L· da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 115). [00056] Figura 4Y mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 9.7.2C-Ser (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 52) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00057] Figura 4Z mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.7.2C-Ser (resíduos 20-136 de SEQ ID NO: 50) com a seqüência de Vh3-11, Dh6-13 Jh6ó da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 115).
[00058] Figura 4AA mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 9.14.4C-Ser (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 56) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00059] Figura 4BB mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4C-Ser (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 54) com a seqüência de Vh3-11, Dh7-27 Jh4ó da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00060] Figura 4CC mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 8.10.3C-Ser (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 60) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00061] Figura 4DD mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3C-Ser (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 58) com a seqüência de Vh3-48, Dh1-26 Jh4ó da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
[00062] Figura 4EE mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
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8.10.3- CG2 (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 60) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00063] Figura 4FF mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3-CG2 (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 62) com a seqüência de Vh3-48, Dh1-26 JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
[00064] Figura 4GG mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.7.2- CG2 (resíduos 21-130 de SEQ ID NO: 52) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00065] Figura 4HH mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.7.2-CG2 (resíduos 20-136 de SEQ ID NO: 66) com a seqüência de Vh3-11, Dh6-13 JH6b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 115).
[00066] Figura 4II mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.7.2- CG4 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 52) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00067] Figura 4JJ mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.7.2-CG4 (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 70) com a seqüência de Vh3-11, Dh6-13, JH6b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 115).
[00068] Figura 4KK mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.14.4- CG2 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 56) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00069] Figura 4LL mostra um alinhamento da seqüência de
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13/140 aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4-CG2 (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 74) com a seqüência de VH3-11, DH7-27, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00070] Figura 4MM mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.14.4- CG4 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 56) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00071] Figura 4NN mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4-CG4 (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 78) com a seqüência de VH3-11, DH7-27, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00072] Figura 4OO mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.14.4- Ser (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 28) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00073] Figura 4PP mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4-Ser (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 82) com a seqüência de VH3-11, DH7-27, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00074] Figura 4QQ mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
9.7.2-Ser (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 48) com a seqüência de VkO12, Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00075] Figura 4RR mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.7.2-Ser (resíduos 20-136 de SEQ ID NO: 86) com a seqüência de VH3-11, DH6-13, JH6b da linhagem germinativa (SEQ ID
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NO: 115).
[00076] Figura 4SS mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
8.10.3- Ser (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 44) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00077] Figura 4TT mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3-Ser (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 90) com a seqüência de VH3-48, DH1-26, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
[00078] Figura 4UU mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
8.10.3- CG4 (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 60) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00079] Figura 4VV mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3-CG4 (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 94) com a seqüência de VH3-48, DH1-26, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
[00080] Figura 4WW mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo 9.14.4G1 (resíduos 23-130 de SEQ ID NO: 28) com a seqüência de VkO12 Jk3 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 103).
[00081] Figura 4XX mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 9.14.4G1 (resíduos 20-135 de SEQ ID NO: 102) com a seqüência de VH3-11, DH7-27 JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 116).
[00082] Figura 4YY mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia leve para o anticorpo
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8.10.3FG1 (resíduos 21-129 de SEQ ID NO: 32) com a seqüência de VkA27, Jk4 da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 114).
[00083] Figura 4ZZ mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido prevista da região variável da cadeia pesada para o anticorpo 8.10.3FG1 (resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 98) com a seqüência de Vh3-48, Dh1-26, JH4b da linhagem germinativa (SEQ ID NO: 113).
Descrição Detalhada da Invenção
Definições e Técnicas gerais [00084] A menos que de outra maneira aqui definido, termos técnicos e científicos usados com relação a presente invenção possuirão os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Ainda, a menos que de outra maneira necessitado pelo contexto, termos no singular incluirão pluralidades e termos no plural incluirão o singular. Geralmente, nomenclaturas usadas com relação a, e técnicas de, cultura de tecido ou célula, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteína e ácido nucléico aqui descritas são aquelas conhecidas e comumente usadas na técnica.
[00085] Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem-conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas na presente especificação a menos que de outra maneira indicado. Veja, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que estão aqui incorporadas por referência. Reações enzimáticas e técnicas de
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16/140 purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente executado na técnica ou como aqui descrito. As nomenclaturas usadas com relação a, e procedimentos laboratoriais e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica aqui descritas são aquelas bemconhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para síntese química, análise química, preparação, formulação e entrega farmacêutica, e tratamento de pacientes.
[00086] Os seguintes termos, a menos que de outra maneira indicado, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados: [00087] O termo polipeptídio abrange proteínas naturais ou artificiais, fragmentos de proteína e análogos de polipeptídio de uma seqüência de proteína. Um polipeptídio pode ser monomérico ou polimérico.
[00088] O termo proteína isolada, polipeptídio isolado ou anticorpo isolado é uma proteína, polipeptídio, ou anticorpo que em virtude de sua origem ou fonte de derivação possui um a quatro dos seguintes: (1) não está associado com componentes associados naturalmente que o acompanha em seu estado natural, (2) está livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Desta forma, um polipeptídio que é sintetizado quimicamente ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula da qual ele se origina naturalmente estará isolado de seus componentes associados naturalmente. Uma proteína pode ainda ser tornada substancialmente livre de componentes associados naturalmente por isolamento, usando técnicas de purificação de proteínas bem-conhecidas na técnica.
[00089] Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo antiM-CSF que foi purificado por afinidade usando M-CSF, um anticorpo anti-M-CSF que foi sintetizado por hibridoma ou outra linhagem celular
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17/140 in vitro, e um anticorpo anti-M-CSF humano derivado de um camundongo transgênico.
[00090] Uma proteína ou polipeptídio é substancialmente puro, substancialmente homogêneo ou substancialmente purificado quando pelo menos cerca de 60 a 75% de uma amostra exibe uma única espécie de polipeptídio. O polipeptídio ou proteína pode ser monomérica ou multimérica. Um polipeptídio ou proteína substancialmente puro irão compreender tipicamente cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% P/P de uma amostra de proteína mais usualmente cerca de 95%, e preferivelmente será superior a 99% pura. Pureza ou homogeneidade de proteína pode ser indicada por muitos meios conhecidos na técnica, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguida por visualizar uma única banda polipeptídica corando-se o gel com uma corante bemconhecido na técnica. Para certos fins, maior resolução pode ser fornecida pelo uso de HPLC ou outros meios bem-conhecidos na técnica para purificação.
[00091] O termo fragmento de polipeptídio como aqui usado se refere a um polipeptídio que possui uma deleção amino-terminal e/ou carbóxi-terminal, mas onde a seqüência de aminoácido remanescente é idêntica às posições correspondentes na seqüência de ocorrência natural. Em algumas modalidades, fragmentos são de pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de extensão. Em outras modalidades, os fragmentos são de pelo menos 14, pelo menos 20, pelo menos 50, ou pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de extensão.
[00092] O termo análogo de polipeptídio como aqui usado se refere a um polipeptídio que compreende um segmento que tem identidade substancial com uma porção de uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica a M-CSF sob condições adequadas de ligação, (2) habilidade de inibir MPetição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 23/156
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CSF.
[00093] Tipicamente, análogos de polipeptídio compreendem uma substituição de aminoácido conservativa (ou inserção ou deleção) em relação à seqüência de ocorrência natural. Análogos geralmente são de pelo menos 20 ou 25 aminoácidos de extensão, preferivelmente de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de extensão ou mais extensos, e podem freqüentemente ser tão longos quanto um polipeptídio inteiro.
[00094] Em algumas modalidades, substituições de aminoácidos do anticorpo ou porção de ligação de antígeno desse são aquelas que: (1) reduzem suscetibilidade a proteólise, (2) reduzem suscetibilidade a oxidação, (3) alteram afinidade de ligação com complexos de proteína em formação, ou (4) conferem ou modificam outras propriedades fisicoquímicas ou funcionais de tais análogos. Análogos podem incluir várias muteínas de uma seqüência outras que a seqüência de peptídio de ocorrência normal. Por exemplo, substituições de aminácido únicas ou múltiplas (preferivelmente substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na seqüência de ocorrência normal, preferivelmente a porção do polipeptídio fora do(s) domínio(s) formador(es) de contatos intermoleculares.
[00095] Uma substituição de aminoácido conservativa não deve alterar substancialmente as características estruturais da seqüência parental, por exemplo, um aminoácido substituto não deve alterar a folha-β anti-paralela que compõe o domínio de ligação da imunoglobulina que ocorre na seqüência parental, ou quebrar outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência parental. Em geral, análogos de glicina e prolina não deveriam ser usadas em uma folha-β anti-paralela. Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídios reconhecidos na técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and
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Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); e Thornton et al., Nature 354:105 (1991), que estão aqui incorporadas por referência.
[00096] Análogos não-peptídicos são comumente usados na indústria farmacêutica como fármacos com propriedades análogas àquelas do peptídio molde. Esses tipos de compostos não-peptídicos são chamados miméticos de peptídio ou peptidomiméticos. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger, TINS p.392 (1985). e Evans et al., J. Méd. Chem. 30:1229 (1987), que estão aqui incorporados por referência. Tais compostos são freqüentemente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos de peptídio que são estruturalmente semelhantes aos peptídios terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes ao polipeptídio padrão (isto é, um polipeptídio que possui uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica desejada), tais como um anticorpo humanos, mas possui uma ou mais ligações opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada a partir do grupo que consiste em -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (Cis e trans), -COCH2-, CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, por métodos bem-conhecidos na técnica. Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ainda ser usada para gerar peptídios mais estáveis. Além disso, peptídios reprimidos compreendendo uma seqüência consenso ou uma variação de seqüência consenso substancialmente idêntica pode ser gerada por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch, Ann. Rer. Biochem. 61:387 (1992), aqui incorporada por referência); por exemplo, pela adição de resíduos de
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20/140 cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídio.
[00097] Um anticorpo se refere a um anticorpo intacto ou porção de ligação de antígeno que compete com o anticorpo intacto por ligação específica. Veja, geralmente, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins). Porções de ligação de antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Em algumas modalidades, porções de ligação de antígeno incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, e fragmentos da região de determinação de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipeptídios que contêm pelo menos uma porção de um anticorpo que é suficiente para conferir ligação de antígeno especifica ao polipeptídio.
[00098] Da N-terminação a C-terminação, ambos os domínios variáveis da cadeia leve e pesada maduros compreendem as regiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A escolha de aminoácidos para cada domínio está de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:9010917 (1987), ou Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).
[00099] Como aqui usado, um anticorpo que é referido por número é o mesmo que um anticorpo monoclonal que é obtido de um hibridoma do mesmo número. Por exemplo, anticorpo monoclonal 3.8.3 é o mesmo anticorpo que o obtido do hibridoma 3.8.3.
[000100] Como aqui usado, um fragmento Fd significa um fragmento de anticorpo que consiste dos domínios Vh e Ch 1; um fragmento Fv consiste dos domínios Vh e Vl de um único braço de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)) consiste em
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21/140 um domínio Vh.
[000101] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de cadeia única (scFv) em que os domínios Vl e Vh são pareados para formar moléculas monovalentes via um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia única de proteína (Bird et al., Science 242:423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Em algumas modalidades, os anticorpos são diacorpos, isto é, são anticorpos bivalentes em que os domínios Vh e Vl são expressos em uma cadeia polipeptídica única, mas usando um ligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, dessa forma forçando os domínios parearem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno. (Veja por exemplo, Holliger P. et ac., Proc. Natl, Acad, Sci. USA 90:6444-6448 (1993), e Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)). Em algumas modalidades, uma ou mais CDRs de um anticorpo da invenção podem ser incorporados em uma molécula tanto covalentemente quanto não-covalentemente para torná-la uma imunoadesina que se liga especificamente a M-CSF. Em tais modalidades, a(s) CDR(s) pode(m) ser incorporada(s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode(m) ser covalentemente ligada(s) a outra cadeia polipeptídica, ou pode(m) ser incorporada(s) nãocovalentemente.
[000102] Em modalidades que possuem um ou mais sítios de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos um ou outro ou podem ser diferentes.
[000103] Com aqui usado, o termo anticorpo humano significa qualquer anticorpo em que as seqüências do domínio variável e constante são seqüências humanas. O termo abrange anticorpos com seqüências derivadas de genes humanos, mas que foram alteradas, por exemplo, para diminuir possível imunogenicidade, aumentar afinidade,
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22/140 eliminar cisteínas que possam causar dobramento indesejado, etc. O termo abrange tais anticorpos produzidos recombinantemente em células não-humanas, que possam conferir glicosilação atípica de células humanas. Esses anticorpos podem ser preparados de uma variedade de maneiras, como descrito abaixo.
[000104] O termo anticorpo quimérico como aqui usado significa um anticorpo que compreende regiões de dois ou mais anticorpos diferentes. Em uma modalidade, uma ou mais das CDRs são derivadas de um anticorpo anti-M-CSF humano. Em outra modalidade, todas as CDRs são derivadas de um anticorpo anti-M-CSF humano. Em outra modalidade, as CDRs de mais de um anticorpo anti-M-CSF humano são combinadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-M-CSF humano, uma CDR2 da cadeia leve de um segundo anticoro anti-M-CSF humano e uma CDR3 da cadeia leve de um terceiro anticorpo anti-M-CSF humano, e as CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas de um ou mais outros anticorpos anti-M-CSF humanos. Além disso, as regiões estruturais podem ser derivadas de um ou mais dos anticorpos anti-M-CSF dos quais uma ou mais das CDRs são retiradas de um ou mais anticorpos humanos diferentes.
[000105] Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser rapidamente preparadas por aqueles versados na técnica seguindo os ensinamentos dessa especificação. Terminações -amino e -carbóxi preferidas de fragmentos ou análogos ocorrem próximo dos limites de domínios funcionais. Domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação de dados de seqüência de nucleotídeo e/ou aminoácido com bancos de dados de seqüências públicos ou particulares. Preferivelmente, métodos de comparação computadorizada são usados para identificar motivos da seqüência ou domínios da conformação da proteína prevista
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23/140 que ocorrem em outras proteínas de estrutura e /ou função conhecidas. Métodos para identificar seqüências de proteínas que se dobram em uma estrutura tri-dimensional são conhecidos. Veja Bowie et al., Science 253:164 (1991).
[000106] O termo ressonância de plásmon de superfície, como aqui usado se refere a um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações em concentrações de proteína dentro de uma matriz de biosensor, por exemplo usando o sistema BIACORETM (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Para descrições adiconais, veja Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al.,J. Mol. Reconit. 8:125-131 (1995) e Johnsson B. et al.,Anal. Biochem. 198:268-277 (1991).
[000107] O termo KD se refere a constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antígeno particular.
[000108] O termo epítopo inclui qualquer proteína determinante capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de célula T ou interagir de outra forma com uma molécula. Determinantes epitópicos geralmente consistem de grupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como cadeias laterais de aminoácidos ou de açúcar e geralmente possuem características estruturais tri-dimensionais específicas, assim como características de carga especificas. Um epítopo pode ser linear ou conformacional. Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula interagindo (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da seqüência de aminoácido primária da proteína. Em um epítopo conformacional, os pontos de interação ocorrem entre resíduos de aminoácidos na proteína que são separados um do outro. Um anticorpo é dito se ligar especificamente a um antígeno quando a constante de
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24/140 dissociação é < 1 mM, preferivelmente <100 nM e mais preferivelmente <10 nM. Em certas modalidades, o Kd é 1 pM a 500 pM. Em outras modalidades o Kd é 500 pM a 1 μΜ. Em outras modalidades, o Kd é entre 1 μM a 100 nM. Em outras modalidades, o Kd é entre 100 mM a 10 nM. Uma vez que um epítopo desejado sobre um antígeno é determinado, é possível gerar anticorpos para este epítopo, por exemplo, usando técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos podem elucidar informação sobre epítopos desejáveis. A partir dessa informação, é então possível rastrear anticorpos pela ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar isso é conduzir estudos de competição-cruzada para encontrar anticorpos que ligam competitivamente um com o outro, por exemplo, os anticorpos competem pela ligação ao antígeno. Um processo de alta produtividade para binning anticorpos baseados em sua competiçãocruzada é descrito no Pedido de Patente Internacional No. WO 03/48731.
[000109] Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem uso convencional. Veja Immunology - A Synthesis (2a edição, E.S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que está aqui incorporada por referência. [000110] O termo polinucleotídeo como aqui referido significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de extensão, ou ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer dos tipos de nucleotídeos. O termo inclui formas de fita simples e dupla.
[000111] O termo polinucleotídeo isolado como aqui usado significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação destas, que em virtude de sua origem ou fonte de derivação, o polinucleotídeo isolado possui um dos três seguintes: (1)
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25/140 não está associado com todo ou uma porção de polinucleotídeos com que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é operavelmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.
[000112] O termo oligonucleotídeo como aqui usado inclui nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados juntos por ligações de oligonucleotídeos de ocorrência de natural ou não-natural. Oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeo geralmente compreendendo uma extensão de 200 bases ou menos. Oligonucleotídeos preferíveis são de 10 a 60 bases de extensão e mais preferivelmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases de extensão. Oligonucleotídeos são usualmente de fita simples, por exemplo, para iniciadores e sondas; embora oligonucleotídeos da invenção possam ser de fita dupla, por exemplo, para uso na construção de um mutante de gene. Oligonucleotídeos da invenção podem ser tanto oligonucleotídeos senso ou anti-senso.
[000113] O termo nucleotídeos de ocorrência natural como aqui usado inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo nucleotídeos modificados como aqui usado inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. O termo ligações de oligonucleotídeos como aqui referido inclui ligações de oligonucleotídeos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e os semelhantes. Veja por exemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc.
106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Patente U.S. No.
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5,151,510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), as divulgações dos quais estão por meio deste incorporados por referência. Um oligonucleotídeo pode incluir uma marcação para detecção, se desejado.
[000114] Seqüências operavelmente ligadas incluem tanto as seqüências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse como seqüências de controle de expressão que agem em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. O termo seqüência de controle de expressão como aqui usado significa seqüências de polinucleotídeo que são necessárias para efetuar a expressão e processamento de seqüências codificantes as quais elas estão ligadas. Seqüências de controle de expressão incluem seqüências de iniciação, terminação, promotoras e intensificadores de transcrição apropriadas; sinais de processamento de RNA eficientes tais como sinais de splicing e poliadenilação; seqüências que estabilizam mRNA citoplasmático; seqüências que aumentam e eficiência da tradução (isto é, seqüência consenso de Kozak); seqüências que aumentam a estabilidade da proteína; e quando desejado, seqüências que aumentam a secreção de proteína. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotos, tais seqüências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossomal, e seqüência de terminação de transcrição; em eucariotos, geralmente tais seqüências de controle incluem promotores e seqüência de terminação de transcrição. O termo seqüências de controle pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento, e pode ainda incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüências compartilhadas de fusão.
[000115] O termo vetor como aqui usado significa uma molécula de
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27/140 acido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ele foi ligado. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo, isto é, um anel de DNA de fita dupla circular dentro do qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Em outras modalidades, os vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira dentro das quais são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Em outras modalidades, os vetores (por exemplo, vetores mamíferos não-epissomais) podem ser integrados dentro do genoma de uma célula hospedeira pela introdução na célula hospedeira, e por causa disso são replicadas junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são aqui referidos como vetores de expressão recombinantes (ou simplesmente vetores de expressão).
[000116] O termo célula hospedeira recombinante (ou simplesmente célula hospedeira), como aqui usado, significa uma célula dentro da qual um vetor de expressão recombinante tenha sido introduzido. Deveria ser entendido que célula hospedeira recombinante e célula hospedeira significam não apenas a célula em particular, mas também a progênie de tal célula. Pelo fato de que certas modificações podem ocorrem em gerações sucessivas devido ou a mutação ou influências ambientais, tal progênie pode não, de fato, ser idêntica à célula parental, mas são ainda incluídas dentro do escopo do termo célula hospedeira como aqui usado.
[000117] O termo hibridiza seletivamente aqui referido significa ligar detectavelmente e especificamente. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos desses de acordo com a invenção hibridizam seletivamente a
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28/140 fitas de ácidos nucléicos sob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicos não-específicos. Condições de alta estringência ou altamente estringente podem ser usadas para alcançar condições de hibridização seletiva como conhecido na técnica e aqui discutido. Um exemplo de condições de alta estrigência ou altamente estringente é a incubação de um polinucleotídeo com outro polinucleotídeo, em que um polinucleotídeo pode ser afixado a uma superfície sólida tal como uma membrana, e um tampão de hibridização de 6X SSPE ou SSC, formamida 50%, 5X reagente de Denhardt, SDS 0,5%, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão fragmentado, desnaturado e uma temperatura de hibridização de 42°C por 12-16 horas, seguido por lavar duas vezes a 55°C usando um tampão de lavagem de 1X SSC, SDS 0,5%. Veja também Sambrook, et al., supra, pp. 9.50-9.55.
[000118] O termo por cento de identidade de seqüência no contexto de seqüências de ácido nucléico significa a porcentagem de resíduos quando uma primeira seqüência contígua é comparada e alinhada para máxima correspondência com uma segunda seqüência contígua. A extensão da comparação de identidade de seqüência pode ser superior a um trecho de pelo menos nove nucleotídeos, usualmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotídeos, e preferivelmente pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucleotídeos. Há muitos algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de seqüência de nucleotídeo. Por exemplo, seqüências de polinucleotídeos podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas no Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, fornece
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29/140 alinhamentos e porcentagem de identidade de seqüência das regiões da melhor superposição entre as seqüências de dúvida e de pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); aqui incorporados por referência). A menos que de outra maneira especificado, parâmetros padrão para um programa ou algoritmo particular são usados. Por exemplo, porcentagem de identidade de seqüência entre seqüências de ácido nucléico pode ser determinada usando FASTA com seus parâmetros padrão (um tamanho de letra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de contagem) ou usando Gap com seus parâmetros padrão como fronecido em CGC Versão 6.1, aqui incorporado por referência.
[000119] Uma referência a uma seqüência de nucleotídeo abrange seu complemento a menos que de outra forma especificado. Dessa forma, uma referência a um ácido nucléico que possui uma seqüência particular deve ser entendida de abranger sua fita complementar com sua seqüência complementar.
[000120] O termo porcentagem de identidade de seqüência significa uma razão, expressa como uma porcentagem do número de resíduos idênticos sobre o número de resíduos comparado.
[000121] O termo similaridade substancial ou similaridade de seqüência substancial, quando se referindo a um ácido nucléico ou fragmento desse, significa que quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas com outro ácido nucléico (ou sua fita complementar), há identidade de seqüência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases do nucleotídeo, como medido por qualquer algoritmo bem-conhecido de identidade de seqüência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido acima.
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30/140 [000122] Como aplicado a polipeptídios, o termo identidade substancial significa que duas seqüências peptídicas, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando valores de diferença (gap weight) padrão, como fornecido com os programas, compartilham pelo menos 70%, 75% ou 80% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência. Em certas modalidades, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma substituição de aminoácido conservativa é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que possui um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não irá alterar substancialmente as propriedades funcionais da proteína. Em casos onde duas ou mais seqüências de aminoácidos diferem uma da outra por substituições conservativas, a porcentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Meios para fazer esse ajuste são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeis laterais hidroxil-alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais que contêm amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais que contêm enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituições de aminoácidos conservativas são:
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31/140 valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina.
[000123] Alternativamente, uma reposição conservativa é qualquer alteração que tem um valor positivo na matriz de log-similaridade PAM250 descrita em Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), aqui incorporada por referência. Uma reposição moderadamente conservativa é qualquer alteração que tem um valor não negativo na matriz de log-similaridade PAM250.
[000124] Identidade de seqüência para polipeptídios, é tipicamente medida usando programas de análise se seqüência. Programa de análise de seqüência combina seqüências usando medidas de similaridade designadas para várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, CGC contém programas tais como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão, como especificado com os programas, para determinar homologia de seqüência ou identidade de seqüência entre polipeptídios intimamente relacionados, tais como polipeptídios homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína selvagem e uma muteína dessa. Veja, por exemplo, CGC Versão 6.1. Seqüências de polipeptídios podem ainda ser comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, veja CGC Versão 6.1. (Universidade de Wisconsin WI) FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de seqüenciadas regiões da melhor superposição entre as seqüências de dúvida e de pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Outro algoritmo preferido quando comparando uma seqüência da invenção com um banco de dados contendo um grande numero de seqüências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros padrão, como
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32/140 fornecido como os programas. Veja, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389402 (1997).
[000125] A extensão de seqüências de polipeptídio comparadas para homologia será geralmente de pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácidos, usualmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos e preferivelmente mais do que cerca de 35 resíduos. Quando pesquisando um banco de dados contendo seqüências de um grande número de organismos diferentes, é preferível comparar seqüências de aminoácidos.
[000126] Como aqui usado, os termos rótulo ou marcado se referem a incorporação de outra molécula no anticorpo. Em uma modalidade, o rótulo é um indicador detectável, por exemplo, incorporação de um aminoácido radiorotulado ou ligação a um polipeptídio de porções biotinil que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um indicador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em outra modalidade, o rótulo ou indicador pode ser terapêutico, por exemplo, um conjugado de droga ou toxina. Vários métodos de marcar polipeptídios e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de rótulos para polipeptídios incluem, mas não são limitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforo de lantanide), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), rótulos quimioluminescentes, grupos biotinil, epítopos de polipeptídios predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para
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33/140 anticorpos secundários, domínios de ligação de metais, indicador de epítopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas tais como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1dehidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos desses. Em algumas modalidades, rótulos são ligados por braços espaçadores de vários tamanhos para reduzir impedimento estérico potencial.
[000127] Por toda essa especificação e reivindicações, a palavra compreende ou variações tais como compreendem ou compreendendo, serão entendidas como implicando a inclusão de um inteiro estabelecido ou grupos de inteiros mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.
Anticorpos Anti-M-CSF Humanos e Caracterização Desses [000128] Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos anti-MCSF humanizados. Em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos anti-M-CSF humanos. Em algumas modalidades, anticorpos anti-MCSF humanos são produzidos pela imunização de um animal transgênico não-humano, por exemplo, um roedor, cujo genoma compreende genes de imunoglobulina humana para que o roedor produza anticorpos humanos.
[000129] Um anticorpo anti-M-CSF da invenção pode compreender uma cadeia leve kappa humana ou lamda humana ou uma seqüência de aminoácido derivada delas. Em algumas modalidades compreendendo uma cadeia leve kappa, o domínio variável da cadeia leve (VL) é codificado em parte por um gene VkO12, VkL2, VkL5, VkA27 ou VkB3 e um gene Jk1 , Jk2, Jk3 ou Jk4. Em modalidades particulares da invenção, o domínio variável da cadeia leve é codificado pelo gene VK O12/JK3, VKL2/JK3,
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VkL5/Jk3, VkL5/Jk4,VkA27/ Jk4, ou VkB3/ Jk1.
[000130] Em algumas modalidades, o Vl do anticorpo anti-M-CSF compreende uma ou mais substituições de aminoácidos relativas à seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, o Vl do anticorpo anti-M-CSF compreende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácidos relativas à seqüência da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, uma ou mais dessas substituições da linhagem germinativa é nas regiões CDR da cadeia leve. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos relativas à linhagem germinativa são em uma ou mais das mesmas posições que as substituições relativas à da linhagem germinativa em qualquer ou mais dos Vl dos anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4,
8.10.3FG1 ou 9.14.4G1. Por exemplo, o Vl do anticorpo anti-M-CSF pode conter uma ou mais substituições de aminoácidos comparadas à linhagem germinativa encontrada no Vl do anticorpo 88, e outras substituições de aminoácidos comparadas à linhagem germinativa encontradas no Vl do anticorpo 252 que utiliza o mesmo gene Vk que anticorpo 88. Em algumas modalidades, as alterações de aminoácidos são em uma ou mais das mesmas posições mas envolvem uma mutação diferente que no anticorpo de referência.
[000131] Em algumas modalidades, alterações de aminoácidos relativas à linhagem germinativa ocorrem em uma ou mais das mesmas posições que em quaisquer dos Vl dos anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3,
2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2CSer, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4,
9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-
CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1, mas as alterações podem representar
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35/140 substituições de aminoácidos conservativas em tal(is) posição(ões) relativa(s) ao aminoácido no anticorpo de referência. Por exemplo, se uma posição particular em um desses anticorpos é alterada em relação a linhagem germinativa e é glutamato, pode-se substituir aspartato nessa posição. Similarmente, se uma substituição de aminoácido comparada a linhagem germinativa é serina, pode-se substituir treonina por serina nessa posição. Substituições de aminoácidos conservativas são discutidas supra.
[000132] Em algumas modalidades, a cadeia leve do anticorpo humano anti-M-CSF compreende a seqüência de aminoácido que é a mesma que a seqüência de aminoácido do VL do anticorpo 252 (SEQ ID NO: 4), 88 (SEQ ID NO: 8), 100 (SEQ ID NO: 12), 3.8.3 (SEQ ID NO: 16), 2.7.3 (SEQ ID NO: 20), 1.120.1 (SEQ ID NO: 24), 9.14.4I (SEQ ID NO: 28), 8.10.3F (SEQ ID NO: 32), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 36), 9.14.4 (SEQ ID NO: 28), 8.10.3 (SEQ ID NO: 44), 9.7.2 (SEQ ID NO: 48), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 52), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 56), 8.10.3CSer (SEQ ID NO: 60), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 60), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 52), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 52), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 56),
9.14.4-CG4 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 28), 9.7.2-Ser (SEQ ID NO: 48), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 44), 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 60) 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 32) ou 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 28), ou dita seqüência de aminoácido possuindo até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácidos conservativas e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservativas. Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende a seqüência de aminoácido do inicio da CDR1 ao final da CDR3 de quaisquer dos aminoácidos anteriores.
[000133] Em algumas modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-MCSF compreende pelo menos as CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia leve de uma seqüência de linhagem germinativa ou anticorpo, como aqui
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36/140 descrito. Em outra modalidade, a cadeia leve pode compreender regiões CDR1, CDR2 ou CDR3 de um anticorpo independentemente selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser,
8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou
9.14.4G1 ou regiões CDR tendo cada, menos que 4 ou menos que 3 substituições de aminoácidos conservativas e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácidos não-conservativas. Em outras modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-M-CSF compreende as CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia leve, cada uma das quais são independentemente selecionadas a partir das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da região Vl selecionada a partir de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60, ou codificada por uma molécula de ácido nucléico que codifica a região Vl selecionada a partir de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 ou 47. A cadeia leve do anticorpo anti-M-CSF pode compreender as regiões CDR1, CDR2 ou CDR3 de um anticorpo compreendendo a seqüência de aminoácido da região Vl selecionada a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser,
8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou.14.4G1 ou SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 or 60.
[000134] Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende as regiões CDR1, CDR2 ou CDR3 de anticorpo 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4,
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8.10.3FG1 ou 9.14.4G1, ou ditas regiões CDR cada tendo menos que 4 ou menos que 3 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservativas. [000135] Com relação à cadeia pesada, em algumas modalidades, a região variável da seqüência de aminoácido da cadeia pesada é codificada em parte por um gene Vh3-11, Vh3-23, Vh3-7, Vh1-18, Vh333, Vh3-48 humano e um gene Jh4, Jh6, JH4b, ou JH6b. Em uma modalidade particular da invenção, a região variável da cadeia pesada é codificada pelo gene VH3-11/DH7-27/JH6, VH3-7/DH6-13/JH4, VH323/DH1-26/JH4, VH3-11/DH7-27/JH4, VH3-33/DH1-26/JH4, VH1-18/DH423/JH4, VH3-11/DH7-27/JH4b, VH3-48/DH1-26/JH4b, VH3-11/DH6-13/JH6b, VH3-11/DH7-27/JH4b, VH3-48/DH1-6/JH4b, or VH3-11/DH6-13/JH6b. Em algumas modalidades, o VH do anticorpo anti-M-CSF contém uma ou mais substituições, deleções ou inserções (adições) de aminoácido, relativas a seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada compreende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 mutações a partir da seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a(s) mutação(ões) é(são) substituição(ões) não-conservativa(s) comparadas a seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, as mutações são nas regiões CDR da cadeia pesada. Em algumas modalidades, as alterações de aminoácido são feitas em uma ou mais das mesmas posições que as mutações a partir da linhagem germinativa em um ou mais dos Vh dos anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser,
8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou
9.14.4G1. Em outras modalidades, as alterações de aminoácido são em uma ou mais das mesmas posições mas envolvem uma mutação
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38/140 diferente do que no anticorpo de referência.
[000136] Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido do domínio variável (VH) do anticorpo 252 (SEQ ID NO: 2), 88 (SEQ ID NO: 6), 100 (SEQ ID NO: 10), 3.8.3 (SEQ ID NO: 14), 2.7.3 (SEQ. ID NO: 18), 1.120.1 (SEQ. ID NO: 22),
9.14.4I (SEQ ID NO: 26), 8.10.3F (SEQ ID NO: 30), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 34), 9.14.4 (SEQ ID NO: 38), 8.10.3 (SEQ ID NO: 30), 9.7.2 (SEQ ID NO: 46), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 50), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 54), 8.10.3C-Ser (SEQ ID NO: 58), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 62), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 66), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 70), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 74), 9.14.4-CG4 (SEQ ID NO: 78), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 82), 9.7.2Ser (SEQ ID NO: 86), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 90) 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 94), 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 98) ou 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 102), ou dita seqüência de aminoácido tendo até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservativas. Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende a seqüência de aminoácido do inicio da CDR1 ao final da CDR3 de quaisquer dos aminoácidos anteriores.
[000137] Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada do anticorpo 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser,
8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1, ou ditas regiões CDR cada tendo menos que 8, menos que 6, menos que 4, ou menos que 3 substituições de aminoácidos conservativas e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não-conservativas.
[000138] Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende uma CDR3 de linhagem germinativa ou anticorpo, como descrito acima,
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39/140 de uma seqüência de anticorpo como aqui descrita, e pode ainda compreender as regiões CDR1 e CDR2 de uma seqüência de linhagem germinativa, ou pode compreender uma CDR1 e CDR2 de uma seqüência de anticorpo, cada uma das quais são independentemente selecionadas a partir de um anticorpo compreendo uma cadeia pesada de um anticorpo selecionada a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4,
8.10.3FG1 ou 9.14.4G1. Em outra modalidade a cadeia pesada compreende uma CDR3 de uma seqüência de anticorpo como aqui descrito, e pode ainda compreender as regiões CDR1 e CDR2, cada uma das quais são independentemente selecionadas a partir de uma região CDR1 e CDR2 de uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácido da região VH selecionada a partir de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102, ou codificada por uma seqüência de ácido nucléico que codifica a região VH selecionada a partir de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 ou 101. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma cadeia leve como descrita acima e uma cadeia pesada como descrita acima.
[000139] Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é mudar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que pode ser quimicamente reativa, a outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Em uma modalidade, há uma substituição de uma cisteína não-canônica. A substituição pode ser em uma região estrutural de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em outra modalidade, a cisteína é em uma região não-canônica do anticorpo.
[000140] Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é remover quaisquer sítios proteolíticos potenciais no anticorpo,
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40/140 particularmente aqueles que são em uma região CDR ou estrutural de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Substituição de resíduos de cisteína e remoção de sítios proteolíticos pode diminuir o risco de qualquer heterogeneidade no produto de anticorpo e dessa forma aumentar sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido é eliminação de pares asparagina-glicina, que formam sítios de desaminação potenciais, pela alteração de um ou ambos os resíduos.
[000141] Em algumas modalidades, a lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-M-CSF da invenção não está presente (Lewis D. A., et al., Anal. Chem, 66(5): 585-95 (1994)). Em várias modalidades da invenção, as cadeias pesadas e leves dos anticorpos anti-M-CSF podem opcionalmente incluir uma seqüência de sinal.
[000142] Em um aspecto, a invenção de refere a inibir anticorpos monoclonais anti-M-CSF humanos e as linhagens celulares projetadas para produzi-los. Tabela 1 lista os identificadores de seqüência (SEQ ID NOS) dos ácidos nucléicos que codificam a região variável das cadeias pesadas e leves e as seqüências de aminoácido correspondentes previstas para os anticorpos monoclonais: 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3 e 9.7.2. Anticorpos variantes adicionais 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2,
9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser,
8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1 poderiam ser feitos por métodos conhecidos aos versados da técnica.
Tabela 1
ANTICORPOS ANTI-M-CSF HUMANOS
MAb IDENTIFICADORES DE SEQÜÊNCIA (SEQ ID NOS)
Extensão completa
Pesada Leve
DNA Proteína DNA Proteína
252 1 2 3 4
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ANTICORPOS ANTI-M-CSF HUMANOS
MAb IDENTIFICADORES DE SEQÜÊNCIA (SEQ ID NOS)
Extensão completa
Pesada Leve
DNA Proteína DNA Proteína
88 5 6 7 8
100 9 10 11 12
3.8.3 14 16
2.7.3 18 20
1.120.1 22 24
9.14.4I 25 26 27 28
9.14.4 37 38 27 28
9.14.4C-Ser 54 56
9.14.4-CG2 74 56
9.14.4-CG4 78 56
9.14.4-Ser 82 27 28
9.14.4-G1 101 102 27 28
8.10.3F 29 30 31 32
8.10.3 29 30 43 44
8.10.3C-Ser 58 60
8.10.3-CG2 62 60
8.10.3-Ser 90 43 44
8.10.3-CG4 94 60
8.10.3FG1 97 98 31 32
9.7.2IF 33 34 35 36
9.7.2C-Ser 50 52
9.7.2-CG2 66 52
9.7.2-CG4 70 52
9.7.2-Ser 86 47 48
Classes e subclasses de anticorpos anti-M-CSF [000143] A classe e subclasse de anticorpos anti-M-CSF pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas usando
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42/140 anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse particulares de um anticorpo. Tais anticorpos são comercialmente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determinadas por ELISA, ou Western Blot assim como outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser terminadas por seqüênciamento de todo ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos, comparando suas seqüências de aminoácidos com as seqüências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando a classe e subclasse dos anticorpos.
[000144] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-M-CSF é um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-M-CSF pode ser uma molécula de IgG, de IgM, de IgE, de IgA, ou de IgD. Em modalidades preferidas, o anticorpo anti-M-CSF é uma IgG e é uma subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em outras modalidades preferidas, o anticorpo é de subclasse IgG2 ou IgG4. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é de subclasse IgG1.
Espécie e Seletividade Molecular [000145] Em outro aspecto da invenção, os anticorpos anti-M-CSF demonstram tanto seletividade de espécie como molecular. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-M-CSF se liga a M-CSF humana, de macaco cinomólogo e de camundongo. Seguindo as técnicas da especificação, pode-se determinar a seletividade de espécie para o anticorpo anti-M-CSF usando métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade de espécie usando Western Blot, FACS, ELISA, RIA, um ensaio de proliferação celular, ou um ensaio de ligação de receptor de M-CSF. Em uma modalidade preferida, pode-se determinar a seletividade de espécies usando um ensaio de proliferação celular ou ELISA.
[000146] Em outra modalidade, o anticorpo anti-M-CSF tem uma
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43/140 seletividade para M-CSF que é pelo menos 100 vezes maior que sua seletividade para GM-/G-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-M-CSF não exibe qualquer ligação especifica apreciável a qualquer outra proteína que não M-CSF. Pode-se determinar a seletividade do anticorpo anti-M-CSF para M-CSF usando métodos bem-conhecidos na técnica seguindo os ensinamentos da especificação. Por exemplo podese determinar a seletividade usando Western blot, FACS, ELISA ou RIA. Identificação de Epítopos de M-CSF Reconhecidos por Anticorpos AntiM-CSF [000147] A invenção fornece um anticorpo monoclonal anti-M-CSF humano que se liga a M-CSF e competem com, faz competição cruzada com e /ou se liga ao mesmo epítopo e/ou se liga a M-CSF com o mesmo Kd que (a) em anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3,
2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2CSer, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4,
9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-
CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1; (b) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102; (c) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60; (d) um anticorpo que compreende tanto uma região variável de cadeia pesada como definida em (b) e uma região variável de cadeia leve como definida em (c).
[000148] Pode-se determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo, compete pela ligação com, faz competição cruzada para ligar com ou tem o mesmo KD que um anticorpo anti-M-CSF pelo uso de métodos conhecido na técnica. Em uma modalidade, permite-se que o anticorpo anti-M-CSF da invenção se ligue a M-CSF sob condições de
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44/140 saturação e então mede-se a habilidade do anticorpo em teste de se ligar a M-CSF. Se o anticorpo em teste é capaz de se ligar a M-CSF ao mesmo tempo que o anticorpo anti-M-CSF, então o anticorpo em teste se liga a um epítopo diferente que o anticorpo anti-M-CSF. Entretanto, se o anticorpo em teste não é capaz de se ligar a M-CSF ao mesmo tempo, então o anticorpo em teste se liga ao mesmo epítopo, a um epítopo superposto, ou a um epítopo que está próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo anti-M-CSF humano. Esse experimento pode ser realizado usando ELISA, RIA ou FACS. Em uma modalidade preferida, o experimento é realizado usando BIACORETM.
Afinidade de Ligação de Anticorpos Anti-M-CSF a M-CSF [000149] Em algumas modalidades da invenção, os anticorpos anti-MCSF se ligam a M-CSF com alta afinidade. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-M-CSF se liga a M-CSF com uma Kd de 1x10-7 M ou menos. Em outras modalidades preferidas, o anticorpo se liga a M-CSF com um Kd de 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, ou menos. Em certas modalidades, o Kd é 1 pM a 500 pM. Em outras modalidades, o Kd é entre 500 pM a 1 μΜ. Em outras modalidades, o Kd é entre 1 μΜ a 100 nM. Em outras modalidades, o Kd é entre 100 mM a 10 nM. Em uma modalidade ainda mais preferida, o anticorpo se liga a M-CSF com substancialmente o mesmo Kd que um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser,
8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou
9.14.4G1. Em outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a M-CSF com substancialmente o mesmo Kd que um anticorpo que compreende uma CDR2 de uma cadeia leve, e/ou uma CDR3 de uma cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser,
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9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4,
8.10.3FG1 ou 9.14.4G1. Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a M-CSF com substancialmente o mesmo Kd que um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102, ou que compreende uma região variável de cadeia leve que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60. Em outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a M-CSF com substancialmente o mesmo KD que um anticorpo que compreende uma CDR2, e pode opcionalmente compreender uma CDR1 e/ou CDR3, de uma região variável de cadeia leve que tem uma seqüência de aminoácido da região Vl de SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60, ou que compreende uma CDR3, e pode opcionalmente compreender uma CDR1 e/ou CDR2, de uma região variável e cadeia pesada que tem uma seqüência de aminoácido da região Vh de SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102.
[000150] Em algumas modalidades o anticorpo anti-M-CSF tem uma baixa taxa de dissociação. Em algumas modalidades o anticorpo antiM-CSF tem um koff de 2,0 x 10-4 s-1 ou menor. Em outras modalidade preferidas o anticorpo se liga a M-CSF com um koff de 2,0 x 10-5 ou um koff de 2,0 x 10-6 s- ou menor. Em algumas modalidades o koff é substancialmente o mesmo que o de um anticorpo aqui descrito, tal como um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4,
8.10.3FG1 ou 9.14.4G1. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga
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46/140 a M-CSF com substancialmente o mesmo koff que um anticorpo que compreende (a) uma CDR3, e pode opcionalmente compreender uma CDR1 e/ou CDR2, de uma cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser,
9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1; ou (b) uma CDR2, e pode opcionalmente compreender uma CDR1 e/ou CDR3 de uma cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100,
3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser,
8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a M-CSF com substancialmente o mesmo koff que um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102; ou que compreende uma região variável de cadeia leve que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60; Em outra modalidade preferida, o anticorpo se liga a M-CSF com substancialmente o mesmo koff que um anticorpo que compreende uma CDR2, e pode opcionalmente compreender uma CDR1 e/ou CDR3, de uma região variável de cadeia leve que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60; e pode opcionalmente compreender uma CDR1 e/ou CDR2, de uma região variável de cadeia pesada que tem uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102.
[000151] A afinidade de ligação e taxa de dissociação de um anticorpo anti-M-CSF a um M-CSF pode ser determinado por métodos conhecidos
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47/140 na técnica. A afinidade de ligação pode ser medida por ELISAs, RIAs, ressonância de plásmon superficial competitivos (por exemplo, pelo uso de tecnologia BIACORETM). A taxa de dissociação pode ser medida por ressonância de plásmon superficial. Preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação é medida por ressonância de plásmon superficial. Mais preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas usando tecnologia BIACORETM. Exemplo VI exemplifica um método para determinar constantes de afinidade de anticorpos monoclonais anti-M-CSF pela tecnologia BIACORETM. Inibição da Atividade de M-CSF pelo Anticorpo Anti-M-CSF Inibição da ligação de M-CSF a c-fms [000152] Em outra modalidade a invenção fornece um anticorpo antiM-CSF que inibe a ligação de um M-CSF ao receptor c-fms e bloqueia ou previne ativação de c-fms. Em uma modalidade preferida, o M-CSF é humano. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-M-CSF é um anticorpo humano. A IC50 pode ser medida por ELISA, RIA, e ensaios baseados em células tais como ensaio de proliferação celular, um ensaio de alteração da forma de monócitos do sangue total, ou um ensaio de inibição de ligação ao receptor. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção desse inibe proliferação celular com uma IC50 de não mais que 8,0 x 10-7 M, preferivelmente não mais que 3 x 10-7 M. ou mais preferivelmente não mais que 8 x 10-8 M, como medido por um ensaio de proliferação celular. Em outra modalidade, a IC50 medida por um ensaio de alteração de forma de monócito é não mais que 2 x 10-6 M, preferivelmente não mais que 9,0 x 10-7 M, ou mais preferivelmente não mais que 9 x 10-8 M. Em outra modalidade preferida, a IC50 medida por um ensaio de ligação ao receptor é não mais que 2 x 10-6 M, preferivelmente não mais que 8 x 10-7 M, ou mais preferivelmnete não mais que 7,0 x 10-8 M. Exemplos III, IV, e V exemplificam vários tipos de ensaios.
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48/140 [000153] Em outro aspecto anticorpos anti-M-CSF da invenção inibem proliferação celular de monócito/macrófago em resposta a M-CSF em pelo menos 20%, mais preferivelmente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% comparado à proliferação da célula na ausência do anticorpo.
Métodos de Produzir Anticorpos e Linhagens Celulares Produtoras de Anticorpo
Imunização [000154] Em algumas modalidades, anticorpos humanos são produzidos por imunização de um animal não-humano compreendendo em seu genoma alguns ou todos dos loci de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina humana com um antígeno M-CSF. Em uma modalidade preferida o animal não-humano é um animal XENOMOUSE™ (Abgenix Inc., Fremont, Calif.). Outro animal nãohumano que pode ser usado é um camundongo transgênico produzido pela Medarex (Medarex, Inc., Princeton, N.J.).
[000155] Camundongos XENOMOUSETM são cepas de camundongos projetadas que compreendem grandes fragmentos de loci de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina humana e são deficientes na produção de anticorpo de camundongo. Veja, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) e Patentes U.S. Nos. 5.916.771,
5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598,
6.130.364, 6.162.963 e 6.150.584. Veja ainda WO 91/10741, WO
94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, e WO 00/037504.
[000156] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para fazer anticorpos anti-M-CSF a partir de animais não-humanos, nãocamundongos pela imunização de animais transgênicos não-humanos que compreendem loci de imunoglobulina humana com um antígeno M
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CSF. Pode-se produzir tais animais usando os métodos descritos nos documentos acima citados. Os métodos descritos nesses documentos podem ser modificados como descrito na Patente US 5.994.619. Patente US 5.994.619 descreve métodos para produzir novas células e linhagens celulares de massa celular interna cultivada (CICM), derivadas de porcos e vacas, e células CICM transgênicas dentro das quais DNA heterólogo foi inserido. Células transgênicas CICM podem ser usadas para produzir embriões, fetos, e prole transgênicos clonados. A patente '619 ainda descreve os métodos de produzir os animais transgênicos, que são capazes de transmitir o DNA heterólogo para sua prole. Em modalidades preferidas, os animais não-humanos são ratos, ovelha, porcos, cabra, gado e cavalos.
[000157] Camundongos XENOMOUSETM produzem um repertório humano tipo-adulto de anticorpos completamente humanos e geram anticorpos humanos antígeno-específicos. Em algumas modalidades, os camundongos XENOMOUSETM contêm aproximadamente 80% do repertório do gene V de anticorpo humano através da introdução de fragmentos de cromossomo artificial de levedura (YAC) de configuração de linhagem germinativa, tamanho de megabase do loci da cadeia pesada humana e loci da cadeia leve kappa. Em outras modalidades, camundongos XENOMOUSETM ainda conter aproximadamente todos os lócus da cadeia leve lambda. Veja Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), e WO 98/24893, as descrições das quais estão por meio desta incorporadas.
[000158] Em algumas modalidades, o animal não-humano compreendendo genes de imunoglobulina humana são animais que tem um minilocus de imunoglobulina humana. Na abordagem de minilocus, um lócus Ig exógeno é imitado através da inclusão de genes individuais do lócus de Ig. Dessa forma, um ou mais genes de Vh, um ou mais genes
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50/140 de Dh, um ou mais genes de Jh, um domínio constante mu, e um segundo domínio constante (preferivelmente um domínio constante gama) são formados dentro de um construto para inserção no animal. Essa abordagem é descrita inter alia, em Patente U.S. Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429,
5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, e 5.643.763, aqui incorporadas por referência.
[000159] Em outro aspecto a invenção fornece um método para fazer anticorpos anti-M-CSF humanizados. Em algumas modalidades os animais não-humanos são imunizados com um antígeno M-CSF como descrito abaixo sob condições que permitem produção de anticorpo. Células produtoras de anticorpo são isoladas dos animais, fundidas com mielomas para produzir hibridomas, e ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo anti-M-CSF de interesse são isolados. Esses ácidos nucléicos são subseqüentemente projetados usando técnicas conhecidas daqueles versados na técnica e como descrito mais abaixo para reduzir a quantidade de seqüência nãohumana, isto é, para humanizar o anticorpo para reduzir a resposta imune em humanos.
[000160] Em algumas modalidades, o antígeno M-CSF é M-CSF isolado e/ou purificado. Em uma modalidade preferida, o antígeno MCSF é M-CSF humano. Em algumas modalidades, o antígeno M-CSF é um fragmento de M-CSF. Em algumas modalidades, o fragmento de MCSF é o domínio extracelular de M-CSF. Em algumas modalidades, o fragmento de M-CSF compreende pelo menos um epítopo de M-CSF. Em outras modalidades, o antígeno de M-CSF é uma célula que expressa ou superexpressa M-CSF ou um fragmento imunogênico desse sobre sua superfície. Em algumas modalidades, o antígeno MCSF é uma proteína de fusão de M-CSF. M-CSF pode ser purificado de fontes naturais usando técnica conhecidas. M-CSF recombinante é
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[000161] Imunização de animais pode ser feita por qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para imunizar animais não-humanos tais como camundongos, ratos, ovelha, cabras, porcos, gado e cavalos são bem-conhecidos na técnica. Veja, p.e.x., Harlow e Lane, supra, e Patente U.S. No. 5.994.619. Em uma modalidade preferida, o antígeno M-CSF é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantes ilustrativos incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídios de muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídio de rápida dispersão pelo seqüestro dele em um depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que são quimiostáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferivelmente, se um polipeptídio está sendo administrado, o programa de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídio, espalhadas por várias semanas. Exemplo I exemplifica um método para produzir anticorpos monoclonais anti-M-CSF em camundongos XENOMOUSETM.
Produção de Anticorpos e Linhagens Celulares Produtoras de Anticorpo [000162] Após a imunização de um animal com um antígeno M-CSF, anticorpos e/ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidas do animal. Em algumas modalidades, o soro que contém o anticorpo antiM-CSF é obtido do animal pelo sangramento ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado como é obtido do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida a partir do soro, ou os anticorpos antiM-CSF podem ser purificados a partir do soro.
[000163] Em algumas modalidades, linhagens celulares imortalizadas que produzem anticorpo são preparadas a partir de células isoladas do
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52/140 animal imunizado. Após imunização, o animal é sacrificado e o nodo linfático e/ou células B esplênicas são imortalizadas. Métodos de imortalização de células incluem, mas não são limitadas a, transfectálas com oncogenes, infectá-las com um vírus oncogênico, cultivá-las sob condições que selecionam células imortalizadas, sujeitá-las a compostos carcinogênicos ou mutantes, fundí-las com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma e inativar um gene supressor tumoral. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Se fusão com células de mieloma é usada, as células de mieloma preferivelmente não secretam polipeptídios de imunoglobulina (uma linhagem celular não-secretora). Células imortalizadas são rastreadas usando M-CSF, uma porção desse, ou uma célula que expressa M-CSF. Em uma modalidade preferida, o rastreamento inicial é realizado usando um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio. Um exemplo de rastreamento por ELISA é fornecido em WO 00/37504, aqui incorporado por referência.
[000164] Células produtoras de anticorpo anti-M-CSF, por exemplo, hibridomas, são selecionadas clonadas e adicionalmente rastreadas para características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpo e características de anticorpo desejáveis, como discutido mais abaixo. Hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singeneicos, em animais que não tem um sistema imune, por exemplo, camundongo nu, ou em cultura celular in vitro. Métodos se lecionar, clonar e expandir hibridomas são bem-conhecidos dos versados na técnica.
[000165] Em uma modalidade preferida, o animal imunizado é um animal não-humano que expressa genes de imunoglobulina humana e as células B esplênicas são fundidas a uma linhagem celular de mieloma da mesma espécie que o animal não-humano. Em uma modalidade mais preferida, o animal imunizado é um animal
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XENOMOUSETM e a linhagem celular de mieloma é um mieloma de camundongo não-secretor. Em uma modalidade ainda mais preferida, a linhagem celular de mieloma é P3-X63-AG8-653. Veja, por exemplo, Exemplo I.
[000166] Dessa forma em uma modalidade, a invenção fornece métodos de produzir uma linhagem celular que produz um anticorpo monoclonal humano ou um fragmento desse direcionado a M-CSF compreendendo (a) imunizar o animal transgênico não-humano aqui descrito com M-CSF, uma porção de M-CSF ou uma célula ou tecido expressando M-CSF; (b) permitir que o animal transgênico instale uma resposta imune para M-CSF; (c) isolar linfócitos B de um animal transgênico; (d) imortalizar os linfócitos B; (e) criar populações monoclonais individuais dos linfócitos B imortalizados; e (f) rastrear os linfócitos B imortalizados para identificas um anticorpos direcionado para M-CSF.
[000167] Em outro aspecto, a invenção fornece hibridomas que produzem um anticorpo anti-M-CSF humano. Em uma modalidade preferida, os hibridomas são hibridomas de camundongo, como descrito acima. Em outras modalidades, os hibridomas são produzidos em uma espécie não-humana, não-camundongo tal como ratos, ovelha, porcos, cabras, gado ou cavalos. Em outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos.
[000168] Em outra modalidade preferida, um animal transgênico é imunizado com M-CSF, células primárias, por exemplo, células de sangue periférico ou baço, são isoladas a partir de um animal transgênico imunizado e células individuais produzindo anticorpo específicos para o antígeno desejado são identificadas. RNAm poliadenilado de cada célula individual é isolado e reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa (RT-PCR) é realizada usando iniciadores senso que anelam com seqüências da região variável., por
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54/140 exemplo, iniciadores degenerados que reconhecem a maior parte ou todas as regiões FR1 dos genes da região variável de cadeia pesada e leve humanos e iniciadores anti-senso que anelam com seqüências da região constante ou de ligação. cDNAs das regiões variáveis de cadeia pesada e leve são então clonados e expressos em qualquer célula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula de mieloma, como anticorpos quiméricos com as respectivas regiões constantes de imunoglobulina, tais como a cadeia pesada e os domínios constantes κ ou λ. Veja, Babcook, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996, aqui incorporada por referência. Anticorpos anti-M-CSF podem então ser identificados como aqui descrito.
[000169] Em outra modalidade, técnicas de exposição em fago podem ser usadas para fornecer bibliotecas contendo um repertório de anticorpos com variadas afinidades para M-CSF. Para produção de tais repertórios, é desnecessário imortalizar as células B do animal imunizado. De preferência as células B podem ser usadas diretamente como uma fonte de DNA. A mistura de cDNAs obtidos a partir das células B, por exemplo, derivadas de baços é usada para preparar uma biblioteca de expressão, por exemplo, biblioteca de exposição em fago transfectada em E. col. As células resultantes são testadas para imunorreatividade a M-CSF. Técnicas para identificação de anticorpos com alta afinidade de tais bibliotecas são descritos por Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698 e por Griffiths et al., ibid, 12:725-734. Basicamente, clones das bibliotecas são identificados os quais produzem afinidades de ligação de uma magnitude desejada para o antígeno e o DNA que codifica o produto responsável por tal ligação é recuperado e manipulado para expressão recombinante padrão. Bibliotecas de exposição em fago podem ainda ser construídas usando seqüências de nucleotídeos previamente manipuladas e rastreadas em uma forma similar. Em geral, os cDNAs
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55/140 que codificam cadeias pesadas e leves são independentemente supridos ou ligados para formar análogos de Fv para produção na biblioteca de fagos.
[000170] A biblioteca de fagos é então rastreada para os anticorpos com as maiores afinidades para M-CSF e o material genético recuperado a partir do clone apropriado. Sucessões adicionais de rastreamento podem aumentar a afinidade do anticorpo original isolado. [000171] Em outro aspecto, a invenção fornece hibridomas que produzem um anticorpo humano anti-M-CSF. Em uma modalidade preferida, os hibridomas são hibridomas de camundongo, como descrito acima. Em outras modalidades, os hibridomas são produzidos em espécies não-humanas, não-camundongos tais como ratos, ovelha, porcos, cabras, gado ou cavalos. Em outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos.
Ácidos nucléicos, Vetores, Células Hospedeiras, e
Métodos Recombinantes de Fazer Anticorpos
Ácidos Nucléicos [000172] A presente invenção ainda abrange moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos anti-M-CSF. Em algumas modalidades, moléculas de ácidos nucléicos diferentes codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-M-CSF. Em outras modalidades, a mesma molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-MCSF. Em uma modalidade, o ácido nucléico codifica um anticorpo antiM-CSF da invenção.
[000173] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende um gene VkL5, O12, L2, B3, A27 humano e um gene Jk1, Jk2, Jk.3, ou Jk4.
[000174] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve, codifica uma seqüência de aminoácido
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56/140 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 mutações a partir da seqüência de aminoácido da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido do VL compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido não-conservativas e/ou 1, 2 ou 3 substituições nãoconservativas comparadas a seqüência da linhagem germinativa. Substituições podem ser nas regiões CDR, nas regiões estruturais, ou no domínio constante.
[000175] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido do VL compreendendo uma ou mais variantes comparadas com a seqüência de linhagem germinativa que são idênticas às variações encontradas no Vl de um dos anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4,
8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser,
8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1.
[000176] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica pelo menos três mutações de aminoácidos comparadas com a seqüência da linhagem germinativa encontradas na VL de um dos anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,9.14.4, 8.10.3, ou 9.7.2. [000177] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido do VL do anticorpo monoclonal 252 (SEQ ID NO: 4), 88 (SEQ ID NO: 8), 100 (SEQ ID NO: 12), 3.8.3 (SEQ ID NO: 16), 2.7.3 (SEQ ID NO: 20), 1.120.1 (SEQ ID NO: 24), 9.14.4I (SEQ ID NO: 28), 8.10.3F (SEQ ID NO: 32), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 36), 9.14.4 (SEQ ID NO: 28), 8.10.3 (SEQ ID NO: 44), 9.7.2 (SEQ ID NO: 48), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 52), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 56), 8.10.3C-Ser (SEQ ID NO: 60), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 60), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 52), 9.7.2
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CG4 (SEQ ID NO: 52), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-CG4 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 28), 9.7.2-Ser (SEQ ID NO: 48),
8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 44), 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 60) 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 32) ou 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 28), ou uma porção desses. Em algumas modalidades, dita porção compreende pelo menos a região CDR2. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica a seqüência de aminoácido das CDRs de cadeia leve do dito anticorpo. Em algumas modalidades, dita porção é uma porção contígua compreendendo CDR1-CDR3.
[000178] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido da cadeia leve de uma das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60. Em algumas modalidades preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende a seqüência de nucleotídeos da cadeia leve de SEQ ID NOS: 3, 7, 11,27, 31,35, 43 ou 47, ou uma porção dessas.
[000179] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica seqüência de aminoácido do VL que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido do Vl mostrada na Figura 1 ou a seqüências de aminoácido da Vl de quaisquer dos anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou
9.14.4G1, ou uma seqüência de aminoácido de quaisquer das SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60. Moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que hibridizam sob condições altamente estringentes, tais como aquelas descritas acima, a uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidos da cadeia leve de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28,
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32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60, ou que tem a seqüência de ácido nucléico da cadeia leve de SEQ ID NOS: 3, 7, 11,27, 31, 35, 43 ou 47.
[000180] Em outra modalidade, o ácido nucléico codifica uma cadeia leve de extensão completa de um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3,
9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2,
9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser,
8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1, ou uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60 e uma região constante de uma cadeia leve, ou uma cadeia leve compreendendo uma mutação. Além disso, o ácido nucléico pode compreender a seqüência de nucleotídeo da cadeia leve de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 ou 47 e a seqüência de nucleotídeo que codifica uma região constante de uma cadeia leve, ou uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve compreende uma mutação.
[000181] Em outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico codifica o domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende uma seqüência de gene VH 1-18, 3-33, 3-11, 3-23, 3-48, ou 3-7 humano ou uma seqüência derivada dessa. Em várias modalidades a molécula de ácido nucléico compreende um gene VH 1-18 humano, um gene DH4-23 e um gene JH4 humano; um gene VH 3-33 humano, um gene DH1-26 humano e um gene JH4 humano; um gene VH 3-11 humano, um gene DH7-27 humano e um gene JH4 humano; um gene VH 3-11 humano, um gene DH 7-27 humano e um gene JH6 humano; um gene VH 3-23 humano um gene DH1-26 humano e um gene JH4 humano; um gene VH 3-7 humano, um gene DH6-13 humano e um gene JH4 humano; um gene VH3-11 humano, um gene DH7-27 humano, e um gene JH4b humano; um gene VH3-48 humano, um gene DH1-26 humano, e um gene JH4b humano; um gene VH3-11 humano, um gene DH6-13 humano, e um
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59/140 gene Jh6ó humano, ou uma seqüência derivada dos genes humanos. [000182] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 mutações comparado à seqüência de aminoácido da linhagem germinativa dos genes V, D ou J humanos. Em algumas modalidades, ditas mutações são na região do Vh. Em algumas modalidades, ditas mutações são nas regiões CDR. [000183] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica uma ou mais mutações comparada com a seqüência da linhagem germinativa que são idênticas as mutações de aminoácidos encontradas no Vh do anticorpo monoclonal 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4,
8.10.3FG1 ou 9.14.4G1. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica pelo menos três mutações de aminoácidos comparada as seqüências da linhagem germinativa que são idênticas a pelo menos três mutações de aminoácidos encontradas em um dos anticorpos monoclonais acima listados.
[000184] Em algumas modalidades, a seqüência de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma porção da seqüência de aminoácido do Vh do anticorpo 252 (SEQ ID NO: 4), 88 (SEQ ID NO: 8), 100 (SEQ ID NO: 12), 3.8.3 (SEQ ID NO: 16), 2.7.3 (SEQ ID NO: 20), 1.120.1 (SEQ ID NO: 24), 9.14.4I (SEQ ID NO: 28), 8.10.3F (SEQ ID NO: 32), 9.7.2IF (SEQ ID NO: 36), 9.14.4 (SEQ ID NO: 28), 8.10.3 (SEQ ID NO: 44), 9.7.2 (SEQ ID NO: 48), 9.7.2C-Ser (SEQ ID NO: 52), 9.14.4C-Ser (SEQ ID NO: 56), 8.10.3CSer (SEQ ID NO: 60), 8.10.3-CG2 (SEQ ID NO: 60), 9.7.2-CG2 (SEQ ID NO: 52), 9.7.2-CG4 (SEQ ID NO: 52), 9.14.4-CG2 (SEQ ID NO: 56),
9.14.4-CG4 (SEQ ID NO: 56), 9.14.4-Ser (SEQ ID NO: 28), 9.7.2-Ser
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60/140 (SEQ ID NO: 48), 8.10.3-Ser (SEQ ID NO: 44), 8.10.3-CG4 (SEQ ID NO: 60) 8.10.3FG1 (SEQ ID NO: 32) ou 9.14.4G1 (SEQ ID NO: 28), ou dita seqüência tendo mutações de aminoácido conservativas e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácidos não-conservativas. Em várias modalidades a seqüência codifica uma ou mais regiões CDR, preferivelmente uma região CDR3, todas as três regiões CDR, uma porção contígua incluindo CDR1-CDR3, ou a região Vh inteira.
[000185] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo de cadeia pesada que codifica a seqüência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102. Em algumas modalidades preferidas, a molécula de ácido nucléico compreende pelo menos uma porção da seqüência de nucleotídeo de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1,5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 ou 101. Em algumas modalidades, dita porção codifica uma região VH, uma região CDR3, todas as três regiões CDR, ou uma região contígua incluindo CDR1-CDR3.
[000186] Em algumas modalidades, a molécula de acido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido de VH que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica às seqüências de aminoácido de VH mostradas na Figura 4 ou a uma seqüência de aminoácido de quaisquer uma das SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102. Moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que hibridizam sob condições altamente estringentes, tais como aquelas descritas abaixo, com uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido da cadeia pesada de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102 ou que tem a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 1,5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 ou 101.
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61/140 [000187] Em outra modalidade, o ácido nucléico codifica uma cadeia pesada de extensão completa de um anticorpo selecionado a partir de 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4,
8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser,
8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1, ou uma cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102 e uma região constante de uma cadeia pesada, ou uma cadeia pesada compreendendo uma mutação. Além disso, o ácido nucléico pode compreender a seqüência de nucleotídeo da cadeia pesada de SEQ ID NOS: 1,5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 ou 101 e uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma região constante de uma cadeia leve, ou uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada compreendendo uma mutação.
[000188] Uma molécula de acido nucléico que codifica a cadeia pesada ou leve inteira de um anticorpo anti-M-CSF ou porções desse pode ser isolada de qualquer fonte produz tal anticorpo. Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucléico são isoladas a partir de um animal imunizado com M-CSF ou a partir de uma célula imortalizada derivada de uma tal célula B que expressa um anticorpo anti-M-CSF. Métodos de isolar RNAm que codifica um anticorpo são bemconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook, et al. O RNAm pode ser usado para produzir cDNA para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR) ou clonagem de cDNA genes de anticorpo. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico é isolada a partir de um hibridoma que tem como um de seus parceiros de fusão uma célula produtora de imunoglobulina humana de um animal transgênico não humano. Em uma modalidade ainda mais preferida, a célula produtora de imunoglobulina humana é isolada de um animal XENOMOUSETM.
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Em outra modalidade, a célula produtora de imunoglobulina humana é de um animal transgênico não-humano, não-camundongo, como descrito acima. Em outra modalidade, o ácido nucléico é isolado de um animal não-humano, não-transgênico. As moléculas de ácido nucléico isoladas de um animal não-humano, não-transgênico podem ser usadas, por exemplo, para anticorpos humanizados.
[000189] Em algumas modalidades, um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-M-CSF da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio VH da invenção unida estruturalmente a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio constante da cadeia pesada de qualquer fonte. Similarmente, uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-M-CSF da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio VL da invenção unida estruturalmente a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio constante da cadeia leve de qualquer fonte.
[000190] Em um aspecto adicional da invenção, moléculas de ácido nucléico que codificam o domínio variável das cadeias pesadas (VH) e leves (VL) são convertidos em gene de anticorpo de extensão completa. Em uma modalidade, moléculas de ácido nucléico que codificam os domínios VH ou VL são convertidos em genes de anticorpo de extensão completa pela inserção em um vetor de expressão que já codifica os domínios constantes de cadeia pesada (CH) e domínios constantes de cadeia leve (CL), respectivamente, tal que o segmento VH é operativamente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor, e o segmento VL é operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Em outra modalidade, moléculas de ácido nucléico que codificam os domínios VH e/ou VL são convertidas em genes de anticorpos de extensão completa por ligação, por exemplo, ligando, uma molécula de acido nucléico que codifica um domínio VH e/ou VL a uma molécula de
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63/140 ácido nucléico que codifica um domínio Ch e/ou Cl, usando técnicas de biologia molecular padronizadas. Seqüências de ácido nucléico dos genes do domínio constante de imunoglobulina da cadeia pesada e leve são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Moléculas de ácido nucléico que codificam as cadeias pesadas e/ou leves de extensão completa podem então ser expressas a partir de uma célula dentro da qual elas foram introduzidas e o anticorpo anti-MCSF isolado.
[000191] As moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para expressar recombinantemente grandes quantidades de anticorpos antiM-CSF. As moléculas de ácido nucléico podem ainda ser usadas para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos de cadeia única, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos mutados e derivados de anticorpos, como descrito mais abaixo. Se as moléculas de acido nucléico são derivadas de um animal não-humano, nãotransgênico, as moléculas de acido nucléico podem ser usadas para humanização de anticorpos, também como descrito abaixo.
[000192] Em outra modalidade uma molécula de acido nucléico da invenção é usada como uma sonda ou um iniciador de PCR para uma seqüência de anticorpo especifica. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser usado como sonda em métodos diagnósticos ou como iniciadores de PCR para amplificar regiões do DNA que poderiam ser usadas, inter alia, para isolar moléculas de ácido nucléico adicionais que codificam domínios variáveis de anticorpos anti-M-CSF. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucléico são oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são de regiões altamente variáveis das cadeia pesadas e leves do anticorpo de interesse. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos codificam toda ou uma parte de uma ou mais das CDRs do anticorpo 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3,
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64/140 ou 1.120.1, ou variantes desses aqui descritos.
Vetores [000193] A invenção fornece vetores compreendendo moléculas de acido nucléico que codificam a cadeia pesada de um anticorpo anti-MCSF da invenção ou uma porção de ligação de antígeno desse. A invenção também fornece vetores compreendendo moléculas de acido nucléico que codificam a cadeia leve de tais anticorpos ou porção de ligação e antígeno desses. A invenção fornece ainda vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos e sondas desses.
[000194] Em algumas modalidades os anticorpos anti-M-CSF, ou porções de ligação de antígeno da invenção são expressos pela inserção de DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de extensão completa, obtidos como descrito acima, em vetores de expressão tal que os genes são operativamente ligados a seqüências de controle de expressão necessárias tais com seqüências de controle transcricional ou translacional. Vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), vírus de plantas tais como vírus do mosaico da couve-flor, vírus do mosaico do tabaco, cosmídeos, YACs, epissomas derivados de EBV, e os semelhantes. O gene do anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetor servem suas funções pretendidas de regular a transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhidas para ser compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em uma modalidade preferida, ambos os genes são inseridos dentro do mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpos
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65/140 são inseridos dentro do vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sitos de restrição complementares no fragmento e vetor do gene do anticorpo, ou ligação de extremidade cega de sítios de restrição não estão presentes).
[000195] Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina CH ou CL humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados projetados para que qualquer seqüência VH ou VL pode facilmente ser inserida e expressa, como descrito acima. Em tais vetores, splicing geralmente ocorre entre o sítio doador de splice na região J inserida e o sítio aceptor de splice antecedendo o domínio C humano, e ainda nas regiões de splice que ocorrem dentro do exons CH humanos. Poliadenilação e terminação da transcrição ocorrem em sítios cromossômicos nativos à jusante das regiões codificantes. O vetor de expressão recombinante pode ainda codificar um peptídeo de sinal que facilita secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado dentro do vetor tal que o peptídeo de sinal é ligado estruturalmente a terminação amino da cadeia de imunoglobulina. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não-imunoglobulina).
[000196] Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinante da invenção carregam seqüências regulatórias que controlam a expressão de genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. Será valorizado pelos versados na técnica que o projeto do vetor de expressão incluindo a seleção de seqüências regulatórias pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, tais
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66/140 como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/intensificador de CMV), Simian Vírus 40 (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), promotores de mamíferos de polioma e de força tais como promotores de imunoglobulina e actina nativos. Para maior descrição de elementos regulatórios virais e seqüências desses, veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.168.062, Patente U.S. No. 4.510.245 e Patente U.S. No. 4.968.615. Métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores assim como transformação de plantas são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes do Estados Unidos 6.517.529, aqui incorporada por referência. Métodos para expressar polipeptídios em células bacterianas ou células fúngicas, por exemplo, células de levedura, também são bem-conhecidos na técnica.
[000197] Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam replicação do vetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes rótulos selecionáveis. O gene rótulo selecionável facilita seleção de células hospedeiras dentro das quais o vetor tenha sido introduzido (veja por exemplo, Patente U.S. Nos. 6.517.529). Por exemplo, tipicamente o gene rótulo selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexate, em uma célula hospedeira dentro da qual o vetor tenha sido introduzido. Genes rótulos selecionáveis preferidos incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras-dhfr com seleção/amplificação por metotrexate), o gene de resistência a neomicina (para seleção de G418), e o gene da glutamato sintetase.
Células Hospedeiras Não-Hibridoma e Métodos de Produzir Proteína
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Recombinantemente [000198] Moléculas de acido nucléico que codificam anticorpos antiM-CSF e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para transfecção de uma célula de mamífero, de planta, bacteriana ou de levedura adequada. Transformação pode ser por qualquer método conhecido de introduzir polinucleotídeos dentro de uma célula hospedeira. Métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos dentro de células de mamíferos são bem-conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextran, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação dos polinucleotídeos em polipossomas, e microinjeção direta do DNA dentro do núcleo. Em adição, moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em células de mamíferos por vetores virais. Métodos de transformar células são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, e 4.959.455 (patentes as quais estão por meio dessa incorporadas por referência), Métodos de transformar células de plantas são bem-conhecidos na técnica, incluindo por exemplo, transformação mediada por agrobactéria, transformação biolística, injeção direta, eletroporação e transformação viral.
[000199] Células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem-conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis na Americam Type Culture Collection (ATCC). Essas incluem, inter alia, células de ovário de hamster chinês (CHO), NOS, células SP2, células HeLa, células de rim de hamster jovem (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, e várias outras linhagens celulares. Linhagens celulares de preferência particular são selecionadas através da determinação de quais células tem altos níveis de expressão. Outras linhagens que podem ser usadas
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68/140 são linhagens de células de insetos, tais como células Sf9. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos pelo cultivo das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura nas quais a células hospedeiras são crescidas. Anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão. Células hospedeiras de plantas incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabodopsis, Lentilha d'água, milho, trigo, batata, etc. Células hospedeiras bacterianas incluem as espécies E. coli e Streptomyces. Células hospedeiras de levedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.
[000200] Além disso, expressão de anticorpos da invenção (ou outras porções delas) a partir de linhagens celulares de produção pode ser aumentada usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene da sintetase de glutamina (o sistema GS) é uma abordagem comum para aumentar expressão sob certas condições. O sistema GS é discutido no todo ou parte com relação a Patente Européia Nos. 0 216 846, 0 256 055, e 0 323 997 e Pedido de Patente Européia No. 89303964.4.
[000201] É possível que anticorpos expressos por diferentes linhagens celulares ou em animais transgênicas tenham glicosilação diferente uma da outra. Entretanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de acido nucléico aqui fornecidas, ou compreendendo as seqüências de aminoácidos aqui fornecidas são parte da presente invenção independente do estado ou padrão de glicosilação ou modificação dos anticorpos.
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Animais e Plantas Transgênicas [000202] Anticorpos anti-M-CSF da invenção podem ainda ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que é transgênico para as seqüências de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de interesse e produção do anticorpo em uma forma recuperável dele. Em relação à produção transgênica em mamíferos, anticorpos anti-M-CSF podem ser produzidos em, e recuperados de leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, e 5.741.957. Em algumas modalidades, animais não-humanos transgênicos que compreendem loci de imunoglobulina humana são imunizados com M-CSF ou uma porção imunogênica desse, como descrito acima. Métodos para fazer anticorpos em plantas, levedura ou fungo/alga são descritos por exemplo, nas patentes US 6.046.037 e US 5.959.177.
[000203] Em algumas modalidades, animais não-humanos transgênicos ou plantas são produzidas pela introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo anti-M-CSF da invenção dentro do animal ou planta por técnicas transgênicas padrão. Veja Hogan e Patente dos estados Unidos 6.417.429, supra. As células transgênicas usadas para fazer o animal transgênico podem ser células tronco embrionárias ou células somáticas. Os organismos transgênicos não-humanos podem ser quiméricos, heterozigotos não-quiméricos e homozigotos não-quiméricos. Veja, por exemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Em algumas modalidades, os animais não-humanos transgênicos tem uma quebra e reposição selecionada por um construto de seleção que codifica a cadeia pesada e/ou leve de interesse. Em
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70/140 uma modalidade preferida, os animais transgênicos compreendem e expressam moléculas de ácido nucléico que codificam cadeias pesadas e leves que se ligam especificamente a M-CSF, preferivelmente M-CSF humano. Em algumas modalidades, os animais transgênicos compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam um anticorpo modificado tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-M-CSF podem ser feitos em qualquer animal transgênico. Em uma modalidade preferida, os animais não-humanos são camundongo, ratos, ovelha, porcos, cabras, gado ou cavalos. O animal não-humano transgênico expressa ditos polipeptídios codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros fluidos corporais.
Bibliotecas de Exposição em Fago [000204] A invenção fornece um método para produzir um anticorpo anti-M-CSF ou porção de ligação de antígeno desse compreendendo as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fago, rastrear a biblioteca com M-CSF ou uma porção desse, isolar o fago que se liga a M-CSF, e obter o anticorpo a partir do fago. Como exemplo, um método para preparar a biblioteca de anticorpos para uso em técnicas de exposição em fago compreende as etapas de imunizar um animal não-humano compreendendo loci de imunoglobulina humana com M-CSF ou porção antigênica desse para criar uma resposta imune, extrair células produtoras de anticorpo do animal imunizado. Isolar RNA das células extraídas, transcrever reversamente o RNA para produzir cDNA, amplificar o cDNA usando um iniciador, e inserir o cDNA em um vetor de exposição de fago tal que anticorpos são expresso no fago. Anticorpos anti-M-CSF recombinantes da invenção podem ser obtidos dessa maneira.
[000205] Anticorpos humanos anti-M-CSF recombinantes da invenção podem, ser isolados pelo varredura de uma biblioteca de anticorpo
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71/140 combinatória recombinante. Preferivelmente a biblioteca é uma biblioteca de exposição em fago scFv, gerada usando cDNAs de Vl e VH humano preparado a partir de RNAm isolado de células B. Metodologias para preparar e rastrear tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Há kits comercialmente disponíveis para gerar bibliotecas de exposição em fago (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e o kit para exposição em fago Stratagene SurfZAPTM, catálogo no. 240612). Há ainda outros métodos e reagentes que podem ser usados para gerar e rastrear bibliotecas de exposição em fago (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.223.409; Publicação PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:12751281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al.,
Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); e Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991).
[000206] Em uma modalidade para isolar anticorpos anti-M-CSF humanos com as características desejadas, um anticorpo anti-M-CSF como aqui descrito é primeiro usado para selecionar seqüências de cadeia pesada e leve humanas que tem atividade de ligação similar em relação a M-CSF, usando os métodos de impressão de epítopo descritos na Publicação PCT No. WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos usadas messe método são preferivelmente bibliotecas scFv preparadas e rastreadas como descrito na Publicação PCT No. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); e Griffiths et al.,
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EMBO J. 12:725-734 (1993). As bibliotecas de anticorpos scFv são rastreadas usando M-CSF humano como o antígeno.
[000207] Uma vez que os domínios Vl e Vh humanos iniciais são selecionados, experimentos de misturar e combinar são realizados, nos quais pares diferentes dos segmentos Vl e Vh inicialmente selecionados são rastreados para ligação de M-CSF para selecionar combinações de pares Vl/Vh preferidos. Adicionalmente, para melhorar adicionalmente a qualidade do anticorpo, os segmentos Vl e Vh do(s) par(es) Vl/Vh preferido(s) pode(m) ser randomicamente mutados, preferivelmente dentro da região CDR3 de Vh e/ou Vl, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela mutação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Essa maturação de afinidade in vitro pode ser alcançada pela amplificação dos domínios Vl e Vh usando iniciadores de PCR complementares à CDR3 de Vh ou CDR3 de Vl, respectivamente, esses iniciadores foram fixados com uma mistura randômica das quatro bases de nucleotídeos em certas posições tal que os produtos de PCR resultantes codificam segmentos Vl e Vh dentro dos quais mutações randômicas foram introduzidas nas regiões CDR3 de Vh e/ou Vl Esses segmentos Vl e Vh randomicamente mutados podem ser re-rastreados para ligação a M-CSF.
[000208] Seguindo o rastreamento e isolamento de um anticorpo antiM-CSF da invenção a partir de uma biblioteca de exposição de imunoglobulina recombinante, ácidos nucléicos que codificam o anticorpo selecionado podem ser recuperadas a partir do conjunto de exposição (por exemplo, a partir do genoma do fago) e subclonados em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucléico pode ainda ser manipulado para criar outras formas de anticorpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado por rastreamento
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73/140 de uma biblioteca combinatória, o DNA que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamíferos, como descrito acima.
Mudança de Classe [000209] Outro aspecto da invenção fornece um método para converter a classe ou subclasse de um anticorpo anti-M-CSF em outra classe ou subclasse. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucléico que codifica um VL ou VH que não inclui quaisquer seqüências de ácido nucléico que codificam Cl ou Ch é isolada usando métodos bem-conhecidos na técnica. A molécula de ácido nucléico então é operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma cadeia CL ou CH, de uma classe ou subclasse de imunoglobulina desejada. Isso pode ser alcançado usando um vetor ou uma molécula de ácido nucléico que compreende uma cadeia CL ou CH, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti-M-CSF que foi originalmente IgM pode ter a classe mudada para uma IgG. Além disso, a mudança de classe pode ser usada para converter uma subclasse de IgG em outra, por exemplo, de IgG1 para IgG2. Outro método para produzir um anticorpo da invenção compreendendo um isotipo desejado compreende as etapas de isolar um ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-M-CSF e um ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-M-CSF, isolar a seqüência que codifica a região Vh, ligar a seqüência Vh a uma seqüência que codifica um domínio constante de cadeia pesada do isotipo desejado, expressar o construto da cadeia leve e da cadeia pesada em uma célula, e coletar o anticorpo anti-M-CSF com o isotipo desejado.
[000210] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-M-CSF da invenção tem a serina da posição 228 (de acordo com a convenção de numeração-EU) da cadeia pesada mudada para uma prolina.
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Conseqüentemente, a sub-seqüência CPSC na região Fc da IgG4 se torna CPPC, que é a sub-seqüência em IgG1 (Aalberse, R. C. e Schuurman, J., Immunology, 105:9-19 (2002)). Por exemplo, a serina no resíduo 243 SEQ ID NO: 46 (que corresponde a resíduo 228 na convenção de numeração-EU se tornaria prolina. Similarmente, a serina no resíduo 242 de SEQ ID NO: 38 (que corresponde ao resíduo 228 na convenção de numeração-EU) se tornaria prolina. Em algumas modalidades, a região estrutural do anticorpo IgG4 pode ser contramutada para uma seqüência estrutural da linhagem germinativa. Algumas modalidades compreendem tanto a região estrutural contramutada como a mudança de serina para prolina na região Fc. Veja, por exemplo, SEQ ID NO: 54 (anticorpo 9.14.4C-Ser) e SEQ ID NO: 58 (anticorpo 8.10.3C-Ser) na Tabela 1.
Anticorpos Desimunizados [000211] Outra maneira de produzir anticorpos com imunogenicidade reduzida é a desimunização de anticorpos. Em outro aspecto da invenção, o anticorpo pode ser desimunizado usando técnicas descritas em, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO98/52976 e WO00/34317 (que aqui incorporadas por referencia em sua totalidade).
Anticorpos Mutados [000212] Em outra modalidade as moléculas de ácido nucléico, vetores e células hospedeiras podem ser usadas para fazer anticorpos anti-M-CSF mutados. Os anticorpos podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeia pesadas e/ou leves, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir o Kd do anticorpo para M-CSF, para aumentar ou diminuir koff, ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. Técnicas em mutagênese direcionada ao local são bem-conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook, et al., e Ausubel, et al, supra. Em uma
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75/140 modalidade preferida, mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que é conhecido de estar alterado comparado com a linhagem germinativa em um domínio variável de um anticorpo anti-MCSF. Em outra modalidade, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácidos que é conhecido de estar alterado comparado com a linhagem germinativa em uma região CDR ou região estrutural de um domínio variável, ou em um domínio constante de um anticorpo monoclonal 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF,
9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser,
9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser, 8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G. Em outra modalidade, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácidos que é conhecido de estar alterado comparado com a linhagem germinativa em uma região CDR ou região estrutural de um domínio variável de uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38,
46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98 ou 102, ou cuja seqüência de aminoácido é apresentada em SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 25, 29, 33, 37, 45, 97 ou 101. Em outra modalidade, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que é conhecido de estar alterado comparado com a linhagem germinativa em uma região CDR ou região estrutural de um domínio variável de uma seqüência de aminoácido de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 44, 48, 52, 56 ou 60, ou cuja seqüência de aminoácido é apresentada em SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 27, 31, 35, 43 ou
47.
[000213] Em uma modalidade, a região estrutural é mutada de modo que a(s) região(ões) estrutural(is) resultante(s) tem a seqüência de aminoácido do gene da linhagem germinativa correspondente. Uma mutação pode ser feita em uma região estrutural ou domínio constante
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76/140 para aumentar a meia-vida do anticorpo anti-M-CSF. Veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 00/09560, aqui incorporada por referência. Uma mutação em uma região estrutural ou domínio constante também pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio para ligação covalente ou não-covalente com outra molécula, ou para alterar tais propriedades como fixação do complemento, ligação de FcR e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). De acordo com a invenção, um anticorpo único pode ter mutações em qualquer uma ou mais das regiões CDRs ou estruturais do domínio variável ou no domínio constante.
[000214] Em algumas modalidades, há de 1 a 8 incluindo qualquer número entre, mutações de aminoácidos tanto nos domínios VH ou VL do anticorpo anti-M-CSF mutado comparado com o anticorpo anti-MCSF antes da mutação. Em qualquer dos acima, as mutações podem ocorrer em uma ou mais das regiões CDR. Além disso, quaisquer das mutações podem ser substituições de aminoácidos conservativas. Em algumas modalidades, há não mais que 5, 4, 3, 2, ou 1 alterações de aminoácidos nos domínios constantes.
Anticorpos Modificados [000215] Em outra modalidade, um anticorpo de fusão ou imunoadesina pode ser feita que compreenda todo ou uma porção de um anticorpo anti-M-CSF da invenção ligado a outro polipeptídio. Em uma modalidade preferida, apenas os domínios variáveis do anticorpo anti-M-CSF são ligados ao polipeptídio. Em outra modalidade preferida, o domínio Vh de um anticorpo anti-M-CSF é ligado ao primeiro polipeptídio, enquanto o domínio VL de um anticorpo anti-M-CSF é ligado a um segundo polipeptídio que se associa com o primeiro polipeptídio de uma maneira tal que os domínios Vh e Vl podem interagir um com o outro para formar um sítio de ligação de anticorpo. Em outra
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77/140 modalidade preferida, o domínio Vh é separado do domínio Vl por um ligante tal que os domínios Vh e Vl podem interagir um com o outro (veja abaixo sob Anticorpos de Cadeia Única). O anticorpo VH-ligante-VL é então ligado ao polipeptídio de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídio para uma célula ou tecido que expressa M-CSF. O polipeptídio pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, fator de crescimento ou outra proteína regulatória, ou pode ser um agente diagnóstico, tal como uma enzima que pode ser facilmente visualizada, tal como peroxidase de rábano silvestre. Em adição, anticorpos de fusão podem ser criados nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados um ao outro. Isso é útil se deseja-se criar um anticorpo divalente ou polivalente ou uma única cadeia de polipeptídio, ou se deseja-se criar um anticorpo biespecífico. [000216] Para criar um anticorpo de única, (scFv) os fragmentos de DNA que codificam Vh e Vl são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a seqüência de aminoácido (Gly4 - Ser)3, tal que as seqüências Vh e Vl podem ser expressão como uma proteína de cadeia única contígua, com os domínios Vl e Vh unidos pelo ligante flexível. Veja, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas um único Vh e Vl são usados, bivalente, se dois Vh e Vl são usados, polivalente se mais de dois Vh e Vl são usados. Anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados que se ligam especificamente a MCSF e a outra molécula.
[000217] Em outras modalidades, outros anticorpos modificados podem ser preparados usando moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpo anti-M-CSF. Por exemplo, Kappa corpos (Kappa bodies) (Ill et. el., Protein. Eng. 10: 949-57 (1997)), Minicorpos (Martin
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78/140 et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), Diacorpos (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)), or Janusins (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) e Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) podem ser preparados usando técnicas de biologia molecular padrão seguindo os ensinamentos da especificação. [000218] Anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação de antígeno podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Em adição, anticorpos biespecíficos podem ser formados como diacorpos ou Janusins. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga a dois epítopos diferentes de M-CSF. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico tem uma primeira cadeia pesada e uma primeira cadeia leve do anticorpo monoclonal 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, ou 9.7.2 e uma cadeia pesada e cadeia leve adicionais também são de um dos anticorpos monoclonais acima identificados, mas são diferentes dos da primeira cadeia pesada e leve.
[000219] Em algumas modalidades, os anticorpos modificados descritos acima são preparados usando um ou mais dos domínios variáveis ou regiões CDR de um anticorpo anti-M-CSF humano fornecido aqui, de uma seqüência de aminoácido do dito anticorpo monoclonal, ou de uma cadeia pesada ou cadeia leve codificada por uma seqüência de ácido nucléico que codifica dito anticorpo monoclonal.
Anticorpos Derivatizados e Marcados [000220] Um anticorpo anti-M-CSF ou porção de ligação de antígeno da invenção pode ser derivatizada ou ligada a outra molécula (por exemplo, outro peptídio ou proteína). Em geral, os anticorpos ou porção
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79/140 desses são derivatizados tal que de a ligação de M-CSF não é afetada adversamente pela derivatização ou marcação. Conseqüentemente, os anticorpos e porções de anticorpo da invenção pretendem incluir ambas as formas intactas e modificadas dos anticorpos anti-M-CSF humanos aqui descritos. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem ser funcionalmente ligados (por acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outra forma) a uma ou mais entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídio que pode mediar associação do anticorpo ou porção de anticorpo com outra molécula (tal como uma região central de estreptavidina ou um indicador de polihistidina).
[000221] Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido pela ligação cruzada de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos reativos distintamente separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncionais (por exemplo, suberato de dissuccinimidil). Tais ligantes são disponíveis no Pierce Chemical Company, Rockford, Il1.
[000222] Outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo marcado. Agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção pode ser derivatizada incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isoticianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1napthalenesulfonila, ficoerithrina, fósforo de lantamida e semelhantes. Um anticorpo pode também ser marcado com enzimas que são úteis para detecção, tais como peroxidase de rábano silvestre, βgalactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, oxidase de glicose e
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80/140 semelhantes. Quando um anticorpo é marcado com uma enzima detectável, ele é detectado pela adição de reagentes adicionais que as enzimas usam para produzir um produto de reação que pode ser distinguidos. Por exemplo, quando o agente peroxidase de rábano silvestre está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo pode também ser marcado com biotina, e detectado através de medição indireta de ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo pode ainda ser marcado com um epítopo de polipeptídio determinado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpo secundários, domínios de ligação de metais, indicadores de epitopos). Em algumas modalidades, rótulos são ligados por braços espaçadores de varias extensões para reduzir hidrância estérica potencial.
[000223] Um anticorpo anti-M-CSF pode ainda ser marcado com um aminoácido radiorotulado. O anticorpo anti-M-CSF radiorotulado pode ser usado tanto para fins de diagnóstico como terapêutico. Por exemplo, o anticorpo radiorotulado anti-M-CSF pode ser usado pra detectar tumores que expressam M-CSF por raio-x ou outras técnicas de diagnóstico. Adicionalmente, o anticorpo anti-M-CSF radiorotulado pode ser usado terapeuticamente como uma toxina para células cancerosas ou tumores. Exemplos de rótulos para polipeptídios incluem mas não são limitados a, os seguintes radioisótopos ou radionuclídeos - 3H, 14C, 15N 35s 90y 99Tc 111In 135f e 131f [000224] Um anticorpo anti-M-CSF pode ainda ser derivatizado com um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila, ou um grupo carboidrato. Esses grupos são úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia- vida do soro ou para aumentar a ligação do tecido.
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Kits e Composições Farmacêuticas [000225] A invenção também se refere a composições compreendendo um anticorpo antagonista anti-M-CSF para o tratamento de indivíduos necessitados de tratamento para artrite reumatóide, osteoporose, ou aterosclerose. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em outras modalidades, o indivíduo é um indivíduo veterinário. Distúrbios hiperproliferativos, onde monócitos tem um papel que pode ser tratado por um anticorpo anti-M-CSF antagonista da invenção podem envolver qualquer tecido ou órgão e incluem, mas não são limitados a câncer de cérebro, pulmão, células escamosas, baço, gástrico, pancreático, de cabeça, pescoço, fígado, renal, ovariano, prostático, colorretal, do esôfago, ginecológico, ou de tireóide, melanomas, linfomas, leucemias ou mielomas múltiplos. Em particular, anticorpos antagonistas anti-M-CSF humanos da invenção são úteis para tratar ou prevenir carcinomas de mama, próstata e, cólon e pulmão. [000226] Essa invenção também abrange composições para o tratamento de uma condição selecionada a partir do grupo que consiste em artrite, artrite psoriásica, síndrome de Reiter gota, artrite traumática, artrite da rubéola e sinovite aguda, artrite reumatóide, espondilite reumatóide, espondilite anqilosante, osteoartrite, artrite gotosa e outras condições artríticas, sepse, choque séptico, choque endotóxico, sepse por gram-negativo, síndrome do choque tóxico, doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, neurotrauma, asma, síndrome da angústia respiratória do adulto, malária cerebral, doença inflamatória pulmonar crônica, silicose, sarcoidose pulmonar, doença de reabsorção óssea, osteoporose, reestenose, lesão de reperfusão renal e cardíaca, trombose, glomerulonefrite, diabete, reação enxerto vs. hospedeiro, rejeição de aloenxerto, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, degeneração muscular, eczema, dermatite de contato, psoríase, queimadura solar e conjuntivite em um
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82/140 mamífero, incluindo um ser humano, compreendendo uma quantidade de um anticorpo monoclonal anti-M-CSF humano da invenção eficaz em tal tratamento e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[000227] Tratamento pode envolver a administração de um ou mais anticorpos monoclonais anti-M-CSF antagonistas da invenção, ou fragmentos de ligação de antígenos desses, sozinhos ou com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui usado, veículo farmaceuticamente aceitável significa qualquer e todos solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento de absorção e isotônico, e os semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol, e os semelhantes, assim como combinações desses. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes de umedecimento ou menores quantidades de substâancias auxiliares tais como agentes de umedecimento ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil e a eficácia do anticorpo.
[000228] Anticorpos anti-M-CSF da invenção e composições os compreendendo, podem ser administrados em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, diagnósticos ou profiláticos. Agentes terapêuticos adicionais incluem outros agentes anti-neoplásicos, antitumorais, antiongiogênicos, ou quimioterapêuticos. Tais agentes adicionais podem ser incluídos na mesma composição ou administrados separadamente. Em algumas modalidades, um ou mais anticorpos antiM-CSF inibitórios da invenção podem ser usados como uma vacina ou como adjuvantes para uma vacina.
[000229] As composições dessa invenção podem estar em uma
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83/140 variedade de formas, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semisólidas ou sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração e aplicação terapêutica pretendida. Composições típicas preferidas estão na forma de soluções injetáveis ou que podem ser infundidas, tais como composições similares àquelas usadas para imunização passiva de humanos. O modo de administração preferido é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitonial, intramuscular). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea. Em outra modalidade, a invenção inclui um método de tratar um indivíduo necessitado desse com um anticorpo ou porção e ligação de antígeno desse que se liga especificamente a M-CSF compreendendo as etapas de : (a) administrar uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou a porção de ligação de antígeno dessa, uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação de antígeno dessa, ou ambas as moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia pesada e cadeia leve ou porções de ligação de antígeno dessas, e (b) expressar a molécula de ácido nucléico.
[000230] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura receitada adequada para alta concentração de droga. Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas pela incorporação do anticorpo anti-M-CSF na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por
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84/140 esterilização por filtração. Geralmente, dispersões podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem por atomização e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado a partir de uma solução filtrada-estéril dessa. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela preservação do tamanho da partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que retarda absorção, por exemplo, sais de monoesterato e gelatina.
[000231] Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo de administração preferido é subcutâneo, intramuscular, ou infusão intravenosa. Como será avaliado pelos técnicos versados, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados.
[000232] Em certas modalidades, o composto ativo das composições de anticorpo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o anticorpo contra liberação rápida, tal como formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos dos versados na técnica. Veja,
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85/140 por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
[000233] Em certas modalidades, um anticorpo anti-M-CSF da invenção pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode ainda ser encerrado em uma cápsula de gelatina mole ou dura, prensado em comprimidos, ou incorporado diretamente da dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os anticorpos anti-M-CSF podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos que podem ser ingeridos, comprimidos orais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, e os semelhantes. Para administrar um composto da invenção por outra que não administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar composto com, um material para prevenir sua inativação.
[000234] Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições. Em certas modalidades um anticorpo anti-M-CSF da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Esses agentes incluem anticorpos que se ligam a outros alvos, agente antineoplásicos, agentes quimioterapêuticos, análogos de peptídios que inibem M-CSF, c-fms solúvel que pode se ligar a M-CSF, um ou mais agentes químicos que inibem M-CSF, agentes antiinflamatórios, anti-coagulantes, agentes que diminuem a pressão sanguínea (isto é, inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA)). Tais terapias de combinação podem requerer dosagens mais baixas do anticorpo anti-M-CSF assim como dos agentes co-administrados, dessa forma evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com as varias monoterapias.
[000235] Anticorpos anti-M-CSF inibitórios da invenção e composições os compreendendo também podem ser administradas em
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86/140 combinação com outros regimes terapêuticos, em particular com tratamento de radiação para o câncer. Os compostos da presente invenção podem ainda ser usados em combinação com agentes anticâncer tais como endostatina e angiostatina ou drogas citotóxicas tais como adriamicina, daunomicina, cis-platina, etoposídeo, taxol, taxotere e alcalóides tais como vincristina, inibidores de farnesil transferase, inibidores de VEGF e antimetabólitos tais como metotrexato.
[000236] Os compostos da invenção podem ainda ser usados em combinação com agentes antivirais tais como Viracept, AZT, Aciclovir e famciclovir e compostos anti-sépticos tais como Valant.
[000237] As composições da invenção podem incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de antígeno desse da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo ou porção de anticorpo de fazer surgir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são excedidas pelos efeitos terapêuticos benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, já que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[000238] Regimes de dosagens podem ser ajustados para fornecer a
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87/140 resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas durante o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem como aqui usado se refere a unidades fisicamente discretas adaptadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o feito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico desejado. As especificações para as formas de unidade de dosagem da invenção são impostas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do anticorpo anti-M-CSF ou porção e o efeito terapêutico ou profilático particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor tal anticorpo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
[000239] Uma variação não-limitante, ilustrativa, para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1 - 25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Deve ser notado que os valores de dosagens podem variar com o tipo de severidade da condição a ser aliviada. É para ser adicionalmente conhecido que para um indivíduo particular, regimes de dosagens específicos devem ser ajustados durante o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que está administrando ou supervisionando a administração das composições, e que variações de dosagem aqui descritas são ilustrativas e não pretendem limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.
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88/140 [000240] Outro aspecto da presente invenção fornece kits compreendendo um anticorpo anti-M-CSF ou porção de ligação de antígeno da invenção ou uma composição compreendendo tal anticorpo ou porção. Um kit pode incluir, além do anticorpo e da composição agentes diagnósticos ou terapêuticos. Um kit pode ainda incluir instruções para uso em método diagnóostico ou terapêutico. Em uma modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição compreendendo-o e um agente diagnóstico que pode ser usado em um método descrito abaixo, em outra modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição compreendendo-o e um ou mais agentes terapêuticos que podem ser usados em um método descrito abaixo. Uma modalidade da invenção é um kit compreendendo uma recipiente, instruções sobre administração de um anticorpo anti-M-CSF a um ser humano sofrendo que uma doença inflamatória, ou instruções para medir o número de monócitos CD14+CD16+ em uma amostra biológica e um anticorpo anti-M-CSF.
[000241] Essa invenção se refere ainda a composições para inibir crescimento celular anormal em um mamífero compreendendo uma quantidade de um anticorpo da invenção em combinação com uma quantidade de um agente quimioterapêutico, em que as quantidades do compostos, sais, solvato, ou pró-droga e do agente quimioterapêutico são juntas eficazes em inibir o crescimento celular anormal. Muitos agentes quimioterapêuticos são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico é selecionado do grupo que consiste em inibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabólitos, antibióticos intercalantes, inibidores de fatores de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, modificadores de resposta biológica, anti-hormônios, por exemplo, antiandrogênios, e agentes anti-angiogênese.
[000242] Agentes anti-angiogênese, tais como inibidores de MMP-2
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89/140 (matriz-metaloproteinase 2), inibidores de MMP-9 (matrizmetaloproteinase 9) e inibidores de COX-II (ciclooxigenase II), podem ser usados em conjunto com um anticorpo anti-M-CSF da invenção. Exemplos e inibidores de COX-II úteis incluem CELEBREX™, (celecoxib), valdecoxib e rofecoxib. Exemplos de inibidores de metaloproteinase de matriz úteis são descritos em WO 96/33172 (publicado em 24 de outubro de 1996), WO 96/27583 (publicado em 7 de março de 1996), Pedido de Patente Europeu No. 97304971.1 (depositado em 8 de julho de 1997), Pedido de Patente Europeu No. 99308617.2 (depositado em 29 de outubro de 1999), WO 98/07697 (publicado em 26 de fevereiro de 1998), WO 98/03516 (publicado em 29 de janeiro de 1998), WO 98/34918 (publicado em 13de agosto de 1998), WO 98/34915 (publicado em 13de agosto de 1998), WO 98/33768 (publicado em 6 de agosto de 1998), WO 98/30566 (publicado em 16 de julho de 1998), Publicação de Patente Européia 606.046 (publicada em 13 de julho de 1994), Publicação de Patente Européia 931.788 (publicada em 28 de julho de 1999), WO 90/05719 (publicada em 31 de maio de 1990), WO 99/52910 (publicado em 21 de outubro de 1999), WO 99/52889 (publicado em 21 de outubro de 1999), WO 99/29667 (publicado em 17 de junho de 1999), Pedido Internacional PCT No. PCT/IB98/01113 (depositado em 21 de julho de 1998), Pedido de Patente Europeu No. 99302232.1 (depositado em 25 de março de 1999), pedido de patente da Grã-Bretanha número 9912961.1 (depositado em 3 de junho de 1999), Pedido Provisório U.S. No. 60/148,464 (depositado em 12 de agosto de 1999), Patente U.S. 5.863.949 (emitido em 26 de janeiro de 1999), Patente U.S. 5.861.510 (emitido em 19 de janeiro de 1999), e Publicação de Patente Européia 780.386 (publicada em 25 de junho de 1997), todas as quais estão aqui incorporadas em suas totalidades por referencia. Inibidores de MMP preferidos são aqueles que não demonstram artralgia. Mais preferidos são aqueles que inibem seletivamente MMP-2 e/ou MMP-9 relativos a outras matixPetição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 95/156
90/140 metaloproteinases (isto é, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, e MMP-13). Alguns exemplos específicos de inibidores de MMP úteis na presente invenção são AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, e os compostos enumerados na seguinte lista: ácido 3-[[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propiônico; hidroxiamida de ácido 3-exo-3-[4-(4flúor-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3carboxílico; hidroxiamida de ácido (2R, 3R) 1-[4-(2-cloro-4-flúor-benzilóxi)-benzenossulfonil]-3-hidróxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; hidroxiamida de ácido 4-[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonilamino]tetrahidro-piran-4-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-flúor-fenóxi)benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propiônico; hidroxiamida de ácido 4-[4-(4-cloro-fenóxi)-benzenossulfonilamino]tetrahidro-pyran-4-carboxílico; hidroxiamida de ácido (R) 3-[4-(4-clorofenóxi)-benzenossulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-carboxílico;
hidroxiamida de ácido (2R, 3R) 1-[4-(4-flúor-2-metil-benzilóxi)benzenossulfonil]-3-hidróxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4flúor-fenóxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1-metil-etil)-amino]propiônico; ácido 3-[[4-(4-flúor-fenóxi)-benzenossulfonil]-(4hidroxicarbamoil-tetrahidro-piran-4-il)-amino]-propiônico; hidroxiamida de ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxabiciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida de ácido 3-endo-3-[4-(4flúor-fenóxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]- octano-3carboxílico; e hidroxiamida de ácido (R) 3-[4-(4-flúor-fenóxi)benizenossulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-carboxílico; e sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos ditos compostos.
[000243] Um composto compreendendo um anticorpo monoclonal anti-M-CSF humano da invenção pode ainda ser usado com inibidores de transdução de sinal, tais como agentes que podem inibir respostas de EGF-R (receptor de fator de crescimento epidérmico), tais como
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91/140 anticorpos de EGF-R, anticorpos de EGF, e moléculas que são inibidoras de EGF-R; inibidores de VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), tais como receptores de VEGF e moléculas que podem inibir VEGF; e inibidores de receptor erbB2, tais como moléculas orgânicas ou anticorpos que se ligam ao receptor erbB2, por exemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Inibidores de EGF-R são descritos em, por exemplo WO 95/19970 (publicado em 27 de julho de 1995), WO 98/14451 (publicado em 9 de abril de 1998), WO 98/02434 (publicado em 22 de janeiro de 1998), e Patente dos Estados Unidos 5.747.498 (depositada em 5 de maio de 1998), e tais substâncias podem ser usadas na presente invenção com aqui descrito. Agentes que inibem EGFR incluem, mas não são limitados a, os anticorpos monoclonais C225 e anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. e Merck KgaA), e os compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183.805 (Warner Lambert Parke Davis), CL387.785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) e Vacina de EGF-R (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Esses e outros agentes inibidores de EGF-R podem ser usados na presente invenção. [000244] Inibidores de VEGF, por exemplo SU-5416 e SU-6668
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92/140 (Sugen Inc.), AVASTINTM (Genentech), SH-268 (Schering), e NX-1838 (NeXstar) podem ainda ser combinados com o composto da presente invenção. Inibidores de VEGF são descritos em, por exemplo WO 99/24440 (publicado em 20 de maio de 1999), Pedido Internacional PCT PCT/IB99/00797 (depositado em 3 de 1999), em WO 95/21613 (publicado em 17 de agosto de 1995), WO 99/61422 (publicado em 2 de dezembro de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.834.504 (depositada em 10 de novembro de 1998), WO 98/50356 (publicado em 12 de novembro de 1998), Patente dos Estados Unidos 5.883.113 (depositada em 16 de março de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.886.020 (depositada em 23 de março de 1999), Patente dos Estados Unidos 5.792.783 (depositada em 11 de agosto de 1998), WO 99/10349 (publicada em 4 de março de 1999), WO 97/32856 (publicada em 12 de setembro de 1997), WO 97/22596 (publicada em 26 de junho de 1997), WO 98/54093 (publicada em 3 de dezembro de 1998), WO 98/02438 (publicada e, 22 de janeiro de 1998), WO 99/16755 (publicada em 8 de abril de 1999), e WO 98/02437 (publicada em 22 de janeiro de 1998), todas as quais estão aqui incorporadas em suas totalidades por referência. Outros exemplos de alguns inibidores de VEGF úteis na presente invenção são IM862 (Cytran Inc.); anticorpo monoclonal antiVEGF da Genentech, Inc.; e angiozima, uma ribozima sintética da Ribozyme e Chiron. Esses e outros inibidores de VEGF podem ser usados na presente invenção como aqui descrito. Inibidores de receptor de erbB2, tais como GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), e os anticorpos monoclonais AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) e 2B-1 (Chiron) podem ainda ser combinados com o composto da invenção, por exemplo aqueles indicados em WO 98/02434 (publicado em 22 de janeiro de 1998), WO 99/35146 (publicado em 15 de julho de 1999), WO 99/35132 (publicado em 15 de julho de 1999), WO 98/02437 (publicado em 22 de janeiro de 1998), WO 97/13760 (publicado em 17 de abril de
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1997), WO 95/19970 (publicado em 27 de julho de 1995), Patente dos Estados Unidos 5.587.458 (depositada em 24 de dezembro de 1996), e Patente dos Estados Unidos 5.877.305 (depositada em 2 de março de 1999), que estão todos aqui incorporados em suas totalidades por referência. Inibidores de receptor erbB2 úteis na presente invenção são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos 6.465.449 (depositada em 15 de outubro de 2002), e na Patente dos Estados Unidos 6.284.764 (depositada em 4 de setembro de 2001), ambas as quais estão aqui incorporadas em suas totalidades por referência. Os compostos e substâncias inibidoras de receptor de erbB2 descritas nos pedidos PCT, patentes U.S. e pedidos provisórios U.S. acima mencionados, assim como outros compostos e substâncias que inibem o receptor de erbB2, podem ser usados com o composto da presente invenção de acordo com a presente invenção.
[000245] Agentes anti-sobrevivência incluem anticorpos anti-IGF-IR e agentes anti-integrina, tais como anticorpos anti-integrina.
[000246] Agentes anti-inflamatórios podem ser usados em conjunto com um anticorpo anti-M-CSF da invenção. Para o tratamento de artrite reumatóide, os anticorpos anti-M-CSF da invenção podem ser combinados com agentes tais como inibidores de TNF-α tais como fármacos de TNF (tais como REMICADE™, CDP-870 e HUMIRA™) e moléculas de imunoglobulina de receptor de TNF (tais como ENBREL™), inibidores de IL-1, antagonistas de receptor ou IL-1ra solúvel (por exemplo, inibidores Kineret ou ICE), inibidores de COX-2 (tais como celecoxib, rofecoxib, valdecoxib e etoricoxib), inibidores de metaloprotease (preferivelmente inibidores seletivos de MMP-13), inibidores de p2X7, ligantes de α2δ (tais como NEURONTIN™ e PREGABALINTM), metotrexato em baixa dose, leflunomida, hidroxicloroquina, d-penicilina, auranofina ou ouro parenteral ou oral. Os compostos da invenção podem ainda ser usados em combinação com
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94/140 agentes terapêuticos existentes para o tratamento de osteoartrite. Agentes adequados para ser usados em combinação incluem agentes anti-inflamátorios não-esteroidais padrão (daqui por diante NSAID'S) tais como piroxicam, diclofenaco, ácidos propiônicos tais como naproxen, flubirprofen, fenoprofen, ketoprofen e ibuprofen, fenamatos tais como ácido mefenâmico, indometacina, sulindac, apazona, pirazolonas tais como fenilbutazona, salicilatos tais como aspirina, inibidores de COX-2 tais como celecoxib, valdecoxib, rofecoxib e etoricoxib, analgésicos e terapias intra-articulares tais como corticosteróides e ácidos hialurônicos tais como hyalgan e synvisc.
[000247] Agentes anti-coagulantes podem ser usados em conjunto com um anticorpo anti-M-CSF da invenção. Exemplos de agentes anticoagulantes incluem, mas não são limitados a, varfarina (COUMADINTM), heparina e enoxiparina (LOVENOXTM).
[000248] Os anticorpos anti-M-CSF humanos da presente invenção podem ainda ser usados em combinação com agentes cardiovasculares tais como bloqueadores de canais de cálcio, agentes redutores de lipídios tais como estatinas, fibratos, beta-bloqueadores, inibidores de ECA, antagonistas do receptor de Angiotensina-2 e inibidores de agregação plaquetária. Os compostos da presente invenção podem ainda ser usados em combinação com agentes de CNS tais como antidepressivos (tais como sertralina), fármacos anti-Parkinsonianos (tais como deprenil, L-dopa, REQUIPTM, MIRAPEXTM, inibidores de MAOB tais como selegina e rasagilina, inibidores de comP tais como Tasmar, inibidores de A-2, inibidores de recaptação de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas de Nicotina, agonistas de Dopamina e inibidores de sintase de óxido nítrico neuronal), e fármacos antiAlzheimer tais como donepezil, tacrina, inibidores de ligantes de α2δ (tais como NEURONTINTM e PREGABALINTM), inibidores de COX-2, propentofilina ou metirfonato.
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95/140 [000249] Os anticorpos anti-M-CSF humanos da presente invenção podem ainda ser usados em combinação com agentes de osteoporose tais como roloxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno ou fosomax e agentes imunossupressores tais como FK-506 e rapamicina.
Métodos Diagnósticos de Uso [000250] Em outro aspecto a invenção fornece métodos diagnósticos. Os anticorpos anti-M-CSF podem ser usados para detectar M-CSF em uma amostra biológica in vivo ou in vitro. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para diagnosticar a presença ou localização de um tumor que expressa M-CSF em um indivíduo que necessite disso, compreendendo as etapas de injetar o anticorpo no indivíduo, determinar a expressão de M-CSF no indivíduo pela localização de onde o anticorpo se ligou, comparar a expressão no indivíduo com aquela de um indivíduo normal de referência ou padrão, e diagnosticar a presença ou localização do tumor.
[000251] Os anticorpos anti-M-CSF podem ser usados em um imunoensaio convencional, incluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, FACS, imunohistoquímica de tecido, Western blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos anti-M-CSF da invenção podem ser usados para detectar M-CSF de humanos. Em outra modalidade, os anticorpos anti-M-CSF podem ser usados para detectar M-CSF de primatas tais como macacos cinomólogos, macacos rhesus, chimpanzés ou símios. A invenção fornece um método para detectar MCSF em uma amostra biológica compreendendo contactar uma amostra biológica com um anticorpo anti-M-CSF da invenção e detectar a ligação do anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-M-CSF é diretamente marcado com um rótulo detectável. Em outra modalidade, o anticorpo anti-M-CSF (o anticorpo primário) é não-marcado e um segundo anticorpo ou outra molécula que se liga ao anticorpo anti-MCSF é marcado. Como é bem-conhecido ao versado na técnica, um
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96/140 segundo anticorpo que é escolhido é capaz de se ligar especificamente à espécie e classe particular do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-M-CSF é uma IgG humana, então o anticorpo secundário poderia ser uma anti-IgG-humana. Outras moléculas que se ligam ao anticorpo incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G, ambas as quais são disponíveis comercialmente, por exemplo, da Pierce Chemical Co.
[000252] Rótulos adequados para o anticorpo ou anticorpo secundário foram descritos supra, e incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidade, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo prostético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.
[000253] Em outras modalidades, M-CSF pode ser testado em uma amostra biológica por um imunoensaio de competição utilizando padrões de M-CSF marcados com uma substância detectável e um anticorpo M-CSF não-marcado. Nesse ensaio, a amostra biológica, os padrões de M-CSF marcados e o anticorpo anti-M-CSF são combinados e a quantidade de padrão de M-CSF marcado ligada ao anticorpo nãomarcado é determinada. A quantidade de M-CSF na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de M-CSF marcado ligada ao anticorpo anti-M-CSF.
[000254] Pode-se usar os imunoensaios descritos acima para muitas finalidades. Por exemplo, os anticorpos anti-M-CSF podem ser usados
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97/140 para detectar M-CSF em células ou na superfície de células em cultura celular, ou secretadas no meio de cultura de tecido. Os anticorpos antiM-CSF podem ser usados para determinar a quantidade de M-CSF na superfície de células ou secretadas no meio de cultura de tecido que foram tratadas com vários compostos. Esse método pode ser usado para identificar compostos que são úteis para inibir ou ativar expressão ou secreção de M-CSF. De acordo com esse método, uma amostra de células é tratada com um composto teste por um período de tempo enquanto outra amostra é deixada sem tratamento. Se o nível total de M-CSF for medido, as células são lisadas e o nível de M-SCF total é medido usando um dos imunoensaios descritos acima. O nível total de M-CSF nas células tratadas versus as não-tratadas é comparado para determinar o efeito do composto teste.
[000255] Um imunoensaio para medir níveis totais de M-CSF é um ELISA ou Western blot. Se o nível de superfície celular de M-CSF for medido, as células não são lisadas, os níveis de superfície celular de MCSF podem ser medidos usando um dos imunoensaios descritos acima. Um imunoensaio para determinar níveis de superfície celular de M-CSF pode incluir as etapas de marcar as proteínas de superfície celular com um rótulo detectável, tal como biotina ou 125I, imunoprecipitar o M-CSF com um anticorpo anti-M-CSF e então detectar o M-CSF marcado. Outro imunoensaio para determinar a localização de M-CSF, por exemplo, níveis de superfície celular, pode ser imunohistoquímica. Métodos tais como ELISA, RIA, Western blot, imunohistoquímica, marcação de superfície celular de proteínas de membrana integrais e imunoprecipitação são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Além disso, os imunoensaios podem ser aumentados proporcionalmente para rastreamento de alta produtividade a fim de testar um número maior de compostos para inibição ou ativação de M-CSF.
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98/140 [000256] Outro exemplo de um imunoensaio para medir níveis de MCSF secretados pode ser um ensaio de captura de antígeno, ELISA, ensaio de imunohistoquímica, Western blot e os semelhantes usando anticorpos da invenção. Se M-CSF secretado for medido, meio de cultura celular ou fluido corporal, tal como soro sangüíneo, urina, ou fluido sinovial, pode ser testado para M-CSF secretado e/ou células podem ser lisadas para liberar M-CSF produzido mas ainda não secretado. Um imunoensaio para determinar níveis secretados de MCSF inclui as etapas de marcar as proteínas secretadas com um rótulo detectável, tal como biotina ou 125I, imunoprecipitar o M-CSF com um anticorpo anti-M-CSF e então detectar o M-CSF marcado. Outro imunoensaio para determinar níveis secretados de M-CSF pode incluir as etapas de (a) pré-ligar anticorpos anti-M-CSF à superfície de uma placa de microtitulação; (b) adicionar meio de cultura celular de tecido ou fluido corporal contendo o M-CSF secretado às cavidades da placa de microtitulação para ligar aos anticorpos anti-M-CSF; (c) adicionar um anticorpo que irá detectar o anticorpo anti-M-CSF, por exemplo, anti-MCSF marcado com digoxigenina que se liga a um epítopo e M-CSF diferente do anticorpo anti-M-CSF da etapa (a); (d) adicionar um anticorpo para digoxigenina conjugado com peroxidase; e (e) adicionar um substrato de peroxidase que irá produzir um produto de reação colorido que pode ser quantificado para determinar o nível de M-CSF secretado no meio de cultura celular de tecido ou uma amostra de fluido corporal. Métodos tais como ELISA, RIA, Western blot, imunohistoquímica, e ensaio de captura de antígeno são bemconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Lane supra. Além disso, os imunoensaios podem ser aumentados proporcionalmente para rastreamento de alta produtividade a fim de testar um número maior de compostos para inibição ou ativação de M-CSF.
[000257] Os anticorpos anti-M-CSF da invenção podem ainda ser
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99/140 usados para determinar os níveis de M-CSF da superfície da célula em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em algumas modalidades o tecido é de um tecido doente. Em algumas modalidades, o tecido pode ser um tumor ou uma biópsia desse. Em algumas modalidades do método, um tecido ou uma biópsia desse pode ser excisado de um paciente. O tecido ou biópsia pode então ser usado em um imunoensaio pra determinar por exemplo, níveis de M-CSF totais, níveis de de MCSF de superfície celular, ou localização de M-CSF pelos métodos discutidos acima.
[000258] O método pode compreender as etapas de administrar um anticorpo anti-M-CSF diretamente marcado ou uma composição compreendendo-os a um paciente que necessite de tal teste diagnóstico e submeter o paciente a análise de retratação por imagem para determinar a localização dos tecidos que expressam M-CSF. Análise de retratação por imagem é bem-conhecida no campo médico, e inclui, sem limitação, análise por raio-X, retratação por imagem por ressonância nuclear magnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CE). O anticorpo pode ser marcado com um agente adequado para retratação por imagem in vivo, por exemplo um agente de contraste tal, como bário, que pode ser usado para análise por raio X, ou um agente de contraste magnético, tal como quelato de gadolínio, que pode ser usado para MRI ou CE. Outros agentes rótulos incluem, sem limitação, radioisótopos, tais como 99Tc. Em outra modalidade, o anticorpo anti-M-CSF será nãomarcado e será retratado por imagem pela administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que é detectável e que pode se ligar ao anticorpo anti-M-CSF. Em uma modalidade, uma biópsia é obtida de um paciente para determinar se o tecido de interesse expressa M-CSF.
[000259] Os anticorpos anti-M-CSF da invenção podem ainda ser usados para determinar os níveis secretados de M-CSF em um fluido
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100/140 corporal tal como soro sangüíneo, urina ou fluido sinovial derivado de um tecido. Em algumas modalidades, o fluido corporal é de um tecido doente. Em algumas modalidades, o fluido corporal é de um tumor ou uma biópsia desse. Em algumas modalidades do método, fluido corporal é removido de um paciente. O fluido corporal é então usado em um imunoensaio para determinar níveis de M-CSF secretado pelos métodos discutidos acima. Uma modalidade da invenção é um método para testar atividade de um antagonista de M-CSF compreendendo: administrar um antagonista de M-CSF a um indivíduo primata ou humano e medir o número de monócitos CD14+CD16+ em uma amostra biológica.
Métodos Terapêuticos de Uso [000260] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para inibir atividade de M-CSF pela administração e um anticorpo anti-M-CSF a um paciente que necessita desse. Quaisquer dos tipos de anticorpos aqui descritos podem ser usados terapeuticamente. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-M-CSF é um anticorpo humano, quimérico ou humanizado. Em outra modalidade preferida, o M-CSF é humano e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa um M-CSF tal que o anticorpo anti-M-CSF reaja cruzadamente com ele. O anticorpo pode ser administrado a um mamífero não-humano que expressa um M-CSF com o qual o anticorpo faça reação cruzada. (isto é um primata) para fins veterinários ou como modelo animal de doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos dessa invenção.
[000261] Como aqui usado, o termo um distúrbio na qual atividade de M-CSF é prejudicial pretende incluir doenças e outros distúrbios nas quais a presença de altos níveis de M-CSF em um indivíduo que sofre do distúrbio tenha sido mostrado como sendo ou suspeita de ser
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101/140 responsável pela patofisiologia do distúrbio ou um fator contribui para uma piora do distúrbio. Tais distúrbios põem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento nos níveis e M-CSF secretados e/ou na superfície da célula ou autofosforilação de tirosina de c-fms aumentada nas células afetadas ou tecidos de um indivíduo que sofre do distúrbio. Os níveis de M-CSF aumentados podem ser detectados, por exemplo, usando um anticorpo anti-M-CSF como descrito acima.
[000262] Em uma modalidade, um anticorpo anti-M-CSF pode ser administrado a um paciente que tem um tumor que expressa c-fms ou um tumor que secreta M-CSF e/ou que expressa M-CSF na superfície de suas células. Preferivelmente, o tumor expressa um nível de c-fms ou M-CSF que é mais alto que o de um tecido normal. O tumor pode ser um tumor sólido ou pode ser um tumor não-sólido, tal como um linfoma. Em uma modalidade mais preferida, um anticorpo anti-M-CSF pode ser administrado a um paciente que tem um tumor que expressa c-fms, um tumor que expressa M-CSF, ou um tumor que secreta M-CSF que é canceroso. Adicionalmente, o tumor pode ser canceroso. Em uma modalidade ainda mais preferida, o tumor é um câncer de pulmão, mama, próstata ou cólon. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-M-CSF administrado a um paciente resulta em M-CSF não mais se ligar ao receptor c-fms. Em uma modalidade altamente preferida, o método faz com que o tumor não aumente em peso ou volume ou diminua em peso ou volume. Em outra modalidade, o método faz com que c-fms nas células tumorais não esteja ligado a M-CSF. Em outra modalidade, o método fax com que M-CSF em células tumorais não esteja ligado a c-fms. Em outra modalidade o método faz com que MCSF secretado das células tumorais esteja ligado a c-fms. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é selecionado a partir de 252, 88, 100,
3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, 9.7.2, 9.7.2C-Ser, 9.14.4C-Ser, 8.10.3C-Ser, 8.10.3-CG2, 9.7.2-CG2, 9.7.2-
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CG4, 9.14.4-CG2, 9.14.4-CG4, 9.14.4-Ser, 9.7.2-Ser, 8.10.3-Ser,
8.10.3-CG4, 8.10.3FG1 ou 9.14.4G1, ou compreende uma cadeia pesada, cadeia leve ou porção e ligação de antígeno desse.
[000263] Em outra modalidade preferida, um anticorpo anti-M-CSF pode ser administrado a um paciente que expressa níveis inapropriadamente altos de M-CSF. É conhecido na técnica que expressão em altos níveis de M-CSF pode levar a uma variedade de cânceres comuns. Em uma modalidade dito método se refere ao tratamento de câncer tal como câncer de cérebro, célula escamosa, bexiga, gástrico, pancreático, mama, cabeça, pescoço, esôfago, próstata, colorretal, pulmão, renal, rim, ovariano, ginecológico, ou tireóide. Pacientes que podem ser tratados com compostos da invenção de acordo com os métodos dessa invenção incluem, por exemplo, pacientes que foram diagnosticados como tendo câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, tumores ginecológicos (por exemplo, sarcomas uterinos, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma da cérvix, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino (por exemplo, câncer de tireóide, paratireóide, ou glândulas adrenais), sarcomas de tecidos moles, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, leucemia aguda ou crônica, tumores sólidos (por exemplo, sarcomas, carcinomas ou linfomas que são cânceres de tecidos corporais que não sangue, medula óssea ou sistema linfático), tumores sólidos da infância, linfomas linfocíticos, câncer da bexiga, câncer do rim ou uréter (por exemplo, carcinoma de célula renal, carcinoma da pelve renal), ou neoplasmas do sistema nervoso central (por exemplo, linfoma de CNS
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103/140 primário, tumores do eixo espinhal, gliomas do tronco cerebral ou adenomas de pituitária). Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-M-CSF é administrado a um paciente com câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão ou câncer de cólon. Em uma modalidade ainda mais preferida, o método faz com que o câncer pare de proliferar anormalmente, ou não aumente em peso ou volume ou diminua em peso ou volume.
[000264] O anticorpo pode ser administrado uma vez, mas mais preferivelmente é administrado várias vezes. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado de três vezes diariamente a uma vez a cada seis meses ou mais tempo. A administração pode ser em um programa tal como três vezes diariamente, duas vezes diariamente, uma vez diariamente, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses. O anticorpo pode ser ainda administrado continuamente por uma minibomba. O anticorpo pode ser administrado por uma via oral, por mucosa, bucal, intranasal, inalatória, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, intratumoral ou tópica. O anticorpo pode ser administrado no local do tumor ou parte do corpo inflamada, dentro do tumor ou da parte do corpo inflamada, em um local distante do local do tumor ou da parte do corpo inflamada. O anticorpo pode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou por pelo menos o período de tempo até que a condição seja tratada, paliada ou curada. O anticorpo geralmente será administrado pra tanto tempo quanto o tumor está presente contanto que o anticorpo faça com que o tumor ou câncer pare de crescer ou que diminua em peso e volume até que a parte do corpo inflamada seja curada. O anticorpo será geralmente administrado como parte de uma composição farmacêutica como descrita supra. A dosagem do anticorpo estará geralmente na
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104/140 faixa de 0,1 - 100 mg/kg, mais preferivelmente 0,5 - 50 mg/kg, mais preferivelmente 1 - 20 mg/kg, e ainda mais preferivelmente 1 - 10 mg/kg. A concentração sérica do anticorpo pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica.
[000265] Em outro aspecto, o anticorpo anti-M-CSF pode ser coadministrado com outros agentes terapêuticos, tais como agentes antiinflamatórios, agentes anti-coagulantes, agentes que irão diminuir ou reduzir a pressão sangüínea, fármacos ou moléculas antineoplásicas, a um paciente que tem um distúrbio hiperproliferativo, tal como câncer ou tumor. Em um aspecto a invenção se refere a um método para o tratamento do distúrbio hiperproliferativa em um mamífero compreendendo administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção em combinação com um agente anti-tumoral selecionado a partir do grupo que consiste em, mas não é limitado a, inibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabólitos, agentes intercalantes, inibidores de fator de crescimento, inibidores de ciclo celular, enzimas, inibidores de topoisomerase, modificadores de resposta biológica, anti-hormônios, inibidores de quinase, inibidores de metaloprotease de matriz, terapêuticos genéticos e anti-androgênios. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo pode ser administrado com um agente antineoplásico tal como adriamicina ou taxol. Em outra modalidade preferida, o anticorpo ou terapia de combinação é administrado junto com radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, cirurgia ou outra imunoterapia. Em outra modalidade ainda preferida, o anticorpo será administrado com outro anticorpo. Por exemplo, o anticorpo anti-M-CSF pode ser administrado com um anticorpo ou outro agente que é conhecido por inibir proliferação da célula do tumor ou do câncer, por exemplo, um anticorpo ou agente que inibe receptor de erbB2, EGF-R, CD20 ou VEGF.
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105/140 [000266] Co-administração do anticorpo com um agente terapêutico adicional (terapia de combinação abrange administrar uma composição farmacêutica compreendendo a anticorpo anti-M-CSF e o agente terapêutico adicional e administrar duas ou mais composições farmacêuticas separadas, uma compreendendo o anticorpo anti-M-CSF e a(s) outra(s) compreendendo o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is). Adicionalmente embora co-administração ou terapia de combinação geralmente significa que o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados todos ao mesmo tempo, isso ainda abrange ocasiões nas quais o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados em tempos diferentes. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado uma vez a cada três dias, enquanto o agente terapêutico adicional é administrado uma vez diariamente. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado antes ou logo após o tratamento do distúrbio com o agente terapêutico adicional. Similarmente, administração do anticorpo anti-M-CSF pode ser administrada antes ou logo após outra terapia, tal como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, cirurgia, ou outra imunoterapia.
[000267] O anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos adicionais (a terapia de combinação) podem ser administrados uma vez, duas vezes ou pelo menos o período de tempo até que a condição seja tratada, paliada ou curada. Preferivelmente a terapia de combinação é administrada várias vezes. A terapia de combinação pode ser administrada de três vezes diariamente até uma vez a cada seis meses. A administração pode ser em um programa tal como três vezes diariamente, duas vezes diariamente, uma vez diariamente, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses, ou pode ser administrada continuamente por uma minibomba. A terapia de
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106/140 combinação pode ser administrada por uma via oral, por mucosa, bucal, intranasal, inalatória, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, intratumoral ou tópica. A terapia de combinação pode ser administrada em um local distante do local do tumor. A terapia de combinação será geralmente administrada por tanto tempo quanto o tumor está presente contanto que a anticorpo faça com que o tumor ou câncer pare de crescer ou que diminua em peso ou volume.
[000268] Em uma modalidade ainda adicional, o anticorpo anti-M-CSF é marcado com um radiorrótulo, uma imunotoxina ou uma toxina, ou é uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo tóxico. O anticorpo anti-M-CSF ou proteína de fusão de anticorpo anti-M-CSF direciona a radiomarca, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico para a célula que expressa M-CSF. Em uma modalidade preferida, a radiomarca, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico é internalizada após o anticorpo anti-M-CSF se ligar a M-CSF na superfície da célula alvo.
[000269] Em outro aspecto, o anticorpo anti-M-CSF pode ser usado para tratar estados não-cancerosos nos quais altos níveis de M-CSF e/ou M-CSF foram associados com o estado ou doença não-cancerosa. Em uma modalidade, o método compreende a etapa de administrar um anticorpo anti-M-CSF a um paciente que tem um estado patológico nãocanceroso causado ou exacerbado por altos níveis de M-CSF e/ou níveis ou atividade M-CSF. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-M-CSF retarda o progresso do estado patológico nãocanceroso, em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-M-CSF pára ou reverte, pelo menos em parte o estado patológico não-canceroso. Terapia Gênica [000270] As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser administradas a um paciente que necessite delas por terapia gênica. A terapia pode ser ou in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade preferida, moléculas de ácido nucléico que codificam tanto uma cadeia leve como
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107/140 uma cadeia pesada são administradas a um paciente. Em uma modalidade mais preferida, as moléculas de ácido nucléico são administradas tal que elas são estavelmente integradas nos cromossomos de células B porque essas células são especializadas em produzir anticorpos. Em uma modalidade preferida, células B precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas em um paciente que necessite delas. Em outra modalidade, células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo usando um vírus que se sabe que infecta o tipo celular de interesse. Vetores típicos usados para terapia gênica incluem lipossomas, plasmídeos e vetores virais. Vetores virais ilustrativos são retrovírus, adenovírus e vírus associados a adenovírus. Após infecção ou in vivo ou ex vivo, níveis de expressão do anticorpo podem ser monitorados pegando-se uma amostra do paciente tratado e usando-se um imunoensaio conhecido na técnica ou aqui discutido.
[000271] Em uma modalidade preferida, o método de terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno dessa de um anticorpo anti-M-CSF e expressar a molécula de ácido nucléico. Em outra modalidade, o método de terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno dessa de um anticorpo anti-M-CSF e expressar a molécula de ácido nucléico. Em uma modalidade mais preferida, o método de terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno dessa e uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno dessa de um anticorpo anti-M-CSF da invenção e expressar as moléculas de ácido nucléico. O método de terapia gênica pode ainda compreender a
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108/140 etapa de administrar outro agente anti-câncer, tal como taxol ou adriamicina.
[000272] A fim de que essa invenção possa ser mais bem entendida, os seguintes exemplos são descritos. Esses exemplos são para fins de ilustração apenas e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção em qualquer maneira.
EXEMPLO 1
Geração de Linhagens Celulares que Produzem Anticorpo Anti-M-CSF [000273] Anticorpos da invenção foram preparados, selecionados e testados como se segue:
Imunização e geração de hibridoma [000274] Oito a dez camundongos XENOMOUSETM idosos foram imunizados intraperitonialmente ou nos seus coxins plantares traseiros com M-CSF humano (10pg/dose/camundongo). Essa dose foi repetida cinco a sete vezes durante um período de três a oito semanas. Quatro dias antes da fusão, foi dada aos camundongos uma injeção final de MCSF humano em PBS. Os linfócitos do baço e dos nodos linfáticos dos camundongos imunizados foram fundidos com a linhagem celular não secretória P3-X63-Ag8.653 de mieloma, e as células fundidas foram submetidas seleção com HAT como previamente descrita (Galfre e Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Um painel de hibridomas todos secretando anticorpos IgG2 e IgG4 humanos específicos de MCSF foram recuperados. Anticorpos foram também gerados usando tecnologia XENOMAXTM como descrito em Babcook, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996. Nove linhagens celulares projetadas para produzir anticorpos da invenção foram selecionadas para estudo adicional e designadas 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,
9.14.4, 8.10.3 e 9.7.2. Os hibridomas foram depositados sob termos de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209
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109/140 em 8 e agosto de 2003. Aos hibridomas foram atribuídos os seguintes números ascendentes:
Hibridoma 3.8.3 (LN 15891) PTA-5390
Hibridoma 2.7.3 (LN 15892) PTA-5391
Hibridoma 1.120.1 (LN 15893) PTA-5392
Hibridoma 9.7.2 (LN 15894) PTA-5393
Hibridoma 9.14.4 (LN 15895) PTA-5394
Hibridoma 8.10.3 (LN 15896) PTA-5395
Hibridoma 88-gamma (UC 25489) PTA-5396
Hibridoma 88-kappa (UC 25490) PTA-5397
Hibridoma 100-gamma (UC 25491) PTA-5398
Hibridoma 100-kappa (UC 25492) PTA-5399
Hibridoma 252-gamma (UC 25493) PTA-5400
Hibridoma 252-kappa (UC 25494) PTA-5401
EXEMPLO II
Análise de Utilização de Gene
[000275] DNA que codifica as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1,120.1, 9.14.4,
8.10.3 e 9.7.2 foi clonado a partir das respectivas linhagens celulares de hibridoma e as seqüências de DNA foram determinadas por métodos conhecidos aos versados na técnica. Adicionalmente, DNA das linhagens celulares de hibridoma 9.14.4, 8.10.3 e 9.7.2 foi mutado em regiões estruturais especificas no domínio variável e/ou isotipo-trocado para obter, por exemplo, 9.14.4I, 8.10.3F, e 9.7.2IF, respectivamente. A partir da seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido previstas dos anticorpos, a identidade de uso de gene para cada cadeia de anticorpo foi determinada (VBASE). Tabela 2 descreve a utilização de gene dos anticorpos selecionados de acordo com a invenção:
Tabela 2
Utilização de Gene de Cadeia Pesada e Leve
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Clone Cadeia Pesada Cadeia Leve Kappa
SEQ ID NO: Vh DH Jh SEQ ID NO: Vx Jk
252 1,2 3-11 7-27 6 3, 4 O12 3
88 5, 6 3-7 6-13 4 7, 8 O12 3
100 9, 10 13-23 1-26 4 11, 12 L2 3
3.8.3 14 1 3-11 7-27 4 16 L5 3
2.7.3 18 13-33 1-26 4 20 L5 4
1.120.1 22 1-18 4-23 4 24 B3 1
9.14.4I 25, 26 3-11 7-27 4b 27, 28 O12 3
8.10.3F 29, 30 1 3-48 1-26 4b 31,32 A27 4
9.7.2IF 33, 34 3-11 6-13 6b 35, 36 O12 3
9.14.4 37, 38 3-11 7-27 4b 27, 28 O12 3
8.10.3 29, 30 3-48 1-26 4b 43, 44 A27 4
9.7.2 45, 46 3-11 643 6b 47, 48 O12 3
8.10.3FG1 97, 98 3-48 1-26 4b 31,32 A27 4
9.14.4G1 101, 102 3-11 7-27 4b 27, 28 O12 3
9.14.40-Ser 54 3-11 7-27 4b 56 O12 3
9.14.4-CG2 74 3-11 7-27 4b 56 O12 3
9.14.4-CG4 78 3-11 7-27 4b 56 O12 3
8.10.30C-Ser 58 3-48 1-26 4b 60 A27 4
8.10.3-CG2 62 3-48 1-26 4b 60 A27 4
8.10.3-CG4 94 3-48 1-26 4b 60 A27 4
8.10.3-Ser 90 3-48 1-26 4b 43, 44 A27 4
9.7.20-Ser 50 3-11 6-13 6b 52 O12 3
9.7.2-CG2 66 341 6-13 6b 52 O12 3
9.7.2-CG4 70 3-11 6-13 6b 52 O12 3
9.7.2-Ser 86 3-11 6-13 6b 47, 48 O12 3
9.14.4-Ser 82 3-11 7-27 4b 27, 28 O12 3
[000276] Mutagênese de resíduos específicos das cadeias leves e pesadas foi executada projetando-se iniciadores e usando o QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit da Stratagene, de acordo com as instruções do fabricante. Mutações foram confirmadas por seqüenciamento automático, insertos mutagenizados foram
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111/140 subclonados em vetores de expressão. Os vetores expressão foram transfectados em células HEK293 para produzir o suficiente dos anticorpos para caracterização.
EXEMPLO III
Ensaio de Proliferação de Célula Monocítica de Camundongo de MCSF [000277] Ensaios in vitro foram conduzidos para medir a proliferação de célula monocítica de camundongo dependente de M-CSF na presença de anticorpos anti-M-CSF para determinar o grau de inibição pelos anticorpos anti-M-CSF.
[000278] Células monocíticas de camundongo, células M-NFS-60, da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA), foram obtidas e mantidas em meio RPMI-1640 contendo L-glutamina 2 mM (ATCC), soro bovino inativado por calor (FBS) 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2-mercaptoetanol 0,05 mM (Sigma, St. Louis MO) (meio de ensaio), com M-CSF humano 15 ng/ml. Células M-NSF-60 foram repicadas para 5 x 104 para uso no dia seguinte ou para 2,5 x 104 para uso em 2 dias. Antes de usar no ensaio, as células foram lavadas três vezes com RPMI-1640, contadas e o volume ajustado com meio de ensaio para produzir 2 x 105 células/ml. Todas as condições foram conduzidas em triplicata em placas de cultura de tecido tratadas de 96 cavidades (Corning, Corning, NY). Para cada cavidade 50 μΙ das células lavadas, M-CSF 100 pM ou 1000 pM em um volume de 25 μl e anticorpo teste ou controle em várias concentrações em um volume de 25 μl em tampão de acetato (cloreto de sódio 140mM, acetato de sódio 20 mM, e polissorbato 80 0,2 mg/ml, pH 5.5) para um volume final de 100 μl foi adicionado. Anticorpos da invenção foram testados sozinhos e com MCSF humano. As placas foram incubadas por 24 horas (hrs) em 37°C com 5% de CO2.
[000279] Após 24 horas, 10 μl/cavidade de 0,5 μ^ 3H-timidina
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112/140 (Amershan Biosciences, Piscataway, NJ) foi adicionado e pulsado com as células por 3 hrs. Para detectar a quantidade de timidina incorporada, as células foram colhidas em placas de filtro GF/C unifilter pré- umedecidas (Packard, Meriden, CT) e lavadas 10 vezes com água. As placas foram deixadas secando durante a noite. Lacres de fundo foram adicionados às placas de filtro. A seguir, 45μΙ de Microscint 20 (Packard, Meriden, CT) por cavidade foram adicionados. Após um lacre de superfície foi adicionado, as placas foram contadas em um contador de microbeta Trilux (Wallac, Norton, OH).
[000280] Esses experimentos demonstram que anticorpos anti-MCSF da invenção inibem proliferação de células monocíticas de camundongo em resposta a M-CSF. Adicionalmente, pelo uso de várias concentrações de anticorpos, a IC50 para inibição de proliferação de células monocíticas de camundongo foi determinada para os anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4,
8.10.3, e 9.7.2 (Ensaio de Proliferação Celular, Tabela 3a e Tabela 3b).
Tabela 3a
Anticorpo 252 88 100 3.8.3 2.7.3 1.120.1
Ensaio de Proliferação de Célula 1.86 x 2.31 x 7.44 x 7.3 x 1.96 x 1.99 x
Monocítica de Camundongo de MCSF[IC50, M] 10-10 10-10 10-10 10-11 10-10 10-10
Ensaio de Ativação de Monócito de 8.67x 5.80x 1.53x 8.6x 7.15 x 8.85x
Sangue Total Humano [IC50, M] 10-10 10-10 10-10 10-31 10-10 10-10
Ensaio de Inibição de Ligação de 7.47 x 4.45 x 1.25 x 7.0 x 3.08 x 1.57 x
Receptor [IC50, M] 10-10 10-10 10-4 10-11 10-10 10-10
Tabela 3b
Anticorpo 9.14.41 8.103F 9 7.21F 9.14.4 8.10.3 9.7.2
Ensaio de Proliferação de Célula 2.02x 4.13x 7.37x 2.02x 4.13x 7.37x
Monocítica de Camundongo de MCSF[IC50, M] 10-10 10-10 10-10 10-10 10-10 10-10
Ensaio de Ativação de Monócito 2.49 4.46 1.125 6.48 2.8 x 1.98 x
de Sangue Total Humano [IC50, M] x10-10 x10-10 x10-9 x10-10 10-10 10-10
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Ensaio de Inibição de Ligação de Receptor [IC50, M] 2.97 x 10-10 9.8 x10-11' 5.29 x10-10 4.1 x 10-11 1.5 x 10-9 6 x 10-12
EXEMPLO IV
Ensaio de Ativação de Monócito de Sangue Total Humano [000281] Ensaios in vitro foram conduzidos para medir as alterações da forma de monócitos dependente de M-CSF na presença de anticorpos anti-M-CSF para determinar se os anticorpos anti-M-CSF foram capazes de inibir ativação de monócito de sangue total e seu grau de inibição de alterações de forma de monócito.
[000282] Em cavidades individuais de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades, 6 μΙ de anti-M-CSF 1,7 nM e 94 μΙ de sangue total humano para uma concentração final de 104 pM de anticorpo anti-MCSF foram misturadas. As placas foram incubadas em 37°C em um incubador de cultura de tecido de CO2. A seguir, as placas foram removidas do incubador. Para cada cavidade, 100 μl de uma solução de fixação (formalina 0,5% em solução salina tamponada com fosfato sem MgCl2 ou CaCl2) foi adicionado e as placas foram incubadas por 10 minutos em temperatura ambiente. Para cada amostra, 180 μl de cada cavidade e 1 ml de Tampão de Lise Red Cell foram misturados. Os tubos foram vortexados por 2 segundos. A seguir, as amostras foram incubadas em 37°C por 5 minutos em um banho-maria com agitação para lisar as células vermelhas do sangue, mas deixar os monócitos intactos. Imediatamente após essa incubação, as amostras foram lidas em uma máquina de escanear células ativadas com fluorescência (FACS) (BD Beckman FACS) e o dado foi analisado usando FACS Station Software Versão 3.4.
[000283] Esses experimentos demonstram que anticorpos anti-MCSF da invenção inibem alterações de forma de monócitos quando comparado com amostras controle, usando o ensaio de alteração de forma de monócito, a IC50 foi determinada para os anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1, 9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, e
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9.7.2 (Ativação de Monócito de Sangue Total Humano, Tabela 3a e 3b). EXEMPLO V
Ensaio de Inibição de Ligação ao Receptor c-fms [000284] Ensaios in vitro foram conduzidos para medir a ligação de MCSF ao receptor c-fms na presença de anticorpos anti-M-CSF para determinar se os anticorpos anti-M-CSF foram capazes de inibir ligação de M-CSF ao receptor c-fms e seu grau de inibição.
[000285] Células NIH-3T3 transfectadas com c-fms humano ou células M-NSF-60 mantidas em solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco sem magnésio ou cálcio foram lavadas. Células NIH-3T3 foram removidas das placas de cultura de tecido com 5 mM etilenodiamino-tetraacetato (EDTA), pH. 7.4. As células NIH-3T3 foram retornadas para o incubador de cultura de tecido por 1-2 minutos e os frascos foram tampados para transferidos para desprender as células. As células NIH-3T3 e as células M-NSF-60 foram transferidas para tubos de 50 ml e lavadas duas vezes com tampão de reação (1 x RPMI sem bicarbonato de sódio contendo 50 mM de N-hidroxietilpiperazinaN'-2-ácido etanossulfônico (HEPES), pH 7.4), a seguir as células NIH3T3 foram ressuspensas em um tampão de ligação para uma concentração final de 1,5 x 105 células/ml. As células M-NSF-60 foram ressuspensas em um tampão e reação para uma concentração final de
2,5 x 106 células/ml.
[000286] Para o ensaio, 9 μΙ de uma solução de sacarose 0,4 M estéril, 100 μl de 125I-M-CSF (Amershan, IMQ7228v) em uma concentração final de 200 pM em RPMI-1640 contendo HEPES 50mM (pH 7.4), albumina de soro bovino 0,2%, e 100 μl de M-CSF nãomarcado em uma concentração final de 200 nM foram misturados em um tubo de ligação. A seguir, 50 μ^^^ de concentrações crescentes de um anticorpo teste foi adicionado. A fim de determinar ligação não específica dos anticorpos, foram incluídas amostras às quais foram
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115/140 também adicionados M-CSF 200 nM. Para os tubos controle, não foi adicionado anticorpo. A seguir, 15.000 células NIH-3T3 ou 250.000 células M-NFS-60 forma adicionadas por tubo. Todos os tubos foram incubados em temperatura ambiente por 3 hrs e submetidos a centrifugação a 10.000 rpm por 2 min. As pontas dos tubos contendo o precipitado de células foram cortadas e a quantidade de M-CSF ligada às células foi determinada usando um contados Packard Cobra II Gamma. A ligação específica foi determinada pela subtração da ligação não-específica da ligação total. Todos os ensaios foram realizados em duplicata. O dado de ligação foi analizado usando o programa de computador, Graph Pad Prism 2.01.
[000287] Esses experimentos demonstram que anticorpos anti-MCSF da invenção inibem a ligação de M-CSF ao receptor c-fms quando comparado a amostras controle. Adicionalmente, pelo uso de várias concentrações de anticorpos, a IC50 para inibição de ligação ao receptor foi determinada para os anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3, 1.120.1,
9.14.4I, 8.10.3F, 9.7.2IF, 9.14.4, 8.10.3, e 9.7.2 (Ensaio de Inibição de Ligação ao Receptor, Tabela 3a e Tabela 3b).
EXEMPLO VI
Determinação de Constantes de Afinidade (Kd) de Anticorpos Monoclonais Anti-M-CSF por BIACORE™ [000288] Medições de afinidade de anticorpos purificados foram realizadas por ressonância de plásmon de superfície usando o instrumento BIACORETM 3000, seguindo os protocolos do fabricante. [000289] Para anticorpos 3.8.3, 2.7.3 e 1.120.1, os experimentos foram realizados em um instrumento BIACORETM 3000 a 25°C em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo Tween20 0,0005%. Concentrações de proteína foram obtidas de experimentos de velocidade de sedimentação ou pela medição do comprimento de onda da amostra a 280 nm usando os coeficientes
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116/140 de extinção teóricos derivados de seqüências de aminoácidos. Para experimentos medindo a ligação de anticorpo a antígenos imobilizados, M-CSF foi imobilizada em um chipe B1 por procedimentos padrão de acoplamento direto de amina. Amostras de anticorpos foram preparadas em 0,69μΜ para 3.8.3, 2.7.3 e 1.120.1. Essas amostras foram diluídas serialmente 3 vezes para 8,5 nM ou 2,8 nM para aproximadamente uma variação de 100 vezes em concentrações. Para cada concentração, as amostras foram injetadas em duplicata em fluxo de 5 μΙ/min por 4 min. A dissociação foi monitorada por 2000 segundos. O dado foi globalmente ajustado a um simples modelo de ligação 1:1 usando o programa BIACORETM Biaevaluation. Em todos os casos, esse método foi usado para obter koff e foi encontrado que este conjunto de dados comparou bem com dados obtidos de ajuste global de dado de associação e dissociação. [000290] Para anticorpos 252, 88 e 100, os experimentos foram realizados em um instrumento BIACORE™ 3000 a 25°C em Tampão HBS-EP (HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, Surfactante P20 0.005%). Para experimentos medindo a ligação de anticorpo a antígenos imobilizados, um M-CSF foi imobilizada em um chipe CM5 Research Grade Sensor por procedimentos padrão de acoplamento direto de amina. Amostras de anticorpos foram preparadas em 12,5nM para anticorpos 252 e 100 e a 25,0 nM para anticorpo 88. Essas amostras foram diluídas serialmente 2 vezes para 0,78 nM para aproximadamente uma variação de 15 - 30 vezes em concentrações. Para cada concentração, as amostras foram injetadas em duplicata em ordem randômica em um fluxo de 30 μ^π por 3 min. A dissociação foi monitorada por 300 seg. O dado foi globalmente ajustado a um simples modelo de ligação 1:1 usando o programa BIACORETM Biaevaluation. Em todos os casos, esse método foi usado para obter koff e foi encontrado que este conjunto de dados comparou bem com dados
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117/140 obtidos de ajuste global de dado de associação e dissociação. [000291] Tabela 4 mostra resultados para anticorpos 252, 88, 100, 3.8.3, 2.7.3 e 1.120.1.
Tabela 4
252 88 100 3.8.3 2.7.3 1.120.1
Kd (M) 1,33 x 10-11 1,33 x 10-9 2,0 x 10-11 4,0x10-10 4,7x10-9 5,4x10-9
Koff (I/s) 1,03X10-6 7,3X10-5 1,7X10-5
EXEMPLO VII
Produção de anticorpos 8.10.3 a partir de células de hibridoma 8.10.3 [000292] Anticorpo 8.10.3 foi produzido em rotor de pulverização. O frasco sparged rotor de 3L é um recipiente de vidro onde culturas são misturadas com um impulsor controlado por uma plataforma magnética. O rotor é conectado a linhas de gás para fornecer 5% de CO2 e ar. Células de hibridoma 8.10.3 foram inicialmente descongeladas em frasco de cultura de células T-25. As células foram progressivamente expandidas até que houve um número suficiente de células para semear os rotor de pulverização.
[000293] Os dois frascos rotor de pulverização de 3L foram semeados com células hibridoma 8.10.3 em Meio de Hibridoma Livre de Soro com as adições observadas na Tabela 5, para os dois frascos sparged. As concentrações para soro de IgG Ultra baixo (Gibco cat# 16250-078), Lglutamina (JRH Biosciences cat# 59202-500M), Aminoácidos NãoEssenciais (Gibco cat# 11140-050), Peptona (Difco cat# 211693), glicose (estoque interno preparado por JT Baker cat# 211693), e antiespumante C (Sigma cat# A-8011) são dados nas suas concentrações finais no meio. O balanço do volume em cada reator é Meio De Hibridoma Livre de Soro.
Tabela 5. Condições para Crescer Hibridoma 8.10.3 em dois rotor de pulverização.
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Condições Rotor 1 Rotor 2
Densidade de semeadura 0,16 ml 0,16 ml
Meio de Hibridoma Livre de Soro (Gibco cat# 12045076) Balanço Balanço
Soro de IgG ultra baixo (Gibco cat# 16250-078) 5% 5%
L-glutamina (JRH Biosciences cat# 59202-500M) 8 mmol/L 8 mmol/L
Aminoácidos Não-Essenciais (Gibco cat# 11140050) 1% 1%
Peptona (Difco cat# 211693) 1 g/l 1 g/l
Glicose 2M (estoque interno preparado por JT Baker cat# 211693) 8 g/l 8 g/l
Anti-espumante C (Sigma cat# A-8011) 1 ml/L 1 ml/L
[000294] As culturas foram crescidas por 15 dias e foram colhidas quando a viabilidade estava abaixo de 20%. Viabilidade foi determinada pelo método de exclusão por azul de tripan com um contador de células automático (Cedex, Innovatis). Coleta foi realizada por centrifugação e subseqüente filtração. Sobrenadante transparente foi obtido após centrifugação por 15 minutos a 7000 rpm e subseqüente filtração com um filtro Opticap Millipore (cat# KVSCO4HB3) estéril de 0,22 pm 4'' em um saco TC-Tech (cat # P/N 12420 Bag Style CC-10-112420) estéril de 10L. O filtrado foi então purificado no seguinte exemplo.
EXEMPLO VIII
Purificação de um Anticorpo Anti-M-CSF [000295] Uma coluna de proteína A (Amersham Pharmacia) foi preparada pela lavagem com 3 volumes de coluna de Urea 8M, seguido por uma lavagem de equilíbrio com Tris 20mM (pH 8). O filtrado final do Exemplo VII foi bloqueado com 2% v/v de Tris 1M pH 8.3 e NaNs 0,02%, antes de ser colocado da coluna de Proteína A por um modo de gotejamento por gravidade. Após o enchimento estar completo, a resina foi lavada com 5 volumes e coluna de Tris 20mM (pH 8), seguido por 5 volumes de coluna de tampão de eluição (Glicina 0,1 M pH 3). Qualquer precipitação foi observada, e então uma ponta 10% v/v de Tris 1M pH
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8.3 foi adicionada ao anticorpo eluído. A proteína eluída foi então dializada em 100 vezes a quantidade de volume do material eluido de tampão de diálise (Acetato de Sódio 140 mM NaCl / 20 mM pH 5.5). Seguindo diálise, o anticorpo foi filtrado esterilmente com um filtro de 0,22 pm e armazenado até uso posterior.
EXEMPLO IX
Tratamento de Macacos e Contagens de Monócitos [000296] Um macaco cinomólogo macho e uma fêmea por grupo de dosagem foram administrados intravenosamente veículo ou anticorpo
8.10.3 (produzido como descrito nos exemplos VII e VIII) a 0, 0,1, 1, ou 5 mg/kg em um volume de dose de 3,79 mL/kg durante um período de aproximadamente 5 minutos. Amostras de sangue para análise laboratorial clínica foram coletadas em 24 e 72 horas pós-dosagem e semanalmente por 3 semanas. As contagens de monócitos foram determinadas por dispersão da luz usando um sistema Abbott Diagnostics Inc. Cell Dyn. (Abbott park, Illinois).
[000297] Uma diminuição relacionada com a dose (~25% a 85%) nos monócitos totais em todas as doses (Figura 1A e 1B) foi observada. Contagens de monócitos em 0,1 e 1 mg/kg pareceu reproduzir níveis próximos aos de controle na semana 2, enquanto contagens de monócitos em 5 mg/kg estavam ainda decrescendo em 3 semanas. Análise do subconjunto de monócitos CD14+CD16+ [000298] Sangue total de primata foi retirado em tubos Vacutainer contendo heparina de sódio. 0,2 ml de cada amostra de sangue foi adicionada a um tubo de centrifuga de polipropileno cônico de 15 ml contendo 10 ml de tampão de lise de células vermelhas (Sigma), e incubado em um banho-maria de 37°C por 15 minutos. Os tubos foram então centrifugados em uma centrífuga Sorvall RT7 por 5 minutos a 1200 rpm. O sobrenadante foi aspirado, o precipitado foi ressuspenso em 10 ml de tampão de FACS 4°C (Solução de Sal Balanceada de
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Hanks / FBS 2% / azida de sódio 0,02%), e o tubo centrifugado novamente por 5 minutos a 1200 rpm. O sobrenadante foi aspirado e o precipitado ressuspenso em uma mistura de anticorpo consistindo em 80 μΙ de tampão de FACS 4°C, 10 μΙ de anticorpo monoclonal anti-CD14 humano conjugado a FITC (BD Biosciences, San Diego, CA), 0,5 μl de anticorpo monoclonal anti-CD16 humano conjugado a Cy5-PE (BD Biosciences, San Diego, CA), e 10 μl de anticorpo monoclonal antiCD89 humano conjugado a PE (BD Biosciences, San Diego, CA). A suspensão celular foi incubada sobre gelo por 20 minutos, após os quais 10 ml de tampão de FACS 4°C foram adicionados e as células centrifugadas como antes. O sobrenadante foi aspirado, e o precipitado celular ressupenso em 400 μl de tampão de FACS e as células analisadas em um citômetro de fluxo FACSCaliber (BD Biosciences, San Diego, CA). Dados para 30.000 células foram coletados de cada amostra.
[000299] A população de monócitos foi identificada por uma combinação de dispersão de luz de ângulo anterior e dispersão de luz ortogonal. Células dentro da seleção de monócitos foram adicionalmente analisadas para expressão de CD14 e CD16. Duas populações distintas de monócitos foram observadas, uma expressando altos níveis de CD24 com pouca ou nenhuma expressão de CD16 (CD14++CD16-) e a outra expressando baixos níveis de CD14, mas altos níveis de CD16 (CD14+CD16-), da mesma forma que os dois subconjuntos de monócitos previamente descritos em sangue periférico humano (Ziegler-Heitbrock H.W., Immunology Today 17:424-428 (1996)). Para cada primata testado, a porcentagem de monócitos dentro de subconjunto CD14+CD16+ foi determinada após cada retirada de sangue, nos dias 1,3, 7, 14 e 21 após a injeção de 8.10.3.
[000300] Em geral, tratamento com 8.10.3 resultou em uma redução na porcentagem de monócitos CD14+CD16- (veja figuras 2A e 2B).
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Macacos que não receberam Anticorpo 8.10.3 demonstraram níveis de monócitos CD14+CD16+ relativamente estáveis. Monócitos CD14+CD16+ foram chamados pró-inflamatórios porque eles produzem altos níveis de TNF-α e outras citocinas inflamatórias (Frankenberger, M.T. et al., Blood 87:373-377 (1996)). Também foi publicado que diferenciação de monócitos do fenótipo CD14++CD16convencional para o fenótipo pró-inflamatório é dependente de M-CSF (Saleh M.N., et al., Blood 85:2910-2917 (1995)).
EXEMPLO X
Tratamento de Macacos e Contagens de Monócitos [000301] Três macacos cinomólogos por grupo de dosagem foram administrados intravenosamente veículo (acetato de Sódio 20 mM, pH 5.5, NaCl 140 mM), anticorpo purificado 8.10.3F, ou anticorpo purificado 9.14.4I a 0, 1, ou 5 mg/kg em um volume de dose de 3,79 mL/kg durante um período de aproximadamente 5 minutos. Os macacos eram de 4 a 9 anos de idade de pesavam 6 a 10 kg. Amostras de sangue para análise laboratorial clínica foram coletadas nos dias 2, 4, 8, 15, 23 e 29.
Contagens monócitos foram determinadas por dispersão de luz usando um sistema Abbott Diagnostics Inc. Cell Dyn (Abbott Park, Illinois).
[000302] Uma diminuição na alteração da porcentagem nos monócitos totais em todas as doses de anticorpo 8.10.3F e anticorpo 9.14.4I quando comparado com níveis pré-teste de monócitos (Figuras 3A e 3B) foi observada (veja por exemplo, dia 4, 8, 15 e 23 nas Figuras 3A e 3B). [000303] Todas as publicações e pedidos de patente citados nesse relatório descritivo estão aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse especificamente e individualmente indicado de estar incorporado por referência. Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe como meio de ilustração e exemplos para fins de clareza de entendimento, será prontamente claro aqueles versados na técnica à luz dos ensinamentos
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122/140 dessa invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas nela sem se desviar do espírito ou escopo das reivindicações anexas.
Listagem de Seqüências
Código:
Peptídeo de sinal: letra minúscula sublinhada
CDRs 1,2, 3: LETRA MAIÚSCULA sublinhada
Domínio Variável: LETRA MAIÚSCULA
Domínio constante: letra minúscula
Mutações da linhagem germinativa em negrito
SEQ ID NO: 1
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 252 atggagttggggctgtgctggattttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtCAGGT GC AGCT GGT G GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCC GCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTTCATACATTAGTGGTA GTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCAT CTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATCACTGTGCGAGAGCCCTGGGTGG GATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTtcca ccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctg gtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttccc agctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagac ctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagt gcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatga tctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtac gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtca gcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctccca gcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatccc gggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtgga gtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcc tctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggct ctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 2
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 252
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123/140 melglcwiflvaiikgvqcQVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIR QAPGKGLEWISYISGSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE DTAVYHCARALGGMDVWGOGTTVTVSSAstkgpsvfolapcsrstsestaalaclvkdvfp epvtvswnsgaltsgvhtfyavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcp appvagpsvflfypkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevqfewyvdgvevhnaktkpreeqfhstfrwsv Itwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisldkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 3
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 252 atgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATCCAGAT
GACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCGGCTTTTTAAATTGGTATC AGC AG A A ACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCA GTTTGCAAAGTGGGGTCCCATTCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGA CAGATTTCACTCTCACCATCÀGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAC TTATTACTGTCAACAGAGTTACAGTGTCCCATTCACTTTCGGCCCTGGG ACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagc agttgaaatctggaactgctagcgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggt ggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcc tgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 4
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 252 mrvpaqngllllwIrgarcDIOMTQSPSSLSASVGDRVTrrCRASQSlSGFLNWYOOK PGKAPkLLTYATSSLQSGXTFRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQS YSVPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcIlimfypreakvqwkvdnalqsflns qesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 5
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 88
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 129/156
124/140 atggaatttgggctgtgctgggttttccttgttgclattttagaaggtgtccaKtgtGAGGTGCAGCTGGTG GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCC GCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCÃACATAAAGCAA GATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGAÇTCTGTGAAGGGCCGATTCACC ATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGC CTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTCCGGGTATAGCA GCAGCTGGTAGGGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC TCAGCTtccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggc cctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagc.ggcg tgcacaccttcccagcígtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccglgccctccagcaacttc ggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaat gttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaagg acaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaágaccccgaggtcca gttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacg ttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaac aaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacc ctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcg acatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccg acggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccg tgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 6
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 88 mefglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWV
RÕAPGKGLEWVANIKODGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSTALOMNSf.
RAEDTAVY YCAPGIAAAGRAV WGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgcl vkdyípepvtvswiisgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccv ecppcpappvagpsvflfppkpkdtlnüsrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfns tfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreenitknqvsllclvkgíyp sdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksnvqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 7
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 88 atgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATC CA G AT GACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACC ATCACTTGCCGGCCAAGTCAGGACATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATC AGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTÃAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCA GTTTGCAAAGTGGGGTCCCATTAAGGTTCAGTGGCAGI’GGATCTGGGA CAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAC TTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGG ACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagc agttgaaatctggaactgctagcgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggt ggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaaglcacccatcagggcc tgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 8
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 88
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 130/156
125/140 mrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRPSODISSYLNWYOOK PGKAPKLLIYAASSLQSGVPLRFSGSGSGTDFTT.TTSST,QPEDFATYYCOOS YSTPFTFGPGTKYPIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgns qesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfiirgec
SEQ ID NO: 9
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 100 atggagtttgggctccgctggatttttcttgtggctattttaaaaggtgtccagtgtGAGGTGCAGCTGTTG GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCC GCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGÃÃTGGGTCTCÃGCTÃTTAGTGGTC GTGGTGGTAGGACATACTTCGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCA TCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGGTAGAAGGCTATA GTGGGCGCTACGGATTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTAGTCAC CGTCTCCTCAGCCtccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgag agcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctct gaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccçtcagcagcgtggtgaccgtgcc ctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaca gttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaaga ccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagca gttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtg caaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaacc acaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctccca tgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 10
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 100 mefglrwiflvai IkgvqcE V OLLES GGGL V QPGGSLRLS C AAS GFTFS S Y AMS WVR QAPGKGLEWVSAISGRGGRTYFADS VKGRFTLSRDNSKNTT ,YT .QMNST ,R A EDTAVYFCAVEGYSGRYGFFDYWGOGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaai gclvkdyijoepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntlcvdktverkc cvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqf nstfrvvsvltwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreerntknqvsltclvkgf ypsdiavewesngqpennykttppnildsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg k
SEQ ID NO: 11
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 100
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 131/156
126/140 atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggaGAAATAGTGATG
ACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC
CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACC AGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAC CAGGGCCAGTGGTATCCCAGACAGGATCAGTGGCAGTGGGTCTGGAAC AGAGTTCACTCTCATCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTT TATTACTGTCAGCAGTCTAATAACTGGCCATTCACTTTCGGCCCTGGGA CCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagca gttgaaatctggaactgctagcgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtg gataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctca gcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcct gagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 12
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia gamma] de 100 meapaqllfllllwlpdttgEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASOSVSSNLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASTRASGIPDRISGSGSGTEFTLIISSLQSEDFAVYYCQOS NNWPETFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgn . sqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
SEQ ID NO: 14
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 3.8.3 mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
RQAPGKGLEWFSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLSLOMNST® A EDTAVYYCARGLTGDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfyavlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpa ppvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfiistfrvvsvlt whqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavew esngqpeimykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 16
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 3.8.3 mdmrvpaqllgllllwipgsrcDIQMTQSPSSVSASVGDRVTISCRASODISGWLAWY OQKPGKAPKLLISATSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQTNSFPFTF GP GTK VDIKRtvaaps vfi fpp sdeq Iksgtas wcllnnfypreakvq wkvdnalq sgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyelchlcvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 18
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 2.7.3
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 132/156
127/140 mefglswvflvallrgcqcOVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWV
IKQAPGKGT.EWVAFIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL
RAEDTAVYYCARGYRVYFDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgcl vkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkn^eskygp pcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqfos tyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiekiiskakgqprepq\^ytlppsqeemtknqvsltclvkgfy psdiavewesngqpeimykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 20
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 2.7.3 mdim\/paqllgllllwfpgsrcDIOMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWY
QRKPGKAPKLQIYAASSLESGVPSRFNGSGSGTDFTLSISSLQPEDFATYYC QQTNSFPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcUimfypreakvqwkvdnal qsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhlcvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 22
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 1.120.1 mewtwsflflvaaatgahsOVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWV kqapgqgt.ewmgwisayngntnyaqklqdrvtmttdtstttaymelrs
ILRSDDTAVYY CARRAY GANFFD Y W GQGTLVTVSS Astkgpsvfplapcsrstsestaa Igclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverk ccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevqfhwyvdgvevlmaktkpree qfiistfrvvsvltwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvk gfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls pgk
SEQ ID NO: 24
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 1.120.3 mvlqtqvfislllwisgavgDIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSILFFSNNKNYL AWYRQKPGQPPNLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCOQYYSSPWTFGQGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksRtasvvcllimfypreakvq wkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 25
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4I
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 133/156
128/140 atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtC C AGT GT C AGGT GC AGCTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTATATGAGCTGGA TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTA GTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCA CCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACA GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGÇCTAA CTGGGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTtcc accaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcc cagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccaga cctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgag tgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatg atctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtc agcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctccc agcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc cgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtgg agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 26
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4I iTKTTswvIlvniikuvqcQVQi/VESGGGI Ad<l‘GGSlAC,SCAAS< rtn i 'SUY YMSWI RQAPGKGLEWVSYISSSGSllYYADSVKGRFnSimNAKNSLYLQMNSLRA BDTAVYYCARGLTGDYWGOGTLVTVSSAstkgpsvrplapcsiBtscstaalgdvkdyfpc pvtvswnsgaltsgvlitipavlqssglyslssvvtvpssn.fgtqtyt.cnvdhkpsiitkvdktverkccvecppcpii ppvagpsvfl íppkpktI tlmisrtp evtcw vd vshedpevq In wyvdgvcvímakI kprceq fn st ft v vs vlt whqdwlngkeykckvsnlcgipapiektisktkgqprepqvytlppsi-eemtkiiqvsltclvkgfypsdiavew esiigqpennykttppinldsdgsfflyskllvdksrvvqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 27
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.14.4,
9.14.4I, 9.14.4-Ser e 9.14.4-G1 atggacatgagggtccccgctcagctcctgfiggctectgctactctggctccgaggtgccagatgTCf AC ATCC
AGÁTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGCCAAGTCAGATCATTAGCAGTTTATTAAATTGG TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAÃGCTCCTGATCCÃTGCIOÇA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGÃCAGATTTCÃCTCTCACCATCAGTAGTCTGCAACCTGAAGAITrTGC AACTTACTACTGTCAACAGAGTrACAGTACCCCA'ITCACrrrCGGCCCT GGGACCAAAGTGGATATC A A ACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctga tgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataa.cttctateccagagaggccaaagtacagtgga aggtggalaacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctaca gcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatea gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 28
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.14.4,
9.14.4I, 9.14.4-Ser e 9.14.4-G1.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 134/156
129/140 mdmrvpaqngnilwlrgarcDIOMTOSPSSLSASVGDRVTlTCRPSQIISSJLLNWYO
QKPGKAPKLLIHAASSDQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCn
QSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqiksgtasvvclIrmfypreakvqwkvdnalqs gnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
SEQ ID NO: 37
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4.
atKgagttt.gggctgagctgggttttcctt.gttgctattataaaaggtgtCCAGTGTCAGGTGCAGCTG
GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTATATGAGCTGGA TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATÃCATTAGTA GTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCA ICCATCTCCAGGGÃCAACGCCÁAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACA GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCTAA CTGGGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTtcc accaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctclgaccagcggcgtgcacaccttcc cagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaga cctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtccccca tgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctca tgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactgg tacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtgg tcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctc ccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccat cccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgt ggagtgggagagcaalgggcagccggagaacaaciacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc ttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcltctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 38
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4.
mefglswvflvaiikgvqcOVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCARGLTGDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpa peflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqihwyvdgvevhnaktkpreeqfhstyrvvsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtkiiqvsltclvkgiypsdiavc wesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 54
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4CSer.
mefglswvflvaiikgvqcOVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI ROAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRA EDTAVYYCARGLTGDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdlilcpsntkvdkiYeskygppcppcpa peflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpen.nykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 56
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 135/156
130/140
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.14.4C-Ser,
9.14.4-CG2 e 9.14.4-CG4.
mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRPSQIISSLLNWYO QKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ OS YSTPFTF GPGTKVDLKRtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvq wkvdnalq s gnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyeldikvyacevthqglsspvtksfnrgec
SEQ ID NO: 74
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4CG2.
mefglswvflvaiikgvqcQVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRA
EDTAVYYCARGLTGDYWGOGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgcIvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpa ppvagpsvfl^pkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqfhstfrwsvlt whqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavew esngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmliealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 78
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4CG4.
mefglswvflvaiikgvqcOVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCARGLTGDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvíplapcsrstsestaalgclvkdyípe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpa peflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqfhstyrvvsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmliealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 82
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4Ser.
mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI ROAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRA EDTAVYYCARGLTGDYWGOGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpe pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdlcrveskygppcppcpa peflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfirwyvdgvevhnaktkpreeqfhstyrvvsvl tvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvnüieallmhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 101
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 136/156
131/140
9.14.4G1.
atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtCAGGT GC AGCT GGTG GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTATATGAGCTGGATCC GCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTA GTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCAT CTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCTAACTGG GGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTtccaccaag ggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaa ggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctg tcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacat ctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcaca catgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaa ctggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccg tgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaag ccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcc cccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggct ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgc atgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag
SEQ ID NO: 102
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.14.4G1.
mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
IRQAPGKGLE WVS YISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKM SLYLQMNSLRA EDTAVYYCARGLTGDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfb epvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvdikpsntkvdkkvepkscdkthtcpp cpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfhwyvdgvevlmaktkpreeqynstyrv vsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdia vewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmliealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 29
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia Gamma] de 8.10.3 e 8.10.3F.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 137/156
132/140 atggagttggggctgtgctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgtGAGGT GC AGCT GG'IG GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGC A GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTTTAGTATGACCTGGGTCC gccaggctccaggaaaggggctggagtgggtttcatacattagtagta GAAGTAGTACCATATCCTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCA TCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCC TG A GAGA CG A GG A C A CGGCTGTGT ATTACTGTGCGAGAGATCCTCTTCI AGCGGGAGCTACCTTCTTI jACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC CGTCTCCTCAGCCtccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgag agcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctct gaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgcc ctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagalcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaca gttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccc caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaaga ccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagca gttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtg caaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaacc acaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctccca tgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 30
Seqüência de proteína de Cadeia Pesada [cadeia Gamma] de 8.10.3 e
8.10.3F.
melglcwvflvailegvqcEVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMTWV RQAPGKGLEWVSYISSRSSTISYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRD EDTAVYY CARDPLLAGATFFDYW GQGTLVTV S S Astkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdy^epvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcc vecppcpappvagpsvfl^pkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqfh stfiwsvltwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfy psdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 31
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 8.10.3FG1 e 8.10.3F.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 138/156
133/140 atggaaaccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggaGAATTT GT GTT G
ACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTÇTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGTTACTTAGCCTGGTA CC A GC A GA A A CCTGGCC AGGCTCCC AGGCTCCTC ATCTATGGTGC ATCC AGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGG ACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAG TGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACTTTCGGCGGAGG GACCAAGGTGGAGATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatga gcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcc tcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcaggg cctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 32
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 8.10.3FG1 e
8.10.3F.
metpaqllfllllwlpdttgEFVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYOO KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCOO YGSSPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllrmfypreakvqwkvdnalqsg nsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 43
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 8.10.3 e
8.10.3-Ser.
atggaaaccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggaGA ATTT GT GTT G ACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGTTACTTAGCCTGGTA CC A GC A GA A A CCTGGCC AGGCTCCC AGGCTCCTC ATCTATGGTGC ATCC AGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGG ACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGTAG TGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACTTTCGGCGGAGG GACCAAGGTGGAGATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatga gcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaag gtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcc tcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcaggg cctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 44
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 8.10.3 e
8.10.3-Ser.
metpaqllfllllwlpdttgEFVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYOO KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFVVYYCQQ YGSSPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsg nsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 139/156
134/140
SEQ ID NO: 58
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 8.10.3Ser.
melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMTWV
RQAPGKGLEWVSYISSRSSTISYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRD
EDTAVYYCARDPLLAGATFFDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskyg ppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqf nstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgf ypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 60
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 8.10.3CG2,
8.10.3-CG4, e 8.10.3C-Ser.
metpaqllfllllwlndttgEIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASOSVSSSYLAWYOO KPGOAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YGSSPLTFGGGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfvpreakvqwkvdnalqsg nsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
SEQ ID NO: 62
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 8.10.3CG2.
melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMTWV ROAPGKGLEWVSYISSRSSTISYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRD EDTAVYYCARDPLLAGATFFDYWGOGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdlil<psntkvdktverkcc vecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvA^dvshedpevqfiiwyvdgvevhnaktkpreeqfh stfrwsvltwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreenitlcnqvsltclvkgfy psdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvnihealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 90
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 8.10.3Ser.
melglcwvflvailegvqcEVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMTWV ROAPGKGLEWVSYISSRSSTISYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRD EDTAVYYCARDPLLAGATFFDYWGQGTLVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfyepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskyg ppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqf nstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtlaiqvsltclvkgf ypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 94
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 140/156
135/140
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 8.10.3CG4.
melglcwvflvaile.gvqcEVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMTWV RQAPGKGLEWVSYISSRSSTISYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRD EDTAVYYCARDPLLAGATFFDYWGOGTLVTVSSAstkgpsvfolaDCsrstsestaalg dvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfyavlqssglyslsswtvpssslgtktytcnvdlikpsntkvdkrveskyg ppcpscpapeflggpsvfl^pkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpevqfiiwyvdgvevlmaktkpreeqf nstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgf ypsdiavewesngqpemykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmheallinhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 97
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada de 8.10.3FG1.
atggagttggggctgagctgggttttçcttgttgctattataaaaggtgtecagtgtGAGGT GC AGCT GGT G
GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTTTAGTATGACCTGGGTCC GCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTA GAAGTAGTACCATATCCTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCA TCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCTCTTCT AGCGGGAGCTACCTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC CGTCTCCTCAGCCtccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccc tgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgc cctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaa agttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagt cttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgc gggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaa ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcc tggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagac cacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagca ggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccg ggtaaatag
SEQ ID NO: 98
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada (cadeia gamma) de
8.10.3FG1.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 141/156
136/140 melglcwvflvailegvqcEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMTWV RQAPGKGLEWVSYISS.RSSTISYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRD EDTAVYYCARDPLLAGATFFDYWGQGTLi^TVSSAstkgpsvfplapsskstsggtaal gclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepk scdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmísrtpevtcvvvdvshedpevkfiiwyvdgvevhnaktkpr eeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclv kgf)psdiavewesngqpennykttppvldsdgsfílyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls Pgk
SEQ ID NO: 33
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de
9.7.2IF.
atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtcAGGT GC AGCTGGT G GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCC GCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTA GTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCAT CTCCAGGGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCGTATAGGAGG TATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTtcca ccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctg gtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttccc agctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagac ctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagt gcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatga tctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtac gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtca gcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctccca gcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatccc gggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtgga gtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcc tctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggct ctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 34
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2IF. mefglswvflvaiikgvqcOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCARRIGGMDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyf pepvtvswnsgaltsgvht^avlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhlcpsntkvdlrtverkccvecppc pappvagpsvflfpplqjkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrws vltwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiav ewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 35
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 142/156
137/140
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.7.2.IF.
atggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATCC
AGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCGGCTTTTTAATTTGG TATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGÇTACA TCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGC AACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCT GGGACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctga tgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgga aggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctaca gcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 36
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.7.2IF.
mdmrvpaqllginiwlrgarcDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGFLIWYQ QRPGWKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QSYSTPFTFGPGTKVDIKRívaapsvfiippsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqs gnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 45
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 143/156
138/140 atggagtttgggctgagctgggttttccttgttgctattataaaaggtgtccagtgtc AGGT GC AGCT GGT G GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC tgtgcagcctctggattcaccttcagtgactactacatgagctggatcc GCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTA gtggtagtaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccai CTCCÃGGGACAACGCCAAGAATTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCGTATAGGAGG TATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTtcca ccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctctagaagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctg gtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttccc agctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagac ctacacctgcaacgtagatcaçaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccat gcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcat gatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggt acgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggt cagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctc ccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccat cccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgt ggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc ttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgag gctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO: 46
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2.
mefglswvflvaiikgvqcQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
Irqapgkgtrwvsyisssgstjyyadsvkgrftisrdnaknslylomnslra EDTAVWCARRIGGMDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyf pepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglysIssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdlCTveskygppcpsc papeflggpsvflippkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrw svltvlhqdwlngkeykclcvsnlcglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtloiqvsltclvkgfypsdia vewesngqpeimykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 47
Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.7.2 e
9.7.2-Ser.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 144/156
139/140 atggacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtGACATCC
AGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT C A CC A TC ACTTGCCGGGC AAGTC AGAGC ATTAGCGGCTTTTTAATTTGG TATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTACA TCCAGTTTACAAAGTGGGGTCCCATTAAGGTTCAGTGGCAGTGAATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGC aagttactactgtcaacagagttacagtaccccattcactttcggccct
GGGACCAAAGTGGATATCAAACGAactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctga tgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgga aggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctaca gcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
SEQ ID NO: 48
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.7.2 e 9.7.2Ser.
mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGFLIWYO
ORPGKAPKLLIYATSSLOSGVPLRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QSYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllimfypreakvqwkvdnalqs gnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 50
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2CSer.
mefglswvflvaiikgvqcOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCAIRIGGMDVWGQGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfp epvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcp apeflggpsvflfpplqikdtlmisrtpevtcwvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfhstyrvvs vltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiav ewesngqpennykttppvldsdgsfflysritvdksrwqegnvfscsvmhealhiihytqkslslspgk
SEQ ID NO: 52
Seqüência de proteína da Cadeia Leve [cadeia kappa] de 9.7.2C-Ser,
9.7.2-CG2 e 9.7.2-CG4.
mdmrvpaqllgllllwlrgarcDIOMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGFLIWYO QKPGKAPKI.LIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC2 ^SYSTPFTFGPGTKVDIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwk\^dnalqs gnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec
SEQ ID NO: 66
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2CG2.
Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 145/156
140/140 mefglswvflvaiikgvqcOVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRA
EDTAVYYCAIRIGGMDVWGOGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfp epvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcp appvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsv Itwhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 70
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2CG4.
mefglswvflvaiikgvqcOVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCARIGGMDVWGOGTTVTVSSAstkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfp epvtvswnsgaltsgvhtipavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscp apeflggpsvflQ)pkpkdtlmisitpevtcvwdvsqedpevqfhwyvdgvevhnaktkpreeqihstyrws vltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiav ewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 86
Seqüência de proteína da Cadeia Pesada [cadeia gamma] de 9.7.2-Ser.
mefglswvflvaiikgvqcQVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI RQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRA EDTAVYYCARRIGGMDVWGOGTTVTVSSAstk.gpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyf pepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppc papeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfiistyrvv svltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdia vewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a M-CSF, em que a cadeia pesada do anticorpo compreende as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 encontradas no domínio variável de uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 30 e a cadeia leve do anticorpo compreende as sequências de aminoácidos das CDR1, CDR2 e CDR3 encontradas no domínio variável de uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 32.
  2. 2. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos de qualquer um ou mais dos FR1, FR2, FR3 e FR4 encontrados no domínio variável de uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 30 e a cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos de qualquer um ou mais dos FR1, FR2, FR3 e FR4 encontrados no domínio variável de uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 32.
  3. 3. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos desde o início da CDR1 até o final da CDR3 encontrada no domínio variável de uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 30 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos desde o início da CDR1 até o final da CDR3 encontrada no domínio variável de uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 32.
  4. 4. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos do domínio variável de uma cadeia pesada
    Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 147/156
    2/4 compreendendo SEQ ID NO: 30 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos do domínio variavel de uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 32.
  5. 5. Anticorpo monoclonal humano, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo é SEQ ID NO: 30 sem os dezenove resíduos de aminoácido da sequência sinal (resíduos 1-19 da SEQ ID NO: 30) e a sequência de aminoácido de cadeia leve do anticorpo é SEQ ID NO: 32 sem os vinte resíduos de aminoácidos da sequência sinal (resíduos 1-20 da SEQ ID NO: 32).
  6. 6. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dentre o grupo que consiste em: um IgG, um IgM, um IgE, um IgA e um IgD.
  7. 7. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao antígeno é seleccionada dentre o grupo que consiste em: um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 e um fragmento Fv.
  8. 8. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo ou porção não está presente.
  9. 9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  10. 10. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica ambas a cadeia pesada e a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno das mesmas de um anticorpo monoclonal humano como
    Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 148/156
    3/4 definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
  11. 11. Primeira molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada, ou uma porção de ligação ao antígeno da mesma, de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-8; e uma segunda molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a cadeia leve, ou uma porção de ligação ao antígeno da mesma, de um anticorpo monoclonal humano como definido em qualquer uma das reivindicações 1-8.
  12. 12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 10, em que o vetor opcionalmente compreende uma sequência de controle de expressão operavelmente ligada à dita molécula de ácido nucléico.
  13. 13. Método para preparar um anticorpo anti-M-CSF ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sob condições adequadas, e recuperar o dito anticorpo ou porções de ligação ao antígeno.
  14. 14. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma condição selecionada dentre o grupo que consiste em artrite, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, gota, artrite traumática, artrite rubéola e sinovite aguda e outras condições artríticas, sepse, choque séptico, choque endotóxico, sepse gram negativa, síndrome do choque tóxico, mal de Alzheimer, acidente
    Petição 870190085822, de 02/09/2019, pág. 149/156
    4/4 vascular cerebral, neurotrauma, asma, síndrome do desconforto respiratório do adulto, malária cerebral, doença inflamatória pulmonar crônica, silicose, sarcoidose pulmonar, doença de reabsorção óssea, osteoporose, reestenose, lesão de reperfusão cardíaca e renal, trombose, glomerularonefrite, diabetes, reação enxerto versus hospedeiro, rejeição de aloenxerto, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, degeneração muscular, eczema, dermatite de contato, psoríase, queimadura solar e choque da conjuntivite, em um indivíduo em necessidade do mesmo.
  15. 15. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.
  16. 16. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de cérebro, câncer de células escamosas, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer de fígado, câncer de esôfago, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer renal, câncer de rim, câncer de ovário, câncer de útero, câncer ginecológico, câncer de nasofaringe, câncer de tireóide, câncer de paratireóide, câncer de glândula supra-renal, câncer de intestino delgado, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer retal, câncer anal, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, câncer de uretra, câncer peniano, melanoma, um tumor sólido da infância, linfoma, leucemia ou mieloma múltiplo.
  17. 17. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um paciente em necessidade do mesmo.
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